(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-14
(45)【発行日】2023-04-24
(54)【発明の名称】機能性ミトコンドリアで富化された哺乳動物細胞
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20230417BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20230417BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20230417BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230417BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230417BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230417BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20230417BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230417BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230417BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230417BHJP
C12N 5/077 20100101ALN20230417BHJP
C12N 5/0789 20100101ALN20230417BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61K38/43
A61P7/06
A61P9/00
A61P21/00
A61P25/00
A61P25/08
A61P25/28
A61P27/02
A61P43/00 111
C12N5/077
C12N5/0789
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2021142214
(22)【出願日】2021-09-01
(62)【分割の表示】P 2017544332の分割
【原出願日】2016-02-24
(65)【公開番号】P2021191776
(43)【公開日】2021-12-16
【審査請求日】2021-09-30
(31)【優先権主張番号】62/120,907
(32)【優先日】2015-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517287615
【氏名又は名称】ミノヴィア セラピューティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】イヴジ－オハナ，ナタリー
(72)【発明者】
【氏名】ハラヴィー，ウリエル
【審査官】原口 美和
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１０７２８５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Food Funct，2015年，6，401-408
【文献】Nature medicine，2012年05月，18，759-766
【文献】Nature，1982年03月，295，605-607
【文献】PNAS，2006年，Vol. 103, No. 5，pp. 1283-1288
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／２８
Ａ６１Ｋ ３８／４３
Ａ６１Ｐ ７／０６
Ａ６１Ｐ ９／００
Ａ６１Ｐ ２１／００
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ａ６１Ｐ ２５／０８
Ａ６１Ｐ ２５／２８
Ａ６１Ｐ ２７／０２
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ１２Ｎ ５／０７７
Ｃ１２Ｎ ５／０７８９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療を必要とするヒト患者のミトコンドリア疾患の治療に使用するための、ミトコンドリアで富化されたヒトＣＤ３４＋骨髄細胞を含む医薬組成物であって、前記ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者またはミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取または誘導されており、
前記ミトコンドリアは、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取された単離されたヒトミトコンドリアであり、
ミトコンドリアで富化された前記ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞のミトコンドリア含有量が、富化される前のミトコンドリア含有量と比べて増加している、医薬組成物。
【請求項2】
クエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを求めることによって、前記ＣＤ３４＋骨髄細胞のミトコンドリア含有量を求める、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
患者から採取または誘導された前記ＣＤ３４＋骨髄細胞が、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の骨髄から採取されるか末梢血へ動員されるものであるか、またはミトコンドリア疾患に罹患していない対象の骨髄から採取されるか末梢血へ動員されるものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ＣＤ３４＋骨髄細胞が、ミトコンドリア疾患に罹患している患者から採取されるものであり、（ｉ）正常未満の酸素（Ｏ２）消費速度、
（ｉｉ）正常未満のクエン酸シンターゼの含有量または活性レベル、
（ｉｉｉ）正常未満のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度、または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せ
を示す、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記ＣＤ３４＋骨髄細胞が、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取されるものであり、（ｉ）正常な酸素（Ｏ２）消費速度、
（ｉｉ）正常なクエン酸シンターゼの含有量または活性レベル、
（ｉｉｉ）正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度、または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せ
を示す、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記単離ヒトミトコンドリアが、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取されるものであり、（ｉ）正常な酸素（Ｏ２）消費速度、
（ｉｉ）正常なクエン酸シンターゼの含有量または活性レベル、
（ｉｉｉ）正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度、または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せ
を示す、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
ミトコンドリアで富化された前記ＣＤ３４＋骨髄細胞が、（ｉ）正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度、
（ｉｉ）正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量または活性レベル、
（ｉｉｉ）正常を上回るアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度、または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せ
を示す、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
総ミトコンドリアタンパク質量が、試料中の総細胞タンパク質量の２０％～８０％である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項9】
ミトコンドリアで富化された前記ＣＤ３４＋骨髄細胞が、シトクロームＣ還元酵素もシトクロームＣ還元酵素の活性もミトコンドリアで富化されていない前記ＣＤ３４＋骨髄細胞に比して富化されていない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記ＣＤ３４＋骨髄細胞が造血幹細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ＣＤ３４＋骨髄細胞が、前記ミトコンドリア疾患に罹患している前記患者に対して自己のものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記ＣＤ３４＋骨髄細胞が、前記ミトコンドリア疾患に罹患している前記患者に対して外来性のものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記ミトコンドリア疾患がミトコンドリア呼吸鎖障害（ＭＲＣＤ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記ミトコンドリア疾患が、ＬＨＯＮ（レーバー遺伝性視神経症）、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア性ミオパチー、脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様症状）、ピアソン症候群、リー症候群、ＮＡＲＰ（ニューロパチー、運動失調、網膜色素変性および眼瞼下垂）、ＭＥＲＲＦ（赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん）、ＫＳＳ（カーンズ・セイヤー症候群）、ＭＮＧＩＥ（筋神経原性の胃腸脳症）、フリードライヒ運動失調症およびアルパース病からなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記ミトコンドリア疾患が、ＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳ、ピアソン症候群、リー症候群、ＮＡＲＰ、ＭＥＲＲＦ、およびＫＳＳからなる群より選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記ミトコンドリア疾患がＬＨＯＮである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記ミトコンドリア疾患がＭＥＬＡＳである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記ミトコンドリア疾患が、ミトコンドリアＤＮＡの変異を原因とするものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記ミトコンドリア疾患が、核ＤＮＡの変異を原因とするものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト骨髄から誘導され機能性ミトコンドリアで富化された細胞、その作製法および上記の細胞を用いる治療法に関する。
【背景技術】
【0002】
ミトコンドリアは、膜で囲まれた直径０．５～１．０μｍの細胞小器官の１つであり、ほとんどの真核細胞にみられる。ミトコンドリアはほとんどあらゆる真核細胞にみられ、細胞型によって数および位置が異なる。ミトコンドリアには、それ独自のＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）が含まれているほか、ＲＮＡおよびタンパク質を合成する独自の機構がある。ｍｔＤＮＡに含まれる遺伝子はわずか３７種類であり、したがって、哺乳動物体内の遺伝子産物のほとんどは核ＤＮＡがコードしている。
【0003】
ミトコンドリアは、真核細胞に不可欠なピルビン酸酸化、アミノ酸、脂肪酸およびステロイドのクレブス回路／代謝などの多数の役割を担っている。しかし、ミトコンドリアの主要な機能は、電子伝達鎖および酸化的リン酸化系（「呼吸鎖」）によってエネルギーをアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の形で発生させることである。ミトコンドリアが関与する過程としてはほかにも、熱産生、カルシウムイオンの貯蔵、カルシウムシグナル伝達、プログラムされた細胞死（アポトーシス）および細胞増殖が挙げられる。このため、ミトコンドリアの機能不全または機能障害を原因とし治療を必要とする当該技術分野で公知の疾患および障害が多数存在する。
【0004】
細胞内のＡＴＰ濃度は通常、１～１０ｍＭである。ＡＴＰは、単純な糖および複雑な糖（炭水化物）または脂質をエネルギー源として利用する酸化還元反応によって産生され得る。複雑な燃料からＡＴＰを合成するには、最初にそれを分子量の小さい単純な分子に分解する必要がある。複雑な炭水化物はグルコースおよびフルクトースなどの単純な糖に加水分解される。脂肪（トリグリセリド）は代謝されて脂肪酸とグリセロールになる。
【0005】
グルコースを酸化して二酸化炭素にする過程全体は細胞呼吸として知られ、単一のグルコース分子からＡＴＰ分子が約３０個産生され得る。ＡＴＰはいくつかの異なる細胞過程によって産生され得る。真核生物のエネルギー生成に用いられる３つの主な経路は、解糖およびクエン酸回路／酸化的リン酸化（ともに細胞呼吸の構成要素である）ならびにベータ酸化である。好気性の非光合成真核生物によるこのＡＴＰ産生の大部分は、典型的な細胞の総体積の２５％前後を占めることもあるミトコンドリアで起こる。
【0006】
ミトコンドリア疾患は、機能障害を起こしたミトコンドリアを原因とする障害群である。ミトコンドリア疾患には、ミトコンドリア機能に影響を及ぼすミトコンドリアＤＮＡの変異を原因とするものがある。ミトコンドリア疾患のその他の原因として、核ＤＮＡの遺伝子のうち産物がミトコンドリア（ミトコンドリアタンパク質）内に輸送されるものに起こる変異のほか、後天性のミトコンドリア病態がある。ミトコンドリア疾患には固有の特徴があり、これは、疾患が遺伝性である場合が多いことおよびミトコンドリアが細胞機能に極めて重要であることの両方が理由となっている。上記の疾患のうち神経筋の症状を呈するサブクラスは多くの場合、ミトコンドリア性ミオパチーと呼ばれる。
【0007】
ミトコンドリア障害には、後天性、遺伝性を問わず、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）またはミトコンドリア構成要素をコードする核遺伝子に起こる変異を原因とするものがある。このほか、薬物の有害作用、感染症をはじめとする環境的な原因による後天的なミトコンドリア機能障害に起因するものもある。罹患したミトコンドリアの数がある一定のレベルに達したときにミトコンドリア疾患が臨床的に明らかになることもあり、この現象は「閾値発現」と呼ばれる。ミトコンドリアＤＮＡにはエラーをチェックする能力がないため、変異の起こる頻度が高い。つまり、ミトコンドリアＤＮＡの障害は自発的に比較的高い頻度で起こり得るということである。このほか、ミトコンドリアＤＮＡの複製を制御する酵素（いずれも核ＤＮＡの遺伝子がコードしている）の欠損がミトコンドリアＤＮＡの変異を引き起こすことがある。ミトコンドリアの機能および生合成の大部分は核ＤＮＡによって制御されている。ヒトミトコンドリアＤＮＡがコードする呼吸鎖のタンパク質は１３種類にすぎず、ミトコンドリアに向けたものである推定１，５００種類のタンパク質および構成要素ほとんどは核にコードされている。核にコードされるミトコンドリア遺伝子の欠損は、貧血、認知症、高血圧症、リンパ腫、網膜症、痙攣および神経発達障害を含めた数百にのぼる臨床的な疾患表現型を引き起こす。
