特許 7262508 癌を治療するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-13

(45)【発行日】2023-04-21

(54)【発明の名称】癌を治療するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/137 20060101AFI20230414BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230414BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20230414BHJP

【ＦＩ】

A61K31/137

A61P35/00

A61P35/04

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2021073337

(22)【出願日】2021-04-23

(62)【分割の表示】P 2018509731の分割

【原出願日】2016-04-29

(65)【公開番号】P2021105064

(43)【公開日】2021-07-26

【審査請求日】2021-05-21

(31)【優先権主張番号】62/154,699

(32)【優先日】2015-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/155,451

(32)【優先日】2015-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/158,469

(32)【優先日】2015-05-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/192,940

(32)【優先日】2015-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/192,944

(32)【優先日】2015-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/252,085

(32)【優先日】2015-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/252,916

(32)【優先日】2015-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/265,696

(32)【優先日】2015-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/265,658

(32)【優先日】2015-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/265,774

(32)【優先日】2015-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/265,663

(32)【優先日】2015-12-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/323,572

(32)【優先日】2016-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/323,576

(32)【優先日】2016-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】517378016

【氏名又は名称】ラジウス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100095832

【弁理士】

【氏名又は名称】細田 芳徳

(72)【発明者】

【氏名】ガーナー，フィオナ

(72)【発明者】

【氏名】ハタスリー，ガリー

【審査官】春日 淳一

(56)【参考文献】

【文献】特許第６９２６０６５（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】FDA Accepts IND Application for Radius Health's Investigational Drug RAD1901 Being Developed for Pot，2014年12月19日，https://ir.radiuspharm.com/static-files/a1f4834f-ce20-4045-892b-da963b826cb2

【文献】Breast Cancer Research，2014年，Vol. 16, No. 494

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００ ～ ３１／８０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

薬物耐性エストロゲン受容体アルファ陽性乳癌脳転移を有する対象において腫瘍成長を阻害するためのまたは腫瘍退縮を生じさせるための組成物であって、治療上有効量の、構造：

【化1】

を有するＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物を含み、前記エストロゲン受容体アルファが、Ｙ５３７Ｓ、Ｙ５３７Ｎ、Ｙ５３７Ｃ、Ｄ５３８ＧおよびＳ４６３Ｐからなる群から選択される変異を有する、
組成物。

【請求項2】

前記乳癌脳転移が、転移性であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記変異が、Ｙ５３７Ｓであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

投与後の前記腫瘍中のＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物の濃度の、血漿中のＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物の濃度に対する比（Ｔ／Ｐ）が、少なくとも約１５であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記対象が、骨粗鬆症または骨粗鬆症の高いリスクを有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記対象が、閉経前の女性であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記対象が、ＳＥＲＭ及び／またはＡＩによるこれまでの治療後に、再発または進行している閉経後の女性であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記治療上有効量が、１日に約１５０～約１，５００ｍｇであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記その塩が、ＲＡＤ１９０１二塩酸塩であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記腫瘍が、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される薬物に耐性を示すことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記抗エストロゲンが、タモキシフェンまたはフルベストラントであることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記アロマターゼ阻害剤が、アロマシンであることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。

【請求項13】

前記治療上有効量が、１５０ｍｇ～２，０００ｍｇであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

前記治療上有効量が、２００ｍｇ、４００ｍｇ、または５００ｍｇであることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／１５４，６９９号、２０１５年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／１５５，４５１号、２０１５年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５２，０８５号、２０１５年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，６９６号、２０１５年５月７日に出願された米国仮特許出願第６２／１５８，４６９号、２０１５年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２５２，９１６号、２０１５年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，７７４号、２０１５年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／１９２，９４０号、２０１５年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，６５８号、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，５７２号、２０１５年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／１９２，９４４号、２０１５年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２６５，６６３号、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，５７６号の利益を主張するものであり、これらのすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、癌を治療するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

乳癌は、３つの受容体：エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びヒト上皮成長因子受容体－２（Ｈｅｒ２）の発現に基づいて３つのサブタイプに分類される。ＥＲの過剰発現は、多くの乳癌患者において見出される。ＥＲ陽性（ＥＲ＋）の乳癌は、すべての乳癌の３分の２を含む。エストロゲン及びＥＲは、例えば、乳癌以外の卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、及び子宮内膜癌と関連している。

【0004】

ＥＲは、エストロゲンによって活性化し、ＤＮＡに結合する細胞核へ移行し、それにより、様々な遺伝子の活性を調節することができる。例えば、非特許文献１、及び非特許文献２を参照されたい。

【0005】

エストロゲン産生を阻害する薬剤、例えば、アロマターゼ阻害剤（ＡＩ、例えば、レトロゾール、アナストロゾール、及びアロマシン）、またはＥＲ活性を直接遮断するもの、例えば、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ、例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、アルゾキシフェン、ミプロキシフェン、レボルメロキシフェン、及びＥＭ－６５２（ＳＣＨ ５７０６８））ならびに選択的エストロゲン受容体ディグレーダー（ＳＥＲＤ、例えば、フルベストラント、ＴＡＳ－１０８（ＳＲ１６２３４）、ＺＫ１９１７０３、ＲＵ５８６６８、ＧＤＣ－０８１０（ＡＲＮ－８１０）、ＧＷ５６３８／ＤＰＣ９７４、ＳＲＮ－９２７、ＩＣＩ１８２７８２、及びＡＺＤ９４９６）は、すでに使用されているか、またはＥＲ陽性乳癌の治療において開発されている。

【0006】

ＳＥＲＭ及びＡＩはまた、ＥＲ陽性乳癌のための第１選択のアジュバント全身療法としてよく使用されている。タモキシフェンは、閉経前及び閉経後の女性において早期及び進行性の両方のＥＲ陽性乳癌のために現在使用されている。しかしながら、タモキシフェンは、血液凝固及び卒中等の重篤な副作用を有し得る。タモキシフェンは、閉経後の女性において骨喪失を防ぎ得るが、閉経前の女性において骨粗しょうを引き起こし得る。タモキシフェンは、子宮内膜における部分アゴニストとして作用するため、子宮内膜癌のリスクも増大する。

【0007】

ＡＩは、体内でアンドロゲンをエストロゲンに変える、アロマターゼの活性を遮断することによって末梢組織中のエストロゲン産生を抑える。しかしながら、ＡＩは、卵巣がエストロゲンを生成するのを止めることができない。そのため、ＡＩは、主に、閉経後の女性を治療するために使用される。さらに、ＡＩは、重篤な副作用が少なく、タモキシフェンよりもさらに有効であるため、ＡＩは、閉経前の女性を治療するために使用され、卵巣機能を抑えることもできる。例えば非特許文献３を参照されたい。

【0008】

これらの薬剤による初期治療が成功し得るが、多くの患者は、最終的には、薬物耐性乳癌を再発する。ＥＲに影響を及ぼす変異は、この抵抗性の発症のためにある潜在的機序として現れる。例えば、非特許文献４を参照されたい。ＥＲのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）における変異は、内分泌療法の少なくとも１つを受けている患者からの転移性ＥＲ陽性乳癌試料のうちの２１％に見出される。非特許文献５。

【0009】

フルベストラントは、現在、抗エストロゲン療法後の疾患の進行があるＥＲ陽性転移性乳癌の治療に承認されている唯一のＳＥＲＤである。その臨床的有効性にもかかわらず、フルベストラントの効用は、単回投与において投与され得る薬物の量によって、バイオアベイラビリティの低下によって制限されている。１８Ｆ－フルオロエストラジオール陽電子放出断層撮影法（ＦＥＳ－ＰＥＴ）を用いた画像研究は、５００ｍｇの用量レベルでさえ、患者の中には、完全なＥＲの阻害を有さない場合があり、不十分な投与は、治療不全の理由であり得ることを示唆している。

【0010】

エストロゲン標的療法に関連する別の課題は、子宮、骨、及びその他の組織への望ましくない効果を有し得ることである。ＥＲは、多種多様な組織及び細胞型にエストロゲン応答性遺伝子の転写を指示する。これらの効果は、特に、エストロゲン及びその他の卵巣ホルモンの内因性レベルが、更年期中に減退する場合に、顕著であり得る。例えば、タモキシフェンは、子宮内膜における部分アゴニストとして作用するため、閉経前の女性において骨粗しょうを引き起こし、子宮内膜癌のリスクを増大させ得る。閉経後の女性では、ＡＩは、タモキシフェンよりもさらに骨喪失及び骨折を引き起こし得る。フルベストラントで治療された患者はまた、作用機序により、骨粗鬆症のリスクにさらされ得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【文献】Ｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｏ Ｉｍｐａｃｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，” Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７（８）：４９７－５０８（２００６）

【文献】Ｈｅｌｄｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｈｏｗ Ｄｏ Ｔｈｅｙ Ｓｉｇｎａｌ ａｎｄ Ｗｈａｔ Ａｒｅ Ｔｈｅｉｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，”Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８７（３）：９０５－９３１（２００７）

【文献】Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｏｖａｒｉａｎ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｅｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ，”ｔｈｅ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３７２：４３６－４４６（２０１５）

【文献】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＥＳＲ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，” Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４５：１４４６－５１（２０１３）

【文献】Ｊｅｓｅｌｓｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．，“ＥＳＲ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ－ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：５７３－８３（２０１５）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、現在の内分泌療法と関連する課題のいくつかを克服し、耐性発現に有効であるようなより持続的かつ有効なＥＲ標的療法の必要性が依然としてある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

一態様では、本開示は、薬物耐性エストロゲン受容体アルファ陽性癌を有する対象において腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍退縮を生じさせる方法に関する。本方法は、対象に、治療上有効量の、構造：

【化1】

を有するＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物を投与することを含む。

【0014】

別の態様では、本開示は、変異体エストロゲン受容体アルファ陽性癌を有する対象において腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍退縮を生じさせる方法に関する。本方法は、対象に、治療上有効量の、構造：

【化2】

を有するＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物を投与することを含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、子宮癌、卵巣癌、及び下垂体癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、転移性癌である。いくつかの実施形態では、癌は、Ｙ５３７Ｘ_１、Ｌ５３６Ｘ_２、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の変異を含む変異体エストロゲン受容体アルファに対して陽性であり、式中、Ｘ_１が、Ｓ、Ｎ、またはＣ、Ｄ５３８Ｇであり、Ｘ_２がＲまたはＱである。例えば、変異は、Ｙ５３７Ｓである。

【0016】

いくつかの実施形態では、腫瘍は、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される薬物に耐性を示す。例えば、抗エストロゲンは、タモキシフェンまたはフルベストラントであり、アロマターゼ阻害剤は、アロマシンである。

【0017】

即ち、本発明の要旨は、
［１］薬物耐性エストロゲン受容体アルファ陽性癌を有する対象において腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍退縮を生じさせる方法であって、前記対象に、治療上有効量の、構造：

【化A-1】

を有するＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物を投与することを含む、方法、
［２］変異体エストロゲン受容体アルファ陽性癌を有する対象において腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍退縮を生じさせる方法であって、前記対象に、治療上有効量の、構造：

【化A-2】

を有するＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物を投与することを含む、方法、
［３］前記癌が、乳癌、子宮癌、卵巣癌、及び下垂体癌からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の方法、
［４］前記癌が、転移性癌である、［１］または［２］に記載の方法、
［５］前記癌が、Ｙ５３７Ｘ_１、Ｌ５３６Ｘ_２、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の変異を含む変異体エストロゲン受容体アルファに対して陽性であり、式中、
Ｘ_１が、Ｓ、Ｎ、またはＣ、Ｄ５３８Ｇであり、Ｘ_２がＲまたはＱである、［１］または［２］に記載の方法、
［６］前記変異が、Ｙ５３７Ｓである、［５］に記載の方法、
［７］投与後の前記腫瘍中のＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物の濃度の、血漿中のＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物の濃度に対する比（Ｔ／Ｐ）が、少なくとも約１５である、［１］または［２］に記載の方法、
［８］前記対象が、骨粗鬆症または骨粗鬆症の高いリスクを有する、［１］または［２］に記載の方法、
［９］前記対象が、閉経前の女性である、［１］または［２］に記載の方法、
［１０］前記対象が、ＳＥＲＭ及び／またはＡＩによるこれまでの治療後に、再発または進行している閉経後の女性である、［１］または［２］に記載の方法、
［１１］前記治療上有効量が、１日１回約１５０～約１，５００ｍｇである、［１］または［２］に記載の方法、
［１２］前記その塩が、ＲＡＤ１９０１二塩酸塩である、［１］または［２］に記載の方法、
［１３］前記腫瘍が、抗エストロゲン、アロマターゼ阻害剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される薬物に耐性を示す、［１］または［２］に記載の方法、
［１４］前記抗エストロゲンが、タモキシフェンまたはフルベストラントである、［１３］に記載の方法、
［１５］前記アロマターゼ阻害剤が、アロマシンである、［１３］に記載の方法、
［１６］前記治療上有効量が、１５０ｍｇ～２，０００ｍｇである、［１］または［２］に記載の方法、
［１７］前記治療上有効量が、２００ｍｇ、４００ｍｇ、または５００ｍｇである、［１６］に記載の方法
に関する。

【発明の効果】

【0018】

本発明により、癌を治療するための方法が提供され得る。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ＲＡＤ１９０１は、ＥＳＲ１状態及び前内分泌療法にもかかわらず、様々な患者由来の異種移植片（ＰＤｘ）モデルにおける腫瘍成長を阻害した。ＲＡＤ１９０１で治療したＰＤｘモデルにおける腫瘍成長の阻害（ＴＧＩ）の割合を示す。

【図2】ＲＡＤ１９０１は、野生型（ＷＴ）ＥＲα ＭＣＦ－７マウス異種移植片モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－）における腫瘍成長及び腫瘍退縮を示した。（図２Ａ）：箱ひげ図は、ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（０．３、１、３、１０、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇの１日１回経口投与）、タモキシフェン（ＴＡＭ）（１ｍｇ／用量、皮下注射、１日毎）、及びフルベストラント（ＦＵＬ）（０．５ｍｇ／用量、皮下注射、１日１回）で治療したＭＣＦ－７マウス異種移植片モデルにおける群別の４０日目の腫瘍体積を示した；（図２Ｂ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（６０、９０、及び１２０ｍｇ／ｋｇ、経口投与１日１回）、タモキシフェン（１ｍｇ／用量、皮下注射、１日毎）、及びフルベストラント（０．５ｍｇ／用量、皮下注射、１日１回）で治療したＭＣＦ－７マウス異種移植片モデルにおける経時的な腫瘍体積の中央値（図２Ｃ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（６０、９０、及び１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、タモキシフェン（１ｍｇ／用量、皮下注射、１日毎）、及びフルベストラント（０．５ｍｇ／用量、皮下注射、１日１回）で治療したＭＣＦ－７マウス異種移植片モデルにおける４２日目の個々の動物からの腫瘍体積；（図２Ｄ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（ＲＡＤ）（０．３、１、３、１０、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇ １日１回経口投与）、タモキシフェン（１ｍｇ／用量、皮下注射、１日毎）、及びフルベストラント（０．５ｍｇ／用量、皮下注射、１日１回）で治療したＭＣＦ－７マウス異種移植片モデルにおける経時的な腫瘍体積の中央値；（図２Ｅ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（ＲＡＤ）（０．３、１、３、１０、３０、及び６０ｍｇ／ｋｇ １日１回経口投与）、タモキシフェン（１ｍｇ／用量、皮下注射、１日毎）、及びフルベストラント（０．５ｍｇ／用量、皮下注射、１日１回）で治療したＭＣＦ－７マウス異種移植片モデルにおける１日目からの群平均体重の変化の割合（％）。

【図3】ＲＡＤ１９０１は、ＷＴ ＥＲα ＭＣＦ－７異種移植片モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－）における腫瘍成長の阻害及び腫瘍退縮を示した。（図３Ａ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（３０及び６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＭＣＦ－７異種移植片モデルの腫瘍成長；（図３Ｂ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（３０及び６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるベースラインから研究終了までの個々の腫瘍サイズの変化。

【図4】ＲＡＤ１９０１は、ＷＴ ＥＲα ＰＤｘ－４モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－、治療ナイーブ）における腫瘍成長の阻害及び腫瘍退縮を示した。（図４Ａ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（３０、６０、及び１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－４モデルの腫瘍成長；（図４Ｂ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（３０、６０、１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－４モデルにおけるベースラインから研究終了までの個々の腫瘍サイズの変化。

【図5】ＲＡＤ１９０１の有効性は、ＲＡＤ１９０１での治療を終了してから少なくとも２カ月持続し、一方、エストラジオール治療は、ＷＴ ＥＲα ＰＤｘ－４モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－、治療ナイーブ）において継続した。ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（１ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－４モデルの腫瘍成長。

【図6】ＲＡＤ１９０１は、ＷＴ ＥＲα ＰＤｘ－２モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－、治療ナイーブ）における腫瘍成長の阻害を示した。ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、フルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）、ならびに（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）とフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）との組み合わせで治療したＰＤｘ－２モデルの腫瘍成長。ｎ＝８～１０／群。

【図7】ＷＴ ＥＲα ＰＤｘ－１１モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、アロマターゼ阻害剤、フルベストラント、及び化学療法で以前に治療した）におけるＲＡＤ１９０１腫瘍成長の阻害及び腫瘍退縮を示した。（図７Ａ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－１１モデルの腫瘍成長；（図７Ｂ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－１１モデルにおけるベースラインから研究終了までの個々の腫瘍サイズの変化。ｎ＝８～１０／群。

【図8】ＲＡＤ１９０１は、ＷＴ ＥＲα ＰＤｘ－１２モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－、治療ナイーブ）における様々な用量での腫瘍成長の阻害及び腫瘍退縮を示した。ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（３０及び６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（１ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－１１モデルの腫瘍成長。

