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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-17
(45)【発行日】2023-04-25
(54)【発明の名称】ＨＥＲ２を標的とするキメラ抗原受容体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230418BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230418BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230418BHJP
C12N 5/22 20060101ALI20230418BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230418BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230418BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230418BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230418BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20230418BHJP
C07K 16/32 20060101ALN20230418BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C12N5/0783
C12N5/22
A61K35/17
A61P35/04
A61P35/00
A61P25/00
C07K14/705
C07K16/32
【請求項の数】
12
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021133074
(22)【出願日】2021-08-18
(62)【分割の表示】P 2018543279の分割
【原出願日】2016-11-04
(65)【公開番号】P2021192617
(43)【公開日】2021-12-23
【審査請求日】2021-09-14
(31)【優先権主張番号】62/251,052
(32)【優先日】2015-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】518156369
【氏名又は名称】プライスマン，ソール ジェイ．
(73)【特許権者】
【識別番号】518156370
【氏名又は名称】フォーマン，スティーブン ジェイ．
(73)【特許権者】
【識別番号】518156381
【氏名又は名称】ブラウン，クリスティーン イー．
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(74)【代理人】
【識別番号】100091214
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 進介
(72)【発明者】
【氏名】プライスマン，ソール ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】フォーマン，スティーブン ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン，クリスティーン イー．
【審査官】佐久 敬
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５１０１０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３１４７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００９９３０９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／１００３８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１０５５２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１６４５９４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／０７０９５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ZHAO, Yangbing et al.，The Journal of Immunology，2009年，Vol. 183, No. 9，pp. 5563-5574
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２６及び２７並びに１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体はＨＥＲ２を標的化し、かつ、前記アミノ酸修飾はＨＥＲ２を標的化するためのｓｃＦｖ部分には存在しない、ＨＥＲ２を標的化するためのキメラ抗原受容体。
【請求項2】
配列番号２６及び２７並びに１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸修飾はＨＥＲ２を標的化するためのｓｃＦｖ部分には存在しない、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項3】
配列番号２６又は２７で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項4】
１～５個のアミノ酸修飾は、１～５個のアミノ酸置換である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項5】
１～５個のアミノ酸修飾は、１又は２個のアミノ酸修飾である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項6】
配列番号２６又は２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性があるアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項7】
配列番号２８～４１で表されるアミノ酸配列のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体をコードする、核酸分子。
【請求項8】
キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＮＫ細胞の集団であって、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２６及び２７並びに１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトＮＫ細胞の集団であって、ここで、前記変異体は、ＨＥＲ２を標的化し、かつ、前記アミノ酸修飾はＨＥＲ２を標的化するためのｓｃＦｖ部分には存在しない、ヒトＮＫ細胞の集団。
【請求項9】
患者のＨＥＲ２発現脳腫瘍の治療方法で用いられる、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＮＫ細胞の集団であって、前記ヒトＮＫ細胞の集団は、患者に投与され、かつ、前記キメラ抗原受容体は、配列番号２６及び２７並びに１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒトＮＫ細胞の集団であって、ここで、前記変異体は、ＨＥＲ２を標的化し、かつ、前記アミノ酸修飾はＨＥＲ２を標的化するためのｓｃＦｖ部分には存在しない、ヒトＮＫ細胞の集団。
【請求項10】
前記腫瘍が乳房から脳への転移である、請求項９のヒトＮＫ細胞の集団。
【請求項11】
Ｔ細胞が腫瘍内または脳室内に投与される、請求項９記載のヒトＮＫ細胞の集団。
【請求項12】
配列番号２６及び２７から選択されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド又は１～５個のアミノ酸修飾を有するその変異体を発現する、ヒトＮＫ細胞の集団であって、ここで、前記変異体はＨＥＲ２を標的化し、かつ、前記アミノ酸修飾はＨＥＲ２を標的化するためのｓｃＦｖ部分には存在しない、ヒトＮＫ細胞の集団。【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
腫瘍特異的Ｔ細胞を用いた免疫療法は、遺伝子操作されたＴ細胞を用いた療法も含めて、抗腫瘍治療について研究されている。しかし、このような治療法で用いられるＴ細胞は、生体内で十分な期間、活性を維持できない場合がある。また、固形腫瘍が不均一であることや、自己抗原を標的とした場合に非がん細胞へのオフターゲット効果が生じる可能性があること等のため、Ｔ細胞の腫瘍特異性が比較的低い場合もある。そのため、当技術分野では、抗腫瘍特異性と機能が改善された腫瘍特異的ながん治療法が求められている。
【0002】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）は、細胞外腫瘍認識／標的ドメイン、細胞外リンカー／スペーサー、膜貫通ドメイン及び細胞内Ｔ細胞活性化及び共刺激シグナル伝達ドメインで構成される。有害なオフターゲット作用の回避には、認識／標的ドメインの設計が重要である。ＣＡＲ腫瘍標的ドメインの大部分は、特定の抗原に対する抗体の結合の特異性を利用する抗体配列由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）である。また、ＩＬ－１３受容体であるＩＬ１３Ｒα２を発現する細胞を標的とするＩＬ－１３サイトカインＣＡＲ等、正常な受容体リガンド由来のＣＡＲ腫瘍標的ドメインの例もある。
【0003】
ＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を利用する養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍の患者において、強固で持続的な臨床効果を示してきた（非特許文献１及び２）。血液疾患における初期の成功により、固形腫瘍に対するこのアプローチのより広範な適用について、現在、熱心に研究されている。
【0004】
米国国立がん研究所のＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｅｎｄ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＳＥＥＲ）のデータによると、２０１４年の乳がんによる死亡者数は推定４万人で、主に転移性疾患が原因とされている。乳がん患者の約２５～３０％ではＨＥＲ２遺伝子が増幅しており、特に予後が悪い。標的治療を含む新しい薬剤が出現しても、ステージＩＶの疾患における全死亡率の改善はわずかである。例えば、ＨＥＲ２陽性の乳がん患者を対象とした無作為化試験では、トラスツズマブとペルツズマブという２つのＨＥＲ２標的抗体とドセタキセルの併用療法が最も有望とされているものの、トラスツズマブとドセタキセルの単独療法に比べて、全生存期間の中央値は５６．５カ月、無増悪生存期間は６．３カ月しか延長されなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ｐｒｉｃｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１５ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｎｃｏｌ
