特許 7262597 二重特異性抗体及びその作製方法と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-13

(45)【発行日】2023-04-21

(54)【発明の名称】二重特異性抗体及びその作製方法と使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230414BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20230414BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20230414BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230414BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230414BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230414BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230414BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230414BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230414BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230414BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230414BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230414BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C07K16/46

C07K16/28

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P35/02

A61P37/02

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021547639

(86)(22)【出願日】2020-02-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 CN2020076516

(87)【国際公開番号】W WO2020186974

(87)【国際公開日】2020-09-24

【審査請求日】2021-04-27

(31)【優先権主張番号】201910209330.4

(32)【優先日】2019-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】521183028

【氏名又は名称】益科思特（北京）医葯科技▲發▼展有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】袁 清安

(72)【発明者】

【氏名】孟 ▲慶▼武

(72)【発明者】

【氏名】白 ▲麗▼莉

(72)【発明者】

【氏名】▲趙▼ 立坤

(72)【発明者】

【氏名】李 延虎

【審査官】原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０８６９０１３８（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５０００２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５０４３２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５３１１００（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１２８６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／１８８６９３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ１９及びＣＤ３に結合する二重特異性抗体であって、
（ａ）２つの完全な軽鎖－重鎖ペアであり、ＣＤ１９に特異的に結合できるモノクローナル抗体単位と、
（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、且つＣＤ３に特異的に結合できる２つの一本鎖抗体を含む一本鎖抗体単位と、を含み、
（１）前記２つの一本鎖抗体のＣ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結する方式と、
（２）前記２つの一本鎖抗体のＮ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結する方式
のいずれかの連結方式によって連結された対称構造であり、
前記一本鎖抗体の軽鎖配列が配列番号５で示され、かつ、前記一本鎖抗体の重鎖配列が配列番号６で示され、もしくは、
前記一本鎖抗体の軽鎖配列が配列番号９で示され、前記一本鎖抗体の重鎖配列が配列番号１０で示され、
前記一本鎖抗体の軽鎖と重鎖で膜融合ペプチドを構成し、前記膜融合ペプチドの配列が、下記のいずれかであり、
（１）前記２つの一本鎖抗体のＣ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結する場合、前記膜融合ペプチドの配列が配列番号１６で示される；
（２）前記２つの一本鎖抗体のＮ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結する場合、前記膜融合ペプチドの配列が配列番号１７で示される；
前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域の配列が配列番号１８で示され、重鎖可変領域の配列が配列番号１９で示され、
前記リンカーのアミノ酸配列が配列番号１３で示されることを特徴とする二重特異性抗体。

【請求項2】

前記二重特異性抗体が、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または組み換え抗体であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項3】

前記モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖がジスルフィド結合によって連結されており、
前記モノクローナル抗体のＦｃ断片が、ヒトまたはヒト化抗体のＦｃ断片であり、前記ヒトまたはヒト化抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の１種であることを特徴とする請求項１または２に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

前記モノクローナル抗体のＦｃ断片が、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ４抗体のＦｃ断片であることを特徴とする請求項３に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

前記モノクローナル抗体の軽鎖全長の配列が配列番号３で示され、重鎖全長の配列が配列番号１または配列番号２０で示されることを特徴とする請求項３に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードする遺伝子であって、
前記モノクローナル抗体の軽鎖全長のコーディング遺伝子配列が配列番号４で示され、
前記モノクローナル抗体の重鎖全長のコーディング遺伝子配列が配列番号２または配列番号２１で示され、
前記２つの一本鎖抗体のＣ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結する場合、前記一本鎖抗体のコーディング遺伝子配列が配列番号１４で示され、前記２つの一本鎖抗体のＮ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結する場合、前記一本鎖抗体のコーディング遺伝子配列が配列番号１５で示されることを特徴とする遺伝子。

【請求項7】

組換えＤＮＡ、発現カセット、ベクター、宿主細胞、組換え菌または細胞株を含むことを特徴とする請求項６に記載の遺伝子を含む生体材料。

【請求項8】

前記一本鎖抗体及びモノクローナル抗体のコーディング遺伝子を含む発現ベクターを構築すること、
前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記二重特異性抗体を安定して発現する宿主細胞を得ること、および
宿主細胞を培養し、分離精製によって前記二重特異性抗体を得ること、
を含むことを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載の二重特異性抗体の作製方法。

【請求項9】

請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体、または請求項６に記載の遺伝子、または請求項７に記載の生体材料の下記のいずれかの使用であって、
（１）ＣＤ１９を発現するＢ細胞関連疾患を治療または予防するための医薬品の製造における使用；
（２）ＣＤ１９を標的とする疾患を治療または予防するための医薬品の製造における使用；
（３）ＣＤ１９発現細胞を殺傷するための医薬品の製造における使用；及び
（４）ＣＤ１９及び／またはＣＤ３の検出試薬の製造における使用；
から選択され、前記ＣＤ１９を発現するＢ細胞関連疾患がＢ細胞関連腫瘍、Ｂ細胞による自己免疫疾患を含む、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１９年３月１９日に出願された発明の名称が「二重特異性抗体、及びその作製方法と使用」である中国発明特許第２０１９１０２０９３３０．４号の優先権を主張し、引用によりその全内容を本願に援用する。

【0002】

本発明は、バイオテクノロジー及び免疫学の技術分野に関するものであり、具体的に、ＣＤ１９とＣＤ３に結合する二重特異性抗体、及びその作製方法と使用に関するものである。

【背景技術】

【0003】

抗体医薬品は、細胞工学技術及び遺伝子工学技術を主体とする抗体工学技術によって作製された高分子医薬品であり、特異性が高く、特性が均一で、特定の標的に的を絞って作製できるなどの利点がある。モノクローナル抗体は、主に腫瘍の治療、免疫疾患の治療、および感染症の治療という３つの点で臨床的に使用されている。その中で、腫瘍の治療は、現在モノクローナル抗体が最も広く使用されている分野であり、現在すでに臨床試験に入ったモノクローナル抗体製品や市販されているモノクローナル抗体製品において、腫瘍の治療に使用されている製品の数はおよそ５０％を占めている。モノクローナル抗体による腫瘍の治療は、疾患細胞の特異的なターゲットを対象として免疫系を刺激して標的細胞を殺傷する免疫療法であり、抗体のエフェクター機能、特に腫瘍細胞を殺傷する効果を高めるために、さまざまな方法で抗体分子を改造することが試されていて、二重特異性抗体は、抗体の治療効果を改善するための開発方向の１つであり、抗体工学研究分野のホットスポットになっている。