【図9】ＲＡＤ１９０１は、変異（Ｙ５３７Ｓ）ＥＲα ＰＤｘ－５モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、アロマターゼ阻害剤で以前に治療した）における腫瘍成長の阻害を示した。（図９Ａ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（６０、１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－１１モデルの腫瘍成長；（図９Ｂ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（６０、１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）、及びフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－５モデルにおけるベースラインから１７日目までの個々の腫瘍サイズの変化；（図９Ｃ）：ＲＡＤ１９０１（６０、１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）で治療したＰＤｘ－５モデルにおけるベースラインから５６日目までの個々の腫瘍サイズの変化。

【図10】ＲＡＤ１９０１は、変異（Ｙ５３７Ｓ）ＥＲα ＰＤｘ－６モデル（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２：１＋、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、及びフルベストラントで以前に治療した）における腫瘍成長の阻害及び腫瘍退縮を示した。（図１０Ａ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（３０、６０、及び１２０ｍｇ／ｋｇ １日１回経口投与）、タモキシフェン（１ｍｇ／用量、皮下注射、１日毎）、及びフルベストラント（１ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－６モデルの腫瘍成長；（図１０Ｂ）：ビヒクル対照、ＲＡＤ１９０１（３０、６０、及び１２０ｍｇ／ｋｇ １日１回経口投与）、及びフルベストラント（１ｍｇ／用量、週１回皮下注射）で治療したＰＤｘ－６モデルにおけるベースラインから研究終了までの個々の腫瘍サイズの変化。

【図11】ヌードマウスにおけるフルベストラントの薬物動態分析。１ｍｇ／用量（黒ひし形）、３ｍｇ／用量（黒丸）、及び５ｍｇ／用量（黒三角）のフルベストラントの血漿濃度を示す。ヌードマウスに、１日目にフルベストラントを皮下投与し、２回目を８日目に投与した。フルベストラントの血漿濃度を、２回目の投与から１６８時間まで指示された時点でモニタリングした。

【図12】頭蓋内ＭＣＦ－７腫瘍モデルにおけるマウス生存へのＲＡＤ１９０１及びフルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）の効果。

【図13】ＥＲ＋進行性乳癌のためのＲＡＤ１９０１治療の第１相試験。

【図14】ＥＲ＋進行性乳癌のためのＲＡＤ１９０１治療の第１相試験に登録された対象のこれまでの治療歴及びＲＡＤ１９０１治療。（図１４Ａ）：これまでの癌治療；（図１４Ｂ）：ＲＡＤ１９０１治療。

【図15】２００及び５００ｍｇのＲＡＤ１９０１を１日１回の経口投与で治療を受けた対象の子宮のＦＥＳ－ＰＥＴスキャンの代表的な画像、及びＲＡＤ１９０１治療後のＥＲ関与の変化。（図１５Ａ）：２００ｍｇのＲＡＤ１９０１での治療前（ａ）及び治療後（ｃ）の子宮ＣＴスキャンの横断図ならびにＲＡＤ１９０１での治療前（ｂ）及び治療後（ｄ）の子宮ＦＥＳ－ＰＥＴスキャンの横断図；（図１５Ｂ）：５００ｍｇのＲＡＤ１９０１での治療前（（ａ）上パネル）及び治療後（（ａ）下パネル）の子宮ＣＴスキャンの矢状図、ＲＡＤ１９０１での治療前（（ｂ）上パネル）及び治療後（（ｂ）下パネル）の子宮ＦＥＳ－ＰＥＴスキャンの矢状図、ＲＡＤ１９０１での治療前（（ｃ）上パネル）及び治療後（（ｃ）下パネル）の子宮ＣＴスキャンの横断図、ＲＡＤ１９０１での治療前（（ｄ）上パネル）及び治療後（（ｄ）下パネル）の子宮ＦＥＳ－ＰＥＴスキャンの横断図；（図１５Ｃ）：ベースライン（ＲＡＤ１９０１治療前）と比較した、対象１～３（２００ｍｇ）及び対象４～７（５００ｍｇ）のＲＡＤ１９０１での治療後のＥＲ関与の変化率（％）。

【図16】ＲＡＤ１９０１（５００ｍｇ）での治療前（ベースライン）及びその後（治療後）の子宮（図１６Ａ）及び下垂体（図１６Ｂ）のＦＥＳ－ＰＥＴスキャンの代表的な画像。（ａ）側面断面図、（ｂ）経度断面図、及び（ｃ）経度断面図。

【図17】ＲＡＤ１９０１治療は、完全なＥＲの低下をもたらし、インビトロでのＭＣＦ－７細胞株（図１７Ａ）及びＴ４７Ｄ細胞株（図１７Ｂ）におけるＥＲシグナル伝達を阻害した。０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、及び１μＭの様々な濃度で、それぞれ、ＲＡＤ１９０１及びフルベストラントで治療した両方の細胞株において、ＥＲ発現を示した。試験した３つのＥＲ標的遺伝子：ＰＧＲ、ＧＲＥＢ１、及びＴＦＦ１によって、ＥＲシグナル伝達を示した。

【図18】ＲＡＤ１９０１での治療は、ＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるＥＲ分解及びＥＲシグナル伝達の廃止をもたらした。（図１８Ａ）：最後の投与から２時間または８時間後に、ビヒクル対照、３０及び６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１、ならびに３ｍｇ／用量のフルベストラントで治療したＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるＰＲ及びＥＲ発現を示すウェスタンブロット；（図１８Ｂ）：最後の投与から２時間または８時間後に、ビヒクル対照、３０及び６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１、ならびに３ｍｇ／用量のフルベストラントで治療したＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるＥＲタンパク質発現；（図１８Ｃ）：最後の投与から８時間後に、ビヒクル対照、３０及び６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１、ならびに３ｍｇ／用量のフルベストラントで治療したＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるＰＲタンパク質発現。

【図19】ＲＡＤ１９０１での治療は、ＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるＰＲの急激な減少をもたらした。（図１９Ａ）：単回投与から８時間または１２時間後に、ビヒクル対照、３０、６０、及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で治療したＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるＰＲ発現を示すウェスタンブロット；（図１９Ｂ）：７回目の投与から４時間または２４時間後に、ビヒクル対照、３０、６０、及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で処置したＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるＰＲ発現を示すウェスタンブロット；（図１９Ｃ）：３０、６０、及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で治療したＭＣＦ－７異種移植片モデルにおけるＰＲ発現の用量依存的な減少。

【図20】ＲＡＤ１９０１での治療は、ＭＣＦ－７異種移植片モデルにおける増殖の急激な減少をもたらした。（図２０Ａ）：単回投与から８時間後及び４回目の投与から２４時間後に、ビヒクル対照及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で治療し、増殖マーカーＫｉ－６７に対して染色した、ＭＣＦ－７異種移植片モデルから採取した切片腫瘍の代表的な写真；（図２０Ｂ）：単回投与から８時間後及び４回目の投与から２４時間後に、ビヒクル対照及び９０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１で治療したＭＣＦ－７異種移植片モデルにおける増殖マーカーＫｉ－６７の減少を示すヒストグラム。

【図21】３０、６０、及び１２０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１での治療は、５６日の有効性研究の最終日において４時間のＰＤｘ－４モデルの研究腫瘍の終わりに、フルベストラント（１ｍｇ／動物）よりもさらに著しいＫｉ６７の減少をもたらした。

【図22】６０及び１２０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１での治療は、ＰＲ発現の減少に伴って、ＰＤｘ－５モデルにおけるインビボでのＥＲのシグナル伝達の低下をもたらした。

【図23】乳離れしたばかりの雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおける子宮組織へのＲＡＤ１９０１の効果。（図２３Ａ）：最終投与から２４時間後に殺処分したラットの子宮湿重量；（図２３Ｂ）：子宮の組織切片における上皮重量；（図２３Ｃ）：４００倍率のトルイジンブルーＯ染色した子宮組織の代表的な切片；（図２３Ｄ）：子宮組織から抽出し、１８ＳリボソームＲＮＡハウスキーピング遺伝子と比較して、補体Ｃ３発現のレベルに対して定量的ＲＴ－ＰＣＲによって分析した全ＲＮＡ。

【図24】７日目に２００、５００、７５０、及び１０００ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１を投与した後の血漿薬物動態の結果。

【図25】３ＥＲＴ（Ｉ）。

【図26】３ＥＲＴ（ＩＩ）。

【図27】表１３に要約されたＥＲα ＬＢＤ－アンタゴニスト複合体の重ね合わせ。

【図28】（図２８Ａ）ＲＡＤ１９０１－１Ｒ５Ｋ及び（図２８Ｂ）ＧＷ５－１Ｒ５Ｋのモデリング。

【図29】（図２９Ａ）ＲＡＤ１９０１－１ＳＪ０及び（図２９Ｂ）Ｅ４Ｄ－１ＳＪ０のモデリング。

【図30】（図３０Ａ）ＲＡＤ１９０１－２ＪＦＡ及び（図３０Ｂ）ＲＡＬ－２ＪＦＡのモデリング。

【図31】（図３１Ａ）ＲＡＤ１９０１－２ＢＪ４及び（図３１Ｂ）ＯＨＴ－２ＢＪ４のモデリング。

【図32】（図３２Ａ）ＲＡＤ１９０１－２ＩＯＫ及び（図３２Ｂ）ＩＯＫ－２ＩＯＫのモデリング。

【図33】１Ｒ５Ｋ及び２ＯＵＺによるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造の重ね合わせ。

【図34】２ＢＪ４及び２ＪＦＡによるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造の重ね合わせ。

【図35】２ＢＪ４、２ＪＦＡ、及び１ＳＪ０によるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造の重ね合わせ。

【図36】２ＢＪ４によるＲＡＤ１９０１のＩＦＤ。

【図37】ＩＦＤによって２ＢＪ４にドックされたＲＡＤ１９０１のタンパク質表面相互作用。

【図38】２ＢＪ４によるフルベストラントのＩＦＤ。

【図39】２ＢＪ４によるフルベストラント及びＲＡＤ１９０１のＩＦＤ。

【図40】２ＢＪ４によるフルベストラント及びＲＡＤ１９０１のＩＦＤの重ね合わせ。

【図41】ＷＴ及びＬＢＤ変異体のＥＲα構築物によるＲＡＤ１９０１のインビトロ結合アッセイ。

【図42】エストロゲン受容体。

【図43】ＥＲ＋進行性乳癌の治療のためのＲＡＤ１９０１の第１相試験の重要なベースライン人口統計。

【図44】ＥＲ＋進行性乳癌の治療のためのＲＡＤ１９０１の第１相試験の治療関連ＡＥ。

【図45】４０日間治療した後の、ＭＣＦ７細胞を移植したマウスの血漿、腫瘍、及び脳におけるＲＡＤ１９０１レベル。＊ＢＬＱ：定量下限未満。

【図46】２００ｍｇの用量の経口投与で、１日１回、６日間治療したヒト対象の子宮、筋肉、及び骨のＳＵＶ。

【図47】５００ｍｇの用量の経口投与で、１日１回、６日間治療したヒト対象（ｎ＝４）の子宮、筋肉、及び骨のＳＵＶ。

【図48】卵巣摘出ラットにおけるＢＭＤへのＲＡＤ１９０１の効果。成体雌ラット（治療群当たりｎ＝２０）は、ビヒクル、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＡＤ１９０１（３ｍｇ／ｋｇ）で１日１回の治療開始の前に、偽手術または卵巣摘出手術のいずれかを施行した。ＢＭＤは、ベースライン及び治療から４週間後に、二重放射Ｘ線吸光光度法によって測定された。データは、平均±標準偏差で表される。＊Ｐ＜０．０５対対応するＯＶＸ＋Ｖｅｈ対照。ＢＭＤ、骨ミネラル濃度；Ｅ２、ベータエストラジオール；ＯＶＸ、卵巣摘出した；Ｖｅｈ、ビヒクル。

【図49】卵巣摘出ラットにおける大腿マイクロアーキテクチャへのＲＡＤ１９０１の効果。成体雌ラット（治療群当たりｎ＝２０）は、ビヒクル、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＡＤ１９０１（３ｍｇ／ｋｇ）で１日１回の治療開始の前に、偽手術または卵巣摘出手術のいずれかを施行した。４週間後、骨マイクロアーキテクチャは、マイクロコンピュータ断層撮影法を用いて評価した。データは、平均±標準偏差で表される。＊Ｐ＜０．０５対対応するＯＶＸ＋Ｖｅｈ対照。ＡＢＤ、見掛け骨密度；ＢＶ／ＴＶ、骨体積密度；ＣｏｎｎＤ、連結密度；Ｅ２、ベータエストラジオール；ＯＶＸ、卵巣摘出した；ＴｂＮ、骨梁数；ＴｂＴｈ、骨梁幅；ＴｂＳｐ、骨梁中心距離；Ｖｅｈ、ビヒクル。

【図50】ＲＡＤ１９０１の第１相用量漸増試験の重要なベースライン人口統計。

【図51】ＲＡＤ１９０１の第１相用量漸増試験における最も頻繁に起こる（１０％超）治療関連ＡＥ。ＣＴＣＡＥ ｖ４．０により等級分けされたＡＥ。同じ優先使用語の複数のシナリオを有する任意の患者は、最も重度のグレードまで１回のみ計数した。＊任意の関連ＴＥＡＥを有した全活性群における１０％超の患者。ｎ＝所与のカテゴリーにおける少なくとも１つの治療関連ＡＥを有する対象の数。

【図52】ＲＡＤ１９０１の第１相用量漸増試験における薬物動態学的パラメータ（７日目）。

【図53】ＬＢＤ変異の頻度。

【図54】残留姿勢対３ＥＲＴにおけるＥＲ－α ＬＢＤ－アンタゴニスト複合体の違い。

【図55】ＲＭＳＤ計算によるＥＲ－α ＬＢＤ－アンタゴニスト複合体の構造オーバーラップの評価。

【図56】ＥＲ－α ＬＢＤ－アンタゴニスト複合体におけるリガンド結合の分析。

【図57】ＲＡＤ１９０１ドッキングのモデル評価。

【図58】１Ｒ５Ｋ、２ＩＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺによるＲＡＤ１９０１の誘導適合ドッキングスコア。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下の実施例の項に示されるように、ＲＡＤ１９０１（以下の構造）は、ＥＳＲ１状態及びこれまでの内分泌療法にもかかわらず、乳癌異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を阻害する及び／または腫瘍退縮を生じることが見出された（実施例Ｉ（Ａ））。治療された異種移植片モデルは、高いまたは低いＨｅｒ２の発現を有し、これまでの内分泌療法（例えばタモキシフェン（ｔａｍ）、ＡＩ、化学療法（ｃｈｅｍｏ）、Ｈｅｒ２阻害剤（Ｈｅｒ２ｉ、例えばトラスツズマブ、ラパチニブ）、ベバシズマブ、及び／またはリツキシマブを有するまたは有さない、ＷＴまたは変異（例えばＹ５３７Ｓ）ＥＲαを発現する腫瘍を有した（図１）。そして、すべての場合において、ＲＡＤ１９０１は、腫瘍成長を阻害した。ＷＴ ＥＲ ＰＤｘモデル及び変異ＥＲ ＰＤｘモデルは、フルベストラント治療に対して異なるレベルの反応性を有し得る。しかしながら、ＲＡＤ１９０１は、ＰＤｘモデルが、フルベストラント治療に対して反応性があったにもかかわらず、腫瘍成長を阻害することが見出された。それ故に、ＲＡＤ１９０１は、改善された腫瘍成長の阻害を有するフルベストラントに反応する乳癌の反応性を治療するため、及びフルベストラントによってあまり有効に治療されない乳癌を治療するためにもフルベストラント置換として使用され得る。例えば、ＲＡＤ１９０１は、フルベストラント治療に対する多様な反応性を有するＷＴ ＥＲ＋ＰＤｘモデル（例えばＭＣＦ－７細胞株異種移植片モデル、フルベストラント治療に反応するＰＤｘ－４、ＰＤｘ－２、及びＰＤｘ－１１モデル、ならびにフルベストラント治療にほとんど反応しないＰＤｘ－１２モデル）、ならびにフルベストラント治療に対して変化するレベルの反応性を有する変異（例えばＹ５３７Ｓ）ＥＲ＋ＰＤｘモデル（例えば、フルベストラント治療に反応するＰＤｘ－６モデル、及びフルベストラント治療にほとんど反応しないＰＤｘ－５モデル）において腫瘍退縮を生じた。ＲＡＤ１９０１は、エストラジオール治療は継続したが、治療を終了した後に、腫瘍成長を阻害する際に持続的な有効性を示した（例えばＰＤｘ－４モデル）。本明細書に提供される結果はまた、ＲＡＤ１９０１が脳に送達され得ることを示し（実施例ＩＩ）、当該送達は、野生型ＥＲαを発現する頭蓋内腫瘍モデル（ＭＣＦ－７異種移植片モデル、実施例Ｉ（Ｂ））においてマウス生存を改善した。ＲＡＤ１９０１は、強力な抗ＥＲ＋乳癌療法である。

【化3】

【0021】

ＲＡＤ１９０１はまた、他の内分泌療法（例えば、タモキシフェン等の他のＳＥＲＭ及びフルバストラント等のＳＥＲＤ）と比較してより少ない副作用を生じる可能性が高い。例えば、タモキシフェンは、子宮内膜癌のリスクも増大し得る。タモキシフェンはまた、閉経前の女性において骨粗しょうを引き起こし得る。フルベストラントはまた、治療した患者において骨喪失のリスクを増大し得る。ＲＡＤ１９０１は、同様の副作用を有する可能性は低い。ＲＡＤ１９０１は、腫瘍中に優先的に蓄積することが見出され、最大約３５の腫瘍中のＲＡＤ１９０１レベル対血漿中のＲＡＤ１９０１レベル（Ｔ／Ｐ比）があった（実施例ＩＩ）。子宮、筋肉、及び骨に対する標準取り込み値（ＳＵＶ）は、約２００ｍｇ～最大約５００ｍｇの用量で、１日１回ＲＡＤ１９０１で治療したヒト対象について計算された（実施例ＩＩＩ（Ａ））。投与後の子宮シグナルは、「非標的組織」（エストロゲン受容体を発現しない組織）からのレベルに近く、ＲＡＤ１９０１治療後のＦＥＳ－ＰＥＴの取り込みの完全な減衰を示唆している。エストロゲン受容体を有意に発現しなかった組織（例えば筋肉、骨）中の治療前対治療後ＰＥＴスキャンについては、ほとんど変化が観察されなかった（実施例ＩＩＩ（Ａ））。ＲＡＤ１９０１治療は、卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットにおける子宮組織のエストラジオール刺激に拮抗し（実施例ＩＶ（Ａ））、治療を受けた対象の骨質を大いに保存した。それ故に、ＲＡＤ１９０１治療は、他の内分泌療法が患者の骨構造を害し得るように、患者の骨構造を害する可能性が低い。例えば、ＲＡＤ１９０１で治療したＯＶＸラットは、維持されたＢＭＤ及び大腿マイクロアーキテクチャを示した（実施例ＩＶ（Ａ））。それ故に、ＲＡＤ１９０１治療は、特に、骨粗鬆症または骨粗鬆症のより高いリスクを有する患者において有用であり得る。