【0008】
レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）またはレーバー視神経萎縮は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）およびその軸索のミトコンドリア遺伝性（母親から子孫に伝わる）の変性であり、主として若年成人男性にみられ、中心視野が急性または亜急性に失われる。ただし、ＬＨＯＮの主な原因は（核ではなく）ミトコンドリアのゲノムの変異であり、胚にミトコンドリアを与えるのは卵子のみであるため、ＬＨＯＮは母親のみを通じて伝わる。ＬＨＯＮは通常、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の病原性の点変異３種類のうちの１つに起因する。この３種類の変異は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化鎖の複合体ＩのＮＤ４サブユニット、ＮＤ１サブユニットおよびＮＤ６サブユニットの遺伝子で、それぞれ１１７７８位のヌクレオチドがＧからＡに、３４６０位のヌクレオチドがＧからＡに、１４４８４位のヌクレオチドがＴからＣに変異したものである。これらの変異は、細胞のエネルギー産生量を減少させ、これが特定の視神経細胞に細胞損傷および細胞死を引き起こし得る。ＬＨＯＮ変異があると、男性の平均５０％、女性の平均１５％が生涯のうちに視力を失うことになるが、現時点では、家族の誰が症状を発現するのかは専門化にもわからない。
【0009】
ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳと略される）は、ミトコンドリア細胞症のファミリーの１つであり、ＭＥＲＲＦおよびレーバー遺伝性視神経症も同ファミリーに含まれる。この疾患は男女とも発症する可能性がある。ＭＥＬＡＳはミトコンドリアＤＮＡの遺伝子の変異を原因とする。ＭＥＬＡＳで影響を受ける遺伝子の一部（ＭＴ－ＮＤ１、ＭＴ－ＮＤ５）は、酸素および単純な糖からエネルギーへの変換を促すミトコンドリアのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（複合体Ｉとも呼ばれる）の一部をなすタンパク質をコードする。これ以外の遺伝子（ＭＴ－ＴＨ、ＭＴ－ＴＬ１およびＭＴ－ＴＶ）はミトコンドリア特異的転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードする。ＭＥＬＡＳの全症例のうちＭＴ－ＴＬ１の変異を原因とするものは８０％を超える。この変異によって、ミトコンドリアがタンパク質を生成し、酸素を利用し、エネルギーを産生する能力が損なわれる。
【0010】
国際公開第２０１３／００２８８０号には、妊娠促進法に使用し、成熟卵母細胞の質を回復させたり、卵原幹細胞を増強したり、その派生物（例えば、細胞質または単離ミトコンドリア）を改善したりする生体エネルギー物質を含む組成物および方法が記載されている。
【0011】
本発明者らの国際公開第２０１３／０３５１０１号は、ミトコンドリア組成物およびそれを用いる治療法に関するものであり、部分的に精製した機能性ミトコンドリアの組成物のほか、必要とする対象に同組成物を投与することによってミトコンドリア機能を増大させることから利益が得られる病態の治療に同組成物を使用する方法が開示されている。
【0012】
ミトコンドリア疾患に対する治療選択肢については研究が進められているものの、その数は限られており、多くの場合、ビタミン類が処方されるが、その有効性を示す証拠は少ない。このほか、膜透過性抗酸化剤、ピルビン酸塩およびＮ－アセチルシステインがミトコンドリア機能障害の改善に何らかの役割を果たすことが示唆されている。さらに、図面を参照しながら、慣例的な方法および従来の方法と、本願の残りの部分に記載される本発明のいくつかの態様とを比較することにより、上記のシステムの限界および不利な点が当業者に明らかになるであろう。ミトコンドリア疾患に対して効力の高い短期間および長期間の治療法の必要性は未だ満たされていない。
【発明の概要】
【0013】
本発明は、様々なミトコンドリア疾患を治療するための細胞および方法を提供する。本発明は特に、健常ドナーから採取され機能性ミトコンドリアで富化された骨髄細胞を含む、組成物を提供する。本発明はさらに、患者の治療に異種または自己の「ミトコンドリア富化」骨髄細胞を使用する方法を提供する。ミトコンドリア疾患に罹患している患者の骨髄細胞を準備し、ｅｘ－ｖｉｖｏで処理し、同じ患者に戻すことにより、同種細胞療法を含む他の方法よりも大きな利益がもたらされる。例えば、集団をスクリーニングして患者とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致したドナーを見つけるのは時間もコストもかかる過程であり、必ずしも成功するとは限らないものであるが、提供される方法によってその必要がなくなる。この方法はさらに、患者の身体が同種細胞集団を拒絶しないよう長期間にわたる免疫抑制療法を実施する必要がなくなるという点で有利である。このように、本発明は、患者の身体から欠陥のあるヒト細胞を取り出し、ｅｘ－ｖｉｖｏで処理し、同じ患者に戻すという独自のｅｘ－ｖｉｖｏ是正療法の方法論を提供する点で有利である。さらに、本発明は、いかなる理論にも機序にも束縛されるものではないが、体全体の様々な組織に分布し、富化された健常なミトコンドリアを患者の損傷細胞に移行させる骨髄細胞の投与に関する。
【0014】
本発明は、部分的には、単離機能性ミトコンドリアがインタクトの線維芽細胞および骨髄細胞に侵入することが可能であり、欠陥のあるミトコンドリアを有する線維芽細胞および骨髄細胞を機能性ミトコンドリアで処理することによってミトコンドリア含有量、細胞生存能およびＡＴＰ産生量が増大するという驚くべき発見に基づくものである。
【0015】
さらには、驚くべきことに、骨髄細胞の方が線維芽細胞よりもミトコンドリアの富化を受けやすく、ヒト骨髄細胞の方がマウス骨髄細胞よりもミトコンドリアの富化を受けやすいことがわかった。さらには、驚くべきことに、骨髄細胞が機能性ミトコンドリアで富化される程度は、その濃度または相対的接近度に依存するため、これを操作し得ることがわかった。
【0016】
さらに、本発明は、部分的には、最初に骨髄細胞に含まれていた機能性ミトコンドリアが、骨髄細胞を眼球などの器官に直接注射した後、ｉｎ ｖｉｖｏで自発的に器官全体に分布し得るという驚くべき発見に基づくものである。このような発見は、機能性ミトコンドリアを送達するための様々な細胞プラットフォームおよびミトコンドリア疾患の治療へのその使用の土台となる。
【0017】
いかなる理論にも機序にも束縛されるものではないが、骨髄細胞と単離機能性ミトコンドリアとの共インキュベーションにより、インタクトの機能性ミトコンドリアの骨髄細胞内への移行が促進されるとする仮説が立てられる。さらに、本明細書で初めて示される有益な効果をもたらすのは、是正成分、すなわち、単離機能性ミトコンドリアにみられ、ミトコンドリア疾患を有する患者の骨髄細胞のミトコンドリアには欠けている、または欠陥がある成分の移行であるとする仮説が立てられる。上記の仮説に束縛されるものではないが、本発明は、ミトコンドリア疾患の患者の骨髄細胞であって、病的でないミトコンドリア活性を十分に有する骨髄細胞を初めて提供するものである。
【0018】
同じく、いかなる理論にも機序にも束縛されるものではないが、本発明が提供する組成物および方法は「置換療法」の一形態であると考えられる。本発明の原理によれば、変異遺伝子および／またはその欠損タンパク質もしくは非機能性タンパク質産物が野生型の機能性ミトコンドリアの遺伝子および／または機能性タンパク質に置き換わる（またはそれによって問題のないものになる）。インタクトの機能性ミトコンドリアをミトコンドリア疾患患者の骨髄細胞に融合または移行させることによって、野生型ミトコンドリア遺伝子および機能性ミトコンドリアタンパク質がともにもたらされる。
【0019】
本発明は、一態様では、ヒト骨髄細胞を機能性ミトコンドリアで富化するｅｘ ｖｉｖｏの方法を提供し、この方法は、（ｉ）ミトコンドリア疾患に罹患している患者またはミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取または誘導された複数のヒト骨髄細胞を含む第一の組成物を準備する段階と；（ｉｉ）ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取された複数の単離ヒト機能性ミトコンドリアを含む第二の組成物を準備する段階と；（ｉｉｉ）第一の組成物のヒト骨髄細胞と、第二の組成物のヒト機能性ミトコンドリアとを接触させて、第三の組成物を作製する段階と；（ｉｖ）ヒト機能性ミトコンドリアがヒト骨髄細胞に侵入できる条件下で第三の組成物をインキュベートすることにより、前記ヒト骨髄細胞を前記ヒト機能性ミトコンドリアで富化して、第四の組成物を作製する段階とを含み；第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量が、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも５０％高い。
【0020】
ある特定の実施形態では、クエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを求めることによって、第一の組成物中または第四の組成物中の骨髄細胞のミトコンドリア含有量を求める。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0021】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は骨髄造血細胞を含む。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は赤血球生成細胞を含む。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、骨髄系共通前駆細胞、リンパ球系共通前駆細胞またはその任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、巨核球、赤血球、肥満細胞、筋芽細胞，好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞またはその任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は間葉系幹細胞を含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0022】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４発現する（ＣＤ３４＋）。
【0023】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の骨髄から採取されるか、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の骨髄から採取されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の骨髄から動員されるか、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の骨髄から動員されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の骨髄から直接採取されるか、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の骨髄から直接採取されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の骨髄から間接的に採取されるか、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の骨髄から間接的に採取されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の末梢血から採取されるか、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の末梢血から採取されるものである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0024】
ある特定の実施形態では、上記の方法は前段階をさらに含み、この段階は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者またはミトコンドリア疾患に罹患していない対象に骨髄細胞の末梢血への動員を誘導する薬剤を投与することを含む。ある特定の実施形態では、薬剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、１，１’－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］－ビス［１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン］（プレリキサフォル）、その塩およびその任意の組合せからなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、上記の方法は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の末梢血またはミトコンドリア疾患に罹患していない対象の末梢血から骨髄細胞を単離する段階をさらに含む。ある特定の実施形態では、単離をアフェレーシスにより実施する。
【0025】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション前またはインキュベーション時に第三の組成物中の骨髄細胞および機能性ミトコンドリアを濃縮することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション前、インキュベーション時またはインキュベーション後に第三の組成物を遠心分離することをさらに含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0026】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者から採取されるものであり、（ｉ）正常未満の酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）正常未満のクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）正常未満のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルが、第一の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルよりも少なくとも５０％低い。
【0027】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取されるものであり、（ｉ）正常な酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）正常なクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0028】
