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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-17
(45)【発行日】2023-04-25
(54)【発明の名称】モルガネラ属細菌由来ナノ小胞およびその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 35/74 20150101AFI20230418BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20230418BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230418BHJP
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A61P 13/12 20060101ALI20230418BHJP
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A61P 17/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230418BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20230418BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230418BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20230418BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20230418BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230418BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230418BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230418BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230418BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20230418BHJP
A61P 31/08 20060101ALI20230418BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230418BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230418BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230418BHJP
C12N 1/20 20060101ALN20230418BHJP
【ＦＩ】
A61K35/74 Z
A23L33/135
A61P1/00
A61P9/00
A61P9/10
A61P9/10 101
A61P11/00
A61P11/02
A61P11/06
A61P13/10
A61P13/12
A61P15/00
A61P17/00
A61P17/06
A61P17/10
A61P19/02
A61P19/08
A61P19/10
A61P21/00
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61P27/02
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P31/04
A61P31/06
A61P31/08
A61P35/00
A61P37/02
A61P37/08
A61P43/00 105
A61P43/00 111
C12N1/20 E ZNA
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021185327
(22)【出願日】2021-11-15
(62)【分割の表示】P 2020557894の分割
【原出願日】2018-12-21
(65)【公開番号】P2022028794
(43)【公開日】2022-02-16
【審査請求日】2021-11-15
(31)【優先権主張番号】10-2018-0004603
(32)【優先日】2018-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2018-0158636
(32)【優先日】2018-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】516348577
【氏名又は名称】エムディー ヘルスケア インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＤ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム、ユン－クン
【審査官】藤井 美穂
(56)【参考文献】
【文献】特開２０２１－０７３２７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 1998, Vol.180, No.20, p.5478-5483
【文献】Acta Pharmaceutica Sinica B, 2021, Vol.11, No.8, pp.2114-2135
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００ － ３５／７６８
Ｃ１２Ｎ １／００ － ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または治療用薬学的組成物であって、
モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）由来小胞を有効成分として含み、前記炎症性疾患が、インターロイキン－６（ＩＬ－６）または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）により媒介される疾患である、薬学的組成物。
【請求項2】
前記炎症性疾患は、アトピー皮膚炎、にきび、乾癬、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性コラーゲン血管疾患、糸球体腎炎、脳炎、炎症性腸炎、慢性閉鎖性肺疾患、敗血症、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、関節炎、関節リウマチ、反応性関節炎、骨関節炎、鞏皮症、骨粗しょう症、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心内膜炎、心嚢炎、嚢胞性線維症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ハンセン病、梅毒、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、ボレリア症（Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、神経性ボレリア症、結核、サルコイドーシス（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、ループス、凍瘡状ループス、結核性ループス、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、黄斑変性、ブドウ膜炎、過敏性腸症候群、クローン病、シェーグレン症候群、線維筋痛、慢性疲労症候群、慢性疲労免疫不全症候群、筋痛性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、および多発性硬化症よりなる群から選ばれる１つ以上である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記小胞は、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）から自然的または人工的に分泌される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または改善用食品組成物であって、
モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）由来小胞を有効成分として含み、前記炎症性疾患が、インターロイキン－６（ＩＬ－６）または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）により媒介される疾患である、食品組成物。
【請求項6】
前記炎症性疾患は、アトピー皮膚炎、にきび、乾癬、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性コラーゲン血管疾患、糸球体腎炎、脳炎、炎症性腸炎、慢性閉鎖性肺疾患、敗血症、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、関節炎、関節リウマチ、反応性関節炎、骨関節炎、鞏皮症、骨粗しょう症、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心内膜炎、心嚢炎、嚢胞性線維症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ハンセン病、梅毒、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、ボレリア症（Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、神経性ボレリア症、結核、サルコイドーシス（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、ループス、凍瘡状ループス、結核性ループス、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、黄斑変性、ブドウ膜炎、過敏性腸症候群、クローン病、シェーグレン症候群、線維筋痛、慢性疲労症候群、慢性疲労免疫不全症候群、筋痛性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、および多発性硬化症よりなる群から選ばれる１つ以上である、請求項５に記載の食品組成物。
【請求項7】
前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍである、請求項５に記載の食品組成物。
【請求項8】
