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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-21
(45)【発行日】2023-05-01
(54)【発明の名称】セレブロン改変化合物のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20230424BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230424BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20230424BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230424BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230424BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230424BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
A61K38/16
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2020538704
(86)(22)【出願日】2019-01-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-04-30
(86)【国際出願番号】 US2019013049
(87)【国際公開番号】W WO2019140088
(87)【国際公開日】2019-07-18
【審査請求日】2021-12-15
(31)【優先権主張番号】62/617,112
(32)【優先日】2018-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/710,401
(32)【優先日】2018-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】509307635
【氏名又は名称】セルジーン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】マリー マティスキエラ
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ チャンバーレイン
(72)【発明者】
【氏名】スザナ スツルリニ コウト
(72)【発明者】
【氏名】ガング ル
(72)【発明者】
【氏名】キャサリン スタンプ
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ ジェイ．シェルラット
(72)【発明者】
【氏名】ジュリア フイ
【審査官】高田 亜希
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１６１１１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５１７４７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００４／０２６５２３０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５２８１１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３４２７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３８１０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】GANG LU, RICHARD E. MIDDLETON, HUAHANG SUN, MARKVIC NANIONG, CHRISTOPHER J. OTT, CONSTANTINE S. MITSIADES, KWOK-KIN WONG, JAMES E. BRADNER AND WILLIAM G. KAELIN, JR.，The Myeloma Drug Lenalidomide Promotes the Cereblon-Dependent Destruction of Ikaros Proteins，SCIENCE，2013年11月28日，Vol 343, Issue 6168，pp. 305-309，DOI: 10.1126/science.1244917
【文献】Kronke, J., Fink, E., Hollenbach, P. et al，Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1α in del(5q) MDS，Nature，2015年，523，183-188，https://doi.org/10.1038/nature14610
【文献】Jurgen Knobloch & Ulrich Ruther，Shedding light on an old mystery: Thalidomide suppresses survival pathways to induce limb defects，Cell Cycle，2008年，7:9，1121-1127
【文献】Jurgen Kohlhase, Marielle Heinrich, Lucia Schubert, Manuela Liebers, Andreas Kispert, Franco Laccone, Peter Turnpenny, Robin M. Winter, William Reardon，Okihiro syndrome is caused by SALL4 mutations，Human Molecular Genetics，2002年11月01日，Volume 11, Issue 23，Pages 2979-2987，https://doi.org/10.1093/hmg/11.23.2979
【文献】Hiro Tatetsu, Nikki R. Kong, Gao Chong, Giovanni Amabile, Daniel G. Tenen, Li Chai，SALL4, the missing link between stem cells, development and cancer，Gene，2016年，Volume 584, Issue 2，Pages 111-119，https://doi.org/10.1016/j.gene.2016.02.019
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ －３３／９８
Ａ６１Ｋ ３１／３３ －３３／４４
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３５／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）セレブロン改変化合物を試料に投与すること、及び（ｂ）前記セレブロン改変化合物が、Ｓａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）の分解を誘発するかを判断することを含む方法であって、
該ＳＡＬＬ４の分解が、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用によって誘発される、前記方法。
【請求項2】
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）試料を得ること、
（ｂ）前記試料中のＳａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）の第１のタンパク質レベルを求めること、
（ｃ）前記セレブロン改変化合物を前記試料に投与すること、
（ｄ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、
（ｅ）ＳＡＬＬ４の前記第１のタンパク質レベルと前記第２のタンパク質レベルとを比較して、前記セレブロン改変化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断すること、及び
（ｆ）ＳＡＬＬ４の前記第２のタンパク質レベルが前記第１のタンパク質レベルよりも低くない場合、ＳＡＬＬ４の分解を誘発しない前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含み、
ＳＡＬＬ４の前記第１のタンパク質レベルと前記第２のタンパク質レベルとの差異が、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用によって誘発される、前記方法。
【請求項3】
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）前記試料中のＳａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）のユビキチン化レベルを求めること、
（ｃ）コントロール試料中の対照化合物により誘発されるＳＡＬＬ４のユビキチン化よりも、低下したレベルのＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発する前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含み、
ＳＡＬＬ４のユビキチン化が、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用によって誘発される、前記方法。
【請求項4】
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）Ｓａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）とセレブロンとの相互作用を判断すること、
（ｃ）コントロール試料中のＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発する対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発しない前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含む、前記方法。
【請求項5】
前記疾患または障害が、がんである、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記がんが、血液がんである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記がんが、固形がんである、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記がんが、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記がんが、多発性骨髄腫である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記がんが、リンパ腫である、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記がんが、白血病である、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
ＳＡＬＬ４の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）とセレブロンとの相互作用によって、またはＳＡＬＬ４の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１）とセレブロンとの相互作用によって、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）試料を得ること、
（ｂ）前記試料中のＳａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）の第１のタンパク質レベルを求めること、
（ｃ）前記セレブロン改変化合物を前記試料に投与すること、
（ｄ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、
（ｅ）ＳＡＬＬ４の前記第１のタンパク質レベルと前記第２のタンパク質レベルとを比較して、前記セレブロン改変化合物の催奇形性作用を判断すること、
を含み、
ＳＡＬＬ４の前記第１のタンパク質レベルと前記第２のタンパク質レベルとの差異が、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用によって誘発される、前記方法。
【請求項14】
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）前記試料中のＳａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）のユビキチン化レベルを求めることによって、前記セレブロン改変化合物の催奇形性作用を判断すること、
を含み、
ＳＡＬＬ４のユビキチン化が、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用によって誘発される、前記方法。
【請求項15】
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）Ｓａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）とセレブロンとの相互作用を判断することによって、前記セレブロン改変化合物の催奇形性作用を判断すること、
を含む、前記方法。
【請求項16】
ＳＡＬＬ４の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）とセレブロンとの相互作用によって、またはＳＡＬＬ４の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１）とセレブロンとの相互作用によって、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断する、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１月１２日に出願した米国特許仮出願第６２／６１７，１１２号及び２０１８年２月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／７１０，４０１号の優先権の権利を主張するものであり、これらの各出願の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本願は、２０１８年１月１２日に出願した米国特許仮出願第６２／６１７，１１２号及び２０１８年２月１６日に出願した米国特許仮出願第６２／７１０，４０１号の優先権の権利を主張するものであり、これらの各出願の開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【0002】
配列表
本願には、参照により、１４２４７－２６９－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔという名称で２０１９年１月８日に作成し、サイズが５７，３３０バイトであるテキストファイルとして、本願とともに提出した配列表が援用される。
本願には、参照により、１４２４７－２６９－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔという名称で２０１９年１月８日に作成し、サイズが５７，３３０バイトであるテキストファイルとして、本願とともに提出した配列表が援用される。
【0003】
１．技術分野
本発明で提供するのは、ある特定の実施形態においては、催奇形性を誘発するリスクが低減されたセレブロン改変化合物のスクリーニング方法である。さらに本発明で提供するのは、ある特定の実施形態においては、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法である。
本発明で提供するのは、ある特定の実施形態においては、催奇形性を誘発するリスクが低減されたセレブロン改変化合物のスクリーニング方法である。さらに本発明で提供するのは、ある特定の実施形態においては、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法である。
【背景技術】
【0004】
２．背景
タンパク質セレブロン（ＣＲＢＮ）には、少なくとも２つのアイソフォームが存在し、それぞれ４４２アミノ酸長及び４４１アミノ酸長であり、ＣＲＢＮは、植物からヒトまで保存されている。ヒトでは、ＣＲＢＮ遺伝子は、常染色体劣性非症候群性精神遅滞（ＡＲＮＳＭＲ）の候補遺伝子として同定されている。Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００４，６３：１９２７－１９３１を参照されたい。ＣＲＢＮは当初、ラット脳で、カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質（ＳＬＯ１）と相互作用する新規なＲＧＳ含有タンパク質として特徴付けられ、後に、ＡＭＰＫ１及びＤＤＢ１とともに、網膜内の電位依存性塩素チャネル（ＣＩＣ－２）と相互作用することが示された。Ｊｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００５，９４：１２１２－１２２４、Ｈｏｈｂｅｒｇｅｒ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２００９，５８３：６３３－６３７、Ａｎｇｅｒｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４３：５９０－５９３を参照されたい。ＤＤＢ１は元々、損傷ＤＮＡ結合タンパク質２（ＤＤＢ２）と会合するヌクレオチド除去修復タンパク質として同定された。その活性の欠損により、色素性乾皮症相補群Ｅ（ＸＰＥ）の患者において、修復が欠損する。ＤＤＢ１は、標的タンパク質のユビキチン化及びそれに続くプロテアソーム分解を媒介する多くの異なるＤＣＸ（ＤＤＢ１－ＣＵＬ４－Ｘ－ｂｏｘ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ複合体の構成要素としても機能すると見られる。ＣＲＢＮは、大脳皮質の疾患に対する治療剤の開発の標的としても特定されている。ＷＯ２０１０／１３７５４７Ａ１を参照されたい。
タンパク質セレブロン（ＣＲＢＮ）には、少なくとも２つのアイソフォームが存在し、それぞれ４４２アミノ酸長及び４４１アミノ酸長であり、ＣＲＢＮは、植物からヒトまで保存されている。ヒトでは、ＣＲＢＮ遺伝子は、常染色体劣性非症候群性精神遅滞（ＡＲＮＳＭＲ）の候補遺伝子として同定されている。Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００４，６３：１９２７－１９３１を参照されたい。ＣＲＢＮは当初、ラット脳で、カルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質（ＳＬＯ１）と相互作用する新規なＲＧＳ含有タンパク質として特徴付けられ、後に、ＡＭＰＫ１及びＤＤＢ１とともに、網膜内の電位依存性塩素チャネル（ＣＩＣ－２）と相互作用することが示された。Ｊｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００５，９４：１２１２－１２２４、Ｈｏｈｂｅｒｇｅｒ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，２００９，５８３：６３３－６３７、Ａｎｇｅｒｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００６，４４３：５９０－５９３を参照されたい。ＤＤＢ１は元々、損傷ＤＮＡ結合タンパク質２（ＤＤＢ２）と会合するヌクレオチド除去修復タンパク質として同定された。その活性の欠損により、色素性乾皮症相補群Ｅ（ＸＰＥ）の患者において、修復が欠損する。ＤＤＢ１は、標的タンパク質のユビキチン化及びそれに続くプロテアソーム分解を媒介する多くの異なるＤＣＸ（ＤＤＢ１－ＣＵＬ４－Ｘ－ｂｏｘ）Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ複合体の構成要素としても機能すると見られる。ＣＲＢＮは、大脳皮質の疾患に対する治療剤の開発の標的としても特定されている。ＷＯ２０１０／１３７５４７Ａ１を参照されたい。
【0005】
ＣＲＢＮは、サリドマイド、ポマリドミド及びレナリドマイドのような治療用化合物に結合する重要な分子標的として特定されている。これらの薬物は、ＣＲＢＮを標的とし、そのユビキチンリガーゼの基質特異性を改変して、特定のがん細胞において臨床活性を誘導する。結合した基質は、ＣＲＢＮ－ＣＲＬ４複合体によってユビキチン化され、その結果、２６Ｓプロテアソームによって分解される。ＣＲＢＮ下流の基質を特定し、ＣＲＢＮとそれらの基質との相互作用を理解することにより、有効性及び／または毒性の分子機序を定義できるようになり、有効性及び毒性プロファイルの改善した薬物をもたらし得る。
【発明の概要】
【0006】
３．発明の概要
一態様では、本発明において提供するのは、（ａ）セレブロン改変化合物を試料に投与すること、及び（ｂ）その化合物が、ＳＡＬＬ４タンパク質の分解を誘発するかを判断することを含む方法である。
一態様では、本発明において提供するのは、（ａ）セレブロン改変化合物を試料に投与すること、及び（ｂ）その化合物が、ＳＡＬＬ４タンパク質の分解を誘発するかを判断することを含む方法である。
【0007】
別の態様では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）試料を得ること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、（ｃ）その化合物をその試料に投与すること、（ｄ）その試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、（ｅ）ＳＡＬＬ４のその第１のレベルとその第２のタンパク質レベルを比較して、その化合物がＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断すること、及び（ｆ）ＳＡＬＬ４の分解を誘発しないその化合物を選択することを含む方法である。
【0008】
別の態様では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）試料を得ること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、（ｃ）その化合物をその試料に投与すること、（ｄ）その試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、（ｅ）ＳＡＬＬ４のその第１のレベルとその第２のタンパク質レベルを比較して、ＳＡＬＬ４の分解レベルを求めること、及び（ｆ）対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４の分解の低減を示す（または誘導する）その化合物を選択することを含む方法である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するセレブロン改変化合物である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４の分解は、サリドマイドによるそのＳＡＬＬ４の分解と比べて低減される。
【0009】
別の態様では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断すること、（ｃ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発しないその化合物を選択することを含む方法である。
【0010】
別の態様では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断すること、（ｃ）対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用の低減をもたらす（または誘導する）その化合物を選択することを含む方法である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用（または結合）を誘発するセレブロン改変化合物である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４の分解は、サリドマイドによるそのＳＡＬＬ４の分解と比べて低減される。
【0011】
一実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとのその相互作用は、サリドマイドの存在下における、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用と比べて低減される。
【0012】
いくつかの実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとのその相互作用は、ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）とセレブロンとの相互作用によって判断する。いくつかの実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとのその相互作用は、ＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基とセレブロンとの相互作用によって判断する。
【0013】
別の態様では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めること、（ｃ）ＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発しないその化合物を選択することを含む方法である。
【0014】
別の態様では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めること、（ｃ）対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルの低下を示す（誘導する）その化合物を選択することを含む方法である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、ＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発するセレブロン改変化合物である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な一実施形態では、そのＳＡＬＬ４のユビキチン化は、サリドマイドによるそのＳＡＬＬ４のユビキチン化と比べて低下する。
【0015】
本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、その疾患または障害は、がんである。いくつかの実施形態では、そのがんは、血液がんである。別の実施形態では、そのがんは、固形がんである。いくつかの実施形態では、そのがんは、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病からなる群から選択する。具体的な実施形態では、そのがんは、多発性骨髄腫である。別の具体的な実施形態では、そのがんは、リンパ腫である。さらに別の具体的な実施形態では、そのがんは、白血病である。別の実施形態では、その疾患または障害は、がんではない。一実施形態では、その疾患または障害は、非催奇形性治療、例えば、非催奇形性であるかまたは対照化合物による治療と比べて、催奇形性の軽減されたセレブロン改変化合物による治療を要する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、その催奇形性は、サリドマイドによる治療と比べて軽減されている。
【0016】
別の実施形態では、その疾患または障害は、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発しないか、または対照化合物による治療と比べて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用の低減を誘導するセレブロン改変化合物による治療を要する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用は、サリドマイドによる治療と比べて低減されている。
【0017】
別の実施形態では、その疾患または障害は、ＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発しないか、または対照化合物による治療と比べて、ＳＡＬＬ４のユビキチン化の軽減を誘導するセレブロン改変化合物による治療を要する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４のユビキチン化は、サリドマイドによる治療と比べて軽減されている。
【0018】
別の実施形態では、その疾患または障害は、ＳＡＬＬ４の分解を誘発しないか、または対照化合物による治療と比べて、ＳＡＬＬ４の分解の低減を誘導するセレブロン改変化合物による治療を要する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４の分解は、サリドマイドによる治療と比べて低減される。
【0019】
別の態様では、本発明において提供するのは、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）試料を得ること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、（ｃ）その化合物をその試料に投与すること、（ｄ）その試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、（ｅ）ＳＡＬＬ４のその第１のレベルとその第２のタンパク質レベルを比較して、その化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断することによって、その化合物の催奇形性を判断することを含む方法である。
【0020】
さらに別の態様では、本発明において提供するのは、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）そのセレブロン改変化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めることによって、その化合物の催奇形性を判断することを含む方法である。
【0021】