ある特定の実施形態では、第二の組成物中の単離ヒト機能性ミトコンドリアは、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取されるものであり、（ｉ）正常な酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）正常なクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0029】
ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞は、（ｉ）正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）正常を上回るアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0030】
ある特定の実施形態では、第二の組成物中の総ミトコンドリアタンパク質量は、試料中の総細胞タンパク質量の２０％～８０％である。
【0031】
ある特定の実施形態では、第四の組成物は、シトクロームＣ還元酵素もシトクロームＣ還元酵素の活性も第一の組成物に比して富化されていない。
【0032】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はミトコンドリア呼吸鎖疾患（ＭＲＣＤ）である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は、ＬＨＯＮ（レーバー遺伝性視神経症）；ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア性ミオパチー、脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様症状）；ピアソン症候群；リー症候群；ＮＡＲＰ（ニューロパチー、運動失調、網膜色素変性および眼瞼下垂）；ＭＥＲＲＦ（赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん）；ＫＳＳ（カーンズ・セイヤー症候群）；ＭＮＧＩＥ（筋神経原性の筋神経原性の胃腸脳症）；フリードライヒ運動失調症；およびアルパース病からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は、ＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳ、ピアソン症候群、リー症候群、ＮＡＲＰ、ＭＥＲＲＦおよびＫＳＳからなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＬＨＯＮである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＭＥＬＡＳである。
【0033】
本発明は、別の態様では、上記の方法のいずれか１つの実施形態によって得られる、機能性ミトコンドリアで富化された複数のヒト骨髄細胞をさらに提供する。
【0034】
本発明は、別の態様では、複数のヒト骨髄細胞をさらに提供し、骨髄細胞は、（ａ）正常を上回るミトコンドリア含有量を示すか；（ｂ）正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度を示すか；（ｃ）正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを示すか；（ｄ）ＣＤ３４＋であるか；（ｅ）その任意の組合せである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0035】
ある特定の実施形態では、上記の複数のヒト骨髄細胞は、正常を上回るミトコンドリア含有量を示し；正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度を示し；正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを示し；かつＣＤ３４＋である。
【0036】
本発明は、別の態様では、複数の上記のヒト骨髄細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。
【0037】
本発明は、別の態様では、ヒト患者のミトコンドリア疾患を治療する方法に使用する上記の医薬組成物をさらに提供する。
【0038】
本発明は、別の態様では、治療を必要とするヒト患者のミトコンドリア疾患を治療する方法であって、患者に上記の医薬組成物を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【0039】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者に対して自己のものである。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者に対して外来性のものである。ある特定の実施形態では、上記の方法は、患者にミトコンドリア生合成を促進する薬剤を投与する段階をさらに含む。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア生合成を促進する薬剤は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはその塩である。ある特定の実施形態では、上記の方法は、患者に患者と骨髄細胞との間の有害な免疫原性反応を防ぐ、遅らせる、最小限に抑える、または消失させる薬剤を投与する段階をさらに含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、有害な免疫原性反応は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。ある特定の実施形態では、上記の方法は、医薬組成物の投与の前に患者に移植前処置剤を投与する段階をさらに含む。
【0040】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はミトコンドリアＤＮＡの変異を原因とするものである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は核ＤＮＡの変異を原因とするものである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＭＲＣＤである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は、ＬＨＯＮ；ＭＥＬＡＳ；ピアソン症候群；リー症候群；ＮＡＲＰ；ＭＥＲＲＦ；ＫＳＳ；ＭＮＧＩＥ；フリードライヒ運動失調症；およびアルパース病からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は、ＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳ、ピアソン症候群、リー症候群、ＮＡＲＰ、ＭＥＲＲＦおよびＫＳＳからなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＬＨＯＮである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＭＥＬＡＳである。
【0041】
以下に記載する詳細な説明から、本発明のさらなる実施形態および適用性の全範囲が明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明から、本発明の趣旨と範囲に含まれる様々な変更および修正が当業者に明らかになるため、詳細な説明および具体例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、単に説明を目的に記載されるものであることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】ヒト胎盤細胞から単離したミトコンドリアを加えて（Ｍｉｔｏ）または加えず（対照）にインキュベートしたヒト肝細胞のクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の比較を示す棒グラフである。
【図2】蛍光共焦点顕微鏡法によって得た３つの顕微鏡像であり、ミトコンドリアのＧＦＰを発現するマウス線維芽細胞（左パネル）、単離したＲＦＰ標識ミトコンドリアとのインキュベーション（中央パネル）および重ね合せ（右パネル）を示している。
【図3】未処置マウス線維芽細胞（対照）、ミトコンドリア複合体Ｉの不可逆的阻害剤で処置したマウス線維芽細胞（ロテノン）またはロテノンおよびマウス胎盤ミトコンドリアで処置したマウス線維芽細胞（ロテノン＋ミトコンドリア）のＡＴＰレベルの比較を示す棒グラフである。データは平均値±ＳＥＭで表されており、（＊）ｐ値＜０．０５である。ＲＬＵは相対発光量を表す。
【図4】蛍光共焦点顕微鏡法によって得た４つの顕微鏡像であり、マウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアとインキュベートしたマウス骨髄細胞を示している。
【図5】マウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアの量を変えて、遠心分離を実施するか実施せずにインキュベートしたマウス骨髄（ＢＭ）細胞のクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性の比較を示す棒グラフである。
【図6A】ＧＦＰ標識ミトコンドリアの量を漸増させて富化した後のマウスＢＭ細胞のＣＳ活性の比較を示す棒グラフである。
【図6B】上記の細胞（黒色のバー）のシトクロームｃ還元酵素活性とＧＦＰ標識ミトコンドリアの活性（灰色のバー）との比較を示す棒グラフである。
【図7A】対照である未処置マウス眼球のＧＦＰ染色の結果を示す図である。
【図7B】ＧＦＰ標識ミトコンドリアと遠心分離した後にインキュベートしたマウスＢＭ細胞を注射したマウス眼球のＧＦＰ染色の結果を示す図である。（＊）網膜神経節細胞層の血管の内側のＧＦＰ標識細胞。（→）血管壁を裏打ちする細胞。
【図8A】ｍｔＤＮＡ含有細胞（ミトコンドリア、下の３つのパネル）から単離したミトコンドリアによるミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）欠損ヒト１４３Ｂ骨肉腫細胞（対照、上の３つのパネル）の生存能の増大を示す図である。
【図9A】対照の未処置ヒトＢＭ細胞およびヒト胎盤細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアと遠心分離を実施するか実施せずにインキュベートしたヒトＢＭ細胞のＣＳ活性の比較を示す棒グラフである。
【図9B】対照の未処置ヒトＢＭ細胞およびヒト胎盤細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアと遠心分離を実施してインキュベートしたヒトＢＭ細胞のＡＴＰレベルの比較を示す棒グラフである。
【図10A】ＧＦＰ標識ミトコンドリアとインキュベートしていないヒトＢＭ細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図10B】ＧＦＰ標識ミトコンドリアと遠心分離した後にインキュベートしたヒトＢＭ細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0043】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞プラットフォーム、より具体的には、治療上意味のある量の完全に機能する健常なミトコンドリアを標的化送達および全身送達するための骨髄由来細胞プラットフォームを提供する。本発明はさらに、このような細胞プラットフォームを作製する方法およびミトコンドリア疾患の治療にそれを用いる方法を提供する。
本発明は、細胞プラットフォーム、より具体的には、治療上意味のある量の完全に機能する健常なミトコンドリアを標的化送達および全身送達するための骨髄由来細胞プラットフォームを提供する。本発明はさらに、このような細胞プラットフォームを作製する方法およびミトコンドリア疾患の治療にそれを用いる方法を提供する。
【0044】
機能性ミトコンドリアで高度に富化された骨髄細胞を提供することにより、これまで用いることができなかったミトコンドリア疾患の特定の治療法が可能になる。例えば、機能性ミトコンドリアを疾患細胞内に移植することによって、ＬＨＯＮ（レーバー遺伝性視神経症）およびＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中様発作）などのミトコンドリアＤＮＡの変異（欠失／挿入を含む）を原因とするトコンドリア疾患を治療し、疾患を長期間、可能性としては生涯にわって解消することがこれで可能になる。罹患細胞が骨髄細胞であるか、骨髄細胞から誘導されたものである場合はほかにも、投与した骨髄細胞が罹患細胞と置き換わり、同じく長期間、可能性としては生涯にわたって疾患が解消され得る。ほかの例では、ＭＮＧＩＥおよびフリードライヒ運動失調症のように、ミトコンドリア疾患が核ＤＮＡの変異（欠失／挿入を含む）を原因とするものであり、罹患細胞が骨髄細胞であるか、骨髄細胞から誘導されたものである場合、投与した骨髄細胞が罹患細胞と置き換わり、同じく長期間、可能性としては生涯にわたって疾患が解消され得る。本発明は、ミトコンドリア疾患の病理学的状態の是正を持続させ、その結果、これらの疾患を解消する手段および方法を初めて提供するものであることが強調されるべきである。
【0045】
本発明は、いくつかの驚くべき発見、とりわけ、（ｉ）骨髄細胞がインタクトの機能性ミトコンドリアで富化される程度はその濃度に依存するため、これを操作し得る、（ｉｉ）骨髄細胞は線維芽細胞よりもミトコンドリアの富化を受けやすい、（ｉｉｉ）ヒト骨髄細胞はマウス骨髄細胞よりもミトコンドリアの富化を受けやすく、その天然状態のミトコンドリア含有量の８倍超に達する、（ｉｖ）正常な機能性ミトコンドリアで富化された骨髄細胞はそのようなミトコンドリアを患者の細胞に移行させることが可能であるという発見に基づくものである。
【0046】
本発明は、一態様では、ヒト骨髄細胞を機能性ミトコンドリアで富化するｅｘ ｖｉｖｏの方法を提供し、この方法は、（ｉ）ミトコンドリア疾患に罹患している患者またはミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取または誘導された複数のヒト骨髄細胞を含む第一の組成物を準備する段階と；（ｉｉ）ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取された複数の単離ヒト機能性ミトコンドリアを含む第二の組成物を準備する段階と；（ｉｉｉ）第一の組成物のヒト骨髄細胞と、第二の組成物のヒト機能性ミトコンドリアとを接触させて、第三の組成物を作製する段階と；（ｉｖ）ヒト機能性ミトコンドリアがヒト骨髄細胞に侵入できる条件下で第三の組成物をインキュベートすることにより、前記ヒト骨髄細胞を前記ヒト機能性ミトコンドリアで富化して、第四の組成物を作製する段階とを含み；第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量が、第一の組成物中のヒト骨髄細胞ミトコンドリア含有量よりも少なくとも５０％高い。
【0047】
本明細書で使用される「ｅｘ ｖｉｖｏの方法」という用語は、もっぱらヒト体外で実施する段階を含む任意の方法を指す。
【0048】
本明細書で使用される「富化」という用語は、ヒト細胞のミトコンドリア含有量、例えばインタクトのミトコンドリアの数を増大させることを目的とする任意の操作を指す。
【0049】
本明細書で使用される「ヒト骨髄細胞」という用語は一般に、ヒト骨髄に天然に存在するあらゆるヒト細胞およびヒト骨髄に天然に存在するあらゆる細胞集団を指す。
【0050】
本明細書で使用される「機能性ミトコンドリア」という用語は、病的でない正常なレベルの活性を示すミトコンドリアを指す。ミトコンドリアの活性は、Ｏ２消費量、ＡＴＰ産生量およびＣＳ活性レベルなどの当該技術分野で周知の様々な方法によって測定することができる。
【0051】
本明細書で使用される「ミトコンドリア疾患に罹患している患者またはミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取された骨髄細胞」という語句は、患者または対象から単離する時点で骨髄細胞であった細胞を指す。