前記小胞は、モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）から自然的または人工的に分泌される、請求項５に記載の食品組成物。
【請求項9】
モルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）由来小胞の、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または治療用薬剤の製造のための使用であって、前記炎症性疾患が、インターロイキン－６（ＩＬ－６）または腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）により媒介される疾患である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、モルガネラ属細菌由来ナノ小胞およびその用途に関し、より具体的には、モルガネラ属細菌に由来するナノ小胞を用いた胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌およびリンパ腫などの悪性疾患、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中などの心血管疾患、糖尿病、およびパーキンソン病の診断方法、および前記小胞を含む前記疾患または炎症性疾患に対する予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
２１世紀に入って過去伝染病と認識された急性感染性疾患の重要性が低下することになる反面、ヒトとマイクロバイオームとの不調和によって発生する免疫機能の異常を伴った慢性疾患が生活の質と人間の寿命を決める主な疾患になり、疾病のパターンが変わった。２１世紀難治性慢性疾患として、癌、心血管疾患、慢性肺疾患、代謝疾患、炎症性疾患、および神経－精神疾患が、人間の寿命と生活の質を決める主な疾患として国民保健に大きい問題になっている。
【0003】
炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）は、細胞および組織の損傷や感染に対する局所的または全身的な防御機序であって、主に免疫系を成す体液性メディエーター（ｈｕｍｏｒａｌ ｍｅｄｉａｔｏｒ）が直接反応し、局所的または全身的作動システム（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）を刺激することによって起こる連鎖的な生体反応により誘発される。主な炎症性疾患としては、胃炎、炎症性腸炎などの消化器疾患、歯周炎などの口腔疾患、喘息、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、鼻炎などの呼吸器疾患、アトピー皮膚炎、脱毛、乾癬などの皮膚疾患、退行性関節炎、関節リウマチなどのような関節炎；および肥満、糖尿病、肝硬変症などの代謝疾患に含まれる。また、多様な研究を通じて持続的な炎症が癌を誘発することができるという結果が報告されてきた。
【0004】
人体に共生する微生物は、１００兆に達し、ヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒト遺伝子数の１００倍を超えると知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた棲息地に存在する真正細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言う。
【0005】
人体に共生する細菌および周辺環境に存在する細菌は、他の細胞への遺伝子、低分子化合物、タンパク質などの情報を交換するために、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成して、粘膜に共生する細菌である場合には、粘膜を通過しないが、細菌由来小胞は、サイズが略１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通じて上皮細胞を通過した後に人体に吸収される。局所的に分泌された細菌由来小胞は、粘膜の上皮細胞あるいは皮膚角質細胞を通じて吸収されて、局所炎症反応を誘導すると共に、人体に吸収されて各臓器に分布し、吸収された臓器で免疫および炎症反応を調節する。例えば、大腸菌（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような病原性グラム陰性細菌に由来する小胞は、血管に吸収された場合に、血管内皮細胞の炎症反応を通じて全身的な炎症反応および血液凝固を促進させ、また、インスリンが作用する筋肉細胞などに吸収されて、インスリン抵抗性と糖尿病を誘発する。反面、有益な細菌に由来する小胞は、病原性小胞による免疫機能および代謝機能の異常を調節して疾病を調節することができる（Ｃｈｏｉ ＹＷ ｅｔ ａｌ．，Ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｔｈｅｒｅｂｙ ｉｍｐａｉｒｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５．）。
【0006】
細菌に由来する小胞などの因子に対する免疫反応は、ＩＬ－１７サイトカインの分泌を特徴とするＴｈ１７免疫反応であって、これは、細菌由来小胞に曝露時にＩＬ－６が分泌され、これは、Ｔｈ１７免疫反応を誘導する。Ｔｈ１７免疫反応による炎症は、好中球の浸潤を特徴とし、炎症が発生する過程でマクロファージなどのような炎症細胞で分泌されるＴＮＦ－ａｌｐｈａが重要な役割を担当する。
【0007】
モルガネラ属細菌は、嫌気性グラム陰性細菌であって、人間と動物の腸に共生する細菌と知られている。前記細菌のうちモルガネラ・モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）菌は、手術後に感染または尿道感染などを起こす病原性細菌と知られている。しかしながら、現在まで、モルガネラ属細菌が細胞外に小胞を分泌するという事実は報告されておらず、特に癌、心血管疾患、代謝疾患、炎症性疾患、および神経－精神疾患の診断および治療に応用した事例は報告されたことがない。
【0008】
これより、本発明では、モルガネラ属細菌由来小胞が正常ヒトに比べて癌、心血管疾患、代謝疾患、炎症性疾患、および神経－精神疾患の患者の臨床サンプルに有意に減少していることを確認して、疾病を診断することができることを確認した。また、モルガネラ・モルガニイ菌から小胞を分離し、特性を分析した結果、悪性疾患、心血管疾患、代謝疾患、炎症性疾患、および神経－精神疾患の予防または治療用組成物に用いられることを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明者らは、前記のような従来の問題点を解決するために鋭意研究した結果、メタゲノム分析を通して正常ヒトに比べて胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌およびリンパ腫などの悪性疾患、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中などの心血管疾患、糖尿病、およびパーキンソン病などの患者臨床サンプルでモルガネラ属細菌由来小胞の含量が有意に減少していることを確認した。また、モルガネラ属細菌に属するモルガネラ・モルガニイ菌から小胞を分離してマクロファージに処理したとき、病原性小胞によるＴＮＦ－ａｌｐｈａの分泌を顕著に抑制することを確認し、これに基づいて本発明を完成した。
【0010】
これより、本発明は、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病の診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
【0011】
また、本発明は、モルガネラ由来小胞を有効成分として含む胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、パーキンソン病、または炎症性疾患の予防または治療用組成物を提供することを他の目的とする。
【0012】
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【0013】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病の診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行って、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてモルガネラ属細菌由来小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病と判定する段階。
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行って、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてモルガネラ属細菌由来小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病と判定する段階。
【0014】
また、本発明は、下記の段階を含む、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病の診断方法を提供する：
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行って、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてモルガネラ属細菌由来小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病と判定する段階。
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行って、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてモルガネラ属細菌由来小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病と判定する段階。
【0015】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ａ）でのサンプルは、血液、尿、または便でありうる。
【0016】
本発明のさらに他の具現例において、前記段階（ｂ）でのプライマーペアは、配列番号１および配列番号２のプライマーでありうる。
【0017】
また、本発明は、モルガネラ属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、パーキンソン病、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0018】