【0022】

さらに、ＲＡＤ１９０１は、ＭＣＦ７細胞株異種移植片モデルにおいてインビボで野生型ＥＲαを分解し、ＥＲシグナル伝達を廃止することが見出され、これらのＭＣＦ７細胞株異種移植片モデルにおいて、ＰＲの用量依存的な減少を示した（実施例ＩＩＩ（Ｂ））。ＲＡＤ１９０１は、治療を受けた対象から採取した腫瘍中の増殖マーカーＫｉ６７の減少からも明らかなように、ＭＣＦ－７細胞株異種移植片モデル及びＰＤｘ－４モデルにおける増殖を減少した。ＲＡＤ１９０１はまた、フルベストラント治療に対してほとんど反応性がなかった変異体ＥＲ ＰＤｘモデルにおいてインビボでＥＲシグナル伝達を減少した（実施例ＩＩＩ（Ｂ））。

【0023】

フルベストラント治療に対してほとんど反応性がない腫瘍及び変異体ＥＲαを発現する腫瘍に対するＲＡＤ１９０１の予期せぬ有効性は、ＲＡＤ１９０１とＥＲαとの間の固有の相互作用によるものであり得る。ＲＡＤ１９０１に結合するＥＲα及び他のＥＲαと結合する化合物の構造モデルは、特定の結合相互作用についての情報を得るために分析した（実施例Ｖ）。コンピュータモデリングは、ＲＡＤ１９０１－ＥＲαの相互作用が、ＥＲαのＬＢＤの変異体、例えばＹ５３７Ｘ変異体（式中、Ｘが、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、及びＳ４６３Ｐによって影響を受ける可能性が低いことを示し、これは、内分泌療法のうちの少なくとも１つを施した患者からの転移性ＥＲ陽性乳房の腫瘍試料の最近の研究に見出されたＬＢＤ変異の約８１．７％を占める（表１１、実施例Ｖ）。これは、結合にとって欠かせない、野生型ＥＲαだけでなく、ある特定の変異及びそれらのバリアントと結合し、拮抗する化合物を発生するために使用することができる情報である、ＥＲαのＣ末端リガンド結合ドメインにおける特定の残基の特定をもたらした。

【0024】

これらの結果に基づいて、対象に、治療上有効量の、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩を投与することによって、それらを必要とする対象においてＥＲα陽性癌または腫瘍の成長を阻害する、またはその退行を生じるための方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）の投与は、腫瘍成長を阻害することに加えて、例えば、（例えば、エストラジオール結合を阻害するまたはＥＲαを分解することによって）癌細胞の増殖を阻害するまたはＥＲα活性を阻害することを含む、さらなる治療的有効性を有する。ある特定の実施形態では、本方法は、筋肉、骨、乳部、及び子宮に対する負の効果を生じない。

【0025】

ＥＲα及び変異体ＥＲαを調節する及び分解する方法、ＥＲα及び変異体ＥＲαの活性または発現と関連する状態を治療する方法、これらの方法で用いるための化合物、ならびにＥＲα及び変異体ＥＲαに結合する当該化合物の複合体及び結晶もまた、本明細書に提供される。

【0026】

本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または腫瘍退縮の方法のある特定の実施形態では、対象に、治療上有効量の、ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）を投与することによって、それらを必要とする対象においてＥＲα陽性腫瘍の成長を阻害する、またはその退行を生じるための方法が、提供される。ある特定のこれらの実施形態では、その塩は、構造：

【化4】

を有するＲＡＤ１９０１二塩酸塩である。

【0027】

本明細書に使用されるＥＲα陽性腫瘍の「成長を阻害すること」は、腫瘍成長の速度を減速すること、または腫瘍成長を完全に停止することを指し得る。

【0028】

本明細書に使用されるＥＲα陽性腫瘍の「腫瘍退縮」または「退縮」は、最大サイズの腫瘍を軽減することを指し得る。ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩の投与は、腫瘍のサイズ対ベースライン（すなわち、治療開始前のサイズ）の減少、または腫瘍の根絶もしくは部分的根絶でさえももたらし得る。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に提供される腫瘍退縮の方法は、代替的に、腫瘍のサイズ対ベースラインを減少する方法と特徴付けられ得る。

【0029】

本明細書に使用される「腫瘍」は、悪性腫瘍であり、「癌」と同義に使用される。

【0030】

腫瘍成長の阻害または退縮は、特定の組織または臓器内の単発性腫瘍または一連の腫瘍に限局され得るか、または全身性であり得る（すなわち、すべての組織または臓器における腫瘍に影響を及ぼす）。

【0031】

ＲＡＤ１９０１は、ＥＲα対エストロゲン受容体ベータ（ＥＲβ）と優先的に結合することが周知であるため、別段記述がない限り、エストロゲン受容体、エストロゲン受容体アルファ、ＥＲα、ＥＲ、野生型ＥＲα、及びＥＳＲ１は、本明細書において同義に使用される。本明細書に使用される「エストロゲン受容体アルファ」または「ＥＲα」は、遺伝子ＥＳＲ１によってコードされる、野生型ＥＲαアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、ポリペプチドを指す。本明細書に使用される「エストロゲン受容体アルファに対して陽性である」、「ＥＲα陽性」、「ＥＲ＋」、または「ＥＲα＋」である腫瘍は、１つ以上の細胞がＥＲαのうちの少なくとも１つのイソ型を発現する腫瘍を指す。ある特定の実施形態では、これらの細胞は、ＥＲαを過剰発現する。ある特定の実施形態では、患者は、エストロゲン受容体ベータのうちの１つ以上の型を発現する腫瘍内に１つ以上の細胞を有する。ある特定の実施形態では、ＥＲα陽性腫瘍及び／または癌は、乳部、子宮、卵巣、または下垂体癌と関連している。ある特定のこれらの実施形態では、患者は、乳部、子宮、卵巣、または下垂体組織に位置する腫瘍を有する。患者が乳部に位置する腫瘍を有するような実施形態では、腫瘍は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ２＋腫瘍に対して陽性であり得るかまたはあり得ない、内腔乳癌と関連し得、腫瘍は、高いまたは低いＨＥＲ２を発現し得る（例えば図１）。他の実施形態では、患者は、別の組織または臓器（例えば、骨、筋肉、脳）に位置する腫瘍を有するが、それにもかかわらず、乳部、子宮、卵巣、または下垂体癌（例えば、乳部、子宮、卵巣、または下垂体癌の移動または転移に由来する腫瘍）とは関連しない。したがって、本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または退縮の方法のある特定の実施形態では、標的とされる腫瘍は、転移性腫瘍である、及び／または腫瘍が、他の臓器（例えば、骨及び／または筋肉）におけるＥＲの過剰発現を有する。ある特定の実施形態では、標的とされる腫瘍は、脳腫瘍及び／または癌である。ある特定の実施形態では、標的とされる腫瘍は、別のＳＥＲＤ（例えば、フルベストラント、ＴＡＳ－１０８（ＳＲ１６２３４）、ＺＫ１９１７０３、ＲＵ５８６６８、ＧＤＣ－０８１０（ＡＲＮ－８１０）、ＧＷ５６３８／ＤＰＣ９７４、ＳＲＮ－９２７、ＩＣＩ１８２７８２、及びＡＺＤ９４９６）、Ｈｅｒ２阻害剤（例えば、トラスツズマブ、ラパチニブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、及び／もしくはペルツズマブ）、化学療法（例えば、アブラキサン、アドリアマイシン、カルボプラチン、サイトキサン、ダウノルビシン、ドキシル、エレンス、フルオロウラシル、ジェムザール、ヘラベン、ｌｘｅｍｐｒａ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミコキサントロン（ｍｉｃｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ナベルビン、タクソール、タキソテール、チオテパ、ビンクリスチン、及びキセロダ）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、及びレトロゾール）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、及び／もしくはトレミフェン）、血管新生阻害剤（例えばベバシズマブ）、ならびに／またはリツキシマブによる治療よりも、ＲＡＤ１９０１の治療に対してより感受性がある。

【0032】

本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または退縮の方法のある特定の実施形態では、本方法は、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩を投与する前に、患者がＥＲαを発現する腫瘍を有するかどうかを決定するステップをさらに含む。本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または退縮の方法のある特定の実施形態では、本方法は、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩を投与する前に、患者が変異体ＥＲαを発現する腫瘍を有するかどうかを決定するステップをさらに含む。本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または退縮の方法のある特定の実施形態では、本方法は、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩を投与する前に、患者がフルベストラント治療に応答するまたは応答しないＥＲαを発現する腫瘍を有するかどうかを決定するステップをさらに含む。これらの決定は、当該技術分野で周知である発現の検出のうちのいずれかの方法を用いて行われ得、対象から摘出された腫瘍または組織試料を用いてインビトロで行われ得る。

【0033】

野生型ＥＲαを発現する腫瘍において腫瘍成長を阻害するＲＡＤ１９０１の能力を示すことに加えて、本明細書に提供される結果は、ＲＡＤ１９０１がＥＲαの変異型、すなわちＹ５３７Ｓ ＥＲαを発現する腫瘍の成長を阻害する予期しない能力を示したことを示す（実施例Ｉ（Ａ））。ＥＲα変異の例のコンピュータモデリング評価は、例えば、Ｙ５３７Ｘ変異体（式中、Ｘが、Ｓ、Ｎ、またはＣである）を有するＥＲα、Ｄ５３８Ｇ変異体を有するＥＲα、及びＳ４６３Ｐ変異体を有するＥＲαからなる群から選択される１種以上の変異体を有するＥＲαのような、これらの変異のいずれも、リガンド結合ドメインに影響を与えるか、またはＲＡＤ１９０１結合を特異的に妨げることが期待されなかったことを示した（実施例Ｖ（Ａ））。これらの結果に基づいて、対象に、治療上有効量の、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩を投与することによって、癌に罹患している対象において、Ｙ５３７Ｘ_１（式中、Ｘ_１が、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｘ_２（式中、Ｘ_２が、ＲまたはＱである）、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、特にＹ５３７Ｓ ＥＲαからなる群から選択される、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）内に１種以上の変異体を有するＥＲαに対して陽性である腫瘍の成長を阻害するか、またはその退縮を生じるための方法が、本明細書に提供される。本明細書に使用される「変異体ＥＲα」は、ＥＲαのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる、１つ以上の置換または欠失を含むＥＲα、及びそれらのバリアントを指す。

【0034】

動物異種移植片モデルにおける乳癌腫瘍成長を阻害することに加えて、本明細書に開示される結果は、ＲＡＤ１９０１が、腫瘍細胞内に有意な蓄積を示し、血液脳関門を通過することができることを示す（実施例ＩＩ）。血液脳関門を通過する能力は、ＲＡＤ１９０１の投与が、脳転移異種移植片モデルにおいて有意に生存期間の延長を示すことによって確認された（実施例Ｉ（Ｂ））。したがって、本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または退縮の方法のある特定の実施形態では、標的とされるＥＲα陽性腫瘍は、脳または中枢神経系の他の場所に位置する。ある特定のこれらの実施形態では、ＥＲα陽性腫瘍は、主として脳癌と関連している。他の実施形態では、ＥＲα陽性腫瘍は、主として、別の組織または臓器から遊走してきた乳部、子宮、卵巣、または下垂体癌等の別のタイプの癌と関連している転移性腫瘍である。ある特定のこれらの実施形態では、腫瘍は、乳癌脳転移（ＢＣＢＭ）等の脳転移である。本明細書に開示される方法のある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物は、標的腫瘍内の１つ以上の細胞に蓄積する。

【0035】

本明細書に開示される方法のある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、好ましくは、約１５以上、約１８以上、約１９以上、約２０以上、約２５以上、約２８以上、約３０以上、約３３以上、約３５以上、約４０以上のＴ／Ｐ（腫瘍中のＲＡＤ１９０１濃度／血漿中のＲＡＤ１９０１濃度）比で腫瘍に蓄積する。

【0036】

本明細書に提供される結果は、ＲＡＤ１９０１投与が卵巣摘出ラットにおける骨量の減少を防ぐことを示す（実施例ＩＶ（Ａ））。したがって、本明細書に提供される腫瘍成長の阻害または退縮の方法のある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、例えば、治療された対象の骨体積密度、骨表面密度、骨ミネラル濃度、骨梁数、骨梁幅、骨梁中心距離、連結密度、及び／または見掛け骨密度への望ましくない効果を含む、骨への望ましくない効果を有さない。ＲＡＤ１９０１は、骨粗鬆症または骨粗鬆症のより高いリスクを有する患者において有用であり得る。タモキシフェンは、閉経前の女性において骨喪失と関連し得、作用機序により骨構造を害し得る。ＲＡＤ１９０１は、閉経前の女性及び／またはタモキシフェンもしくは抗エストロゲン療法に耐性を示す腫瘍において特に有用であり得る。

【0037】

本明細書に提供される結果は、ＲＡＤ１９０１が卵巣摘出ラットにおける子宮組織のエストラジオール刺激を拮抗することを示す（実施例ＩＶ（Ａ））。さらに、２００ｍｇまたは最大５００ｍｇの用量のＲＡＤ１９０１で１日１回治療したヒト対象において、ＥＲを有意に発現しなかった子宮、筋肉、及び骨組織に対する標準取り込み値（ＳＵＶ）は、治療前及び治療後のシグナルにおいてほとんど変化を示さなかった（実施例ＩＩＩ（Ａ））。したがって、ある特定の実施形態では、かかる投与はまた、例えば、子宮、筋肉、または乳部組織を含む、他の組織への望ましくない効果をもたらさない。

【0038】

本明細書に開示される方法で用いるための治療上有効量のＲＡＤ１９０１は、特定の時間間隔にわたって投与される場合、１つ以上の治療的基準の達成（例えば、腫瘍成長を遅らせるまたは停止すること、腫瘍退縮を生じさせること等）をもたらす量である。理想的には、治療上有効量は、治療を受けた対象の５０％以上が吐き気またはさらなる薬物投与を阻む他の毒性反応を経験する最大耐性用量を超えない。治療上有効量は、様々な症状、性別、年齢、体重の範囲、または対象の一般的健康、投与モード及び塩または溶媒和物タイプ、薬物に対する感受性の変動、特定のタイプの疾患等を含む、様々な要因に応じて対象において変動し得る。

【0039】

本明細書に開示される方法で用いるためのＲＡＤ１９０１の治療上有効量の例としては、耐性ＥＲ駆動腫瘍または癌に罹患している対象において、１日１回、約１５０～約１，５００ｍｇ、約２００～約１，５００ｍｇ、約２５０～約１，５００ｍｇ、または約３００～約１，５００ｍｇの投与量、野生型ＥＲ駆動腫瘍及び／または癌ならびに耐性腫瘍及び／または癌の両方を有する対象において、１日１回、約１５０～約１，５００ｍｇ、約２００～約１，０００ｍｇ、約２５０～約１，０００ｍｇ、または約３００～約１，０００ｍｇの投与量、主に野生型ＥＲ駆動腫瘍及び／または癌を有する対象において、１日１回、約３００～約５００ｍｇ、約３００～約５５０ｍｇ、約３００～約６００ｍｇ、約２５０～約５００ｍｇ、約２５０～約５５０ｍｇ、約２５０～約６００ｍｇ、約２００～約５００ｍｇ、約２００～約５５０ｍｇ、約２００～約６００ｍｇ、約１５０～約５００ｍｇ、約１５０～約５５０ｍｇ、または約１５０～約６００ｍｇの投与量が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、成人対象において、現在開示されている方法で用いるためのＲＡＤ１９０１またはそれらの溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩の投与量は、１日１回、約２００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、３０ｍｇ～２，０００ｍｇ、１００ｍｇ～１，５００ｍｇ、または１５０ｍｇ～１，５００ｍｇの経口投与であり得る。この１日投与量は、単回投与または複数回投与を介して達成され得る。

【0040】

耐性株ならびに変異体受容体（複数可）を発現する例を含む乳癌の治療の際のＲＡＤ１９０１の投与量は、１日当たり１００ｍｇ～１，０００ｍｇの範囲内である。例えば、ＲＡＤ１９０１は、１日当たり１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍｇで投与され得る。特に、１日当たり２００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、及び１，０００ｍｇが、知られている。経口投与後のヒトにおいて、驚くほど半減期が長いＲＡＤ１９０１が、特に実行可能なこの選択肢を作成する。したがって、薬物は、１日２回、２００ｍｇ（１日当たり合計４００ｍｇ）、１日２回、２５０ｍｇ（１日当たり合計５００ｍｇ）、１日２回、３００ｍｇ（１日当たり合計６００ｍｇ）、１日２回、４００ｍｇ（１日当たり８００ｍｇ）、または１日２回、５００ｍｇ（１日当たり合計１，０００ｍｇ）投与され得る。好ましくは、投与は経口である。