【0052】
本明細書で使用される「ミトコンドリア疾患に罹患している患者またはミトコンドリア疾患に罹患していない対象から誘導された骨髄細胞」という語句は、患者または対象の体内では骨髄細胞ではなく、操作されて骨髄細胞になった細胞を指す。本明細書で使用される「操作」という用語は、体細胞を未分化状態に再プログラム化して人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）にし、任意選択でｉＰＳをさらに再プログラム化して所望の系列または集団の細胞（Ｃｈｅｎ Ｍ．ら，ＩＯＶＳ，２０１０，Ｖｏｌ．５１（１１），ｐ．５９７０－５９７８）、例えば骨髄細胞（Ｘｕ Ｙ．ら，２０１２，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，Ｖｏｌ．７（４），ｐａｇｅ ｅ３４３２１）などにする方法として当該分野で知られているもの（Ｙｕ Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，Ｖｏｌ．３１８（５８５８），ｐ．１９１７－１９２０）をいずれか１つ用いることを指す。
【0053】
本明細書で使用される「ミトコンドリア疾患に罹患している患者」という用語は、ミトコンドリア疾患であると診断されたヒト対象、ミトコンドリア疾患を有することが疑われるヒト対象またはミトコンドリア疾患を発症するリスクのあるグループに含まれるヒト対象を指す。特定のミトコンドリア疾患は遺伝性であることから、ミトコンドリア疾患であると診断された対象の子孫は、ミトコンドリア疾患を発症するリスクのあるグループと見なされる。
【0054】
本明細書で使用される「ミトコンドリア疾患に罹患していない対象」という用語は、ミトコンドリア疾患であると診断されていないヒト対象、ミトコンドリア疾患を有することが疑われないヒト対象および／またはミトコンドリア疾患を発症するリスクのあるグループに含まれないヒト対象を指す。
【0055】
本明細書で使用される「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）」という用語は、成人細胞から作製したヒト多能性幹細胞を指す。
【0056】
本明細書で使用される「単離ヒト機能性ミトコンドリア」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取された細胞から単離されたインタクトのミトコンドリアを指す。
【0057】
本明細書で使用される「ヒト機能性ミトコンドリアがヒト骨髄細胞に侵入できる条件」という用語は一般に、時間、温度およびミトコンドリアと骨髄細胞との間の接近度などのパラメータを指す。上記の条件を特定することは当業者の能力の範囲内にあり、そのような条件が本発明により提供される。例えば、ヒト細胞およびヒト細胞系を液体培地中でインキュベートし、組織培養恒温器などの無菌環境中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で維持するのが慣例的なものとなっている。
【0058】
本明細書で使用される「ミトコンドリア含有量」という用語は、細胞内の機能性ミトコンドリアの量を指す。
【0059】
ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％または１０００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも１００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも２００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも３００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも４００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも５００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも６００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも７００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも７５０％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも少なくとも８００％高い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量は、第一の組成物中のヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量よりも１００％～７９００％、２００％～６９００％、３００％～５９００％、４００％～４９００％、５００％～３９００％、６００％～２９００％、７００％～１９００％または８００％～１４００％高い。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0060】
ある特定の実施形態では、第一の組成物は新鮮なものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物は、凍結させたのち解凍したものである。ある特定の実施形態では、第二の組成物は新鮮なものである。ある特定の実施形態では、第二の組成物は、凍結させたのち解凍したものである。
【0061】
クエン酸シンターゼ（ＣＳ）は、ミトコンドリアのマトリックスに局在するが、核ＤＮＡによってコードされている。クエン酸シンターゼは、クレブス回路の第一段階に関与し、インタクトのミトコンドリアの存在を示す定量的酵素マーカーとしてよく用いられる（Ｌａｒｓｅｎ Ｓ．ら，２０１２，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５９０（１４），ｐ．３３４９－３３６０；Ｃｏｏｋ Ｇ．Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９８３，Ｖｏｌ．７６３（４），ｐ．３５６－３６７）。ある特定の実施形態では、クエン酸シンターゼの含有量を求めることによって、第一の組成物中または第四の組成物中の骨髄細胞のミトコンドリア含有量を求める。ある特定の実施形態では、クエン酸シンターゼの活性レベルを求めることによって、第一の組成物中または第四の組成物中の骨髄細胞のミトコンドリア含有量を求める。ある特定の実施形態では、第一の組成物中または第四の組成物中の骨髄細胞のミトコンドリア含有量はクエン酸シンターゼの含有量と相関する。ある特定の実施形態では、第一の組成物中または第四の組成物中の骨髄細胞のミトコンドリア含有量はクエン酸シンターゼの活性レベルと相関する。
【0062】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は骨髄造血細胞を含む。本明細書で使用される「骨髄造血細胞」という用語は、骨髄造血、例えば骨髄およびそれから生じるあらゆる細胞、すなわち全血液細胞の産生に関与する細胞を指す。
【0063】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は赤血球生成細胞を含む。本明細書で使用される「赤血球生成細胞」という用語は、赤血球生成、例えば赤血球の産生に関与する細胞を指す。
【0064】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。本明細書で使用される「多能性造血幹細胞」または「血球芽細胞」という用語は、造血過程を経てほかのあらゆる血液細胞を生じる幹細胞を指す。
【0065】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、骨髄系共通前駆細胞、リンパ球系共通前駆細胞またはその任意の組合せを含む。本明細書で使用される「骨髄系共通前駆細胞」という用語は、骨髄系細胞を生じる細胞を指す。本明細書で使用される「リンパ球系共通前駆細胞」という用語は、リンパ球を生じる細胞を指す。
【0066】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、巨核球、赤血球、肥満細胞、筋芽細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞またはその任意の組合せを含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0067】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は間葉系幹細胞を含む。本明細書で使用される「間葉系幹細胞」という用語は、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞、筋細胞および脂肪細胞を含めた様々な細胞型に分化することができる多能性間質細胞を指す。
【0068】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は骨髄造血細胞からなる。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は赤血球生成細胞からなる。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）からなる。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、骨髄系共通前駆細胞、リンパ球系共通前駆細胞またはその任意の組合せからなる。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、巨核球、赤血球、肥満細胞、筋芽細胞、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞またはその任意の組合せからなる。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は間葉系幹細胞からなる。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0069】
ＣＤ３４抗原としても知られる造血前駆細胞抗原ＣＤ３４は、ヒトではＣＤ３４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＣＤ３４は、細胞表面糖タンパク質の分化クラスターの１つであり、細胞間接着因子として機能する。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４を発現する（ＣＤ３４＋である）。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、その外膜に骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４を提示する。
【0070】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者から直接誘導されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から直接誘導されるものである。本明細書で使用される「直接誘導される（もの）」という用語は、ほかの細胞から直接誘導された骨髄細胞を指す。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は造血幹細胞（ＨＳ）から誘導されたものである。
【0071】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者から間接的に誘導されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から間接的に誘導されるものである。本明細書で使用される「間接的に誘導される（もの）」という用語は、非骨髄細胞から誘導された骨髄細胞を指す。ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、操作されて人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）になった体細胞から誘導されたものである。
【0072】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の骨髄から直接採取されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の骨髄から直接採取されるものである。本明細書で使用される「直接採取される（もの）」という用語は、例えば外科手術またはシリンジによる針からの吸引などの手段によって、骨髄自体から採取された骨髄細胞を指す。
【0073】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の骨髄から間接的に採取されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の骨髄から間接的に採取されるものである。本明細書で使用される「間接的に採取される（もの）」という用語は、骨髄自体以外の位置から採取された骨髄細胞を指す。
【0074】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の末梢血から採取されるものである。ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の末梢血から採取されるものである。本明細書で使用される「末梢血」は、血液系を循環している血液を指す。
【0075】
ある特定の実施形態では、上記の方法は前段階をさらに含み、前段階は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者に骨髄細胞の末梢血への動員を誘導する薬剤を投与することを含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は前段階をさらに含み、前段階は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象に骨髄細胞の末梢血への動員を誘導する薬剤を投与することを含む。
【0076】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞の末梢血への動員を誘導する薬剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、１，１’－［１，４－フェニレンビス（メチレン）］ビス［１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン］（プレリキサフォル、ＣＡＳ番号１５５１４８－３１－５）、その塩およびその任意の組合せからなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0077】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者の末梢血から骨髄細胞を単離する段階をさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象の末梢血から骨髄細胞を単離する段階をさらに含む。本明細書で使用される「末梢血から単離する」という用語は、血液のほかの成分から骨髄細胞を単離することを指す。
【0078】
アフェレーシスでは、１つの特定の成分を分離し残りの成分を循環中に戻す装置にドナーまたは患者の血液を通過させる。したがって、アフェレーシスは体外で実施する医学的処置の１つである。ある特定の実施形態では、単離をアフェレーシスにより実施する。
【0079】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション前に第三の組成物中の骨髄細胞および機能性ミトコンドリアを濃縮することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション時に第三の組成物中の骨髄細胞および機能性ミトコンドリアを濃縮することをさらに含む。