また、本発明は、モルガネラ属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、パーキンソン病、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または改善用食品組成物を提供する。
【0019】
また、本発明は、モルガネラ属細菌由来小胞を有効成分として含む薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、パーキンソン病、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または治療方法を提供する。
【0020】
また、本発明は、モルガネラ属細菌由来小胞の、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、パーキンソン病、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または治療用途を提供する。
【0021】
本発明の一具現例において、前記炎症性疾患は、アトピー皮膚炎、にきび、乾癬、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性コラーゲン血管疾患、糸球体腎炎、脳炎、炎症性腸炎、慢性閉鎖性肺疾患、敗血症、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、関節炎、関節リウマチ、反応性関節炎、骨関節炎、鞏皮症、骨粗しょう症、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心内膜炎、心嚢炎、嚢胞性線維症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ハンセン病、梅毒、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、ボレリア症（Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、神経性ボレリア症、結核、サルコイドーシス（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、ループス、凍瘡状ループス、結核性ループス、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、黄斑変性、ブドウ膜炎、過敏性腸症候群、クローン病、シェーグレン症候群、線維筋痛、慢性疲労症候群、慢性疲労免疫不全症候群、筋痛性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、および多発性硬化症よりなる群から選ばれる１つ以上でありうる。
【0022】
本発明の他の具現例において、前記炎症性疾患は、ＩＬ－６またはＴＮＦ－αにより媒介される疾患でありうる。
【0023】
本発明のさらに他の具現例において、前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍのものでありうる。
【0024】
本発明のさらに他の具現例において、前記小胞は、モルガネラ属細菌から自然的にまたは人工的に分泌されるものでありうる。
【0025】
本発明のさらに他の具現例において、前記モルガネラ属細菌由来小胞は、モルガネラ・モルガニイから分泌されるものでありうる。
【発明の効果】
【0026】
本発明者らは、腸内細菌である場合には、体内に吸収されないが、細菌由来小胞である場合には、上皮細胞を通じて体内に吸収されて、全身的に分布し、腎臓、肝臓、肺を通じて体外に排泄されることを確認し、患者の血液、尿、または便などに存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を通して胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、およびパーキンソン病の患者の血液、尿、または便に存在するモルガネラ属細菌由来小胞が正常ヒトに比べて有意に減少していることを確認した。また、モルガネラ属細菌の一種であるモルガネラ・モルガニイを体外で培養して小胞を分離して、体外で炎症細胞に投与したとき、病原性小胞による炎症メディエーターの分泌を有意に抑制すると同時に、癌動物モデルで癌の発生を抑制することを観察したところ、本発明によるモルガネラ属細菌由来小胞は、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、およびパーキンソン病に対する診断方法、および前記疾患または炎症性疾患に対する食品または薬物などの予防用あるいは治療用組成物に有用に用いられるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1a-b】図１ａは、マウスに細菌と細菌由来小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔で投与した後１２時間目に、血液、腎臓、肝臓、および様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した結果である。
【図2b-c】図２ａ～図２ｃは、胃癌患者および正常ヒトの便（図２ａ）、血液（図２ｂ）、および尿（図２ｃ）に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図16a-b】図１６ａおよび図１６ｂは、糖尿病患者および正常ヒトの血液（図１６ａ）および尿（図１６ｂ）に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を実施した後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を比較した結果である。
【図18】図１８は、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の細胞死滅効果を評価するために、モルガネラ・モルガニイ由来小胞をマクロファージに処理して、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の細胞死滅効果を評価した結果である。
【図19a-b】図１９ａおよび図１９ｂは、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症効果を評価するために、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ）の処理前にモルガネラ・モルガニイ由来小胞を前処理して、大腸菌小胞による炎症メディエーターであるＩＬ－６（図１９ａ）およびＴＮＦ－α（図１９ｂ）の分泌に及ぼす影響を評価した結果である。
【図20】図２０は、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症効果に対する互いに異なる菌株に由来した小胞の影響を比較するために、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ）の処理前に互いに異なるヒトから分離したモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１）由来小胞を前処理して、大腸菌小胞によるＴＮＦ－αの分泌に及ぼす影響を評価した結果である（ＮＣ：ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；ＰＣ：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明は、モルガネラ属細菌由来小胞およびその用途に関する。
【0029】
本発明者らは、メタゲノム分析を通して正常ヒトに比べて胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、およびパーキンソン病の患者由来サンプルでモルガネラ属細菌由来小胞の含量が顕著に減少していることを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【0030】
これより、本発明は、下記の段階を含む、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病の診断のための情報提供方法を提供する。
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行って、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてモルガネラ属細菌由来小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病と判定する段階。
（ａ）正常ヒトおよび被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行って、それぞれのＰＣＲ産物を収得する段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通して正常ヒトに比べてモルガネラ属細菌由来小胞の含量が低い場合、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、またはパーキンソン病と判定する段階。
【0031】
本発明において使用される用語「診断」とは、広い意味では患者の病の実態をすべての面にわたって判断することを意味する。判断の内容は、病名、病因、病型、軽重、病床の詳細な様態、合併症の有無、および予後などである。本発明において診断は、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、およびパーキンソン病の発病の有無および疾患の水準などを判断することである。
【0032】
本発明において使用される用語「ナノ小胞（Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）あるいは小胞（Ｖｅｓｉｃｌｅ）」とは、多様な細菌から分泌されるナノサイズの膜からなる構造物を意味する。グラム陰性菌（ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来小胞、または外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＯＭＶｓ）は、内毒素（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）だけでなく、毒性タンパク質および細菌ＤＮＡとＲＮＡも有しており、グラム陽性菌（ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来小胞は、タンパク質と核酸の他にも、細菌の細胞壁構成成分であるペプチドグリカン（ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ）とリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）も有している。本発明において、ナノ小胞あるいは小胞は、モルガネラ属細菌から自然的に分泌されたり、または人工的に生産されるものであって、球形の形態であり、１０～２００ｎｍの平均直径を有している。
