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特許7263538皮膚での活性型ＰＡＲ－２を指標とした皮膚状態評価方法、ＰＡＲ－２活性化促進剤又は抑制剤のスクリーニング方法及びＰＡＲ－２活性化抑制剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-14
(45)【発行日】2023-04-24
(54)【発明の名称】皮膚での活性型ＰＡＲ－２を指標とした皮膚状態評価方法、ＰＡＲ－２活性化促進剤又は抑制剤のスクリーニング方法及びＰＡＲ－２活性化抑制剤
(51)【国際特許分類】
G01N 33/50 20060101AFI20230417BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230417BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230417BHJP
A61K 8/42 20060101ALI20230417BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20230417BHJP
A61K 31/16 20060101ALI20230417BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230417BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230417BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230417BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230417BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230417BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230417BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20230417BHJP
【ＦＩ】
G01N33/50 Q ZNA
G01N33/53 D
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
A61K8/42
A61Q19/00
A61K31/16
A61P17/00
A61P29/00
A61P37/08
A61P17/06
A61P43/00 111
C07K16/28
C07K14/705
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021554044
(86)(22)【出願日】2019-11-01
(86)【国際出願番号】 JP2019043162
(87)【国際公開番号】W WO2021084760
(87)【国際公開日】2021-05-06
【審査請求日】2022-09-01
(73)【特許権者】
【識別番号】000001959
【氏名又は名称】株式会社 資生堂
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100166165
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 英直
(72)【発明者】
【氏名】傳田 澄美子
(72)【発明者】
【氏名】傳田 光洋
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－１７０３２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０９－２２７３６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】安東嗣修，痒みにおける表皮ケラチノサイトの重要性，薬学雑誌，2006年，Vol.126,No.6，PP.403-408
【文献】川端篤史，プロテアーゼ受容体ＰＡＲ-２（protease-activated receptor-2）の生理機能，日本薬理学雑誌，2003年，Vol.121，PP.411-420
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
Ａ６１Ｋ ３１／１６
Ａ６１Ｐ １７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、皮膚試料における表皮の活性型ＰＡＲ－２を検出することを含む、表皮状態の評価方法。【請求項2】
前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、請求項１に記載の評価方法。【請求項3】
前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の２６～３６位のＮ末端アミノ酸を含む、請求項２に記載の評価方法。【請求項4】
前記活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如する、請求項１～３のいずれか一項に記載の評価方法。【請求項5】
前記活性型ＰＡＲ－２の検出量が高い場合に、表皮が荒れ状態であると評価する、請求項１～４のいずれか一項に記載の評価方法。【請求項6】
表皮の荒れ状態とは、炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥からなる群から選ばれる少なくとも１の表皮状態を決定する、請求項５に記載の評価方法。【請求項7】
活性型ＰＡＲ－２の検出が、以下の：前記皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、
標識付きの二次抗体を皮膚試料と接触させる工程、及び
皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の評価方法。
【請求項8】
皮膚試料において候補物質を適用する工程、候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
活性型ＰＡＲ－２の検出強度を低下させる候補物質をＰＡＲ－２活性化抑制剤と決定する工程
を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項9】
皮膚試料において、スクラッチ処理を行う工程をさらに含み、スクラッチ処理がされた皮膚試料に候補物質が適用される、請求項８に記載のスクリーニング方法。【請求項10】
前記ＰＡＲ－２活性化抑制剤が、表皮状態改善剤である、請求項８又は９に記載のスクリーニング方法。【請求項11】
皮膚試料において候補物質を適用する工程、候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
活性型ＰＡＲ－２の検出強度を増加させる候補物質をＰＡＲ－２活性化促進剤と決定する工程
を含む、ＰＡＲ－２活性化促進剤のスクリーニング方法。
【請求項12】
前記ＰＡＲ－２活性化促進剤が、表皮状態悪化物質である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。【請求項13】
活性型ＰＡＲ－２を検出する工程が、皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、及び
標識付き二次抗体を接触させ、標識を検出する工程、
を含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項14】
前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、請求項８～１３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。【請求項15】
前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の２６～３６位のＮ末端アミノ酸を有する、請求項１４に記載のスクリーニング方法。【請求項16】