【文献】Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．２０１４ Ｂｌｏｏｄ １２３：２６２５－２６３５
【文献】Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ
【文献】Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９６９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５
【発明の概要】
【0006】
本明細書には、細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ膜貫通免疫受容体（キメラ抗原受容体または「ＣＡＲ」）が記載される。細胞外ドメインは、ＨＥＲ２を標的としたｓｃＦｖと、場合によっては、例えば、ヒトＦｅドメインの一部を含むスペーサーを含む。膜貫通部分は、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３膜貫通ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインには、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ξ）と、１つ以上の共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激ドメイン）が含まれる。
【0007】
細胞外ドメインは、Ｔ細胞の表面に発現したＣＡＲに、ＨＥＲ２を発現している細胞にＴ細胞活性を誘導させうる。当該細胞としては、特定の乳がん細胞や特定の脳がん細胞があげられる。また、細胞内領域にＣＤ３ξと直列に並んだ４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメイン等の共刺激ドメインが含まれているため、Ｔ細胞が共刺激シグナルを受け取ることができる。Ｔ細胞、例えば、患者特異的自己Ｔ細胞を操作して、本明細書に記載されるＣＡＲを発現することができ、当該操作された細胞を増殖させて、ＡＣＴに用いることができる。アルファベータＴ細胞とガンマデルタＴ細胞とともに含む、様々なＴ細胞サブセットを用いることができる。
【0008】
さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞等の他の免疫細胞で発現させることができる。本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞で患者を治療する場合、その細胞は自己Ｔ細胞または同種Ｔ細胞であることができる。ある場合、用いられる細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ＋及びＣＤ４５ＲＡ－であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋のセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）をともに含む細胞集団であるか、又は、用いられる細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴＣＭ細胞、ステムセルセントラルメモリーＴ細胞及びナイーブＴ細胞を含む細胞集団（すなわち、ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞の集団）である。ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞の集団は、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋であり、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋の細胞をともに、並びに、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をともに含む。このような細胞を用いると、他のタイプの患者特異的Ｔ細胞を用いる場合と比較して、養子移入後の細胞の長期持続性を向上させることができる。
【0009】
本明細書において記載されているのは、ＣＡＲをコードする核酸分子であり、ＣＡＲは：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ（例えば、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号１）又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；並びに、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体；を含む。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号１）又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；並びに、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体；を含む。
【0010】
様々な実施形態では、共刺激ドメインは：ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される。特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体が存在する。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体等、２つの共刺激ドメインが存在する。様々な実施形態では、１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾は置換である。
【0011】
ある場合、共刺激ドメインとＣＤ３ξシグナル伝達ドメインとの間、及び／又は、２つの共刺激ドメイン間に１～６のアミノ酸の短い配列（例えばＧＧＧ）が存在する。
【0012】
さらなる実施形態では、ＣＡＲは：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体、及び、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；及び、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１～２のアミノ酸修飾を有するその変異体；ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ又はその変異体と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（例えば、スペーサー領域は、配列番号２～１２及び４２を含む群から選択されるアミノ酸配列（表３）又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾を有するその変異体を含む）；を含み、スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含み；スペーサー領域は、１～１５０のアミノ酸を含み；スペーサーはなく；４－１ＢＢシグナル伝達ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含み；ＣＤ３ξシグナル伝達ドメインは、配列番号２１アミノ酸配列を含み；３乃至１５のアミノ酸のリンカーが、共刺激ドメインとＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する。特定の実施形態では、２つの共刺激ドメインがある場合、１つは４－１ＢＢ共刺激ドメインであり、もう一方は、ＣＤ２８及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激ドメインである。様々な実施形態では、１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾は、例えば保存的置換等の置換である。
【0013】
ある実施形態では、核酸分子は、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し；キメラ抗原受容体は、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0014】
キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団も開示され、キメラ抗原受容体は：ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及びＣＤ３ξ膜貫通ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体から選択される膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；又は、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体及び４－１ＢＢ共刺激ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体の両方）；及び、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体；を含む。様々な実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、配列番号２６～４１のうちいずれかから選択されるアミノ酸配列又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含むキメラ抗原受容体を発現するベクターを含み；ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）を含み、例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ細胞であり、又は、ヒトＴ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及びステムセルセントラルメモリー細胞の組み合わせ（ＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞）を含み、例えば、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である。いずれの場合においても、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞もＣＤ８＋細胞も含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０、８０又は９０％が、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋であり；ＣＤ３＋細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞の少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％がＣＤ８＋細胞である）。