さらに別の態様では、本発明において提供するのは、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断することを含み、ＳＡＬＬ４とセレブロンとのその相互作用によって、催奇形性の可能性が示される方法である。いくつかの実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとのその相互作用は、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの物理的結合である。
【0022】
いくつかの実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用は、ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）とセレブロンとの相互作用によって判断する。いくつかの実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用は、ＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１）とセレブロンとの相互作用によって判断する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
４．図面の簡単な説明
【図1A】特定のＳＡＬＬ４ジンクフィンガードメイン（４０５～４３２位のアミノ酸）が、サリドマイド依存的に、セレブロン－ＣＲＬ４によって顕著にユビキチン化されることを示している（ＤＭＳＯは、ネガティブコントロールである）。Ｉｋａｒｏｓのジンクフィンガードメイン（１４０～１６８位のアミノ酸）のユビキチン化をポジティブコントロールとして使用した。
【0024】
【図1B】個々のＳＡＬＬ４ジンクフィンガーと、セレブロンと結合するＩｋａｒｏｓ及びＺＦＰ９１のジンクフィンガーをアラインメントしたものを示している。重要なグリシンの位置が強調表示されている。
【0025】
【図1C】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ヒト及びウサギのＳＡＬＬ４ジンクフィンガーは、セレブロン－ＣＲＬ４の直接的なサリドマイド依存性基質であるが、マウスＳＡＬＬ４は、認識されないことを示している。パネルａは、ＳＡＬＬ４Ａタンパク質の概略図であり、ジンクフィンガードメインが、四角で囲まれている。デグロンのグリシンを含むジンクフィンガーは、☆で強調表示されている。パネルｂには、個々のＭＢＰタグ付加ＳＡＬＬ４ジンクフィンガーにおいて、サリドマイドの不在下（ＤＭＳＯ、ビヒクルコントロール）または存在下（ｔｈａｌ）で、セレブロン－ＣＲＬ４によるユビキチン化について試験した結果が示されている。ユビキチン化反応物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離してから、抗ＭＢＰウエスタンブロットを行った。ＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２（ＺＦ２、４１０～４３２位のアミノ酸）は、サリドマイド依存的に、セレブロン－ＣＲＬ４によって効率的にユビキチン化されたが、ＳＡＬＬ４ジンクフィンガー４（ＺＦ４、５９４～６１６位のアミノ酸）のユビキチン化は弱かった。パネルｃには、ＳＡＬＬ４ジンクフィンガーのユビキチン化が、β－ヘアピンセレブロン結合モチーフ内の重要なグリシンに依存していることが示されている。ＭＢＰタグを付加したＷＴ ＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２及びＧ４１６Ａ ＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離及び抗ＭＢＰ抗体によるウエスタンブロッティングの前に、ユビキチン化について試験した。重要なグリシンの変異によって、ユビキチン化が有意に軽減され、このＳＡＬＬ４ジンクフィンガーが、証明されたグリシン含有β－ヘアピンモチーフを利用して、セレブロンと結合することが示された。「－」は、サリドマイドを含むが、ＡＴＰを含まない完全反応物を示している。パネルｄには、ウサギセレブロンは、ウサギＳＡＬＬ４を標的とし得るが、マウスセレブロンまたはヒトセレブロンのいずれも、マウスＳＡＬＬ４を標的とできないことが示されている。ヒトＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２、またはオルソログのウサギジンクフィンガー及びマウスジンクフィンガーにおいて、示されているように、ヒトセレブロン、ウサギセレブロンまたはマウスセレブロンによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのユビキチン化について試験した。ウサギセレブロンによるウサギジンクフィンガー２（３６２～３８９位のアミノ酸）のユビキチン化では、効率性は、ヒトセレブロンによるヒトＳＡＬＬ４のユビキチン化と同程度である。これに対して、マウスＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２（４１５～４３７位のアミノ酸）は、マウスセレブロンまたはヒトセレブロンによって、効率的にはユビキチン化されない。「－」は、サリドマイドを含むが、ＡＴＰを含まない完全反応物を示している。パネルｂ～ｄの結果はそれぞれ、３回の独立した実験の代表的なものである。
【0026】
【図1D】ＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２（４１０～４３２位のアミノ酸）におけるＧ４１６Ａという変異、及びＳＡＬＬ４ジンクフィンガー４（５９４～６１６位のアミノ酸）におけるＧ６００Ａという変異によって、Ｉｋａｒｏｓ及びＺＦＰ９１のセレブロン結合ジンクフィンガーの同様の変異と同様に、そのそれぞれのジンクフィンガーのユビキチン化が、有意に軽減されたことを示しており、ＳＡＬＬ４ジンクフィンガーが、証明されたグリシン含有モチーフを利用して、セレブロンに結合することが示されている。ＭＢＰタグを付加した野生型ＳＡＬＬ４ジンクフィンガー及びグリシン変異ＳＡＬＬ４ジンクフィンガーを個々に精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離及び抗ＭＢＰ抗体によるウエスタンブロッティングの前に、精製したセレブロン－ＣＲＬ４によるユビキチン化についてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。結果は、３回の独立した実験の代表的なものである。
【0027】
【図1E】ヒトセレブロン、ウサギセレブロン及びマウスセレブロンをアラインメントしたものを示しており、種間のアミノ酸の違いが示されている。Ｅ３７７及びＶ３８８は、ヒトにおいて、基質の結合に不可欠であり、マウスにおいて、基質の結合を阻害するものであることが示されたとともに、強調表示されている。ウサギでは、これらの位置に、ヒトアミノ酸が見られる。複数配列のアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏ（１．２．４）を用いて行った。
【0028】
【図1F】ヒトＳＡＬＬ４、ウサギＳＡＬＬ４及びマウスＳＡＬＬ４をアラインメントしたものを示しており、種間のアミノ酸の違いが示されている。セレブロン－ＣＲＬ４＋サリドマイドによって強くユビキチン化されるヒトジンクフィンガー２が、強調表示されている。セレブロンとの結合のために重要なグリシン残基が示されている。複数配列のアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏ（１．２．４）を用いて行った。
【0029】
【図1G】ＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２骨格の構造モデル（左）、及びサリドマイドの存在下で、ＳＡＬＬ４ジンクフィンガーが結合しているセレブロンの構造モデル（右）を示しており、ヒトとのアミノ酸配列の違いが、強調表示されている。ＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２は、ウサギでは１００％保存されているが、マウスでは、アミノ酸の違いが５つ見られる。ウサギセレブロンでは、基質結合部位の周囲領域に、アミノ酸の違いは見られないが、マウスセレブロンは、サリドマイド結合ポケットを取り囲む２つのアミノ酸の違い（Ｅ３７７Ｖ及びＶ３８８Ｉ）を含み、セレブロンネオ基質の結合を阻害する。
【0030】
【図1H】マウスＳＡＬＬ４ジンクフィンガーが、ヒトまたはマウスのセレブロンによって、効率的にはユビキチン化されないことを示している。パネルａは、マウスＳＡＬＬ４Ａタンパク質の概略を示しており、ジンクフィンガードメインが、四角で囲まれている。デグロンのグリシンを含むジンクフィンガーは、☆で強調表示されている。パネルｂには、個々のＭＢＰタグ付加ＳＡＬＬ４ジンクフィンガーにおいて、サリドマイドの不在下（ＤＭＳＯ、ビヒクルコントロール）または存在下（ｔｈａｌ）で、マウスセレブロン（左パネル）またはヒトセレブロン（右パネル）のいずれかによるユビキチン化について試験した結果が示されている。ユビキチン化反応物は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離してから、抗ＭＢＰによるウエスタンブロットを行った。比較のために、セレブロンと結合するＺＦＰ９１ジンクフィンガー（３９５～４２３位のアミノ酸、ヒト、ウサギ及びマウスの間で１００％保存されている）、ならびにヒトＳＡＬＬ４ジンクフィンガー２（ＺＦ２、４１０～４３２位のアミノ酸）が示されており、この両方とも、サリドマイド依存的に、ヒトセレブロンによって効率的にユビキチン化される。パネルｃには、セレブロンと結合するＺＦＰ９１ジンクフィンガー（３９５～４２３位のアミノ酸、ヒト、ウサギ及びマウスの間で１００％保存されている）において、ヒトセレブロン、ウサギセレブロン及びマウスセレブロンによるユビキチン化について試験した結果が示されている。ＺＦＰ９１は、ヒトセレブロン及びウサギセレブロンによって効率的にユビキチン化できるが、マウスセレブロンによってはユビキチン化できない。これにより、ＺＦＰ９１は、ヒト、ウサギ及びヒト化セレブロンマウスにおいては分解されるが、野生型マウスでは分解されないことが示されている。パネルｂ及びｃの結果は、３回の独立した実験の代表的なものである。
【0031】
【図2】細胞内でのＳＡＬＬ４の分解が、化合物及びセレブロンに依存的なものであり、Ｇ４１６からＡ４１６への変異によって、ＳＡＬＬ４のこの分解が阻害されることを示している。
【0032】
【図3】共免疫沈降によって示した場合に、細胞内でのＳＡＬＬ４とセレブロンとの結合が、化合物に依存的なものであり、Ｇ４１６の変異によって阻害されることを示している。
【0033】
【図4】各種のがん細胞株において、短期間暴露（Ｓ．Ｅ）または長期間暴露（Ｌ．Ｅ．）の後に、内在性ＳＡＬＬ４が化合物依存的に分解されたことを示している。
【0034】
【図5】ＳＡＬＬ４のＩＨＣ染色によって示した場合に、サリドマイドが、用量依存的に、ウサギ精巣中のＳＡＬＬ４レベルを低下させることを示している。
【0035】
【図6】ＳＡＬＬ４のＩＨＣ染色によって示した場合に、サリドマイドが、ウサギ胚においてＳＡＬＬ４レベルをダウンレギュレートさせることを示している。雌の妊娠ウサギを１８０ｍｇ／ｋｇのサリドマイドで処置し、受精から１２日後に胚を調べた。胚を固定し、ＳＡＬＬ４（上パネル）及びビメンチンＣ（下パネル）を染色し、免疫組織化学法によって調べた。すべての組織は、ヘマトキシリンブルーで対比染色した。画像は、各群においてｎ＝１０の胚の代表的なものである。
【0036】
【図7A】ｉＰＳ細胞におけるＳＡＬＬ４タンパク質のレベルの低下が、サリドマイド及びセレブロンに依存することを示している。ＣＲＢＮ野生型（ＷＴ）ヒトｉＰＳ細胞及びＣＲＢＮノックアウト（－／－）ヒトｉＰＳ細胞の全細胞溶解液のイムノブロット解析を行った。細胞を、ＤＭＳＯビヒクルコントロール（－）、または示されている濃度のサリドマイド（Ｔｈａｌ）で１６時間処理した（ｎ＝４、生物学的複製物）。
【0037】
【図7B】ｉＰＳ細胞におけるＳＡＬＬ４タンパク質のレベルのサリドマイド依存的な低下が、ＮＥＤＤ化依存的かつプロテアソーム依存的であることを示している。１μＭのＭＬＮ４９２４または１０μＭのＭＧ１３２の存在下または不在下で、ＤＭＳＯ（－）またはＴｈａｌ（＋）で６時間処理したヒトｉＰＳ細胞の全細胞溶解液のイムノブロット解析を行った（ｎ＝２、生物学的複製物）。
【0038】
【図7C】ＧＳＴ－ＣＲＢＮ及びＳＡＬＬ４バリアントを安定的に発現するＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３ＨＥＫ細胞の全細胞溶解液のイムノブロット解析結果を示している。示されているように、細胞を４０μＭのサリドマイド（＋）またはビヒクルコントロールのＤＭＳＯ（－）で１６時間処理した（ｎ＝２、生物学的複製物）。
【0039】
【図7D】ＧＳＴ－ＣＲＢＮ及びＳＡＬＬ４バリアントを安定的に発現するＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３ＨＥＫ細胞の抗ＨＡ免疫沈降物（上パネル）及び全細胞溶解液（下パネル）のイムノブロット解析結果を示している。示されているように、すべての細胞を１μＭのＭＬＮ４９２４、及び４０μＭのサリドマイド（＋）またはビヒクルコントロールのＤＭＳＯ（－）で８時間処理した（ｎ＝２、生物学的複製物）。
【0040】
【図7E】ヒトｉＰＳ細胞におけるＳＡＬＬ４ ｍＲＮＡのレベルのｑＲＴ－ＰＣＲ解析によって、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルの低下が、転写のダウンレギュレーションによるものではないことが示されていることを示している。ＤＭＳＯまたは２０μＭのサリドマイド（ＴＨＡ）で１６時間処理したヒトｉＰＳ細胞に対して、定量ＲＴ－ＰＣＲ解析を行った。ＳＡＬＬ４及びＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）の相対的なｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨによって正規化した（ｎ＝２、生物学的複製物）。
【0041】
【図8】ウサギにおいてサリドマイドによる処理を行うと、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルが低下するが、野生型マウスまたはヒトセレブロンを発現するマウスでは低下しないことを示している。ウサギ、野生型マウス及びヒト化セレブロンマウスの精巣で、ＳＡＬＬ４及びＺＦＰ９１のタンパク質レベルを免疫組織化学法によって調べた。左パネルには、１５０ｍｇ／ｋｇのサリドマイドでウサギを処理した場合に、ＺＦＰ９１及びＳＡＬＬ４の両方が分解されたことが示されている。中央パネルには、野生型マウスを１０００ｍｇ／ｋｇのサリドマイドで処理した場合には、ＺＦＰ９１またはＳＡＬＬ４のいずれも、有意には分解されなかったことが示されている。右パネルには、ｈｕＣＲＢＮマウスを１０００ｍｇ／ｋｇのサリドマイドで処理した場合に、ＺＦＰ９１は分解されたが、ＳＡＬＬ４は分解されなかったことが示されている。ｈｕＣＲＢＮマウスは、７日処置して、精巣を採取し、免疫組織化学法によって調べた（マウス種あたり処置群あたりｎ＝３匹）。
【0042】
【図9】未処置のウサギの胚とサリドマイドで処置したウサギの胚の肢芽において、ＳＡＬＬ４ ｍＲＮＡのレベルが同程度であったことを示している。ウサギ胚の肢芽において、ＳＡＬＬ４ ｍＲＮＡ転写産物をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって可視化した。
【0043】
【図10】ヒト化セレブロンノックインマウスの概略を示している。
【0044】
【図11】サリドマイドで処置したｈｕＣＲＢＮマウスにおいて、四肢欠損が観察されなかったことを示している。ビヒクルで処置したマウスの骨格写真が左側に示されており、１０００ｍｇ／ｋｇのサリドマイドで処置したｈｕＣＲＢＮトランスジェニックマウスが右側に示されている。骨の可視化のために、胎児は、アリザリンレッドＳで準備した。
【発明の詳細な説明】
【0045】
５．発明の詳細な説明
本発明で提供する方法は部分的には、ＳＡＬＬ４が、セレブロン－ＣＲＬ４によるユビキチン化の直接的な化合物依存性基質であるという所見に基づいている。例えば、下記の第６節の実施例に示されているように、ＳＡＬＬ４は、ウサギの精巣及び発育中のウサギ胚において、サリドマイドによる処理によってダウンレギュレーションされる。本明細書に示さているデータによって、ＳＡＬＬ４のダウンレギュレーションが、サリドマイドのようなセレブロン改変化合物による治療によって誘発される催奇形性作用の大きな動因であることが示されている。したがって、ＳＡＬＬ４レベルを利用して、セレブロン改変化合物の毒性を判断することによって、生殖毒性及び／または胚障害のリスクが低減された化合物のスクリーニング及び選択を可能にできる。
本発明で提供する方法は部分的には、ＳＡＬＬ４が、セレブロン－ＣＲＬ４によるユビキチン化の直接的な化合物依存性基質であるという所見に基づいている。例えば、下記の第６節の実施例に示されているように、ＳＡＬＬ４は、ウサギの精巣及び発育中のウサギ胚において、サリドマイドによる処理によってダウンレギュレーションされる。本明細書に示さているデータによって、ＳＡＬＬ４のダウンレギュレーションが、サリドマイドのようなセレブロン改変化合物による治療によって誘発される催奇形性作用の大きな動因であることが示されている。したがって、ＳＡＬＬ４レベルを利用して、セレブロン改変化合物の毒性を判断することによって、生殖毒性及び／または胚障害のリスクが低減された化合物のスクリーニング及び選択を可能にできる。
【0046】
５．１ 定義
「セレブロン」または「ＣＲＢＮ」という用語、及び類似の用語は、ヒトＣＲＢＮタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７３８６のヒトＣＲＢＮアイソフォーム１またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１６６９５３のヒトＣＲＢＮアイソフォーム２（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される））のようないずれかのＣＲＢＮのアミノ酸配列を含むポリペプチド（「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では同義的に用いる）と、関連するポリペプチド（そのＳＮＰバリアントを含む）を指す。関連するＣＲＢＮポリペプチドには、ある特定の実施形態では、ＣＲＢＮ活性を保持し、及び／または抗ＣＲＢＮ免疫応答を起こすのに充分であるアレルバリアント（例えばＳＮＰバリアント）、スプライスバリアント、断片、誘導体、置換バリアント、欠失バリアント、挿入バリアント、融合ポリペプチド及び種間ホモログが含まれる。
「セレブロン」または「ＣＲＢＮ」という用語、及び類似の用語は、ヒトＣＲＢＮタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５７３８６のヒトＣＲＢＮアイソフォーム１またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１６６９５３のヒトＣＲＢＮアイソフォーム２（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される））のようないずれかのＣＲＢＮのアミノ酸配列を含むポリペプチド（「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では同義的に用いる）と、関連するポリペプチド（そのＳＮＰバリアントを含む）を指す。関連するＣＲＢＮポリペプチドには、ある特定の実施形態では、ＣＲＢＮ活性を保持し、及び／または抗ＣＲＢＮ免疫応答を起こすのに充分であるアレルバリアント（例えばＳＮＰバリアント）、スプライスバリアント、断片、誘導体、置換バリアント、欠失バリアント、挿入バリアント、融合ポリペプチド及び種間ホモログが含まれる。
【0047】
本明細書で使用する場合、「化合物」及び「治療用化合物」という用語は、同義的に用いる。化合物の非限定的な例としては、下記の第５．４節に開示されているものが挙げられる。本開示の例示的な化合物または治療用化合物は、セレブロン改変化合物である。
【0048】
「セレブロン改変化合物」（または「ＣＲＢＮ改変剤」）という用語は、ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を直接または間接的に調節する分子を指す。いくつかの実施形態では、「セレブロン改変化合物」は、ＣＲＢＮに直接結合するか、ＣＲＢＮタンパク質のコンホメーション変化を誘導するか、またはＣＲＢＮタンパク質の表面を変化させることができる。別の実施形態では、セレブロン改変化合物は、ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の他のサブユニットに直接結合できる。
【0049】
本明細書で使用する場合、「免疫調節化合物」または「免疫調節薬」という用語は概して、免疫応答を何らかの方法で改変できる分子または薬剤を指す。
【0050】
本明細書で使用する場合、「がん」という用語には、固形がん及び血液がんが含まれるが、これらに限らない。「がん」という用語は、組織または器官の疾患を指し、膀胱癌、骨癌、血液がん、脳癌、乳癌、頸癌、胸部癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ節癌、肺癌、口腔癌、頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌及び子宮癌が挙げられるが、これらに限らない。具体的ながんとしては、進行性悪性腫瘍、アミロイドーシス、神経芽腫、髄膜腫、血管周囲細胞腫、多発性脳転移、多形性膠芽腫、膠芽腫、脳幹グリオーマ、予後不良の悪性脳腫瘍、悪性グリオーマ、再発性悪性グリオーマ、退形成星性細胞腫、退形成乏突起神経膠腫、神経内分泌腫瘍、直腸腺癌、結腸直腸癌（ステージ３及びステージ４の結腸直腸癌を含む）、切除不能な結腸直腸癌、転移性肝細胞癌、カポジ肉腫、核型急性骨髄芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、悪性胸水中皮腫症候群、腹膜癌、漿液性乳頭状癌、婦人科肉腫、軟部組織肉腫、強皮症、皮膚血管炎、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、平滑筋肉腫、進行性骨化性線維異形成症、ホルモン抵抗性前立腺癌、切除後のハイリスク軟部組織肉腫、肝細胞癌、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、くすぶり型骨髄腫、無症候性骨髄腫、卵管癌、アンドロゲン非依存性前立腺癌、アンドロゲン依存性ステージＩＶ非転移性前立腺癌、ホルモン非感受性前立腺癌、化学療法非感受性前立腺癌、甲状腺乳頭癌、濾胞状甲状腺癌、甲状腺髄様癌及び平滑筋腫が挙げられるが、これらに限らない。
【0051】
本明細書で使用する場合、「血液がん（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎｅ ｃａｎｃｅｒ）」または「血液がん（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｃａｎｃｅｒ）」とは、体の造血系及び免疫系（骨髄組織及びリンパ組織）の癌を指す。このような癌としては、白血病、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫）、ホジキン病（ホジキンリンパ腫ともいう）及び骨髄腫が挙げられる。一実施形態では、その骨髄腫は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、その白血病は例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ヒトリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）白血病、肥満細胞症またはＢ細胞急性リンパ芽球性白血病である。いくつかの実施形態では、そのリンパ腫は例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞免疫芽球性リンパ腫、小非分割細胞性リンパ腫、ヒトリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）白血病／リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ＡＩＤＳ関連性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質転換リンパ腫、縦隔原発（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、リヒタートランスフォーメーション、節性辺縁帯リンパ腫またはＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。一実施形態では、その血液がんは、例えば、ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫または辺縁帯リンパ腫を含む緩慢性リンパ腫である。そのリンパ腫は、新たに診断されたものであり、再発性であり、難治性であり、及び／または従来の療法に対して耐性であることができる。
【0052】
「白血病」という用語は、造血組織の悪性新生物を指す。白血病としては、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病及び急性骨髄芽球性白血病が挙げられるが、これらに限らない。白血病は、新たに診断されたものであり、再発性であり、難治性であり、及び／または従来の療法に対して耐性であることができる。
【0053】
「骨髄異形成症候群」という用語は、血液（赤血球、白血球（リンパ球以外）及び血小板（またはその前駆細胞である巨核球））の細胞成分のうちの１つ以上の産生の異常によって特徴付けられる血液学的状態を指し、不応性貧血（ＲＡ）、環状鉄芽球を伴うＲＡ（ＲＡＲＳ）、芽球過剰のＲＡ（ＲＡＥＢ）、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）、単一血球系統の異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＵＤ）、分類不能型骨髄異形成症候群（ＭＤＳ－Ｕ）、ｄｅｌ（５ｑ）単独の染色体異常を伴う骨髄異形成症候群、治療関連骨髄性腫瘍及び慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）という障害が挙げられる。
【0054】
本明細書で使用する場合、「前骨髄球性白血病」または「急性前骨髄球性白血病」とは、骨髄系の細胞における成熟血液細胞不全と、前骨髄球という未熟細胞の過剰が見られる、骨髄の悪性腫瘍を指す。その白血病は通常、１５番染色体及び１７番染色体の領域の転座によって特徴付けられる。
【0055】
本明細書で使用する場合、「急性リンパ芽球性白血病」としても知られる「急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）」とは、初期の非顆粒性白血球、すなわちリンパ球の異常な成長または発生を原因とする悪性疾患を指す。
【0056】
本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞白血病」とは、Ｔリンパ球またはＴ細胞と呼ばれる特定のリンパ系細胞が悪性である疾患を指す。Ｔ細胞は、通常は、ウイルス感染細胞、外来細胞及びがん細胞を攻撃するとともに、免疫応答を調節する物質を産生することができる白血球である。
【0057】
本明細書で使用する場合、別段に定められていない限り、「治療する」、「治療すること」及び「治療」という用語は、患者が所定の疾患または障害に罹患している際に行う措置であって、その疾患もしくは障害の重症度、その疾患もしくは障害の症状を軽減するか、またはその疾患または障害の進行を遅らせるかもしくは減速させる措置を指す。一実施形態では、その疾患または障害は、がんである。
【0058】
本明細書で使用する場合、化合物の「治療上有効な量」という用語は、疾患または障害の治療または管理の際に治療効果をもたらすか、またはその疾患もしくは障害の存在と関連する１つ以上の症状を遅らせるかもしくは最小限に抑えるのに充分な量である。化合物の治療上有効な量とは、治療剤単独の量、または他の療法剤と組み合わせた場合の治療剤の量であって、疾患または障害の治療または管理の際に治療効果をもたらす量を意味する。「治療上有効な量」という用語には、治療全体を改善するか、疾患もしくは障害の症状もしくは原因を軽減もしくは回避するか、または別の治療剤の治療効力を高める量を含めることができる。その用語は、研究者、獣医、医師または臨床医が追求している、生体分子（例えば、タンパク質、酵素、ＲＮＡもしくはＤＮＡ）、細胞、組織、系、動物またはヒトの生物学的応答または医学的応答を誘起するのに充分な化合物量も指す。
【0059】
「調節する」という用語は、本明細書で使用する場合、分子または生体機能の活性または機能を増強または低減することのように、分子または生体機能の活性を制御することを指す。
【0060】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語（本明細書では同義的に用いられている）は、３つ以上のアミノ酸が連続した配列で、ペプチド結合を通じて連結されているアミノ酸ポリマーを指す。「ポリペプチド」という用語には、タンパク質、タンパク質断片、タンパク質類似体、オリゴペプチドなどが含まれる。「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、ペプチドを指すこともできる。ポリペプチドを構成するアミノ酸は、天然由来であっても、合成したものであってもよい。ポリペプチドは、生体試料から精製できる。ポリペプチド、タンパク質またはペプチドには、修飾されたポリペプチド、タンパク質及びペプチド、例えば、糖ポリペプチド、糖タンパク質もしくは糖ペプチド、またはリポポリペプチド、リポタンパク質もしくはリポペプチドも含まれる。
【0061】
「レベル」という用語は、分子の量、蓄積量または比率を指す。レベルは、例えば、遺伝子によってコードされたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成量もしくは合成速度、遺伝子によってコードされたポリペプチドもしくはタンパク質の合成量もしくは合成速度、または細胞もしくは生体液に蓄積された生体分子の合成量もしくは合成速度によって表すことができる。いくつかの実施形態では、「レベル」という用語は、試料中の分子の絶対量または分子の相対量を定常状態または非定常状態の条件下で求めたものを指す。
【0062】