【0004】

二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｓＡｂ）は、２つの異なる抗原または異なるエピトープを特異的に認識して結合する人工抗体である。当該２つの抗原が異なる細胞の表面にある場合、このような二重特異性抗体は２つの抗原分子の間に橋渡しをして、細胞間の架橋を形成し、細胞を介して指向性のエフェクター機能を獲得できる。ＢｓＡｂは、生物医学、特に腫瘍の免疫治療で広い応用の見通しがある。免疫治療に使用される二重特異性抗体（免疫二重抗体）は、細胞受容体抗原と結合する２つの特異的抗原結合部位を含む人工抗体であり、疾患細胞（標的細胞）と機能性細胞（免疫細胞）との間に橋渡しをして、指向性を有する免疫反応を誘起できる。ＢｓＡｂで免疫細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞など）により腫瘍細胞を殺傷することは、現在の免疫治療の使用研究のホットスポットとなり、その作用メカニズムは、ＢｓＡｂが腫瘍関連抗原と免疫エフェクター細胞上の標的分子に同時に結合し、免疫細胞を活性化させるとともに、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を特異的に殺傷するよう直接誘導することである。

【0005】

二重特異性抗体は、様々な手段により入手でき、その作製方法として主に化学的カップリング法、ハイブリッドハイブリドーマ法、および組み換え抗体の作製方法がある。化学的カップリング法は、化学的カップリングによって２つの異なるモノクローナル抗体を連結し、二重特異性モノクローナル抗体を作製するものであり、これが最初の二重特異性モノクローナル抗体である。ハイブリッドハイブリドーマ法は、ハイブリドーマ融合法またはトリオーマ法により二重特異性モノクローナル抗体を産生し、これらのハイブリドーマ融合法またはトリオーマは、構築されたハイブリドーマの融合、または作り出されたハイブリドーマとマウスからのリンパ球との融合により得られるものであり、マウス由来の二重特異性抗体の生産のみに使用できるため、その使用は大幅に制限されている。分子生物学技術の急速な発展に伴い、遺伝子工学におけるヒト化または全ヒト二重特異性抗体の複数種の構築法が現れ、主に二重特異性ミニ抗体、二本鎖抗体、一本鎖二価抗体、および多価二重特異性抗体という４種類を含む。現在、世界で複数種の遺伝子操作された二重特異性抗体医薬品が臨床試験段階に入っており、そして良好な応用の見通しを有することが示されている。

【0006】

Ｔ細胞表面におけるＣＤ３分子は、δ、ε、γ、ζという４つのサブユニットから構成されたものであり、それぞれの分子量が１８．９ｋＤａ、２３．１ｋＤａ、２０．５ｋＤａ、１８．７ｋＤａであり、それぞれの長さが１７１、２０７、１８２、１６４個のアミノ酸残基である。それらは、６本のペプチド鎖を形成し、さらにＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、 ＴＣＲ）と密接に結合して８本のペプチド鎖を含むＴＣＲ－ＣＤ３複合体を形成し、その構造模式図を図１に示す。この複合体は、Ｔ細胞の活性化、シグナル伝達、ＴＣＲ構造の安定化といった機能を有する。ＣＤ３の細胞質ドメインには免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ、ＩＴＡＭ）が含まれ、ＴＣＲが、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏ－ｃｏｍｐаｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）分子によって提示されたペプチド抗原を認識して結合するため、ＣＤ３におけるＩＴＡＭの保存配列内のチロシン残基が、Ｔ細胞内のｐ５６ｌｃｋチロシンキナーゼによりリン酸化され、ＳＨ２（Ｓｃｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ２）ドメインを含有する他のチロシンキナーゼ（例えばＺＡＰ－７０）を動員する。ＩＴＡＭのリン酸化及びＺＡＰ－７０との結合は、Ｔ細胞の活性化シグナル伝達プロセスの初期段階での重要な生化学反応の１つである。このため、ＣＤ３分子の機能は、ＴＣＲを介した抗原認識による活性化シグナルを伝達することである。

【0007】

ＣＤ１９はＢ４またはＬｅｕ－１２とも呼ばれ、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーに属し、その分子量が９５ｋＤａであり、１６番染色体の短腕に位置し、１５個のエクソンを含み、５５６個のアミノ酸からなるI型膜貫通糖タンパク質をコードし、免疫グロブリン遺伝子に組換えが起こる場合、最初に後期前駆Ｂ細胞と初期プレＢ細胞に発現する。ＣＤ１９は、Ｂ細胞から形質細胞に分化するまで、Ｂ細胞の発生及び成熟過程に渡って高発現し、その後発現量が低下していき、その成熟Ｂ細胞における発現レベルは未熟な細胞の３倍である。

【0008】

ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体（Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、 ＢＣＲ）依存性や非依存性シグナルを同時に調節することにより、Ｂ細胞シグナル閾値を決定し、Ｂ細胞の発生、増殖、および分化の制御において重要な役割を果たす。ＣＤ１９は、成熟Ｂ細胞の表面多分子複合体の主な構成要素として、受容体ＣＤ２１（ＣＤ２）、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ－１）及びＣＤ２２５とともに複合体を形成し、内因性および受容体を介して誘導されるシグナルを調整することにより、Ｂ細胞の分裂及び分化を開始させるのに必要な抗原濃度の閾値を下げる。ＣＤ８１は、シャペロンとして、シグナル伝達経路の分子結合部位を提供し、ＣＤ１９の発現を制御する。ＣＤ１９は、Ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼを動員して活性化を増幅することにより、チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）を活性化させ、ＢＣＲシグナルを活性化させる。同時に、ＢＣＲシグナルが活性化された場合、ＣＤ１９は、ＰＩ３Ｋ及び下流のＡｋｔキナーゼを活性化させることにより、ＢＣＲシグナルを増強し、Ｂ細胞の増殖を促進できる。