【0033】
前記小胞は、モルガネラ属細菌を含む培養液を遠心分離、超高速遠心分離、高圧処理、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍－解凍、電気穿孔、機械的分解、化学物質処理、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、およびキャピラリー電気泳動よりなる群から選ばれる１つ以上の方法を使用して分離することができる。また、不純物の除去のための洗浄、収得された小胞の濃縮などの過程をさらに含むことができる。
【0034】
本発明において使用される用語「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」とは、「群 遺伝子」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、かびなどを含む遺伝子の総和を意味するものであって、主に培養にならない微生物を分析するために、配列分析器を使用して一度に多くの微生物を同定することを説明するゲノムの概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノムまたは遺伝子を言うものではなく、１つの環境単位のすべての種の遺伝子であって、一種の混合遺伝子を言う。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、速い配列分析法を利用して、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、１つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を解明する技法の対象である。
【0035】
本発明において、前記段階（ａ）でのサンプルは、血液、尿、または便でありうるが、これに制限されるものではない。
【0036】
本発明において、前記段階（ｂ）でのプライマーペアは、配列番号１および配列番号２のプライマーでありうる。
【0037】
本発明の他の様態として、本発明は、モルガネラ属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、パーキンソン病、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0038】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、モルガネラ属細菌由来小胞を有効成分として含む、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、パーキンソン病、および炎症性疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾病の予防または改善用食品組成物を提供する。
【0039】
本発明において、前記炎症性疾患は、アトピー皮膚炎、にきび、乾癬、副鼻腔炎、鼻炎、結膜炎、喘息、皮膚炎、炎症性コラーゲン血管疾患、糸球体腎炎、脳炎、炎症性腸炎、慢性閉鎖性肺疾患、敗血症、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、関節炎、関節リウマチ、反応性関節炎、骨関節炎、鞏皮症、骨粗しょう症、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心内膜炎、心嚢炎、嚢胞性線維症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ハンセン病、梅毒、ライム病（Ｌｙｍｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、ボレリア症（Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、神経性ボレリア症、結核、サルコイドーシス（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、ループス、凍瘡状ループス、結核性ループス、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、黄斑変性、ブドウ膜炎、過敏性腸症候群、クローン病、シェーグレン症候群、線維筋痛、慢性疲労症候群、慢性疲労免疫不全症候群、筋痛性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、および多発性硬化症よりなる群から選ばれる１つ以上でありうるが、これに制限されない。
【0040】
本発明において、前記炎症性疾患は、インターロイキン－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６；ＩＬ－６）または腫瘍壊死因子－アルファ（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ；ＴＮＦ－α）により媒介される疾患でありうるが、これに制限されない。
【0041】
本発明において使用される用語「予防」とは、本発明による食品または薬学的組成物の投与により癌、炎症疾患、心血管疾患、代謝疾患、または神経－精神疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【0042】
本発明において使用される用語「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により癌、炎症疾患、心血管疾患、代謝疾患、または神経－精神疾患に対する症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
【0043】
本発明において使用される用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。
【0044】
本発明の一実施例では、細菌および細菌由来小胞をマウスの経口で投与して細菌および小胞の体内吸収、分布、および排泄様相を評価し、細菌である場合には、腸粘膜を通じて吸収されないのに対して、小胞は、投与５分以内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝臓などを通じて排泄されることを確認した（実施例１参照）。
【0045】
本発明の他の一実施例では、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、およびパーキンソン病の患者に年齢と性別をマッチングした正常ヒトの血液、尿、または便から分離した小胞を用いて細菌メタゲノム分析を実施した。その結果、正常ヒトのサンプルに比べて、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、およびパーキンソン病の患者のサンプルにモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（実施例３～１５参照）。
【0046】
本発明のさらに他の実施例では、炎症細胞でモルガネラ・モルガニイ由来小胞（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ ＥＶ）の細胞死滅効果を評価するために、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ ２６４．７細胞にモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、細胞死滅程度を評価した結果、モルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞の処理時に細胞死滅は観察されないことを確認した（実施例１７参照）。
【0047】
本発明のさらに他の実施例では、前記実施例の結果に基づいてモルガネラ属細菌に属するモルガネラ・モルガニイ種細菌由来小胞の特性を分析するためにさらに研究した結果、モルガネラ・モルガニイ菌株を培養してこれから分泌された小胞が抗炎症効果を示すかを評価したが、多様な濃度のモルガネラ・モルガニイ由来小胞をマクロファージに処理した後、炎症疾患の原因因子である大腸菌由来小胞を処理して炎症メディエーターの分泌を評価した結果、大腸菌由来小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌をモルガネラ・モルガニイ由来小胞が効率的に抑制することを確認した（実施例１８参照）。
【0048】
本発明のさらに他の実施例では、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症作用が熱処理または酸処理の効果を評価するために、マクロファージに大腸菌由来小胞を処理する前に熱処理または酸処理した小胞を投与してＴＮＦ－αの分泌に及ぼす影響を評価した結果、モルガネラ・モルガニイ由来小胞によるＴＮＦ－αの分泌抑制効果が熱処理や酸処理により変わらないことを確認した（実施例１９参照）。
【0049】
本発明のさらに他の実施例では、モルガネラ・モルガニイ菌株を培養してこれから分泌された小胞が抗癌治療効果を示すかを評価した。このために、癌細胞株を皮下で注射して癌モデルを作成し、モルガネラ・モルガニイ由来小胞を癌細胞株の処置４日前からマウスに経口または腹腔で投与した後、２０日間癌組織の大きさを測定した結果、前記小胞を腹腔および経口で投与した場合に、対照群に比べて癌組織の大きさが減少し、特に経口で投与した場合に顕著に減少していることを確認した（実施例２０参照）。
【0050】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液など他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、または錠剤に製剤化することができる。適切な薬学的に許容される担体および製剤化に関しては、レミントンの文献に開示されている方法を用いて各成分によって好適に製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、または経口摂取剤などに製剤化することができる。
【0051】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。