前記活性型されたＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如している、請求項８～１５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。【請求項17】
以下の：【化1】
【化2】
で表される化合物、又はその塩を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤。
【請求項18】
Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩を含む、請求項１７に記載のＰＡＲ－２活性化抑制剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚での活性型ＰＡＲ－２を指標とした皮膚状態評価方法、並びにＰＡＲ－２活性を指標としたＰＡＲ－２活性化剤又は抑制剤のスクリーニング方法に関する。さらに、本発明に係るスクリーニング方法により選択されたＰＡＲ－２活性化抑制剤にも関する。
【背景技術】
【0002】
プロテアーゼ受容体（ＰＡＲ：Protease Activated Receptor）は、特定のプロテアーゼにより活性化されるＧタンパク共役７回膜貫通型受容体の一種である。現在までに４つのＰＡＲファミリー（ＰＡＲ－１～４）が同定されている。ＰＡＲ－１、３及び４は、トロンビン受容体である一方で、ＰＡＲ－２はトロンビンでは活性化されない。ＰＡＲ－２は、トリプシン、トリプターゼ、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子などにより活性化されることが知られている。ＰＡＲ－２は、ＰＡＲ－２のＮ末端の部分ペプチドがこれらのプロテアーゼにより切断され、新たなＮ末端が生成し、この新たなＮ末端を含むペプチドがリガンドとして作用することにより活性化される。また、切断により生じる新たなＮ末端のペプチドの配列に基づく合成ペプチドが、ＰＡＲ－２を活性化できることが報告されている。ＰＡＲ－２は、内皮性の組織に広く分布し、特に消化器、循環器、呼吸器、神経、皮膚などで高度に発現していることが知られている。
【0003】
表皮ケラチノサイトのＰＡＲ－２（Protease Activated Receptor-2）は、アトピーや乾癬の病態、皮膚バリアの恒常性・痒み・炎症に関与している。ＰＡＲ－２はプロテアーゼにより切断され活性化すると、Ｇタンパク質を介してイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を産生し、細胞内カルシウムを上昇させ、ＮＦ－κＢ（Nuclear Factor-kappa B）などの転写因子を動員させ、ＴＳＬＰ（Thymic Stromal Lymphopoietin）など炎症性サイトカインの産生を増加させる。表皮の顆粒層における細胞外カルシウムの上昇は、ラメラ顆粒の放出を抑制し、バリア回復を遅らせる。ＴＳＬＰなどの炎症性サイトカインは皮膚内の感覚神経を刺激し、痒みを起こすと考えられている。
【0004】
このように生理的に重要な役割を担うＰＡＲ－２に関し、特定の化合物についてＰＡＲ－２抑制作用を評価する方法や、スクリーニング方法が開発されている（特許文献１：特許第４７２８２４８号、特許文献２：特表２０１２－５１９７３５号、特許文献３：特開２００４－１７０３２３号）。これまでのＰＡＲ－２抑制剤のスクリーニング法は、ＰＡＲ－２を発現する培養細胞を用いて、ＰＡＲ－２活性化以降に起こる細胞内の反応、例えばカルシウム濃度変化やサイトカインの放出量などを測定し、指標とするものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特許第４７２８２４８号公報
【文献】特表２０１２－５１９７３５号公報
【文献】特開２００４－１７０３２３号公報
【文献】特開平９－２２７３６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従来行われているＰＡＲ－２活性化以降に起こる細胞内の反応を指標としたＰＡＲ－２抑制作用の評価方法やスクリーニング方法は、ＰＡＲ－２活性化を間接的に評価することに基づいている。これらの評価方法は、ＰＡＲ－２活性化を直接測定しているわけではないことから、試験物質の他の生理作用に基づく反応をＰＡＲ－２への作用と誤認する可能性がある。また、従来の方法では培養細胞においてスクリーニングがされることから、実際の組織、例えば皮膚で生じているＰＡＲ－２活性化を反映した結果が得られないという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
そこで、本発明者らが、鋭意研究を行ったところ、ＰＡＲ－２タンパク質のＮ末端の切断を検知する抗体を用いることで、ＰＡＲ－２の切断状態に基づいてＰＡＲ－２活性化の評価が可能になることを見出した。抗体を用いることにより、表皮においてＰＡＲ－２活性化が生じる部位を明らかにすることができ、かかる部位に着目することで、ＰＡＲ－２活性化抑制剤又はＰＡＲ－２活性化促進剤をスクリーニングする方法を発明するに至った。さらに当該スクリーニング方法を用いることで、新たなＰＡＲ－２活性化抑制剤を見出した。そこで本発明は、以下のものに関する：
【0008】
［１］ 活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、皮膚試料における表皮の活性型ＰＡＲ－２を検出することを含む、表皮状態の評価方法。
［２］ 前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、項目１に記載の評価方法。
［３］ 前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の第２６位～第３６位のＮ末端アミノ酸を含む、項目２に記載の評価方法。
［４］ 前記活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも第３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如する、項目１～３のいずれか一項に記載の評価方法。
［５］ 前記活性型ＰＡＲ－２の検出量が高い場合に、表皮が荒れ状態であると評価する、項目１～４のいずれか一項に記載の評価方法。
［６］ 表皮の荒れ状態であると評価するとは、炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥からなる群から選ばれる少なくとも１の表皮状態を決定することである、項目５に記載の評価方法。
［７］ 活性型ＰＡＲ－２の検出が、以下の：
前記皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、
標識付きの二次抗体を皮膚試料と接触させる工程、及び
皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程
を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の評価方法。
［８］ 皮膚試料において候補物質を適用する工程、
候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
活性型ＰＡＲ－２の検出強度を低下させる候補物質をＰＡＲ－２活性化抑制剤と決定する工程
を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニング方法。
［９］ 皮膚試料において、スクラッチ処理を行う工程をさらに含み、スクラッチ処理がされた皮膚試料に候補物質が適用される、項目８に記載のスクリーニング方法。
［１０］ 前記ＰＡＲ－２活性化抑制剤が、表皮状態改善剤である、項目８又は９に記載のスクリーニング方法。
［１１］ 皮膚試料において候補物質を適用する工程、
候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
活性型ＰＡＲ－２の検出強度を増加させる候補物質をＰＡＲ－２活性化促進剤と決定する工程
を含む、ＰＡＲ－２活性化促進剤のスクリーニング方法。