【0009】

ＣＤ１９は、正常Ｂリンパ球および悪性Ｂリンパ球のいずれにおいても発現し、Ｂ細胞の発生過程において、長期間に渡る最も信頼できる表面マーカーの１つと見なされている。正常リンパ組織において、ＣＤ１９は、プレＢ細胞、Ｂ細胞、濾胞樹状細胞、マントル細胞、濾胞間域Ｔ細胞領域の樹状細胞において発現している。また、フローサイトメトリー法によって検出すると、ヒト組織から分離された形質細胞においてＣＤ１９を検出できる。通常、ＣＤ１９は、Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫を含むＢ細胞腫瘍において発現している。このため、ＣＤ１９は、Ｂ細胞性悪性腫瘍を治療するための特異的分子標的となっている。近年、ＣＤ１９を標的とする免疫療法の戦略は、前臨床および臨床研究で広く発展しており、モノクローナル抗体、二重特異性抗体及びキメラ抗原受容体遺伝子改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）でも、通常の小分子薬の療法よりも顕著に優れる臨床効果を達成し、免疫療法の進歩を促進した。

【0010】

腫瘍に対する養子免疫療法は、自体又は異体からの免疫担当細胞を体外で増殖させた後、患者の体内に投与して腫瘍細胞を直接殺し、生体の免疫機能を調節・強化するものであり、主にＬＡＫ細胞、ＴＩＬ細胞、活性化されたＴリンパ球及びＣＩＫ細胞の免疫療法を含む。免疫療法は、散在しているわずかな腫瘍細胞しか除去できないため、末期の固形腫瘍に対する有効性が限られている。このため、免疫療法は補助療法として、手術、化学療法、放射線治療などの通常の方法と併用することがよくある。まず、通常の方法で大量の腫瘍細胞を除去した後、さらに免疫療法で残りの腫瘍細胞を除去することにより、腫瘍の集学的治療の効果を高めることができる。腫瘍の集学的治療での新しい方法の１つとして、養子免疫療法は、すでに通常の手術治療、放射線治療、化学療法及び他の免疫細胞療法並びに分子療法と広く併用されており、複数種の腫瘍の治療において幅広い応用の見通しがある。しかしながら、二重特異性抗体を組み合わせる、理想的な腫瘍養子免疫療法は、二重特異性抗体の一端が免疫細胞の表面抗原（例えばＣＤ３）に結合して、それとともに生体内に投与され、二重特異性抗体のもう一端が腫瘍細胞の表面抗原によく結合するものでなければならず、これで、二重特異性抗体が、生体内で腫瘍細胞と免疫細胞との間に橋渡しをして、免疫細胞を腫瘍細胞の周りに集め、さらに腫瘍細胞を殺傷する。このような方法によれば、腫瘍細胞の転移及び拡散を効果的に抑制でき、手術、放射線治療、化学療法という従来の三大治療法の「完治できず、転移しやすく、副作用が強い」などの短所を克服できる。従って、腫瘍細胞と免疫細胞に結合する効率的な二重特異性抗体を開発することは、重要な意味を持つ。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】中国発明特許第２０１９１０２０９３３０．４号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、先行技術に存在する課題を解決するために、ＣＤ１９とＣＤ３に結合し、特異的な標的作用を有し、指向性免疫反応を効率的に誘起できる二重特異性抗体、及びその作製方法と使用を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記の目的を達成するために、本発明の技術案は下記の通りである。

【0014】

本発明は、ＣＤ１９とＣＤ３に結合する二重特異性抗体の分子構造を設計・スクリーニングすることによって、下記のような対称構造を有する二重特異性抗体が、それに対応するモノクローナル抗体、または他の構造の二重特異性抗体と比べ、元の抗体の特異的結合能をよりよく保持できるとともに、２つのモノクローナル抗体の生物学的機能を有するため、製造プロセスや薬効などの点で明らかな優位性を有することを創造的に見出した。前記二重特異性抗体は、（ａ）２つの完全な軽鎖－重鎖ペアからなるモノクローナル抗体単位と、（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む完全に同じである２つの一本鎖抗体を含む一本鎖抗体単位とを含有するものであり、その中で、一本鎖抗体単位は免疫細胞の表面抗原ＣＤ３に対して特異的結合能を有し、モノクローナル抗体単位は腫瘍細胞の表面抗原ＣＤ１９に対して特異的結合能を有する。一本鎖抗体単位はリンカーによってモノクローナル抗体単位のＮ末端又はＣ末端に連結している。本発明は、上記のような抗体分子構造を有する、ＣＤ１９とＣＤ３に結合する二重特異性抗体を開発した。この二重特異性抗体は、特異的な標的作用を有し、指向性を有する免疫反応を効率的に誘起でき、腫瘍細胞を殺傷することができる。

【0015】

具体的に、まず、本発明は、（ａ）２つの完全な軽鎖－重鎖ペアであり、ＣＤ１９に特異的に結合できるモノクローナル抗体単位と、（ｂ）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、且つＣＤ３に特異的に結合できる２つの一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）を含む一本鎖抗体単位と、を含み、下記のいずれかの連結方式によって連結された対称構造である二重特異性抗体を提供する。

【0016】

（１）前記２つの一本鎖抗体のＮ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結する方式。

【0017】

（２）前記２つの一本鎖抗体のＣ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結する方式。

【0018】

好ましくは、前記リンカーのアミノ酸配列が（ＧＧＧＧＸ）ｎであり、その中で、ＸがＧｌｙまたはＳｅｒであり、ｎが１～４の自然数である（即ち、１、２、３又は４である）。上記配列を有するリンカーを使用する場合、前記二重特異性抗体は、抗原結合能をよりよく発揮できる。

【0019】

本発明の好ましい実施態様として、前記リンカーのアミノ酸配列が配列番号１３で示される。

【0020】

好ましくは、前記一本鎖抗体の軽鎖のアミノ酸配列が配列番号５または配列番号９で示される。

【0021】

前記一本鎖抗体の重鎖のアミノ酸配列が配列番号６または配列番号１０で示される。

【0022】

前記一本鎖抗体の軽鎖及び重鎖はいずれも免疫細胞の表面抗原ＣＤ３に特異的に結合できる。

【0023】

本発明は、膜融合ペプチドを採用して一本鎖抗体を発現し、特定の抗体構造及び配列設計によって、一本鎖抗体とモノクローナル抗体との連結方式が異なる場合、それぞれ特定の一本鎖抗体膜融合ペプチド配列を採用することにより、抗体構造の安定性をより向上でき、２種類の抗原によりよく結合できることを発見した。