【0015】
また、自己又は同種のヒトＴ細胞（例えば、中心記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）または中心記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞および幹中心記憶細胞の組み合わせ（すなわち、Ｔ細胞はＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である）を含む自己又は同種Ｔ細胞の集団を投与することを含む、患者のがんを治療する方法が記載され、ここで、細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％６０％、７０％、８０％はＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ細胞である。いずれの場合でも、Ｔ細胞の集団は、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたＣＤ４＋細胞もＣＤ８＋細胞も含み（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０、８０又は９０％が、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋であり；ＣＤ３＋細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞の少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％がＣＤ８＋細胞である）、キメラ抗原受容体は、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含む。様々な実施形態では、がんは、脳がん、例えば、乳がんからの転移であるＨＥＲ２発現脳がんであり；形質導入されたヒトＴ細胞は、患者からＴ細胞を取得する工程、Ｔ細胞を処理してセントラルメモリーＴ細胞を単離する工程、及び、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むウイルスベクターを用いてセントラルメモリー細胞の少なくとも一部に形質導入を行う工程、を含む方法によって調製され、ここで、キメラ抗原受容体は、配列番号２６又は２７から選択されるアミノ酸配列又は１～５（例えば１又は２）のアミノ酸修飾（例えば置換）を有するその変異体を含む。ある場合、ＣＡＲ Ｔ細胞は、脳腫瘍に直接は投与されず、代わりに、患者の脳内の脳室内空間に投与される。
【0016】
配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；５以下のアミノ酸の置換、欠失、存在又は挿入の存在を除いて、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；５以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び、２以下のアミノ酸置換の存在を除いて、配列番号２６～４１から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；も記載される。
【0017】
本開示は、本明細書において記載されるＣＡＲのいずれかをコードする核酸分子（例えば、ＣＡＲのうちの１つをコードする核酸配列を含むベクター）及び本明細書において記載されるＣＡＲのいずれかを発現する単離されたＴリンパ球も含む。
【0018】
本明細書において記載されるＣＡＲは、ＨＥＲ２結合ドメイン（例えばＨＥＲ２ ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含みうる。様々な異なるスペーサーを用いてよい。それらの一部は、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又は、ＣＨ３ドメイン又はその変異体を含む。以下の表１は、本明細書で記載されるＣＡＲで用いることができる様々なスペーサーを提供する。
【0019】
【表1】
【0020】
「アミノ酸修飾」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することをいう。当該置換は、非保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸に変化させることにより）で、又は保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸に変化させることにより）で、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるように行いうる。当該保存的変化では、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより少なくなる。以下に、アミノ酸の様々な群分けを例示する：１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；
２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ ６．０で正に荷電）。他の群はフェニル基をもつアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。
２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ ６．０で正に荷電）。他の群はフェニル基をもつアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。
【0021】
特定の実施形態では、スペーサーは、未修飾のスペーサーにおいて存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される１つ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から得られる。１つ以上の置換されるアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はその組み合わせの１つ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。以下により詳細に記載されるこのナンバリングスキームにおいて、表１のＩｇＧヒンジ配列及びＩｇＧ４ヒンジリンカー（ＨＬ）配列における最初のアミノ酸のように、表１のＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）スペーサーにおける最初のアミノ酸は２１９であり、表１のＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）スペーサーにおける最初のアミノ酸は２１９である。
【0022】
ある実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｓ２２８Ｐ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３０Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｐ２４７Ｉ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｓ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｒ２９２Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｇ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ｓ、Ｋ３３４Ａ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ又はその組み合わせのうち１つ以上の置換を含むがこれらに限定されないＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から得られる。
【0023】
特定の実施形態では、修飾されたスペーサーは、未修飾の領域に存在するものとは異なるアミノ酸残基で置換される１つ以上のアミノ酸残基を含むＩｇＧ４領域から得られる。１つ以上の置換されるアミノ酸残基は、位置２２０、２２６、２２８、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３４、２３７、２３８、２３９、２４３、２４７、２６７、２６８、２８０、２９０、２９２、２９７、２９８、２９９、３００、３０５、３０９、２１８、３２６、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３６、３３９又はその組み合わせの１つ以上のアミノ酸残基から選択されるが、これらに限定されない。
【0024】
一部の実施形態では、修飾されたスペーサーは、以下のアミノ酸残基置換：２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３０Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ａ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｅ、２３６Ａ、２３７Ａ、２３８Ｓ、２３９Ｄ、２４３Ｌ、２４７Ｉ、２６７Ｅ、２６８Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９０Ｅ、２９０Ｎ、２９２Ｐ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９８Ａ、２９８Ｇ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２９９Ａ、３００Ｌ、３０５Ｉ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２６Ａ、３２６Ｗ、３２６Ｅ、３２８Ｆ、３３０Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、３３１Ｓ、３３２Ｅ、３３３Ａ、３３３Ｓ、３３３Ｓ、３３４Ａ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、３９６Ｌ又はその組み合わせのうち１つ以上の置換を含むがこれらに限定されないＩｇＧ４領域から得られ、未修飾のスペーサーにおけるアミノ酸は、示された位置にて上記の同定されたアミノ酸で置換される。
【0025】
本明細書において論じられる免疫グロブリンのアミノ酸位置について、番号付けは、ＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキーム（参照により全内容が本願に援用される非特許文献３）による。ＥＵインデックス又は非特許文献３に記載のＥＵインデックス又はＥＵナンバリングスキームは、ＥＵ抗体の番号付けをいう（非特許文献４）。