【0052】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量の水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与され得、単一または多重投与され得る。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
【0053】
具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変わり得、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１～１５０ｍｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇを毎日または隔日投与したり、１日１～３回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減され得るので、前記投与量がいかなる意味でも本発明の範囲を限定するものではない。
【0054】
本発明の食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。本発明による食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加したり他の食品または食品成分と共に使用され得、通常の方法によって適切に使用され得る。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって適宜決定され得る。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかしながら、健康および衛生を目的としたりまたは健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下でありうる。
【0055】
本発明の食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有すること他に、他の成分には特別な制限がなく、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などをさらなる成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖など；二糖類、例えばマルトース、スクロースなど；および多糖類、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、当業者の選択によって適切に決定され得る。
【0056】
前記の他に本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率も、当業者によって適宜選択され得る。
【0057】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が制限されるものではない。
【実施例】
【0058】
［実施例１．腸内細菌および細菌由来小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析］
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を通じて全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体像を観察した結果、図１ａに示されたように、細菌である場合には、腸粘膜を通じて全身的に吸収されないが、細菌由来小胞である場合には、投与後５分に全身的に吸収され、投与３０分には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった（図１ａ参照）。
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を通じて全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体像を観察した結果、図１ａに示されたように、細菌である場合には、腸粘膜を通じて全身的に吸収されないが、細菌由来小胞である場合には、投与後５分に全身的に吸収され、投与３０分には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった（図１ａ参照）。
【0059】
腸内細菌と腸内細菌由来小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来小胞を前記の方法のように投与した後、投与１２時間後に血液、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉を採取した。採取した組織から蛍光を観察した結果、図１ｂに示されたように、細菌由来小胞が、血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉、腎臓に分布したが、細菌は吸収されないことが分かった（図１ｂ参照）。
【0060】
［実施例２．臨床サンプルで細菌由来小胞メタゲノム分析］
血液、尿、便などの臨床サンプルをまず１０ｍｌチューブに入れて遠心分離法（３，５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈め、上澄み液だけを新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍのフィルターを使用して細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移して１５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨てて、１０ｍｌまで濃縮させた。さらに０．２２μｍのフィルターを使用してバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨てて、固まったペレットを生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かした。
血液、尿、便などの臨床サンプルをまず１０ｍｌチューブに入れて遠心分離法（３，５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈め、上澄み液だけを新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍのフィルターを使用して細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移して１５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、５０ｋＤより小さい物質は捨てて、１０ｍｌまで濃縮させた。さらに０．２２μｍのフィルターを使用してバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨てて、固まったペレットを生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かした。
【0061】
前記方法で分離した小胞１００μｌを１００℃で沸かして内部のＤＮＡを脂質外に出るようにし、その後、氷上で５分間冷ました。そして、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液だけを集めた。そして、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ量を定量した。その後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行って、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
【0062】
【表1】
【0063】
前記方法で抽出したＤＮＡを前記の１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使用して増幅した後、シーケンシングを行い（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）、その結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力してＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を利用してＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）分析のためには、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを利用してシークエンス類似度によってクラスタリングを行い、ｇｅｎｕｓは９４％、ｆａｍｉｌｙは９０％、ｏｒｄｅｒは８５％、ｃｌａｓｓは８０％、ｐｈｙｌｕｍは７５％シークエンス類似度を基準としてクラスタリングを行い、各ＯＴＵのｐｈｙｌｕｍ、ｃｌａｓｓ、ｏｒｄｅｒ、ｆａｍｉｌｙ、ｇｅｎｕｓレベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＲＮＡシークエンスデータベース（１０８，４５３シークエンス）を用いて属水準で９７％以上のシークエンス類似度を有する細菌をプロファイリングした（ＱＩＩＭＥ）。
【0064】
［実施例３．胃癌患者の便、血液および尿細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で胃癌患者６３人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１２６人の便を対象に、便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの便に比べて胃癌患者の便にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表２および図２ａ参照）。
実施例２の方法で胃癌患者６３人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１２６人の便を対象に、便内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの便に比べて胃癌患者の便にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表２および図２ａ参照）。
【0065】
【表2】
【0066】
実施例２の方法で胃癌患者６６人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１９８人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて胃癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表３および図２ｂ参照）。
【0067】
【表3】
【0068】