【0041】

ある特定の実施形態では、癌または腫瘍は、耐性ＥＲ駆動型癌または腫瘍（例えば、変異体ＥＲ結合ドメイン（例えば、Ｙ５３７Ｘ_１（式中、Ｘ_１が、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｘ_２（式中、Ｘ_２が、ＲまたはＱである）、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、１種以上の変異を含むＥＲα）を有する）であり、ＥＲまたは腫瘍及び／もしくは癌の増殖の過剰発現体がリガンド非依存性になるか、またはＳＥＲＤ（例えば、フルベストラント、ＴＡＳ－１０８（ＳＲ１６２３４）、ＺＫ１９１７０３、ＲＵ５８６６８、ＧＤＣ－０８１０（ＡＲＮ－８１０）、ＧＷ５６３８／ＤＰＣ９７４、ＳＲＮ－９２７、ＩＣＩ１８２７８２、及びＡＺＤ９４９６）、Ｈｅｒ２阻害剤（例えば、トラスツズマブ、ラパチニブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、及び／もしくはペルツズマブ）、化学療法（例えば、アブラキサン、アドリアマイシン、カルボプラチン、サイトキサン、ダウノルビシン、ドキシル、エレンス、フルオロウラシル、ジェムザール、ヘラベン、ｌｘｅｍｐｒａ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミコキサントロン（ｍｉｃｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ナベルビン、タクソール、タキソテール、チオテパ、ビンクリスチン、及びキセロダ）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、及びレトロゾール）、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、及び／もしくはトレミフェン）、血管新生阻害剤（例えばベバシズマブ）、ならびに／またはリツキシマブの治療で進行する腫瘍及び／または癌である。

【0042】

現在開示されている方法で用いるためのＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、対象に１回または複数回投与され得る。化合物が複数回投与されるこれらの実施形態では、それらは、一連の間隔、例えば、毎日、隔日、毎週、または毎月投与され得る。あるいは、それらは、例えば、症状、患者の健康状態等に基づいて、必要に応じて、不規則な間隔で投与され得る。

【0043】

現在開示されている方法で用いるためのＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、単一剤形に製剤化され得、治療を受けている対象のための単一投与量として好適な物理的に別々の単位を意味し、各単位は、任意に、好適な薬学的担体と関連して、所望の治療効果を生じるように計算された活性材料の予め決定された量を含有する。単位剤形は、単一の１日用量または複数の１日用量（例えば、１日１回、約１～４回またはそれ以上）のうちの１つであり得る。複数の１日用量が使用される場合、単位剤形は、各用量について同じであってもよく、または異なっていてもよい。ある特定の実施形態では、本化合物は、制御放出のために製剤化され得る。

【0044】

現在開示されている方法で用いるためのＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、任意の利用可能な従来の方法に従って製剤化され得る。好ましい剤形の例としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等が挙げられる。製剤化には、希釈剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、香味剤、及び必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤のような通常用いられる添加剤を使用することができる。加えて、製剤化はまた、従来の方法に従って、一般に薬学的製剤の原料として用いられる成分を混合することによって行われる。これらの組成物の例には、例えば、（１）大豆油、牛脂、及び合成グリセリド等の油、（２）流動パラフィン、スクアラン、及び固形パラフィン等の炭化水素、（３）ミリスチン酸オクチルドデシル及びミリスチン酸イソプロピル等のエステル油、（４）セトステアリルアルコール及びベヘニルアルコール等の高級アルコール、（５）シリコーン樹脂、（６）シリコーン油、（７）ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、固形ポリオキシエチレンヒマシ油、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤、（８）ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びメチルセルロース等の水溶性高分子、（９）エタノール及びイソプロパノール等の低級アルコール、（１０）グリセロール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、及びソルビトール等の多価アルコール、（１１）グルコース及びスクロース等の糖類、（１２）無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、及びケイ酸アルミニウム等の無機粉末、（１３）精製水等が含まれる。上の製剤で用いるための添加剤には、例えば、１）希釈剤として、ラクトース、コーンスターチ、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、結晶セルロース、及び二酸化ケイ素、２）結合剤として、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガカント、ゼラチン、セラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール－ポリオキシエチレン－ブロックコポリマー、メグルミン、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン等、３）崩壊剤として、デンプン、寒天、ゼラチン粉末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、カルボキシメチルセルロース／カルシウム等、４）滑沢剤として、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等、５）添加が薬学的に許容される着色剤として十分である任意の着色剤、６）香味剤として、ココアパウダー、メントール、アロマタイザー、ハッカ油、及びシナモンパウダー、７）アスコルビン酸またはアルファ－トフェノール等の添加が薬学的に許容される抗酸化剤が含まれ得る。

【0045】

現在開示されている方法で用いるためのＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩は、本明細書に記載される活性化合物のうちの任意の１つ以上及び生理学的に許容される担体（薬学的に許容される担体または溶液または希釈剤とも称される）として薬学的組成物に製剤化され得る。かかる担体及び溶液には、本発明の方法で使用されたＲＡＤ１９０１の薬学的に許容される塩及び溶媒和物、ならびにかかる化合物のうちの２つ以上、該化合物の薬学的に許容される塩、及び該化合物の薬学的に許容される溶媒和物を含む混合物が含まれる。かかる組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような許容される薬学的手順に従って調製される。

【0046】

「薬学的に許容される担体」という用語は、患者においてアレルギー反応または他の不都合な反応を生じず、該患者に投与され、製剤中の他の材料と混合可能である、担体を指す。薬学的に許容される担体は、例えば、目的の投与形態に対して適当に選択され、かつ従来の薬務と一致する、薬学的希釈剤、賦形剤、または担体を含む。例えば、固体担体／希釈剤としては、ガム、デンプン（例えば、コーンスターチ、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース系材料（例えば微結晶性セルロース）、アクリレート（例えばポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体は、湿潤剤または乳化剤、治療剤の貯蔵期間または有効性を増強する保存剤または緩衝剤等の少量の補助物質をさらに含み得る。

【0047】

ＲＡＤ１９０１は、遊離形態で、従来の方法によって塩に変換され得る。本明細書に使用される「塩」という用語は、塩がＲＡＤ１９０１で形成され、薬理学的に許容される限り、限定されず、塩の好ましい例には、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸性塩（例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（例えば、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（例えば、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、第４級アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩等）等が含まれる。加えて、塩酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩等は、本発明に従って化合物の「薬理学的に許容される塩」として好ましい。

【0048】

ＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩及び／または第２の治療剤（複数可）（例えばエベロリムス）の異性体（例えば、幾何異性体、光学異性体、回転異性体、互変異性体等）は、例えば、再結晶化、ジアステレオマー塩法等の光学的分解能、酵素分画法、様々なクロマトグラフ法（例えば、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガラスクロマトグラフィー等）を含む通常の分離方法を用いて、単一異性体に精製することができる。本明細書において「単一異性体」という用語は、１００％の純度を有する異性体だけでなく、従来の精製操作を通してでさえ存在する、標的物以外の異性体を含有する異性体も含む。結晶多形は、時には、ＲＡＤ１９０１またはその塩に対して存在し、そのすべての結晶多形は、本発明に含まれる。結晶多形は、時には、単一であり、時には、混合物であり、その両方が、本明細書に含まれる。

【0049】

ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１は、その活性型を達成するために、いくつかの変化（例えば酸化または加水分解）しなければならないことを意味する、プロドラッグ形態であり得る。あるいは、ＲＡＤ１９０１は、親プロドラッグのその活性型への変化によって生成される化合物であり得る。

【0050】

ある特定の実施形態では、本明細書に提供される腫瘍成長の阻害の方法は、対象を遺伝子プロファイリングすることをさらに含み、プロファイリングされた遺伝子は、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＳＸＬ１、ＡＴＭ、ＡＵＲＫＡ、ＢＡＰ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤＨ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＤＤＲ２、ＤＮＭＴ３Ａ、Ｅ２Ｆ３、ＥＧＦＲ、ＥＭＬ４、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＳＲ１、ＥＷＳＲ１、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＦＲＳ２、ＨＩＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＪＡＫ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＲＰ１Ｂ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＧＭＴ、ＭＬＬ、ＭＰＬ、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＫＸ２－１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＯＳ１、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＯＸ２、ＳＴＫ１１、ＴＥＴ２、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、及びＶＨＬから選択される１つ以上の遺伝子である。

【0051】

いくつかの実施形態では、本発明は、サブ集団の乳癌患者を治療する方法であって、当該サブ集団が、以下の遺伝子のうちの１つ以上の発現を増加する、治療する方法と、本開示に記載される投与の実施形態に従って、有効用量のＲＡＤ１９０１（または組み合わせ）で当該サブ集団を治療する方法と、を提供する。

【0052】

ＲＡＤ１９０１の腫瘍成長を阻害する能力を構築することに加えて、本明細書に提供される結果は、ＲＡＤ１９０１が、子宮及び下垂体においてＥＲへのエストラジオール結合を阻害することを示す（実施例ＩＩＩ（Ａ））。これらの実験において、子宮及び下垂体組織においてＥＲへのエストラジオール結合は、ＦＥＳ－ＰＥＴ画像化によって評価された。ＲＡＤ１９０１による治療後、ＥＲ結合の観察されたレベルは、バックグラウンドレベルでまたはそのレベルを下回った。これらの結果は、ＥＲ活性へのＲＡＤ１９０１の拮抗効果は、リアルタイムの走査を用いて評価され得る。これらの結果に基づいて、結合の減少または消失が有効性を示す、１つ以上の標的組織においてエストラジオール－ＥＲ結合を測定することによって、ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物で治療の有効性をモニタリングするための方法が、本明細書に提供される。

【0053】

エストラジオール－ＥＲ結合に基づいて、ＲＡＤ１９０１または塩もしくは溶媒和物の投与量を調節する方法が、さらに提供される。これらの方法のある特定の実施形態では、結合は、第１の投与量の化合物のうちの１つ以上の投与後のいくつかの時点で測定される。エストラジオール－ＥＲ結合が影響を及ぼさないか、または予め決定された閾値を下回る減少（例えば、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、または５０％未満のベースラインに対する結合の減少）を示す場合、第１の投与量は、低すぎると見なされる。ある特定の実施形態では、これらの方法は、増加した第２の投与量の化合物を投与するさらなるステップを含む。これらのステップを繰り返して、エストラジオール－ＥＲ結合の所望の低下が達成されるまで、投与量を繰り返し増加させることができる。ある特定の実施形態では、これらのステップは、本明細書に提供される腫瘍成長を阻害する方法に組み込まれ得る。これらの方法において、エストラジオール－ＥＲ結合は、腫瘍成長の阻害の代用、または成長の阻害を評価する補助手段としての役割を果たし得る。他の実施形態では、これらの方法は、例えば、癌細胞増殖の阻害を含む、腫瘍成長の阻害以外の目的のために、ＲＡＤ１９０１の投与と併用して使用することができる。

【0054】

ある特定の実施形態では、ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）の投与量を調節するために本明細書に提供される方法は、
（１）第１の投与量のＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩（例えば、約３５０～約５００ｍｇ、または約２００～約６００ｍｇ／日）を、３、４、５、６、または７日間投与することと、
（２）エストラジオール－ＥＲ結合活性を、例えば、本明細書に開示されるＦＥＳ－ＰＥＴ画像化を用いて検出することであって、
（ｉ）ＥＲ結合活性が、検出不可能である、または予め決定された閾値レベルを下回る場合、第１の投与量を継続して投与する（すなわち、投与量レベルを維持する）こと、または
（ｉｉ）ＥＲ結合活性が、検出可能である、または予め決定された閾値レベルを上回る場合、第１の投与量よりも多い第２の投与量（例えば、第１の投与量＋約５０～約２００ｍｇ）を３、４、５、６、または７日間投与し、次いで、ステップ（３）に進むこと、
（３）エストラジオール－ＥＲ結合活性を、例えば、本明細書に開示されるＦＥＳ－ＰＥＴ画像化を用いて検出することであって、
（ｉ）ＥＲ結合活性が、検出不可能である、または予め決定された閾値レベルを下回る場合、第２の投与量を継続して投与する（すなわち、投与量レベルを維持する）こと、または
（ｉｉ）ＥＲ結合活性が、検出可能である、または予め決定された閾値レベルを上回る場合、第２の投与量よりも多い第３の投与量（例えば、第２の投与量＋約５０～約２００ｍｇ）を３、４、５、６、または７日間投与し、次いで、ステップ（４）に進むこと、
（４）ＥＲ結合活性が検出されなくなるまで、第４の投与量、第５の投与量等を通して、上のステップを繰り返すこと、を含む。

【0055】

ある特定の実施形態では、本発明は、ＥＲ感受性またはＥＲ耐性癌を検出及び／または投与するために、ＰＥＴ画像化の使用を含む。

【0056】

本明細書に開示されるＲＡＤ１９０１またはその溶媒和物（例えば水和物）もしくは塩の投与経路としては、局所投与、経口投与、皮内投与、筋肉投与、腹腔内投与、静脈内投与、膀胱腔内注入、皮下投与、経皮投与、及び経粘膜投与が挙げられるが、これらに限定されない。

【0057】

ＲＡＤ１９０１－ＥＲαの相互作用
（１）内分泌療法のうちの少なくとも１つの方針を受けている患者からのＥＲ陽性乳癌腫瘍試料中の変異体ＥＲα
過去２年間に報告された５つの研究において、内分泌療法のうちの少なくとも１つの方針を受けている患者からの合計１８７の転移性ＥＲ陽性乳癌腫瘍試料が、配列決定され、ＥＲ ＬＢＤ変異が、３９人の患者（２１％）において特定された（Ｊｅｓｅｌｓｏｈｎ）。３９人の患者の中で、６つの最も頻繁なＬＢＤ変異を、図４２に示される、Ｊｅｓｅｌｓｏｈｎから適合されたスキーム１を示す。

【0058】

すべてのＬＢＤ変異の頻度を、表１１に要約する。

【0059】

コンピュータモデリングは、ＲＡＤ１９０１－ＥＲαの相互作用が、ＥＲαのＬＢＤの変異体、例えばＹ５３７Ｘ変異体（式中、Ｘが、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、及びＳ４６３Ｐによって影響を受ける可能性が低いことを示し、これは、内分泌療法のうちの少なくとも１つを施した患者からの転移性ＥＲ陽性乳房の腫瘍試料の最近の研究に見出されたＬＢＤ変異の約８１．７％を占める（表１１、実施例Ｖ）。

【0060】

ＥＲα及び／または変異体ＥＲαと結合するＲＡＤ１９０１の複合体及び結晶が、本明細書に提供され、変異体ＥＲαは、Ｙ５３７Ｘ_１（式中、Ｘ_１が、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｘ_２（式中、Ｘ_２が、ＲまたはＱである）、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の変異を含む。

【0061】

本明細書に提供される方法のある特定の実施形態では、ＥＲα及び変異体ＥＲαのＬＢＤは、ＡＦ－２を含む。他の実施形態では、ＬＢＤは、ＥＲαのアミノ酸２９９～５５４を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。ある特定の実施形態では、変異体ＥＲαのＬＢＤは、Ｙ５３７Ｘ_１（式中、Ｘ_１が、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、Ｌ５３６Ｘ_２（式中、Ｘ_２が、ＲまたはＱである）、Ｐ５３５Ｈ、Ｖ５３４Ｅ、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ３９２Ｉ、Ｅ３８０Ｑ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の変異を含む。本明細書に使用される「及び／または」という用語は、「及び」の場合と「または」の場合の両方を含む。

【0062】

以下の実施例は、請求された発明をよりよく例証するために提供され、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。特定の材料が言及される程度では、それは、単に例証の目的のためであり、及び本発明を限定することを意図しない。当業者は、発明能力の行使なしで、及び本発明の範囲を逸脱しない範囲で、均等な手段または反応を開発するであろう。多くの変更が、本明細書に記載される手順でなされ得るが、一方、依然として本発明の範囲内で維持されることを理解されよう。かかる変更が、本発明の範囲内に含まれることが本発明者らの意図である。

【実施例】

【0063】

材料及び方法
試験化合物
以下の実施例に使用されるＲＡＤ１９０１は、ＩＲＩＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって製造された（６Ｒ）－６－（２－（Ｎ－（４－（２－（エチルアミノ）エチル）ベンジル）－Ｎ－エチルアミノ）－４－メトキシフェニル）－５，６，７，８－テトラヒドロナフタレン－２－オール二塩酸塩であった（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＳＣ）。ＲＡＤ１９０１は、乾燥粉末として保存され、脱イオン水中の０．５％（ｗ／ｖ）メチルセルロース中の均一の懸濁液として使用するために製剤化され、動物モデルにおいては、経口投与によって投与された。タモキシフェン、ラロキシフェン、及びエストラジオール（Ｅ２）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られ、皮下注射によって投与された。フルベストラントは、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得られ、皮下注射によって投与された。その他の実験試薬は、別途記述がない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0064】

細胞株
ＭＣＦ－７細胞（ヒト乳房転移性腺癌）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン及び１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充した、２ｍＭのＬ－グルタミン及びＥａｒｌｅのＢＳＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するフェノールレッドフリーの最小必須培地（ＭＥＭ）中で、通常、５％ＣＯ_２で維持した。

【0065】

Ｔ４７Ｄ細胞を、１０％ＦＢＳ及び５μｇ／ｍＬのヒトインスリンを補充したＲＰＭＩ増殖培地中で約７５％コンフルエントになるまで１０ｃｍの皿中で５％ＣＯ_２インキュベーターで培養した。

【0066】

インビボでの異種移植片モデル
すべてのマウスを、明暗周期（人工光の１２～１４時間の概日周期）ならびに制御された室温及び湿度下で、不断で滅菌食及び水へのアクセスする、滅菌した埃のない寝わらの塊（ｂｅｄｄｉｎｇ ｃｏｂ）を有する個々に換気したケージの中に無菌ハウジングに収容した。腫瘍は、ノギスで週２回測定し、体積は、式：（Ｌ＊Ｗ^２）＊０．５２を用いて計算した。