【0026】
様々な膜貫通ドメインを用いることができる。表２は、適当な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサードメインが存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサードメインのカルボキシ末端に位置する。
【0027】
【表2】
【0028】
【表3】
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号２６）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインが、配列の下に順番に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟ＣＡＲ配列（配列番号３４）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。また、図３Ａ～８Ｅ及び本明細書中では、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζともいう。
【図2】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号２７）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインが、配列の下に順番に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟ＣＡＲ配列（配列番号３５）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。また、図３Ａ～８Ｅ及び明細書中では、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζともいう。
【図3】ＨＥＲ２特異的ＣＡＲのコンストラクト及びＣＡＲ Ｔ細胞増殖データを示す図である。
【図4】乳がん細胞株に対するＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏを示す図である。
【図5】ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの腫瘍活性に対する研究の結果を示す図である。
【図6】局所腫瘍内送達されたＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍有効性に対する研究の結果を示す図である。
【図7】ヒト同所性ＢＢＭ異種移植モデルにおけるＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の局所送達に対する研究の結果を示す図である。
【図8】ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の脳室内送達に対する研究の結果を示す図である。
【図9】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＣＤ８ヒンジＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号２８）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟ＣＡＲ配列（配列番号３６）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。
【図10】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ２２８Ｐ）－リンカー－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列（配列番号２９）を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟ＣＡＲ配列（配列番号３７）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。
【図11】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）－リンカーＩｇＧ４ ＣＨ３－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟したＣＡＲ配列（配列番号３８）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。
【図12】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）－リンカー－ＩｇＧ４ ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号３１）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟したＣＡＲ配列（配列番号３９）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。
【図13】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－リンカー－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔ（配列番号３２）のアミノ酸配列を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟したＣＡＲ配列（配列番号４０）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。
【図14】Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－リンカー－ＣＤ８ｔｍ－４１ＢＢ－ゼータ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列を示す。配列番号３３）を示す図である。様々なドメインは、配列の下に順に記載され、下線と非下線を交互に表示する。成熟したＣＡＲ配列（配列番号４１）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又は切断型ＣＤ１９を含まない。
【図15】様々なスペーサーを有する特定のさらなるＣＡＲを特徴づける研究の結果を示す図である。ＩｇＧ３（ＥＱ）は図２にあり；ＤｅｌｔａＣｈ２は図１１にあり；ＣＤ８ｈは図９にあり；ＨＬは図１０にあり；Ｌは図１４にある。
【図16】様々なＣＡＡＲを発現するＴＣＭが、ＨＥＲ２が発現しない細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲ）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＬＯ）又はＨＥＲ２の発現が多い細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＨＩ）に曝露される場合に産生されるＣＤ１０７ａ及びＩＮＦガンマを検査する研究の結果を示した図である。
【図18】様々なＣＡＡＲを発現するＴＣＭが、ＨＥＲ２の発現がない細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲ）、ＨＥＲ２の発現が少ない細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＬＯ）又はＨＥＲ２の発現が多い細胞（２３１ＢＲＨＥＲ２ＨＩ）に曝露される場合に産生されるＣＤ１０７ａ及びＩＮＦガンマを検査する研究の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0030】
以下に記載されるのは、ＨＥＲ２を標的とし、ＨＥＲ２発現乳がん並びに乳房から脳への転移に治療に有用な様々なキメラ抗原受容体の構造、構築及び特徴づけである。重要なことは、本明細書で記載されるＣＡＲをＡＣＴで用いると、脳室内又は腫瘍内送達によって脳内のＨＥＲ２発現腫瘍を治療することができることである。
【0031】
キメラ抗原（ＣＡＲ）は、少なくとも、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されず、標的に特異的に結合することができるいかなる分子をいう。例えば、ＣＡＲは、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンドを含むことができる。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメイン又は単に細胞外認識ドメインが含有する認識要素ともいう）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は、膜内にＣＡＲを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のゼータ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、場合によっては、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣによる制限を受けず、抗原に結合し、かつ、Ｔ細胞活性化を伝達することができる。したがって、ＣＡＲは、そのＨＬＡ遺伝子型に関係なく、抗原陽性腫瘍患者の集団を治療することができる「普遍的な（ユニバーサルな）」免疫受容体である。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いた養子免疫療法は、がんの治療の強力な治療戦略となりうる。
【0032】
ある場合、本明細書に記載されるＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後に、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び、細胞質シグナル伝達テールがない（アミノ酸３２３で切断されている）切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続く、ベクターを用いて作製することができる。この構成では、ＣＤ１９ｔを共発現させることにより、不活性で非免疫原性の表面マーカーが得られ、遺伝子改変細胞を正確に測定できるようになり、かつ、遺伝子改変細胞のポジティブ選択、並びに、養子縁組後の生体内の治療用Ｔ細胞の効率的な細胞追跡及び／又はイメージングが可能になる。ＣＤ１９ｔの共発現により、臨床的に利用可能な抗体及び／又は免疫毒素試薬を用いて、生体内に導入された細胞を免疫学的に標的化するマーカーがもたらされて、治療用細胞が選択的に除去され、それによって自殺スイッチとして機能する。
【0033】
本明細書中に記載されるＣＡＲは、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されるが、当技術分野で公知のいかなる手段により製造されうる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発等）により、簡便に調製し、完全なコード配列に構築することができる。