また、実施例２の方法で胃癌患者６１人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１２０人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて胃癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表４および図２ｃ参照）。
【0069】
【表4】
【0070】
［実施例４．大腸癌患者の尿細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で大腸癌患者３８人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト３８人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて大腸癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表５および図３参照）。
実施例２の方法で大腸癌患者３８人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト３８人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて大腸癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表５および図３参照）。
【0071】
【表5】
【0072】
［実施例５．すい臓癌患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法ですい臓癌患者１７６人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２７１人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べてすい臓癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表６および図４参照）。
実施例２の方法ですい臓癌患者１７６人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２７１人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べてすい臓癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表６および図４参照）。
【0073】
【表6】
【0074】
［実施例６．胆管癌患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で胆管癌患者７９人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２５９人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて胆管癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表７および図５参照）。
実施例２の方法で胆管癌患者７９人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト２５９人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて胆管癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表７および図５参照）。
【0075】
【表7】
【0076】
［実施例７．乳癌患者の尿細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で乳癌患者１２７人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群２２０人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて乳癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表８および図６参照）。
実施例２の方法で乳癌患者１２７人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群２２０人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて乳癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表８および図６参照）。
【0077】
【表8】
【0078】
［実施例８．卵巣癌患者の血液および尿細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で卵巣癌患者１３７人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１３９人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて卵巣癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表９および図７ａ参照）。
実施例２の方法で卵巣癌患者１３７人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１３９人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて卵巣癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表９および図７ａ参照）。
【0079】
【表9】
【0080】
また、実施例２の方法で卵巣癌患者１３６人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１３６人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて卵巣癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１０および図７ｂ参照）。
【0081】
【表10】
【0082】
［実施例９．膀胱癌患者の血液および尿細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で膀胱癌患者９６人の血液および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１８４人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて膀胱癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１１および図８ａ参照）。
実施例２の方法で膀胱癌患者９６人の血液および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１８４人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて膀胱癌患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１１および図８ａ参照）。
【0083】
【表11】
【0084】
また、実施例２の方法で膀胱癌患者９５人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１５７人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて膀胱癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１２および図８ｂ参照）。
【0085】
【表12】
【0086】
［実施例１０．前立腺癌患者の尿細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で前立腺癌患者５３人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１５９人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて前立腺癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１３および図９参照）。
実施例２の方法で前立腺癌患者５３人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１５９人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて前立腺癌患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１３および図９参照）。
【0087】
【表13】
【0088】
［実施例１１．リンパ腫患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法でリンパ腫患者６３人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト５３人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べてリンパ腫患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１４および図１０参照）。
実施例２の方法でリンパ腫患者６３人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト５３人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べてリンパ腫患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１４および図１０参照）。
【0089】
【表14】
【0090】
［実施例１２．心臓疾患患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で心筋梗塞患者５７人の血液および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１６３人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて心筋梗塞患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１５および図１１参照）。
実施例２の方法で心筋梗塞患者５７人の血液および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１６３人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて心筋梗塞患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１５および図１１参照）。