［１２］ 前記ＰＡＲ－２活性化促進剤が、表皮状態悪化物質である、項目１１に記載のスクリーニング方法。
［１３］ 活性型ＰＡＲ－２を検出する工程が、
皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、及び
標識付き二次抗体を接触させ、標識を検出する工程、
を含む、項目８～１２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１４］ 前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、項目８～１３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１５］ 前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の２６～３６位のＮ末端アミノ酸を有する、項目１４に記載のスクリーニング方法。
［１６］ 前記活性型されたＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如している、項目８～１５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１７］ 以下の：
｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
（但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
で表される化合物、又はその塩を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤。
［１８］ ＰＡＲ－２活性化の抑制を必要とする対象に、以下の：
｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
（但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
で表される化合物、又はその塩を投与することを含む、炎症性皮膚疾患、皮膚の炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥の治療方法又は美容方法。
［１９］ ＰＡＲ－２活性化抑制を介して、炎症性皮膚疾患、皮膚の炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥の治療において使用するための、以下の：
｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
（但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
で表される化合物、又はその塩。
［２０］ ＰＡＲ－２活性化抑制剤の製造のための、以下の：
｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
（但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
で表される化合物、又はその塩の使用。
［２１］ Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩を含む、項目１７に記載のＰＡＲ－２活性化抑制剤、項目１８に記載の方法、項目１９に記載の化合物又はその塩、又は項目２０に記載の使用。
［２］ 前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、項目１に記載の評価方法。
［３］ 前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の第２６位～第３６位のＮ末端アミノ酸を含む、項目２に記載の評価方法。
［４］ 前記活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも第３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如する、項目１～３のいずれか一項に記載の評価方法。
［５］ 前記活性型ＰＡＲ－２の検出量が高い場合に、表皮が荒れ状態であると評価する、項目１～４のいずれか一項に記載の評価方法。
［６］ 表皮の荒れ状態であると評価するとは、炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥からなる群から選ばれる少なくとも１の表皮状態を決定することである、項目５に記載の評価方法。
［７］ 活性型ＰＡＲ－２の検出が、以下の：
前記皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、
標識付きの二次抗体を皮膚試料と接触させる工程、及び
皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程
を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の評価方法。
［８］ 皮膚試料において候補物質を適用する工程、
候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
活性型ＰＡＲ－２の検出強度を低下させる候補物質をＰＡＲ－２活性化抑制剤と決定する工程
を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニング方法。
［９］ 皮膚試料において、スクラッチ処理を行う工程をさらに含み、スクラッチ処理がされた皮膚試料に候補物質が適用される、項目８に記載のスクリーニング方法。
［１０］ 前記ＰＡＲ－２活性化抑制剤が、表皮状態改善剤である、項目８又は９に記載のスクリーニング方法。
［１１］ 皮膚試料において候補物質を適用する工程、
候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
活性型ＰＡＲ－２の検出強度を増加させる候補物質をＰＡＲ－２活性化促進剤と決定する工程
を含む、ＰＡＲ－２活性化促進剤のスクリーニング方法。
［１２］ 前記ＰＡＲ－２活性化促進剤が、表皮状態悪化物質である、項目１１に記載のスクリーニング方法。
［１３］ 活性型ＰＡＲ－２を検出する工程が、
皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、及び
標識付き二次抗体を接触させ、標識を検出する工程、
を含む、項目８～１２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１４］ 前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体が、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない、項目８～１３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１５］ 前記非活性型ＰＡＲ－２が、配列番号１の２６～３６位のＮ末端アミノ酸を有する、項目１４に記載のスクリーニング方法。
［１６］ 前記活性型されたＰＡＲ－２が、配列番号１の少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸を欠如している、項目８～１５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
［１７］ 以下の：
【化1】
【化2】
で表される化合物、又はその塩を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤。
［１８］ ＰＡＲ－２活性化の抑制を必要とする対象に、以下の：
【化3】
【化4】
で表される化合物、又はその塩を投与することを含む、炎症性皮膚疾患、皮膚の炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥の治療方法又は美容方法。
［１９］ ＰＡＲ－２活性化抑制を介して、炎症性皮膚疾患、皮膚の炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥の治療において使用するための、以下の：