得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球細胞系、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞系の形質転換に用いられる。
得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球細胞系、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞系の形質転換に用いられる。
【0034】
非選択のＰＢＭＣ若しくは濃縮されたＣＤ３のＴ細胞、又は、濃縮されたＣＤ３若しくはメモリーＴ細胞のサブセット又はＴＣＭ若しくはＴＣＭ／ＳＣＭ／Ｎを含む、患者から単離された様々なＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現用ベクターを用いて形質導入することができる。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞のサブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、例えば、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を濃縮することによって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞のために濃縮された細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化され、例えばＣＡＲの発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクター及び生体内検出及び潜在的な生体外選択用の非免疫原性の表面マーカーである切断型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）で形質導入することができる。活性化／遺伝子修飾されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５を用いてインビトロで増殖させた後、凍結保存することができる。
【実施例1】
【0035】
２つのＨＥＲ２－ＣＡＲの構造
本明細書に記載のＨＥＲ２ ｓｃＦｖを含む１つのＣＡＲは、Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔという。このＣＡＲには、ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；Ｆｅ受容体（ＦｃＲｓ）との結合を阻害するようにＣＨ２領域内の２つの部位（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）が変異しているＩｇＧ４ Ｆｅ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ξ活性化ドメインを含む、様々な重要な特徴が含まれる。図１は、このＣＡＲのアミノ酸配列を示し、ＣＡＲ発現のモニターに用いられる切断型ＣＤＩ９配列の配列、及び、切断型ＣＤＩ９配列を融合せずにＣＡＲを作製することができるＴ２Ａリボソームスキップ配列を含む。図２に示すように、未成熟ＣＡＲは、以下の：ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、スペーサーとして機能するＩｇＧ４、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＬＬからＧＧへの配列変化を含む４－１ＢＢ共刺激ドメイン、３つのＧｌｙ配列、ＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。また、転写物には、ＣＡＲタンパク質配列には含まれないＴ２Ａリボソーム配列及び切断型ＣＤＩ９配列がコードされる。当該成熟ＣＡＲは、未成熟ＣＡＲと同一であるが、ＧＭＣＳＦシグナルペプチドがない。
本明細書に記載のＨＥＲ２ ｓｃＦｖを含む１つのＣＡＲは、Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－Ｚｅｔａ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔという。このＣＡＲには、ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；Ｆｅ受容体（ＦｃＲｓ）との結合を阻害するようにＣＨ２領域内の２つの部位（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）が変異しているＩｇＧ４ Ｆｅ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ξ活性化ドメインを含む、様々な重要な特徴が含まれる。図１は、このＣＡＲのアミノ酸配列を示し、ＣＡＲ発現のモニターに用いられる切断型ＣＤＩ９配列の配列、及び、切断型ＣＤＩ９配列を融合せずにＣＡＲを作製することができるＴ２Ａリボソームスキップ配列を含む。図２に示すように、未成熟ＣＡＲは、以下の：ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ、スペーサーとして機能するＩｇＧ４、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＬＬからＧＧへの配列変化を含む４－１ＢＢ共刺激ドメイン、３つのＧｌｙ配列、ＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。また、転写物には、ＣＡＲタンパク質配列には含まれないＴ２Ａリボソーム配列及び切断型ＣＤＩ９配列がコードされる。当該成熟ＣＡＲは、未成熟ＣＡＲと同一であるが、ＧＭＣＳＦシグナルペプチドがない。
【実施例2】
【0036】
ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ Ｔ細胞の発現に用いられるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｅｐＨＩＶ７ベクターは、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲの発現に用いることができるベクターであり、ｐＨＩＶ７ベクターから作製した。重要なことは、このベクターは、ヒトＥＦＩプロモーターを用いてＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５’配列及び３’配列はともに、以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから得られたように，ｐｖ６５３ＲＳＮに由来する。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙのＨＩＶ－Ｉ株ｐＮＬ４－３に由来する。ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列は以前に記載された。
ｅｐＨＩＶ７ベクターは、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲの発現に用いることができるベクターであり、ｐＨＩＶ７ベクターから作製した。重要なことは、このベクターは、ヒトＥＦＩプロモーターを用いてＣＡＲの発現を駆動する。ベクターの５’配列及び３’配列はともに、以前にＨＸＢｃ２プロウイルスから得られたように，ｐｖ６５３ＲＳＮに由来する。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙのＨＩＶ－Ｉ株ｐＮＬ４－３に由来する。ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列は以前に記載された。
【0037】
ｐＨＩＶ７の構築を以下のように行った。簡潔には、介在性ＳＬ３－ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を備えるｇａｇ－ｐｏｌ＋５’及び３’の末端反復配列（ＬＴＲｓ）由来の６５３ｂｐを含有するｐｖ６５３ＲＳＮを、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。つまり、工程１では、５’ＬＴＲからＲｅｖ応答配列（ＲＲＥ）までの配列で、ｐ５’ＨＩＶ－Ｉ ５Ｉを作製した後、５’ＬＴＲを、ＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去して修飾し、最初にＣＭＶエンハンサーに連結させた後、ＳＶ４０複製開始点に連結した（ｐ５’ＨＩＶ－２）。工程２では、３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングしてｐ３’ＨＩＶ－１を作製した後、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターから４００ｂｐを欠失させて、ＨＩＶ Ｕ３のシス制御要素を除去し、ｐ３’ＨＩＶ－２を形成した。工程３では、ｐ５’ＨＩＶ－３及びｐ３’ＨＩＶ－２から単離したフラグメントを連結させて、ｐＨＩＶ－３を作製した。工程４では、上流の余分なＨＩＶ配列を除去してさらにｐ３’ＨＩＶ－２をさらに修飾してｐ３’ＨＩＶ－３を作製し、ＷＰＲＥを含む６００ｂｐのＢａｍＨＩ－ＳａｌＩ断片をｐ３’ＨＩＶ－３に付加して、ｐ３’ＨＩＶ－４を作製した。工程５では、ｐＨＩＶ－３のＲＲＥをＰＣＲによってサイズダウンし、ｐＨＩＶ－３の５’断片（図示せず）及びｐ３’ＨＩＶ－４に連結させて、ｐＨＩＶ－６を作製した。工程６では、ＨＩＶ－Ｉ ｐＮＬ４－３（５５）由来のｃＰＰＴ ＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ－ＢａｍＨＩ断片をｐＮＬ４－３から増幅し、ｐＨＩＶ６のＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列の間に配置してｐＨＩＶ－７を作製した。この親プラスミドｐＨＩＶ７－ＧＦＰ（ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質）を用いて、４－プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングした。
【0038】
ウイルスゲノムをベクターに効率よくパッケージングするためには、パッケージングシグナルｐｓｉ（ψ）が必要である。。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の運搬と導入遺伝子の発現を促進する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入の効率を高めることが実証されている。
【0039】
ウイルスベクターの作製に必要なヘルパー機能は、組換えによる複製能力のあるレンチウイルスの作製確率を下げるために３つの別々のプラスミド：ｌ）ｐＣｇｐは、ウイルスベクター構築に必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする；２）ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの運搬に寄与するＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする；かつ、３）ｐＣＭＶ－Ｇは、ウイルスベクターの感染性に水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする；に分けられる。