【0024】

前記二重特異性抗体における一本鎖抗体単位では、好ましくは、前記一本鎖抗体の軽鎖と重鎖で膜融合ペプチドを構成し、前記膜融合ペプチドの配列が下記のいずれかである。
（１）前記２つの一本鎖抗体のＮ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結する場合、前記膜融合ペプチドの配列が配列番号１７で示される。
（２）前記２つの一本鎖抗体のＣ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結する場合、前記膜融合ペプチドの配列が配列番号１６で示される。

【0025】

前記二重特異性抗体のモノクローナル抗体では、好ましくは、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域の配列は、配列番号１８で示されるか、または配列番号１８で示されるアミノ酸配列における１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入により得られた同じ機能を持つポリペプチドのアミノ酸配列である。

【0026】

前記モノクローナル抗体の重鎖可変領域の配列は、配列番号１９で示されるか、または配列番号１９で示されるアミノ酸配列における１または複数のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入により得られた同じ機能を持つポリペプチドのアミノ酸配列である。

【0027】

本発明において、前記二重特異性抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または組み換え抗体であってもよい。

【0028】

本発明の好ましい実施態様として、前記モノクローナル抗体の軽鎖と重鎖はジスルフィド結合によって連結されている。前記モノクローナル抗体のＦｃ断片は、ヒトまたはヒト化抗体のＦｃ断片である。

【0029】

好ましくは、前記ヒトまたはヒト化抗体はＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体の１種を含む。

【0030】

本発明の好ましい実施態様として、前記モノクローナル抗体のＦｃ断片は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ４抗体のＦｃ断片である。

【0031】

本発明の好ましい実施態様として、前記モノクローナル抗体の軽鎖全長の配列は配列番号３で示される。前記モノクローナル抗体の重鎖全長の配列は配列番号１または配列番号２０で示される。

【0032】

本発明において、上記「１または複数のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入により得られた同じ機能を持つ蛋白質のアミノ酸配列」は、１または複数のアミノ酸残基が、示される配列と異なるが、得られた分子の生物学的活性を保持できる配列を意味する。それは「保存的に修飾された変異体」、または「保存的アミノ酸置換」によって改変されたものである。「保存的に修飾された変異体」、または「保存的アミノ酸置換」は、当業者が知っているアミノ酸置換を意味し、このような置換を行う場合、通常、得られた分子の生物学的活性が変化しない。一般的に、当業者は、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が生物学的活性を基本的に変化させないことを認識している。例示的な置換は、好ましくは、以下に示す置換に従って行う。

【0033】

【表1】

【0034】

本発明は、上記二重特異性抗体の例示として、ヒトのＣＤ３及びＣＤ１９に対する二重特異性抗体を提供する。本発明では、上記一本鎖抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及びモノクローナル抗体の重鎖と軽鎖を有する構造及びアミノ酸配列をスクリーニングすることで、２つの対応するモノクローナル抗体の生物学的機能を最大限に保持でき、且つ製造プロセスや薬効などの点において明らかな優位性を有する、ＣＤ１９とＣＤ３に結合する二重特異性抗体が得られた。その構造及びアミノ酸配列を下記に示す：

【0035】

（１）一本鎖抗体の軽鎖と重鎖とからなる膜融合ペプチドのアミノ酸配列が配列番号１６で示され、モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３で示され、モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列が配列番号１で示される。抗体の構造は、２つの一本鎖抗体の膜融合ペプチドのＣ末端がそれぞれアミノ酸配列が配列番号１３で示されるリンカーによってモノクローナル抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結する対称構造である（図２Ａに示す）。

【0036】

（２）一本鎖抗体の軽鎖と重鎖とからなる膜融合ペプチドのアミノ酸配列が配列番号１７で示され、モノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列が配列番号３で示され、モノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列が配列番号２０で示される。抗体の構造は、２つの一本鎖抗体の膜融合ペプチドのＮ末端がそれぞれアミノ酸配列が配列番号１３で示されるリンカーによってモノクローナル抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結する対称構造である（図２Ｂに示す）。

【0037】

上記二重特異性抗体のアミノ酸配列に基づいて、本発明は、前記二重特異性抗体をコードする遺伝子を提供する。

【0038】

コドンのコーディング規則及びコドンの縮退と偏位に従って、当業者は、上記二重特異性抗体のアミノ酸配列に応じて、コーディング遺伝子（ｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ）を設計することができる。

【0039】

本発明の好ましい実施態様として、前記モノクローナル抗体の軽鎖全長のコーディング遺伝子配列が配列番号４で示される。

【0040】

本発明の好ましい実施態様として、前記モノクローナル抗体の重鎖全長のコーディング遺伝子配列が配列番号２または配列番号２１で示される。

【0041】

本発明の好ましい実施態様として、前記２つの一本鎖抗体のＣ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結する場合、前記一本鎖抗体のコーディング遺伝子配列が配列番号１４で示される。前記２つの一本鎖抗体のＮ末端がそれぞれリンカーによって前記モノクローナル抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結する場合、前記一本鎖抗体のコーディング遺伝子配列が配列番号１５で示される。

【0042】

上記遺伝子配列は、組み合わせることで前記二重特異性抗体の発現に使用でき、または、前記二重特異性抗体におけるほかの単位をコードする遺伝子配列と組み合わせることで前記二重特異性抗体の発現に使用できる。

【0043】

さらに、本発明は、前記遺伝子を含む生体材料を提供する。

【0044】

本発明において、前記生体材料は、組換えＤＮＡ、発現カセット、ベクター、宿主細胞、組換え菌または細胞株を含む。

【0045】

本発明は、さらに、前記一本鎖抗体及びモノクローナル抗体のコーディング遺伝子を含む発現ベクターを構築すること、前記発現ベクターを宿主細胞に導入して、前記二重特異性抗体を安定発現できる宿主細胞を得ること、および、宿主細胞を培養し、分離精製によって前記二重特異性抗体を得ること、を含む前記二重特異性抗体の作製方法を提供する。

【0046】

前記二重特異性抗体を作製する場合、当業者は、必要に応じて、当分野の慣用の宿主細胞、発現ベクター、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、および抗体の分離精製方法を選択することができる。

