特許 7263497 トリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離方法及び分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-14

(45)【発行日】2023-04-24

(54)【発明の名称】トリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離方法及び分析方法

(51)【国際特許分類】

   C07C 67/56 20060101AFI20230417BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20230417BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20230417BHJP

   C07B 63/00 20060101ALI20230417BHJP

   C07C 69/58 20060101ALI20230417BHJP

   C07C 69/587 20060101ALI20230417BHJP

   C07C 69/52 20060101ALI20230417BHJP

【ＦＩ】

C07C67/56

G01N30/88 C

B01J20/281 X

B01J20/281 G

G01N30/88 W

C07B63/00 F

C07C69/58

C07C69/587

C07C69/52

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2021198856

(22)【出願日】2021-12-07

(62)【分割の表示】P 2017172849の分割

【原出願日】2017-09-08

(65)【公開番号】P2022034567

(43)【公開日】2022-03-03

【審査請求日】2022-01-05

(73)【特許権者】

【識別番号】000165284

【氏名又は名称】月島食品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(72)【発明者】

【氏名】永井 利治

(72)【発明者】

【氏名】後藤 直宏

【審査官】三須 大樹

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２７７３０３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１９－０４９４２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】永井利治ほか，キラルＨＰＬＣによる食用油脂のトリアシルグリセロール位置異性体・鏡像異性体の同時分離，日本油化学第５４回年会講演要旨集，日本，2015年09月08日，第211頁

【文献】株式会社ダイセル，耐溶剤型キラルカラム ｉＣＨＩＲＡＬ ＳＥＲＩＥＳ，耐溶剤型キラルカラム ｉＣＨＩＲＡＬ ＳＥＲＩＥＳ，2016年，https://www.daicelchiral.com/img/mainpage/column/pdf/ichiral_series.pdf

【文献】深津 誠，トリアシルグリセロールの分析法の実際，日本油化学会誌，第４７巻、第１０号，p.947-952

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｃ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールからなる、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む試料溶液を、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の分離剤が充填されたカラムを通過させる工程を含む、上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の高速液体クロマトグラフィーによる分離方法であって、
前記試料溶液を通過させる前に、前記カラムに少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程をさらに含み、
１）エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを通液する；
２）エタノールを通液した後、テトラヒドロフランを通液する；
３）イソプロピルアルコールを通液する；
４）イソプロピルアルコールとテトラヒドロフランの混合液を通液する；かつ、
前記試料溶液が、（ａ）２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールのエステル化反応、（ｂ）２種の脂肪酸Ａ及びＢを含むトリグリセリドのエステル交換反応、（ｃ）脂肪酸Ａ及び／又はＢを構成脂肪酸とするモノアシルグリセロール及び／又はジアシルグリセロールと脂肪酸Ａ及び／又はＢのエステル化反応、あるいは、（ｄ）脂肪酸Ａ及び／又はＢのエステルとトリグリセリドのエステル交換反応で得られたものであるか、（ｅ）天然の脂質から得られたものである、前記分離方法。

【請求項2】

試料溶液が、ＡＡＢ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールの混合物である、請求項１
に記載された分離方法。

【請求項3】

脂肪酸が、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸から選択される２種である、請求項１又は２に記載された分離方法。

【請求項4】

２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールからなる、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む試料溶液を、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の分離剤が充填されたカラムを通過させる工程を含む、前記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の高速液体クロマトグラフィーによる分析方法であって、
前記試料溶液を通過させる前に、前記カラムに少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程をさらに含み、
１）エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを通液する；
２）エタノールを通液した後、テトラヒドロフランを通液する；
３）イソプロピルアルコールを通液する；
４）イソプロピルアルコールとテトラヒドロフランの混合液を通液する；かつ、
前記試料溶液が、（ａ）２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールのエステル化反応、（ｂ）２種の脂肪酸Ａ及びＢを含むトリグリセリドのエステル交換反応、（ｃ）脂肪酸Ａ及び／又はＢを構成脂肪酸とするモノアシルグリセロール及び／又はジアシルグリセロールと脂肪酸Ａ及び／又はＢのエステル化反応、あるいは、（ｄ）脂肪酸Ａ及び／又はＢのエステルとトリグリセリドのエステル交換反応で得られたものであるか、（ｅ）天然の脂質から得られたものである、前記分析方法。