【0040】
ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間には最小限のＤＮＡ配列相同性がある。相同性のある領域としては、ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列に位置する約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；３つのヘルパープラスミドの全てに存在するＣＭＶプロモーター配列；かつ、ヘルパープラスミドｐＣｇｐ内のＲＲＥ配列；があげられる。これらの領域における相同性のために複製可能な組換えウイルスが生成される見込みは極めて低いが、それは、多数の組換え事象が必要であるからである。さらに、得られた組換え体には、レンチウイルスの複製に必要な機能的なＬＴＲもｔａｔ配列もないであろう。
【0041】
ＣＭＶプロモーターをＥＦｌα－ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦＩｐ）に置換し、新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した。ＥＦｌｐは５６３ｂｐであり、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７内に導入した。
【0042】
野生型ウイルスの病原性に必要で、標的細胞の増殖性感染に必要なｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれてきた。さらに、当該ベクター構築物には、インタクトな３’ＬＴＲプロモーターがないため、結果として、標的細胞で発現かつ逆転写されたDNAプロウイルスゲノムのＬＴＲは不活性である。このような設計の結果、ＨＩＶ－Ｉ由来の配列はプロウイルスから転写されず、治療用の配列のみが各々のプロモーターから発現されることになる。ＳＩＮベクターのＬＴＲプロモーター活性を除去すると、宿主遺伝子の意図せぬ活性化の可能性が著しく軽減されると予想される。
【実施例3】
【0043】
患者Ｔ細胞の形質導入用の作製
患者Ｔ細胞の形質導入用ベクターは、以下のように調製することができる。ＣＡＲ、及び、場合によっては、切断型ＣＤ１９；２）ｐＣｇｐ；３）ｐＣＭＶ－Ｇ；及び４）ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２等のマーカーを発現する各プラスミドに対して、種子バンクが生成され、当該種子バンクを発酵槽に播種して、十分量のプラスミドＤＮＡを生成する。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの作製に用いる前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
患者Ｔ細胞の形質導入用ベクターは、以下のように調製することができる。ＣＡＲ、及び、場合によっては、切断型ＣＤ１９；２）ｐＣｇｐ；３）ｐＣＭＶ－Ｇ；及び４）ｐＣＭＶ－Ｒｅｖ２等のマーカーを発現する各プラスミドに対して、種子バンクが生成され、当該種子バンクを発酵槽に播種して、十分量のプラスミドＤＮＡを生成する。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの作製に用いる前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
【0044】
簡潔には、細胞を、無菌性及びウイルス汚染がないことの確認に試験された２９３Ｔワーキングセル（ＷＣＢ）から継代する。２９３Ｔ ＷＣＢ由来の２９３Ｔ細胞のバイアルを解凍する。ベクター作製及び細胞トレイン維持に適する数の１０層のセルファクトリー（ＣＦｓ）を播種に十分数の細胞となるまで、細胞を増殖させて、継代する。細胞の単一トレイン用いて作製することができる。
【0045】
レンチウイルスベクターは、最大１０ＣＦのサブバッチで作製される。同じ週に２つのサブバッチを作製することができ、１週あたり約２０Ｌのレンチウイルス上清を作製することができる。全てのサブバッチから作製された材料は、下流の処理段階でプールされ、１ロットの製品が作製される。２９３Ｔ細胞を、２９３Ｔ培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）内のＣＦに播種する。ファクトリーを、３７℃のインキュベーター内に置き、水平にして、ＣＦの層全てに細胞を均一に分布させる。２日後、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ ＣａＣｈ、２Ｘ ＨＢＳ及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を含むＣａＰＱ４法を用いて、細胞に上記の４つのレンチウイルスプラスミドを遺伝子導入する。遺伝子導入から３日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含む上清を回収し、精製して、濃縮する。ＣＦから上清を除去した後、各ＣＦから最終生成物である細胞を回収する。細胞をトリプシン処理し、遠心分離によって各ファクトリーから回収される。細胞を凍結培地に再懸濁し、凍結保存する。これらの細胞は、後に、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）の試験に用いる。
【0046】
ベクターを精製して製剤化するため、未精製の上清を膜ろ過法で洗い細胞片を除去する。宿主細胞のＤＮＡ及び残存プラスミドのＤＮＡは、エンドヌクレアーゼによる消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））で分解される。ウイルス上清を、０．４５μｍのフィルターを用いて細胞片を除去して洗浄する。洗浄された上清を、予め秤量した容器に回収し、そこにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を添加する（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残存プラスミドのＤＮＡ及び宿主ゲノムのＤＮＡをエンドヌクレアーゼで、３７℃で６時間消化する。エンドヌクレアーゼ処理された上清の最初のタンジェンシャルフローウルトラフィルトレーション（ＴＦＦ）濃縮で、ウイルスを２０倍まで濃縮し、かつ未精製の上清から残存の低分子量成分を除去する。洗浄されたエンドヌクレアーゼ処理されたウイルス上清を、流動速度を最大にして、剪断速度を４，０００秒－１以下に維持されるように設計された流速で５００ｋＤのＮＭＷＣＯを備えるホローファイバーカートリッジで循環する。ヌクレアーゼで処理された上清の透析ろ過を濃縮プロセスで開始して、カートリッジの性能を持続させる。透析ろ過緩衝液としてＰＢＳ中４％ラクトースを用いて、８０％の透過置換速度（ｐｅｒｍｅａｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｒａｔｅ）を確立する。ウイルス上清を、未精製上清の２０倍の濃度を表す目標量とし、かつ、透過液交換率を１００％として、さらに４回の交換容量で透析濾過を継続する。
【0047】
高速遠心分離技術を用いてウイルス生成物のさらなる濃縮を達成する。レンチウイルスの各サブバッチを、６℃で１６～２０時間、６０００ＲＰＭ（６，０８８ＲＣＦ）でＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ－２６ｐｌｕｓ遠心機を用いてペレット状にする。次に、各サブバッチからのウイルスペレットは、４％ラクトース含有ＰＢＳで５０ｍＬの量で再構成される。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製に対する最終製剤である。ベクター濃縮工程全体で、約２００分の１まで体積が減少する。全てのサブバッチが完了した後、材料を－８０℃に保存し、各サブバッチの試料の無菌性を試験する。試料の無菌性の確認後、サブバッチを、頻繁に攪拌して３７℃で急速解凍する。その後、クラスＩＩタイプＡ／Ｂ３バイオセイフティキャビネット内で、この材料をプールし、手動で分注する。濃縮レンチウイルスを、無菌のＵＳＰクラス６の外部ネジ付き０リングクライオバイアルに１ｍＬで充填する構成を用いる。
【0048】
レンチウイルスベクター調製物の純度を確保するため、残存宿主のＤＮＡ混入物及び残存宿主及びプラスミドのＤＮＡの導入が試験される。他の試験のうち、特に、正しいベクターが存在していることを確実にするため、ベクター同一性をＲＴ－ＰＣＲで評価する。
【実施例4】
【0049】
ＡＣＴで用いるのに適するＴ細胞の調製
ＣＡＲの発現にＴＣＭを用いる場合、適当な患者細胞を以下のように調製することができる。まず、白血球フェレーシスによって患者からＴリンパ球を得て、さらに、適当な同種又は自己Ｔ細胞のサブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作して、いかなる臨床的に許容可能な手段で患者に再投与して、抗がん療法を達成する。
ＣＡＲの発現にＴＣＭを用いる場合、適当な患者細胞を以下のように調製することができる。まず、白血球フェレーシスによって患者からＴリンパ球を得て、さらに、適当な同種又は自己Ｔ細胞のサブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作して、いかなる臨床的に許容可能な手段で患者に再投与して、抗がん療法を達成する。
【0050】
適当なＴｃＭを以下のように作製することができる。同意が得られた研究参加者から得られたアフェレーシス生成物を、フィコール処理（ｆｉｃｏｌｌｅｄ）し、洗浄し、一晩インキュベートする。次に、ＧＭＰグレードの抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ４５ＲＡ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置を用いて、細胞から単球、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞の集団を枯渇する。枯渇後、陰性画分の細胞は、ＤＲＥＧ５６－ビオチン（ＣＯＨ臨床グレード）及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置を用いて、ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ細胞を濃縮する。
【0051】