【0067】

ＰＤｘモデル
患者由来の異種移植片モデル（ＰＤｘモデル）のいくつかの例を、図１に示す。患者由来の乳癌腫瘍を有するＰＤｘモデルは、腫瘍の不均一性を維持するために、動物（無胸腺ヌードマウス（Ｎｕ（ＮＣＦ）－Ｆｏｘｎ１ｎｕ））において、限定された回数、連続継代している生存ヒト腫瘍組織または液体から構築された。前試験腫瘍体積は、その推定された開始日より約１週間前に開始する各実験で記録した。腫瘍がおよそ腫瘍体積開始（ＴＶＩ）の範囲（１５０～２５０ｍｍ^３）に達したとき、動物を治療及び対照群にランダム化し、投与を開始し（０日目、各群において８～１０匹）、すべての試験における動物は各実験において個々に従った。投与開始は、０日目に開始、すべての群の動物は、体重別に投与した（１グラム当たり０．０１ｍＬ、１０ｍｌ／ｋｇ）。各群は、０日目から特定されるように、ビヒクル（対照、経口投与／エンドポイントまで１日１回）、タモキシフェン（１ｍｇ／対象、皮下注射／エンドポイントまで１日毎）、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標）；必要に応じて、１ｍｇ／対象または３ｍｇ／対象、皮下注射／週×５、必要に応じて延長）、またはＲＡＤ１９０１（３０または６０または１２０ｍｇ／対象のｋｇ、経口投与／エンドポイントまで１日１回）で治療した。治療期間は、モデルに応じて、５６～６０日間続いた。これらのＰＤｘモデルのための飲料水に、１７β－エストラジオールを補充した。

【0068】

薬剤の有効性
すべての試験において、０日目に開始し、腫瘍寸法を、各群に対して記録された個々の及び平均の推定された腫瘍体積（平均ＴＶ±標準誤差）を含むデジタルキャリパーによって測定し、腫瘍体積を、式（Ｙａｓｕｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ １７：２５９－２６９（１９９７）、これは参照により本明細書に組み込まれる）：ＴＶ＝幅^２×長さ×０．５２を用いて計算した。腫瘍体積（ＴＶ）エンドポイントに達したらすぐに、各群または試験を終了し（時間エンドポイントは、６０日であり、体積エンドポイントは、群平均２ｃｍ^３であった）、２ｃｍ^３以上の腫瘍体積に達する個々のマウスは、試験から除外し、最終測定は、平均が体積エンドポイントに達するかまたは試験が時間エンドポイントに達するまで群平均に含まれた。

【0069】

有効性の計算及び統計学的分析
腫瘍成長阻害（％）（ＴＧＩ（％））値は、単一時点で計算し（対照群が腫瘍体積または時間エンドポイントに達したとき）、式によって初期（ｉ）及び最終（ｆ）腫瘍測定を用いて各治療群（Ｔ）対対照（Ｃ）について報告した（Ｃｏｒｂｅｔｔ ＴＨ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｉｎ： Ｔｅｉｃｈｅｒ Ｂ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ．Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ．２００４：９９－１２３．）：ＴＧＩ（％）＝１－Ｔｆ－Ｔｉ／Ｃｆ－Ｃｉ。

【0070】

統計学
ＴＧＩ試験－一元配置分散分析＋Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定（Ｃｏｒｂｅｔｔ ＴＨら）。

【0071】

試料採集
エンドポイントで、腫瘍を除去した。ある断片を急速冷凍し、一方、別の断片を、１０％ ＮＢＦ中に少なくとも２４時間入れ、ホルマリン固定パラフィン包埋した（ＦＦＰＥ）。急速冷凍した試料を、－８０℃で保存し、ＦＦＰＥブロックを、室温で保存した。

【0072】

ウェスタンブロット
細胞を採取し、タンパク質発現を、標準的技法を用いて分析した。腫瘍を、投与の最終日後に指示された時点で採取し、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。等量のタンパク質を、ＭＷによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、標準的技法を用いて以下の抗体でブロットした：
●エストロゲン受容体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ（ＨＣ－２０）；ｓｃ－５４３）
●プロゲステロン受容体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；３１５３）
●ビンキュリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ｖ９１３１）

【0073】

ｑＰＣＲ分析を、次のように行った：細胞を採取し、ｍＲＮＡを抽出し、等量が、プロゲステロン受容体、ＧＲＥＢ１、及びＴＦＦ１（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）に特異的なプライマーを有するｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲのために使用した。バンドは、１Ｄ Ｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）を用いて定量化した。

【0074】

免疫組織化学
腫瘍を採取し、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。包埋した腫瘍を切断し（６μＭ）、ＥＲ、ＰＲ、及びＨｅｒ２に特異的な抗体で染色した。定量化を以下の通りに行った：５つの分野を、陽性細胞（０～１００％）及び染色強度（０～３＋）について計数した。Ｈスコア（０～３００）を、以下の式：陽性（％）＊強度、を用いて計算した。

【0075】

実施例Ｉ．ＲＡＤ１９０１は、異なる事前内分泌療法を用いて、ＷＴ ＥＲまたは変異体ＥＲ（例えばＹ５３７Ｓ）を発現する腫瘍及び／または癌において腫瘍成長を阻害した。

【0076】

Ｉ（Ａ）．動物異種移植片モデルにおけるＲＡＤ１９０１の有効性
Ｉ（Ａ）（ｉ）ＲＡＤ１９０１は、ＥＲ状態及び事前内分泌療法にもかかわらず、ＰＤｘモデル（ＰＤｘ－１～ＰＤｘ－１２）において腫瘍成長を阻害した。

【0077】

図１は、ＲＡＤ１９０１単独で治療したマウスにおける様々なＰＤｘモデルにおいて腫瘍成長の阻害を実証する。１２の患者由来の異種移植片モデルをスクリーニングして、様々なレベルのＥＲ、ＰＲ、及びＨｅｒ２を有する様々な遺伝的バッググラウンドにおけるＲＡＤ１９０１反応を試験した。ｎ＝８～１０を有する、「＊」の印が付いたＰＤｘモデル（ＰＤｘ－１～ＰＤｘ－４、及びＰＤｘ－１２）に対して、完全有効性試験を行った。これらのＰＤｘモデルを、６０ｍｇ／ｋｇの用量のビヒクル（陰性対照）またはＲＡＤ１９０１で、１日１回経口投与で６０日間治療した。スクリーニング試験は、９０ｍｇ／ｋｇの投与量のビヒクル（陰性対照）またはＲＡＤ１９０１を１日１回経口投与で６０日間治療した、ｎ＝３を有する他のＰＤｘモデル（ＰＤｘ－５～ＰＤｘ－１１）に対して行われた。図１で示されるように、ＥＲ及びさらなるドライバー（例えばＰＲ＋及び／またはＨｅｒ２＋）で成長を引き起こしたＰＤｘモデルに対して、ＲＡＤ１９０１治療が有効であった。ＲＡＤ１９０１は、前治療、ナイーブ（Ｒｘ－陰性）、またはアロマターゼ阻害剤、タモキシフェン（ｔａｍ）、化学療法（ｃｈｅｍｏ）、Ｈｅｒ２阻害剤（Ｈｅｒ２ｉ、例えばトラスツズマブ、ラパチニブ）、ベバシズマブ、フルベストラント、及び／もしくはリツキシマブのいずれかの治療にもかかわらず、ＥＲ変異及び／または高いレベルの発現のＨｅｒ２（ＰＤｘ）を有するモデルにおいて腫瘍成長を阻害する際に有効であった。

【0078】

Ｉ（Ａ）（ｉｉ）ＲＡＤ１９０１は、ＷＴ ＥＲを発現する異種移植片モデルにおいて退縮を引き起こした。

【0079】

Ｉ（Ａ）（ｉｉ）（１）ＲＡＤ１９０１は、フルベストラント治療に反応したＭＣＦ－７異種移植片において、退縮を引き起こした。

【0080】

ＭＣＦ－７異種移植片モデル－Ｉ
ＲＡＤ１９０１の抗癌効果は、腫瘍成長を刺激するためにエストラジオール投与を有する雌胸腺欠損ヌードマウス（対照：ＮＵ（ＮＣｒ）－Ｆｏｘｎ１ｎｕ）における第１のＭＣＦ－７異種移植片モデル（ＭＣＦ－７異種移植片モデル－Ｉ）を用いて試験した。腫瘍細胞移植の３日前に、エストロゲンペレット（０．３６ｍｇのＥ２、６０日の放出；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を、滅菌套管針を用いてすべての試験動物の肩甲骨間に皮下移植した。ＭＣＦ－７ヒト乳腺癌細胞は、１０％ ウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭ グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０７５％ 重炭酸ナトリウム、及び２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地内で中間ログ相まで培養した。腫瘍細胞移植日に、ＭＣＦ－７細胞をトリプシン化し、ペレット化し、５×１０^７細胞／ｍＬの濃度で、リン酸緩衝生理食塩水中で再懸濁した。各試験マウスは、１×１０^７ ＭＣＦ－７細胞を右脇腹に皮下移植され、腫瘍成長をモニタリングした。必要に応じて、腫瘍重量は、１ｍｍ^３の腫瘍体積が１ｍｇの腫瘍湿重量に相当するという仮定に基づいて、推定された。体重は、ＭＣＦ－７細胞移植後に５日間、１日１回測定し、次いで、試験の残りを通じて週２回測定した。

【0081】

腫瘍細胞移植から１４日後に（試験の１日目と表される）、マウスは、２１．４～３２．５グラムの範囲に及ぶ体重を有する９週齢であり、個々の腫瘍体積は、７５～１４４ｍｍ^３の範囲に及び、１０８ｍｍ^３の群平均腫瘍体積（ＭＴＶ）であった。マウスを、１５匹ずつの動物の９つの群にランダム化し、ビヒクル経口投与、タモキシフェン（１ｍｇ／動物、１日毎皮下注射）、フルベストラント（０．５ｍｇ／動物、１日１回皮下注射）、またはＲＡＤ１９０１（０．３、１、３、１０、３０、６０、９０、及び１２０ｍｇ／ｋｇ １日１回経口投与）で治療した。

【0082】

腫瘍体積は、週２回評価した。腫瘍エンドポイントは、対照群において、１，５００ｍｍ^３のＭＴＶとして定義された。体重測定、及び処置に関連した副作用の臨床症候に関する頻繁な観察により、処置耐性を評価した。１回の測定において３０％を超える、または３回の測定において２５％を超える体重減少を有する動物は、人道的に殺処分し、処置関連死として分類された。許容され得る毒性は、試験期間中で２０％未満の群平均体重損失、及び１０匹の処置動物当たり多くても１匹の処置関連死、または１０％として定義された。試験の終了時に、動物は、イソフルラン麻酔下で末期的心穿刺によって殺処分した。

【0083】

ベースライン（すなわち、１日目）の腫瘍体積と試験終了時（すなわち、４２日目）の腫瘍体積との間の割合の差として定義された、腫瘍成長の阻害（ＴＧＩ）の割合に基づいて、処置成果を評価した。ＴＧＩ分析に対するデータセットは、各群においてすべての動物を含み、処置に関連したまたは処置に関連しなかった原因により死亡したいかなるものを含まない。潜在的な治療活性の閾値は、６０％以上のＴＧＩの処置効果として定義された。結果は、０．０５のあらかじめ特定されたアルファを有する、Ｋｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓまたはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて分析された。

【0084】

３０及び６０ｍｇ／ｋｇの投与量でＲＡＤ１９０１による治療は、有意なＴＧＩ（それぞれ、４０日目で、６６％ＴＧＩ（Ｐ＜０．０５）及び８８％ＴＧＩ（Ｐ＜０．００１））をもたらした。これらの結果は、タモキシフェン（４０日目で、８６％ＴＧＩ）及びフルベストラント（４０日目で、８８％ＴＧＩ）で得られたものと同様であった（図２Ａ）。図２Ａでは、箱は、２５～７５パーセンタイルの観察を表し、線は、観察の中央値を表し、ひげは、極限の観察を表す。

【0085】

より高い用量のＲＡＤ１９０１がこのモデルにおいてより強固な効果を誘発したかどうかを調査するために、ＲＡＤ１９０１の最大１２０ｍｇ／ｋｇまでの投与量を評価した（図２Ｂ～Ｄ）。早期の結果と一致して、ＲＡＤ１９０１は、６０ｍｇ／ｋｇの投与量で有意な腫瘍阻害を誘発した（４２日目で９４％ＴＧＩ、２／１０の部分的退縮を有する）。より高い投与量は、さらに高いＴＧＩ（９０ｍｇ／ｋｇで８／１０のＰＲを有する９７％のＴＧＩ、１２０ｍｇ／ｋｇで７／１０のＰＲを有する９６％のＴＧＩ）をもたらした。試験したすべての投与量で、ＲＡＤ１９０１は、タモキシフェンまたはフルベストラントのいずれよりも高い程度まで腫瘍成長を阻害した。タモキシフェン治療は、９０％のＴＧＩ（２／１０のＰＲを有する）を生じたが、フルベストラント治療は、８７％のＴＧＩ（１／１０のＰＲを有する）をもたらした。９０及び１２０ｍｇ／ｋｇ群でのＲＡＤ１９０１の阻害は、タモキシフェン（Ｐ＜０．０５）及びフルベストラント（Ｐ＜０．０５）の両方と比較して、有意に高かった。

【0086】

全体的に、これらの結果は、ＲＡＤ１９０１が用量依存的様式でエストロゲンで誘発した腫瘍成長を阻害することを示す。ＲＡＤ１９０１で処置したマウスにおいて処置終了の腫瘍体積は、ベースラインと同等であるまたはそれより低く、これは、ＲＡＤ１９０１が腫瘍成長を阻害するだけでなく、マウス異種移植片モデルにおいて腫瘍サイズの退縮も生じさせることができることを示す。

【0087】

ＲＡＤ１９０１は、体重に副作用を伴わずに、すべての投与量レベルで良好な耐性を示した（図２Ｅ）。

【0088】

ＲＡＤ１９０１の抗癌効果は、以下に記載されるように調製された第２のＭＣＦ－７異種移植片（ＭＣＦ－７異種移植片モデル－ＩＩ）を用いてさらに試験した。

【0089】

ＭＣＦ－７異種移植片モデル－ＩＩ
細胞移植の２日前に、Ｂａｌｂ／Ｃ－ヌードマウスを、１７β－エストラジオールペレットで０．１８／９０日の放出でインキュベートした。ＭＣＦ－７細胞（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－）を採取し、１×１０^７細胞を、Ｂａｌｂ／Ｃ－ヌードマウスの右脇腹に皮下移植した。腫瘍は、２００ｍｍ^３の平均を達した場合、マウスを、腫瘍体積別に治療群にランダム化し、試験化合物で治療した。各群は、０日目から特定されるように、ビヒクル（対照、エンドポイントまで１日１回経口投与）、フルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標）；３ｍｇ／対象、週１回皮下注射×５、必要に応じて延長）、ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／対象のｋｇ、エンドポイントまで１日１回経口投与）で治療した。治療期間は、２８日間続いた。

【0090】

図３Ａ～Ｂは、ＭＣＦ－７異種移植片モデル－ＩＩにおいて、ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）は、フルベストラント（３ｍｇ／対象、週１回皮下注射）よりもさらに有意な腫瘍成長の阻害をもたらした。意外にも、フルベストラント治療群において１０匹の対象のうち１匹のみが、試験終了時にわずかな腫瘍退縮を示したが、３０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１治療群において１０匹の対象のうち５匹及び６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１治療群において１０匹の対象のうち８匹が、様々なレベルの退縮を示した（図３Ｂ）。

【0091】

Ｉ（Ａ）（ｉｉ）（２）ＲＡＤ１９０１は、フルベストラント治療に反応したＷＴ ＥＲ ＰＤｘモデル（例えば、ＰＤｘ－４、ＰＤｘ－２、及びＰＤｘ－１１）において腫瘍退縮を引き起こした。

【0092】

異なるＷＴ ＥＲ ＰＤｘモデル（ＰＤｘ－４、ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－、及びＰＤｘ－２モデル、ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、両方とも、治療ナイーブである；ならびにＰＤｘ－１１、ＰＲ＋、Ｈｅｒ２＋、ＡＩ、フルベストラント、及び化学療法で治療した）は、フルベストラント（１ｍｇ／用量または３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）に対して異なった反応を示したが、様々な用量（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、及び／または１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）でのＲＡＤ１９０１治療は、フルベストラントよりもすべてのＰＤｘモデルにおいて、より有意な腫瘍成長の阻害を生じた（ＰＤｘ－４モデルについては図４Ａ、ＰＤｘ－２モデルについては図６、及びＰＤｘ－１１モデルについては図７）。例えば、フルベストラント治療（１ｍｇ／用量）に対して反応したＰＤｘ－４モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１は、意外にも、腫瘍成長を停止した、またはフルベストラント（１ｍｇ／対象）よりもさらに対象において腫瘍退縮を引き起こした（図４Ｂ）。さらに、フルベストラント治療（３ｍｇ／用量）に対して反応したＰＤｘ－１１モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１は、意外にも、治療したすべての対象において、腫瘍成長を停止した、または腫瘍退縮を引き起こしたが、一方、フルベストラント（３ｍｇ／対象）のみが、治療した１０匹の対象のうちの２匹において、退縮を引き起こした（図７Ｂ）。

【0093】

６０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１の経口投与のみが、ＰＤｘ－２モデルにおいて、３ｍｇ／用量のフルベストラントの皮下注射と同様に、腫瘍成長の阻害を達成した（図６）。さらに、ＲＡＤ１９０１とフルベストラントとの組み合わせは、さらなる利益をもたらさなかった。

【0094】

最後に、フルベストラント治療（１ｍｇ／用量、週１回皮下注射）に対して反応したＰＤｘ－４モデルにおいて、ＲＡＤ１９０１の媒介による腫瘍成長の阻害は、ＲＡＤ１９０１治療（３０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）期間が終了したが、エストラジオール治療は継続してから少なくとも２カ月間治療の不在下で維持された（図５）。

【0095】

Ｉ（Ａ）（ｉｉ）（３）ＲＡＤ１９０１は、フルベストラント治療に対してほとんど反応しなかったＷＴ ＥＲ ＰＤｘモデル（例えばＰＤｘ－１２）において、退縮を引き起こした。