【請求項5】

カラムを通過させたトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を質量分析法で検出する工程をさらに含む、請求項４に記載の分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、高速液体クロマトグラフィーによるトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離工程を含む当該位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法に関する。更に詳細には、２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールからなる、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の原材料混合物を、特定のカラムを使用して高速液体クロマトグラフィーにより分取する工程を含む当該位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

三大栄養素の１つである脂質の中で、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は天然界に最も多く存在する脂質の形態である。ＴＡＧは、グリセロールのｓｎ－１位（α位）、ｓｎ－２位（β位）及びｓｎ－３位（α位）に３つの脂肪酸がエステル結合する構造を有し、食用油脂の主成分である。食用油脂の物理的性質及び栄養学的性質は、グリセロールにエステル結合している脂肪酸の種類とその結合位置に影響される。

【0003】

２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧのｓｎ－２位の炭素が不斉炭素である場合、当該ＴＡＧには鏡像異性体が存在する。例えば、１つのエイコサペンタエン酸（Ｅ）と２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧには、エイコサペンタエン酸（Ｅ）がグリセロールのｓｎ－３位にエステル結合し、２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－２位にエステル結合しているＴＡＧ（以下、「ｓｎ－ＣＣＥ」と表記する。）と、エイコサペンタエン酸（Ｅ）がグリセロールのｓｎ－１位にエステル結合し、２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールのｓｎ－２位及びｓｎ－３位にエステル結合しているＴＡＧ（以下、「ｓｎ－ＥＣＣ」と表記する。）がある。また、１つのドコサヘキサエン酸（Ｄ）と２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧには、ドコサヘキサエン酸（Ｄ）がグリセロールのｓｎ－３位にエステル結合し、２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－２位にエステル結合しているＴＡＧ（以下、「ｓｎ－ＣＣＤ」と表記する。）と、ドコサヘキサエン酸（Ｄ）がグリセロールのｓｎ－１位にエステル結合し、２つのカプリル酸（Ｃ）がグリセロールのｓｎ－２位及びｓｎ－３位にエステル結合しているＴＡＧ（以下、「ｓｎ－ＤＣＣ」と表記する。）がある。ｓｎ－ＣＣＥとｓｎ－ＥＣＣ、ｓｎ－ＣＣＤとｓｎ－ＤＣＣは、それぞれ、鏡像異性体として区別される。ｓｎ－ＣＣＥとｓｎ－ＥＣＣの分離、ｓｎ－ＣＣＤとｓｎ－ＤＣＣの分離が、それぞれ、セルロース誘導体がシリカゲルに担持された分離剤が充填されたカラムを利用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検討された（例えば、非特許文献１参照）。

【0004】

本発明者らは、食用油脂に含まれる鏡像異性体であるｓｎ－ＰＰＯ（パルミチン酸（Ｐ）がグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－２位にエステル結合し、オレイン酸（Ｏ）がグリセロールのｓｎ－３位に結合しているＴＡＧ）とｓｎ－ＯＰＰ（パルミチン酸（Ｐ）がグリセロールのｓｎ－２位及びｓｎ－３位にエステル結合し、オレイン酸（Ｏ）がグリセロールのｓｎ－１位に結合しているＴＡＧ）の上記分離方法による分離を検討したが、ｓｎ－ＰＰＯとｓｎ－ＯＰＰを分離できなかったため、ｓｎ－ＰＰＯとｓｎ－ＯＰＰのリサイクルＨＰＬＣによる分離方法を検討した（例えば、非特許文献２参照）。リサイクルＨＰＬＣは、ＵＶ検出器の出口の流路をポンプの入口に戻し、移動相を循環させる機能を有するＨＰＬＣである。