【0080】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション前に第三の組成物を遠心分離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション時に第三の組成物を遠心分離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション後に第三の組成物を遠心分離することをさらに含む。
【0081】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者から採取されるものであり、（ｉ）正常未満の酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）正常未満のクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）正常未満のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0082】
本明細書で使用される「正常未満の酸素（Ｏ２）消費速度」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられる酸素（Ｏ２）消費速度から導かれるか、これに対応する対照酸素（Ｏ２）消費速度よりも実質的に小さい酸素（Ｏ２）消費速度を指す。
【0083】
本明細書で使用される「正常未満のクエン酸シンターゼの含有量または活性レベル」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象のクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルから導かれるか、これに対応するクエン酸シンターゼの対照含有量値または活性レベルよりも実質的に低いクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを指す。
【0084】
本明細書で使用される「正常未満のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度から導かれるか、これに対応する対照アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度よりも実質的に小さいアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度を指す。
【0085】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「実質的に小さい（低い）」という用語は、正常値と正常値未満との間の統計的に有意な減少を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「実質的に小さい（低い）」という用語は、病的減少、すなわち、実質的に小さい（低い）値を原因とする少なくとも１つの病的症状が明らかになるレベルを指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「正常未満」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられる対応する値の２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１または１０分の１の値を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「正常未満」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられる対応する値の少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１または少なくとも１０分の１の値を指す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0086】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者から採取されるものであり、（ｉ）ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象から採取された骨髄細胞の酸素（Ｏ２）消費速度と比較して正常未満の酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象から採取された骨髄細胞のクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベルと比較して正常未満のクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象から採取された骨髄細胞のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度と比較して正常未満のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。
【0087】
複数の細胞またはミトコンドリアに関する任意の測定可能な特徴、特性または態様への言及はいずれも、その複数の細胞またはミトコンドリアの測定可能な特徴、特性または態様の平均値に関するものであることが強調されるべきである。
【0088】
ヘテロプラスミーとは、１つの細胞または個体に２種類以上（野生型／機能性対変異型／非機能性）のミトコンドリアＤＮＡが存在することであり、ミトコンドリア疾患の重症度を考慮する際に重要な因子となる。健常な表現型ではヘテロプラスミーのレベルが低く（機能性のミトコンドリアの量が十分である）、病的状態ではヘテロプラスミーのレベルが高い（機能性のミトコンドリアの量が不十分である）。ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルが、第一の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルよりも少なくとも５０％低い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルが、第一の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルよりも少なくとも６６％低い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルが、第一の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルよりも少なくとも７５％低い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルが、第一の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルよりも少なくとも８０％低い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルが、第一の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルよりも少なくとも８７％低い。ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルが、第一の組成物中の骨髄細胞のヘテロプラスミーのレベルよりも少なくとも９０％低い。
【0089】
ある特定の実施形態では、第一の組成物中の骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取されるものであり、（ｉ）正常な酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）正常なクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0090】
本明細書で使用される「正常な酸素（Ｏ２）消費速度」および「対照酸素（Ｏ２）消費速度」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の細胞またはミトコンドリアにみられる酸素（Ｏ２）消費速度を指す。
【0091】
本明細書で使用される「正常なクエン酸シンターゼの含有量または活性レベル」および「対照クエン酸シンターゼの含有量または活性レベル」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象のクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを指す。
【0092】
本明細書で使用される「正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度」および「対照アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の細胞またはミトコンドリアにみられるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度を指す。
【0093】
ある特定の実施形態では、第二の組成物中の単離ヒト機能性ミトコンドリアは、ミトコンドリア疾患に罹患していない対象から採取されるものであり、（ｉ）正常な酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）正常なクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）正常なアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0094】
ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞は、（ｉ）正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）正常を上回るアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0095】
本明細書で使用される「正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられる酸素（Ｏ２）消費速度から導かれるか、これに対応する対照酸素（Ｏ２）消費速度よりも実質的に大きい酸素（Ｏ２）消費速度を指す。
【0096】
本明細書で使用される「正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量または活性レベル」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象のクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルから導かれるか、これに対応するクエン酸シンターゼの対照含有量値または活性レベルよりも実質的に高いクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを指す。
【0097】
本明細書で使用される「正常を上回るアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度から導かれるか、これに対応する対照アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度よりも実質的に大きいアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度を指す。
【0098】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「実質的に高い（大きい）」という用語は、正常値と正常を上回る値との間の統計的に有意な増大を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「実質的に高い（大きい）」という用語は、病的でない増大、すなわち、実質的に高い（大きい）値を原因とする病的症状が全くみられないレベルを指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「正常を上回る」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられる対応する値の２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、８．５倍、９倍または１０倍の値を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「正常を上回る」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられる対応する値の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍の値を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される「正常を上回る」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアにみられる対応する値の２～８０倍、３～７０倍、４～６０倍、５～５０倍、６～４０倍、７～３０倍、８～２０倍、８．５～２０倍または９～１５倍の値を指す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0099】
ある特定の実施形態では、第四の組成物中の骨髄細胞は、（ｉ）ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象から採取された骨髄細胞の酸素（Ｏ２）消費速度と比較して正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度；（ｉｉ）ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象から採取された骨髄細胞クエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベルと比較して正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル；（ｉｉｉ）ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象から採取された骨髄細胞のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度と比較して正常を上回るアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生速度；または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の組合せを示す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0100】
ある特定の実施形態では、第二の組成物中の総ミトコンドリアタンパク質量は、試料中の総細胞タンパク質量の２０％～８０％である。
【0101】
真核生物のＮＡＤＰＨ－シトクロームＣ還元酵素（シトクロームＣ還元酵素）は、小胞体に局在するフラボタンパク質である。この酵素はＮＡＤＰＨから数種類のオキシゲナーゼに電子を伝達するものであり、そのうち最も重要なのは、生体異物の解毒作用を担うシトクロームＰ４５０ファミリーの酵素である。シトクロームＣ還元酵素は小胞体マーカーとして広く用いられている。ある特定の実施形態では、第二の組成物には、シトクロームＣ還元酵素もシトクロームＣ還元酵素の活性も実質的にみられない。ある特定の実施形態では、第四の組成物は、第一の組成物と比較してシトクロームＣ還元酵素もシトクロームＣ還元酵素の活性も富化されていない。
【0102】