【0091】
【表15】
【0092】
また、実施例２の方法で拡張性心筋症患者７２人の血液および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１６３人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて拡張性心筋症患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１６および図１２参照）。
【0093】
【表16】
【0094】
また、実施例２の方法で心房細動患者３２人の血液と性別と年齢をマッチングした正常対照群３２人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて心房細動患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１７および図１３参照）。
【0095】
【表17】
【0096】
また、実施例２の方法で異型狭心症患者８０人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト８０人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて異型狭心症患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１８および図１４参照）。
【0097】
【表18】
【0098】
［実施例１３．脳卒中患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で脳卒中患者１１５人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１０９人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて脳卒中患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１９および図１５参照）。
実施例２の方法で脳卒中患者１１５人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１０９人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて脳卒中患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表１９および図１５参照）。
【0099】
【表19】
【0100】
［実施例１４．糖尿病患者の血液細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法で糖尿病患者７３人の血液および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１４６人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて糖尿病患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表２０および図１６ａ参照）。
実施例２の方法で糖尿病患者７３人の血液および、性別と年齢をマッチングした正常対照群１４６人の血液を対象に、血液内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの血液に比べて糖尿病患者の血液にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表２０および図１６ａ参照）。
【0101】
【表20】
【0102】
また、実施例２の方法で糖尿病患者６０人および、年齢と性別をマッチングした正常ヒト１３４人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べて糖尿病患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表２１および図１６ｂ参照）。
【0103】
【表21】
【0104】
［実施例１５．パーキンソン病患者の尿細菌由来小胞メタゲノム分析］
実施例２の方法でパーキンソン病患者３９人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群７９人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べてパーキンソン病患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表２２および図１７参照）。
実施例２の方法でパーキンソン病患者３９人の尿および、性別と年齢をマッチングした正常対照群７９人の尿を対象に、尿内に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム分析を行った後、モルガネラ属細菌由来小胞の分布を評価した。その結果、正常ヒトの尿に比べてパーキンソン病患者の尿にモルガネラ属細菌由来小胞が有意に減少していることを確認した（表２２および図１７参照）。
【0105】
【表22】
【0106】
［実施例１６．モルガネラ・モルガニイ培養液から小胞分離］
前記実施例に基づいて、モルガネラ・モルガニイ（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）菌株は、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）で標準菌株１種（ＭＭＲ１０１）およびヒトから分離した２種の分離菌株（ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）を培養した後、培養液から小胞を分離して特性を分析した。モルガネラ菌株（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）を３７℃培養器で吸光度（ＯＤ６００）が１．０～１．５になるまでＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で培養した後、サブカルチャーした。以後、菌株が含まれている培養液を回収して１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離して菌株を除去し、０．２２μｍのフィルターに濾過した。濾過した上澄み液を１００ｋＤａ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｃａｓｓｅｔｔｅフィルターメンブレイン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳ）でＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ ｐｕｍｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ，ＵＳ）を用いてマイクロフィルター濾過を通じて５０ｍｌ以下の体積に濃縮した。濃縮させた上澄み液をさらに０．２２μｍのフィルターで濾過した。以後、ＢＣＡアッセイを用いてタンパク質を定量し、得られた小胞に対して下記実験を実施した。
前記実施例に基づいて、モルガネラ・モルガニイ（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）菌株は、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）で標準菌株１種（ＭＭＲ１０１）およびヒトから分離した２種の分離菌株（ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）を培養した後、培養液から小胞を分離して特性を分析した。モルガネラ菌株（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）を３７℃培養器で吸光度（ＯＤ６００）が１．０～１．５になるまでＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地で培養した後、サブカルチャーした。以後、菌株が含まれている培養液を回収して１０，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離して菌株を除去し、０．２２μｍのフィルターに濾過した。濾過した上澄み液を１００ｋＤａ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｃａｓｓｅｔｔｅフィルターメンブレイン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳ）でＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ ｐｕｍｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ，ＵＳ）を用いてマイクロフィルター濾過を通じて５０ｍｌ以下の体積に濃縮した。濃縮させた上澄み液をさらに０．２２μｍのフィルターで濾過した。以後、ＢＣＡアッセイを用いてタンパク質を定量し、得られた小胞に対して下記実験を実施した。
【0107】
［実施例１７．モルガネラ・モルガニイ由来小胞の細胞死滅効果］
炎症細胞でモルガネラ・モルガニイ由来小胞（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ ＥＶ）の細胞死滅効果を評価するために、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ ２６４．７細胞にモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、細胞死滅程度を評価した。より具体的に、４８ウェル細胞培養プレート内に５×１０４個ずつ分注したＲａｗ ２６４．７細胞にＤＭＥＭ無血清培地で希釈した多様な濃度のモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞を処理して１２時間の間培養した。以後、細胞死滅は、ＥＺ－ＣＹＴＯＸ（Ｄｏｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いて測定した。その結果、モルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞の処理時に細胞死滅は観察されなかった（図１８参照）。