【0047】

本発明の実施態様として、前記宿主細胞がＣＨＯ－Ｋ１細胞である。

【0048】

本発明の実施態様として、前記発現ベクターがｐＧ４ＨＫである。

【0049】

前記発現ベクターの構築では、当分野の慣用の方法を使用することができる。本発明の好ましい実施態様として、前記発現ベクターの構築では、前記抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の軽鎖のコーディング遺伝子をＳａｌＩ及びＢｓｉＷＩの二重酵素切断（Ｄｏｕｂｌｅ Ｄｉｇｅｓｔｓ）により発現ベクターｐＧ４ＨＫに組み込み、抗ＣＤ１９軽鎖の発現ベクターを得、プラスミドをｐＧ４ＨＫ１９ＶＬと命名する。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｔＥＩＩの二重酵素切断によって、抗ＣＤ３一本鎖抗体のコーディング遺伝子と抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖遺伝子との融合断片をベクターｐＧ４ＨＫ１９ＶＬに組み込み、二重特異性抗体の発現ベクターを得る。

【0050】

前記分離精製は、当分野の慣用の抗体分離精製の方法を使用することができる。

【0051】

本発明の実施態様として、前記分離精製は、下記の工程を含む：
（１）組換えｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムによって、培養上清からＦｃドメインを持つ抗体をすべで分離する工程、
（２）Ｑセファロースを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによって副生成物から二重特異性抗体を分離する工程、および
（３）分子ふるいクロマトグラフィーによって二重特異性抗体を精製する工程。

【0052】

上記二重特異性抗体に基づいて、本発明は、本発明に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。

【0053】

好ましくは、前記医薬組成物は、さらに、薬学的に許容される他の有効成分または賦形剤を含む。

【0054】

さらに、本発明は、前記二重特異性抗体、前記二重特異性抗体のコーディング遺伝子、または前記コーディング遺伝子を含む生体材料の、下記のいずれかの使用を提供する。
（１）ＣＤ１９を発現するＢ細胞関連疾患を治療または予防する医薬品の製造における使用、
（２）ＣＤ１９を標的とする疾患を治療または予防する医薬品の製造における使用、
（３）ＣＤ１９発現細胞を殺傷するための医薬品の製造における使用、
（４）ＣＤ１９及び／またはＣＤ３検出試薬の製造における使用。

【0055】

本発明において、前記ＣＤ１９を発現するＢ細胞関連疾患は、Ｂ細胞関連腫瘍、Ｂ細胞による自己免疫疾患を含むが、これらに限定されるものではない。

【0056】

前記Ｂ細胞関連腫瘍は、Ｂリンパ腫、Ｂ細胞性リンパ性白血病を含むが、これらに限定されるものではない。

【0057】

本発明の有益な効果は以下の通りである。本発明は、遺伝子工学及び抗体工学的手法を利用して、一本鎖抗体及び完全なモノクローナル抗体の構造を含む、ＣＤ１９とＣＤ３に結合する二重特異性抗体を構築し、この二重特異性抗体融合タンパク質は、完全なモノクローナル抗体の構造を保持でき、且つ非常に安定した対称構造を有するため、抗ＣＤ３一本鎖抗体及び抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の生物学的機能をよりよく保持でき、１つの二重特異性抗体として抗ＣＤ１９モノクローナル抗体および抗ＣＤ３モノクローナル抗体の優れる生物学的機能を同時に備えることを実現し、腫瘍細胞と免疫エフェクター細胞との間に橋渡しをして、免疫エフェクター細胞及び指向性免疫反応を効率的に誘起でき、腫瘍細胞を殺傷する免疫細胞の効力を大幅に高め、同時にＡＤＣＣ活性を最小限に抑え、高い安全性を有する。また、本発明が提供する二重特異性抗体は、構造が完全に対称となるという特徴を有するため、宿主に発現する場合、他の構造のタンパク質のアイソフォームを産生せず、抽出・精製プロセスの難易度を大幅に下げることができ、製造が簡単で、収率が高く、腫瘍免疫療法において広い使用の見通しがある。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】本発明の背景技術に記載の細胞の表面抗原ＣＤ３分子の構造模式図である。

【図2】本発明の実施例１でスクリーニングにより得られた２つの二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２の分子の構造模式図であり、その中で、Ａが二重特異性抗体ＹＫ００１であり、Ｂが二重特異性抗体ＹＫ００２である。

【図3】本発明の実施例２の二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動図であり、その中で、Ａ及びＣが還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動検出であり、Ｂ及びＤが非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動検出であり、Ａ及びＢが二重特異性抗体ＹＫ００１のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動結果であり、Ｃ及びＤが二重特異性抗体ＹＫ００２のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動結果であり、Ｍがタンパク質分子量マーカーを表し、レーン１が目的タンパク質である。

【図4】本発明の実施例２の二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２の、ＨＰＬＣ－ＳＥＣによる純度に関するピークグラフであり、その中で、Ａが二重特異性抗体ＹＫ００１であり、Ｂが二重特異性抗体ＹＫ００２である。

【図5】本発明の実施例３のフローサイトメトリー法により測定された二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２とＲａｊｉ細胞との結合率であり、その中で、ＡがネガティブコントロールＮＣであり、Ｂが二重特異性抗体ＹＫ００１であり、Ｃがポジティブコントロール抗体（ＰＣ）Ａｎｔｉ－ＣＤ１９であり、ＤがネガティブコントロールＮＣであり、Ｅが二重特異性抗体ＹＫ００２であり、Ｆがポジティブコントロール抗体（ＰＣ）Ａｎｔｉ－ＣＤ１９である。

【図6】本発明の実施例３のフローサイトメトリー法により測定された二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２とＴ細胞との結合率であり、その中で、ＡがネガティブコントロールＮＣであり、Ｂが二重特異性抗体ＹＫ００１であり、Ｃが二重特異性抗体ＹＫ００２であり、Ｄがポジティブコントロール抗体（ＰＣ）Ａｎｔｉ－ＣＤ３である。

【図7】本発明の実施例４の二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２がＰＢＭＣ細胞を効率的に介してＲａｊｉ腫瘍細胞を殺傷する結果を示す図であり、その中で、「▼」が二重特異性抗体ＹＫ００１を表し、「▽」が二重特異性抗体ＹＫ００２を表し、「■」がＡｎｔｉ－ＣＤ１９モノクローナル抗体を表し、「■」が無関係コントロール０５２７×ＣＤ３二重特異性抗体（Ｈｅｒ２×ＣＤ３二重特異性抗体）を表し、「●」がＡｎｔｉ－ＣＤ３モノクローナル抗体を表す。