「求めること」、「測定すること」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」及び「アッセイすること」という用語は、本明細書で使用する場合、概して、いずれかの形態の測定を指し、ある要素が存在するか否かを判断することを含む。これらの用語には、定量的判断及び／または定性的判断が含まれる。評価は、相対的評価であっても、絶対的評価であってもよい。「～の存在を判断すること」には、存在するものの量を求めること、及びその存在または不在を判断することを含めることができる。
【0063】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドで構成されたいずれかの長さのポリマー、または合成により作製した化合物であって、２本の天然の核酸と同様に、配列特異的に天然の核酸とハイブリダイズできる（例えば、ワトソン・クリック塩基対相互作用に関与できる）化合物を説明する目的で、同義的に用いられている。「複数の塩基」（または「１つの塩基」）という用語は、ポリヌクレオチド配列との関係で本明細書で使用する場合、「複数のヌクレオチド」（または「１つのヌクレオチド」）、すなわち、ポリヌクレオチドのモノマーサブユニットと同義である。「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリン塩基及びピリミジン塩基を含有する部分のみならず、修飾された他の複素環型塩基も含有する部分を含むように意図されている。このような修飾物としては、メチル化プリンもしくはメチル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、アルキル化リボース、またはその他の複素環が挙げられる。加えて、「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語には、従来のリボース糖及びデオキシリボース糖のみならず、他の糖も含有する部分が含まれる。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分にも修飾を含み、例えば、そのヒドロキシル基のうちの１つ以上が、ハロゲン原子もしくは脂肪族基で置き換えられているか、またはエーテルもしくはアミンなどに官能化されている。「類似体」とは、模倣体、誘導体として文献で認識されている構造的特徴を有する分子、類似の構造を有する分子、または他の同様の用語を指し、例えば、非天然ヌクレオチドが組み込まれたポリヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体（２’－修飾ヌクレオシドなど）、ペプチド核酸、オリゴマーヌクレオシドホスホネート、及び置換基（保護基または連結部分など）が付加されている任意のポリヌクレオチドが挙げられる。
【0064】
本明細書で使用する場合、「結合する」という用語は、直接的または間接的な結合を示す。「結合する」という用語は、ある特定の実施形態では、２分子間の直接的な物理的相互作用を意味する。化学的構造との関係においては、「結合する」とは、２つの部分を直接連結するか、または２つの部分を間接的に（例えば、その分子の連結基もしくは任意の他の介在部分を介して）連結する化学結合が存在することを指してよい。その化学結合は、共有結合、イオン結合、配位錯体、水素結合、ファンデルワールス相互作用または疎水性スタッキングであっても、複数のタイプの化学結合の特徴を示すものであってもよい。特定のケースでは、「結合する」には、その結合が直接的である実施形態、及びその結合が間接的である実施形態が含まれる。本明細書で使用する場合、「セレブロンに結合する」には、セレブロンへの直接的な結合、及びＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の他のサブユニットへの結合の両方が含まれる。
【0065】
「試料」という用語は、本明細書で使用する場合、必須ではないが、典型的には流体形態で、対象となる構成成分を１つ以上含む物質または物質の混合物に関するものである。試料は、「生体試料」であることができ、「生体試料」とは、生体組織または生体液由来の試料を含め、生体対象から得た試料であって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで取得または採取した試料を指す。生体試料には、罹患細胞または罹患組織、例えば前がん細胞、前がん組織、がん細胞またはがん組織を含む生体対象領域に由来する試料も含まれる。このような試料は、哺乳動物から単離した器官、組織及び細胞であることができるが、これらに限らない。他の例示的な試料としては、細胞溶解液、細胞培養液、細胞株、単離タンパク質（複合体中のものを含む）、合成タンパク質（複合体中のものを含む）、細胞抽出物、操作した細胞（例えば、遺伝子改変細胞またはトランスフェクション細胞）、細菌細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞）、昆虫細胞（例えばｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞）、胎児細胞、胎児組織、ゼブラフィッシュ組織、口腔組織、胃腸組織、器官、細胞小器官、生体液、血液試料、尿試料、皮膚試料、骨髄試料、循環腫瘍細胞、腫瘍細胞など、及びこれらのうちの１つ以上を組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。
【0066】
本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「製薬学的に許容可能な塩」という用語には、その用語が言及している化合物の無毒の酸付加塩と塩基付加塩が含まれる。許容可能な無毒の酸付加塩には、当該技術分野において知られている有機酸及び無機酸に由来する塩が含まれ、その酸としては例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ソルビン酸、アコニット酸、サリチル酸、フタル酸、エンボル酸、エナント酸などが挙げられる。天然において酸性である化合物は、様々な製薬学的に許容可能な塩基と塩を形成できる。このような酸性化合物の製薬学的に許容可能な塩基付加塩を調製するのに用いることができる塩基は、無毒の塩基付加塩、すなわち、以下に限らないが、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（特には、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩またはカリウム塩）のように、薬理学的に許容可能なカチオンを含む塩を形成する塩基である。好適な有機塩基としては、Ｎ，Ｎ－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ－メチルグルカミン）、リシン及びプロカインが挙げられるが、これらに限らない。
【0067】
本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「溶媒和物」という用語は、本明細書に示されている化合物またはその塩であって、非共有結合分子間力により結合された溶媒を化学量論的量または非化学量論的量でさらに含む化合物またはその塩を意味する。溶媒が水である場合、溶媒和物は、水和物である。
【0068】
本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「共結晶」という用語は、結晶格子内に２つ以上の化合物を含む結晶体を意味する。共結晶には、結晶格子内で、非イオン性相互作用を通じて結合し合った２つ以上の不揮発性化合物の結晶性分子複合体が含まれる。本明細書で使用する場合、共結晶には、その結晶性分子錯体に、治療用化合物と、１つ以上の追加の不揮発性化合物（複数可）（本明細書ではカウンター分子（複数可）という）が含まれている医薬品共結晶が含まれる。医薬品共結晶中のカウンター分子は典型的には、例えば、食品添加物、保存剤、医薬品賦形剤またはその他の医薬活性成分（ＡＰＩ）のような製薬学的に許容可能な非毒性分子である。いくつかの実施形態では、医薬品共結晶は、ＡＰＩの化学構造的一体性を損なうことなく、薬品の特定の物理化学的特性（例えば、溶解性、溶解速度、バイオアベイラビリティ及び／または安定性）を高める。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２００６，３１，８７５－８７９、Ｔｒａｓｋ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２００７，４（３）：３０１－３０９、Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓｓ ＆ Ｎｅｗｍａｎ，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｅｓｉｇｎ ２００９，９（６）：２９５０－２９６７、Ｓｈａｎ ＆ Ｚａｗｏｒｏｔｋｏ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００８，１３（９／１０）：４４０－４４６及びＶｉｓｈｗｅｓｈｗａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００６，９５（３）：４９９－５１６を参照されたい。
【0069】
本明細書で使用する場合、別段に定められていない限り、「立体異性体」という用語には、本発明の鏡像異性体的／立体異性体的に純粋な化合物及び鏡像異性体的／立体異性体的に濃縮された化合物のすべてが含まれる。
【0070】
本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「立体異性体的に純粋な」という用語は、化合物の１つの立体異性体を含むとともに、その化合物の他の立体異性体を実質的に含まない組成物を意味する。例えば、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体的に純粋な組成物は、その化合物の逆のエナンチオマーを実質的に含まないことになる。キラル中心を２つ有する化合物の立体異性体的に純粋な組成物は、その化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まないことになる。典型的な立体異性体的に純粋な化合物は、その化合物の１つの立体異性体を約８０重量％超、その化合物の他の立体異性体を約２０重量％未満、より好ましくは、その化合物の１つの立体異性体を約９０重量％超、その化合物の他の立体異性体を約１０重量％未満、さらに好ましくは、その化合物の１つの立体異性体を約９５重量％超、その化合物の他の立体異性体を約５重量％未満、最も好ましくは、その化合物の１つの立体異性体を約９７重量％超、その化合物の他の立体異性体を約３重量％未満含む。
【0071】
本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「立体異性体的に濃縮された」という用語は、化合物の１つの立体異性体を約６０重量％超、好ましくは、約７０重量％超、より好ましくは、化合物の１つの立体異性体を約８０重量％超含む組成物を意味する。本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「鏡像異性体的に純粋な」という用語は、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体的に純粋な組成物を意味する。同様に、「立体異性体的に濃縮された」という用語は、キラル中心を１つ有する化合物の立体異性体的に濃縮された組成物を意味する。
【0072】
本明細書で使用する場合、別段に定められていない限り、「プロドラッグ」という用語は、化合物の誘導体であって、生物学的条件下（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）で加水分解したり、酸化したり、または別段の形で反応したりして、その化合物をもたらすことのできる誘導体を意味する。プロドラッグの例としては、生加水分解性アミド、生加水分解性エステル、生加水分解性カルバメート、生加水分解性カーボネート、生加水分解性ウレイド及び生加水分解性ホスフェート類似体のような生加水分解性部分を含む化合物が挙げられるが、これらに限らない。プロドラッグの他の例としては、－ＮＯ、－ＮＯ２、－ＯＮＯまたは－ＯＮＯ２部分を含む化合物が挙げられる。プロドラッグは典型的には、Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，１７２－１７８，９４９－９８２（Ｍａｎｆｒｅｄ Ｅ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．，５ｔｈ ｅｄ．１９９５）及びＤｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｄ．，Ｅｌｓｅｌｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８５）に記載されているような周知の方法を用いて調製できる。
【0073】
化合物は、その原子の１つ以上において、非天然な割合の原子同位体を含むことができる点にも留意されたい。例えば、化合物は、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、硫黄３５（３５Ｓ）または炭素１４（１４Ｃ）のような放射性同位体で放射線標識されていても、重水素（２Ｈ）、炭素１３（１３Ｃ）または窒素１５（１５Ｎ）などの同位体が濃縮されていてもよい。本明細書で使用する場合、「アイソトポログ」は、同位体が濃縮された化合物である。「同位体が濃縮された」という用語は、その原子の天然の同位体組成以外の同位体組成を有する原子を指す。「同位体が濃縮された」とは、その原子の天然の同位体組成以外の同位体組成を有する原子を少なくとも１つ含む化合物を指してもよい。「同位体組成」という用語は、所定の原子において存在する各同位体の量を指す。放射線標識されており、同位体が濃縮された化合物は、治療剤、例えば、がん治療剤、炎症治療剤、研究試薬、例えば結合アッセイ試薬、及び診断剤、例えばｉｎ ｖｉｖｏイメージング剤として有用である。本明細書に記載されているような化合物の同位体の変形形態はいずれも、放射性であるか否かにかかわらず、本発明で提供する実施形態の範囲に含まれるように意図されている。いくつかの実施形態では、化合物のアイソトポログを提供し、例えば、そのアイソトポログは、重水素、炭素１３または窒素１５が濃縮された化合物である。いくつかの実施形態では、本発明で提供するアイソトポログは、重水素が濃縮された化合物である。いくつかの実施形態では、本発明で提供するアイソトポログは、重水素が濃縮された化合物であって、キラル中心で重水素化されている化合物である。いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、本発明で提供する化合物のアイソトポログであって、キラル中心で重水素化されている化合物である。いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、化合物Ｃのアイソトポログであって、キラル中心で重水素化されている化合物である。
【0074】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定されるような、特定の値の許容誤差を意味し、この誤差は部分的には、その値を測定したり、または求めたりする方法に左右される。ある特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、標準偏差が１、２、３または４以内であることを意味する。ある特定の実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、所定の値または範囲の５０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．０５％以内であることを意味する。
【0075】
本明細書で使用する場合、「対象」及び「患者」という用語は、同義的に用いられている。本明細書で使用する場合、対象は、霊長類動物以外の動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類動物（例えば、サル及びヒト）のような哺乳動物であることができる。具体的な実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、疾患、障害または状態を有する哺乳動物（例えばヒト）である。別の実施形態では、対象は、疾患、障害または状態を発症するリスクのある哺乳動物（例えばヒト）である。
【0076】
本明細書で使用する場合、化合物に関連する「選択すること」及び「選択された」とは、特定の化合物が所定の基準を有することに基づき（所定の基準を有することにより）、その特定の化合物を化合物群から特異的に選択することを意味する目的で用いられている。化合物は、化合物のライブラリーまたは化合物群をスクリーニングすることによって選択できる。
【0077】
図示されている構造と、その構造に与えられた名称との間に矛盾がある場合、図示されている構造が優先されることに留意されたい。加えて、構造または構造の一部の立体化学が、例えば、太線または破線で示されていない場合、その構造または構造の一部には、そのすべての立体異性体が含まれると解釈するものとする。
【0078】
本明細書に示されている実施形態の実施の際には、別段に示されていない限り、分子生物学、微生物学及び免疫学の従来の技法を用いることとし、これらの技法は、当業者の技能の範囲内である。このような技法は、文献で十分に説明されている。特に好適な参照用テキストの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．１９８９）、Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）、Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９８４）、Ｈａｍｅｓ ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８４）、Ｈａｍｅｓ ＆ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（１９８４）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，２ｄ ｅｄ．１９８７）及びＷｅｉｒ ＆ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（１９８６）が挙げられる。
【0079】
５．２ 化合物を特徴付けるかまたは選択する方法
Ｓａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）は、Ｓｐａｌｔ－ｌｉｋｅ（ＳＡＬＬ）遺伝子ファミリーのメンバーであるＳＡＬＬ４によってコードされる転写因子である。ＳＡＬＬ４の発現は、マウスでは、７細胞期または８細胞期ほどの発生早期に開始され（Ｅｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０３（４４）：１６３１９－１６３２４（２００６）、Ｋｏｓｈｉｂａ－Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３８：１７５－１８３（２００６））、成人のヒト及びその他の哺乳動物の精巣のように、特定の種類の幹細胞では、胚盤胞期以降も持続する（Ｅｉｌｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，１９６（３）：２０６－２０（２０１２）、Ｇａｓｓｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，８（１）：ｅ５３９７６（２０１３））。
Ｓａｌ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＳＡＬＬ４）は、Ｓｐａｌｔ－ｌｉｋｅ（ＳＡＬＬ）遺伝子ファミリーのメンバーであるＳＡＬＬ４によってコードされる転写因子である。ＳＡＬＬ４の発現は、マウスでは、７細胞期または８細胞期ほどの発生早期に開始され（Ｅｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０３（４４）：１６３１９－１６３２４（２００６）、Ｋｏｓｈｉｂａ－Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３８：１７５－１８３（２００６））、成人のヒト及びその他の哺乳動物の精巣のように、特定の種類の幹細胞では、胚盤胞期以降も持続する（Ｅｉｌｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ，１９６（３）：２０６－２０（２０１２）、Ｇａｓｓｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，８（１）：ｅ５３９７６（２０１３））。
【0080】
ＳＡＬＬ４は、四肢の形態形成を制御する胚性転写因子である。発生時の機能性ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルの低下は、四肢奇形によって特徴付けられるいくつかのヒト症候群の原因であることが示されている。ヒトでは、ＳＡＬＬ４における機能欠損変異は、オキヒロ症候群（デュアン－橈側列症候群としても知られている）、ＩＶＩＣ症候群（眼－耳－橈側列症候群としても知られている）、ホルト－オーラム症候群及び肢端－腎－眼症候群を引き起こし、これらの症候群はいずれも、前腕異常とともに、耳、眼、心臓及び腎臓の様々な程度の異常によって特徴付けられる（Ｂｏｒｏｚｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，４１：ｅ１１３ （２００４）、Ｂｏｒｏｚｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：ｅ１０２（２００４）、Ｋｈｏｌａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔ．，２６（３）：１７６－８３（２００５）、Ａｌ－Ｂａｒａｄｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．，７１：１１９５－１１９９（２００２）、Ｋｏｈｌａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．，４０（７）：４７３－８（２００３）及びＫｏｈｌａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｒｅｓ Ａ Ｃｌｉｎ Ｍｏｌ Ｔｅｒａｔｏｌ．，７０（８）：５５０－１（２００４））。これらの症候群と関連するＳＡＬＬ４変異は、常染色体優性変異であり、ＳＡＬＬ４活性を低下させると予想される（Ｂｏｒｏｚｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ，４１：ｅ１１３（２００４）、Ｋｏｓｈｉｂａ－Ｔａｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３８：１７５－１８３（２００６））。したがって、ＳＡＬＬ４のハプロ不全が発症メカニズムであること、及びＳａｌｌ４タンパク質のレベルの低下が小さくても、発生異常が生じると予測し得ることが示されている。
【0081】
ＳＡＬＬ４には、少なくとも２つのアイソフォーム（ＳＡＬＬ４Ａ及びＳＡＬＬ４Ｂ）が存在する。本発明で提供する方法は部分的には、ＳＡＬＬ４Ａが、セレブロン－ＣＲＬ４によるユビキチン化の直接的な化合物依存性基質であるという発見に基づいている。下記の第６節の実施例によって、ＳＡＬＬ４Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、セレブロン－ＣＲＬ４によるユビキチン化の直接的な化合物誘発性標的であることが示されている。
【0082】
すなわち、本開示に開示されているデータによって、ＳＡＬＬ４（またはＳＡＬＬ４Ａ）の分解が、セレブロン改変化合物によって誘発される催奇形性の動因として特定されている。ＳＡＬＬ４のレベルを用いて、セレブロン改変化合物の毒性を判断することによって、生殖毒性のリスクが低減されたセレブロン改変化合物のスクリーニング及び選択を可能にできる。より具体的には、ＳＡＬＬ４の分解の有意な低減を誘発しないか、またはＳＡＬＬ４の分解を有意には低減させないセレブロン改変化合物は、生殖毒性のリスクが低減されている可能性があるので、特定の患者を治療するには、そのような化合物が好ましいことがある。
【0083】
本明細書で使用する場合、「ＳＡＬＬ４」という用語は、アイソフォームＡ、すなわちＳＡＬＬ４Ａを指す。ヒトＳＡＬＬ４Ａ（識別子：Ｑ９ＵＪＱ４－１）のアミノ酸配列は、
ＭＳＲＲＫＱＡＫＰＱ ＨＩＮＳＥＥＤＱＧＥ ＱＱＰＱＱＱＴＰＥＦ ＡＤＡＡＰＡＡＰＡＡ ＧＥＬＧＡＰＶＮＨＰ ＧＮＤＥＶＡＳＥＤＥ ＡＴＶＫＲＬＲＲＥＥ ＴＨＶＣＥＫＣＣＡＥ ＦＦＳＩＳＥＦＬＥＨ ＫＫＮＣＴＫＮＰＰＶ ＬＩＭＮＤＳＥＧＰＶ ＰＳＥＤＦＳＧＡＶＬ ＳＨＱＰＴＳＰＧＳＫ ＤＣＨＲＥＮＧＧＳＳ ＥＤＭＫＥＫＰＤＡＥ ＳＶＶＹＬＫＴＥＴＡ ＬＰＰＴＰＱＤＩＳＹ ＬＡＫＧＫＶＡＮＴＮ ＶＴＬＱＡＬＲＧＴＫ ＶＡＶＮＱＲＳＡＤＡ ＬＰＡＰＶＰＧＡＮＳ ＩＰＷＶＬＥＱＩＬＣ ＬＱＱＱＱＬＱＱＩＱ ＬＴＥＱＩＲＩＱＶＮ ＭＷＡＳＨＡＬＨＳＳ ＧＡＧＡＤＴＬＫＴＬ ＧＳＨＭＳＱＱＶＳＡ ＡＶＡＬＬＳＱＫＡＧ ＳＱＧＬＳＬＤＡＬＫ ＱＡＫＬＰＨＡＮＩＰ ＳＡＴＳＳＬＳＰＧＬ ＡＰＦＴＬＫＰＤＧＴ ＲＶＬＰＮＶＭＳＲＬ ＰＳＡＬＬＰＱＡＰＧ ＳＶＬＦＱＳＰＦＳＴ ＶＡＬＤＴＳＫＫＧＫ ＧＫＰＰＮＩＳＡＶＤ ＶＫＰＫＤＥＡＡＬＹ ＫＨＫＣＫＹＣＳＫＶ ＦＧＴＤＳＳＬＱＩＨ ＬＲＳＨＴＧＥＲＰＦ ＶＣＳＶＣＧＨＲＦＴ ＴＫＧＮＬＫＶＨＦＨ ＲＨＰＱＶＫＡＮＰＱ ＬＦＡＥＦＱＤＫＶＡ ＡＧＮＧＩＰＹＡＬＳ ＶＰＤＰＩＤＥＰＳＬ ＳＬＤＳＫＰＶＬＶＴ ＴＳＶＧＬＰＱＮＬＳ ＳＧＴＮＰＫＤＬＴＧ ＧＳＬＰＧＤＬＱＰＧ ＰＳＰＥＳＥＧＧＰＴ ＬＰＧＶＧＰＮＹＮＳ ＰＲＡＧＧＦＱＧＳＧ ＴＰＥＰＧＳＥＴＬＫ ＬＱＱＬＶＥＮＩＤＫ ＡＴＴＤＰＮＥＣＬＩ ＣＨＲＶＬＳＣＱＳＳ ＬＫＭＨＹＲＴＨＴＧ ＥＲＰＦＱＣＫＩＣＧ ＲＡＦＳＴＫＧＮＬＫ ＴＨＬＧＶＨＲＴＮＴ ＳＩＫＴＱＨＳＣＰＩ ＣＱＫＫＦＴＮＡＶＭ ＬＱＱＨＩＲＭＨＭＧ ＧＱＩＰＮＴＰＬＰＥ ＮＰＣＤＦＴＧＳＥＰ ＭＴＶＧＥＮＧＳＴＧ ＡＩＣＨＤＤＶＩＥＳ ＩＤＶＥＥＶＳＳＱＥ ＡＰＳＳＳＳＫＶＰＴ ＰＬＰＳＩＨＳＡＳＰ ＴＬＧＦＡＭＭＡＳＬ ＤＡＰＧＫＶＧＰＡＰ ＦＮＬＱＲＱＧＳＲＥ ＮＧＳＶＥＳＤＧＬＴ ＮＤＳＳＳＬＭＧＤＱ ＥＹＱＳＲＳＰＤＩＬ ＥＴＴＳＦＱＡＬＳＰ ＡＮＳＱＡＥＳＩＫＳ ＫＳＰＤＡＧＳＫＡＥ ＳＳＥＮＳＲＴＥＭＥ ＧＲＳＳＬＰＳＴＦＩ ＲＡＰＰＴＹＶＫＶＥ ＶＰＧＴＦＶＧＰＳＴ ＬＳＰＧＭＴＰＬＬＡ ＡＱＰＲＲＱＡＫＱＨ ＧＣＴＲＣＧＫＮＦＳ ＳＡＳＡＬＱＩＨＥＲ ＴＨＴＧＥＫＰＦＶＣ ＮＩＣＧＲＡＦＴＴＫ ＧＮＬＫＶＨＹＭＴＨ ＧＡＮＮＮＳＡＲＲＧ ＲＫＬＡＩＥＮＴＭＡ ＬＬＧＴＤＧＫＲＶＳ ＥＩＦＰＫＥＩＬＡＰ ＳＶＮＶＤＰＶＶＷＮ ＱＹＴＳＭＬＮＧＧＬ ＡＶＫＴＮＥＩＳＶＩ ＱＳＧＧＶＰＴＬＰＶ ＳＬＧＡＴＳＶＶＮＮ ＡＴＶＳＫＭＤＧＳＱ ＳＧＩＳＡＤＶＥＫＰ ＳＡＴＤＧＶＰＫＨＱ ＦＰＨＦＬＥＥＮＫＩ ＡＶＳ
（配列番号１）
である。
ＭＳＲＲＫＱＡＫＰＱ ＨＩＮＳＥＥＤＱＧＥ ＱＱＰＱＱＱＴＰＥＦ ＡＤＡＡＰＡＡＰＡＡ ＧＥＬＧＡＰＶＮＨＰ ＧＮＤＥＶＡＳＥＤＥ ＡＴＶＫＲＬＲＲＥＥ ＴＨＶＣＥＫＣＣＡＥ ＦＦＳＩＳＥＦＬＥＨ ＫＫＮＣＴＫＮＰＰＶ ＬＩＭＮＤＳＥＧＰＶ ＰＳＥＤＦＳＧＡＶＬ ＳＨＱＰＴＳＰＧＳＫ ＤＣＨＲＥＮＧＧＳＳ ＥＤＭＫＥＫＰＤＡＥ ＳＶＶＹＬＫＴＥＴＡ ＬＰＰＴＰＱＤＩＳＹ ＬＡＫＧＫＶＡＮＴＮ ＶＴＬＱＡＬＲＧＴＫ ＶＡＶＮＱＲＳＡＤＡ ＬＰＡＰＶＰＧＡＮＳ ＩＰＷＶＬＥＱＩＬＣ ＬＱＱＱＱＬＱＱＩＱ ＬＴＥＱＩＲＩＱＶＮ ＭＷＡＳＨＡＬＨＳＳ ＧＡＧＡＤＴＬＫＴＬ ＧＳＨＭＳＱＱＶＳＡ ＡＶＡＬＬＳＱＫＡＧ ＳＱＧＬＳＬＤＡＬＫ ＱＡＫＬＰＨＡＮＩＰ ＳＡＴＳＳＬＳＰＧＬ ＡＰＦＴＬＫＰＤＧＴ ＲＶＬＰＮＶＭＳＲＬ ＰＳＡＬＬＰＱＡＰＧ ＳＶＬＦＱＳＰＦＳＴ ＶＡＬＤＴＳＫＫＧＫ ＧＫＰＰＮＩＳＡＶＤ ＶＫＰＫＤＥＡＡＬＹ ＫＨＫＣＫＹＣＳＫＶ ＦＧＴＤＳＳＬＱＩＨ ＬＲＳＨＴＧＥＲＰＦ ＶＣＳＶＣＧＨＲＦＴ ＴＫＧＮＬＫＶＨＦＨ ＲＨＰＱＶＫＡＮＰＱ ＬＦＡＥＦＱＤＫＶＡ ＡＧＮＧＩＰＹＡＬＳ ＶＰＤＰＩＤＥＰＳＬ ＳＬＤＳＫＰＶＬＶＴ ＴＳＶＧＬＰＱＮＬＳ ＳＧＴＮＰＫＤＬＴＧ ＧＳＬＰＧＤＬＱＰＧ ＰＳＰＥＳＥＧＧＰＴ ＬＰＧＶＧＰＮＹＮＳ ＰＲＡＧＧＦＱＧＳＧ ＴＰＥＰＧＳＥＴＬＫ ＬＱＱＬＶＥＮＩＤＫ ＡＴＴＤＰＮＥＣＬＩ ＣＨＲＶＬＳＣＱＳＳ ＬＫＭＨＹＲＴＨＴＧ ＥＲＰＦＱＣＫＩＣＧ ＲＡＦＳＴＫＧＮＬＫ ＴＨＬＧＶＨＲＴＮＴ ＳＩＫＴＱＨＳＣＰＩ ＣＱＫＫＦＴＮＡＶＭ ＬＱＱＨＩＲＭＨＭＧ ＧＱＩＰＮＴＰＬＰＥ ＮＰＣＤＦＴＧＳＥＰ ＭＴＶＧＥＮＧＳＴＧ ＡＩＣＨＤＤＶＩＥＳ ＩＤＶＥＥＶＳＳＱＥ ＡＰＳＳＳＳＫＶＰＴ ＰＬＰＳＩＨＳＡＳＰ ＴＬＧＦＡＭＭＡＳＬ ＤＡＰＧＫＶＧＰＡＰ ＦＮＬＱＲＱＧＳＲＥ ＮＧＳＶＥＳＤＧＬＴ ＮＤＳＳＳＬＭＧＤＱ ＥＹＱＳＲＳＰＤＩＬ ＥＴＴＳＦＱＡＬＳＰ ＡＮＳＱＡＥＳＩＫＳ ＫＳＰＤＡＧＳＫＡＥ ＳＳＥＮＳＲＴＥＭＥ ＧＲＳＳＬＰＳＴＦＩ ＲＡＰＰＴＹＶＫＶＥ ＶＰＧＴＦＶＧＰＳＴ ＬＳＰＧＭＴＰＬＬＡ ＡＱＰＲＲＱＡＫＱＨ ＧＣＴＲＣＧＫＮＦＳ ＳＡＳＡＬＱＩＨＥＲ ＴＨＴＧＥＫＰＦＶＣ ＮＩＣＧＲＡＦＴＴＫ ＧＮＬＫＶＨＹＭＴＨ ＧＡＮＮＮＳＡＲＲＧ ＲＫＬＡＩＥＮＴＭＡ ＬＬＧＴＤＧＫＲＶＳ ＥＩＦＰＫＥＩＬＡＰ ＳＶＮＶＤＰＶＶＷＮ ＱＹＴＳＭＬＮＧＧＬ ＡＶＫＴＮＥＩＳＶＩ ＱＳＧＧＶＰＴＬＰＶ ＳＬＧＡＴＳＶＶＮＮ ＡＴＶＳＫＭＤＧＳＱ ＳＧＩＳＡＤＶＥＫＰ ＳＡＴＤＧＶＰＫＨＱ ＦＰＨＦＬＥＥＮＫＩ ＡＶＳ
（配列番号１）
である。
【0084】
ヒトＳＡＬＬ４Ａのコード配列は、
１ ａｔｇｔｃｇａｇｇｃ ｇｃａａｇｃａｇｇｃ ｇａａａｃｃｃｃａｇ ｃａｃａｔｃａａｃｔ ｃｇｇａｇｇａｇｇａ ｃｃａｇｇｇｃｇａｇ
６１ ｃａｇｃａｇｃｃｇｃ ａｇｃａｇｃａｇａｃ ｃｃｃｇｇａｇｔｔｔ ｇｃａｇａｔｇｃｇｇ ｃｃｃｃａｇｃｇｇｃ ｇｃｃｃｇｃｇｇｃｇ
１２１ ｇｇｇｇａｇｃｔｇｇ ｇｔｇｃｔｃｃａｇｔ ｇａａｃｃａｃｃｃａ ｇｇｇａａｔｇａｃｇ ａｇｇｔｇｇｃｇａｇ ｔｇａｇｇａｔｇａａ
１８１ ｇｃｃａｃａｇｔａａ ａｇｃｇｇｃｔｔｃｇ ｔｃｇｇｇａｇｇａｇ ａｃｇｃａｃｇｔｃｔ ｇｔｇａｇａａａｔｇ ｃｔｇｔｇｃｇｇａｇ
２４１ ｔｔｃｔｔｃａｇｃａ ｔｃｔｃｔｇａｇｔｔ ｃｃｔｇｇａａｃａｔ ａａｇａａａａａｔｔ ｇｃａｃｔａａａａａ ｔｃｃａｃｃｔｇｔｃ