炎症細胞でモルガネラ・モルガニイ由来小胞（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ ＥＶ）の細胞死滅効果を評価するために、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ ２６４．７細胞にモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、細胞死滅程度を評価した。より具体的に、４８ウェル細胞培養プレート内に５×１０４個ずつ分注したＲａｗ ２６４．７細胞にＤＭＥＭ無血清培地で希釈した多様な濃度のモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞を処理して１２時間の間培養した。以後、細胞死滅は、ＥＺ－ＣＹＴＯＸ（Ｄｏｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を用いて測定した。その結果、モルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞の処理時に細胞死滅は観察されなかった（図１８参照）。
【0108】
［実施例１８．モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症効果］
モルガネラ・モルガニイ由来小胞が、炎症細胞で炎症メディエーターの分泌に対する影響を調べてみるために、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ ２６４．７細胞にモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１）由来小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、炎症疾患病原性小胞である大腸菌由来小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ）を処理して炎症メディエーター（ＩＬ－６、ＴＮＦ－αなど）の分泌量を測定した。より具体的に、Ｒａｗ ２６４．７細胞を１ｘ１０５個ずつ２４ウェル細胞培養プレートに分注した後、２４時間の間ＤＭＥＭ完全培地で培養させた。以後、培養上澄み液を１．５ｍｌのチューブに集めて３０００ｇで５分間遠心分離して上澄み液を集めて４℃に保管しておいて、ＥＬＩＳＡ分析を進めた。その結果、モルガネラ・モルガニイ由来小胞を前処理した場合、大腸菌由来小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌が顕著に抑制されることを確認した（図１９ａおよび１９ｂ参照）。特に、モルガネラ・モルガニイ由来小胞を前処理した場合に、マクロファージでＴＮＦ－αの分泌がラクトバチルスプランタルム小胞に比べて抑制程度が顕著に高かった（図１９ｂ参照）。
モルガネラ・モルガニイ由来小胞が、炎症細胞で炎症メディエーターの分泌に対する影響を調べてみるために、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ ２６４．７細胞にモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１）由来小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、炎症疾患病原性小胞である大腸菌由来小胞（Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＶ）を処理して炎症メディエーター（ＩＬ－６、ＴＮＦ－αなど）の分泌量を測定した。より具体的に、Ｒａｗ ２６４．７細胞を１ｘ１０５個ずつ２４ウェル細胞培養プレートに分注した後、２４時間の間ＤＭＥＭ完全培地で培養させた。以後、培養上澄み液を１．５ｍｌのチューブに集めて３０００ｇで５分間遠心分離して上澄み液を集めて４℃に保管しておいて、ＥＬＩＳＡ分析を進めた。その結果、モルガネラ・モルガニイ由来小胞を前処理した場合、大腸菌由来小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌が顕著に抑制されることを確認した（図１９ａおよび１９ｂ参照）。特に、モルガネラ・モルガニイ由来小胞を前処理した場合に、マクロファージでＴＮＦ－αの分泌がラクトバチルスプランタルム小胞に比べて抑制程度が顕著に高かった（図１９ｂ参照）。
【0109】
また、多様なサンプルから分離したモルガネラ・モルガニイ菌株から分離した小胞の抗炎症効果を評価するために、多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）のモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞をマウスマクロファージ細胞株に１２時間前処理した後、病原性小胞である大腸菌由来小胞１μｇ／ｍｌを処理し、１２時間後に炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。その結果、有用微生物対照群であるラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来小胞の前処理によるＴＮＦ－αの分泌抑制効果よりモルガネラ・モルガニイ（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１、ＭＭＲ２０２）由来小胞の抑制効果がさらに高いことを確認した（図２０参照）。これは、モルガネラ・モルガニイのソースに関係なくモルガネラ・モルガニイ菌が分泌する小胞が、抗炎症効果があることを意味する。
【0110】
［実施例１９．モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症作用に対する熱または酸処理の効果］
前記実施例１８を通じてモルガネラ・モルガニイ標準菌株（ＭＭＲ１０１）および分離菌株（ＭＭＲ２０１）由来小胞の抗炎症効果を確認し、ひいては、前記小胞の安定性および有効物質の特性を具体的に調べてみようとした。このために、１００℃で１０分間煮沸、又は１０分間酸処理（ｐＨ２．０）をした２種のモルガネラ・モルガニイ由来小胞（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１）をマクロファージ（Ｒａｗ ２６４．７）に前処理して抗炎症効果を評価した。その結果、小胞を１００℃の煮沸処理や、酸処理をしても、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症効果が維持されることを確認した（図２１参照）。これは、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症作用は、温度と酸に対して安定であることを意味する。
前記実施例１８を通じてモルガネラ・モルガニイ標準菌株（ＭＭＲ１０１）および分離菌株（ＭＭＲ２０１）由来小胞の抗炎症効果を確認し、ひいては、前記小胞の安定性および有効物質の特性を具体的に調べてみようとした。このために、１００℃で１０分間煮沸、又は１０分間酸処理（ｐＨ２．０）をした２種のモルガネラ・モルガニイ由来小胞（ＭＭＲ１０１、ＭＭＲ２０１）をマクロファージ（Ｒａｗ ２６４．７）に前処理して抗炎症効果を評価した。その結果、小胞を１００℃の煮沸処理や、酸処理をしても、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症効果が維持されることを確認した（図２１参照）。これは、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗炎症作用は、温度と酸に対して安定であることを意味する。
【0111】
［実施例２０．モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗癌効果］
前記実施例に基づいて、ひいては、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗癌効果を調べてみようとした。このために、図２２に示されたように、モルガネラ・モルガニイ分離菌株（ＭＭＲ２０１）由来小胞を６週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスに腹腔注射または経口で投与し、投与４日目に癌細胞株（ＣＴ２６ ｃｅｌｌ）を皮下で注射して癌モデルを作成した。癌細胞株を投与した後、モルガネラ・モルガニイ分離菌株由来小胞を腹腔注射または経口で毎日投与し、２４日目まで癌組織の大きさを測定した（図２２参照）。その結果、癌組織の大きさは、対照群である生理食塩水経口投与群に比べて、前記小胞を腹腔注射で投与したマウスと経口で投与したマウスにおいて癌組織の大きさが減少し、特に、経口で投与した場合に大きさがさらに減少した（図２３参照）。これは、モルガネラ・モルガニイ由来小胞を投与したとき、癌組織の成長を効率的に抑制することができることを意味する。
前記実施例に基づいて、ひいては、モルガネラ・モルガニイ由来小胞の抗癌効果を調べてみようとした。このために、図２２に示されたように、モルガネラ・モルガニイ分離菌株（ＭＭＲ２０１）由来小胞を６週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄性マウスに腹腔注射または経口で投与し、投与４日目に癌細胞株（ＣＴ２６ ｃｅｌｌ）を皮下で注射して癌モデルを作成した。癌細胞株を投与した後、モルガネラ・モルガニイ分離菌株由来小胞を腹腔注射または経口で毎日投与し、２４日目まで癌組織の大きさを測定した（図２２参照）。その結果、癌組織の大きさは、対照群である生理食塩水経口投与群に比べて、前記小胞を腹腔注射で投与したマウスと経口で投与したマウスにおいて癌組織の大きさが減少し、特に、経口で投与した場合に大きさがさらに減少した（図２３参照）。これは、モルガネラ・モルガニイ由来小胞を投与したとき、癌組織の成長を効率的に抑制することができることを意味する。
【0112】
前記記述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0113】
本発明によるモルガネラ属細菌由来小胞は、胃癌、大腸癌、すい臓癌、胆管癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、リンパ腫、心筋梗塞、心筋症、心房細動、異型狭心症、脳卒中、糖尿病、およびパーキンソン病に対する診断方法、および前記疾患または炎症性疾患に対する食品または薬物などの予防用あるいは治療用組成物に有用に用いられるものと期待される。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8a】
【図8b】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16a】
【図16b】
【図17】
【図18】
【図19a】
【図19b】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】