濃縮後、ＴＣＭ細胞を、完全なＸ－Ｖｉｖｏ１５に５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５に配合し、ｔｅｆｌｏｎ性（登録商標）の細胞培養バッグに移し、Ｄｙｎａｌ ＣｌｉｎＥｘ（商標）Ｖｉｖｏ ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激する。刺激から最大５日後、細胞を、１．０～０．３の感染多重度（ＭＯＩ）で所望のＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。培養は、細胞増殖に必要な完全Ｘ－Ｖｉｖｏ１５及びＩＬ－２及びＩＬ－１５サイトカインを添加しながら（細胞密度を３ｘ１０５～２ｘ１０６生細胞／ｍＬに保ち、かつ、毎週月曜日、水曜日及び金曜日の培養時にサイトカインを補給する）、４２日間まで維持される。細胞は、通常、２１日以内にこれらの条件下で約１０９の細胞まで増殖する。培養期間が終わると、細胞を収集し、２回洗浄し、臨床等級の凍結保存培地（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ ＣＳ５、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で製剤化する。
【0052】
Ｔ細胞注入の日に、凍結保存され放出された生成物を解凍し、洗浄し、再注入のために製剤化する。放出される細胞生成物を含む凍結保存されたバイアルを、液体窒素保存から取り出し、解凍し、冷却し、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄する。遠心分離後、上清を除去し、細胞を、防腐剤無添加生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈剤に再懸濁する。品質管理試験用に試料を取り出す。
【実施例5】
【0053】
ＨＥＲ２を標的とするＣＡＲの発現
図３Ａは、図１及び図２で示される２つのＨＥＲ２特異的ＣＡＲ構築物の概略図である。ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξでは、ｓｃＦｖは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、細胞内ＣＤ２８共刺激ドメイン及び細胞溶解性ＣＤ３ξドメインを含む、改変ＩｇＧ４Ｆｃリンカー（二重変異体、Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）によって膜に繋がれている。Ｔ２Ａスキップ配列により、ＣＡＲが細胞トラッキングに利用される切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質から分離される。ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξは、共刺激ドメインがＣＤ２８ではなく４－１ＢＢであること、及び、膜貫通ドメインがＣＤ２８膜貫通ドメインではなくＣＤ８膜貫通ドメインであること以外は類似する。ヒトセントラルメモリー（ＴＣＭ）細胞を、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξのいずれかを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。図３Ｂは、ヒトＴＣＭ表面表現型の代表的なＦＡＣＳデータを示す。図３Ｃは、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξのいずれかを発現するレンチウイルスベクターで形質導入されたＴＣＭにおけるＣＤ１９及びタンパク質Ｌの発現に対するアッセイの結果を示す。これらの結果からわかるように、ＣＤ１９の発現によって評価された形質導入効率は、両方のＣＡＲで同程度であった。しかし、タンパク質Ｌの発現は、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξよりもＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξで低く、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲは、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξよりも安定性が低いことを示唆された。細胞増殖の分析（図３Ｄ）から、いずれのＣＡＲもＴ細胞増殖を阻害しないことが示された。
図３Ａは、図１及び図２で示される２つのＨＥＲ２特異的ＣＡＲ構築物の概略図である。ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξでは、ｓｃＦｖは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、細胞内ＣＤ２８共刺激ドメイン及び細胞溶解性ＣＤ３ξドメインを含む、改変ＩｇＧ４Ｆｃリンカー（二重変異体、Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）によって膜に繋がれている。Ｔ２Ａスキップ配列により、ＣＡＲが細胞トラッキングに利用される切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質から分離される。ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξは、共刺激ドメインがＣＤ２８ではなく４－１ＢＢであること、及び、膜貫通ドメインがＣＤ２８膜貫通ドメインではなくＣＤ８膜貫通ドメインであること以外は類似する。ヒトセントラルメモリー（ＴＣＭ）細胞を、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξのいずれかを発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。図３Ｂは、ヒトＴＣＭ表面表現型の代表的なＦＡＣＳデータを示す。図３Ｃは、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξのいずれかを発現するレンチウイルスベクターで形質導入されたＴＣＭにおけるＣＤ１９及びタンパク質Ｌの発現に対するアッセイの結果を示す。これらの結果からわかるように、ＣＤ１９の発現によって評価された形質導入効率は、両方のＣＡＲで同程度であった。しかし、タンパク質Ｌの発現は、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξよりもＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξで低く、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲは、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξよりも安定性が低いことを示唆された。細胞増殖の分析（図３Ｄ）から、いずれのＣＡＲもＴ細胞増殖を阻害しないことが示された。
【実施例6】
【0054】
様々な乳がん細胞株に対するＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のインビトロ特性評価
ＨＥＲ２陰性細胞株（ＬＣＬリンパ腫、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ｕ８７グリオーマ）、低ＨＥＲ２発現細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、２３１ＢＲ）及び高ＨＥＲ２発現細胞株（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、ＢＢＭ１）を含む様々な乳がん細胞株を用いて、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８及びＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξを特徴づけた。図４Ａは、当該細胞株各々のＨＥＲ２発現レベルを示す。フローサイトメトリー（ＣＡＲ＋Ｔ細胞を対象とする）を用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍細胞との（低ＨＥＲ２発現）、又は、ＢＢＭ１腫瘍細胞（高いＨＥＲ２発現）との５時間の共培養後、Ｍｏｃｋ（非形質導入）、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮｙの産生で解析した。この分析結果を図４Ｂに示す。同様の研究を、他の乳がん細胞株を用いて行い、その結果を図４Ｃにまとめた。組換えＨＥＲ２タンパク質又は腫瘍標的の２４時間の培養後、ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を、ＥＬＩＳＡで測定して、分析した結果を図４Ｄに示す。
ＨＥＲ２陰性細胞株（ＬＣＬリンパ腫、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ｕ８７グリオーマ）、低ＨＥＲ２発現細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、２３１ＢＲ）及び高ＨＥＲ２発現細胞株（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、ＢＢＭ１）を含む様々な乳がん細胞株を用いて、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８及びＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξを特徴づけた。図４Ａは、当該細胞株各々のＨＥＲ２発現レベルを示す。フローサイトメトリー（ＣＡＲ＋Ｔ細胞を対象とする）を用いて、ＭＤＡ－ＭＢ－３６１腫瘍細胞との（低ＨＥＲ２発現）、又は、ＢＢＭ１腫瘍細胞（高いＨＥＲ２発現）との５時間の共培養後、Ｍｏｃｋ（非形質導入）、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮｙの産生で解析した。この分析結果を図４Ｂに示す。同様の研究を、他の乳がん細胞株を用いて行い、その結果を図４Ｃにまとめた。組換えＨＥＲ２タンパク質又は腫瘍標的の２４時間の培養後、ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を、ＥＬＩＳＡで測定して、分析した結果を図４Ｄに示す。
【実施例7】
【0055】
インビトロ抗腫瘍活性