【0005】

食用油脂には、ｓｎ－ＰＰＯとｓｎ－ＯＰＰの位置異性体として、ｓｎ－ＰＯＰ（パルミチン酸（Ｐ）がグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－３位にエステル結合し、オレイン酸（Ｏ）がグリセロールのｓｎ－２位に結合しているＴＡＧ）も含まれている。従来のキラルカラムとリサイクルＨＰＬＣだけでは、これらの位置・鏡像異性体を同時に分離することは不可能だったため、ｓｎ－ＰＰＯ、ｓｎ－ＯＰＰ及びｓｎ－ＰＯＰを同時に分離するため、アミロース トリス（３－クロロフェニルカルバメート）がシリカゲルに担持された、粒子径３μｍの分離剤が充填されたカラム、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに担持された、粒子径５μｍの分離剤が充填されたカラムを、それぞれ、使用するＨＰＬＣによる分離方法が検討された（例えば、非特許文献３参照）。

【0006】

一方、ＴＡＧを含む試料を超臨界流体を含む移動相が送液される流路中に注入し、アミロース トリス（３－クロロフェニルカルバメート）がシリカゲルに担持された、粒子径３μｍの分離剤が充填されたカラムに通液させてＴＡＧ鏡像異性体を分離する方法が検討された（例えば、特許文献１参照）。しかし、当該ＴＡＧ鏡像異性体の分離方法によるＴＡＧ位置異性体とＴＡＧ鏡像異性体の同時分離は検討されていなかった。さらに、超臨界流体を移動相とするクロマトグラフィーシステムは、従来のＨＰＬＣシステムよりかなり高価である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特開２０１５-１７５７４７号公報

【非特許文献】

【0008】

【文献】Y. Iwasaki, M. Yasui, T. Ishikawa, R. Irimescu, K. Hata, T. Yamane. J. Chromatogr. A 905,111-118(2001)

【文献】T. Nagai,H. Mizobe, I. Otake, K. Ichioka, K. Kojima, Y. Matsumoto, N. Gotoh, I. Kuroda, S. Wada. Enantiomeric separation of asymmetric triacylglycerol by recycle high-performance liquid chromatography with chiral column.J. Chromatogr. A 1218, 2880-2886(2011).

【文献】永井利治 外７名、日本油化学会第５４回年会講演要旨集、第２１１頁、２０１５年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

食用油脂の物理的性質及び栄養学的性質の検討のため、従来のＨＰＬＣシステムを利用する、２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧ位置異性体及び鏡像異性体の分離能が更に向上した分離方法が期待されていたが、そのような分離方法は提供されていなかった。本発明の課題は、かかる２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧ位置異性体及び／又は鏡像異性体をＨＰＬＣにより分離する工程を含むこれら異性体の製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、リサイクルシステムを用いない従来のＨＰＬＣシステムを利用する、ＴＡＧ位置異性体及び鏡像異性体の分離能が向上した分離方法を鋭意検討した結果、特定のカラム、特に特定の有機溶媒が通液されて処理された特定のカラムを使用してＨＰＬＣを実施すると、２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧ位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離能が向上することを見いだし、本発明を完成させるに至った。

【0011】

すなわち、本発明は、以下の製造方法に関する。
［１］以下の工程Ａ及びＢを含む、任意の脂肪酸Ａ、及び脂肪酸Ａとは異なる任意の脂肪酸Ｂを構成脂肪酸とする、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法。
Ａ）上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む原料混合物を準備する工程Ａ；
Ｂ）工程Ａで準備した原料混合物から、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の固定相が充填された分離カラムを使用する高速液体クロマトグラフィーにより、上記位置異性体及び／又は鏡像異性体を分取する工程Ｂ；
［２］以下の工程Ｃを更に含む［１］に記載の位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法。
Ｃ）前記原料混合物から、逆相高速液体クロマトグラフィーにより、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上の位置異性体及び／又は鏡像異性体を濃縮する工程Ｃ
［３］工程Ｂの前に、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の固定相が充填された分離カラムに、少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程Ｄを更に含む、［１］又は［２］に記載された位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法。
１）エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを通液する；
２）エタノールを通液した後、テトラヒドロフランを通液する；
３）イソプロピルアルコールを通液する；
４）イソプロピルアルコールとテトラヒドロフランの混合液を通液する；
［４］脂肪酸が、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸からなる群から選択される２種である、［１］～［３］のいずれかに記載された位置異性体及び／又は鏡像異性体の製造方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明の製造方法においては、キラルＨＰＬＣによりＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を短時間で同時に分離でき、その分離能は非常に高いことから、本発明のＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を製造する方法によると、高純度のＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を短時間で製造できる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸とグリセロールを反応させて得られるＴＡＧの異性体をＨＰＬＣで分離して作成された抽出イオンクロマトグラム