【化5】
【化6】
で表される化合物、又はその塩。
［２０］ ＰＡＲ－２活性化抑制剤の製造のための、以下の：
【化7】
【化8】
で表される化合物、又はその塩の使用。
［２１］ Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩を含む、項目１７に記載のＰＡＲ－２活性化抑制剤、項目１８に記載の方法、項目１９に記載の化合物又はその塩、又は項目２０に記載の使用。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、活性型ＰＡＲ－２の検出強度を指標とすることで、実際の皮膚において生じるＰＡＲ－２活性化に即してＰＡＲ－２活性化を検出することができ、より正確に表皮状態の評価が可能となり、またスクリーニング方法において、皮膚において作用するＰＡＲ－２活性化抑制剤及び／又はＰＡＲ－２活性化促進剤の選択が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図5】図５は、皮膚試料を、水（Water)、ダイズトリプシン阻害剤（SBTI）、５０μＭトリプシン及びダイズトリプシン阻害剤(Try 50μM+SBTI)、１０μＭトリプシン(Try 10μM)、１００μＭトリプシン(Try 100μM)で処理した後に、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて蛍光染色を行い、蛍光顕微鏡で撮影された写真から蛍光強度を数値化したグラフ示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の１の態様は、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いた表皮状態の評価方法に関する。本発明により評価される表皮状態として、ＰＡＲ－２の活性化により引き起こされる表皮状態である表皮の荒れの状態を評価することができる。表皮の荒れ状態としては、さらに具体的に炎症状態、肌荒れ、バリア機能低下、かゆみ、赤み、乾燥などが挙げられる。本発明に係る評価方法は、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、皮膚試料における表皮の活性型ＰＡＲ－２を検出することを含む。
【0012】
ＰＡＲ－２とは、プロテアーゼ受容体２（Protease activated receptor-2）を指す。ＰＡＲ－２のアミノ酸配列は、ヒトでは例えば配列番号１により表され（図７Ａ）、マウスについては配列番号２で表される（図７Ｂ）。図中、活性化ＰＡＲ－２において切断して生じる新たなＮ末端を含むペプチド（ヒト：SLIGKV、マウス：SLIGRL）に下線を付して示す。ＰＡＲ－２の由来生物は任意の生物であってよいが、哺乳動物、例えばヒトが好ましい。ＰＡＲ－２は、上記のアミノ酸配列を有するものだけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含されうる。
【0013】
活性型ＰＡＲ－２とは、ＰＡＲ－２の細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断されたＰＡＲ－２を指す。一方、ＰＡＲ－２の細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていないＰＡＲ－２を非活性型ＰＡＲ－２と呼ぶ。ヒトの場合、ＰＡＲ－２の細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位は、配列番号１の第３６位と第３７位との間であり、少なくとも３６位までのＮ末端のアミノ酸が切断されることで配列番号１の３７位のＳ（セリン）が新たなＮ末端として露出する。新たなＮ末端を含むペプチド（図７Ａ及びＢ、下線部）が細胞外第２ループに結合することで、細胞内シグナルが誘起される。ＰＡＲ－２のＮ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位は、トリプシン、トリプターゼなどの酵素により切断されることが知られているが、これらに限定されることを意図しない。活性型ＰＡＲ－２と、非活性型ＰＡＲ－２は、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断されている点を除き同一であることから、活性型ＰＡＲ－２を抗体で検出を行う場合、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端を識別できる抗体を使用する必要がある。活性型ＰＡＲ－２のＮ末端を識別できる抗体は、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端の抗原ペプチドに結合することができる。このような抗原ペプチドは、ヒトの場合ＳＬＩＧＫＶ（配列番号３）を含むペプチドを意味し、好ましくはＮ末端部分がＳＬＩＧＫＶであるペプチドである。マウスの場合、ＳＬＩＧＲＬ（配列番号４）を含むペプチドを意味し、好ましくはＮ末端部分がＳＬＩＧＲＬであるペプチドである。
【0014】
本発明において用いられる抗活性型ＰＡＲ－２抗体は、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位で切断された活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、細胞外Ｎ末領域に存在するプロテアーゼ切断部位が切断されていない非活性型ＰＡＲ－２には結合しない抗体を指す。このような抗体は、ＳＬＩＧＫＶを含む抗原ペプチドを用いて、定法に従い製造することができる。ＳＬＩＧＫＶを含む抗原ペプチドとしては、一例として配列番号１の配列のうち、ＳＬＩＧＫＶから始まる１０～２０残基のペプチドを使用することができる。抗活性型ＰＡＲ－２抗体の一例として、Santa Cruz社から販売される、ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（sc-8206)が挙げられる。また、非活性型ＰＡＲ－２を検出する目的で、抗非活性型ＰＡＲ－２抗体を使用することができる。抗非活性型ＰＡＲ－２抗体は、非活性型ＰＡＲ－２のＮ末領域、例えば配列番号１の第２６位～第３６位のペプチドを抗原として生成することができる。また、活性型ＰＡＲ－２と非活性型ＰＡＲ－２とを識別せずに検出する目的で、抗ＰＡＲ－２抗体を使用することができる。抗ＰＡＲ－２抗体としては、細胞外Ｎ末領域以外の領域を抗原ペプチドとして用いることで生成することができる。抗ＰＡＲ－２抗体の一例として、Santa Cruz社から販売される、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（sc-5597)が挙げられる。
【0015】
本発明において抗体は、最も広い意味で使用するものとし、所望の特異的結合性が示される限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びその改変抗体も含まれるものとする。本発明における抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、任意の動物由来の抗体であってもよい。改変抗体としては、例えば抗体の一部分を含む蛋白質であり、抗原に結合できる抗体のフラグメントが挙げられる。抗体のフラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、またはｓｃＦｖが挙げられる。
【0016】
皮膚試料における表皮の活性型ＰＡＲ－２の検出は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて検出されうる。より具体的には、抗活性型ＰＡＲ－２抗体を用いて、免疫学的検出を行うことにより、皮膚試料中で活性型ＰＡＲ－２の存在場所を検出することができる。免疫学的検出は、定法に基づいて行うことができる。免疫学的検出として、免疫組織染色や免疫ブロッティングなどが挙げられるが、組織上での活性型ＰＡＲ－２の存在部位を検出する観点から、免疫組織化学染色が好ましい。免疫組織染色としては、蛍光標識又は色素標識を用いた手法を用いることができる。免疫組織染色を行うにあたり、例えば抗体に直接標識を付して検出する直接法、抗体を認識する二次抗体に標識を付して検出する間接法、複合体形成物質、例えばビオチン－アビジンを利用した増幅法を利用することができる。増幅法では、一例として抗体をビオチン化し、標識化されたアビジンやストレプトアビジンを用いることで検出が可能になる。