３０１ ｃｔｃａｔｃａｔｇａ ａｔｇａｃａｇｃｇａ ｇｇｇｇｃｃｔｇｔｇ ｃｃｔｔｃａｇａａｇ ａｃｔｔｃｔｃｃｇｇ ａｇｃｔｇｔａｃｔｇ
３６１ ａｇｃｃａｃｃａｇｃ ｃｃａｃｃａｇｔｃｃ ｃｇｇｃａｇｔａａｇ ｇａｃｔｇｔｃａｃａ ｇｇｇａｇａａｔｇｇ ｃｇｇｃａｇｃｔｃａ
４２１ ｇａｇｇａｃａｔｇａ ａｇｇａｇａａｇｃｃ ｇｇａｔｇｃｇｇａｇ ｔｃｔｇｔｇｇｔｇｔ ａｃｃｔａａａｇａｃ ａｇａｇａｃａｇｃｃ
４８１ ｃｔｇｃｃａｃｃｃａ ｃｃｃｃｃｃａｇｇａ ｃａｔａａｇｃｔａｔ ｔｔａｇｃｃａａａｇ ｇｃａａａｇｔｇｇｃ ｃａａｃａｃｔａａｔ
５４１ ｇｔｇａｃｃｔｔｇｃ ａｇｇｃａｃｔａｃｇ ｇｇｇｃａｃｃａａｇ ｇｔｇｇｃｇｇｔｇａ ａｔｃａｇｃｇｇａｇ ｃｇｃｇｇａｔｇｃａ
６０１ ｃｔｃｃｃｔｇｃｃｃ ｃｃｇｔｇｃｃｔｇｇ ｔｇｃｃａａｃａｇｃ ａｔｃｃｃｇｔｇｇｇ ｔｃｃｔｃｇａｇｃａ ｇａｔｃｔｔｇｔｇｔ
６６１ ｃｔｇｃａｇｃａｇｃ ａｇｃａｇｃｔａｃａ ｇｃａｇａｔｃｃａｇ ｃｔｃａｃｃｇａｇｃ ａｇａｔｃｃｇｃａｔ ｃｃａｇｇｔｇａａｃ
７２１ ａｔｇｔｇｇｇｃｃｔ ｃｃｃａｃｇｃｃｃｔ ｃｃａｃｔｃａａｇｃ ｇｇｇｇｃａｇｇｇｇ ｃｃｇａｃａｃｔｃｔ ｇａａｇａｃｃｔｔｇ
７８１ ｇｇｃａｇｃｃａｃａ ｔｇｔｃｔｃａｇｃａ ｇｇｔｔｔｃｔｇｃａ ｇｃｔｇｔｇｇｃｔｔ ｔｇｃｔｃａｇｃｃａ ｇａａａｇｃｔｇｇａ
８４１ ａｇｃｃａａｇｇｔｃ ｔｇｔｃｔｃｔｇｇａ ｔｇｃｃｔｔｇａａａ ｃａａｇｃｃａａｇｃ ｔａｃｃｔｃａｃｇｃ ｃａａｃａｔｃｃｃｔ
９０１ ｔｃｔｇｃｃａｃｃａ ｇｃｔｃｃｃｔｇｔｃ ｃｃｃａｇｇｇｃｔｇ ｇｃａｃｃｃｔｔｃａ ｃｔｃｔｇａａｇｃｃ ｇｇａｔｇｇｇａｃｃ
９６１ ｃｇｇｇｔｇｃｔｃｃ ｃｇａａｃｇｔｃａｔ ｇｔｃｃｃｇｃｃｔｃ ｃｃｇａｇｃｇｃｔｔ ｔｇｃｔｔｃｃｔｃａ ｇｇｃｃｃｃｇｇｇｃ
１０２１ ｔｃｇｇｔｇｃｔｃｔ ｔｃｃａｇａｇｃｃｃ ｔｔｔｃｔｃｃａｃｔ ｇｔｇｇｃｇｃｔａｇ ａｃａｃａｔｃｃａａ ｇａａａｇｇｇａａｇ
１０８１ ｇｇｇａａｇｃｃａｃ ｃｇａａｃａｔｃｔｃ ｃｇｃｇｇｔｇｇａｔ ｇｔｃａａａｃｃｃａ ａａｇａｃｇａｇｇｃ ｇｇｃｃｃｔｃｔａｃ
１１４１ ａａｇｃａｃａａｇｔ ｇｔａａｇｔａｃｔｇ ｔａｇｃａａｇｇｔｔ ｔｔｔｇｇｇａｃｔｇ ａｔａｇｃｔｃｃｔｔ ｇｃａｇａｔｃｃａｃ
１２０１ ｃｔｃｃｇｃｔｃｃｃ ａｃａｃｔｇｇａｇａ ｇａｇａｃｃｃｔｔｃ ｇｔｇｔｇｃｔｃｔｇ ｔｃｔｇｔｇｇｔｃａ ｔｃｇｃｔｔｃａｃｃ
１２６１ ａｃｃａａｇｇｇｃａ ａｃｃｔｃａａｇｇｔ ｇｃａｃｔｔｔｃａｃ ｃｇａｃａｔｃｃｃｃ ａｇｇｔｇａａｇｇｃ ａａａｃｃｃｃｃａｇ
１３２１ ｃｔｇｔｔｔｇｃｃｇ ａｇｔｔｃｃａｇｇａ ｃａａａｇｔｇｇｃｇ ｇｃｃｇｇｃａａｔｇ ｇｃａｔｃｃｃｃｔａ ｔｇｃａｃｔｃｔｃｔ
１３８１ ｇｔａｃｃｔｇａｃｃ ｃｃａｔａｇａｔｇａ ａｃｃｇａｇｔｃｔｔ ｔｃｔｔｔａｇａｃａ ｇｃａａａｃｃｔｇｔ ｃｃｔｔｇｔａａｃｃ
１４４１ ａｃｃｔｃｔｇｔａｇ ｇｇｃｔａｃｃｔｃａ ｇａａｔｃｔｔｔｃｔ ｔｃｇｇｇｇａｃｔａ ａｔｃｃｃａａｇｇａ ｃｃｔｃａｃｇｇｇｔ
１５０１ ｇｇｃｔｃｃｔｔｇｃ ｃｃｇｇｔｇａｃｃｔ ｇｃａｇｃｃｔｇｇｇ ｃｃｔｔｃｔｃｃａｇ ａａａｇｔｇａｇｇｇ ｔｇｇａｃｃｃａｃａ
１５６１ ｃｔｃｃｃｔｇｇｇｇ ｔｇｇｇａｃｃａａａ ｃｔａｔａａｔｔｃｃ ｃｃａａｇｇｇｃｔｇ ｇｔｇｇｃｔｔｃｃａ ａｇｇｇａｇｔｇｇｇ
１６２１ ａｃｃｃｃｔｇａｇｃ ｃａｇｇｇｔｃａｇａ ｇａｃｃｃｔｇａａａ ｔｔｇｃａｇｃａｇｔ ｔｇｇｔｇｇａｇａａ ｃａｔｔｇａｃａａｇ
１６８１ ｇｃｃａｃｃａｃｔｇ ａｔｃｃｃａａｃｇａ ａｔｇｔｃｔｃａｔｔ ｔｇｃｃａｃｃｇａｇ ｔｃｔｔａａｇｃｔｇ ｔｃａｇａｇｃｔｃｃ
１７４１ ｃｔｃａａｇａｔｇｃ ａｔｔａｔｃｇｃａｃ ｃｃａｃａｃｃｇｇｇ ｇａｇａｇａｃｃｇｔ ｔｃｃａｇｔｇｔａａ ｇａｔｃｔｇｔｇｇｃ
１８０１ ｃｇａｇｃｃｔｔｔｔ ｃｔａｃｃａａａｇｇ ｔａａｃｃｔｇａａｇ ａｃａｃａｃｃｔｔｇ ｇｇｇｔｔｃａｃｃｇ ａａｃｃａａｃａｃａ
１８６１ ｔｃｃａｔｔａａｇａ ｃｇｃａｇｃａｔｔｃ ｇｔｇｃｃｃｃａｔｃ ｔｇｃｃａｇａａｇａ ａｇｔｔｃａｃｔａａ ｔｇｃｃｇｔｇａｔｇ
１９２１ ｃｔｇｃａｇｃａａｃ ａｔａｔｔｃｇｇａｔ ｇｃａｃａｔｇｇｇｃ ｇｇｔｃａｇａｔｔｃ ｃｃａａｃａｃｇｃｃ ｃｃｔｇｃｃａｇａｇ
１９８１ ａａｔｃｃｃｔｇｔｇ ａｃｔｔｔａｃｇｇｇ ｔｔｃｔｇａｇｃｃａ ａｔｇａｃｃｇｔｇｇ ｇｔｇａｇａａｃｇｇ ｃａｇｃａｃｃｇｇｃ
２０４１ ｇｃｔａｔｃｔｇｃｃ ａｔｇａｔｇａｔｇｔ ｃａｔｃｇａａａｇｃ ａｔｃｇａｔｇｔａｇ ａｇｇａａｇｔｃａｇ ｃｔｃｃｃａｇｇａｇ
２１０１ ｇｃｔｃｃｃａｇｃａ ｇｃｔｃｃｔｃｃａａ ｇｇｔｃｃｃｃａｃｇ ｃｃｔｃｔｔｃｃｃａ ｇｃａｔｃｃａｃｔｃ ｇｇｃａｔｃａｃｃｃ
２１６１ ａｃｇｃｔａｇｇｇｔ ｔｔｇｃｃａｔｇａｔ ｇｇｃｔｔｃｃｔｔａ ｇａｔｇｃｃｃｃａｇ ｇｇａａａｇｔｇｇｇ ｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔ
２２２１ ｔｔｔａａｃｃｔｇｃ ａｇｃｇｃｃａｇｇｇ ｃａｇｃａｇａｇａａ ａａｃｇｇｔｔｃｃｇ ｔｇｇａｇａｇｃｇａ ｔｇｇｃｔｔｇａｃｃ
２２８１ ａａｃｇａｃｔｃａｔ ｃｃｔｃｇｃｔｇａｔ ｇｇｇａｇａｃｃａｇ ｇａｇｔａｔｃａｇａ ｇｃｃｇａａｇｃｃｃ ａｇａｔａｔｃｃｔｇ
２３４１ ｇａａａｃｃａｃａｔ ｃｃｔｔｃｃａｇｇｃ ａｃｔｃｔｃｃｃｃｇ ｇｃｃａａｔａｇｔｃ ａａｇｃｃｇａａａｇ ｃａｔｃａａｇｔｃａ
２４０１ ａａｇｔｃｔｃｃｃｇ ａｔｇｃｔｇｇｇａｇ ｃａａａｇｃａｇａｇ ａｇｃｔｃｃｇａｇａ ａｃａｇｃｃｇｃａｃ ｔｇａｇａｔｇｇａａ
２４６１ ｇｇｔｃｇｇａｇｃａ ｇｔｃｔｃｃｃｔｔｃ ｃａｃｇｔｔｔａｔｃ ｃｇａｇｃｃｃｃｇｃ ｃｇａｃｃｔａｔｇｔ ｃａａｇｇｔｔｇａａ
２５２１ ｇｔｔｃｃｔｇｇｃａ ｃａｔｔｔｇｔｇｇｇ ａｃｃｃｔｃｇａｃａ ｔｔｇｔｃｃｃｃａｇ ｇｇａｔｇａｃｃｃｃ ｔｔｔｇｔｔａｇｃａ
２５８１ ｇｃｃｃａｇｃｃａｃ ｇｃｃｇａｃａｇｇｃ ｃａａｇｃａａｃａｔ ｇｇｃｔｇｃａｃａｃ ｇｇｔｇｔｇｇｇａａ ｇａａｃｔｔｃｔｃｇ
２６４１ ｔｃｔｇｃｔａｇｃｇ ｃｔｃｔｔｃａｇａｔ ｃｃａｃｇａｇｃｇｇ ａｃｔｃａｃａｃｔｇ ｇａｇａｇａａｇｃｃ ｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃ
２７０１ ａａｃａｔｔｔｇｔｇ ｇｇｃｇａｇｃｔｔｔ ｔａｃｃａｃｃａａａ ｇｇｃａａｃｔｔａａ ａｇｇｔｔｃａｃｔａ ｃａｔｇａｃａｃａｃ
２７６１ ｇｇｇｇｃｇａａｃａ ａｔａａｃｔｃａｇｃ ｃｃｇｃｃｇｔｇｇａ ａｇｇａａｇｔｔｇｇ ｃｃａｔｃｇａｇａａ ｃａｃｃａｔｇｇｃｔ
２８２１ ｃｔｇｔｔａｇｇｔａ ｃｇｇａｃｇｇａａａ ａａｇａｇｔｃｔｃａ ｇａａａｔｃｔｔｔｃ ｃｃａａｇｇａａａｔ ｃｃｔｇｇｃｃｃｃｔ
２８８１ ｔｃａｇｔｇａａｔｇ ｔｇｇａｃｃｃｔｇｔ ｔｇｔｇｔｇｇａａｃ ｃａｇｔａｃａｃｃａ ｇｃａｔｇｃｔｃａａ ｔｇｇｃｇｇｔｃｔｇ
２９４１ ｇｃｃｇｔｇａａｇａ ｃｃａａｔｇａｇａｔ ｃｔｃｔｇｔｇａｔｃ ｃａｇａｇｔｇｇｇｇ ｇｇｇｔｔｃｃｔａｃ ｃｃｔｃｃｃｇｇｔｔ
３００１ ｔｃｃｔｔｇｇｇｇｇ ｃｃａｃｃｔｃｃｇｔ ｔｇｔｇａａｔａａｃ ｇｃｃａｃｔｇｔｃｔ ｃｃａａｇａｔｇｇａ ｔｇｇｃｔｃｃｃａｇ
３０６１ ｔｃｇｇｇｔａｔｃａ ｇｔｇｃａｇａｔｇｔ ｇｇａａａａａｃｃａ ａｇｔｇｃｔａｃｔｇ ａｃｇｇｃｇｔｔｃｃ ｃａａａｃａｃｃａｇ
３１２１ ｔｔｔｃｃｔｃａｃｔ ｔｃｃｔｇｇａａｇａ ａａａｃａａｇａｔｔ ｇｃｇｇｔｃａｇｃｔ ａａ（配列番号２）
である。
１ ａｔｇｔｃｇａｇｇｃ ｇｃａａｇｃａｇｇｃ ｇａａａｃｃｃｃａｇ ｃａｃａｔｃａａｃｔ ｃｇｇａｇｇａｇｇａ ｃｃａｇｇｇｃｇａｇ
６１ ｃａｇｃａｇｃｃｇｃ ａｇｃａｇｃａｇａｃ ｃｃｃｇｇａｇｔｔｔ ｇｃａｇａｔｇｃｇｇ ｃｃｃｃａｇｃｇｇｃ ｇｃｃｃｇｃｇｇｃｇ
１２１ ｇｇｇｇａｇｃｔｇｇ ｇｔｇｃｔｃｃａｇｔ ｇａａｃｃａｃｃｃａ ｇｇｇａａｔｇａｃｇ ａｇｇｔｇｇｃｇａｇ ｔｇａｇｇａｔｇａａ
１８１ ｇｃｃａｃａｇｔａａ ａｇｃｇｇｃｔｔｃｇ ｔｃｇｇｇａｇｇａｇ ａｃｇｃａｃｇｔｃｔ ｇｔｇａｇａａａｔｇ ｃｔｇｔｇｃｇｇａｇ
２４１ ｔｔｃｔｔｃａｇｃａ ｔｃｔｃｔｇａｇｔｔ ｃｃｔｇｇａａｃａｔ ａａｇａａａａａｔｔ ｇｃａｃｔａａａａａ ｔｃｃａｃｃｔｇｔｃ
３０１ ｃｔｃａｔｃａｔｇａ ａｔｇａｃａｇｃｇａ ｇｇｇｇｃｃｔｇｔｇ ｃｃｔｔｃａｇａａｇ ａｃｔｔｃｔｃｃｇｇ ａｇｃｔｇｔａｃｔｇ
３６１ ａｇｃｃａｃｃａｇｃ ｃｃａｃｃａｇｔｃｃ ｃｇｇｃａｇｔａａｇ ｇａｃｔｇｔｃａｃａ ｇｇｇａｇａａｔｇｇ ｃｇｇｃａｇｃｔｃａ
４２１ ｇａｇｇａｃａｔｇａ ａｇｇａｇａａｇｃｃ ｇｇａｔｇｃｇｇａｇ ｔｃｔｇｔｇｇｔｇｔ ａｃｃｔａａａｇａｃ ａｇａｇａｃａｇｃｃ
４８１ ｃｔｇｃｃａｃｃｃａ ｃｃｃｃｃｃａｇｇａ ｃａｔａａｇｃｔａｔ ｔｔａｇｃｃａａａｇ ｇｃａａａｇｔｇｇｃ ｃａａｃａｃｔａａｔ
５４１ ｇｔｇａｃｃｔｔｇｃ ａｇｇｃａｃｔａｃｇ ｇｇｇｃａｃｃａａｇ ｇｔｇｇｃｇｇｔｇａ ａｔｃａｇｃｇｇａｇ ｃｇｃｇｇａｔｇｃａ
６０１ ｃｔｃｃｃｔｇｃｃｃ ｃｃｇｔｇｃｃｔｇｇ ｔｇｃｃａａｃａｇｃ ａｔｃｃｃｇｔｇｇｇ ｔｃｃｔｃｇａｇｃａ ｇａｔｃｔｔｇｔｇｔ
６６１ ｃｔｇｃａｇｃａｇｃ ａｇｃａｇｃｔａｃａ ｇｃａｇａｔｃｃａｇ ｃｔｃａｃｃｇａｇｃ ａｇａｔｃｃｇｃａｔ ｃｃａｇｇｔｇａａｃ
７２１ ａｔｇｔｇｇｇｃｃｔ ｃｃｃａｃｇｃｃｃｔ ｃｃａｃｔｃａａｇｃ ｇｇｇｇｃａｇｇｇｇ ｃｃｇａｃａｃｔｃｔ ｇａａｇａｃｃｔｔｇ
７８１ ｇｇｃａｇｃｃａｃａ ｔｇｔｃｔｃａｇｃａ ｇｇｔｔｔｃｔｇｃａ ｇｃｔｇｔｇｇｃｔｔ ｔｇｃｔｃａｇｃｃａ ｇａａａｇｃｔｇｇａ
８４１ ａｇｃｃａａｇｇｔｃ ｔｇｔｃｔｃｔｇｇａ ｔｇｃｃｔｔｇａａａ ｃａａｇｃｃａａｇｃ ｔａｃｃｔｃａｃｇｃ ｃａａｃａｔｃｃｃｔ
９０１ ｔｃｔｇｃｃａｃｃａ ｇｃｔｃｃｃｔｇｔｃ ｃｃｃａｇｇｇｃｔｇ ｇｃａｃｃｃｔｔｃａ ｃｔｃｔｇａａｇｃｃ ｇｇａｔｇｇｇａｃｃ
９６１ ｃｇｇｇｔｇｃｔｃｃ ｃｇａａｃｇｔｃａｔ ｇｔｃｃｃｇｃｃｔｃ ｃｃｇａｇｃｇｃｔｔ ｔｇｃｔｔｃｃｔｃａ ｇｇｃｃｃｃｇｇｇｃ
１０２１ ｔｃｇｇｔｇｃｔｃｔ ｔｃｃａｇａｇｃｃｃ ｔｔｔｃｔｃｃａｃｔ ｇｔｇｇｃｇｃｔａｇ ａｃａｃａｔｃｃａａ ｇａａａｇｇｇａａｇ
１０８１ ｇｇｇａａｇｃｃａｃ ｃｇａａｃａｔｃｔｃ ｃｇｃｇｇｔｇｇａｔ ｇｔｃａａａｃｃｃａ ａａｇａｃｇａｇｇｃ ｇｇｃｃｃｔｃｔａｃ
１１４１ ａａｇｃａｃａａｇｔ ｇｔａａｇｔａｃｔｇ ｔａｇｃａａｇｇｔｔ ｔｔｔｇｇｇａｃｔｇ ａｔａｇｃｔｃｃｔｔ ｇｃａｇａｔｃｃａｃ
１２０１ ｃｔｃｃｇｃｔｃｃｃ ａｃａｃｔｇｇａｇａ ｇａｇａｃｃｃｔｔｃ ｇｔｇｔｇｃｔｃｔｇ ｔｃｔｇｔｇｇｔｃａ ｔｃｇｃｔｔｃａｃｃ
１２６１ ａｃｃａａｇｇｇｃａ ａｃｃｔｃａａｇｇｔ ｇｃａｃｔｔｔｃａｃ ｃｇａｃａｔｃｃｃｃ ａｇｇｔｇａａｇｇｃ ａａａｃｃｃｃｃａｇ
１３２１ ｃｔｇｔｔｔｇｃｃｇ ａｇｔｔｃｃａｇｇａ ｃａａａｇｔｇｇｃｇ ｇｃｃｇｇｃａａｔｇ ｇｃａｔｃｃｃｃｔａ ｔｇｃａｃｔｃｔｃｔ
１３８１ ｇｔａｃｃｔｇａｃｃ ｃｃａｔａｇａｔｇａ ａｃｃｇａｇｔｃｔｔ ｔｃｔｔｔａｇａｃａ ｇｃａａａｃｃｔｇｔ ｃｃｔｔｇｔａａｃｃ
１４４１ ａｃｃｔｃｔｇｔａｇ ｇｇｃｔａｃｃｔｃａ ｇａａｔｃｔｔｔｃｔ ｔｃｇｇｇｇａｃｔａ ａｔｃｃｃａａｇｇａ ｃｃｔｃａｃｇｇｇｔ
１５０１ ｇｇｃｔｃｃｔｔｇｃ ｃｃｇｇｔｇａｃｃｔ ｇｃａｇｃｃｔｇｇｇ ｃｃｔｔｃｔｃｃａｇ ａａａｇｔｇａｇｇｇ ｔｇｇａｃｃｃａｃａ
１５６１ ｃｔｃｃｃｔｇｇｇｇ ｔｇｇｇａｃｃａａａ ｃｔａｔａａｔｔｃｃ ｃｃａａｇｇｇｃｔｇ ｇｔｇｇｃｔｔｃｃａ ａｇｇｇａｇｔｇｇｇ
１６２１ ａｃｃｃｃｔｇａｇｃ ｃａｇｇｇｔｃａｇａ ｇａｃｃｃｔｇａａａ ｔｔｇｃａｇｃａｇｔ ｔｇｇｔｇｇａｇａａ ｃａｔｔｇａｃａａｇ
１６８１ ｇｃｃａｃｃａｃｔｇ ａｔｃｃｃａａｃｇａ ａｔｇｔｃｔｃａｔｔ ｔｇｃｃａｃｃｇａｇ ｔｃｔｔａａｇｃｔｇ ｔｃａｇａｇｃｔｃｃ
１７４１ ｃｔｃａａｇａｔｇｃ ａｔｔａｔｃｇｃａｃ ｃｃａｃａｃｃｇｇｇ ｇａｇａｇａｃｃｇｔ ｔｃｃａｇｔｇｔａａ ｇａｔｃｔｇｔｇｇｃ
１８０１ ｃｇａｇｃｃｔｔｔｔ ｃｔａｃｃａａａｇｇ ｔａａｃｃｔｇａａｇ ａｃａｃａｃｃｔｔｇ ｇｇｇｔｔｃａｃｃｇ ａａｃｃａａｃａｃａ
１８６１ ｔｃｃａｔｔａａｇａ ｃｇｃａｇｃａｔｔｃ ｇｔｇｃｃｃｃａｔｃ ｔｇｃｃａｇａａｇａ ａｇｔｔｃａｃｔａａ ｔｇｃｃｇｔｇａｔｇ
１９２１ ｃｔｇｃａｇｃａａｃ ａｔａｔｔｃｇｇａｔ ｇｃａｃａｔｇｇｇｃ ｇｇｔｃａｇａｔｔｃ ｃｃａａｃａｃｇｃｃ ｃｃｔｇｃｃａｇａｇ
１９８１ ａａｔｃｃｃｔｇｔｇ ａｃｔｔｔａｃｇｇｇ ｔｔｃｔｇａｇｃｃａ ａｔｇａｃｃｇｔｇｇ ｇｔｇａｇａａｃｇｇ ｃａｇｃａｃｃｇｇｃ
２０４１ ｇｃｔａｔｃｔｇｃｃ ａｔｇａｔｇａｔｇｔ ｃａｔｃｇａａａｇｃ ａｔｃｇａｔｇｔａｇ ａｇｇａａｇｔｃａｇ ｃｔｃｃｃａｇｇａｇ
２１０１ ｇｃｔｃｃｃａｇｃａ ｇｃｔｃｃｔｃｃａａ ｇｇｔｃｃｃｃａｃｇ ｃｃｔｃｔｔｃｃｃａ ｇｃａｔｃｃａｃｔｃ ｇｇｃａｔｃａｃｃｃ
２１６１ ａｃｇｃｔａｇｇｇｔ ｔｔｇｃｃａｔｇａｔ ｇｇｃｔｔｃｃｔｔａ ｇａｔｇｃｃｃｃａｇ ｇｇａａａｇｔｇｇｇ ｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔ
２２２１ ｔｔｔａａｃｃｔｇｃ ａｇｃｇｃｃａｇｇｇ ｃａｇｃａｇａｇａａ ａａｃｇｇｔｔｃｃｇ ｔｇｇａｇａｇｃｇａ ｔｇｇｃｔｔｇａｃｃ
２２８１ ａａｃｇａｃｔｃａｔ ｃｃｔｃｇｃｔｇａｔ ｇｇｇａｇａｃｃａｇ ｇａｇｔａｔｃａｇａ ｇｃｃｇａａｇｃｃｃ ａｇａｔａｔｃｃｔｇ
２３４１ ｇａａａｃｃａｃａｔ ｃｃｔｔｃｃａｇｇｃ ａｃｔｃｔｃｃｃｃｇ ｇｃｃａａｔａｇｔｃ ａａｇｃｃｇａａａｇ ｃａｔｃａａｇｔｃａ
２４０１ ａａｇｔｃｔｃｃｃｇ ａｔｇｃｔｇｇｇａｇ ｃａａａｇｃａｇａｇ ａｇｃｔｃｃｇａｇａ ａｃａｇｃｃｇｃａｃ ｔｇａｇａｔｇｇａａ
２４６１ ｇｇｔｃｇｇａｇｃａ ｇｔｃｔｃｃｃｔｔｃ ｃａｃｇｔｔｔａｔｃ ｃｇａｇｃｃｃｃｇｃ ｃｇａｃｃｔａｔｇｔ ｃａａｇｇｔｔｇａａ
２５２１ ｇｔｔｃｃｔｇｇｃａ ｃａｔｔｔｇｔｇｇｇ ａｃｃｃｔｃｇａｃａ ｔｔｇｔｃｃｃｃａｇ ｇｇａｔｇａｃｃｃｃ ｔｔｔｇｔｔａｇｃａ
２５８１ ｇｃｃｃａｇｃｃａｃ ｇｃｃｇａｃａｇｇｃ ｃａａｇｃａａｃａｔ ｇｇｃｔｇｃａｃａｃ ｇｇｔｇｔｇｇｇａａ ｇａａｃｔｔｃｔｃｇ
２６４１ ｔｃｔｇｃｔａｇｃｇ ｃｔｃｔｔｃａｇａｔ ｃｃａｃｇａｇｃｇｇ ａｃｔｃａｃａｃｔｇ ｇａｇａｇａａｇｃｃ ｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃ
２７０１ ａａｃａｔｔｔｇｔｇ ｇｇｃｇａｇｃｔｔｔ ｔａｃｃａｃｃａａａ ｇｇｃａａｃｔｔａａ ａｇｇｔｔｃａｃｔａ ｃａｔｇａｃａｃａｃ
２７６１ ｇｇｇｇｃｇａａｃａ ａｔａａｃｔｃａｇｃ ｃｃｇｃｃｇｔｇｇａ ａｇｇａａｇｔｔｇｇ ｃｃａｔｃｇａｇａａ ｃａｃｃａｔｇｇｃｔ
２８２１ ｃｔｇｔｔａｇｇｔａ ｃｇｇａｃｇｇａａａ ａａｇａｇｔｃｔｃａ ｇａａａｔｃｔｔｔｃ ｃｃａａｇｇａａａｔ ｃｃｔｇｇｃｃｃｃｔ
２８８１ ｔｃａｇｔｇａａｔｇ ｔｇｇａｃｃｃｔｇｔ ｔｇｔｇｔｇｇａａｃ ｃａｇｔａｃａｃｃａ ｇｃａｔｇｃｔｃａａ ｔｇｇｃｇｇｔｃｔｇ
２９４１ ｇｃｃｇｔｇａａｇａ ｃｃａａｔｇａｇａｔ ｃｔｃｔｇｔｇａｔｃ ｃａｇａｇｔｇｇｇｇ ｇｇｇｔｔｃｃｔａｃ ｃｃｔｃｃｃｇｇｔｔ
３００１ ｔｃｃｔｔｇｇｇｇｇ ｃｃａｃｃｔｃｃｇｔ ｔｇｔｇａａｔａａｃ ｇｃｃａｃｔｇｔｃｔ ｃｃａａｇａｔｇｇａ ｔｇｇｃｔｃｃｃａｇ
３０６１ ｔｃｇｇｇｔａｔｃａ ｇｔｇｃａｇａｔｇｔ ｇｇａａａａａｃｃａ ａｇｔｇｃｔａｃｔｇ ａｃｇｇｃｇｔｔｃｃ ｃａａａｃａｃｃａｇ
３１２１ ｔｔｔｃｃｔｃａｃｔ ｔｃｃｔｇｇａａｇａ ａａａｃａａｇａｔｔ ｇｃｇｇｔｃａｇｃｔ ａａ（配列番号２）
である。
【0085】
一態様では、本発明で提供する方法は、ＳＡＬＬ４タンパク質の分解を判断することに基づいている。
【0086】
いくつかの実施形態では、本発明において提供するのは、（ａ）セレブロン改変化合物を試料に投与すること、及び（ｂ）その化合物が、その試料中のＳＡＬＬ４タンパク質の分解を誘発するかを判断することを含む方法である。
【0087】
いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法は、セレブロン改変化合物群（または治療用のセレブロン改変化合物群）をスクリーニングして、催奇形性作用のリスクが低減されたセレブロン改変化合物を特定するためのものである。別の実施形態では、本発明で提供する方法は、セレブロン改変化合物を特徴付けるため、より具体的には、セレブロン改変化合物（または治療用のセレブロン改変化合物）が催奇形性作用を誘発し得るかを判断するためのものである。
【0088】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）試料を得ること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、（ｃ）そのセレブロン改変化合物をその試料に投与すること、（ｄ）その試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、（ｅ）ＳＡＬＬ４のその第１のレベルとその第２のタンパク質レベルを比較して、そのセレブロン改変化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断すること、及び（ｆ）ＳＡＬＬ４の分解を誘発しないそのセレブロン改変化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４の分解の低減を誘導するそのセレブロン改変化合物を選択することを含む方法である。
【0089】
ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）試料を得ること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、（ｃ）その化合物をその試料に投与すること、（ｄ）その試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、（ｅ）ＳＡＬＬ４のその第１のレベルとその第２のタンパク質レベルを比較して、その化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断すること、及び（ｆ）ＳＡＬＬ４の分解を誘発しないその化合物を選択することを含む方法である。
【0090】
別の実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）試料を得ること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、（ｃ）その化合物をその試料に投与すること、（ｄ）その試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、（ｅ）ＳＡＬＬ４のその第１のレベルとその第２のタンパク質レベルを比較して、その化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断すること、及び（ｆ）ＳＡＬＬ４の分解の低減を示すその化合物を選択することを含む方法である。一実施形態では、そのＳＡＬＬ４の分解は、サリドマイドによるそのＳＡＬＬ４の分解と比べて低減される。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４の分解は、サリドマイドによるそのＳＡＬＬ４の分解と比べて低減される。
【0091】
ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）試料を得ること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、（ｃ）そのセレブロン改変化合物をその試料に投与すること、（ｄ）その試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、（ｅ）ＳＡＬＬ４のその第１のレベルとその第２のタンパク質レベルを比較して、その化合物の催奇形性を判断することを含む方法である。
【0092】
ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）試料を得ること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、（ｃ）その化合物をその試料に投与すること、（ｄ）その試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、（ｅ）ＳＡＬＬ４のその第１のレベルとその第２のタンパク質レベルを比較して、その化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断することによって、その化合物の催奇形性を判断することを含む方法である。
【0093】
別の態様では、本発明で提供する方法は、ＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めることに基づいている。
【0094】
ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）そのセレブロン改変化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めること、（ｃ）ＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発しないそのセレブロン化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルの低下を誘導するそのセレブロン改変化合物を選択することを含む方法である。
【0095】
いくつかの実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めること、（ｃ）ＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発しないその化合物を選択することを含む方法を提供する。
【0096】
別の実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めること、（ｃ）ＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルの低下を示すその化合物を選択することを含む方法である。一実施形態では、そのＳＡＬＬ４のユビキチン化は、対照化合物によるそのＳＡＬＬ４のユビキチン化と比べて低下する。一実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４のユビキチン化は、サリドマイドによるそのＳＡＬＬ４のユビキチン化と比べて低下する。
【0097】
いくつかの実施形態では、本発明において提供するのは、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めることによって、その化合物の催奇形性を判断することを含む方法である。化合物によって誘発される、ＳＡＬＬ４のユビキチン化によって、催奇形性の可能性が示される。いくつかの実施形態では、ＳＡＬＬ４のより高度なユビキチン化によって、その化合物が、催奇形性作用を誘発する可能性が高いことが示される。
【0098】
さらに別の態様では、本発明で提供する方法は、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用（または結合）を判断することに基づいている。
【0099】
セレブロンは、特定のセレブロン改変化合物、例えば、サリドマイド、ポマリドミド及びレナリドマイドに結合する重要な分子標的として特定されている。これらの化合物は、セレブロンを標的とし、そのユビキチンリガーゼの基質特異性を改変して、特定のがん細胞において臨床活性を誘導する。結合した基質は、セレブロン－ＣＲＬ４複合体によってユビキチン化され、その結果、２６Ｓプロテアソームによって分解される。したがって、ＳＡＬＬ４の分解は、セレブロン改変化合物で処理した場合のＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用（もしくは結合）、及び／またはセレブロン改変化合物で処理した場合のＳＡＬＬ４のユビキチン化を解析することによっても判断することができる。
【0100】
ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）そのセレブロン改変化合物を試料に投与すること、（ｂ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断すること、（ｃ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発しないそのセレブロン改変化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用の低減を誘導するそのセレブロン改変化合物を選択することを含む方法である。
【0101】
いくつかの実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）その試料中のＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断すること、（ｃ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発しないその化合物を選択することを含む方法である。
【0102】
別の実施形態では、本発明において提供するのは、疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断すること、（ｃ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を低減させるその化合物を選択することを含む方法である。一実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用は、対照化合物の存在下における、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用と比べて低減される。一実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用は、サリドマイドの存在下における、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用と比べて低減される。
【0103】
ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）そのセレブロン改変化合物を試料に投与すること、（ｂ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断することによって、その化合物の催奇形性を判断することを含む方法である。
【0104】
さらに別の実施形態では、本発明において提供するのは、セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、（ａ）その化合物を試料に投与すること、（ｂ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断することを含み、ＳＡＬＬ４とＣＲＢＮとのその相互作用によって、催奇形性の可能性が示される方法である。ある特定の実施形態では、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断することは、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの物理的相互作用または結合を判断することを含む。
【0105】
下記の第６節の実施例に示されているように、本開示によって、ＳＡＬＬ４タンパク質の部分のうち、セレブロン改変化合物の存在下で、セレブロンへの結合に直接関与する少なくとも一部分として、ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）またはその断片（例えば、ＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１））が特定され、この領域内の変異（例えばＧ４１６Ａ）によって、化合物で処理したときに、セレブロンとＳＡＬＬ４との相互作用が阻害される可能性があることが示されている。したがって、セレブロン改変化合物の存在下における、ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）またはその断片（例えば、ＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１））とセレブロンとの相互作用を利用して、セレブロン改変化合物による処理によって、ＳＡＬＬ４が分解し得るかを判断することができる。ある特定の実施形態では、ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸断片を使用する。ある特定の実施形態では、ＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸断片を使用する。
【0106】