【発明を実施するための形態】

【0059】

以下、実施例を組み合わせて本発明の好ましい実施形態を説明する。以下の実施例が、説明のために例示されたものであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことを理解できるはずである。当業者は、本発明の趣旨および精神から逸脱しない範疇で本発明に対して様々な修正や置換を行い得る。

【0060】

特に説明のない限り、下記の実施例に使用された実験方法は、いずれも一般的な方法である。

【0061】

特に説明のない限り、下記の実施例に使用された材料、試薬などは、いずれも市販されたものである。

【0062】

実施例１ ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体の構造及び配列の設計
本実施例では、腫瘍細胞の表面抗原ＣＤ１９及び免疫細胞の表面抗原ＣＤ３を標的とし、二重特異性抗体を設計した。

【0063】

タンパク質構造設計ソフトウェア及び大量の人工的実験によるスクリーニングと組み合わせて、本発明は、ＣＤ１９及びＣＤ３に結合する複数種の二重特異性抗体をスクリーニングして、一本鎖抗体単位及びモノクローナル抗体単位を含み、且つ対称構造を有する二重特異性抗体の構造を決定した。その中で、抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体単位がＩｇＧ抗体であり、２つの完全な軽鎖－重鎖ペアを含み（即ち、完全なＦａｂ及びＦｃドメインを有し、軽鎖と重鎖とがジスルフィド結合によって連結されている）、抗－ＣＤ３一本鎖抗体単位が２つの一本鎖抗体を含み、各一本鎖抗体がいずれも重鎖可変領域及び軽鎖可変領域ドメインを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域でリンカーを介して膜融合ペプチドを構築した。一本鎖抗体とモノクローナル抗体がリンカーで連結されており、一本鎖抗体とモノクローナル抗体との連結方式として、２つの異なる連結方式を設計することにより、異なる対称構造を有する２つの二重特異性抗体を得た。
（１）リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３で示される）により抗－ＣＤ３一本鎖抗体のＣ末端を抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖のＮ末端に連結し、二重特異性抗体ＹＫ００１を得た（構造模式図を図２Ａに示す）。
（２）リンカーＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３で示される）により抗－ＣＤ３一本鎖抗体のＮ末端を抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖のＣ末端に連結し、二重特異性抗体ＹＫ００２を得た（構造模式図を図２Ｂに示す）。

【0064】

上記二重特異性抗体の各ドメインのアミノ酸配列が下記の通りである。

【0065】

ＹＫ００１の抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１９で示され、重鎖全長のアミノ酸配列は配列番号１で示される。

【0066】

ＹＫ００２の抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１９で示され、重鎖全長のアミノ酸配列は配列番号２０で示される。

【0067】

抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８で示され、軽鎖全長のアミノ酸配列は配列番号３で示される（ＹＫ００１とＹＫ００２が同じである）。

【0068】

ＹＫ００１における抗－ＣＤ３一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１６で示される。

【0069】

ＹＫ００２における抗－ＣＤ３一本鎖抗体のアミノ酸配列は配列番号１７で示される。

【0070】

実施例２ ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性抗体の作製
１、二重特異性抗体のコーディング遺伝子の設計及び合成
実施例１で設計及びスクリーニングによって得られた２つの二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２のアミノ酸配列、及び宿主細胞のコドンの偏位に従って、二重特異性抗体のコーディング遺伝子を設計し、具体的な配列は下記の通りである。

【0071】

ＹＫ００１の抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２で示される。

【0072】

ＹＫ００２の抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２１で示される。

【0073】

抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４で示される（ＹＫ００１とＹＫ００２が同じである）。

【0074】

ＹＫ００１における抗－ＣＤ３一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４で示される。

【0075】

ＹＫ００２における抗－ＣＤ３一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５で示される。

【0076】

発現ベクターの構築を容易にするために、抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の軽鎖のコーディング遺伝子断片（ＹＫ００１とＹＫ００２が同じである）、および抗－ＣＤ３一本鎖抗体のコーディング遺伝子－抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖のコーディング遺伝子の融合断片（ＹＫ００１、即ち、抗－ＣＤ３一本鎖抗体のＣ末端を抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖のＮ末端に連結したもの）、及び抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖のコーディング遺伝子－抗ＣＤ３一本鎖抗体のコーディング遺伝子の融合断片（ＹＫ００２、即ち、抗－ＣＤ３一本鎖抗体のＮ末端を抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖のＣ末端に連結したもの）を合成した。

【0077】

２、二重特異性抗体の発現ベクターの構築
（１）ＳａｌＩ及びＢｓｉＷＩの二重酵素切断により、抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の軽鎖のコーディング遺伝子を、発現ベクターｐＧ４ＨＫに取り組み、抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体の軽鎖の発現ベクターを得、プラスミドをｐＧ４ＨＫ１９ＶＬと命名した。

【0078】

（２）Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢｓｔＥ ＩＩの二重酵素切断により、抗－ＣＤ３一本鎖抗体の軽鎖のコーディング遺伝子－抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖のコーディング遺伝子の融合断片を、発現ベクターｐＧ４ＨＫ１９ＶＬに取り組み、二重特異性抗体ＹＫ００１の発現ベクターを得、プラスミドをｐＧ４ＨＫ－ＹＫ００１と命名した。

【0079】

（３）Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＢｓｔＥ ＩＩの二重酵素切断により、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の重鎖のコーディング遺伝子－抗ＣＤ３一本鎖抗体のコーディング遺伝子の融合断片を、発現ベクターｐＧ４ＨＫ１９ＶＬに取り組み、二重特異性抗体ＹＫ００２の発現ベクターを得、プラスミドをｐＧ４ＨＫ－ＹＫ００２と命名した。

【0080】

３、二重特異性抗体の発現
（１）ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｔｉａｇｅｎ、４９９１０８３）を用いて、プラスミドを大規模に抽出し、具体的な操作は、キットの取扱説明書に従って行った。

【0081】

（２）トランスフェクション用細胞の用意
１）ＣＨＯ－Ｋ１細胞を再培養し、６×１０^６個の細胞をＣＤ－ＣＨＯ培地１２ｍｌ（６ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸを含む）に接種し、密度が０．５×１０^６／ｍｌであり、５％ＣＯ_２、３７℃、１３５ｒｐｍでシェーカー培養した。
２）トランスフェクトの前日に、細胞密度が０．５×１０^６／ｍｌとなるように調整し、５％ＣＯ_２、３７℃、１３５ｒｐｍでシェーカー培養した。