【0017】
本発明において活性型ＰＡＲ－２の検出は、皮膚試料に対して行われうる。皮膚試料としては、皮膚から採取した皮膚試料又は３次元皮膚モデルにより取得された皮膚試料であってもよい。表皮細胞は基底層で増殖し、有棘層、顆粒層を経て角層へと分化し、最終的に皮膚表面から脱落する。角層への分化過程で脱核し、死んだ細胞となる。活性型ＰＡＲ－２は、表皮のうち生きている表皮細胞が存在している最外層、すなわち顆粒層～角層にかけて、より好ましくは顆粒層の外層において発現している。顆粒層は、外部から内部に向けてＳＧ１～ＳＧ３という三層に分類することができる。顆粒層のＳＧ２層においてタイトジャンクションが形成しているとされている。活性型ＰＡＲ－２の発現パターンは、タイトジャンクションを構成するＺＯ－１の発現パターンとも一致する。したがって、免疫組織染色において、皮膚で活性型ＰＡＲ－２の検出にあたり、場所を特定する観点から、ＺＯ－１などの場所を確定できるタンパク質などとの共染色や、脱核を判別する核染色と共染色を行うことが好ましい。これにより皮膚試料における部位、例えば表皮、さらにより具体的に表皮の顆粒層～角層、特に顆粒層の外層を特定して、活性型ＰＡＲ－２の検出が可能になる。
【0018】
本発明の表皮状態の評価方法は、活性型ＰＡＲ－２の存在量に応じて、表皮状態を評価することができる。より具体的に、活性型ＰＡＲ－２の存在量が高いほど、表皮状態が悪いと評価することができる。より好ましくは、表皮の顆粒層～角層の領域において、活性型ＰＡＲ－２の存在量が多い場合に、表皮状態が悪いと評価することができる。表皮の顆粒層～角層の領域における活性型ＰＡＲ－２の存在量を測定するために、顆粒層～角層の領域の活性型ＰＡＲ－２の染色量を、画像処理ソフト（例えばニコン社製 NIS-elements、フリーソフトImageJ）などにより決定することができる。評価には、適宜設定された閾値と比較することで、表皮状態を決定することができる。さらに別の態様では、活性型ＰＡＲ－２と非活性型ＰＡＲ－２との存在比又は活性型ＰＡＲ－２の存在割合により表皮状態を評価してもよい。活性型ＰＡＲ－２と非活性型ＰＡＲ－２との存在比は、例えば、活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、非活性型ＰＡＲ－２には結合しない抗体と、活性型ＰＡＲ－２に結合しない一方で、非活性型ＰＡＲ－２には結合する抗体とを用いて、存在比を決定してもよい。活性型ＰＡＲ－２の存在割合は、例えば活性型ＰＡＲ－２に結合する一方で、非活性型ＰＡＲ－２には結合しない抗体と、活性型ＰＡＲ－２と非活性型ＰＡＲ－２の両方に結合可能な抗体とを用いて、決定することができる。
【0019】
本発明のさらなる態様は、ＰＡＲ－２活性化抑制剤又はＰＡＲ－２活性化促進剤のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、具体的に以下の工程：
皮膚試料において候補物質を適用する工程、
候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
活性型ＰＡＲ－２の検出強度を低下させる候補物質をＰＡＲ－２活性化抑制剤と決定し、又は活性型ＰＡＲ－２の検出強度を増加させる候補物質をＰＡＲ－２活性化促進剤と決定する工程
を含む。候補物質は、任意のものが挙げられるが、例えば医薬品又は化粧料探索用の化合物ライブラリーや、動植物の抽出物ライブラリーを使用することができる。さらには、化粧品素材ライブラリーなどを選択することができる。候補物質を適用されていない点でのみ異なる皮膚試料における活性型ＰＡＲ－２を検出し、対照として用いることができる。対照については、同時並行で実験されていてもよいし、予め実験されていてもよい。
皮膚試料において候補物質を適用する工程、
候補物質が適用された皮膚試料において、活性型ＰＡＲ－２のＮ末端抗原ペプチドに結合する抗活性型ＰＡＲ－２抗体により、活性型ＰＡＲ－２を検出する工程、及び
活性型ＰＡＲ－２の検出強度を低下させる候補物質をＰＡＲ－２活性化抑制剤と決定し、又は活性型ＰＡＲ－２の検出強度を増加させる候補物質をＰＡＲ－２活性化促進剤と決定する工程
を含む。候補物質は、任意のものが挙げられるが、例えば医薬品又は化粧料探索用の化合物ライブラリーや、動植物の抽出物ライブラリーを使用することができる。さらには、化粧品素材ライブラリーなどを選択することができる。候補物質を適用されていない点でのみ異なる皮膚試料における活性型ＰＡＲ－２を検出し、対照として用いることができる。対照については、同時並行で実験されていてもよいし、予め実験されていてもよい。
【0020】
本発明のスクリーニング方法において、皮膚試料にスクラッチ処理を行う工程を含んでもよい。スクラッチ処理とは、指の爪で皮膚をひっかくことを模す処理であり、スパチュラなどを皮膚試料に接触させて、１～複数回、例えば５０回往復させることにより行われうる。スクラッチ処理を行うことにより、皮膚試料の表皮に目に見えない損傷を与えることができる。スクラッチ処理を行うと、ＰＡＲ－２活性化が起こることが見いだされている。したがって、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニング方法において、スクラッチ処理を行うことで、皮膚試料におけるＰＡＲ－２を活性化することができ、ＰＡＲ－２活性化抑制剤のスクリーニングに有用である。また、スクラッチ処理を行った後にＰＡＲ－２活性化抑制剤としてスクリーニングされた候補物質は、スクラッチ処理直後のＰＡＲ－２活性化を抑制することができる物質であり、掻傷時において即効性のあるＰＡＲ－２活性化抑制剤として使用することができる。このようなＰＡＲ－２活性化抑制剤は、掻傷時において適用するバリア回復機能促進剤、炎症抑制剤、痒み抑制剤として使用しうる。
【0021】
本発明の評価方法及びスクリーニング方法の両方において、活性型ＰＡＲ－２の検出は、より具体的に、下記の工程：
皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、
標識付きの二次抗体を皮膚試料と接触させる工程、及び
皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程
を行うことにより行われうる。皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程において、皮膚試料は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体と一例として１～２０時間、室温又は冷却下で接触されうる。この接触工程の前に、予め皮膚試料を固定する工程が行われてもよい。皮膚試料の固定は、任意の手法で行われてよいが、一例としてエタノール又はパラホルムアルデヒド含有溶液中で皮膚試料を１６～２４時間、室温又は冷却下でインキュベートすることにより実施できる固定されうる。二次抗体は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体に結合する抗体であり、一次抗体である抗活性型ＰＡＲ－２抗体の由来生物に応じて選択することができる。標識は任意の標識であってよいが、一例として蛍光標識が用いられうる。蛍光標識を用いる場合、二次抗体との接触工程は暗所で行われ、一例として１時間、室温で接触されうる。接触は一例として各抗体を含む溶液中でインキュベートすることで行われる。皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程は、標識に応じて適宜機器を選択して検出強度を決定することができる。蛍光標識を用いた場合には、蛍光顕微鏡を利用することができ、蛍光標識に合わせた励起光及びフィルターを用いて蛍光を検出することができる。一次抗体又は二次抗体との接触工程の前後には、さらに洗浄工程がふくまれてもよい。
皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程、
標識付きの二次抗体を皮膚試料と接触させる工程、及び
皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程
を行うことにより行われうる。皮膚試料を前記抗活性型ＰＡＲ－２抗体と接触させる工程において、皮膚試料は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体と一例として１～２０時間、室温又は冷却下で接触されうる。この接触工程の前に、予め皮膚試料を固定する工程が行われてもよい。皮膚試料の固定は、任意の手法で行われてよいが、一例としてエタノール又はパラホルムアルデヒド含有溶液中で皮膚試料を１６～２４時間、室温又は冷却下でインキュベートすることにより実施できる固定されうる。二次抗体は、抗活性型ＰＡＲ－２抗体に結合する抗体であり、一次抗体である抗活性型ＰＡＲ－２抗体の由来生物に応じて選択することができる。標識は任意の標識であってよいが、一例として蛍光標識が用いられうる。蛍光標識を用いる場合、二次抗体との接触工程は暗所で行われ、一例として１時間、室温で接触されうる。接触は一例として各抗体を含む溶液中でインキュベートすることで行われる。皮膚試料において標識の検出強度を決定する工程は、標識に応じて適宜機器を選択して検出強度を決定することができる。蛍光標識を用いた場合には、蛍光顕微鏡を利用することができ、蛍光標識に合わせた励起光及びフィルターを用いて蛍光を検出することができる。一次抗体又は二次抗体との接触工程の前後には、さらに洗浄工程がふくまれてもよい。
【0022】
本発明のスクリーニング方法により、Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドが、ＰＡＲ－２活性化抑制剤としてスクリーニングされた。したがって、本発明のさらに別の態様は、下記の式：
｛式中、Ｒ1およびＲ2は同一または異なり、水素原子、炭素数１～１８の直鎖状または分岐状アルキル基、炭素数５～８のシクロアルキル基、ベンジル基または下記式：
（但し、Ｘは低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子を示し、ｎ＝０～３である）をそれぞれ示す｝
で表される化合物、又はその塩を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤に関する。特に好ましくは、ＰＡＲ－２活性化抑制剤は、Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩を含む。上述の化合物については、特許文献４（特開平９－２２７３６７号）を参照することで製造することができる。
【化9】
【化10】
で表される化合物、又はその塩を含む、ＰＡＲ－２活性化抑制剤に関する。特に好ましくは、ＰＡＲ－２活性化抑制剤は、Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩を含む。上述の化合物については、特許文献４（特開平９－２２７３６７号）を参照することで製造することができる。
【0023】
本発明のスクリーニング方法においてスクリーニングされたＰＡＲ－２活性化抑制剤は、肌荒れ抑制剤、例えば炎症抑制剤、肌荒れ抑制剤、バリア機能亢進剤、かゆみ抑制剤として使用することができる。本発明のＰＡＲ－２活性化抑制剤は、掻傷に対し、炎症を抑制する作用を有することから、炎症性皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬、接触皮膚炎などの治療又は予防用医薬又は美容組成物として使用することができ、PAR-2活性化の抑制を必要とする対象に投与されうる。ＰＡＲ－２活性化の抑制を必要とする対象とは、一例として炎症や掻傷によりかゆみが誘発された対象である。皮膚外用剤として製剤化することが好ましいが、他の任意の剤形に製剤化することもできる。ＰＡＲ－２活性化抑制剤は、化粧料、医薬部外品、医薬品に配合されうる。本発明のＰＡＲ－２活性化抑制剤が配合される化粧料として、例えば化粧水、乳液、美容液、クリーム、ファンデーションなどが挙げられるが、これらに限定されず、皮膚の改善を直接の目的とするものではないが、皮膚に塗布されるもの全てを含むことを意図し、例えば、日焼け止め剤、虫除け剤、脱毛剤、育毛剤、シェービングローション、アフターシェービングローションなども包含するものとする。
【0024】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、種々の態様をとることができる。本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【実施例】
【0025】
実施例１：皮膚におけるＰＡＲ－２及び活性型ＰＡＲ－２の免疫組織染色
ＫＡＣ社から入手したヒト腹部皮膚を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中で、４℃で２４時間インキュベートし、試料を固定した。ＰＢＳで洗浄後、３０％スクロース含有ＰＢＳに置換し、ＯＣＴコンパウンドとともに凍結ブロックを作製した。これをミクロトームで薄切し、６μｍ厚さの皮膚切片を作製し、染色に使用した。切片をブロッキング溶液（１０％ロバ血清及び０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００を含むＰＢＳ）で１時間インキュベートした後、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)を含むブロッキング溶液で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A11055）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ５９４標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21207）を含むブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、蛍光顕微鏡（カールツァイス社）で撮影を行った（図１）。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）は、表皮の最外層に局在しているのに対し、ＰＡＲ－２は、表皮の有棘層～顆粒層に広く分布し、特に顆粒層に多く存在した。
ＫＡＣ社から入手したヒト腹部皮膚を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中で、４℃で２４時間インキュベートし、試料を固定した。ＰＢＳで洗浄後、３０％スクロース含有ＰＢＳに置換し、ＯＣＴコンパウンドとともに凍結ブロックを作製した。これをミクロトームで薄切し、６μｍ厚さの皮膚切片を作製し、染色に使用した。切片をブロッキング溶液（１０％ロバ血清及び０．４％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００を含むＰＢＳ）で１時間インキュベートした後、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)を含むブロッキング溶液で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）で洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A11055）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ５９４標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21207）を含むブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、蛍光顕微鏡（カールツァイス社）で撮影を行った（図１）。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）は、表皮の最外層に局在しているのに対し、ＰＡＲ－２は、表皮の有棘層～顆粒層に広く分布し、特に顆粒層に多く存在した。