フローサイトメトリーを用いて、Ｍｏｃｋ（非形質導入）、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ ＣＡＲ Ｔ細胞を腫瘍標的と７２時間の共培養後、腫瘍細胞死滅を評価した。この分析の結果を図５Ａに示す。全ＣＡＲ Ｔ細胞を、をＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８又はＨＥＲ２陽性ＢＢＭ１細胞との７２時間の共培養後、ＰＤ－１及びＬＡＧ－３誘導を測定し、この分析の結果を図５Ｂに示す。ＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＨＥＲ２陰性（ＬＣＬリンパ腫、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ｕ８７グリオーマ）、低ＨＥＲ２発現（ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、２３１ＢＲ）又は高ＨＥＲ２発現（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、ＢＢＭ１）である腫瘍標的と７２時間の共培養後、ＰＤ－１誘導を測定し、この分析の結果を図５Ｃに示す。これらの研究から、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξは、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξよりもＰＤ－１誘導が低いことを示唆する。エフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比の範囲が０．２５：１～２：１である腫瘍細胞死滅を、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξＣＡＲ Ｔ細胞又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ Ｔ細胞で測定した。この分析の結果は図５Ｄに示され、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξもＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξも、インビトロで腫瘍細胞死滅に効果があることが示された。ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８又はＢＢＭＩ細胞と７２時間共培養後のＣＦＳＥ増殖を、フローサイトメトリーで測定した。この分析の結果は図５Ｅに示され、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ Ｔ細胞はＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξＣＡＲ Ｔ細胞よりも増殖することが示された。
フローサイトメトリーを用いて、Ｍｏｃｋ（非形質導入）、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ ＣＡＲ Ｔ細胞を腫瘍標的と７２時間の共培養後、腫瘍細胞死滅を評価した。この分析の結果を図５Ａに示す。全ＣＡＲ Ｔ細胞を、をＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８又はＨＥＲ２陽性ＢＢＭ１細胞との７２時間の共培養後、ＰＤ－１及びＬＡＧ－３誘導を測定し、この分析の結果を図５Ｂに示す。ＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＨＥＲ２陰性（ＬＣＬリンパ腫、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ｕ８７グリオーマ）、低ＨＥＲ２発現（ＭＤＡ－ＭＢ－３６１、２３１ＢＲ）又は高ＨＥＲ２発現（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、ＢＢＭ１）である腫瘍標的と７２時間の共培養後、ＰＤ－１誘導を測定し、この分析の結果を図５Ｃに示す。これらの研究から、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξは、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξよりもＰＤ－１誘導が低いことを示唆する。エフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比の範囲が０．２５：１～２：１である腫瘍細胞死滅を、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξＣＡＲ Ｔ細胞又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ Ｔ細胞で測定した。この分析の結果は図５Ｄに示され、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξもＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξも、インビトロで腫瘍細胞死滅に効果があることが示された。ＨＥＲ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８又はＢＢＭＩ細胞と７２時間共培養後のＣＦＳＥ増殖を、フローサイトメトリーで測定した。この分析の結果は図５Ｅに示され、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ Ｔ細胞はＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξＣＡＲ Ｔ細胞よりも増殖することが示された。
【実施例8】
【0056】
生体内抗腫瘍活性
患者由来の乳房から脳への転移モデルについて、腫瘍内に送達されたＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性を評価した。図６Ａ～６Ｃは、腫瘍のＨ＆Ｅ染色である。マウスを、Ｍｏｃｋ（非形質導入）又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ Ｔ細胞で腫瘍に直接注入して処置した。図６Ｄ～６Ｆは、腫瘍の光学イメージングの結果を示し、図６Ｇ～６Ｉは、腫瘍注入後３日、８日又は１４日に局所処置したマウスに対するカプラン・マイヤー生存曲線である。これらの研究は、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ Ｔ細胞を、腫瘍に直接注入した場合、生体内で強力な抗腫瘍効力を発揮することを示す。
患者由来の乳房から脳への転移モデルについて、腫瘍内に送達されたＨＥＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の活性を評価した。図６Ａ～６Ｃは、腫瘍のＨ＆Ｅ染色である。マウスを、Ｍｏｃｋ（非形質導入）又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ Ｔ細胞で腫瘍に直接注入して処置した。図６Ｄ～６Ｆは、腫瘍の光学イメージングの結果を示し、図６Ｇ～６Ｉは、腫瘍注入後３日、８日又は１４日に局所処置したマウスに対するカプラン・マイヤー生存曲線である。これらの研究は、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξＣＡＲ Ｔ細胞を、腫瘍に直接注入した場合、生体内で強力な抗腫瘍効力を発揮することを示す。
【0057】
乳房から脳への転移のヒト異種移植モデルにおける抗腫瘍効力を評価するために、ＢＢＭ１細胞（０．２Ｍ）又はＢＴ４７４（０．１５Ｍ）をＮＳＧマウスにおいて頭蓋内に注入した。腫瘍注入後８日に、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ又はＭｏｃｋ（非形質導入）のＴ細胞（ＩＭ）を、腫瘍内に注入した。ＢＢＭＩ（図７Ａ）及びＢＴ４７４（図７Ｂ）の腫瘍を、ルシフェラーゼに基づく光学イメージングによってモニターした。カプラン・マイヤー曲線を、図７Ｃ及び図７Ｄに示す
【0058】
乳がんから脳への転移のヒト患者由来の同所性異種移植モデルも用いて、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ及びＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξのＣＡＲ Ｔ細胞を評価した。図８Ａは、ＢＢＭ １細胞（０．２Ｍ）の定位注入による腫瘍注入の領域、及び、脳心室内Ｔ細胞送達を示す。図８Ｂでは腫瘍の染色が示される。腫瘍注入から１４日後、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ξ、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢξ又はＭｏｃｋ（非形質導入）のＴ細胞（０．５Ｍ）を、腫瘍内に注入した。腫瘍成長を、ルシフェラーゼに基づく光学イメージングでモニターした。図８Ｃは、各処置群に対する流束の平均値を示し、図８Ｄは、各処置群のカプラン・マイヤー生存曲線である。
【実施例9】
【0059】
ＨＥＲ２を標的としたさらなるＣＡＲ
図９～１４は、リンカーが異なる様々なＣＡＲのアミノ酸配列を示す。具体的には、ＣＡＲは、ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間の部分の配列及び長さが異なる。膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８又はＣＤ２８ｇｇである。共刺激ドメインは、４－１ＢＢ又はＣＤ２８である。全てにＣＤ３ζ刺激ドメインがある。いずれの場合も、Ｔ２Ａスキップ配列が、細胞トラッキングに利用される切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質からＣＡＲを分離する。
図９～１４は、リンカーが異なる様々なＣＡＲのアミノ酸配列を示す。具体的には、ＣＡＲは、ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間の部分の配列及び長さが異なる。膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８又はＣＤ２８ｇｇである。共刺激ドメインは、４－１ＢＢ又はＣＤ２８である。全てにＣＤ３ζ刺激ドメインがある。いずれの場合も、Ｔ２Ａスキップ配列が、細胞トラッキングに利用される切断型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質からＣＡＲを分離する。
【0060】
図１５Ａは、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖとＣＤ８膜貫通ドメインとの間の部分の配列及び長さを除いて同一である様々なＨＥＲ２ ＣＡＲの概略図である。全てが、４－１ＢＢ共刺激ドメインとそれに続くＣＤ３ζ刺激ドメインを含む。図１５Ｂは、示されたＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで遺伝子導入されたＴＣＭにおけるＣＤ１９及びタンパク質Ｌの発現に対するアッセイの結果を示す。これらの結果からわかるように、ＣＤ１９の発現によって評価した導入効率は、両方のＣＡＲで同程度であった。しかし、タンパク質Ｌの発現は、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζよりもＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζでは低く、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲは、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζよりも安定性が低いことを示唆する。細胞増殖の分析（図１５Ｃ）から、ＣＡＲのいずれもＴ細胞増殖を阻害しないことを示す。図１６～１８は、さらなる研究の結果を示し、スペーサーが極めて短いＣＡＲ（図１４）が、高レベルのＨＥＲ２を発現するＣＡＲに対して比較的選択的であることを示す。そのようなＣＡＲは、がん細胞よりも低レベルのＨＥＲ２を発現する細胞を残すことが望ましいＨＥＲ２発現がんの治療で有用であると考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】