特定のアッセイでは、ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基またはその断片（例えば、ＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基）内の１つ以上のアミノ酸が、セレブロン改変化合物の存在下で、セレブロンの特定のアミノ酸に結合するかを解析する。いくつかの実施形態では、解析するアミノ酸は、Ｇ４１６である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｔ４０５である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｇ４０６である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｅ４０７である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｒ４０８である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｐ４０９である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｆ４１０である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｖ４１１である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｃ４１２である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｓ４１３である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｖ４１４である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｈ４１７である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｒ４１８である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｆ４１９である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｔ４２０である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｔ４２１である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｋ４２２である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｇ４２３である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｎ４２４である。別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｌ４２５である。さらに別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｋ４２６である。さらに別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｖ４２７である。さらに別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｈ４２８である。さらに別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｆ４２９である。さらに別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｈ４３０である。さらに別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｒ４３１である。さらに別の実施形態では、そのアミノ酸は、Ｈ４３２である。
【0107】
本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、タンパク質の分解の判断は、当業者に知られているいずれかの従来の方法によって行うことができる。本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、そのセレブロン改変化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかは、セレブロン改変化合物の投与後のＳＡＬＬ４タンパク質のレベルと、対照レベルを比較することによって判断する。その対照は、コントロール試料を用いることによって用意でき、そのコントロール試料は、試料と同じ供給源に由来する。本発明で提供する各種の方法の別の実施形態では、その対照レベルは、セレブロン改変化合物の投与前に、試料中のＳＡＬＬ４タンパク質のレベルを測定することによって定める。いくつかの実施形態では、その対照レベルは、事前に定めたレベルである。いくつかの実施形態では、その対照レベルは、対照のセレブロン改変化合物、例えば、サリドマイド、レナリドマイドまたはポマリドミドの存在下におけるＳＡＬＬ４レベルである。
【0108】
いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法は、セレブロン改変化合物を試料に投与する前に、ＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、そのセレブロン改変化合物をその試料に投与した後に、ＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、その第１のレベルと第２のタンパク質レベルを比較すること、及びその第２のレベルが、その第１のレベルよりも有意に低くないかを判断すること（有意に低くないことによって、その化合物が、ＳＡＬＬ４タンパク質の分解を誘発しないことが示される）をさらに含む。
【0109】
本発明で提供する方法のいくつかの実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物をその試料に投与することは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。別の実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物をその試料に投与することは、ｉｎ ｖｉｖｏで行う。一実施形態では、試料を化合物と、ある期間、例えば、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２０日またはこれを超える日数にわたって接触させる。
【0110】
いくつかの実施形態では、本発明で提供する試料は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで得たかまたは採取した生体組織または生体液由来の試料であってよい。いくつかの実施形態では、その試料は、罹患細胞または罹患組織、例えば、前がん細胞、前がん組織、がん細胞、がん組織、例えば腫瘍を含む、患者の領域から得てよい。このような試料は、患者から単離した器官、組織及び細胞であることができるが、これらに限らない。例示的な試料としては、細胞溶解液、細胞培養液、組織、口腔組織、胃腸組織、器官、細胞小器官、生体液、血液試料、尿試料、皮膚試料、骨髄試料、循環腫瘍細胞などが挙げられるが、これらに限らない。別の実施形態では、本発明で提供する試料は、細胞溶解液、細胞培養液、細胞株、単離タンパク質、合成タンパク質、細胞抽出物、操作した細胞、細菌細胞、昆虫細胞、胎児細胞、胎児組織、ゼブラフィッシュなど、及びこれらのうちの１つ以上を組み合わせたものから選択した試料であってよい。
【0111】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する各種の方法では、対象または個体（例えば患者）に由来する試料（例えば生体試料）を使用する。その対象は、がん（例えば、リンパ腫、ＭＭまたは白血病）である患者のような患者であることができる。その対象は、哺乳動物、例えばヒトであることができる。その対象は、男性または女性であることができ、成人、幼児、乳児または胎児であることができる。試料は、がん（例えば、リンパ腫、ＭＭもしくは白血病）の活動期中の時点に、またはがん（例えば、リンパ腫、ＭＭもしくは白血病）が非活動期であるときに解析できる。ある特定の実施形態では、対象由来の試料を２つ以上得ることができる。
【0112】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法で用いる試料は、対象由来の体液を含む。体液の非限定的な例としては、血液（例えば全血）、血漿、羊水、房水、胆汁、耳垢、クーパー液、射精前液、乳び、び汁、膣液、間質液、リンパ液、月経血、母乳、粘液、胸膜液、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、涙、尿、膣潤滑液、嘔吐物、水、糞便、体内液（脳及び脊髄周囲の脳脊髄液を含む）、滑液、細胞内液（細胞内側の流体）、ならびに硝子体液（眼球内の流体）が挙げられる。いくつかの実施形態では、その試料は、血液試料である。血液試料は、例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ，ｅｄｓ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）に記載されているような従来の技法を用いて得ることができる。従来の技法または市販のキット、例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐキット（Ｓｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、血液試料から、白血球細胞を分離することができる。従来の技法、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、白血球細胞のサブ集団、例えば、単核球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、顆粒球またはリンパ球をさらに単離できる。
【0113】
一実施形態では、血液試料は、約０．１ｍＬ～約１０．０ｍＬ、約０．２ｍＬ～約７ｍＬ、約０．３ｍＬ～約５ｍＬ、約０．４ｍＬ～約３．５ｍＬまたは約０．５ｍＬ～約３ｍＬである。別の実施形態では、血液試料は、約０．３ｍＬ、約０．４ｍＬ、約０．５ｍＬ、約０．６ｍＬ、約０．７ｍＬ、約０．８ｍＬ、約０．９ｍＬ、約１．０ｍＬ、約１．５ｍＬ、約２．０ｍＬ、約２．５ｍＬ、約３．０ｍＬ、約３．５ｍＬ、約４．０ｍＬ、約４．５ｍＬ、約５．０ｍＬ、約６．０ｍＬ、約７．０ｍＬ、約８．０ｍＬ、約９．０ｍＬまたは約１０．０ｍＬである。
【0114】
いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いる試料は、生検標本（例えば腫瘍生検標本）を含む。生検標本は、いずれかの器官または組織、例えば、皮膚、肝臓、肺、心臓、結腸、腎臓、骨髄、歯、リンパ節、毛髪、脾臓、脳、乳房またはその他の器官から得たものであることができる。対象から試料を単離するには、当業者に知られているいずれかの生検技法、例えば、開放生検、非切開生検、コア生検、切開生検、切除生検または細針吸引生検を用いることができる。
【0115】
一実施形態では、本発明で提供する方法で用いる試料は、対象が、疾患または障害に対する治療を受ける前に、対象から得る。別の実施形態では、試料は、対象が、疾患または障害に対する治療を受けている最中に、対象から得る。別の実施形態では、試料は、対象が、疾患または障害に対する治療を受けた後に、対象から得る。各種の実施形態では、本明細書に示されているセレブロン改変化合物を対象に投与することが含まれる。
【0116】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法で用いる試料は、がん（例えば、リンパ腫、ＭＭまたは白血病）細胞のような複数の細胞を含む。このような細胞としては、いずれかのタイプの細胞、例えば、幹細胞、血液細胞（例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ））、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、顆粒球、免疫細胞またはがん細胞を挙げることができる。
【0117】
Ｂ細胞（Ｂリンパ球）としては、例えば、血漿Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞、辺縁帯Ｂ細胞及び濾胞性Ｂ細胞が挙げられる。Ｂ細胞は、免疫グロブリン（抗体）及びＢ細胞受容体を発現できる。
【0118】
特異的細胞集団は、市販の抗体（例えば、Ｑｕｅｓｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ（Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＤａｋｏ（Ｄｅｎｍａｒｋ）の抗体）を組み合わせたものを用いて得ることができる。
【0119】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法における細胞は、ＰＢＭＣである。ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法で用いる試料は、例えば、がん（例えばリンパ腫、ＭＭまたは白血病）である個体の疾患組織から得たものである。
【0120】
ある特定の実施形態では、化合物の作用を評価するか、作用機序を調べるか、または対照レベルを定めるなどするための疾患モデルとして、細胞株由来の試料を使用する。いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法で用いる細胞は、がん細胞株に由来するものである。
【0121】
例えば、いくつかの実施形態では、白血病細胞株を試料として使用する。例えば、一実施形態では、ＡＭＬ細胞株を試料として使用する。一実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＫＧ－１細胞株である。別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＫＧ－１ａ細胞株である。さらに別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＫＡＳＵＭＩ－１細胞株である。さらに別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＮＢ４細胞株である。一実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＭＶ－４－１１細胞株である。別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＭＯＬＭ－１３細胞株である。さらに別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＨＬ－６０細胞株である。さらに別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、Ｕ－９３７細胞株である。一実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＯＣＩ－ＡＭＬ２細胞株である。別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞株である。さらに別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＨＮＴ－３４細胞株である。さらに別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＭＬ－２細胞株である。一実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、ＡＭＬ－１９３細胞株である。別の実施形態では、そのＡＭＬ細胞株は、Ｆ３６－Ｐ細胞株である。他の例示的な白血病細胞株としては、８Ｅ５細胞株、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株、ＣＣＲＦ－ＨＳＢ－２細胞株、ＭＯＬＴ－３細胞株、ＣＥＭ／Ｃ２細胞株、ＣＥＭ／Ｃ１細胞株、ＴＡＬＬ－１０４細胞株、ＴＨＰ－１細胞株、Ｋａｓｕｍｉ－３細胞株、ＢＤＣＭ細胞株、ＮＣＩ－ＢＬ２１２２細胞株、ＪＡＡ－Ｆ１１細胞株、３１Ｅ９細胞株、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞株、ＭＶ－４－１１細胞株、ＢＣＰ－１細胞株、ＪＶＭ－１３細胞株、ＫＵ８１２細胞株、ＭＹＡ－１細胞株、Ｍｏ－Ｂ細胞株、ＭＭ．１Ｓ細胞株、ＲＢＬ－１細胞株及びＷＥＨＩ－３細胞株が挙げられるが、これらに限らない。
【0122】
別の例では、リンパ腫及び血液細胞株を試料として使用する。例示的な細胞株としては、Ｄａｕｄｉ細胞株、ＧＡ－１０細胞株、ＨＣＣ３８ＢＬ細胞株、ＨＣＣ２２１８ＢＬ細胞株、ＨＨ細胞株、Ｔｏｌｅｄｏ細胞株、ＦｅＴ－Ｊ細胞株、ＮＫ－９２細胞株、Ｍｉｎｏ細胞株、ＪＶＭ－２細胞株、ＥＭＬ－３Ｃ細胞株、ＩＢ４細胞株、６３Ｄ３細胞株、Ｃ１Ｒ－Ｂ７細胞株、ＯＫＴ５細胞株及び１Ｈ３細胞株が挙げられるが、これらに限らない。
【0123】
別の実施形態では、ＨＴ－１３７６細胞株、ＳＣａＢＥＲ細胞株、Ｔ２４細胞株、ＲＴ４細胞株、ＴＭＢ－５４細胞株及びＨＴ１１９７．Ｔ細胞株のような膀胱癌細胞株を試料として使用する。
【0124】
別の実施形態では、ＳＵＰ－Ｂ１５細胞株、Ｈｓ６９６細胞株、Ｋ－５６２細胞株、ＭＥＧ－０１細胞株、ＴＦ－１細胞株、ＲＤ－ＥＳ細胞株、ＳＡＭＬ－２細胞株、ＦＤＣ－Ｐ１細胞株、Ｄ－１７細胞株、ＨＯＳ細胞株、ＵＭＲ－１０６細胞株、ＳＫ－ＥＳ－１細胞株、ＫＭ７０３細胞株及びＢＢｍ細胞株のような骨癌細胞株を試料として使用する。
【0125】
別の実施形態では、ＳＷ１０８８細胞株、ＣＨＬＡ－０２－ＡＴＲＴ細胞株、Ｕ－１１８ＭＧ細胞株、ＨＣＮ－２細胞株、ＲＧ２細胞株、ＬＮ－２２９細胞株、Ｃ６細胞株、３Ｇ５細胞株、Ｍ０５９Ｋ細胞株、Ｘ２２細胞株、ＳＣＰ細胞株、ＯＡ１細胞株及びＮＥ－ＧＦＰ－４Ｃ細胞株のような脳癌細胞株を試料として使用する。
【0126】
さらに別の実施形態では、Ｈｓ２８１．Ｔ細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株、ＣＡＭＡ－１細胞株、ＳＫ－ＢＲ－３細胞株、ＲＢＡ細胞株、ＵＡＣＣ－１１７９細胞株、ＮＭＵ細胞株、ＢＴ－４８３細胞株、Ｔ－４７Ｄ細胞株、ＺＲ－７５－３０細胞株、ＭＣＦ１０Ａ細胞株及びＥＭＴ６細胞株のような乳癌細胞株を試料として使用する。
【0127】
さらに別の実施形態では、ＲＫＯのような結腸癌細胞株を試料として使用する。さらに別の実施形態では、ＨｅＬａ２２９のような婦人科癌細胞株を試料として使用する。さらに別の実施形態では、ＦａＤｕのような頭頸部癌細胞株を試料として使用する。さらに別の実施形態では、Ｃａｐａｎ－１のような肝臓癌細胞株を試料として使用する。さらに別の実施形態では、Ｃａｌｕ－３のような肺癌細胞株を試料として使用する。さらに別の実施形態では、ＨＰＡＣのような膵臓癌細胞株を試料として使用する。さらに別の実施形態では、ＳＫ－ＬＭＳ－１のような肉腫細胞株を試料として使用する。他のがんモデルの細胞株も本開示に含まれる。
【0128】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法で用いる細胞の数は、１つの細胞～約１０９個の細胞の範囲であることができる。いくつかの実施形態では、本発明で提供する方法で用いる細胞の数は、約１×１０４個、約５×１０４個、約１×１０５個、約５×１０５個、約１×１０６個、約５×１０６個、約１×１０７個、約５×１０７個、約１×１０８個、約５×１０８個または約１×１０９個である。
【0129】
細胞の数及び種類は、例えば、フローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学法（例えば、組織特異的抗体もしくは細胞マーカー特異的抗体による染色）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）のような標準的な細胞検出技法を用いて、細胞表面マーカーの変化を測定することによって、光学顕微鏡もしくは共焦点顕微鏡を用いて、細胞の形態を調べることによって、及び／またはＰＣＲ及び遺伝子発現プロファイリングのような、当該技術分野において周知である技法を用いて、遺伝子発現の変化を測定することによってモニタリングできる。これらの技法は、１つ以上の特定のマーカーに対して陽性である細胞を特定するのにも用いることができる。
【0130】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法において、細胞サブセットを使用する。特異的細胞集団を選別及び単離する方法は、当該技術分野において周知であり、細胞の大きさ、形態、または細胞内もしくは細胞外のマーカーに基づくことができる。このような方法としては、フローサイトメトリー、フローソーティング、ＦＡＣＳ、ビーズベースの分離（磁気細胞選別など）、サイズベースの分離（例えば、ふるい、障害物の配列またはフィルター）、マイクロフルイディクスデバイスでの選別、抗体ベースの分離、沈降、親和性吸着、親和性抽出、密度勾配遠心分離、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションなどが挙げられるが、これらに限らない。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、細胞を含む粒子の蛍光特性に基づき、その粒子を分離するための周知の方法である（Ｋａｍａｒｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５１：１５０－１６５（１９８７））。個々の粒子の蛍光分子をレーザー励起させると、わずかな電荷が付与され、混合物から正の粒子と負の粒子を電磁分離できるようになる。一実施形態では、細胞表面マーカー特異的な抗体またはリガンドを別個の蛍光標識で標識する。細胞をセルソーターにかけて処理し、使用する抗体に結合する能力に基づき、細胞を分離させる。ＦＡＣＳで選別した粒子は、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートの個々のウェルに直接入れて、分離とクローニングを容易にしてよい。
【0131】
ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルは、当業者に知られている方法を用いて求めることができる。
【0132】
ある特定の実施形態では、本発明において提供する方法は、試料、例えば生体試料に由来するＳＡＬＬ４のタンパク質レベルを検出及び定量する方法である。
【0133】
いくつかのタンパク質検出方法及び定量方法を用いて、ＳＡＬＬ４のレベルを測定できる。いずれかの好適なタンパク質定量方法を用いることができる。いくつかの実施形態では、抗体ベースの方法を使用する。使用できる例示的な方法としては、イムノブロッティング（ウエスタンブロット）、臨床現場即時法／臨床現場即時プラットフォーム、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学法、フローサイトメトリー、サイトメトリービーズアレイ、質量分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のようなクロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限らない。直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びサンドイッチＥＬＩＳＡを含め、いくつかのタイプのＥＬＩＳＡが一般的に用いられている。
【0134】
タンパク質レベルを検出するには、例えばプローブ（例えば、ＳＡＬＬ４と特異的に相互作用できる結合タンパク質、例えば抗体）によって、試料中のポリペプチド産物を検出する周知の方法が数多く存在する。標識した抗体、その結合部分またはその他の結合パートナーを使用できる。その抗体は、元々、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体であることができ、あるいは、生合成によって作製してもよい。結合パートナーも、天然の分子であっても、合成によって作製してもよい。複合タンパク質の量は、当該技術分野において説明されている標準的なタンパク質検出手法を用いて求める。免疫アッセイの設計、理論及びプロトコールの詳細な論評は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４を含め、当該技術分野における多くのテキストに見ることができる。
【0135】
標識抗体によってタンパク質を検出するには、様々な免疫組織化学法アッセイが利用可能である。直接標識としては、抗体に結合する蛍光または発光タグ、金属、色素、放射性ヌクレオチドなどが挙げられる。間接標識としては、アルカリホスファターゼ、水素ペルオキシダーゼなどのような、当該技術分野において周知の様々な酵素が挙げられる。１ステップアッセイでは、標的ＳＡＬＬ４タンパク質を固定化し、標識抗体とともにインキュベートする。その標識抗体は、その固定化した標的分子に結合する。洗浄して、未結合の分子を除去した後、その標識の存在について、試料をアッセイする。多くの免疫組織化学法が、臨床現場即時形式及びハンドヘルド型に取り入れられており、そのいずれも、タンパク質レベルを求めるのに使用し得る。
【0136】
そのタンパク質またはポリペプチドに特異的な固定化抗体の使用も、本開示によって企図されている。その抗体は、磁性粒子、クロマトグラフマトリックス粒子、アッセイ場所（マイクロタイターウェルなど）の表面、固体基板材料片（プラスチック片、ナイロン片、紙片など）などのような様々な固体支持体の上に固定化できる。その抗体またはアレイ状の複数の抗体を固体支持体の上にコーティングすることによって、アッセイストリップを調製できる。続いて、このストリップを試験試料に浸漬させ、洗浄及び検出工程によって処理して、測定可能なシグナル、例えば着色スポットを生成させる。
【0137】
２ステップアッセイでは、固定化した標的タンパク質ＳＡＬＬ４を非標識抗体とともにインキュベートしてよい。そして、非標識抗体複合体が存在する場合、その複合体を、その非標識抗体に特異的である二次標識抗体に結合させる。その試料を洗浄し、標識の存在についてアッセイする。抗体を標識するのに用いるマーカーの選択は、用途に応じて変化することになる。しかしながら、マーカーの選択は、当業者には容易に判断可能である。
【0138】
その抗体は、放射性原子、酵素、発色部分、蛍光部分または比色タグで標識し得る。タグ標識の選択は、所望の検出限界にも左右されることになる。酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は典型的には、酵素タグ付加複合体と酵素基質との相互作用によって形成される着色生成物の検出を可能にする。放射性原子のいくつかの例としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１４Ｐが挙げられる。酵素のいくつかの例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。発色部分のいくつかの例としては、フルオレセイン及びローダミンが挙げられる。その抗体は、当該技術分野において知られている方法によって、これらの標識にコンジュゲートし得る。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのようなカップリング剤によって、酵素及び発色分子を抗体にコンジュゲートし得る。あるいは、コンジュゲートは、リガンド－受容体ペアを通じて行ってもよい。いくつかの好適なリガンド－受容体ペアとしては、例えば、ビオチン－アビジン、ビオチン－ストレプトアビジン及び抗体－抗原が挙げられる。
【0139】
一態様では、本開示において、生体試料中の標的タンパク質ＳＡＬＬ４のレベルを検出するのに、サンドイッチ技法を使用することが企図されている。その技法では、対象とするタンパク質と結合できる２つの抗体、例えば、一方で固体支持体の上に固定化する抗体、及び一方で溶液中で遊離しているが、ある程度容易に検出可能な化学化合物で標識した抗体が必要となる。その二次抗体に使用し得る化学標識の例としては、反応基質または酵素基質に暴露されると、着色生成物または電気化学的に活性な生成物を生成させる放射線同位体、蛍光化合物及び酵素、またはその他の分子が挙げられるが、これらに限らない。ＳＡＬＬ４タンパク質を含む試料をこの系に添加すると、そのポリペプチドは、固定化抗体及び標識抗体の両方に結合する。その結果、支持体の表面に「サンドイッチ」状の免疫複合体が得られる。その複合タンパク質は、未結合の試料成分及び過剰な標識抗体を洗い流し、支持体の表面上のタンパク質と複合化した標識抗体の量を測定することによって検出する。サンドイッチイムノアッセイは、検出限界に優れる標識を用いると、特異性が高く、感度が良い。
【0140】
ドットブロッティングは、抗体をプローブとして用いて、所望のタンパク質を検出する目的で、当業者によって日常的に使用されている（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，Ｐａｇｅ ２６３，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ドットブロット装置を用いて、試料を膜に塗布する。標識プローブをその膜とともにインキュベートし、タンパク質の存在を検出する。
【0141】
ウエスタンブロット解析は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｖｏｌ．３，Ｃｈａｐｔｅｒ １８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。ウエスタンブロットでは、試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離する。そのゲルを膜に転写する。所望のタンパク質を検出するために、その膜を標識抗体とともにインキュベートする。
【0142】
上記のアッセイには、イムノブロッティング、免疫拡散、免疫電気泳動または免疫沈降（ただし、これらに限らない）のような工程が伴う。抗体とタンパク質またはポリペプチドとの特異的な免疫学的結合は、直接または間接的に検出できる。いくつかの実施形態では、自動解析装置（例えば自動シーケンシング装置）を用いて、ＳＡＬＬ４のレベルを求める。このような方法はいずれも、当業者に周知である。
【0143】
いくつかの実施形態では、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルまたは存在は、質量分析（ＭＳ）によって解析し、及び／または求める。典型的には、タンパク質の質量分析（ＭＳ）による解析によって、イオンの質量電荷比を測定して、単純な混合物及び複雑な混合物中の分子を同定及び定量する。質量分析計は、イオン源、質量分析部及びイオン検出部を有する。これらの構成要素の性質は、質量分析計の目的、必要なデータの種類、及び試料の物理的特性によって異なる。試料を質量分析計に液体、気体または乾燥の形態で入れてから気化させ、イオン源（例えば、ＡＰＣＩ、ＤＡＲＴ、ＥＳＩ）によってイオン化する。これらの分子が帯びる電荷により、質量分析計において、それらのイオンが加速して、そのシステムの残部にわたり移動できるようになる。それらのイオンが、質量分析部の電場及び／または磁場にさらされると、個々のイオンの軌道が、それらのｍ／ｚに基づき偏向する。広く用いられている質量分析部としては、飛行時間［ＴＯＦ］型、オービトラップ型、四重極型及びイオントラップ型が挙げられ、それぞれの型には、特有の特徴がある。質量分析部を用いて、網羅的解析のために、試料中のすべてのアナライトを分離することができ、あるいは、質量分析部をフィルターのように用いて、特定のイオンのみを検出部の方に偏向させることができる。そして、質量分析部によってうまく偏向したイオンは、イオン検出部に衝突する。これらの検出部は、各イオンが検出部のプレートに衝突すると、カスケード状の電子を放出する電子増倍管またはマイクロチャンネルプレートであることが最も多い。このカスケードによって、感度向上のために、イオンが衝突するごとに増幅が行われる。このプロセス全体は、高度の真空状態で行って、気体分子及び非試料の中性夾雑イオン（試料のイオンと衝突して、それらの軌道を変えたり、または非特異的な反応生成物を生成させたりすることがある）を除去する。質量分析計は典型的には、イメージ電流検出を用いて、イオン振動数を測定し、質量スペクトルを得るコンピューターベースのソフトウェアプラットフォームに接続する。データ解析プログラムがイオンを検出し、そのイオンの個々のｍ／ｚ値及び相対強度によってプロットを行う。そして、そのｍ／ｚ値に基づき、分子の構造を予測する構築済みのデータベースによって、これらのイオンを同定できる。