【0026】
実施例２：活性型ＰＡＲ－２の局在領域の特定
実施例１と同様に、一次抗体としてヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)を用いて、活性型ＰＡＲ－２を検出するとともに、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体に代えてウサギ抗フィラグリン抗体（Santa Cruz, sc-30229）を用い、二次抗体は同じものを使用して、フィラグリンとの局在を調べた（図２）。フィラグリンは、未脱核細胞の最外層から角層において存在している一方で、活性型ＰＡＲ－２は、未脱核細胞の最外層にのみ局在しており、フィラグリンの局在と完全には一致しなかった。
実施例１と同様に、一次抗体としてヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)を用いて、活性型ＰＡＲ－２を検出するとともに、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体に代えてウサギ抗フィラグリン抗体（Santa Cruz, sc-30229）を用い、二次抗体は同じものを使用して、フィラグリンとの局在を調べた（図２）。フィラグリンは、未脱核細胞の最外層から角層において存在している一方で、活性型ＰＡＲ－２は、未脱核細胞の最外層にのみ局在しており、フィラグリンの局在と完全には一致しなかった。
【0027】
実施例１と同様に一次抗体としてヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)を用いて、活性型ＰＡＲ－２を検出するとともに、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体に代えて５００倍希釈マウス抗ＺＯ１－１抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 339100）を用い、二次抗体はＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して、タイトジャンクションとの局在を調べた。活性型ＰＡＲ－２は、タイトジャンクションの層を含めてその外側に局在することが示された。
【0028】
実施例３：抗活性型ＰＡＲ－２抗体の特異性の検討
実施例１と同様に、一次抗体として、ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及びウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)を用い、二次抗体は同じものを使用して、皮膚切片を染色した。ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体をその５倍重量の抗原ペプチド（配列：SLIGKV（配列番号３）を含むN末端部分）（Santa Cruz, sc-8206P）と混合し室温で３０分間処理し、その後遠心した上清をウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体と一緒に皮膚切片に添加してインキュベートを行った。撮影結果を図３に示す。抗原ペプチドとインキュベートすることにより、ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体由来の蛍光は消失する一方で、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体由来の蛍光に変化はなかった（図４）。
実施例１と同様に、一次抗体として、ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及びウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)を用い、二次抗体は同じものを使用して、皮膚切片を染色した。ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体をその５倍重量の抗原ペプチド（配列：SLIGKV（配列番号３）を含むN末端部分）（Santa Cruz, sc-8206P）と混合し室温で３０分間処理し、その後遠心した上清をウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体と一緒に皮膚切片に添加してインキュベートを行った。撮影結果を図３に示す。抗原ペプチドとインキュベートすることにより、ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体由来の蛍光は消失する一方で、ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体由来の蛍光に変化はなかった（図４）。
【0029】
実施例４：トリプシン処理による表皮のＰＡＲ－２抗体の活性化
ＫＡＣ社から入手した５１歳女性の腹部皮膚（手術後４℃保存で７日目）を、ヒト皮膚組織維持用培地（Biopredic社, MIL218）に真皮部分を浸して３７℃で１日器官培養を行った。皮膚上にシリコン接着剤をリング状に形成して、リング内に下記の溶液を適用した：水（Water）、０．０５％ダイズトリプシン阻害剤（SBTI）、５０μＭトリプシン＋０．０５％ダイズトリプシン阻害剤（Try 50μM＋SBTI）、１０μＭトリプシン（Try10μM）、１００μMトリプシン（Try 100μM）。トリプシンはＳｉｇｍａ社製（T-0303)を用い、ダイズトリプシン阻害剤はＳｉｇｍａ社製(T6522)を用いた。皮膚上面に培地がかからないようにして、３７℃５％ＣＯ2雰囲気下で、３０分インキュベートした。水で表面を洗浄し、実施例１と同様に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定、３０％スクロースに置換後、ＯＣＴブロックを作成し、マイクロトームで６μｍ厚さの切片を作成した。切片を、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗PAR-2H99抗体（Santa Cruz, sc-5597)のブロッキング溶液中で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ６４７標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21206）のブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン社）で撮影を行った。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の染色強度をNIS-elementsソフトウェアを用いて測定し、グラフ化して示した（図５）。非活性型ＰＡＲ－２（Ｈ９９）について蛍光強度に変化は見られなかった一方で、活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）はトリプシン処理（１０μＭ、１００μＭ）で用量依存的に蛍光強度が増加する一方、ダイズトリプシン阻害剤の添加により、トリプシンにより増加した蛍光強度が低下した。