【図2】パルミチン酸、オレイン酸及びステアリン酸とグリセロールを反応させて得られるＴＡＧの異性体をＨＰＬＣで分離して作成された抽出イオンクロマトグラム

【図3】リノール酸、オレイン酸及びステアリン酸とグリセロールを反応させて得られるＴＡＧの異性体をＨＰＬＣで分離して作成された抽出イオンクロマトグラム

【図4】パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸とグリセロールを反応させて得られるＴＡＧの異性体をＨＰＬＣで分離して作成された抽出イオンクロマトグラム

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明の製造方法で製造されるＴＡＧは２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールから構成される。当該ＴＡＧを構成するグリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－３位に脂肪酸Ａがエステル結合し、ｓｎ－２位に脂肪酸Ｂがエステル結合しているＴＡＧをＡＢＡ型、当該グリセロールのｓｎ－１位及びｓｎ－２位に脂肪酸Ａがエステル結合し、ｓｎ－３位に脂肪酸Ｂがエステル結合しているＴＡＧをＡＡＢ型、当該グリセロールのｓｎ－１位に脂肪酸Ｂがエステル結合し、ｓｎ－２位及びｓｎ－３位に脂肪酸Ａがエステル結合しているＴＡＧをＢＡＡ型と表記する（以下、２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧを同様に表記する。）。ＡＡＢ型とＢＡＡ型は鏡像異性体である。これら２つのＴＡＧ（ＡＡＢ型及びＢＡＡ型）とＡＢＡ型は位置異性体である。

【0015】

本発明の製造方法で製造されるＴＡＧを構成する脂肪酸は、特定の脂肪酸に限定されない。当該脂肪酸は、食用油脂に含まれるグリセロールエステルを構成する飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸からなる群から選択される２種であり得る。飽和脂肪酸の具体例は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸等である。不飽和脂肪酸の具体例は、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等である。好ましい脂肪酸はパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸である。

【0016】

本発明の製造方法は、任意の脂肪酸Ａ、及び脂肪酸Ａとは異なる任意の脂肪酸Ｂを構成脂肪酸とする、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型ＴＡＧからなる群から選択される２種以上のＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む原材料混合物を準備する工程Ａを含む。当該混合物の調製方法は、特定の方法に限定されない。当該混合物の調製方法の１つの具体例は、（ａ）２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールのエステル化反応、（ｂ）２種の脂肪酸Ａ及びＢを含むトリグリセリドのエステル交換反応、（ｃ）脂肪酸Ａ及び／又はＢを構成脂肪酸とするモノアシルグリセロール及び／又はジアシルグリセロールと脂肪酸Ａ及び／又はＢのエステル化反応、あるいは、（ｄ）脂肪酸Ａ及び／又はＢのメチルエステル、エチルエステル等のエステルとトリグリセリドのエステル交換反応であり、当該混合物の調製方法の別の具体例は、（ｅ）上記ＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む天然の脂質の利用、（ｆ）市販されているＡＡＢ型及びＢＡＡ型ＴＡＧの混合物の利用である。

【0017】

本発明の製造方法は、上記混合物から、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに担持された固定相が充填された分離カラムを使用する高速液体クロマトグラフィーにより、上記位置異性体及び／又は鏡像異性体を分取する工程Ｂを含む。当該固定相の粒径は４μｍ以下であり、好ましい当該粒径は３．５μｍ以下であり、更に好ましい当該粒径は３μｍ以下である。当該粒径が大きすぎると、固定相が充填されるカラムの分離能が低下し、２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールから構成されるＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を分離できなくなる。

【0018】

アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の固定相が充填された分離カラムは市販されている。当該市販品の具体例は、株式会社ダイセル製CHIRALPAK IF-3である。