【0144】
ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、試料、例えば生体試料に由来するＳＡＬＬ４のＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）レベルを検出及び定量する方法である。
【0145】
ｍＲＮＡレベルを検出または定量する方法は、当該技術分野においていくつか知られている。例示的な方法としては、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲベースの方法などが挙げられるが、これらに限らない。そのｍＲＮＡ配列を用いて、そのｍＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的であるプローブを調製できる。続いて、そのプローブを用いて、ＰＣＲベースの方法、ノーザンブロッティング、ディップスティックアッセイなどのようないずれかの好適なアッセイによって、試料中のｍＲＮＡを検出できる。
【0146】
別の実施形態では、試料、例えば生体試料中の核酸のアッセイを調製できる。アッセイは典型的には、固体支持体、及びその支持体と接触している少なくとも１つの核酸を含み、その核酸は、患者において、化合物による治療の際に発現が変化したｍＲＮＡの少なくとも一部に対応する。そのアッセイは、その試料におけるそのｍＲＮＡの発現の変化を検出するための手段を有することもできる。
【0147】
そのアッセイ方法は、所望のｍＲＮＡ情報の種類に応じて変化し得る。例示的な方法としては、ノーザンブロット及びＰＣＲベースの方法（例えばｑＲＴ－ＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限らない。ｑＲＴ－ＰＣＲのような方法は、試料中のｍＲＮＡの量を正確に定量することもできる。
【0148】
いずれかの好適なアッセイプラットフォームを用いて、試料中のｍＲＮＡの存在を判断できる。例えば、アッセイは、ディップスティック、膜、チップ、ディスク、テストストリップ、フィルター、マイクロスフィア、スライド、マルチウェルプレートまたは光ファイバーの形態であってよい。アッセイ系は、そのｍＲＮＡに対応する核酸が結合されている固体支持体を有してもよい。この固体支持体は、例えば、プラスチック、シリコン、金属、樹脂、ガラス、膜、粒子、沈殿物、ゲル、ポリマー、シート、球体、多糖、キャピラリー、フィルム、プレートまたはスライドを含み得る。そのアッセイ構成成分は、ｍＲＮＡを検出するためのキットとして調製して、一緒にパッケージ化することができる。
【0149】
所望の場合、その核酸を標識して、標識ｍＲＮＡの集団を作製できる。概して、試料は、当該技術分野において周知である方法を用いて標識できる（例えば、ＤＮＡリガーゼ、ターミナルトランスフェラーゼを使用して、またはＲＮＡ骨格を標識することなどによって標識できる）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，３ｒｄ ｅｄ．１９９５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，３ｒｄ ｅｄ．２００１）を参照されたい。いくつかの実施形態では、試料は、蛍光標識で標識する。例示的な蛍光色素としては、キサンテン色素、フルオレセイン色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、６カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ））、ローダミン色素（例えば、ローダミン１１０（Ｒ１１０）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、５－カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６－カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６））、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７）、Ａｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ－５５５）、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ウンベリフェロン、ベンズイミド色素（例えばＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８）、フェナントリジン色素（例えばＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）、エチジウム色素、アクリジン色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、キノリン色素、ピレン、フルオレセインクロロトリアジニル、エオシン色素、テトラメチルローダミン、リサミン、ナフトフルオレセインなどが挙げられるが、これらに限らない。
【0150】
典型的なｍＲＮＡアッセイ方法は、１）表面に結合させた対象プローブを得る工程、２）表面に結合させたそのプローブに、特異的な結合をもたらすのに充分な条件で、ｍＲＮＡ集団をハイブリダイズさせる工程、（３）ハイブリダイズ後に洗浄して、表面に結合させたそのプローブに特異的に結合しなかった核酸を除去する工程、及び（４）ハイブリダイズしたｍＲＮＡを検出する工程を含むことができる。これらの各工程で用いる試薬、及びその使用条件は、具体的な用途に応じて変化し得る。
【0151】
ハイブリダイゼーションは、好適なハイブリダイゼーション条件下で行うことができ、この条件は、所望されるストリンジェンシーの点で異なり得る。典型的な条件は、相補的な結合メンバー間、すなわち、表面に結合させた対象プローブと、試料中の相補的なｍＲＮＡとの間のプローブ／標的複合体を固体表面上に生成させるのに充分な条件である。ある特定の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いてよい。
【0152】
ハイブリダイゼーションは典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で行う。標準的なハイブリダイゼーション技法（例えば、試料中の標的ｍＲＮＡをプローブに特異的に結合させるのに充分な条件下）は、Ｋａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２，２５８：８１８－８２１及び国際特許出願公開第ＷＯ９３／１８１８６号に記載されている。一般的技法の手引きは、いくつか入手可能である（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９９３））。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適する技法の説明については、Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１，２１：４７０－４８０、Ａｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ ７，ｐｇｓ４３－６５（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｔｌｏｗ ａｎｄ Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ，ｅｄｓ．１９８５）を参照されたい。温度、塩濃度、ポリヌクレオチド濃度、ハイブリダイゼーション時間、及び洗浄条件のストリンジェンシーなどを含む適切な条件の選択は、試料の供給源、捕捉物質の性質、予測される相補性の度合いなどを含む実験設計に左右されることになり、当業者にとっては日常的な実験の要素として決定することができる。
【0153】
代替的ではあるが、同等であるハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を用いて、同様のストリンジェンシーの条件をもたらすことができることを当業者は容易に認識するであろう。
【0154】
ｍＲＮＡハイブリダイゼーション手順の後、典型的には、表面に結合したポリヌクレオチドを洗浄して、未結合の核酸を除去する。洗浄は、いずれかの利便的な洗浄プロトコールを用いて行ってよく、その洗浄条件は典型的には、上記のように、ストリンジェントな条件である。そして、標準的な技法を用いて、プローブへの標的ｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを検出する。
【0155】
ＰＣＲベースの方法のような他の方法を用いて、ＳＡＬＬ４の発現を検出することもできる。ＰＣＲの方法の例は、米国特許第６，９２７，０２４号に見ることができ、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。ＲＴ－ＰＣＲの方法の例は、米国特許第７，１２２，７９９号に見ることができ、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲの方法は、米国特許第７，１８６，５０７号に記載されており、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【0156】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ標的の検出及び定量の両方に、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を用いることができる（Ｂｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．２００５，１０９：３６５－３７９）。ｑＲＴ－ＰＣＲによって得られる定量結果は概して、定性的データよりも情報量が多い。したがって、いくつかの実施形態では、ｑＲＴ－ＰＣＲベースのアッセイは、細胞ベースのアッセイの際に、ｍＲＮＡレベルを測定するのに有用であることがある。ｑＲＴ－ＰＣＲ法は、患者への治療をモニタリングするのにも有用である。ｑＲＴ－ＰＣＲベースの方法の例は例えば、米国特許第７，１０１，６６３号に見ることができ、この特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【0157】
通常の逆転写酵素ＰＣＲと、アガロースゲルによる解析とは対照的に、ｑＲＴ－ＰＣＲでは、定量結果が得られる。ｑＲＴ－ＰＣＲのさらなる利点は、使用が比較的容易なことと、利便的であることである。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００のようなｑＲＴ－ＰＣＲ用の機器は市販されており、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのような試薬も市販されている。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓをメーカーの指示に従って用いることができる。これらのキットは、ヒト、マウス及びラットのｍＲＮＡ転写産物を迅速かつ確実に検出及び定量するように、事前に調合した遺伝子発現アッセイである。例示的なｑＲＴ－ＰＣＲプログラムは例えば、５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒を４０サイクル行ってから、６０℃で１分行うものである。
【0158】
特定のアンプリコンの蓄積と関連する蛍光シグナルが閾値と交差するサイクル数（ＣＴという）を求めるために、例えば、比較ＣＴ相対定量算出法を用いる７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎソフトウェアｖｓ．を用いて、データを解析できる。この方法を用いると、出力は、発現レベルの変化倍率として表される。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、そのソフトウェアによって自動的に決定されるように選択できる。いくつかの実施形態では、閾値レベルは、ベースラインを上回るが、増幅曲線の指数関数的増加領域内に入るように充分低く設定する。
【0159】
セレブロン改変化合物によって誘発される、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用は、当業者に一般的に知られている方法を用いて解析できる。タンパク質間相互作用を解析するための各種の方法及びアプローチは、本明細書で説明するには数が非常に多いが、例示的な方法について以下で簡単に説明する。
【0160】
本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、共免疫沈降（Ｃｏ－ＩＰ）及びプルダウンアッセイのような物理的な方法を用いて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断する。Ｃｏ－ＩＰは、抗体によって沈降される標的タンパク質を用いて、結合パートナー／タンパク質複合体を溶解液から共沈降させること以外は、単一のタンパク質の免疫沈降（ＩＰ）と本質的に同じようにして行う。相互作用タンパク質を標的抗原に結合させ、支持体に固定化されている抗体に、そのタンパク質を結合させる。免疫沈降させたタンパク質及びその結合パートナーは一般的に、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロット解析によって検出する。
【0161】
プルダウンアッセイは、共免疫沈降と同様の手法のものである。これらの２つのアプローチの違いの１つは、Ｃｏ－ＩＰでは、抗体を用いてタンパク質複合体を捕捉するのに対し、プルダウンアッセイでは、「ベイト」タンパク質を用いて、溶解液中のタンパク質のうち、そのベイトに結合するいずれかのタンパク質を精製する点である。
【0162】
別の実施形態では、一過性のタンパク質間相互作用、例えば、細胞内の１カスケードまたはその他の代謝機能の一部として暫時的に見られるに過ぎないタンパク質間相互作用を判断するのに有用な方法を本発明において使用して、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断する。
【0163】
例えば、架橋相互作用タンパク質は、相互作用する複合体の構成成分を安定させるかまたは恒久的に結合させるアプローチである。相互作用の構成成分が、共有結合で架橋されたら、相互作用する元々の複合体を維持したまま、他の工程（例えば、細胞の溶解、アフィニティー精製、電気泳動または質量分析）を用いて、タンパク質間相互作用を解析できる。ホモ二官能性のアミン反応性架橋剤を細胞に加えて、相互作用する可能性のあるタンパク質を併せて架橋させることができ、その後、溶解後に、ウエスタンブロッティングによって解析できる。架橋剤は、細胞内タンパク質の架橋用では、ＤＳＳのように、膜透過性であることができ、あるいは、細胞表面タンパク質の架橋用では、ＢＳ３のように、膜不透過性であることができる。さらに、いくつかの架橋剤は、ＤＳＰまたはＤＴＳＳＰのような還元剤によって切断して、架橋を解消できる。あるいは、ＳＤＡ生成物またはスルホ－ＳＤＡのように、光活性化可能な基を含むヘテロ二官能性架橋剤を用いて、特定の刺激後などに見られ得る一過性の相互作用を捕捉できる。光活性化は、Ｌ－フォトロイシンまたはＬ－フォトメチオニンのような光活性化可能なアミノ酸で代謝標識後に見られるものであることもできる。タンパク質間の架橋部位は、特にＤＳＳＯまたはＤＳＢＵのようなＭＳ－開裂性架橋剤を用いる場合、質量分析を用いて高精度にマッピングできる。
【0164】
ある特定の実施形態では、本発明の方法において、ラベルトランスファータンパク質相互作用解析を用いることができる。ラベルトランスファーでは、架橋相互作用分子（すなわち、ベイトタンパク質及びプレイタンパク質）を、標識した架橋剤によって結合させてから、その標識がプレイに結合したままになるようにして、ベイトとプレイとの結合を切断する。新規な非同位体試薬及び方法により、いずれの研究者にとっても、引き続きこの技法が利用しやすく、かつ実施しやすくなっている。
【0165】
別の実施形態では、本発明の方法において、ファーウエスタンブロット解析を使用する。ファーウエスタンブロット解析では、電気泳動したタンパク質を、標的タンパク質に特異的な抗体ではなく、精製したタグ付きベイトタンパク質とともにインキュベートすることによって、タンパク質間相互作用を検出する。“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのウェブサイトから入手可能）を参照されたい。
【0166】
さらに別の実施形態では、２つのタンパク質間の相互作用を判断する際に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ（または共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）アッセイもしくは電子エネルギー移動（ＥＥＴ）アッセイ）を使用する。簡潔に述べると、このアッセイは、エネルギーが２つの光感受性分子の間を移動できることに基づくものである。最初は電子励起状態にあるドナー発色団は、非放射性の双極子間結合を通じて、アクセプター発色団にエネルギーを移動させ得る。このエネルギー移動の効率は、ドナーとアクセプターとの距離の６乗に反比例し、これにより、ＦＲＥＴは、距離の小さい変化に対する感度が非常に高くなっている。ＦＲＥＴ効率の測定値を用いて、２つのフルオロフォアが、互いに対して特定の距離以内にあるかを判断できるので、その測定値を用いて、２つの分子間の相互作用を判断できる。
【0167】
ある特定の実施形態では、様々な方法を組み合わせたものを用いて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断及び／または確認できる。
【0168】
本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、ユビキチン化アッセイを用いて、ＳＡＬＬ４タンパク質のユビキチン化レベルを求める。当業者に知られているいずれかの方法を用いることができ、その方法は、本開示に含まれる。例示的なユビキチン化アッセイの１つでは、ユビキチン経路の標的を調べるのに、Ｃｉｓｂｉｏ ＢｉｏａｓｓａｙｓのＨＴＲＦ（登録商標）という試薬を使用する。ＨＴＲＦユビキチンアッセイでは、ＥＵ３＋－クリプテートまたはビオチンのいずれかで標識したユビキチンを用いる。ＸＬ６６５コンジュゲートを加えると、ＨＴＲＦシグナルは、ユビキチン化レベルと比例するとともに、２４時間超にわたって安定な状態を保つ。ＨＴＲＦユビキチンアッセイには、酵素による工程及びＨＴＲＦ検出工程という２つの基本的な段階がある。酵素による工程では、標的タンパク質をユビキチン酵素（Ｅ２及びＥ３）ならびにＥＵ３＋標識ユビキチンとともにインキュベートする。Ｅ１酵素を加えると、反応が開始する。そして、検出工程で、ＥＤＴＡを含むＸＬ６６５標識試薬を加えて、酵素反応を停止させることによって、ユビキチン化された標的タンパク質を検出する。別の例示的なユビキチン化アッセイは、下記の第６．１節に示されている。
【0169】
本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、セレブロン改変化合物を用いて、がんを治療する。いくつかの実施形態では、本発明で提供するスクリーニング方法は、がん治療用のセレブロン改変化合物を特定するためのものである。本発明で示されるがんには、いずれかのセレブロン改変化合物によって治療可能なあらゆる種類のがんが含まれる。本発明で示されるがんには、膀胱癌、骨癌、血液がん、脳癌、乳癌、頸癌、胸部癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭部癌、腎臓癌、肝臓癌、リンパ節癌、肺癌、口腔癌、頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、咽喉癌及び子宮癌が含まれる（ただし、これらに限らない）。具体的ながんとしては、進行性悪性腫瘍、アミロイドーシス、神経芽腫、髄膜腫、血管周囲細胞腫、多発性脳転移、多形性膠芽腫、膠芽腫、脳幹グリオーマ、予後不良の悪性脳腫瘍、悪性グリオーマ、再発性悪性グリオーマ、退形成星性細胞腫、退形成乏突起神経膠腫、神経内分泌腫瘍、直腸腺癌、結腸直腸癌（ステージ３及びステージ４の結腸直腸癌を含む）、切除不能な結腸直腸癌、転移性肝細胞癌、カポジ肉腫、核型急性骨髄芽球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、悪性胸水中皮腫症候群、腹膜癌、漿液性乳頭状癌、婦人科肉腫、軟部組織肉腫、強皮症、皮膚血管炎、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、平滑筋肉腫、進行性骨化性線維異形成症、ホルモン抵抗性前立腺癌、切除後のハイリスク軟部組織肉腫、切除不能な肝細胞癌、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、くすぶり型骨髄腫、無症候性骨髄腫、卵管癌、アンドロゲン非依存性前立腺癌、アンドロゲン依存性ステージＩＶ非転移性前立腺癌、ホルモン非感受性前立腺癌、化学療法非感受性前立腺癌、甲状腺乳頭癌、濾胞状甲状腺癌、甲状腺髄様癌及び平滑筋腫が挙げられるが、これらに限らない。
【0170】
本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、そのがんは、固形がんまたは血液がんである。いくつかの実施形態では、そのがんは、固形がんである。いくつかの実施形態では、その固形がんは、転移性である。いくつかの実施形態では、その固形がんは、肝細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、卵巣癌または膠芽腫である。
【0171】
別の実施形態では、そのがんは、血液腫瘍または血液がんである。ある特定の実施形態では、その血液腫瘍は、転移性である。このようながんとしては、骨髄腫、白血病、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫）及びホジキン病（ホジキンリンパ腫ともいう）が挙げられる。一実施形態では、その骨髄腫は、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。いくつかの実施形態では、その白血病は例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ヒトリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）白血病、肥満細胞症またはＢ細胞急性リンパ芽球性白血病である。いくつかの実施形態では、そのリンパ腫は例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｂ細胞免疫芽球性リンパ腫、小非分割細胞性リンパ腫、ヒトリンパ球向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）白血病／リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ＡＩＤＳ関連性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、形質転換リンパ腫、縦隔原発（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、リヒタートランスフォーメーション、節性辺縁帯リンパ腫またはＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。一実施形態では、その血液がんは、例えば、ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫または辺縁帯リンパ腫を含む緩慢性リンパ腫である。
【0172】
本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、セレブロン改変化合物を用いて、がんではない疾患または障害を治療する。いくつかのこのような実施形態では、その疾患または障害は、非催奇形性の治療、例えば、非催奇形性であるか、または対照化合物による治療と比べて、催奇形性が軽減されたセレブロン改変化合物による治療を要する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、その催奇形性は、サリドマイドによる治療と比べて軽減されている。
【0173】
別の実施形態では、その疾患または障害は、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発しないか、または対照化合物による治療と比べて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用の低減を誘導するセレブロン改変化合物による治療を要する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用は、サリドマイドによる治療と比べて低減されている。
【0174】
別の実施形態では、その疾患または障害は、ＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発しないか、または対照化合物による治療と比べて、ＳＡＬＬ４のユビキチン化の軽減を誘導するセレブロン改変化合物による治療を要する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４のユビキチン化は、サリドマイドによる治療と比べて軽減されている。
【0175】
別の実施形態では、その疾患または障害は、ＳＡＬＬ４の分解を誘発しないか、または対照化合物による治療と比べて、ＳＡＬＬ４の分解の低減を誘導するセレブロン改変化合物による治療を要する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、その対照化合物は、サリドマイドである。別の実施形態では、その対照化合物は、ポマリドミドである。さらに別の実施形態では、その対照化合物は、レナリドマイドである。具体的な実施形態では、そのＳＡＬＬ４の分解は、サリドマイドによる治療と比べて低減される。
【0176】
本明細書に示されているセレブロン改変化合物（または治療用化合物）は、セレブロン及び／またはセレブロンとその基質との結合を直接または間接的に調節できる。いくつかの実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物は、セレブロンに直接結合する。いくつかの実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物は、セレブロンタンパク質のコンホメーション変化を誘導する。いくつかの実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物は、セレブロンタンパク質の基質特異性または親和性を変化させる。いくつかの実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物は、セレブロンタンパク質表面の特性を変化させる。
【0177】
いくつかの実施形態では、そのセレブロン改変化合物は、免疫調節化合物である。いくつかの実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物は、サリドマイド、あるいはそのエナンチオマーもしくはエナンチオマーの混合物、またはその製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、包接化合物もしくは結晶多形である。いくつかの実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物は、レナリドマイド、あるいはそのエナンチオマーもしくはエナンチオマーの混合物、またはその製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、包接化合物もしくは結晶多形である。いくつかの実施形態では、その治療用のセレブロン改変化合物は、ポマリドミド、あるいはそのエナンチオマーもしくはエナンチオマーの混合物、またはその製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、包接化合物もしくは結晶多形である。
【0178】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法は、セレブロン改変化合物であると判断された化合物をスクリーニングするため、または催奇形性作用が低下している１つ以上のセレブロン改変化合物をさらに選択もしくは同定するためのものである。いくつかの実施形態では、そのセレブロン改変化合物は、セレブロンに直接結合する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法は、化合物のセレブロンへの結合を判断または確認することをさらに含む。化合物のセレブロンへの結合は、当業者に知られている方法によって判断できる。いくつかの実施形態では、そのセレブロン改変化合物は、ヒトセレブロンに結合する。別の実施形態では、そのセレブロン改変化合物は、マウスセレブロンに結合する。セレブロン改変化合物の、他の種に由来するセレブロンへの結合も、本開示に含まれる。
【0179】
いくつかの実施形態では、そのセレブロン改変化合物は、セレブロンのコンホメーション変化（例えば、セレブロンの化合物結合ポケット内のコンホメーション変化）を誘導するか、またはセレブロン表面の特性を別段に変化させると判断されている。
【0180】