ミトコンドリア呼吸鎖障害（ＭＲＣＤ）は、分子の欠損がミトコンドリアの酸化的リン酸化系（ＯＸＰＨＯＳ）に影響を及ぼすことによって細胞の生体エネルギー機構が影響を受ける点で共通する異質な障害群である。臨床的には通常、複数の組織に及ぶものであるが、主に神経系および骨格筋が影響を受ける傾向がみられる。肥大型心筋症または拡張型心筋症および心伝導障害を含めた心臓病の症状の頻度が高く、成人または小児の多系ミトコンドリア障害の一部であったり、頻度は低いが孤発性の臨床病態として発現したりする。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はミトコンドリア呼吸鎖疾患（ＭＲＣＤ）である。
【0103】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は、ＬＨＯＮ（レーバー遺伝性視神経症）；ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリア性ミオパチー、脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様症状）；ピアソン症候群；リー症候群；ＮＡＲＰ（ニューロパチー、運動失調、網膜色素変性および眼瞼下垂）；ＭＥＲＲＦ（赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん）；ＫＳＳ（カーンズ・セイヤー症候群）；ＭＮＧＩＥ（筋神経原性の胃腸脳症）；フリードライヒ運動失調症；およびアルパース病からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は、ＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳ、ピアソン症候群、リー症候群、ＮＡＲＰ、ＭＥＲＲＦおよびＫＳＳからなる群より選択される。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＬＨＯＮである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＭＥＬＡＳである。
【0104】
ある特定の実施形態では、方法は、第四の組成物を凍結させることをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、第四の組成物を凍結させたのちに解凍することをさらに含む。
【0105】
本発明は、別の態様では、上記の方法によって採取された機能性ミトコンドリアで富化された複数のヒト骨髄細胞をさらに提供する。
【0106】
ある特定の実施形態では、複数のヒト骨髄細胞を凍結させる。ある特定の実施形態では、複数のヒト骨髄細胞を凍結させたのちに解凍する。
【0107】
本発明は、別の態様では、複数のヒト骨髄細胞をさらに提供し、この骨髄細胞は、（ａ）正常を上回るミトコンドリア含有量を示すか；（ｂ）正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度を示すか；（ｃ）正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを示すか；（ｄ）ＣＤ３４＋であるか；（ｖ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の任意の組合せである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0108】
本明細書で使用される「正常を上回るミトコンドリア含有量」という用語は、ミトコンドリア疾患に罹患していない１例または複数例の対象の対応する細胞にみられるミトコンドリア含有量から導かれるか、これに対応する対照ミトコンドリア含有量よりも実質的に高いミトコンドリア含有量を指す。
【0109】
ある特定の実施形態では、複数のヒト骨髄細胞を凍結させる。ある特定の実施形態では、複数のヒト骨髄細胞を凍結させたのち解凍する。
【0110】
ある特定の実施形態では、上記の複数のヒト骨髄細胞は、正常を上回るミトコンドリア含有量を示し；正常を上回る酸素（Ｏ２）消費速度を示し；正常を上回るクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを示し；かつＣＤ３４＋である。
【0111】
本発明は、別の態様では、上記の複数のヒト骨髄細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。
【0112】
本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの生物学的に活性な作用因子を含む任意の組成物を指す。
【0113】
本明細書で使用される「生物学的に活性な作用因子」という用語は、生体系、例えば生きている細胞（１つまたは複数）、組織（１つまたは複数）、器官（１つまたは複数）および生体（１つまたは複数）に応答を引き起こすことが可能な任意の分子を指す。本発明による生物学的に活性な薬剤の非限定的な例としては、細胞、インタクトのミトコンドリア、ミトコンドリアＤＮＡおよびミトコンドリアタンパク質が挙げられる。
【0114】
ある特定の実施形態では、医薬組成物を凍結させる。ある特定の実施形態では、医薬組成物を凍結させたのち解凍する。
【0115】
ある特定の実施形態では、上記の医薬組成物は、ヒト患者のミトコンドリア疾患を治療する方法に使用するものである。本明細書で使用される「治療」という用語は、疾患または病態を原因とするか、これによって引き起こされる少なくとも１つの症状の消失、緩和または改善を包含する。本明細書で使用される「治療」という用語はほかにも、予防的治療、対症的治療および根治的治療を包含する。
【0116】
本発明は、別の態様では、治療を必要とするヒト患者のミトコンドリア疾患を治療する方法であって、患者に上記の医薬組成物を投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【0117】
本明細書で使用される「方法」という用語は一般に、所与の課題を遂行する仕方、手段、手技および手順を指し、特に限定されないが、化学、薬理学、生化学および医学の当業者が知っているか、既知のものから容易に開発できる仕方、手段、手技および手順がこれに包含される。
【0118】
ある特定の実施形態では、医薬組成物を凍結させ、上記の方法は、凍結させた医薬組成物を解凍することをさらに含む。
【0119】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者に対して自己のものである。本明細書で使用される「患者に対して自己のもの」という用語は、ＨＬＡが一致する患者の骨髄細胞をはじめとする細胞を指す。
【0120】
ある特定の実施形態では、骨髄細胞は、ミトコンドリア疾患に罹患している患者に対して外来性のものである。本明細書で使用される「患者に対して外来性のもの」という用語は、ＨＬＡが一致しない患者の骨髄細胞をはじめとする細胞を指す。
【0121】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、患者にミトコンドリア生合成を促進する薬剤を投与する段階をさらに含む。本明細書で使用される「ミトコンドリア生合成」という用語は、ミトコンドリアの成長および分裂を指す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア生合成を促進する薬剤は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはその塩である。ある特定の実施形態では、薬剤は、組換えヒトエリスロポエチンおよび単離ヒトエリスロポエチンからなる群より選択される。
【0122】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、患者に患者と骨髄細胞との間の有害な免疫原性反応を防ぐ、遅らせる、最小限に抑える、または消失させる薬剤を投与する段階をさらに含む。ある特定の実施形態では、有害な免疫原性反応は移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。ある特定の実施形態では、ＧｖＨＤは急性型の疾患（ａＧｖＨＤ）である。ある特定の実施形態では、ＧｖＨＤは慢性型の疾患（ｃＧｖＨＤ）である。
【0123】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、医薬組成物の投与の前に患者に移植前処置剤を投与する前段階をさらに含む。本明細書で使用される「移植前処置剤」という用語は、ヒト対象の骨髄内の骨髄細胞を死滅させることが可能な任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、移植前処置剤はブスルファンである。
【0124】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はミトコンドリアＤＮＡの変異を原因とするものである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は核ＤＮＡの変異を原因とするものである。本明細書で使用される「変異」という用語は、ミトコンドリアＤＮＡまたは核ＤＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失または置換を指す。
【0125】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＭＲＣＤである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は、ＬＨＯＮ；ＭＥＬＡＳ；ピアソン症候群；リー症候群；ＮＡＲＰ；ＭＥＲＲＦ；ＫＳＳ；ＭＮＧＩＥ；フリードライヒ運動失調症；およびアルパース病からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患は、ＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳ、ピアソン症候群、リー症候群、ＮＡＲＰ、ＭＥＲＲＦおよびＫＳＳからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＬＨＯＮである。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア疾患はＭＥＬＡＳである。
【0126】
ある特定の実施形態では、医薬組成物を局所投与する。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、対象の骨髄への直接投与によるものである。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、組織または器官への投与である。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、眼球への投与である。硝子体液は、眼球の水晶体と網膜の間の空間を満たす無色透明のゼラチン状の塊である。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、眼球の硝子体液への投与である。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、筋肉内への直接注射によるものである。ある特定の実施形態では、医薬組成物を全身投与する。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射および組織または器官への直接注射からなる群より選択される経路によるものである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0127】
ある特定の実施形態では、機能性ミトコンドリアは、胎盤、培養した胎盤細胞および血液細胞からなる群より選択されるヒト細胞またはヒト組織から採取されるものである。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0128】
ある特定の実施形態では、機能性ミトコンドリアは凍結融解サイクルを経たものである。いかなる理論にも機序にも束縛されることを望むものではないが、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、融解後も凍結融解サイクルを経ていない対照ミトコンドリアと同等の酸素消費速度を示す。
【0129】
いくつかの実施形態では、凍結融解サイクルは、前記機能性ミトコンドリアを融解前に少なくとも２４時間凍結させることを含む。いくつかの実施形態では、凍結融解サイクルは、前記機能性ミトコンドリアを融解前に少なくとも１か月、融解前に数か月、またはそれ以上の間凍結させることを含む。別の実施形態では、凍結融解サイクル後の機能性ミトコンドリアの酸素消費は、凍結融解サイクル前の機能性ミトコンドリアの酸素消費と同等かそれ以上である。
【0130】
本明細書で使用される「凍結融解サイクル」という用語は、機能性ミトコンドリアを０℃未満の温度まで凍結させ、０℃未満の温度で定められた期間の間ミトコンドリアを維持し、室温もしくは体温またはそのミトコンドリアで造血細胞を処理することが可能な０℃超の任意の温度までミトコンドリアを融解させることを指す。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。本明細書で使用される「室温」という用語は、１８℃～２５℃の温度を指す。本明細書で使用される「体温」という用語は、３５．５℃～３７．５℃、好ましくは３７℃の温度を指す。別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは機能性ミトコンドリアである。
【0131】
別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、－７０℃以下の温度で凍結させたものである。別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、－２０℃以下の温度で凍結させたものである。別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、－４℃以下の温度で凍結させたものである。別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、０℃以下の温度で凍結させたものである。別の実施形態では、ミトコンドリアの凍結は緩徐なものである。いくつかの実施形態では、ミトコンドリアの凍結は瞬間凍結によるものである。本明細書で使用される「瞬間凍結」という用語は、ミトコンドリアを極低温に曝露することによって急速に凍結させることを指す。
【0132】
別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、融解前に少なくとも３０分間凍結させたものである。別の実施形態では、凍結融解サイクルは、機能性ミトコンドリアを融解前に少なくとも３０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、１８０分間、２１０分間凍結させることを含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、融解前に少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間または１２０時間凍結させたものである。それぞれの凍結時間が本発明の個々の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、融解前に少なくとも４日間、５日間、６日間、７日間、３０日間、６０日間、１２０日間、３６５日間凍結させたものである。それぞれの凍結時間が本発明の個々の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結融解サイクルは、機能性ミトコンドリアを融解前に少なくとも１週間、２週間、３週間凍結させることを含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結融解サイクルは、機能性ミトコンドリアを融解前に少なくとも１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間凍結させることを含む。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。