【0019】

分離対象となる構成脂肪酸によって分離カラムの設定温度は多少異なるが、本発明の製造方法で使用される分離カラムの好ましい設定温度は、１５～４０℃である。より好ましい設定温度は２０～３０℃、更に好ましい当該設定温度は２３～２７℃である。分離カラムの設定温度が低すぎたり高すぎたりすると、分離カラムの分離能が低下する。

【0020】

本発明の製造方法で採用されるＨＰＬＣシステムで使用される好ましい移動相は、アセトニトリルとメタノールが１０：０～５：５（体積比）の範囲の割合で構成される。アセトニトリルとメタノールの好ましい構成比は、１０：０～８：２、更に好ましい当該構成比は１０：０～９：１である。アセトニトリル及びメタノールからなる移動相のメタノールの含有割合が高すぎると、分離カラムの分離能が低下する。

【0021】

本発明の製造方法で採用されるＨＰＬＣシステムで使用される移動相の好ましい線速度は２～１２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２である。より好ましい当該線速度は４～９ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２、更に好ましい当該線速度は５～７ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２である。当該線速度が小さすぎると、分離カラムの分離能が低下する。当該線速度の上限は技術的な制約を受ける。
上記ＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体の混合物は、分離カラムの通過により、上記ＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体毎に分離される。
本発明の製造方法は、工程Ａの後に、工程Ａで準備した原料混合物から、逆相高速液体クロマトグラフィーにより、上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型ＴＡＧからなる群から選択される１種又は２種以上のＴＡＧの濃縮工程Ｃを更に備えていてもよい。つまり、工程Ａで準備した原料混合物中の上記ＴＡＧが濃縮された原料混合物が、工程Ｂに付され得る。

【0022】

好ましくは、本発明の製造方法は、工程Ｂの前に、上記分離カラムに少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程Ｄを更に含む。
１）；エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を通液する。２）；エタノールを通液した後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を通液する。
３）；イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を通液する。
４）；ＩＰＡとＴＨＦの混合液を通液する。

【0023】

上記処理１）におけるＤＭＦ、上記処理２）におけるＴＨＦ、上記処理３）におけるＩＰＡ及び上記処理４）におけるＩＰＡとＴＨＦの混合液の好ましい線速度は０．６～４.
２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２であり、より好ましい線速度は１.２～２．７ｍＬ／ｍｉｎ・ｃ
ｍ^２であり、更に好ましい線速度は１.５～２．０ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２である。

【0024】

上記処理１）におけるＤＭＦ及び上記処理２）におけるＴＨＦの好ましい通液時間は３時間～３日間、より好ましい通液時間は６時間～２日間、更に好ましい通液時間は１２時間～１．５日間である。上記処理３）におけるＩＰＡの好ましい通液時間は１２時間～６日間、より好ましい通液時間は１日間～５日間、更に好ましい通液時間は２日間～４日間である。上記処理４）におけるＩＰＡとＴＨＦの混合液の好ましい通液時間は３０分～５時間、より好ましい通液時間は１時間～４時間、更に好ましい通液時間は１．５時間～３時間である。

【0025】

上記処理４）におけるＩＰＡとＴＨＦの混合液の好ましい混合体積比は、ＩＰＡ：ＴＨＦ＝１：２０～２０：１、より好ましい混合体積比はＩＰＡ：ＴＨＦ＝１：１５～１５：１、更に好ましい混合体積比はＩＰＡ：ＴＨＦ＝１：１０～１０：１である。

【0026】

本発明の製造方法で製造されたＴＡＧの位置異性体及び／又は鏡像異性体を標準品として用い、大気圧イオン化質量分析装置により位置異性体及び／又は鏡像異性体のマスクロマトグラムを利用し、天然油脂、および、加工油脂製品等に含まれるトリアシルグリセロール異性体の定量分析ができる。