ある特定の実施形態では、化合物がセレブロン改変化合物であるか、または化合物がセレブロンに結合するかの判断方法は、（ａ）（ｉ）セレブロン及び対照化合物の第１の結晶構造を得ること、及び（ｉｉ）Ｘ線回折によって、その第１の結晶の三次元構造を求めて、第１のセットの原子座標を得ること、（ｂ）（ｉ）ＣＲＢＮ及びその化合物を含む第２の結晶を得ること、及び（ｉｉ）Ｘ線回折によって、その第２の結晶の三次元構造を求めて、第２のセットの原子座標を得ること、ならびに（ｃ）前記第１のセットの原子座標と前記第２のセットの原子座標を比較することを含み、原子座標の違いによって、セレブロンのコンホメーション変化を誘導するか、またはセレブロン表面の特性を別段に変化させる化合物が示される。いくつかの実施形態では、その第１のセットの原子座標及び／または前記第２のセットの原子座標によって、化合物結合ドメインが定められる。ある特定の実施形態では、原子座標の違いは、原子間距離の差を評価することによって判断する。
【0181】
ある特定の実施形態では、その対照化合物は、セレブロン改変化合物ではない。ある特定の実施形態では、その対照化合物は、セレブロンに結合しないので、セレブロン及びその対照化合物の結晶構造は、セレブロンのコンホメーションが化合物によって変化しないコントロール結晶構造となる。
【0182】
ある特定の実施形態では、化合物がセレブロン改変化合物であるか、または化合物がセレブロンに結合するかの判断方法は、（ａ）セレブロン及び対照化合物の第１の三次元構造を得ること、（ｂ）セレブロン及びその化合物の第２の三次元構造を得ること、及び（ｃ）前記第１の三次元構造と前記第２の三次元構造を比較することを含み、その第１の三次元構造と第２の三次元構造との違いによって、ＣＲＢＮのコンホメーション変化を誘導するか、またはＣＲＢＮ表面の特性を別段に変化させる化合物が示される。ある特定の実施形態では、その対照化合物は、セレブロン改変化合物ではなく、その第１の三次元構造は、化合物に結合していないセレブロンのコントロール構造である。
【0183】
一実施形態では、そのコンホメーション変化または変化は、Ｘ線結晶解析によって評価する。別の実施形態では、その三次元構造は、ＮＭＲ分光法、二面偏波式干渉法、振動分光法またはクライオ電子顕微鏡によって評価する。いくつかの実施形態では、セレブロンは、ＤＤＢ１、Ｃｕｌ４、Ｒｏｃ１またはこれらをいずれかに組み合わせたものにさらに結合する。
【0184】
ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法は、１つ以上のアッセイ（例えば生物学的アッセイ）で、セレブロン改変化合物（または所定の化合物）を解析し、特徴付け、及び試験することをさらに含む。ある特定の実施形態では、本発明で提供する方法は、セレブロン改変化合物（または所定の化合物）の治療効果を試験することをさらに含む。
【0185】
本発明で提供する各種の方法のある特定の実施形態では、本発明で提供する方法は、本発明で提供する方法に基づき選択し及び／または特徴付けたセレブロン改変化合物を対象に投与して、その治療効果を評価することをさらに含む。
【0186】
さらに別の実施形態では、本発明で提供する方法は、本発明で提供する方法に基づき選択し及び／または特徴付けたセレブロン改変化合物を対象に投与して、がんのような疾患または障害を治療することをさらに含む。したがって、ある特定の態様では、本発明において提供するのは、がんの治療を以前受けたことがあるが、標準療法に応答しない患者、及び治療を以前に受けたことがない患者の治療方法である。いくつかの疾患または障害は、特定の年齢群に多く見られるが、本発明には、患者の年齢にかかわらず、患者を治療する方法も含まれる。本発明には、問題の疾患または状態を治療するための手術を受けた患者、及び受けていない患者を治療する方法がさらに含まれる。
【0187】
ある特定の実施形態では、その疾患または障害は、がんである。がん患者は、臨床症候が一様ではなく、臨床転帰が様々なであるため、患者が受ける治療も、患者の予後に応じて変わり得る。熟練の臨床医は、過度の実験なしに、個々のがん患者の治療に効果的に使用できる具体的な二次薬剤、手術の種類及び非薬物ベースの標準療法の種類を容易に判断できるであろう。
【0188】
ある特定の実施形態では、その化合物の治療上有効な量または予防上有効な量は、１日あたり約０．００５～約１，０００ｍｇ、１日あたり約０．０１～約５００ｍｇ、１日あたり約０．０１～約２５０ｍｇ、１日あたり約０．０１～約１００ｍｇ、１日あたり約０．１～約１００ｍｇ、１日あたり約０．５～約１００ｍｇ、１日あたり約１～約１００ｍｇ、１日あたり約０．０１～約５０ｍｇ、１日あたり約０．１～約５０ｍｇ、１日あたり約０．５～約５０ｍｇ、１日あたり約１～約５０ｍｇ、１日あたり約０．０２～約２５ｍｇまたは１日あたり約０．０５～約１０ｍｇである。
【0189】
ある特定の実施形態では、その治療上有効な量または予防上有効な量は、１日あたり約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．５ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇまたは約１５０ｍｇである。
【0190】
一実施形態では、その治療用化合物、またはその立体異性体もしくは立体異性体の混合物、互変異性体、製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、アイソトポログ、プロドラッグ、水和物、共結晶、包接化合物もしくは結晶多形の１日あたりの推奨投与量範囲であって、本明細書に記載されている状態に対する投与量範囲は、例えば、１日１回用量として１回投与するか、または１日をかけて数回に分けて投与する場合、１日あたり約０．１ｍｇ～約５０ｍｇの範囲内である。いくつかの実施形態では、その用量は、１日あたり約１ｍｇ～約５０ｍｇの範囲である。別の実施形態では、その用量は、１日あたり約０．５ｍｇ～約５ｍｇの範囲である。１日あたりの具体的な投与量としては、１日あたり０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇまたは５０ｍｇが挙げられる。
【0191】
具体的な実施形態では、推奨開始用量は、１日あたり０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇまたは５０ｍｇであってよい。別の実施形態では、推奨開始用量は、１日あたり０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇまたは５ｍｇであってよい。その用量は、１日あたり１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇまたは５０ｍｇまで増やしてよい。
【0192】
ある特定の実施形態では、その治療上有効な量または予防上有効な量は、約０．００１～約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約９ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１～約８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約４ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約３ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１～約２ｍｇ／ｋｇ／日または約０．０１～約１ｍｇ／ｋｇ／日である。
【0193】
投与量は、ｍｇ／ｋｇ／日以外の単位で表すこともできる。例えば、非経口投与用の用量は、ｍｇ／ｍ２／日で表すことができる。当業者は、対象の身長もしくは体重、またはこれらの両方を与えられれば、用量をｍｇ／ｋｇ／日からｍｇ／ｍ２／日に変換する方法を容易に理解するであろう。例えば、６５ｋｇのヒトでは、１ｍｇ／ｋｇ／日の用量は、３８ｍｇ／ｍ２／日とほぼ等しい。
【0194】
ある特定の実施形態では、セレブロン改変化合物の投与量は、その化合物の定常状態での血漿中濃度を約０．００１～約５００μＭ、約０．００２～約２００μＭ、約０．００５～約１００μＭ、約０．０１～約５０μＭ、約１～約５０μＭ、約０．０２～約２５μＭ、約０．０５～約２０μＭ、約０．１～約２０μＭ、約０．５～約２０μＭまたは約１～約２０μＭの範囲にするのに充分な量である。
【0195】
別の実施形態では、セレブロン改変化合物の投与量は、その化合物の定常状態での血漿中濃度を約５～約１００ｎＭ、約５～約５０ｎＭ、約１０～約１００ｎＭ、約１０～約５０ｎＭまたは約５０～約１００ｎＭの範囲にするのに充分な量である。
【0196】
本明細書で使用する場合、「定常状態での血漿中濃度」という用語は、セレブロン改変化合物、またはその立体異性体もしくは立体異性体の混合物、互変異性体、製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、アイソトポログ、プロドラッグ、水和物、共結晶、包接化合物もしくは結晶多形の投与期間後に達する濃度である。定常状態に達すると、その化合物の血漿中濃度の時間依存性曲線には、微小ピークとトラフが見られる。
【0197】
ある特定の実施形態では、そのセレブロン改変化合物の投与量は、その化合物の最高血漿中濃度（ピーク濃度）を約０．００１～約５００μＭ、約０．００２～約２００μＭ、約０．００５～約１００μＭ、約０．０１～約５０μＭ、約１～約５０μＭ、約０．０２～約２５μＭ、約０．０５～約２０μＭ、約０．１～約２０μＭ、約０．５～約２０μＭまたは約１～約２０μＭの範囲にするのに充分な量である。
【0198】
ある特定の実施形態では、そのセレブロン改変化合物の投与量は、その化合物の最低血漿中濃度（トラフ濃度）を約０．００１～約５００μＭ、約０．００２～約２００μＭ、約０．００５～約１００μＭ、約０．０１～約５０μＭ、約１～約５０μＭ、約０．０１～約２５μＭ、約０．０１～約２０μＭ、約０．０２～約２０μＭ、約０．０２～約２０μＭまたは約０．０１～約２０μＭの範囲にするのに充分な量である。
【0199】
ある特定の実施形態では、そのセレブロン改変化合物の投与量は、その化合物の曲線下面積（ＡＵＣ）を約１００～約１００，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ、約１，０００～約５０，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ、約５，０００～約２５，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬまたは約５，０００～約１０，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬの範囲にするのに充分な量である。
【0200】
治療する疾患及び対象の状態に応じて、本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＣＩＶ、大槽内注射もしくは注入、皮下注射または埋入）投与経路、吸入投与経路、経鼻投与経路、膣内投与経路、直腸投与経路、舌下投与経路、あるいは局所（例えば、経皮または局部）投与経路によって投与してよい。本明細書に示されている化合物は、各投与経路に適するように、単独でまたは組み合わせて、好適な投与単位で、製薬学的に許容可能な賦形剤、担体、アジュバント及びビヒクルとともに調合してよい。
【0201】
一実施形態では、本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、非経口投与する。別の実施形態では、その化合物は、静脈内投与する。
【0202】
そのセレブロン改変化合物は、単回用量（例えば単回ボーラス注射）として、または経時的に（例えば、経時的な持続注入もしくは経時的な分割ボーラス投与として）送達できる。そのセレブロン改変化合物は、必要な場合、例えば、患者の疾患が安定もしくは退縮するまで、または患者の疾患が進行するか、または許容不能な毒性が見られるまで、繰り返し投与することができる。例えば、固形がんでは、疾患の安定とは概して、測定可能な病巣の垂直直径が、直近の測定値から２５％以上増大していないことを意味する（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，９２（３）：２０５－２１６（２０００））。疾患の安定または安定の欠如は、患者の症状の評価、身体診察、ならびにＸ線、ＣＡＴ、ＰＥＴ、ＭＲＩスキャンまたは一般的に受け入れられているその他の評価モダリティを用いてイメージングした腫瘍の可視化のように、当該技術分野において知られている方法によって判断する。
【0203】
本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、１日に１回（ＱＤ）投与することも、１日あたりの用量を複数回（１日に２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）及び１日に４回（ＱＩＤ）など）に分けることもできる。加えて、その投与は、持続的（すなわち、連日または毎日）であることも、間欠的、例えば周期的（すなわち、数日、数週間または数カ月の休薬期間を含む）であることができる。本明細書で使用する場合、「毎日」という用語は、治療用化合物を、例えば、ある期間にわたって、各日に１回または２回以上投与すること意味するように意図されている。「持続」という用語は、治療用化合物を毎日、少なくとも１０日間～５２週間連続で投与することを意味するように意図されている。「間欠的な」または「間欠的に」という用語は、本明細書で使用する場合、規則的な間隔または不規則な間隔のいずれかで、停止及び開始することを意味するように意図されている。例えば、セレブロン改変化合物の間欠的な投与は、１週間に１～６日投与するか、周期的に投与する（例えば、２～８週間連続で毎日投与してから、最長で１週間の休薬期間を設ける）か、または１日おきに投与することである。「周期化」という用語は、本明細書で使用する場合、休薬期間を設けながら、セレブロン改変化合物を毎日または持続的に投与することを意味するように意図されている。ある特定の実施形態では、休薬期間は、治療期間と同じ長さである。別の実施形態では、休薬期間は、治療期間と異なる長さである。いくつかの実施形態では、周期の長さは、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間または１０週間である。周期化のいくつかの実施形態では、セレブロン改変化合物を１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１５日間、２０日間、２５日間または３０日間、毎日投与してから、休薬期間を設ける。特定の実施形態では、４週間の周期の５日間、セレブロン改変化合物を毎日投与する。別の特定の実施形態では、４週間の周期の１０日間、セレブロン改変化合物を毎日投与する。
【0204】
いくつかの実施形態では、投与頻度は、１日あたり約１回～１カ月あたり約１回の範囲内である。ある特定の実施形態では、投与は、１日に１回、１日に２回、１日に３回、１日に４回、１日おきに１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回または４週間に１回である。一実施形態では、セレブロン改変化合物を１日に１回投与する。別の実施形態では、セレブロン改変化合物を１日に２回投与する。さらに別の実施形態では、その化合物を１日に３回投与する。さらに別の実施形態では、セレブロン改変化合物を１日に４回投与する。
【0205】
ある特定の実施形態では、セレブロン改変化合物を１日～６カ月間、１週間～３カ月間、１週間～４週間、１週間～３週間または１週間～２週間、１日に１回投与する。ある特定の実施形態では、セレブロン改変化合物を１週間、２週間、３週間または４週間、１日に１回投与する。一実施形態では、セレブロン改変化合物を１週間、１日に１回投与する。別の実施形態では、セレブロン改変化合物を２週間、１日に１回投与する。さらに別の実施形態では、セレブロン改変化合物を３週間、１日に１回投与する。さらに別の実施形態では、セレブロン改変化合物を４週間、１日に１回投与する。
【0206】
ある特定の実施形態では、セレブロン改変化合物を医薬組成物で調合し、患者に医薬組成物の形態で投与する。
【0207】
本発明で提供する各種の方法のいくつかの実施形態では、その方法は、第２の活性剤または支持療法剤を治療上有効な量投与することをさらに含む。その第２の活性剤は、大分子（例えば、タンパク質）または小分子（例えば、合成の無機分子、有機金属分子、もしくは有機分子）であることができる。いくつかの実施形態では、その第２の活性剤は、造血成長因子、サイトカイン、抗がん剤（例えばチェックポイント阻害剤）、抗生物質、ｃｏｘ－２阻害剤、免疫調節剤、免疫抑制剤、コルチコステロイド、がん抗原に特異的に結合する治療用抗体、またはそれらの薬理学的に活性な変異体もしくは誘導体である。ある特定の実施形態では、その抗がん剤は、チェックポイント阻害剤である。
【0208】
いくつかの実施形態では、その第２の活性剤は、セレブロン改変化合物、あるいはその立体異性体もしくは立体異性体の混合物、互変異性体、製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、アイソトポログ、プロドラッグ、水和物、共結晶、包接化合物、または結晶多形の投与と関連する有害作用を緩和できる小分子である。第２の小分子活性剤の多くは、セレブロン改変化合物、またはその立体異性体もしくは立体異性体の混合物、互変異性体、製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、アイソトポログ、プロドラッグ、水和物、共結晶、包接化合物、または結晶多形とともに（例えば、その投与前、投与後または同時に）投与すると、相乗作用をもたらすことができると考えられている。第２の小分子活性剤の例としては、抗がん剤、抗生物質、免疫抑制剤及びステロイドが挙げられるが、これらに限らない。
【0209】
５．３ キット
また、本発明において提供するのは、本発明で提供するいずれかの方法を行うためのキットである。別の態様では、本発明において提供するのは、ＳＡＬＬ４（またはそのバリアント）のレベルを求めるための物質を含むキットである。いくつかの実施形態では、そのキットは、セレブロン改変化合物による治療後の、ＳＡＬＬ４の分解を判断するためのものである。
また、本発明において提供するのは、本発明で提供するいずれかの方法を行うためのキットである。別の態様では、本発明において提供するのは、ＳＡＬＬ４（またはそのバリアント）のレベルを求めるための物質を含むキットである。いくつかの実施形態では、そのキットは、セレブロン改変化合物による治療後の、ＳＡＬＬ４の分解を判断するためのものである。
【0210】
別の態様では、本発明において提供するのは、ＳＡＬＬ４（またはそのバリアント）のユビキチン化を判断するための物質を含むキットである。いくつかの実施形態では、そのキットは、セレブロン改変化合物の治療後の、ＳＡＬＬ４のユビキチン化を判断するためのものである。
【0211】
さらに別の態様では、本発明において提供するのは、ＳＡＬＬ４またはその断片と、セレブロンまたはその断片との相互作用を判断するための物質を含むキットである。いくつかの実施形態では、そのキットは、セレブロン改変化合物による治療後の、ＳＡＬＬ４またはその断片と、セレブロンまたはその断片との相互作用を判断するためのものである。
【0212】
例えば、そのキットは、ＳＡＬＬ４の存在（もしくは不在）、または量を検出できるプローブ（例えば、オリゴヌクレオチド、抗体、標識化合物またはその他の物質）を含むことができる。そのキットは、説明書を含むこともできる。
【0213】
プローブは、ゲノム配列、核酸産物またはポリペプチド産物に特異的にハイブリダイズし得る。開示されているキットは、例えば、緩衝剤、保存剤またはタンパク質安定化剤も含むことができる。そのキットは、検出可能な物質（例えば、酵素または基質）を検出するのに必要な構成成分を含むこともできる。そのキットは、アッセイして、含まれる試験試料と比較できる１つのコントロール試料または一連のコントロール試料も含むことができる。キットの各構成成分は通常、個別の容器に入っており、その各種容器のすべてが、使用説明書とともに、１つのパッケージに入っている。
【0214】
本発明で提供する各種キットのある特定の実施形態では、そのキットは、試料を得るための器具または物質も含み得る。いくつかの実施形態では、その器具または物質は、腫瘍生検標本、リンパ節生検標本、血液、または骨髄、脾臓、肝臓、脳もしくは乳房の生検標本から試料を得るためのものである。その生体試料は、例えば、細胞培養液、細胞株、組織、器官、細胞小器官、生体液、血液試料、尿試料または皮膚試料であることができる。
【0215】
ある特定の実施形態では、そのキットは、ＳＡＬＬ４の核酸（例えばｍＲＮＡ）に特異的に結合する１つ以上のプローブを含む。ある特定の実施形態では、そのキットは、洗浄液をさらに含む。ある特定の実施形態では、そのキットは、ハイブリダイゼーションアッセイを行うための試薬、核酸の単離または精製手段、検出手段、ならびにポジティブコントロール及びネガティブコントロールをさらに含む。ある特定の実施形態では、そのキットは、キットの使用説明書をさらに含む。そのキットは、家庭用途、臨床用途または研究用途に合わせて作ることができる。
【0216】
ある特定の実施形態では、本発明において提供するのは、ＳＡＬＬ４のタンパク質レベルを検出するためのキットである。ある特定の実施形態では、そのキットは、特異的なタンパク質を認識する抗体でコーティングしたディップスティック、洗浄液、アッセイを行うための試薬、タンパク質の単離または精製手段、検出手段、ならびにポジティブコントロール及びネガティブコントロールを含む。ある特定の実施形態では、そのキットは、キットの使用説明書をさらに含む。そのキットは、家庭用途、臨床用途または研究用途に合わせて作ることができる。
【0217】
このようなキットでは、例えば、ディップスティック、膜、チップ、ディスク、テストストリップ、フィルター、マイクロスフィア、スライド、マルチウェルプレートまたは光ファイバーを用いることができる。そのキットの固体支持体は、例えば、プラスチック、シリコン、金属、樹脂、ガラス、膜、粒子、沈殿物、ゲル、ポリマー、シート、球体、多糖、キャピラリー、フィルム、プレートまたはスライドであることができる。
【0218】
別の実施形態では、そのキットは、固体支持体、その支持体に結合させる核酸であって、核酸の少なくとも２０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３５０塩基またはそれを超える塩基と相補的である核酸、及び生体試料における遺伝子の発現を検出するための手段を含む。
【0219】
具体的な実施形態では、その医薬キットまたはアッセイキットは、容器内に、化合物またはその医薬組成物を含み、さらに、１つ以上の容器内に、核酸を単離するための構成成分を含む。別の具体的な実施形態では、その医薬キットまたはアッセイキットは、容器内に、化合物または医薬組成物を含み、さらに、１つ以上の容器内に、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ディープシーケンシングまたはマイクロアレイを行うための構成成分を含む。
【0220】
ある特定の実施形態では、本発明で提供するキットでは、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、マイクロアレイ、フローサイトメトリーまたは免疫蛍光法によって、タンパク質の発現を検出するための手段を用いる。別の実施形態では、タンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡベースの手法または当該技術分野において知られているその他の類似の方法によって測定する。
【0221】
別の具体的な実施形態では、その医薬キットまたはアッセイキットは、容器内に、化合物またはその医薬組成物を含み、さらに、１つ以上の容器内に、タンパク質を単離するための構成要素を含む。別の具体的な実施形態では、その医薬キットまたはアッセイキットは、容器内に、化合物または医薬組成物を含み、さらに、１つ以上の容器内に、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡを行うための構成成分を含む。
【0222】
別の態様では、本発明において提供するのは、ＳＡＬＬ４を測定するためのキットであって、１つ以上の遺伝子産物の量を測定するのに必要な物質を供給するキットである。いくつかの実施形態では、このようなキットは、ＲＮＡまたはタンパク質を測定するのに必要な物質及び試薬を含んでよい。いくつかの実施形態では、このようなキットは、マイクロアレイを含み、そのマイクロアレイは、１つ以上の遺伝子産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド及び／またはＤＮＡ及び／またはＲＮＡ断片で構成されている。いくつかの実施形態では、上記のようなキットは、ＲＮＡ産物またはＲＮＡ産物のｃＤＮＡコピーのいずれかのＰＣＲ用のプライマーを含んでよい。いくつかの実施形態では、このようなキットは、ＰＣＲ用のプライマー、及びｑＰＣＲ用のプローブを含んでよい。いくつかの実施形態では、このようなキットは、複数のプライマー及び複数のプローブを含んでよく、複数の遺伝子産物を同時に測定できるように、そのプローブのいくつかは、異なるフルオロフォアを有する。いくつかの実施形態では、このようなキットは、ＲＮＡからｃＤＮＡを作製するための物質及び試薬をさらに含んでよい。いくつかの実施形態では、上記のようなキットは、タンパク質産物に対して特異的な抗体を含んでよい。加えて、このようなキットは、生体試料からＲＮＡ及び／またはタンパク質を単離するための物質及び試薬を含んでもよい。加えて、このようなキットは、生体試料から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための物質及び試薬を含んでよい。
【0223】
核酸マイクロアレイキットでは、そのキットは概して、固体支持体表面に結合させるプローブを含む。このような実施形態の１つでは、プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、または１５０ヌクレオチド長～８００ヌクレオチド長の範囲であるプローブを含め、さらに長いプローブのいずれかであることができる。そのプローブは、検出可能な標識で標識してよい。具体的な実施形態では、そのプローブは、遺伝子産物のうちの１つ以上に対して特異的である。そのマイクロアレイキットは、アッセイ、ならびにそのアッセイを行うことによって得られるデータを解釈及び解析する方法を行うための説明書を含んでよい。
【0224】
定量ＰＣＲの場合、そのキットは概して、事前に選択したプライマーであって、特定の核酸配列に対して特異的なプライマーを含む。その定量ＰＣＲキットは、核酸を増幅するのに適する酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼ）、デオキシヌクレオチド、及び増殖反応に必要な緩衝液も含んでよい。その定量ＰＣＲキットは、ある状態と関連するか、またはその状態を示す核酸配列に対して特異的なプローブも含んでよい。そのプローブは、フルオロフォアで標識されていてもいなくてもよい。そのプローブは、クエンチャー分子で標識されていてもいなくてもよい。いくつかの実施形態では、その定量ＰＣＲキットは、酵素（例えば、ＡＭＶ、ＭＭＬＶなどのような逆転写酵素）及び逆転写用のプライマーとともに、逆転写反応に必要なデオキシヌクレオチド及び緩衝液を含め、逆転写ＲＮＡに適する構成要素も含んでよい。その定量ＰＣＲキットの各構成成分は概して、それぞれ好適な容器に入っている。したがって、これらのキットは概して、それぞれ個々の試薬、酵素、プライマー及びプローブに適する別々の容器を含む。さらに、その定量ＰＣＲキットは、その反応、ならびにその反応を行うことによって得られるデータを解釈及び解析する方法を行うための説明書も含んでよい。
【0225】
抗体ベースのキットでは、そのキットは例えば、（１）対象とするペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に結合する第１の抗体（固体支持体に結合させてもさせなくてもよい）、及び任意に（２）その第１の抗体、またはそのペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質のいずれかに結合するとともに、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体または酵素）にコンジュゲートされている第２の異なる抗体を含むことができる。その抗体ベースのキットは、免疫沈降を行うためのビーズも含んでよい。その抗体ベースのキットの各構成成分は概して、それぞれ好適な容器に入っている。したがって、これらのキットは概して、各抗体及び試薬に適する別々の容器を含む。さらに、その抗体ベースのキットは、そのアッセイ、ならびにそのアッセイを行うことによって得られるデータを解釈及び解析する方法を行うための説明書を含んでよい。
【0226】
一実施形態では、本発明で提供するキットは、セレブロン改変化合物、またはその製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、立体異性体、アイソトポログ、プロドラッグ、水和物、共結晶、包接化合物もしくは結晶多形を含む。そのキットは、追加の活性剤をさらに含んでよく、その活性剤としては、本明細書に開示されている活性剤が挙げられるが、これらに限らない。
【0227】
本発明で提供するキットは、その化合物を投与するのに用いる器具をさらに含んでよい。このような器具の例としては、シリンジ、点滴袋、パッチ及び吸入器が挙げられるが、これらに限らない。
【0228】
キットは、移植用の細胞または血液と、１つ以上の活性成分を投与するのに使用できる製薬学的に許容可能なビヒクルをさらに含んでよい。例えば、非経口投与のために再構成する必要のある固体形態で活性成分を供給する場合、そのキットは、その活性成分を溶解して、微粒子を含まない滅菌溶液であって、非経口投与に適する溶液を形成できる好適なビヒクルの密閉容器を含むことができる。製薬学的に許容可能なビヒクルの例としては、注射用水のＵＳＰ、水性ビヒクル（塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液などであるが、これらに限らない）、水混和性ビヒクル（エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなどであるが、これらに限らない）、ならびに非水性ビヒクル（コーン油、綿実油、ラッカセイ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び安息香酸ベンジルなどであるが、これらに限らない）が挙げられるが、これらに限らない。
【0229】