【0096】

フルベストラント（１ｍｇ／用量、週１回皮下注射）にほとんど反応しなかったＷＴ ＥＲ ＰＤｘ－１２（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２－、治療ナイーブ）において、様々な用量（３０ｍｇ／ｋｇまたは６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）でのＲＡＤ１９０１治療は、意外にも、ＰＤｘ－１２モデルにおいて腫瘍退縮を生じた（図８）。

【0097】

Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）ＲＡＤ１９０１は、変異体ＥＲ（ＥＲα Ｙ５３７Ｓ）を発現する異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を阻害した、及び／または退縮を引き起こした。

【0098】

Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）（１）ＲＡＤ１９０１は、フルベストラント治療に対してほとんど反応しなかったＰＤｘ－５モデルにおいて、腫瘍成長を阻害した。

【0099】

ＰＤｘ－５モデルは、ＰＤｘモデルについて上述されるように、以下の同様のプロトコルを調製した。各投与群の腫瘍サイズは、ノギスで週２回測定し、体積は、式（Ｌ＊Ｗ２）＊０．５２を用いて計算した。

【0100】

ＲＡＤ１９０１は、フルベストラント治療（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）に対してほとんど反応しなかったＰＤｘ－５モデルにおいて、フルベストラントよりも腫瘍成長の阻害（６０ｍｇ／ｋｇまたは１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）においてより有効であった（図９Ａ～Ｃ）。高用量（１２０ｍｇ／ｋｇ）によるＲＡＤ１９０１治療が、低用量（６０ｍｇ／ｋｇ）によるＲＡＤ１９０１治療よりもより有効であった（図９Ａ～Ｃ）。個々の動物の腫瘍サイズを、それぞれ、１７日目（図９Ｂ）及び５６日目（図９Ｃ）に測定した。

【0101】

Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）（２）ＲＡＤ１９０１は、フルベストラント治療に対して反応したＰＤｘ－６モデルにおいて、退縮を引き起こした。

【0102】

変異体ＥＲ（例えばＹ５３７Ｓ）を発現するＰＤｘモデルは、フルベストラント治療（１ｍｇ／用量、週１回皮下注射）及びタモキシフェン（１ｍｇ／用量、週３回皮下注射）治療、例えばＰＤｘ－６（ＰＲ＋、Ｈｅｒ２：１＋、タモキシフェン、ＡＩ、及びフルベストラントでこれまでに治療を受けた）に反応し得る（図１０Ａ～Ｂ）。ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、及び１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）は、フルベストラント及びタモキシフェンよりも腫瘍成長の阻害においてより有効であった（図１０Ａ～Ｂ）。例えば、ＰＤｘ－６モデルのＲＡＤ１９０１治療は、腫瘍退縮を示したが、一方、フルベストラント治療（１ｍｇ／用量）は、示さなかった（図１０Ｂ、ベースラインからの試験終了時に個々の腫瘍サイズの変化を示す）。

【0103】

Ｉ（Ａ）（ｉｖ）非腫瘍担持マウスに対するフルベストラント治療の薬物動態評価。

【0104】

様々な用量のフルベストラントをマウスに投与し、これらは、対象への有意な用量曝露を示した（図１１）。

【0105】

フルベストラントを、１、３、または５ｍｇ／用量で、ヌードマウスに、１日目（Ｄ１ Ｒｘ）及び８日目（Ｄ８ Ｒｘ、ｎ＝４／用量レベル）に皮下投与した。血液を、２回目の投与から１６８時間まで指示された時点で採血し、遠心分離し、血漿を液体クロマトグラフィー質量分析法で分析した。

【0106】

Ｉ（Ｂ）ＲＡＤ１９０１は、脳転移のマウス異種移植片モデル（ＭＣＦ－７頭蓋内モデル）において生存を助長した。

【0107】

血液脳関門を横断し、腫瘍成長を阻害するＲＡＤ１９０１の潜在能力は、ＭＣＦ－７頭蓋内腫瘍異種移植片モデルを用いてさらに評価された。

【0108】

雌無胸腺ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）－Ｆｏｘｎ１ｎｕ）を、腫瘍異種移植片試験のために使用した。腫瘍細胞移植の３日前に、エストロゲンペレット（０．３６ｍｇのＥ２、６０日の放出；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を、滅菌套管針を用いてすべての試験動物の肩甲骨間に皮下移植した。ＭＣＦ－７ヒト乳腺癌細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭ グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０７５％ 重炭酸ナトリウム、及び２５ｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地内で中間ログ相まで培養した。腫瘍細胞移植日に、細胞をトリプシン化し、ペレット化し、５×１０^７細胞／ｍＬの濃度で、リン酸緩衝生理食塩水中で再懸濁した。各試験マウスに、１×１０^６ ＭＣＦ－７細胞を頭蓋内に移植した。

【0109】

腫瘍細胞移植から５日後に（試験の１日目と表される）、マウスを、１２匹ずつの動物の３つの群にランダム化し、上述のように、ビヒクル、フルベストラント（０．５ｍｇ／動物 １日１回）、またはＲＡＤ１９０１（１２０ｍｇ／ｋｇ １日１回）で治療した。

【0110】

エンドポイントは、死亡率または対照群の３倍の生存率のいずれか早い方として定義された。体重測定、及び処置に関連した副作用の臨床症候に関する頻繁な観察により、処置耐性を評価した。１回の測定において３０％を超える、または３回の測定において２５％を超える体重減少を有する動物は、人道的に殺処分し、処置関連死として分類された。許容され得る毒性は、試験期間中で２０％未満の群平均体重損失、及び１０匹の処置動物の中で多くても１匹の処置関連死、または１０％として定義された。試験の終了時に、動物は、イソフルラン麻酔下で末期的心穿刺によって殺処分した。血漿及び腫瘍中のＲＡＤ１９０１及びフルベストラント濃度は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて決定した。

【0111】

カプランマイヤー生存分析は、ＲＡＤ１９０１がフルベストラントと比較して有意に生存を延ばしたことを示した（Ｐ＜０．０００１；図１２）。対照またはフルベストラント群の動物は、それぞれ、２０日目及び３４日目を超えて生存したものはいなかったが、ＲＡＤ１９０１で処置した動物のうちの４１％（５／１２）が、５４日目の試験終了まで生存した。

【0112】

血漿中のＲＡＤ１９０１の濃度は、７３８±４７１ｎｇ／ｍＬであり、頭蓋内腫瘍では、４６２±１０５ｎｇ／ｇであり、このことは、ＲＡＤ１９０１が血液脳関門を有効に横断することができるという仮説を支持した。対照的に、フルベストラントの濃度は、血漿中（２１±１０ｎｇ／ｍＬ）及び頭蓋内腫瘍中（８．３±０．８ｎｇ／ｇ）で実質的には低かった。

【0113】

Ｉ（Ｃ）．ＥＲ＋進行性乳癌のためのＲＡＤ１９０１治療の第１相試験。

【0114】

第１相試験では、安全性、耐性、及び薬物動態が、４４人の健常な閉経後の女性において評価された。用量を制限する毒性は観察されず、最大耐容量（ＭＴＤ）は構築されなかった。血漿曝露は、試験した用量範囲にわたって用量比例的よりも増加した。

【0115】

対象
進行性乳腺腺癌（ＩＨＣによって１％以上の染色を有するＥＲ＋腫瘍、０または１のＥＣＯＧ一般状態を有するＨＥＲ２陰性腫瘍）を有する８人の閉経後の女性を、この第１相試験の対象として登録した。対象は、以下の前治療を受けていなければならない：
●進行性／転移性の設定において２以下の前化学療法レジメン
●６か月の事前内分泌療法及び事前内分泌療法において進行した
●未治療もしくは症候性ＣＮＳ転移、または以下のウィンドウ内の事前抗癌治療を有する患者は、除外された：
●タモキシフェン＜１回目の用量試験処置から１４日前
●フルベストラント＜１回目の用量試験処置から９０日前
●化学療法＜１回目の用量試験処置から２８日前
●ＬＨＲＨ類似体＜１回目の用量試験処置から１２か月前
ＤＬＴ基準
●３以上のいかなるグレードの非血液学的毒性（最適な薬剤で治療されていない脱毛症及び吐き気、嘔吐、または下痢を含まない）
●３以上のいかなるグレードの血液学的毒性
●７日を超える試験薬物中断をもたらすいかなるグレードの毒性
●用量を制限する毒性の観察期間は、周期１のうち１～２８日である

【0116】

投与及び腫瘍評価
対象は、２００ｍｇまたは４００ｍｇの１日１回経口投与で治療し、疾患の進行まで８週毎に評価した（図１３）。第１相試験に登録した進行性乳腺腺癌に罹患している８人の閉経後の女性の主なベースライン人口統計を、表１に要約する。

【0117】

対象の前癌治療を図１４Ａに示し、受容したＲＡＤ１９０１治療を図１４Ｂに示し、対象番号１～３を、２００ｍｇのＲＡＤ１９０１の１日１回経口投与で治療し、対象番号４～７を、４００ｍｇのＲＡＤ１９０１の１日１回経口投与で治療した。矢印は、継続中の試験を示し、棒は、中断した治療を示す。図１４Ａにおいて、「ＡＣ」は、ドキソルビシン／シクロホスファミドであり、「ＦＡＣ」は、５－フルオロウラシル／ドキソルビシン／シクロホスファミドである。

【0118】

治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）
ＴＥＡＥは、試験を通して記録された。予備データを表２に要約する。「ｎ」は、所与のカテゴリー中の少なくとも１つの治療に関連したＡＥを有する対象の数であり、ＡＥは有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０のように等級分けされ、同じ優先使用語の複数のシナリオを有する任意の患者は、最も重度のグレードまで１回のみ計数した。死亡または用量を制限する毒性は観察されず、最大耐容量（ＭＴＤ）は構築されなかった。最もＡＥは、グレード１または２であった。最も一般的な治療に関連したＡＥは、消化不良（５／８人の患者）及び吐き気（３／８人の患者）であった。２つの重篤なＡＥ（ＳＡＥ）が観察され、１つはグレード３の治療に関連した便秘で、その他は、息切れ（胸水）であったが、治療には関連しなかった。

【0119】

この第１相試験の大量にこれまでに治療を受けた対象は、複数の内分泌及び標的薬剤、例えば、ＣＤＫ４／６、ＰＩ３Ｋ、及びｍＴＯＲ阻害剤でこれまでに治療を受けた対象を含んだ。２００ｍｇの用量のＲＡＤ１９０１の１日１回経口投与で最長６か月間治療した後、及び４００ｍｇの用量のＲＡＤ１９０１の１日１回経口投与で最長２か月間治療した後に、用量を制限する毒性は観察されなかった。それ故に、ＲＡＤ１９０１は、特に、ＣＤＫ４／６、ＰＩ３Ｋ、及びｍＴＯＲ阻害剤等の内分泌及び／または標的薬剤でこれまでに治療を受けた対象において、ＥＲ＋進行性乳癌を治療する可能性を示した。

【0120】

実施例ＩＩ．ＲＡＤ１９０１は、好ましくは腫瘍中で蓄積し、脳に送達され得る。

【0121】

実施例Ｉ（Ａ）（ｉ）に記載されるように、ＭＣＦ－７異種移植片を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて、血漿及び腫瘍中のＲＡＤ１９０１濃度についてさらに評価した。試験の終了時に、血漿中のＲＡＤ１９０１の濃度は、３４４±１１７ｎｇ／ｍＬであり、腫瘍中では、６０ｍｇ／ｋｇの用量レベルに対して１１，１１８±３，８０１ｎｇ／ｍＬであった。腫瘍濃度が血漿中よりも約２０～３０倍高かった場合に、同様の腫瘍対血漿の比率も、より低い用量レベルで観察された。４０日間処置されたマウスの血漿、腫瘍、及び脳中のＲＡＤ１９０１レベルを、表３に要約する。有意な量のＲＡＤ１９０１が、処置マウスの脳に送達され（例えば、Ｂ／Ｐ比（脳中のＲＡＤ１９０１濃度／血漿中のＲＡＤ１９０１濃度）を参照のこと）、このことは、ＲＡＤ１９０１が血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することができたことを示した。意外にも、ＲＡＤ１９０１は、好ましくは腫瘍中で蓄積した。例えば、表３に示されるＴ／Ｐ（腫瘍中のＲＡＤ１９０１濃度／血漿中のＲＡＤ１９０１濃度）比を参照されたい。

【0122】

実施例ＩＩＩ．ＲＡＤ１９０１は、ＥＲ経路を阻害し、ＥＲを分解した。

【0123】

ＩＩＩ（Ａ）．ＲＡＤ１９０１は、健常な閉経後の女性ヒト対象の子宮及び下垂体においてＥＲ関与を軽減した。

【0124】

対象は、少なくとも１２か月間無月経であり、血清ＦＳＨが閉経と一致した。対象は、１８．０～３０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する、４０～７５歳であった。対象は、無傷子宮であった。臨床的に関連する病理の証拠を有し、卒中もしくは過去に静脈血栓塞栓事象のリスク増加がある、または臨床研究センターに登録する１４日以内に併用薬（パラセタモールは、３日前まで許容された）の使用を有する患者は、除外された。

【0125】

ＦＥＳ－ＰＥＴは、子宮内のＥＲ関与を評価するために、ベースライン及びＲＡＤ１９０１への曝露から６日後に行われた。ＲＡＤ１９０１は、それぞれ、２００ｍｇ（７人の対象）及び５００ｍｇ（６人の対象）の用量レベルで、子宮内でＥＲが８３％及び９２％を占めた。

【0126】

ＦＥＳ－ＰＥＴ画像は、２００ｍｇまたは５００ｍｇのＲＡＤ１９０１による治療（１日１回経口投与、６日）後に、子宮及び下垂体の両方への標識エストラジオールの結合の有意な減少を示した。

【0127】

高いＥＲ発現により、子宮は、ＲＡＤ１９０１治療前にベースラインで強力なＦＥＳ－ＰＥＴシグナル（図１５Ａ）、２００ｍｇの用量レベルで治療した対象３の子宮ＦＥＳ－ＰＥＴスキャンにおけるベースラインの横断図；図１５Ｂ、５００ｍｇの用量レベルで治療した対象７のベースラインの子宮ＦＥＳ－ＰＥＴスキャンにおける、それぞれ、矢状図及び横断図）を示した。しかしながら、試験中の６日目に投与してから４時間後にスキャンした場合、子宮は、ほとんど見えなかった（バックグラウンドＦＥＳ－ＰＥＴシグナルでまたはそれの近くに（図１５Ａ、対象３の子宮スキャンにおける６日目の横断図；及び図１５Ｂ、対象７の子宮スキャンにおける、それぞれ、６日目の矢状図及び横断図）。かかるデータは、ＥＲの分解及び／または受容体への結合に対する競合と一致した。図１５Ａ及び１５Ｂはまた、ＲＡＤ１９０１治療前及び後の子宮の存在を示す、ＦＥＳ－ＰＥＴによってスキャンされた子宮のＣＴスキャンも含む。

【0128】

ＦＥＳ－ＰＥＴの子宮スキャンの結果は、２００ｍｇの用量群及び５００ｍｇの用量群の例として、それぞれ、対象１～３及び対象４～７を示す、７人の対象についてベースラインから投与後のＥＲ結合の変化を示すためにさらに定量化した（図１５Ｃ）。ＲＡＤ１９０１は、低用量（２００ｍｇ）で強固なＥＲ関与を示した。

【0129】

図１６は、５００ｍｇのＲＡＤ１９０１の１日１回経口投与で６日間治療する前（ベースライン）及び治療した後（治療後）の子宮（Ａ）及び下垂体（Ｂ）のＦＥＳ－ＰＥＴスキャンの代表的な画像を示した。図１６Ａは、（ａ）側面横断図、（ｂ）縦横断図、及び（ｃ）縦横断図によって子宮のＦＥＳ－ＰＥＴスキャンを示した。

【0130】

子宮及び下垂体の対象の投与後のＦＥＳ－ＰＥＴスキャンは、それぞれ、子宮（図１６Ａ、治療後）及び下垂体（図１６Ｂ、治療後）でＥＲ結合の顕著なシグナルを示さなかった。

【0131】

それ故に、結果は、ＲＡＤ１９０１が、２００及び５００ｍｇの投与量で、１日１回６日間経口投与したヒトにおいてＥＲが有効に関与したことを示した。

【0132】

子宮、筋肉、及び骨に対する標準取り込み値（ＳＵＶ）を計算し、２００ｍｇ及び５００ｍｇで１日１回経口投与したＲＡＤ１９０１での治療について、それぞれ、表４及び５に要約した。投与後の子宮シグナルは、「非標的組織」からのレベルに非常に近く、ＲＡＤ１９０１治療後のＦＥＳ－ＰＥＴの取り込みの完全な減衰を示唆している。エストロゲン受容体を有意に発現しなかった組織中の治療前対治療後ＰＥＴスキャンについては、ほとんど変化が観察されなかった。

【0133】

それ故に、ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）は、他の臓器（例えば、骨、筋肉）への悪影響を有さない、ＥＲの過剰発現を有する癌及び／または腫瘍細胞（例えば、乳癌、子宮癌、及び卵巣癌）を治療する際に使用することができる。ＲＡＤ１９０１またはその塩もしくは溶媒和物（例えば水和物）は、他の臓器（例えば、骨、筋肉）への乳癌、子宮癌、及び／または卵巣癌病巣を治療するために、当該臓器への悪影響を有さない、他の臓器においてＥＲ過剰発現を有する転移性癌及び／または腫瘍、例えば、他の臓器（例えば、骨、筋肉）に移動する元の乳癌、子宮癌、及び／または卵巣癌を治療する際に特に有用であり得る。

【0134】

ＩＩＩ（Ｂ）．ＲＡＤ１９０１は、ＥＲ発現を減少させ、ＥＲ経路を阻害した。

【0135】

ＩＩＩ（Ｂ）（ｉ）（１）ＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ細胞株におけるＲＡＤ１９０１及びフルベストラントの比較