【0027】

本発明のその他の態様として、以下に示すトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離方法がある。
［１］２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールからなる、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む試料溶液を、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の分離剤が充填されたカラムを通過させる工程を含む、上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の高速液体クロマトグラフィーによる分離方法。
［２］試料溶液が、（ａ）２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールをエステル化反応、（ｂ）２種の脂肪酸Ａ及びＢを含むトリグリセリドのエステル交換反応、（ｃ）脂肪酸Ａ及び／又はＢを構成脂肪酸とするモノアシルグリセロール及び／又はジアシルグリセロールと脂肪酸Ａ及び／又はＢのエステル化反応、あるいは、（ｄ）脂肪酸Ａ及び／又はＢのメチルエステル、エチルエステル等のエステルとトリグリセリドのエステル交換反応で得られた、［１］に記載された分離方法。
［３］試料溶液が、天然の脂質から得られた、［１］に記載された分離方法。
［４］試料溶液が、ＡＡＢ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールの混合物である、［１］に記載された分離方法。
［５］試料溶液を通過させる前に、分離カラムに少なくとも以下の１）～４）のいずれか１つの処理を施す工程を更に含む、［１］～［４］のいずれかに記載された分離方法。
１）エタノールを通液した後、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを通液する；
２）エタノールを通液した後、テトラヒドロフランを通液する；
３）イソプロピルアルコールを通液する；
４）イソプロピルアルコールとテトラヒドロフランの混合液を通液する；
［６］脂肪酸が、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール酸からなる群から選択される２種である、［１］～［５］のいずれかに記載された分離方法。

【0028】

本発明のその他の態様としては、以下に示すトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の分析方法が挙げられる。
［７］２種の脂肪酸Ａ及びＢとグリセロールからなる、ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体を含む試料溶液を、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径４μｍ以下の分離剤が充填されたカラムを通過させる工程を含む、上記ＡＡＢ型、ＡＢＡ型及びＢＡＡ型トリアシルグリセロールからなる群から選択される１種又は２種以上のトリアシルグリセロールの位置異性体及び／又は鏡像異性体の高速液体クロマトグラフィーによる分析方法。
上記分析方法は、分離された上記位置異性体及び／又は鏡像異性体を検出する工程を含み得る。上記検出工程における検出法として使用され得るものは質量分析法である。

【0029】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されない。
実施例１
ＴＡＧの合成
グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びリノール酸（Ｌ）１モル等量を混合し、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）３モル等量、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）３モル等量、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン３モル等量を触媒とし、クロロホルム中で１２時間反応させ、ＴＡＧ混合物を得た。

【0030】

ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離
上記ＴＡＧ混合物をアセトニトリルで希釈（濃度１００μｇ／ｍＬ）し、ＴＡＧ試料を得た。当該ＴＡＧ試料１０μＬをキラルカラムを付したＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社製Alliance e2695）に注入し、ＴＡＧ位置異性体及び鏡像異性体を分離、検出した。上記ＨＰＬＣシステムの設定条件は以下のとおりであった。
カラム：株式会社ダイセル製CHIRALPAK IF-3（４．６×２５０ｍｍ、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径３μｍの分離剤が充填されている）
カラム温度：２５℃
流量：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトニトリル（和光純薬工業株式会社製ＬＣ／ＭＳ用）

【0031】

エレクトロスプレーイオン化－マススペクトロメトリー（ＥＳＩ－ＭＳ）法によるＴＡＧ異性体の検出
上記ＨＰＬＣシステムから流出する流量の半分をドレインに廃棄し、残りの流量（０．５ｍＬ／ｍｉｎ）に、１００ｍＭのギ酸アンモニウムメタノール溶液を０．１ｍＬ／ｍｉｎの流量で合流させ、上記ＴＡＧ位置異性体及び鏡像異性体をポジティブモードでイオン化し、ＥＳＩ－ＭＳシステム（ウォーターズ社製Quattro micro API）でピークを検出した。上記ＥＳＩ－ＭＳシステムの設定条件は以下のとおりであった。
ソースブロック温度：１２０℃
脱溶媒温度：４５０℃
脱溶媒ガス：窒素（ガス流量：８００Ｌ／ｈ）
キャピラリー電圧：３ｋＶ
コーン電圧：４０Ｖ
検出モード：Ｆｕｌｌ Ｓｃａｎ ｍ／ｚ ２００－１２００

【0032】

結果を図１に示す。トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）から、２つのリノール酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＬＰＬ、ＬＬＰ及びＰＬＬ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、３つのピーク成分が観察された（図１ａ）。ＴＩＣから、１つのリノール酸及び２つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＬＰＰ、ＰＰＬ及びＰＬＰ；図１ｂ）、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＯＰＯ、ＯＯＰ及びＰＯＯ；図１ｃ）、１つのオレイン酸及び２つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＯＰＰ、ＰＰＯ及びＰＯＰ；図１ｄ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察された。したがって、上記１２種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記１２種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。