【0082】

（３）エレクトロポレーションによるトランスフェクション
１）細胞数を計測して細胞濃度を測定し、細胞生存率９５％以上を確保する。
２）１×１０^７細胞を取り、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を新鮮なＣＤ－ＣＨＯ培地に懸濁させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、もう一度洗浄を繰り返した。
３）ＣＤ－ＣＨＯ培地０．７ｍｌに細胞を懸濁させ、発現ベクター４０μｇを加え、均一に混合し、０．４ｃｍのキュベットに移し、電気ショックを行った。
４）電気ショックを行った後、細胞をＣＤ－ＣＨＯ培地（ｗｉｔｈｏｕｔ ＧｌｕｔａＭＡＸ）中に速く移し、９６ウェルプレートに均一にまき、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。
５）トランスフェクション後の２４時間目に、最終濃度が５０μＭになるように各ウェルにＭＳＸを追加し、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
６）二重特異性抗体を高度に発現するモノクローナル細胞株を選別し、流加培養し、１４日間培養した後、上清を収集した。

【0083】

４、二重特異性抗体の精製
（１）試料液の前処理
培養された上清を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、０．２２μｍのメンブレーンフィルターで濾過処理した。

【0084】

（２）アフィニティークロマトグラフィー
Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ社から購入、商品番号１８－５４３８－０２）を用い、前処理された発酵液における抗体を捕捉した。緩衝液（１０ｍＭ ＰＢＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）でクロマトグラフィーカラムの平衡化を十分に行い、試料液をアフィニティークロマトグラフィーカラムに流し、溶離液（０．１Ｍ クエン酸、ｐＨ３．０）で溶出した。

【0085】

（３）陽イオン交換クロマトグラフィー
アフィニティークロマトグラフィーにより作製されたサンプルを、ＳＰ陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。陽イオン交換カラムはＧＥ社（１７－１０１４－０１、１７－１０１４－０３）から購入したものであり、緩衝液（５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ５．５）でクロマトグラフィーカラムの平衡化を行い、前記サンプルをＳＰカラムに流して結合させ、２０カラム体積の溶離液（５０ｍＭ ＰＢＳ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）でリニアグラジエント溶出を行った。

【0086】

（４）陰イオン交換クロマトグラフィー
ＳＰ陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製後、さらにＱセファロースを用いたイオン交換カラム（ＧＥ社から購入、商品番号：１７－１１５３－０１、１７－１１５４－０１）に流した。使用する緩衝液は５０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ５．５である。

【0087】

上記精製後の二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２に対して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図３に示し、ＹＫ００１の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動検出結果を図３Ａに示し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動検出結果を図３Ｂに示す。ＹＫ００２の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動検出結果を図３Ｃに示し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動検出結果を図３Ｄに示す。ＨＰＬＣ－ＳＥＣの結果を図４に示し、その中で、ＹＫ００１のＳＥＣ検出結果を図４Ａに示し、ＹＫ００２のＳＥＣ検出結果を図４Ｂに示す。検出結果によれば、発現及び精製によって二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２の作製に成功し、精製後の二重特異性抗体の純度が９５％以上であることが示されている。

【0088】

実施例３ 二重特異性抗体と腫瘍細胞や免疫細胞との結合活性の測定
Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ社から購入、ＣＣＬ－８６）をＣＤ１９陽性細胞として、Ｔ細胞をＣＤ３陽性細胞として、フローサイトメトリー法によって本発明の二重特異性抗体と、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞やＣＤ３を発現する免疫細胞の標的抗原との結合活性を測定した。

【0089】

１、フローサイトメトリー法による二重特異性抗体とＲａｊｉ細胞との結合活性の測定。
（１）Ｒａｊｉ細胞の収集：１×１０^６ｃｅｌｌ／チューブで収集した。
（２）細胞の洗浄：ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ｗ／ｖＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）１ｍｌで細胞を一回洗浄し、３５０×ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離した後、ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ２００μｌで細胞を再懸濁した。
（３）Ｂｓ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ：５μｇ／ｍｌまで二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２をそれぞれ加え、氷上で４５ｍｉｎインキュベートした。
（４）細胞の洗浄：細胞懸濁液にｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌを添加し、均一に混合し、３５０×ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、もう一度洗浄を繰り返した。遠心分離後、ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌで細胞を再懸濁した。
（５）サンプルチューブにｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体５μｌ（ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３０４）を加え、アイソタイプコントロールチューブにアイソタイプコントロール（ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ（ＦＣ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４００２１３ ）を加え、氷上で１５ｍｉｎ、遮光してインキュベートした。
（６）細胞の洗浄：細胞懸濁液にｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌを添加し、均一に混合し、３５０×ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、もう一度洗浄を繰り返した。
（７）アナライザーによる測定：ＰＢＳ ２００μｌで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターによって測定した。

【0090】

フローサイトメーターの検出結果を図５に示し、その中で、ＹＫ００１とＲａｊｉ細胞の結合の検出結果を図５Ａ、Ｂ、Ｃに示し、ＹＫ００２とＲａｊｉ細胞の結合の検出結果を図５Ｄ、Ｅ、Ｆに示す。結果によれば、二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２がいずれもＲａｊｉ細胞に特異的に結合でき、即ち、二重特異性抗体融合タンパク質がモノクローナル抗体Ａｎｔｉ－ＣＤ１９の結合機能を保持したことが示されている。

【0091】

２、フローサイトメトリー法による二重特異性抗体とＴ細胞との結合活性の測定。
（１）Ｔ細胞の収集：１×１０^６ｃｅｌｌ／チューブで収集する。
（２）細胞の洗浄：ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ｗ／ｖＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）１ｍｌで細胞を一回洗浄し、３５０×ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離した後、ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ ２００μｌで細胞を再懸濁した。
（３）Ｂｓ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ：５μｇ／ｍｌまで二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２をそれぞれ加え、氷上で４５ｍｉｎインキュベートした。
（４）細胞の洗浄：細胞懸濁液にｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌを添加し、均一に混合し、３５０×ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、もう一度洗浄を繰り返した。遠心分離後、ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １００μｌで細胞を再懸濁した。
（５）サンプルチューブにｂｉｏｌｅｇｅｎｄ抗体５μｌ（ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４０９３０４）を加え、アイソタイプコントロールチューブにアイソタイプコントロール（ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、κ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌ（ＦＣ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４００２１３）を加え、氷上で１５ｍｉｎ、遮光してインキュベートした。
（６）細胞の洗浄：細胞懸濁液にｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌを添加し、均一に混合し、３５０×ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、もう一度洗浄を繰り返した。
（７）アナライザーによる測定：ＰＢＳ２００μｌで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターによって測定した。