【0136】

ＲＡＤ１９０１及びフルベストラントの効果を、ＭＣＦ７及びＴ４７Ｄ細胞株（両方とも、ヒト乳癌細胞株である）を用いて、０．０１μＭ、０．１μＭ、及び１μＭの様々な濃度で比較した（ＭＣＦ７細胞株アッセイについては図１７Ａ、及びＴ４７Ｄ細胞株については図１７Ｂ）。３つのＥＲ標的遺伝子、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、乳癌１におけるエストロゲンによる成長調節（ＧＲＥＢ１）、及びトレフォイル因子１（ＴＦＦ１）を、マーカーとして使用した。ＲＡＤ１９０１は、ほぼ完全にＥＲの分解を引き起こし、ＥＲのシグナル伝達を阻害した（図１７Ａ～Ｂ）。意外にも、実施例Ｉ（Ａ）及び実施例Ｉ（Ｂ）において、上に開示されるように、ＲＡＤ１９０１は、腫瘍成長を阻害し、腫瘍退縮を引き起こす際に、フルベストラントと同等またはフルベストラントよりも有効であった。

【0137】

ＩＩＩ（Ｂ）（ｉ）（２）ＲＡＤ１９０１治療は、実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉ）（１）において上述されるように、ＭＣＦ－７異種移植片モデル－ＩＩにおいて、ＥＲの分解及びＥＲのシグナル伝達の廃止をもたらした。

【0138】

ＲＡＤ１９０１治療は、インビボでＥＲの分解をもたらし（図１８Ａ～Ｂ、スチューデントのｔ検定：＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１）、インビボでＥＲのシグナル伝達を阻害した（図１９Ａ及び１９Ｃ、スチューデントのｔ検定：＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１）。

【0139】

ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）またはフルベストラント（３ｍｇ／用量、週１回皮下注射）の最終投与から２時間後にＭＣＦ－７異種移植片から採取した腫瘍は、ＥＲ及びＰＲの発現を有意に減少したことを示した（図１８Ａ～Ｂ）。フルベストラント治療の最終投与から８時間後にＭＣＦ－７異種移植片から採取した腫瘍は、ＰＲ及びＥＲの発現を変化させたことを示した。しかしながら、ＲＡＤ１９０１治療の最終投与から８時間後にＭＣＦ－７異種移植片から採取した腫瘍は、ＰＲ及びＥＲの発現を減少したことを示した（図１８Ａ及び１８Ｃ）。

【0140】

ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、または９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の単回投与から８時間または１２時間後にＭＣＦ－７異種移植片から採取した腫瘍は、ＰＲの発現を急速に減少したことを示した（図１９Ａ）。ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、または９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の７回目の投与から４時間または２４時間後にＭＣＦ－７異種移植片から採取した腫瘍は、ＥＲのシグナル伝達の一貫した安定した阻害を示した（図１９Ｂ）。ＲＡＤ１９０１（３０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、または９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の治療中の様々な時点でＭＣＦ－７異種移植片から採取した腫瘍のウェスタンブロット分析の定量化は、ＰＲの用量依存的な減少を示した（図１９Ｃ）。

【0141】

ＲＡＤ１９０１治療は、ＭＣＦ－７異種移植片モデルにおいて増殖の急速な減少を起こした。例えば、ＲＡＤ１９０１（９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の単回投与から８時間後及びＲＡＤ１９０１（９０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）の４回目の投与から２４時間後に、ＭＣＦ－７異種移植片モデルから採取した腫瘍を切断し、染色して、増殖マーカーＫｉ６７の急速な減少を示した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。

【0142】

これらの結果は、ＲＡＤ１９０１治療が、ＷＴ ＥＲ異種移植片において、インビボでＥＲの分解及びＥＲのシグナル伝達の阻害をもたらすことを示唆している。

【0143】

ＩＩＩ（Ｂ）（ｉ）（３）ＲＡＤ１９０１治療は、実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉ）において上述されるように、ＰＤｘ－４モデルにおいて、ＥＲの分解及びＥＲのシグナル伝達の廃止をもたらした。

【0144】

ＲＡＤ１９０１治療は、ＰＤｘ－４モデルにおいて増殖の急速な減少を起こした。例えば、５６日の有効性試験の最終日に最終投与から４時間後に、ＲＡＤ１９０１（３０、６０、または１２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回経口投与）またはフルベストラント（１ｍｇ／動物、週１回）で治療したＰＤｘ－４モデルから採取した腫瘍を切断し、これは、フルベストラントで治療したＰＤｘ－４モデルと比較して、増殖マーカーＫｉ６７の急速な減少を示した（図２１）。

【0145】

これらの結果は、ＲＡＤ１９０１治療が、ＷＴ ＥＲ異種移植片において、インビボでＥＲの分解及びＥＲのシグナル伝達の阻害をもたらすことを示唆している。

【0146】

ＩＩＩ（Ｂ）（ｉｉ）ＲＡＤ１９０１治療は、実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）（１）において上述されるように、変異体ＥＲ異種移植片モデル（ＰＤｘ－５）において、ＥＲのシグナル伝達の低下をもたらした。

【0147】

腫瘍を、投与の最終日後に指示された時点で採取し（別途特定されない限り）、Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を有するＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。等量のタンパク質を、ＭＷによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、材料及び方法の項：プロゲステロン受容体（ＰＲ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；３１５３）に記載されるように、以下の抗体でブロットした。

【0148】

バンドを、１Ｄ Ｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）を用いて定量化し、実施例Ｉ（Ａ）（ｉｉｉ）（１）に記載されるように、ＰＤｘ－５モデルから得られたＰＲ（Ａｌｌｒｅｄスコア）を、図２２に示す。フルベストラントは、ＰＲの発現に対してほとんど影響を与えなかったが、ＲＡＤ１９０１は、６０ｍｇ／ｋｇ及び１２０ｍｇ／ｋｇの両方の投与量で有効性を示した（１日１回経口投与、図２２）。

【0149】

これらの結果は、ある特定のＥＲα変異（例えばＹ５３７Ｓ）を発現する腫瘍については、腫瘍が、フルベストラント／タモキシフェン治療に対して反応したかどうかにかかわらず（ＰＤｘ－５については図９及びＰＤｘ－６については図１０）、ＲＡＤ１９０１が、腫瘍成長を阻害するときに、フルベストラントよりもさらに有効であり、フルベストラント治療（例えば３ｍｇ／用量の投与量で、週１回皮下注射、ＰＤｘ－５については図９）に対してほとんど反応しなかった腫瘍の成長を阻害する際に特に有効であったことを示す。さらに、フルベストラント治療に対してあまり反応しなかった腫瘍（例えばＰＤｘ－５）については、ＲＡＤ１９０１は、インビボでＰＲの発現を減少する際に有効であったが、フルベストラントは有効でなかった（図２３）。

【0150】

実施例ＩＶ 子宮組織及び／またはＢＭＤに対するＲＡＤ１９０１治療の影響
ＩＶ（Ａ（１））：ＲＡＤ１９０１は、子宮組織のエストラジオール刺激を拮抗した。

【0151】

ＲＡＤ１９０１の子宮向性効果を、未成熟ラットにおいて、子宮重量、組織、及びＣ３遺伝子発現の変化を評価することによって調査した。代表的な試験からの結果を図２３に示す。

【0152】

子宮向性活性の評価
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ仔ラットを、１９日齢で乳離れさせ、群（ｎ＝４）にランダム化し、ビヒクル（水性メチルセルロース）、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、ラロキシフェン（３ｍｇ／ｋｇ）、タモキシフェン（１ｍｇ／ｋｇ）、ＲＡＤ１９０１単独（０．３～１００ｍｇ／ｋｇ）、またはＥ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたＲＡＤ１９０１（０．０１～１０ｍｇ／ｋｇ）を、必要に応じて、皮下注射または経口投与のいずれかで、（上の試薬を参照されたい）１日１回３日間連続で投与した。最終投与から２４時間後、すべての動物を、二酸化炭素の吸入によって殺処分した。体重及び湿子宮重量を、各動物について記録した。同様のアッセイも、ラット及びマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣ）において、ＲＡＤ１９０１（０．０３～１００ｍｇ／ｋｇ）で行った。

【0153】

各ラットからの新鮮な子宮組織を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、エタノールで脱水し、ＪＢ４プラスチック製樹脂に包埋した。切片を８μｍで切断し、０．１％トルイジンブルーＯで染色した。子宮内膜上皮組織の厚さは、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ４０顕微鏡及びＳｐｏｔ Ａｄｖａｎｃｅｄプログラムを用いて測定し、標本当たり９つの測定の平均を計算した。

【0154】

子宮成分の成分３（Ｃ３）遺伝子発現
処置した子宮組織中のＣ３の相対的発現レベルを決定するために、ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、Ｍｉｃｒｏ ｔｏ Ｍｉｄｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて残りの組織から抽出した。ＲＮＡを定量化し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡアーカイブキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、等量を逆転写した。

【0155】

ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７３００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的ＰＣＲを行った。Ｃ３に対して及び参照遺伝子として１８ＳリボソームＲＮＡに対してプローブセットを有するＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＰＣＲを行った。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間の初期変性ステップ、続いて、９５℃で１５秒、及び６０℃で１分間の４０サイクルを含んだ。

【0156】

相対遺伝子発現を、内因性対照（１８Ｓ）に各試料を正規化し、較正器（ビヒクル）で比較することによって決定した。相対遺伝子発現を、等式：２－ΔΔＣｔ（式中、Ｃｔ＝サイクル閾値またはＰＣＲ生成物が最初に検出されたサイクル数、ΔＣｔ＝正規化した試料値、及びΔΔＣｔ＝投与された対象とビヒクルとの間の正規化差）を用いて決定した。５つの複製遺伝子発現の決定を、各試験内の各投与について行った。

【0157】

Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、ラロキシフェン（ＲＡＬ、３ｍｇ／ｋｇ）、またはタモキシフェン（ＴＡＭ、１ｍｇ／ｋｇ）による治療は、ビヒクル単独と比較して、子宮湿重量の有意な増加をもたらし、一方、０．３～１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量でのＲＡＤ１９０１治療は、子宮湿重量に有意な影響を及ぼさなかった（図２３Ａ）。示されたデータ（図２３Ａ）は、平均（±平均誤差）、群当たりｎ＝４のラット、Ｐ対ビヒクル：＊＜０．０５；対Ｅ２：‡＜０．０５である。さらに、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）と併用投与された場合に、ＲＡＤ１９０１は、用量依存的様式においてＥ２の媒介による子宮の刺激を拮抗し、０．１ｍｇ／ｋｇ以上の用量で子宮向性活性の有意な阻害及び３ｍｇ／ｋｇで完全な阻害を示した。ＲＡＤ１９０１のＥＣ_５０は、約０．３ｍｇ／ｋｇであった。０．０３～１００ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１投与もまた、子宮湿重量または上皮の厚さに影響を及ぼさなかったマウスにおいて、同様の結果を得た（データ示さず）。

【0158】

子宮組織における治療依存的変化を、定量的顕微鏡組織学によってさらに調査した。０．０１及び０．３ｍｇ／ｋｇの両方でＥ２による治療後の、子宮内膜上皮の厚さの統計的に有意な増加があった（図２３Ｂ）。上皮の厚さの有意な増加はまた、タモキシフェン（１ｍｇ／ｋｇ）またはラロキシフェン（３ｍｇ／ｋｇ）による治療後にも観察された。対照的に、ＲＡＤ１９０１治療は、最も高く評価された用量の１００ｍｇ／ｋｇまで子宮内膜上皮の厚さを増加しなかった。子宮内膜上皮の代表的な画像を、図２３Ｃに示す。

【0159】

子宮重量及び子宮内膜上皮の厚さの両方の変化と一致して、Ｅ２、タモキシフェン、及びラロキシフェンはすべて、エストロゲンを調節した成分遺伝子Ｃ３の発現を有意に増加した（図２３Ｄ）。対照的に、ＲＡＤ１９０１は、試験した用量のいずれか（０．３～１００ｍｇ／ｋｇ）でＣ３遺伝子発現を増加しなかった。さらに、１、３、及び１０ｍｇ／ｋｇのＲＡＤ１９０１は、Ｅ２で刺激されたＣ３遺伝子発現を有意に抑制した。

【0160】

ＲＡＤ１９０１は、未成熟雌ラットの子宮を刺激しなかった
未成熟雌ラットに、ビヒクル（ＶＥＨ）、エストラジオール（Ｅ２）、ラロキシフェン（ＲＡＬ）、タモキシフェン（ＴＡＭ）、ＲＡＤ１９０１、またはＲＡＤ１９０１＋Ｅ２で３日間連続して１日１回経口投与を施した。子宮湿重量を測定した。示されたデータ（図２３Ａ）は、平均（±平均誤差）、群当たりｎ＝４のラット、Ｐ対ビヒクル：＊＜０．０５；対Ｅ２：‡＜０．０５である。

【0161】

実施例ＩＩ（Ａ）（２）．ＲＡＤ１９０１による治療は、卵巣摘出ラットにおいて骨量の減少を防いだ。
ＲＡＤ１９０１の骨特異的効果を、卵巣摘出ラットにおいて試験した。

【0162】

閉経後骨量減少のモデルとして、麻酔をかけた雌Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、卵巣摘出術を行い、対照として偽手術を行った。手術後、群当たり２０の動物を有する、卵巣摘出ラットを、ビヒクル、Ｅ２（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、またはＲＡＤ１９０１（０．１、０．３、１、３ｍｇ／ｋｇ）で４週間１日１回処置し、上述のように投与した。偽手術群の動物は、ビヒクルで処置した。すべての動物を、最終投与から２４時間後に、二酸化炭素の吸入によって殺処分した。ＰＩＸＩｍｕｓ二重発光Ｘ線吸光光度法を用いて、骨ミネラル濃度を、ベースラインさらに処置から４週間後に評価した。

【0163】

剖検時に、各動物の左大腿骨を除去し、軟組織がないように切開し、分析前に７０％エタノール中に保存した。マイクロ－ＣＴ４０システム（Ｓｃａｎｃｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ）を用いて、詳細な定性的及び定量的３Ｄ評価を行った。各標本については、大腿遠位骨幹端の２５０の画像枚数を必要とした。予め選択された分析領域において直接３Ｄアプローチを用いて、形態学的パラメータを決定した。骨梁において決定されたパラメータは、骨体積密度、骨表面密度、骨梁数、骨梁幅、骨梁中心距離、連結密度、及び見掛け骨密度を含んだ。

【0164】

卵巣摘出術後、未処置（ビヒクル対照）ラットは、ベースラインと比較して、完全大腿骨全体及び腰椎の両方の骨ミネラル濃度を減少した（表６）。Ｅ２による治療は、大腿骨及び脊椎の両方の骨量減少の防止と関連した。ＲＡＤ１９０１による治療は、卵巣摘出術で誘発した骨量減少の用量依存的で統計的に有意な抑制をもたらした（３ｍｇ／ｋｇの処置群について示されたデータ）。０．１ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇの用量で、ＲＡＤ１９０１で処置したラットにおける骨ミネラル濃度は、完全であり、Ｅ２で処置した群と統計的に有意差はなかった。

【0165】

大腿遠位のマイクロＣＴ分析（表７）は、卵巣摘出術が、偽手術動物と比較した場合に、多数の主なマイクロアーキテクチャパラメータの有意な変化を誘発したことを示した。これらの変化は、骨量の減少と一致し、骨体積の減少、骨梁数、厚さ、及び密度の減少、ならびに骨梁間隔の増加を含む。ＲＡＤ１９０１による処置後に観察された骨ミネラル濃度の保存と一致して、骨梁アーキテクチャの有意な保存が、主なマイクロ構造パラメータにおいて観察された（表７）。

【0166】

実施例ＩＶ（Ｂ）：健常な閉経後の女性におけるＲＡＤ１０１の第１相用量漸増試験
第１相試験では、安全性、耐性、及び薬物動態が、４４人の健常な閉経後の女性において評価された。用量を制限する毒性（ＤＬＴ）は観察されず、最大耐容量（ＭＴＤ）は構築されなかった。血漿曝露は、試験した用量範囲にわたって用量比例的よりも増加した。

【0167】

対象
４４人の健常な閉経後の女性を、この第１相試験の対象として登録した。対象は、少なくとも１２か月間無月経であり、血清ＦＳＨが閉経と一致した。対象は、１８．０～３０ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを有する、４０～７５歳であった。臨床的に関連する病理の証拠を有し、卒中もしくは過去に静脈血栓塞栓事象のリスク増加がある、または臨床研究センターに登録する１４日以内に併用薬（パラセタモールは、３日前まで許容された）の使用を有する患者は、除外された。

【0168】

投与
対象を、それぞれ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、及び１０００ｍｇの用量レベルで、軽い朝食後に、プラセボまたは少なくとも１つの経口量で１日１回７日間治療した。第１相試験に登録した４４人の閉経後の女性の主なベースライン人口統計を、表８に要約する。

【0169】

治療中に発生した有害事象（ＴＥＡＥ）
ＴＥＡＥを記録し、最も頻繁に起こる（任意の関連したＴＥＡＥを有した全活性群の患者の１０％超）有害事象（ＡＥ）を表９に要約し、「ｎ」は、所与のカテゴリー中の少なくとも１つの治療に関連したＡＥを有する対象の数であり、ＡＥは有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）ｖ４．０のように等級分けされ、同じ優先使用語の複数のシナリオを有する任意の患者は、最も重度のグレードまで１回のみ計数した。用量を制限する毒性は観察されず、最大耐容量（ＭＴＤ）は構築されなかった。

【0170】

薬物動態評価
血漿中のＲＡＤ１９０１の分析のための試験期間中に、一連の血液試料を採血した。留置ＩＶカテーテルを介して、または抗凝血剤としてＫ_３－ＥＤＴＡを含有するチューブへの直接静脈穿刺によって、５ｍＬの血液試料をそれぞれ、採血した。定常状態は、治療から５日目で達成した。ＲＡＤ１９０１の幾何平均（Ｇｅｏ－Ｍｅａｎ）血漿濃度－時間プロファイルを評価した。試験において、７日目のＲＡＤ１９０１（２００、５００、７５０、または１，０００ｍｇ）により治療した群（Ｎ＝３５）の血漿薬物動態の結果を、例として、表１０及び図２４に提供する。中央値ｔ_１／２は、３７．５～４２．３時間であった（表１０）。ＲＡＤ１９０１の複数回投与後、中央値ｔ_ｍａｘは、投与後の３～４時間であった。