【0033】

実施例２
グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びリノール酸（Ｌ）１モル等量を混合する代わりに、グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びステアリン酸（Ｓ）１モル等量を混合した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図２に示す。
Ｐ、Ｏ及びＳが１分子ずつグリセロール１分子にエステル結合しているＴＡＧの位置異性体、鏡像異性体（Ｐ＋Ｏ＋Ｓ）は、上記ＨＰＬＣシステムで十分に分離されなかった（図２ａ）。いっぽう、ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのステアリン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＯＳＯ、ＯＯＳ及びＳＯＯ；図２ｂ）、１つのオレイン酸及び２つのステアリン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＳＳＯ、ＯＳＳ及びＳＯＳ；図２ｃ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記６種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記６種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。

【0034】

実施例３
グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びリノール酸（Ｌ）１モル等量を混合する代わりに、グリセロール１モル等量に対して、リノール酸（Ｌ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びステアリン酸（Ｓ）１モル等量を混合した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図３に示す。ＴＩＣから、２分子のオレイン酸及び１分子のステアリン酸がグリセロール１分子にエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＯＳＯ、ＯＯＳ及びＳＯＯ；図３ａ）、２分子のリノール酸及び１分子のステアリン酸がグリセロール１分子にエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＬＳＳ、ＳＳＬ及びＳＬＳ；図３ａ）、２分子のリノール酸及び１分子のステアリン酸がグリセロール１分子にエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（ＬＳＬ、ＬＬＳ及びＳＬＬ；図３ｂ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記９種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記９種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。

【0035】

実施例４
実施例１同様に、グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）１モル等量、オレイン酸（Ｏ）１モル等量及びリノール酸（Ｌ）１モル等量を混合し、ＴＡＧ混合物を得た。ＨＰＬＣ条件は、以下の通りとした。
カラム：株式会社ダイセル製CHIRALPAK IF-3（２．０×２５０ｍｍ、アミロース トリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）がシリカゲルに結合した、粒径３μｍの分離剤が充填されている）
カラム温度：２５℃
流量：０．２ ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトニトリル（和光純薬工業株式会社製ＬＣ／ＭＳ用）
結果を図４ａに示す。２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２６．４０のピークはＯＰＯ、２７．４８のピークはＯＯＰ、２８．６８のピークはＰＯＯ；図４ａ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。

【0036】

実施例５
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離の前に上記カラムにエタノールを線速度で２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２で３時間通液し、次いで、ＤＭＦを線速度２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２で１日間通液して前処理した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図４ｂに示す。ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２５．３７のピークはＯＰＯ、２６．１８のピークはＯＯＰ、２７．４４のピークはＰＯＯ；図４ｂ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が上記ＨＰＬＣシステムによって分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。

【0037】

実施例６
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離の前に上記カラムにエタノールを線速度で２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２で３時間通液し、次いで、ＴＨＦを線速度２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２で１日間通液して前処理した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図４ｃに示す。ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２９．４５のピークはＯＰＯ、３０．２３のピークはＯＯＰ、３１．６８のピークはＰＯＯ；図４ｃ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が、実施例４における有機溶媒により前処理されなかったカラムが使用される上記ＨＰＬＣシステムよりもより明確に分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。さらに、カラムにエタノールを通液した後、ＴＨＦを通液する前処理が、カラムの分離能の向上に寄与することがわかった。

【0038】

実施例７
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離の前に上記カラムにＩＰＡを線速度２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２で１日間通液して前処理した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図４ｄに示す。ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２９．６１のピークはＯＰＯ、３０．７０のピークはＯＯＰ、３２．２２のピークはＰＯＯ；図４ｄ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が、実施例４における有機溶媒により前処理されなかったカラムが使用される上記ＨＰＬＣシステムよりもより明確に分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。さらに、カラムにＩＰＡを通液する前処理が、カラムの分離能の向上に寄与することがわかった。