【0092】

フローサイトメーターの検出結果を図６に示し、その中で、ＹＫ００１とＴ細胞の結合の検出結果を図６Ａ、Ｂに示し、ＹＫ００２とＴ細胞の結合の検出結果を図６Ｃ、Ｄに示す。結果によれば、二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２がいずれもＴ細胞に特異的に結合でき、即ち、二重特異性抗体融合タンパク質が一本鎖抗体Ａｎｔｉ－ＣＤ３の結合機能を保持したことが示されている。

【0093】

実施例４ 二重特異性抗体が媒介した体外細胞への殺傷効率の測定
本実施例は、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃを標的細胞として、ＰＢＭＣを免疫エフェクター細胞として、二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２が媒介した標的細胞への殺傷効果を測定し、抗－ＣＤ３モノクローナル抗体と抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体及び０５２７×ＣＤ３二重特異性抗体をコントロールとした。

【0094】

１、標的細胞の用意。
Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ標識Ｒａｊｉ細胞）を標的細胞として、ピペッティングしてから標的細胞を計数し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、ＰＢＳで一回洗浄した。標的細胞を遠心分離した後、ＧＴ－Ｔ５５１培地で密度が０．２×１０^６／ｍｌとなるように調節し、１ウェルあたり５０μｌを加え、１ウェルにおける細胞数が１００００個となる。

【0095】

２、ＰＢＭＣの用意。
ＰＢＭＣをエフェクター細胞とした。液体窒素タンク内に凍結保存されたＰＢＭＣを取り出して解凍し（細胞の凍結保存及び再培養を参考）、ＰＢＳまたはＧＴ－Ｔ５５１培地を含む１５ｍｌの遠心チューブに加え、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、ＰＢＳまたはＧＴ－Ｔ５５１培地で二回洗浄し、細胞数、生存率および密度を計測し、密度が０．２×１０^６／ｍｌとなるように調節し、１ウェルあたり５０μｌを加え、１ウェルにおける細胞数が１０００００個となる。

【0096】

３、抗体の希釈
ＧＴ－Ｔ５５１培地でそれぞれ二重特異性抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２を希釈し、抗体ＹＫ００１及びＹＫ００２の初期濃度が１０ｎＭとなるように調節した。１：５の割合で順次希釈した。希釈された抗体１００μｌを上記で用意した細胞に加え、均一に混合し、９６ウェルプレートをインキュベーターに置き、１８時間後殺傷効果を検出した。

【0097】

４、検出
Ｒａｊｉ標的細胞が、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を持つため、ＬＵＭＩＮＥＸ技術で標的細胞への殺傷効果を検出した。

【0098】

ｓｔｅａｙ－ＧＬＯ（ｐｒｏｍｅｇａ社）を基質として、キット内のｂｕｆｆｅｒを解凍して基質粉末に加え、均一に混合し、１本あたり５ｍｌまたは１０ｍｌ分注し、ｓｔｅａｄｙ－ＧＬＯ基質の再構築を完了した。

【0099】

共培養された細胞をピペッティングしてから１００μｌを取って不透明な白プレートに移し、再構築のｓｔｅａｙ－ＧＬＯ基質１００μｌを加え、均一に混合するように軽くたたき、５分間放置した後プレートを読み取った。検出装置はｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴである。

【0100】

５、データ処理
標的細胞の殺傷率の計算式は次の通りである。

【0101】

標的細胞の殺傷率＝１００×（Ｏｎｌｙ ｔａｒｇｅｔ－ｔｅｓｔ ｗｅｌｌ）／Ｏｎｌｙ ｔａｒｇｅｔ

【0102】

すべてのウェルの標的細胞の殺傷率に対応する抗体濃度をｌｏｇ１０に変換し、これを横軸に、殺傷率を縦軸にしてグラフを作成し、結果を図７に示す。ソフトウェアＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０で結果を分析し、二重特異性抗体のＩＣ５０を計算し、結果を表２に示す。結果によれば、コントロール抗体（抗－ＣＤ３モノクローナル抗体と抗－ＣＤ１９モノクローナル抗体及び０５２７×ＣＤ３二重特異性抗体）と比べて、二重特異性抗体ＹＫ００１及び００２はいずれもＰＢＭＣを介して腫瘍細胞系Ｒａｊｉ－Ｌｕｃを効率的に殺傷することができ、ＹＫ００１や００２の単一分子でも同時にＡｎｔｉ－ＣＤ１９モノクローナル抗体とＡｎｔｉ－ＣＤ３モノクローナル抗体の生物学的機能を有し、ＹＫ００１が媒介した標的細胞を殺傷する効力が、ＹＫ００２より高いことが示されている。

【0103】

【表2】

【0104】

なお、上記において、一般的な説明及び具体的な実施形態を用いて本発明を詳しく説明したが、本発明に基づき、いくつかの修正や改善を行い得ることは、当業者にとって自明である。よって、本発明の趣旨から逸脱しない範疇で行われるこれらの修正やは改善は、いずれも本発明の保護しようとする範囲に属す。

【0105】

本発明は、二重特異性抗体、及びその作製方法と使用を提供する。本発明の二重特異性抗体は、２つの完全な軽鎖－重鎖ペアであり、腫瘍細胞の表面抗原に特異的に結合できるモノクローナル抗体単位と、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、且つ免疫細胞の表面抗原に特異的に結合できる２つの一本鎖抗体を含む一本鎖抗体単位と、を含む。本発明が提供する二重特異性抗体は、（１）２つの一本鎖抗体のＣ末端がそれぞれリンカーによってモノクローナル抗体の２つの重鎖のＮ末端に連結する方式と、（２）２つの一本鎖抗体のＮ末端がそれぞれリンカーによってモノクローナル抗体の２つの重鎖のＣ末端に連結する方式のいずれかの連結方式によって連結された対称構造である。本発明の二重特異性抗体は、同時に免疫細胞及び腫瘍細胞と結合でき、指向性免疫反応を誘起して、腫瘍細胞を効率的に殺傷することができ、良好な経済価値及び使用の見通しを有する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【配列表】

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