【0171】

実施例Ｖ（Ａ）－１．選択公開されたＥＲ構造を用いたＲＡＤ１９０１－ＥＲα結合のモデリング。
別途記述がない限り、構造をそれらのスティックモデルで示す場合、結合の各末端を、それに結合する原子と同じ色で色付けし、灰色は炭素であり、赤色は酸素であり、青色は窒素であり、白色は水素である。

【0172】

様々なＥＲリガンド複合体形成されたＥＲαリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の１４の公開された構造（すなわち、モデル）を、慎重な評価によって９６の公開されたモデルから選択した。これらの１４のモデルのうちの１つは、３ＥＲＴ（４－ヒドロキシタモキシフェンに結合したヒトＥＲα ＬＢＤ（ＯＨＴ））であった。ＯＨＴは、タモキシフェンの活性代謝産物で、乳房組織中のアンタゴニストとしての役割を果たす第一世代のＳＥＲＭである。

【0173】

３ＥＲＴ（図２５及び２６）では、ＥＲα結合部位は、らせん３（Ｈ３）、らせん５（Ｈ５）、及びらせん１１（Ｈ１１）を含む疎水性ポエットを形成する３つの層「らせんサンドイッチ」を導入する（図２５）。図２６中の点線の箱は、結合部位、及び重要であるまたはＯＨＴ結合によって達成される結合部位内の残基を表す。ＯＨＴは、ＬＸＸＬＬコアクチベータ（複数可）を結合する部位にＨ１２を置換することによって、アンタゴニストとして役割を果たす。ＯＨＴは、Ｌ５４０によって正常に充填したスペースを占有し、らせん１１のＣ末端上に４つの残基（Ｇ５２１、Ｈ５２４、Ｌ５２５、及びＭ５２８）の立体構造を修飾する。ＯＨＴはまた、Ｄ３５１との塩橋を形成し、電荷中和をもたらす。

【0174】

その他の１３のＥＲα ＬＢＤ－ＥＲリガンドモデルを、３ＥＲＴと比較した。それらの残基構造の違いを、表１２に要約する。１４のモデルのＥＲα構造の重ね合わせ（図２７）は、これらの構造が、残基Ｅ３８０、Ｍ４２１、Ｇ５２１、Ｍ５２２、Ｈ５２４、Ｙ５２６、Ｓ５２７、Ｍ５２８、Ｐ５３５、Ｙ５３７、Ｌ５４０、及びこれらの様々な組み合わせで有意に異なったことを示す。

【0175】

１４のモデルの任意の対の標準偏差（ＲＭＳＤ）の計算を、表１３に要約する。構造は、ＲＭＳＤが２Å未満であった場合に、重なり合うと見なされた。表１３は、すべての１４のモデルが、１．５Å未満のＲＭＳＤを有したことを示す。フォーマット分析の使用は、１Ｒ５Ｋ及び３ＵＵＣが、他のモデルにあまり同様でなかったことを示唆した（分析は示さず）。したがって、１Ｒ５Ｋ及び３ＵＵＣは、試験された固有の別々の構造クラスターであると見なされた。

【0176】

１４のモデルにおけるリガンドによって結合されたＥＲα残基を、表１４に要約する。表１４はまた、ＥＲα ＬＢＤ－アンタゴニスト複合体におけるＥＣ_５０を示す。１４のモデルのうち、１３のモデルは、リガンドとＥ３５３との間のＨ結合相互作用を示し、１２のモデルは、リガンドとＦ４０４との間のπ相互作用を示し、５つのモデルは、リガンドとＤ３５１との間のＨ結合相互作用を示し、６つのモデルは、リガンドとＨ５２４との間のＨ結合相互作用を示し、４つのモデルは、リガンドとＲ３９４との間のＨ結合相互作用を示し、１つのモデル（３ＵＵＣ）は、リガンドとＴ３４７との間の相互作用を示した。

【0177】

１４のモデルの各々は、リガンドに加えて１，０００の化合物のランダムライブラリーをドックするために使用し、このモデルは、周知のアンタゴニストを特定し、優先順位を付け得るかどうかを決定するために、（周知のアンタゴニスト）と共に公開された。このモデルが周知のアンタゴニストを特定し得る場合、このモデルは、それ自体が公開されたリガンドの構造を予測することができることが決定された。次いで、ＥＦ_５０を計算して、ランダム選択よりもいかに良好であるかを知るためにモデルの強度を定量化した。ＲＡＤ１９０１を、選択したモデルにドッキングした（例えば図２８～３２）。モデルにおける公開されたリガンド及びＲＡＤ１９０１のドッキングスコアを決定した。また、ＥＣ_５０も決定した。ＲＡＤ１９０１の目視検査は、それが、１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、２ＯＵＺにおいて公開されたリガンドと共に示される相互作用に「従う」ことを示した。空間不調和は認められなかった。ある特定の実施形態では、例えば、１Ｒ５ｋ及び２ＢＪ４において、ＲＡＤ１９０１は、公開されたリガンドよりも高いドッキングスコアを有した。

【0178】

９つのモデル（１ＥＲＲ、３ＥＲＴ、３ＵＣＣ、２ＩＯＫ、１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺ）の評価結果を、表１５に要約する。

【0179】

１ＥＲＲ及び３ＥＲＴは、それらの結晶リガンドの正確な構造を予測することができなかった。ＲＡＤ１９０１は、３ＵＣＣにドッキングされなかった。２ＩＯＫ－ＲＡＤ１９０１においてテトラヒドロナフタアレン非伝統的な様式で結合した。

【0180】

モデル１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺの間の大きな違いは、らせん１１のＣ末端の残基（Ｇ５２１－Ｍ５２８）であった。

【0181】

図２８Ａ～Ｂは、ＲＡＤ１９０１－１Ｒ５Ｋ（Ａ）及びＧＷ５－１Ｒ５Ｋ（Ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｅ３５３、Ｒ３９４、及びＬ５３６とのＨ結合相互作用ならびにＦ４０４とのｐ相互作用で結合した。

【0182】

図２９Ａ～Ｂは、ＲＡＤ１９０１－１ＳＪ０（Ａ）及びＥ４Ｄ－１ＳＪ０（Ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｅ３５３及びＤ３５１とのＨ結合相互作用ならびにＦ４０４とのｐ相互作用で結合した。

【0183】

図３０Ａ～Ｂは、ＲＡＤ１９０１－２ＪＦＡ（Ａ）及びＲＡＬ－２ＪＦＡ（Ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｆ４０４とのｐ相互作用で結合した。

【0184】

図３１Ａ～Ｂは、ＲＡＤ１９０１－２ＢＪ４（Ａ）及びＯＨＴ－２ＢＪ４（Ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｅ３５３及びＲ３９４とのＨ結合相互作用ならびにＦ４０４とのｐ相互作用で結合した。

【0185】

図３２Ａ～Ｂは、ＲＡＤ１９０１－２ＩＯＫ（Ａ）及びＩＯＫ－２ＩＯＫ（Ｂ）のモデリングを示す。ＲＡＤ１９０１は、Ｅ３５３、Ｒ３９４、及びＤ３５１とのＨ結合相互作用ならびにＦ４０４とのｐ相互作用で結合した。

【0186】

モデルにおいて公開したリガンドは、以下の構造を有する：

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【0187】

実施例Ｖ（Ａ）－２．ＲＡＤ１９０１及びフルベストラントによるＥＲαの誘導適合ドッキング（ＩＦＤ）
ＥＲαにおいて、ＲＡＤ１９０１の結合立体構造は、５つのＥＲα結晶構造１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺのＩＦＤ分析によってさらに最適化された。ＩＦＤ分析は、その正確な結合立体構造に適合するために（リガンド結合時の）受容体柔軟性を明らかにした。

【0188】

各リガンド（例えばＲＡＤ１９０１及びフルベストラント）に対して異なる立体構造のライブラリーは、回転結合について回転の関数として局所最小値を探すことによって生成した。ＲＡＤ１９０１のライブラリーは、２５の異なる立体構造を有した。

【0189】

５つのＥＲα結晶構造を調製し、最小化した。公開されたＸ線構造において対応するリガンドは、ＥＲα結合ポケットを定義するために使用した。

【0190】

ＲＡＤ１９０１の立体構造は、調製されたＥＲα構造にドッキングして、結合ポケットに位置する残基への側鎖または骨格運動を誘導することを可能にした。これらの運動は、ＥＲαがその結合部位を変化させることを可能にし、そのため、ＲＡＤ１９０１の立体構造の形状及び結合様式にさらに密接に適合した。いくつかの例では、受容体構造における小さな骨格弛緩及び有意な側鎖の立体構造の変化が、ＩＦＤ分析において可能になった。

【0191】

経験的スコアリング関数は、ドッキングスコアまたはＧスコアを提供するために、リガンド結合自由エネルギーを概算するために使用した。Ｇスコアはまた、ＧｌｉｄｅＳｃｏｒｅとして知られており、この実施例では、ドッキングスコアと同義に使用してもよい。ドッキングスコアは、結合親和性の推定値であった。したがって、ドッキングスコアの値が低いほど、「より良好に」リガンドがその受容体に結合した。－１３～－１４のドッキングスコアは、非常に良好な結合相互作用に相当した。

【0192】

１Ｒ５Ｋ、１ＳＪ０、２ＪＦＡ、２ＢＪ４、及び２ＯＵＺによるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造は、それぞれ、それらの違いを示すために重ね合わせた（図３３～３５、スティックモデルにおいて示される）。各ＲＡＤ１９０１の立体構造におけるすべての結合を、図３３、３４、及び３５Ａにおいて同じ色で示した。

【0193】

１Ｒ５Ｋ（青色）及び２ＯＵＺ（黄色）によるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造は、前面にＲＡＤ１９０１のＮ－ベンジル－Ｎ－エチルアニリン基を有した（図３３）。２ＢＪ４（緑色）及び２ＪＦＡ（ピンク色）によるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造は、背面にＲＡＤ１９０１のＮ－ベンジル－Ｎ－エチルアニリン基を有した（図３４）。２ＢＪ４（緑色）、２ＪＦＡ（ピンク色）、及び１ＳＪ０（茶色）によるＩＦＤ分析から得られたＲＡＤ１９０１の立体構造は、それらの重ね合わせによって示されるように、ほぼ同様であった（図３４Ａ及び３４Ｂ）。ＲＡＤ１９０１のＩＦＤドッキングスコアを表１６に要約する。

【0194】

２ＢＪ４によるＲＡＤ１９０１のＩＦＤは、Ｅ３５３及びＤ３５１との水素結合相互作用及びＦ４０４とのπ相互作用を示した（図３６Ａ～３６Ｃ）。図３６Ａは、Ｈ結合受容体基（赤色）、Ｈ結合ドナー基（青色）、及び疎水性基（黄色）に適している結合部位内の領域を示した。図３６Ａ～３６Ｂでは、薄青色は、ＲＡＤ１９０１の炭素に対するものであった。図３７Ａ～３７Ｃは、ＲＡＤ１９０１と２ＢＪ４とのＩＦＤのタンパク質表面の相互作用を示す。図３７Ａ及び３７Ｂは、正面図であり、図３７Ｃは、側面図である。ＲＡＤ１９０１の分子表面は、図３７Ａ中では青色であり、図３７Ｃ中では緑色であった。図３７Ｂ及び３７Ｃは、ＥＲαの溶媒接触可能性のある表面の静電気を示し、赤色は陰性を示し、青色は陽性を示した。

【0195】

上述のように、２ＢＪ４とのフルベストラントに対して、同様のＩＦＤ分析を行った。フルベストラント－２ＢＪ４のＩＦＤは、－１４．９４５のＧスコアをもたらし、Ｅ３５３、Ｙ５２６、及びＨ５２４との水素結合相互作用、ならびにＦ４０４とのπ相互作用を示した（図３８Ａ～３８Ｃ）。図３８Ａは、Ｈ結合受容体基（赤色）、Ｈ結合ドナー基（青色）、及び疎水性基（黄色）に適している結合部位内の領域を示した。図３８Ａでは、薄青色は、ＲＡＤ１９０１において炭素に対するものであった。

【0196】

図３９Ａ及び３９Ｂは、ＩＦＤによって２ＢＪ４にドックされたＲＡＤ１９０１及びフルベストラントがＦ４０４とのπ相互作用及びＥ３５３との水素結合相互作用の両方を有したことを示した。さらに、ＲＡＤ１９０１は、Ｄ３５１との水素結合相互作用を有した（青色は、ＲＡＤ１９０１分子表面を表す、図３９Ｂ）が、一方、フルベストラントは、Ｙ５２６及びＨ５２４との水素結合相互作用を有した（緑色は、フルベストラント分子表面を表す、図３９Ｃ）。ＲＡＤ１９０１及びフルベストラントでドッキングされた２ＢＪ４の重ね合わせを、図４０Ａ及び４０Ｂに示す。図４０Ａでは、緑色は、フルベストラント分子表面を表し、青色は、ＲＡＤ１９０１分子表面を表す。図４０Ｂでは、茶色構造は、フルベストラントであり、青色構造は、ＲＡＤ１９０１である。

【0197】

実施例Ｖ（Ａ）－３．選択ＥＲα変異のモデリング評価。
Ｃ末端リガンド結合ドメイン上の様々なＥＲα変異の効果を評価した。評価した特定のＥＲα変異は、Ｙ５３７Ｘ変異体（式中、Ｘは、Ｓ、Ｎ、またはＣである）、Ｄ５３８Ｇ、及びＳ４６３Ｐであった。

【0198】

らせん１２中のＹ５３７残基。それは、一旦リン酸化されると、リガンド結合、ホモ二量体化、及びＤＮＡ結合を調節し得、ＥＲαがリン酸化によって媒介された対照を逃れ、潜在的に選択的な腫瘍形成の利点を有する細胞を提供することを可能にし得る。加えて、それは、受容体を構造的に活性にする立体構造を変化させ得る。

【0199】

Ｙ５３７Ｓ変異は、リガンドによって占有されているかどうかにかかわらず、転写活性のある閉鎖したポケット構造が好ましい。閉鎖しているが、占有されていないポケットは、ＥＲαの構成的活性を説明し得る（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１４８９７－１４９０５（１９９７））。Ｓｅｒ５３７は、Ａｓｐ３５１との水素結合相互作用を構築し、らせん１１～１２のループの変化した構造及び溶媒が到達しにくい位置のＬｅｕ５３６の埋設をもたらす。これは、Ｙ５３７Ｓ変異体タンパク質の構成的活性の一因となり得る。Ｙ５３７Ｓ表面変異は、ＬＢＤポケットの表面上に影響を及ぼさない。

【0200】

Ｙ５３７Ｎは、ＥＲα陰性転移性乳癌でよく見られる。この部位の変異は、ERαがリン酸化によって媒介された対照を逃れ、潜在的に選択的な腫瘍形成の利点を有する細胞を提供することを可能にし得る。具体的には、Ｙ５３７Ｎ置換は、ホルモン結合を模倣し得るＥＲαにおいて構造変化を誘導し、受容体の二量化する能力に影響を及ぼさないが、受容体への構成的トランス活性化機能を与える（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５７：１２４４－１２４９（１９９７））。

【0201】

Ｙ５３７Ｃは、Ｙ５３７Ｎと同様の効果を有する。

【0202】

Ｄ５３８Ｇは、より好ましくは活性構造であるが、活性及び不活性の両方の構造を安定化させることによって全エネルギー景観を変え得る。これは、ホルモン耐性乳癌において観察されるように、ホルモンの不在下でこの変異体の構成的活性をもたらし得る（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｎｅｗｆｏｕｎｄ ｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｈａｐｅｓ ｔｈｅ ｅｎｅｒｇｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，”Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏｒｙ Ｃｏｍｐｕｔ．１０：２８９７－２９００（２０１４））。

【0203】

これらの変異のいずれも、リガンド結合ドメインに影響を及ぼすまたは具体的には、ＲＡＤ１９０１結合を妨げることを期待されない。Ｙ５３７及びＤ５３８は、リガンド結合と無関係である構成的受容体の活性化をもたらす立体構造を変化させ得る。

【0204】

実施例Ｖ（Ｂ）．ＲＡＤ１９０１及び他の化合物による野生型及びＬＢＤ変異体のＥＲα構築物のインビトロ結合アッセイ。
ＲＡＤ１９０１による野生型（ＷＴ）及びＬＢＤ変異体のＥＲα構築物のインビトロ結合アッセイは、ＲＡＤ１９０１がＷＴ ＥＲαと同様の親和性を有する変異体ＥＲαと結合したことを示した。

【0205】

ＷＴ及びＬＢＤ変異体のＥＲα構築物は、発現し、Ｎ末端チオレドキシン及びＴＥＶプロテアーゼによって切断された６ｘＨｉｓタグで対応するＬＢＤ残基３０２～５５２を精製することによって調製した。

【0206】

蛍光偏光（ＦＰ）は、製造業者の取扱説明書（Ｐｏｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のように、２ｎＭ フルオロモン、１００ｎＭ ＷＴまたはＬＢＤ変異体のＥＲα構築物を用いて、ＥＲαへの試験化合物（ＲＡＤ１９０１、フルベストラント、バゼドキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、及びＡＺＤ９４９６）の結合を決定するために使用した。各セットは、二重に行われ、異なるＥＲα構築物に対するＩＣ_５０を決定するためにある試験化合物を試験した（ＲＡＤ１９０１結合アッセイについては図４１）。

【0207】

上記のように、前述は、本発明の様々な実施形態を例示することを単に意図するものである。上に論じられる特定の改変は、本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。様々な同等物、変更、及び改変が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者にとって明らかであろうから、かかる同等の実施形態が、本明細書中に含まれるべきことも理解されるべきである。本明細書中に引用されたすべての参考文献は、あたかも本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2C-2】

【図2C-3】

【図2D】

【図2E】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20A】

【図20B】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図30A】

【図30B】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【図33】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図37A】

【図37B】

【図37C】

【図38A】

【図38B】

【図38C】

【図39A】

【図39B】

【図40A】

【図40B】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】