【0039】

実施例８
ＨＰＬＣによるＴＡＧ異性体の分離の前に上記カラムにＩＰＡとＴＨＦの混合液（混合体積比ＩＰＡ：ＴＨＦ＝９：１）を線速度２ｍＬ／ｍｉｎ・ｃｍ^２で２時間通液して前処理した以外、実施例１と同様の操作が行われた。結果を図４ｅに示す。ＴＩＣから、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸がグリセロールにエステル結合しているＴＡＧの位置異性体及び鏡像異性体（２９．９６のピークはＯＰＯ、３１．１４のピークはＯＯＰ、３２．６９のピークはＰＯＯ；図４ｅ）に相当する抽出イオンクロマトグラムを作成すると、それぞれ、３つのピーク成分が観察され、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体を含むＴＡＧ混合物から、上記３種類の位置異性体及び鏡像異性体が、実施例４における有機溶媒により前処理されなかったカラムが使用される上記ＨＰＬＣシステムよりも更に明確に分離され、上記ＥＳＩ－ＭＳシステムによって検出されたことが確認された。さらに、カラムにＩＰＡとＴＨＦの混合液（混合体積比９：１）を通液する前処理が、カラムの分離能の向上に寄与することがわかった。

【0040】

実施例９
ＴＡＧ混合物の合成
グリセロール１モル等量に対して、パルミチン酸（Ｐ）２モル等量及びオレイン酸（Ｏ）１モル等量を混合し、ＥＤＣ３モル等量、ＤＭＡＰ３モル等量、Ｎ－エチルジイソプロピルアミン３モル等量を触媒とし、ジクロロメタン中で１２時間反応させ、ＴＡＧ混合物を得た。当該ＴＡＧ混合物を、ヘキサンと酢酸エチルの混合液（混合体積比９５：５）を溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画し、トリパルミチン、ジパルミトイルオレオイルグリセロール、ジオレオイルパルミトイルグリセロール及びトリオレインを含むＴＡＧ混合物６６０ｍｇを得た。

【0041】

ＨＰＬＣによるジパルミトイルオレオイルグリセロール画分の分画
上記ＴＡＧ混合物６６０ｍｇを１３ｍＬのアセトンに溶解してＴＡＧ試料を作製し、当該ＴＡＧ試料を３回に分けて分取ＨＰＬＣシステムに注入し、ＰＯＰ、ＰＰＯ及びＯＰＰを含むジパルミトイルオレオイルグリセロール画分２００ｍｇを分画した。上記ＨＰＬＣシステムの設定条件は以下のとおりであった。
カラム：ジーエルサイエンス株式会社製Inertsil ODS-3（５０×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
移動相の流量：１２０ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトン／アセトニトリル（５０／５０、ｖ／ｖ）
検出器：ＵＶ２０５ｎｍ

【0042】

ＨＰＬＣによるジパルトイルオレオイルグリセロール異性体の分離
上記ジパルトイルオレオイルグリセロール画分をアセトン／アセトニトリル（５０／５０）で希釈（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）し、ジパルミトイルオレオイルグリセロール試料を得た。当該ジパルミチルオレイルグリセロール試料２０μＬをＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社製Alliance e2695）に注入し、ＰＯＰ、ＰＰＯ及びＯＰＰを分離した。上記ＨＰＬＣシステムの設定条件は以下のとおりであった。
カラム：株式会社ダイセル製CHIRALPAK IF-3（４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：２５℃
移動相の流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：アセトニトリル（和光純薬工業株式会社製ＬＣ／ＭＳ用）
検出器：ＵＶ２０５ｎｍ

【0043】

上記ＨＰＬＣによるジパルミチルオレイルグリセロール異性体の分離操作を１００回繰り返し、ＰＯＰ、ＰＰＯ及びＯＰＰを、それぞれ４ｍｇずつ得た。

【産業上の利用可能性】

【0044】

本発明の製造方法における、２種の脂肪酸とグリセロールから構成されるＴＡＧ異性体の位置異性体及び／又は鏡像異性体の分離能は高い。当該分離能の向上により、食用油脂に含まれる当該ＴＡＧ異性体の定性及び定量分析の精度も向上し、食用油脂の物理的性質及び栄養学的性質に関する研究の進展が期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】