ＫＡＣ社から入手した５１歳女性の腹部皮膚（手術後４℃保存で７日目）を、ヒト皮膚組織維持用培地（Biopredic社, MIL218）に真皮部分を浸して３７℃で１日器官培養を行った。皮膚上にシリコン接着剤をリング状に形成して、リング内に下記の溶液を適用した：水（Water）、０．０５％ダイズトリプシン阻害剤（SBTI）、５０μＭトリプシン＋０．０５％ダイズトリプシン阻害剤（Try 50μM＋SBTI）、１０μＭトリプシン（Try10μM）、１００μMトリプシン（Try 100μM）。トリプシンはＳｉｇｍａ社製（T-0303)を用い、ダイズトリプシン阻害剤はＳｉｇｍａ社製(T6522)を用いた。皮膚上面に培地がかからないようにして、３７℃５％ＣＯ2雰囲気下で、３０分インキュベートした。水で表面を洗浄し、実施例１と同様に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定、３０％スクロースに置換後、ＯＣＴブロックを作成し、マイクロトームで６μｍ厚さの切片を作成した。切片を、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗PAR-2H99抗体（Santa Cruz, sc-5597)のブロッキング溶液中で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ６４７標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21206）のブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン社）で撮影を行った。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の染色強度をNIS-elementsソフトウェアを用いて測定し、グラフ化して示した（図５）。非活性型ＰＡＲ－２（Ｈ９９）について蛍光強度に変化は見られなかった一方で、活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）はトリプシン処理（１０μＭ、１００μＭ）で用量依存的に蛍光強度が増加する一方、ダイズトリプシン阻害剤の添加により、トリプシンにより増加した蛍光強度が低下した。
【0030】
実施例５：スクラッチ処理後の皮膚試料における活性型ＰＡＲ－２の抑制
ＫＡＣ社から入手した４０歳女性の腹部皮膚（手術後７日目）を、ヒト皮膚組織維持用培地（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ社）培地中で３７℃で１日間培養を行った。皮膚に対し、金属スパチュラを皮膚に当てて、５０往復のスクラッチ処理を行った。スクラッチ処理を行った領域上にシリコン接着剤をリング状に形成して、リング内に下記の溶液を適用した：水（Water）、１％トラネキサム酸（Tranexamic acid： LKT Laboratories社）、０．７％Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド（N-methyl-trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxamide hydrochloride；CAS No. 38697-94-8)。皮膚上面に培地がかからないようにして、３７℃５％ＣＯ2雰囲気下で１時間インキュベートし、水で表面を洗浄して試料を得た。スクラッチ処理直後の試料及び溶液を適用した試料を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定、３０％スクロースに置換後、ＯＣＴブロックを作成し、マイクロトームで６μｍ厚さの切片を作成した。切片を、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)のブロッキング溶液中で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ６４７標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）のブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン社）で撮影を行った。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の蛍光画像を撮影した（図６Ａ）。染色画像について、活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の蛍光強度をNIS-elementsソフトウェア（ニコン社製）を用いて測定し、グラフ化して示した（図６Ｂ）。非活性型ＰＡＲ－２（Ｈ９９）について蛍光強度に変化は見られなかった。スクラッチ処理の直後は、活性型ＰＡＲ－２の蛍光強度は低いものの、スクラッチ処理後１時間で蛍光強度が大幅に増加した。一方で、トラネキサム酸及びＮ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドを適用した場合、スクラッチ処理により増加する活性型ＰＡＲ－２を抑えることができ、特にＮ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドでは、スクラッチ処理直後のレベルまで抑制することができ、これらの成分をＰＡＲ－２活性化抑制剤としてスクリーニングできた。
ＫＡＣ社から入手した４０歳女性の腹部皮膚（手術後７日目）を、ヒト皮膚組織維持用培地（Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ社）培地中で３７℃で１日間培養を行った。皮膚に対し、金属スパチュラを皮膚に当てて、５０往復のスクラッチ処理を行った。スクラッチ処理を行った領域上にシリコン接着剤をリング状に形成して、リング内に下記の溶液を適用した：水（Water）、１％トラネキサム酸（Tranexamic acid： LKT Laboratories社）、０．７％Ｎ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミド（N-methyl-trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxamide hydrochloride；CAS No. 38697-94-8)。皮膚上面に培地がかからないようにして、３７℃５％ＣＯ2雰囲気下で１時間インキュベートし、水で表面を洗浄して試料を得た。スクラッチ処理直後の試料及び溶液を適用した試料を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定、３０％スクロースに置換後、ＯＣＴブロックを作成し、マイクロトームで６μｍ厚さの切片を作成した。切片を、一次抗体として、３００倍希釈ヤギ抗ＰＡＲ－２Ｎ１９抗体（Santa Cruz, sc-8206)及び３００倍希釈ウサギ抗ＰＡＲ－２Ｈ９９抗体（Santa Cruz, sc-5597)のブロッキング溶液中で、１６時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、二次抗体として、１０００倍希釈のＡｌｅｘａ６４７標識抗ヤギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）及び１０００倍希釈のＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A21447）のブロッキング溶液で、暗室下で１時間インキュベートを行った。ＰＢＳＴ溶液で洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（ニコン社）で撮影を行った。活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の蛍光画像を撮影した（図６Ａ）。染色画像について、活性型ＰＡＲ－２（Ｎ１９）の蛍光強度をNIS-elementsソフトウェア（ニコン社製）を用いて測定し、グラフ化して示した（図６Ｂ）。非活性型ＰＡＲ－２（Ｈ９９）について蛍光強度に変化は見られなかった。スクラッチ処理の直後は、活性型ＰＡＲ－２の蛍光強度は低いものの、スクラッチ処理後１時間で蛍光強度が大幅に増加した。一方で、トラネキサム酸及びＮ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドを適用した場合、スクラッチ処理により増加する活性型ＰＡＲ－２を抑えることができ、特にＮ－メチル－トランス－４－（アミノメチル）シクロヘキサンカルボキサミドでは、スクラッチ処理直後のレベルまで抑制することができ、これらの成分をＰＡＲ－２活性化抑制剤としてスクリーニングできた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】