【0133】
別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、融解前に－７０℃で少なくとも３０分間凍結させたものである。いかなる理論にも機序にも束縛されることを望むものではないが、ミトコンドリアを凍結させ、長期間経た後にそれを融解させることが可能なことにより、ミトコンドリアの保管および使用が容易になり、長期間の保管後でも再現可能な結果が得られる。
【0134】
別の実施形態では、融解を室温で実施する。別の実施形態では、融解を体温で実施する。別の実施形態では、本発明の方法によるミトコンドリアの投与が可能な温度で融解を実施する。別の実施形態では、融解を緩徐に実施する。
【0135】
別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、凍結用緩衝液中で凍結させたものである。別の実施形態では、凍結融解サイクルを経たミトコンドリアは、単離用緩衝液中で凍結させたものである。本明細書で使用される「単離用緩衝液」という用語は、本発明のミトコンドリアを単離した緩衝液を指す。非限定的な例では、単離用緩衝液はスクロース緩衝液である。いかなる機序にも理論にも束縛されることを望むものではないが、単離用緩衝液中でミトコンドリアを凍結させれば、凍結前に単離用緩衝液を凍結用緩衝液に交換したり、融解時に凍結用緩衝液を交換したりする必要がなくなるため、時間および単離の諸段階が省かれる。
【0136】
別の実施形態では、凍結用緩衝液は凍結保護物質を含む。いくつかの実施形態では、凍結保護物質は、糖、オリゴ糖または多糖である。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結用緩衝液の糖濃度は、ミトコンドリアの機能を保護するよう作用するのに十分な糖濃度である。別の実施形態では、単離用緩衝液は糖を含む。別の実施形態では、単離用緩衝液の糖濃度は、ミトコンドリアの機能を保護するよう作用するのに十分な糖濃度である。別の実施形態では、糖はスクロースである。
【0137】
別の実施形態では、当該技術分野で公知の任意の方法によってミトコンドリア膜のインタクト性を判定し得る。非限定的な例では、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）蛍光プローブまたはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）蛍光プローブを用いてミトコンドリアの膜のインタクト性を測定する。それぞれの可能性が本発明の個々の実施形態を表す。顕微鏡下で観察しＴＭＲＭまたはＴＭＲＥの染色が認めら得たミトコンドリアは、インタクトのミトコンドリア外膜を有する。本明細書で使用される「ミトコンドリアの膜」という用語は、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア外膜およびその両方からなる群より選択されるミトコンドリア膜を指す。
【0138】
ここまで特定の実施形態に関して本発明を説明してきたが、当業者には、本発明の範囲を逸脱せずに様々な変更を施し、等価物に置き換え得ることが理解されよう。さらに、本発明の教示に特定の状況または材料を適合させるため、本発明の範囲を逸脱せずに多数の修正を施し得る。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されることはなく、添付の請求項の範囲内に収まるあらゆる実施形態を包含するものとする。
【0139】
以下の実施例は、本発明のより完全な理解をもたらすために記載するものである。本発明の原理を説明するために記載される具体的な技術、条件、材料、割合および報告データは例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0140】
実施例１．単離ミトコンドリアはヒト肝細胞に侵入することはできない。
ヒトＨｅｐＧ２細胞（１０５個、ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）を未処置（対照）とするか、ヒト胎盤細胞から単離したミトコンドリアと２４時間インキュベートした。細胞を播種する前、ミトコンドリアと細胞とを混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁させた。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＳ０７２０ Ｓｉｇｍａキットを用いてＣＳ活性を測定した（図１）。
ヒトＨｅｐＧ２細胞（１０５個、ＡＴＣＣ ＨＢ－８０６５）を未処置（対照）とするか、ヒト胎盤細胞から単離したミトコンドリアと２４時間インキュベートした。細胞を播種する前、ミトコンドリアと細胞とを混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁させた。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＳ０７２０ Ｓｉｇｍａキットを用いてＣＳ活性を測定した（図１）。
【0141】
図１に示される結果から、ミトコンドリアはヒト肝細胞と一緒に遠心分離しても同細胞に侵入することができないことがわかる。
【0142】
実施例２．単離ミトコンドリアは線維芽細胞に侵入することができる。
ミトコンドリア内で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するマウス線維芽細胞（３Ｔ３）（左パネル）と、ミトコンドリア内で赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するマウス線維芽細胞（３Ｔ３）（中央パネル）から単離したＲＦＰ標識ミトコンドリアとを２４時間インキュベートした。蛍光共焦点顕微鏡法を用いて、ＧＦＰおよびＲＦＰの両方で標識され黄色に見える線維芽細胞（右パネル）を確認した（図２）。
ミトコンドリア内で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するマウス線維芽細胞（３Ｔ３）（左パネル）と、ミトコンドリア内で赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するマウス線維芽細胞（３Ｔ３）（中央パネル）から単離したＲＦＰ標識ミトコンドリアとを２４時間インキュベートした。蛍光共焦点顕微鏡法を用いて、ＧＦＰおよびＲＦＰの両方で標識され黄色に見える線維芽細胞（右パネル）を確認した（図２）。
【0143】
図２に示される結果から、ミトコンドリアは線維芽細胞に侵入することができることがわかる。
【0144】
実施例３．ミトコンドリアはミトコンドリア活性が抑制された細胞のＡＴＰ産生を増大させる。
マウス線維芽細胞（１０４個、３Ｔ３）を未処置（対照）とするか、０．５μＭのロテノン（ロテノン、ミトコンドリア複合体Ｉの不可逆的阻害剤、ＣＡＳ番号８３－７９－４）で４時間処置し、洗浄し、さらに０．０２ｍｇ／ｍｌのマウス胎盤ミトコンドリア（ロテノン＋ミトコンドリア）で３時間処置した。細胞を洗浄し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＴＰｌｉｔｅキットを用いてＡＴＰレベルを求めた（図３）。図３からわかるように、ミトコンドリアとインキュベートした細胞は、対照と比較してＡＴＰ産生が完全にレスキューされている。
マウス線維芽細胞（１０４個、３Ｔ３）を未処置（対照）とするか、０．５μＭのロテノン（ロテノン、ミトコンドリア複合体Ｉの不可逆的阻害剤、ＣＡＳ番号８３－７９－４）で４時間処置し、洗浄し、さらに０．０２ｍｇ／ｍｌのマウス胎盤ミトコンドリア（ロテノン＋ミトコンドリア）で３時間処置した。細胞を洗浄し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＴＰｌｉｔｅキットを用いてＡＴＰレベルを求めた（図３）。図３からわかるように、ミトコンドリアとインキュベートした細胞は、対照と比較してＡＴＰ産生が完全にレスキューされている。
【0145】
図３に示される結果から、ロテノン単独ではＡＴＰレベルが約５０％低下したが、ミトコンドリアの添加により、ロテノンの阻害作用を実質的に打ち消し、対照細胞のＡＴＰレベルまで到達させることができたことが明らかにわかる。この実験から、ミトコンドリアはミトコンドリア活性が抑制された細胞のミトコンドリアのＡＴＰ産生を増大させることが可能であることを示す証拠が得られる。
【0146】
実施例４．ミトコンドリアはマウス骨髄細胞に侵入することができる。
マウス骨髄細胞（１０５個）をマウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアと２４時間インキュベートした。蛍光共焦点顕微鏡法を用いて、骨髄細胞内のＧＦＰ標識ミトコンドリアを確認した（図４）。
マウス骨髄細胞（１０５個）をマウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアと２４時間インキュベートした。蛍光共焦点顕微鏡法を用いて、骨髄細胞内のＧＦＰ標識ミトコンドリアを確認した（図４）。
【0147】
図４に示される結果から、ミトコンドリアが骨髄細胞に侵入することができることがわかる。
【0148】
実施例５．ミトコンドリアは濃度依存性に骨髄細胞に侵入する。
マウス骨髄細胞（１０６）を未処置とするか、マウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアの量を変えて一緒に１５時間インキュベートした。細胞を播種する前、ミトコンドリアと細胞とを混合し、室温で５分間静置する（（－）Ｃｅｎｔ）か、４０℃にて５分間、８，０００ｇで遠心分離したＣ（（＋）Ｃｅｎｔ）。次いで細胞を２４ウェルに播種した（１０６細胞／ウェル）。１５分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄して、細胞に侵入していないミトコンドリアを除去した。ＣＳ０７２０ Ｓｉｇｍａキットを用いてクエン酸シンターゼ活性を求めた（図５）。上に明記した条件下で測定したＣＳ活性レベルを表１にまとめる。
マウス骨髄細胞（１０６）を未処置とするか、マウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアの量を変えて一緒に１５時間インキュベートした。細胞を播種する前、ミトコンドリアと細胞とを混合し、室温で５分間静置する（（－）Ｃｅｎｔ）か、４０℃にて５分間、８，０００ｇで遠心分離したＣ（（＋）Ｃｅｎｔ）。次いで細胞を２４ウェルに播種した（１０６細胞／ウェル）。１５分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄して、細胞に侵入していないミトコンドリアを除去した。ＣＳ０７２０ Ｓｉｇｍａキットを用いてクエン酸シンターゼ活性を求めた（図５）。上に明記した条件下で測定したＣＳ活性レベルを表１にまとめる。
【0149】
【表1】
【0150】
図５に示される結果から、ミトコンドリアの添加により細胞内ＣＳ活性が用量依存性に増大し、濃度の増大、したがって僭越にも、例えば遠心分離によるミトコンドリアと細胞との間の接触によりＣＳ活性が増大したことがわかる。
【0151】
実施例６．ＥＲが混入しない特異的ミトコンドリア富化。
マウス骨髄細胞（１０６個）を未処置とするか、マウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリア（１７Ｕまたは３４Ｕ、ミトコンドリア含有量のマーカーとしてクエン酸シンターゼ活性のレベルを示す）と２４時間インキュベートした。細胞とミトコンドリアとを混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁させた。２４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＳ０７２０キットおよびＣＹ０１００キット（Ｓｉｇｍａ社）を用いてクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性（図６Ａ）およびシトクロームｃ還元酵素活性（図６Ｂ）のレベルをそれぞれ測定した。
マウス骨髄細胞（１０６個）を未処置とするか、マウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリア（１７Ｕまたは３４Ｕ、ミトコンドリア含有量のマーカーとしてクエン酸シンターゼ活性のレベルを示す）と２４時間インキュベートした。細胞とミトコンドリアとを混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁させた。２４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＳ０７２０キットおよびＣＹ０１００キット（Ｓｉｇｍａ社）を用いてクエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性（図６Ａ）およびシトクロームｃ還元酵素活性（図６Ｂ）のレベルをそれぞれ測定した。
【0152】
図６に示される結果から、上の実験に用いた機能性ミトコンドリアの組成物が、骨髄細胞のミトコンドリアは富化させるが、ＥＲは富化させないことが明らかにわかる。
【0153】
実施例７．ミトコンドリアで富化されたマウス骨髄細胞はＬＨＯＮのｉｎ ｖｉｖｏモデルでミトコンドリアを分配する。
マウス骨髄細胞（１０５）を未処置にするか、マウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアと２４時間インキュベートした。細胞とミトコンドリアとを混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁させた。２４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ロテノン（２５ｍＭ）を注射してから４時間後に硝子体内に注射した。免疫組織化学法を用いてパラフィン切片を抗ＧＦＰ抗体で染色した。図７Ａに、対照１（細胞もミトコンドリアも注射していない、左パネル）および対照２（ミトコンドリアを搭載した細胞を注射したが染色に抗ＧＦＰを使用していない、右パネル）のスライスの染色を示す。図７Ｂに、注射した眼球のスライスの染色を示す。網膜神経節細胞（ＲＧＣ）層（上のパネル２つ）、血管（＊）および血管壁を裏打ちする細胞（矢印）にＧＦＰ陽性細胞が観察された。
マウス骨髄細胞（１０５）を未処置にするか、マウスメラノーマ細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアと２４時間インキュベートした。細胞とミトコンドリアとを混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁させた。２４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ロテノン（２５ｍＭ）を注射してから４時間後に硝子体内に注射した。免疫組織化学法を用いてパラフィン切片を抗ＧＦＰ抗体で染色した。図７Ａに、対照１（細胞もミトコンドリアも注射していない、左パネル）および対照２（ミトコンドリアを搭載した細胞を注射したが染色に抗ＧＦＰを使用していない、右パネル）のスライスの染色を示す。図７Ｂに、注射した眼球のスライスの染色を示す。網膜神経節細胞（ＲＧＣ）層（上のパネル２つ）、血管（＊）および血管壁を裏打ちする細胞（矢印）にＧＦＰ陽性細胞が観察された。
【0154】
図７に示される結果から、骨髄細胞がミトコンドリアの運搬体の役割を果たし、標的とする器官または組織に機能性ミトコンドリアを分配することが可能であることが明らかにわかる。この能力をさらにほかの様々なミトコンドリア疾患の治療に利用することができる。
【0155】
実施例８．ミトコンドリアはヒトｍｔＤＮＡ欠乏細胞の増殖を増大させる。
１４３Ｂ Ｒｈｏ０細胞（ヒト骨肉腫、ミトコンドリアＤＮＡ欠損（ｍｔＤＮＡ－）を９６ウェルに播種し（３×１０４細胞／ウェル）、ピルビン酸塩とウリジンとを含有する培地で培養した。１４３Ｂ ＴＫ細胞（ヒト骨肉腫、チミジンキナーゼ陽性（ＴＫ＋）、ｍｔＤＮＡ＋、２×１０６細胞／ウェル）からミトコンドリアを単離し、１４３Ｂ Ｒｈｏ０細胞とインキュベートした。２４時間後、培地を交換し、細胞をガンシクロビルで処理して１４３Ｂ ＴＫ＋細胞を除去した。残った細胞をさらに３日間培養した後、培地をピルビン酸塩もウリジンも含まないものに交換した。２４時間後、細胞をトリプシンで処理し、１０ｃｍのディッシュに移した。その後９日間、培地を３日毎に交換した。１組のディッシュ（対照細胞およびミトコンドリア処置細胞）をメタノールで固定し、ギムザで染色した（図８Ａ）。２組目をトリプシンで処理し、細胞数およびミトコンドリア活性の指標としてＡＴＰレベルとアッセイした（図８Ｂ）。図８Ｂからわかるように、ミトコンドリアとインキュベートした細胞のＡＴＰレベルは対照の約５．３倍上昇した。
１４３Ｂ Ｒｈｏ０細胞（ヒト骨肉腫、ミトコンドリアＤＮＡ欠損（ｍｔＤＮＡ－）を９６ウェルに播種し（３×１０４細胞／ウェル）、ピルビン酸塩とウリジンとを含有する培地で培養した。１４３Ｂ ＴＫ細胞（ヒト骨肉腫、チミジンキナーゼ陽性（ＴＫ＋）、ｍｔＤＮＡ＋、２×１０６細胞／ウェル）からミトコンドリアを単離し、１４３Ｂ Ｒｈｏ０細胞とインキュベートした。２４時間後、培地を交換し、細胞をガンシクロビルで処理して１４３Ｂ ＴＫ＋細胞を除去した。残った細胞をさらに３日間培養した後、培地をピルビン酸塩もウリジンも含まないものに交換した。２４時間後、細胞をトリプシンで処理し、１０ｃｍのディッシュに移した。その後９日間、培地を３日毎に交換した。１組のディッシュ（対照細胞およびミトコンドリア処置細胞）をメタノールで固定し、ギムザで染色した（図８Ａ）。２組目をトリプシンで処理し、細胞数およびミトコンドリア活性の指標としてＡＴＰレベルとアッセイした（図８Ｂ）。図８Ｂからわかるように、ミトコンドリアとインキュベートした細胞のＡＴＰレベルは対照の約５．３倍上昇した。
【0156】
図８に示される結果から、単離ｍｔＤＮＡ＋ミトコンドリアはヒト骨ｍｔＤＮＡ－細胞と相互作用し、その生存能、増殖およびＡＴＰ産生を増大させることが明らかにわかる。
【0157】
実施例９．ミトコンドリアはヒト骨髄細胞に侵入することができる。
ヒトＣＤ３４＋細胞（１．４×１０５個、ＡＴＣＣ ＰＣＳ－８００－０１２）を未処置とするか、ヒト胎盤細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアと２０時間インキュベートした。細胞を播種する前、ミトコンドリアと細胞とを混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁させた。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＳ０７２０ Ｓｉｇｍａキットを用いてＣＳ活性を測定した（図９Ａ）。ＡＴＰｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いてＡＴＰ含有量を測定した（図９Ｂ）。上に明記した条件下で測定したＣＳ活性レベル（図９Ａ）を表２にまとめる。
ヒトＣＤ３４＋細胞（１．４×１０５個、ＡＴＣＣ ＰＣＳ－８００－０１２）を未処置とするか、ヒト胎盤細胞から単離したＧＦＰ標識ミトコンドリアと２０時間インキュベートした。細胞を播種する前、ミトコンドリアと細胞とを混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁させた。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＳ０７２０ Ｓｉｇｍａキットを用いてＣＳ活性を測定した（図９Ａ）。ＡＴＰｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いてＡＴＰ含有量を測定した（図９Ｂ）。上に明記した条件下で測定したＣＳ活性レベル（図９Ａ）を表２にまとめる。
【0158】
【表2】
【0159】
図９に示される結果（表２を参照されたい）から、単離ヒトミトコンドリアとの相互作用および共インキュベーションによって、ヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量がヒト線維芽細胞、マウス線維芽細胞またはマウス骨髄細胞のいずれかの能力を上回る程度まで何倍も増大し得ることが明らかにわかる。
【0160】
図９Ｂに示される細胞集団をＦＡＣＳ解析によってさらに評価した。ＧＦＰ標識ミトコンドリアとインキュベートしなかったＣＤ３４＋細胞のうち蛍光を発した細胞の割合はごくわずか（０．９％）であった（図１０Ａ）が、ＧＦＰ標識ミトコンドリアと遠心分離した後にインキュベートしたＣＤ３４＋細胞では相当数（２８．４％）のものが蛍光を発した（図１０Ｂ）。
【0161】
実施例１０．マウスミトコンドリア疾患モデル。
ＷＴマウス胎盤からマウスミトコンドリアを採取し、これを用いてミトコンドリア疾患（ｍｔＤＮＡ ｔＲＮＡ－Ａｌａに変異がみられる疾患など）のマウスモデルの骨髄を処置する。簡潔に述べれば、疾患骨髄細胞をｅｘ ｖｉｖｏでマウス胎盤ミトコンドリアの濃度およびインキュベーション時間を変えて処置し、別の疾患マウスに注射する。比較のため、健常マウスから疾患マウスへの健常骨髄の移植も実施する。効果をみるアッセイを様々な時点で実施する（移植前：ＡＴＰレベル、Ｏ２消費量、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性；移植後：ＡＴＰ合成量、Ｏ２消費量、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー、ＣＳ活性および血中の乳酸の有無）。注射から１日後、１週間後および１か月後、様々な組織（主として骨髄、心臓、骨格筋、肝臓および脳）の変異型ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子と野生型ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子とをＰＣＲで比較解析することにより、ミトコンドリアの生体内分布を調べる。
ＷＴマウス胎盤からマウスミトコンドリアを採取し、これを用いてミトコンドリア疾患（ｍｔＤＮＡ ｔＲＮＡ－Ａｌａに変異がみられる疾患など）のマウスモデルの骨髄を処置する。簡潔に述べれば、疾患骨髄細胞をｅｘ ｖｉｖｏでマウス胎盤ミトコンドリアの濃度およびインキュベーション時間を変えて処置し、別の疾患マウスに注射する。比較のため、健常マウスから疾患マウスへの健常骨髄の移植も実施する。効果をみるアッセイを様々な時点で実施する（移植前：ＡＴＰレベル、Ｏ２消費量、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性；移植後：ＡＴＰ合成量、Ｏ２消費量、ｍｔＤＮＡのヘテロプラスミー、ＣＳ活性および血中の乳酸の有無）。注射から１日後、１週間後および１か月後、様々な組織（主として骨髄、心臓、骨格筋、肝臓および脳）の変異型ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子と野生型ミトコンドリアｔＲＮＡ遺伝子とをＰＣＲで比較解析することにより、ミトコンドリアの生体内分布を調べる。
【0162】
実施例１１．ヒト患者の線維芽細胞の処置。
三次元培養で培養した高純度の活性なヒト胎盤ミトコンドリアを単離し、ＣＳ活性およびＯ２消費量に関して特徴を明らかにする。ｍｔＤＮＡの変異または欠失があるミトコンドリア疾患（ＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳ、リー症候群、ピアソン病、アルパース症候群）の患者の皮膚生検から線維芽細胞を単離する。患者の線維芽細胞および（患者から骨髄を吸引する必要がないように）線維芽細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に変換し造血系統に再プログラム化したものの両方でミトコンドリア増強およびミトコンドリアレスキューの能力を調べる。細胞をヒトミトコンドリアで処置し、ミトコンドリアとインキュベートした後の様々な時点（３時間後、２４時間後および４８時間後）でｍｔＤＮＡヘテロプラスミー、ＣＳ活性、ＡＴＰ含有量およびＯ２消費量を調べる。
三次元培養で培養した高純度の活性なヒト胎盤ミトコンドリアを単離し、ＣＳ活性およびＯ２消費量に関して特徴を明らかにする。ｍｔＤＮＡの変異または欠失があるミトコンドリア疾患（ＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳ、リー症候群、ピアソン病、アルパース症候群）の患者の皮膚生検から線維芽細胞を単離する。患者の線維芽細胞および（患者から骨髄を吸引する必要がないように）線維芽細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に変換し造血系統に再プログラム化したものの両方でミトコンドリア増強およびミトコンドリアレスキューの能力を調べる。細胞をヒトミトコンドリアで処置し、ミトコンドリアとインキュベートした後の様々な時点（３時間後、２４時間後および４８時間後）でｍｔＤＮＡヘテロプラスミー、ＣＳ活性、ＡＴＰ含有量およびＯ２消費量を調べる。
【0163】
実施例１２．ミトコンドリアで富化された骨髄細胞の全身体内分布。
２つの異なるバックグランドに由来する対照健常マウスの骨髄細胞内にミトコンドリアを導入する。これにより、ミトコンドリアの入手源はｍｔＤＮＡ配列の異なるマウス由来になる（Ｊｅｎｕｔｈ ＪＰら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１４，ｐ．１４６－１５１）。
２つの異なるバックグランドに由来する対照健常マウスの骨髄細胞内にミトコンドリアを導入する。これにより、ミトコンドリアの入手源はｍｔＤＮＡ配列の異なるマウス由来になる（Ｊｅｎｕｔｈ ＪＰら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１４，ｐ．１４６－１５１）。
【0164】
この方法の各段階は、（１）Ｂａｌｂ／Ｃマウスの胎盤／肝臓からミトコンドリアを単離し、－８０で凍結させ解凍するか、新鮮な状態で使用する段階；（２）例えばＮＺＢ系統から骨髄を単離する段階；（３）ミトコンドリアと骨髄とを混合し、８０００ｇで５分間遠心分離し、再懸濁させ、２４時間インキュベートする段階；（４）骨髄細胞をＰＢＳで２回洗浄し、マウスの尾静脈に注射する段階である。移植から２４時間後、１週間後、１か月後および３か月後、組織（血液、骨髄、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、骨格筋、眼球）を採取し、ＤＮＡを抽出して、のちの配列解析に供する。
【0165】
実施例１３．ミトコンドリアで富化された骨髄細胞による全身療法。
健常なミトコンドリアがＬＨＯＮに類似したミトコンドリア疾患マウスモデルであるＮＤ６（Ｃｈｕｎ Ｓｈｉ Ｌｉｎら，ＰＮＡＳ，２０１２，Ｖｏｌ．１０９（４９），ｐ．２００６５－２００７０）の表現型を部分的にレスキューし得ることを明らかにするため、ＮＤ６マウスモデルの骨髄細胞内にミトコンドリアを導入する。
健常なミトコンドリアがＬＨＯＮに類似したミトコンドリア疾患マウスモデルであるＮＤ６（Ｃｈｕｎ Ｓｈｉ Ｌｉｎら，ＰＮＡＳ，２０１２，Ｖｏｌ．１０９（４９），ｐ．２００６５－２００７０）の表現型を部分的にレスキューし得ることを明らかにするため、ＮＤ６マウスモデルの骨髄細胞内にミトコンドリアを導入する。
【0166】
この方法の各段階は、（１）Ｂ６ＭＥマウス（ＷＴ系統のＮＤ６マウス）の胎盤／肝臓からミトコンドリアを単離し、－８０で凍結させ解凍するか、新鮮な状態で使用する段階；（２）１Ａ１Ｂ６ＭＥマウス（Ｂ６ＭＥをバックグランドとするＮＤ６変異マウス）から骨髄を単離する段階；（３）ミトコンドリアと骨髄とを混合し、８０００ｇで５分間遠心分離し、再懸濁させ、２４時間インキュベートする段階；（４）骨髄細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１Ａ１Ｂ６ＭＥマウスの尾静脈に注射する段階である。移植から２４時間後、１週間後、１か月後および３か月後、組織（血液、骨髄、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、骨格筋、眼球）を採取し、ＤＮＡを抽出して、のちの配列解析に供する。期間全体にわたって摂餌量、体重、乳酸アシドーシス、血球数および生化学的血液マーカーの変化を評価する。
【0167】
実施例１４．安全性試験および体内分布試験。
安全性試験および体内分布のため、ヒト血中ミトコンドリアをマウス骨髄細胞内に導入する。
安全性試験および体内分布のため、ヒト血中ミトコンドリアをマウス骨髄細胞内に導入する。
【0168】
この方法の各段階は、（１）ヒトの白血球および血小板からミトコンドリアを単離し、－８０で凍結させ解凍するか、新鮮な状態で使用する段階；（２）例えばＣ５７／ｂｌマウスから骨髄を単離する段階；（３）ミトコンドリアと骨髄とを混合し、８０００ｇで５分間遠心分離し、再懸濁させ、２４時間インキュベートする段階；（４）骨髄細胞をＰＢＳで２回洗浄し、例えばＣ５７／ｂｌマウスの尾静脈に注射する段階である。移植から２４時間後、１週間後、１か月後および３か月後、組織（血液、骨髄、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、骨格筋、眼球）を採取し、ＤＮＡを抽出して、のちの配列解析に供する。期間全体にわたって摂餌量、体重、乳酸アシドーシス、血球数および生化学的血液マーカーの変化を評価する。
【0169】
実施例１５．ミトコンドリア疾患に罹患しているヒト患者の治療法。
ミトコンドリア疾患に罹患しているヒト患者を治療する方法の各段階は、（１）ミトコンドリア疾患、例えばＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳまたはピアソン症候群に罹患している患者にＧ－ＣＳＦを用量１０～１６μｇ／ｋｇで５日間投与する段階；（２）第６日、患者の血液にアフェレーシスを実施して骨髄細胞を採取する段階；（３）これと並行して、健常ドナーの血液試料から機能性ミトコンドリアを単離する段階；（４）骨髄細胞を機能性ミトコンドリアと２４時間インキュベートする段階；（５）骨髄細胞を洗浄する段階；および（６）ミトコンドリアを搭載した骨髄細胞を患者に注入する段階である。期間全体にわたって患者の摂食量、体重、乳酸アシドーシス、血球数および生化学的血液マーカーの変化を評価する。
ミトコンドリア疾患に罹患しているヒト患者を治療する方法の各段階は、（１）ミトコンドリア疾患、例えばＬＨＯＮ、ＭＥＬＡＳまたはピアソン症候群に罹患している患者にＧ－ＣＳＦを用量１０～１６μｇ／ｋｇで５日間投与する段階；（２）第６日、患者の血液にアフェレーシスを実施して骨髄細胞を採取する段階；（３）これと並行して、健常ドナーの血液試料から機能性ミトコンドリアを単離する段階；（４）骨髄細胞を機能性ミトコンドリアと２４時間インキュベートする段階；（５）骨髄細胞を洗浄する段階；および（６）ミトコンドリアを搭載した骨髄細胞を患者に注入する段階である。期間全体にわたって患者の摂食量、体重、乳酸アシドーシス、血球数および生化学的血液マーカーの変化を評価する。
【0170】
具体的な実施形態に関する上の記載から、本発明の全般的な性質が十分に明らかになるため、この知識を応用することにより、過度の実験を実施せず、一般的概念から逸脱することもなく、上記の具体的な実施形態を様々な用途に合わせて容易に修正し、かつ／または適応させることが可能であり、したがって、そのような適応および修正は、本開示の実施形態の均等物の意味および範囲に含まれるものであることが理解されるべきであり、また理解されることを意図する。本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的とするものであって、限定を目的とするものではないことが理解されるべきである。開示される様々な機能を遂行する手段、材料および段階は、本発明から逸脱することなく様々な代替的形態をとり得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】