本発明で提供する方法及びキットのある特定の実施形態では、タンパク質の精製、試料の標識または固相アッセイの実施の際には、固相支持体を使用する。本明細書に開示されている方法を行うのに適する固相の例としては、ビーズ、粒子、コロイド、単一表面、チューブ、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、スライド、膜、ゲル及び電極が挙げられる。固相が粒子状物質（例えばビーズ）である場合、一実施形態では、その粒子状物質をマルチウェルプレートのウェルに配分して、固相支持体の並行処理を可能にする。
【0230】
開示されているキットは、遺伝構成要素の有無及びタンパク質の有無、またはそれらのレベルを同時に測定するのに有用なマルチプレックスキットであってもよい。
【0231】
５．４ 化合物
本明細書に示されている化合物は、セレブロン改変化合物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を直接または間接的に調節する。いくつかの実施形態では、本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、セレブロンに直接結合して、ＣＲＢＮタンパク質のコンホメーション変化を誘導できる。別の実施形態では、本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の他のサブユニットに直接結合できる。
本明細書に示されている化合物は、セレブロン改変化合物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体を直接または間接的に調節する。いくつかの実施形態では、本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、セレブロンに直接結合して、ＣＲＢＮタンパク質のコンホメーション変化を誘導できる。別の実施形態では、本明細書に示されているセレブロン改変化合物は、ＣＲＢＮ Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の他のサブユニットに直接結合できる。
【0232】
本発明で提供する方法のための化合物としては、特定のがんを含む数種類のヒト疾患の治療に有用であり得る化合物群である免疫調節化合物が挙げられるが、これらに限らない。
【0233】
本明細書で使用する場合、別段に示されていない限り、「免疫調節化合物」または「免疫調節剤」という用語には、ＬＰＳ誘導性単球ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、ＭＩＰ－１α、ＭＣＰ－１、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ及びＣＯＸ－２の産生を阻害する特定の有機小分子を含めることができる。特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示されている免疫調節化合物がもたらす生体作用の１つは、骨髄系細胞によるＴＮＦ－αの産生を減少させることである。本明細書に開示されている免疫調節化合物は、ＴＮＦ－α ｍＲＮＡの分解を高めることができる。さらに、理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示されている免疫調節化合物は、Ｔ細胞の強力な共刺激因子であり得るとともに、細胞の増殖を用量依存的な形で劇的に増大させ得る。本明細書に開示されている免疫調節化合物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットに対する共刺激作用よりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットに対する共刺激作用の方が大きいことがある。加えて、その化合物は、骨髄系細胞の応答に対する抗炎症特性を有することができるが、Ｔ細胞を効率的に共刺激して、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γをさらに多い量で産生させ、Ｔ細胞の増殖とＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を高めることもできる。さらに、特定の理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示されている免疫調節化合物は、サイトカインの活性化を通じて間接的に、また直接、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞とナチュラルキラーＴ（「ＮＫＴ」）細胞に作用できるとともに、ＮＫ細胞が有益なサイトカイン（ＩＦＮ－γなどであるが、これに限らない）を産生する能力を高めて、ＮＫ細胞とＮＫＴ細胞の細胞傷害活性を高めることができる。
【0234】
本明細書に示されている例示的な免疫調節化合物としては、サリドマイド、レナリドマイド及びポマリドミド、あるいはそれらのエナンチオマーもしくはエナンチオマーの混合物、またはそれらの製薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、共結晶、包接化合物もしくは結晶多形が挙げられるが、これらに限らない。
【0235】
本明細書に開示されている各種の免疫調節化合物は、１つ以上のキラル中心を含み、エナンチオマーのラセミ混合物またはジアステレオマーの混合物として存在できる。したがって、本発明で提供するのは、上記のような化合物の立体異性体的に純粋な形態を使用すること、及びそれらの形態の混合物を使用することでもある。例えば、特定の免疫調節化合物のエナンチオマーを等量または不等量含む混合物を用いてよい。これらの異性体は、不斉合成しても、キラルカラムまたはキラル分割剤のような標準的な技法を用いて分割してもよい。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）、Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３３：２７２５（１９７７）、Ｅｌｉｅｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９６２）及びＷｉｌｅｎ，Ｓ．Ｈ．，Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐ．２６８（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ，ＩＮ，１９７２）を参照されたい。
【0236】
記載されている化合物はいずれも、市販購入することも、本明細書に開示されている特許または特許公開に記載されている方法に従って調製することもできる。さらに、光学的に純粋な化合物は、不斉合成することも、既知の分割剤またはキラルカラム及び他の標準的な有機合成化学技術を使用して分割することができる。
【0237】
本明細書に示されている各種の組成物及び方法のある特定の実施形態では、セレブロン改変化合物は、本明細書に示されている免疫調節化合物である。別の実施形態では、セレブロン改変化合物は、免疫調節化合物ではない。
【0238】
示されている構造と、その構造に与えられた名称との間に矛盾がある場合には、示されている構造が優先されることに留意されたい。加えて、構造または構造の一部の立体化学が、例えば、太線または破線で示されていない場合、その構造または構造の一部には、そのすべての立体異性体が含まれると解釈するものとする。
【0239】
本発明で提供する各種の方法及び／またはキットのいずれにおいても、例えば、１つ以上の試薬（核酸プライマー、固体支持体などであるが、これらに限らない）に関して上で列挙した実施形態をいずれかに組み合わせたものも企図されていることに留意されたい。
【0240】
下記の非限定的な実施例によって、本発明のある特定の実施形態を例示する。
【実施例】
【0241】
６．実施例
下記の実施例は、別段に詳細に説明されている場合を除き、当業者に周知であるとともに、当業者にとって定型的である標準的な技法を用いて行われている。実施例は、単に例示的なものとして意図されている。
下記の実施例は、別段に詳細に説明されている場合を除き、当業者に周知であるとともに、当業者にとって定型的である標準的な技法を用いて行われている。実施例は、単に例示的なものとして意図されている。
【0242】
６．１ 方法
タンパク質の発現及び精製
タンパク質の発現及び精製
【0243】
２ＸＹＴ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）を用いて、ＭＢＰに融合したＷＴタンパク質及び変異体タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒという細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発現させた。０．６のＯＤ６００で１８時間、１６℃で細胞を誘導した。細胞は、ペレット化し、凍結し、精製の際に解凍し、１５０μＭの酢酸亜鉛、４０，０００Ｕのベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＢ－ＰＥＲ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎという緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁させた。溶解液をアミロース樹脂（ＮＥＢ）とともに４℃で１時間インキュベートしてから、ビーズを洗浄した。２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、３ｍＭのＴＣＥＰ、１０％グリセロール、１５０μＭの酢酸亜鉛及び１０ｍＭのマルトースを含む緩衝液で、タンパク質を溶出させた。
【0244】
セレブロン－ＤＤＢ１の精製
【0245】
ＺＺドメイン－６×Ｈｉｓ－トロンビンタグ付加ヒトセレブロン（４０～４４２位のアミノ酸）及び完全長ヒトＤＤＢ１を昆虫細胞ＳＦ９で、ＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中、５０ｕＭの酢酸亜鉛の存在下で共発現させた。５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、２ｍＭのＴＣＥＰ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び４０，０００Ｕのベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含む緩衝液に細胞を再懸濁させ、３０秒、超音波処理した。溶解液を３０，０００ｒｐｍで３０分、高速回転させることによって清澄化し、清澄化した溶解液をアフィニティー樹脂Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）とともに１時間インキュベートした。５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で複合体を溶出させ、そのＺＺドメイン－６×Ｈｉｓタグを、一晩のトロンビンの切断（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１０ｍＭのイミダゾール緩衝液中での透析と組み合わせて除去した。切断された溶出液をアフィニティー樹脂Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）とともにインキュベートし、さらに精製するために、そのフロースルーをＡＮＸ ＨｉＴｒａｐイオン交換カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、２００ｍＭのＮａＣｌに希釈した。そのＡＮＸカラムを１０カラム容量の５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＴＣＥＰで洗浄してから、１０カラム容量の５０ｍＭのビス－トリス（ｐＨ６．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＴＣＥＰで洗浄したところ、２１０ｍＭのＮａＣｌで、セレブロン－ＤＤＢ１のピークが溶出された。このピークを回収し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－４００（１６／６０）というカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２４０ｍＭのＮａＣｌ及び３ｍＭのＴＥＣＰを含む緩衝液中でさらに精製した。そのセレブロン－ＤＤＢ１複合体は、３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮された。
【0246】
完全長ヒトセレブロン、完全長マウスセレブロン及び完全長ウサギセレブロンを完全長ヒトＤＤＢ１とともに、昆虫細胞ＳＦ９で、ＥＳＦ９２１培地中、５０ｕＭの酢酸亜鉛の存在下で共発現させた。５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、２ｍＭのＴＣＥＰ、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び４０，０００Ｕのベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含む緩衝液に細胞を再懸濁させ、３０秒、超音波処理した。溶解液を３０，０００ｒｐｍで３０分、高速回転させることによって清澄化し、清澄化した溶解液をアフィニティー樹脂Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）とともに１時間インキュベートした。５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で複合体を溶出させ、そのＺＺドメイン－６×Ｈｉｓタグを、一晩のトロンビンの切断（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１０ｍＭのイミダゾール緩衝液中での透析と組み合わせて除去した。切断された溶出液をアフィニティー樹脂Ｎｉ－ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）とともにインキュベートし、さらに精製するために、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－４００（１６／６０）というカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、２４０ｍＭのＮａＣｌ及び３ｍＭのＴＥＣＰを含む緩衝液中で、そのフロースルーを２００ｍＭのＮａＣｌに希釈した。
【0247】
ジンクフィンガータンパク質の精製
【0248】
文献で示されているように、個別に精製したＭＢＰ融合ジンクフィンガードメインのドメイン境界には、そのジンクフィンガードメインのＮ末端側に５個のアミノ酸、そのジンクフィンガードメインのＣ末端側に１個のアミノ酸が常に含まれる（いずれのナンバリングも、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｉｓｏｆｏｒｍ １に由来する）。２ＸＹＴ培地（Ｔｅｋｎｏｖａ）を用いて、ＭＢＰに融合した、ＷＴ及び変異体のＳＡＬＬ４ジンクフィンガードメインタンパク質、Ｉｋａｒｏｓジンクフィンガードメインタンパク質及びＺＦＰ９１ジンクフィンガードメインタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒという細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発現させた。０．６のＯＤ６００で１８時間、１６℃で細胞を誘導した。細胞は、ペレット化し、凍結し、精製の際に解凍し、１５０μＭの酢酸亜鉛、４０，０００Ｕのベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及び１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含むＢ－ＰＥＲ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎという緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に再懸濁させた。溶解液をアミロース樹脂（ＮＥＢ）とともに４℃で１時間インキュベートしてから、ビーズを洗浄した。２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、３ｍＭのＴＣＥＰ、１０％グリセロール、１５０μＭの酢酸亜鉛及び１０ｍＭのマルトースを含む緩衝液でタンパク質を溶出させた。
【0249】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのユビキチン化アッセイ
【0250】
精製したＥ１、Ｅ２、ユビキチン、Ｃｕｌ４Ａ－Ｒｂｘ１、セレブロン－ＤＤＢ１及びＧＳＰＴ１タンパク質を用いて、ＭＢＰに融合した上記のＷＴタンパク質及び変異体タンパク質のユビキチン化をｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成させた。マルトースアフィニティー樹脂（ＮＥＢ）によって精製した基質タンパク質を３０ｕＭという適切な濃度でインキュベートした。ユビキチン化の構成要素について、以下で簡潔に説明する。ヒトセレブロン－ＤＤＢ１（セレブロンの４０～４４２位のアミノ酸及び完全長ＤＤＢ１）、ならびに６×ｈｉｓ－ＤＤＢ１のみを昆虫細胞ＳＦ９において、５０μＭの酢酸亜鉛の存在下で共発現させ、ニッケルアフィニティー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）、ＨｉＴｒａｐ ＡＮＸカラムによるイオン交換（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ４００（１６／６０）によるサイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。ヒト完全長Ｃｕｌ４Ａ及びＲｂｘ１を昆虫細胞ＳＦ９で共発現させ、ニッケルアフィニティー樹脂及びＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（１６／６０）によるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製された組み換えヒトＵｂｅ１ Ｅ１（Ｅ－３０５）、組み換えヒトＵｂｃＨ５ａ Ｅ２（Ｅ２－６１６）及び組み換えヒトユビキチン（Ｕ－１００Ｈ）は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。構成成分は、示されているように１００μＭの化合物を含めるか、または含めずに、１０ｍＭのＡＴＰ、１μＭのＵｂｅ１、２５μＭのＵｂｃＨ５ａ、２００μＭのＵｂ、１μＭのＣｕｌ４－Ｒｂｘ１、２５μＭのＧＳＰＴ１及び１μＭのセレブロン－ＤＤＢ１という終濃度になるように、ユビキチン化アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）中で混合した。Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＰ及びユビキチンを３０分プレインキュベートし、別途、ＭＢＰ－基質、ＣＲＢＮ－ＤＤＢ１、Ｃｕｌ４－Ｒｂｘ１及び化合物を５分間、室温でプレインキュベートした後、その２つのプレインキュベーション液を混合することによって、ユビキチン化反応を開始させた。反応液を３０Ｃで２時間インキュベートしてから、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した後、クーマシー染色またはイムノブロット解析を行った。
【0251】
ヒトｉＰＳ細胞の培養
【0252】
ヒトｉＰＳ細胞株ＡＣＳ－１０１９及びＡＣＳ－１０１１（健常なドナー由来）をＡＴＣＣから購入した。それらのｈｉＰＳＣは、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で薄層コーティングした細胞培養プレート内のｍＴＥＳＲ－１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した（５％ＣＯ２加湿インキュベーターで、メーカーの指示に従って３７℃でインキュベートした）。ガラスピペットを用いた機械的な継代を通じて、細胞を分割し、２～３日おきに、ディスパーゼまたはアキュターゼによる酵素消化を行った。
【0253】
ＣＲＩＳＰＲの媒介による、セレブロンのノックアウト
【0254】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、及びセレブロンを標的とするスモールガイドＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターをヒトｉＰＳＣのＡＣＳ－１０１９に４日間トランスダクションした。得られたコロニーを増幅し、抗ＣＲＢＮ６５抗体（Ｃｅｌｇｅｎｅ）を用いたイムノブロット解析によって、セレブロンのノックアウトについてスクリーニングした。
【0255】
リアルタイムＰＣＲ
【0256】
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をメーカーの指示に従って用いて、全ＲＮＡをヒトｉＰＳ細胞から抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ランダムプライマーによって、第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。ＶｉｉＡ ７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍをＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とともに用いて、ＳＡＬＬ４（＃４３５１３７２）、ＰＯＵ５Ｆ１（＃４３３１１８２）及びＧＡＰＤＨ（＃４３２６３１７Ｅ）について、リアルタイムＰＣＲを三連で行った。
【0257】
プラスミド
【0258】
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔが、ヒトＳＡＬＬ４のコード配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、ＢＰ組み換えによってｐＤＯＮＲ２２３にサブクローニングして、ｐＤＯＮＲ２２３－ＳＡＬＬ４を作製した。そして、オーバーラップＰＣＲによる部位特異的変異誘発を行って、ｐＤＯＮＲ２２３－ＳＡＬＬ４－Ｇ４１６Ａ及びｐＤＯＮＲ２２３－ＳＡＬＬ４－Ｇ６００Ａを作製した。次に、Ｇａｔｅｗａｙ組み換えを通じて、ｐＤＯＮＲ２２３－ＳＡＬＬ４、ｐＤＯＮＲ２２３－ＳＡＬＬ４－Ｇ４１６Ａ及びｐＤＯＮＲ２２３－ＳＡＬＬ４－Ｇ６００ＡをｐＬＯＣ－ＥＦ１α－３×ＨＡ－ｇａｔｅｗａｙ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒにシャトル化して、ｐＬＯＣ－ＥＦ１α－３×ＨＡ－ＳＡＬＬ４－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒ、ｐＬＯＣ－ＥＦ１α－３×ＨＡ－ＳＡＬＬ４－Ｇ４１６Ａ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒ及びｐＬＯＣ－ＥＦ１α－３×ＨＡ－ＳＡＬＬ４－Ｇ６００Ａ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒを作製した。ヒトＣＲＢＮのコード配列をヒトｃＤＮＡクローン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）からＰＣＲ増幅し、ＢＰ組み換えによってｐＤＯＮＲ２２３にシャトル化して、ｐＤＯＮＲ２２３－ＣＲＢＮを作製した。そして、ｐＤＯＮＲ２２３－ＣＲＢＮをｐＤＥＳＴ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にシャトル化して、ｐＤＥＳＴ２７－ＣＲＢＮを作製した。
【0259】
レンチウイルスの作製及び感染
【0260】
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を用いて、レンチウイルスプラスミドを２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＭ）によって、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ－２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にコトランスフェクションした。１６時間のインキュベーション後、２０％ＦＢＳを添加した新鮮なＤＭＥＭ培地に培地を変更した。トランスフェクションから２日後に、ウイルス上清を回収し、２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離することによって清澄化してから、０．４５マイクロメートルの酢酸セルロースまたはナイロンのフィルターユニットで濾過した。細胞をレンチウイルスに、多重感染度約０．５で感染させた。１２時間後、ウイルス上清を除去し、完全培養培地をその細胞に加えた。４８時間後、細胞を１～２μｇ／ｍＬのピューロマイシンまたは１０～２０μｇ／ｍＬのブラストサイジンとともに、さらに３日間インキュベートして、レンチウイルスベクターが安定的に組み込まれた細胞を選択した。
【0261】
ＣＲＢＮ及びＳＡＬＬ４の共免疫沈降
【0262】
ＧＳＴ－ＣＲＢＮをコードするｐＤＥＳＴ２７－ＣＲＢＮ、及びブラストサイジン耐性遺伝子を含むｐＬＯＣ空ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３細胞にコトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、細胞をトリプシン処理し、９６ウェルプレートに、限界希釈を通じて播種した。ブラストサイジン（２０μｇ／ｍＬ）によって２週間選択後、シングルクローンをピックアップし、増殖させて、抗ＣＲＢＮ６５抗体によるイムノブロット解析を介して、ＧＳＴ－ＣＲＢＮの過剰発現についてスクリーニングした。次に、ＳＡＬＬ４の野生型及びバリアントを発現するレンチウイルスに、ＧＳＴ－ＣＲＢＮヒトを安定的に発現するＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３細胞を感染させて、ＧＳＴ－ＣＲＢＮ及びＳＡＬＬ４を安定的に発現するＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３細胞を作製した。そして、細胞をＤＭＳＯまたは４０μＭのサリドマイドで８時間、１μＭのＭＬＮ４９２４の存在下で処理し、緩衝液Ｂ［５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、１０％グリセロール、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｕｌｔｒａ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）及び１×ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ）］中で溶解させた。全細胞抽出物を１４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離することによって清澄化してから、抗ＨＡアフィニティー樹脂（Ｒｏｃｈｅ）とともに４℃で一晩インキュベートした。抗ＨＡ樹脂を緩衝液Ｂで６回洗浄した後、２×ＬＤＳローディング緩衝液中で９０℃において５分間煮沸することによって、抗ＨＡ免疫沈降物を溶出してから、イムノブロット解析にかけた。
【0263】
ＳＡＬＬ４の細胞内分解
【0264】
ＧＳＴ－ＣＲＢＮ及びＳＡＬＬ４バリアントを安定的に発現するＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３細胞をＤＭＳＯまたは４０μＭのサリドマイドで１６時間処理した。続いて、細胞を、氷冷した１×ＰＢＳで２回洗浄し、緩衝液Ａ［５０ｍＭのトリス．ＣＬ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトン－ｘ１００、完全プロテアーゼ阻害剤タブレット（Ｒｏｃｈｅ）、ホスファターゼ阻害剤タブレット（Ｒｏｃｈｅ）］で溶解させた。全細胞抽出物を回収し、イムノブロット解析にかけた。
【0265】
雄のニュージーランドホワイトウサギにおけるサリドマイド処置
【0266】
雄のニュージーランドホワイトウサギをビヒクル（脱イオン水中の１％カルボキシメチルセルロース）、または３０ｍｇ／ｋｇ／日もしくは１５０ｍｇ／ｋｇ／日のいずれかのサリドマイドで５６日間処置して、精巣の変性を調べた。最後の投与から２４時間後に、精巣を採取し、１０％ＮＢＦで固定し、処理し、パラフィン包埋し、免疫組織化学法のために４マイクロメートルで切片化した。
【0267】
ウサギ胚のｉｎ ｖｉｖｏ試験
【0268】
すべてのウサギは、ＩＡＣＵＣから承認された手順に従って飼養した。ウサギは、未処置のままにするか（時点ごとのｎ＝４）、またはＧＤ７から開始して、１日あたり１８０ｍｇ／ｋｇのサリドマイドを投与した（時点ごとのｎ＝５）。用量レベル及び妊娠感受ウィンドウは、サリドマイドの催奇形性の研究で以前に報告された所見（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ＭＳ，ｂｉｒｔｈ ｄｅｆｅｃｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７）に基づき選択した。
【0269】
妊娠初期（ＧＤ８～１２）には、コントロールのウサギと、サリドマイドで処置したウサギでは、着床頻度に有意差は見られなかった。Ｔｈａｌ処置群における着床部位の平均数は、８日目では８．２個、９日目では１０．４個、１０日目では８．７５個、１１日目では７．４個、１２日目では８．８個であった。コントロール群における着床部位の平均数は、８日目では８．５個、９日目では７．２５個、１０日目では７個、１１日目では９．５個、１２日目では７．５個であった。
【0270】
胚の採取の際に、胚吸収部位、胚死亡数及び肉眼観察結果を記録した。胚の死亡は、心拍の欠乏に基づいた。コントロール群では、胚吸収部位、または胚及び胎盤の異常は見られなかった。サリドマイドで処置したウサギでは、胚の吸収及び死亡がＧＤ９、ＧＤ１０、ＧＤ１１及びＧＤ１２で認められ、ＧＤ１２に最も顕著であった。８日目には、５匹のウサギの４１個のすべての着床部位は、正常なようであった。９日目に、５匹のウサギのうち１匹で影響が見られ、合計で５２個の着床部位のうち、胚吸収部位が１つ見られた。１０日目には、５匹のウサギのうち１匹で影響が見られ、合計で３８個の着床部位のうち、胚吸収部位が１つ見られた。１１日目には、５匹のウサギのうち３匹で影響が見られ、３７個の着床部位のうち、胚吸収部位は２個（５．４１％）、死亡胚は２個（５．４１％）であった。１２日目には、５匹のウサギのうち５匹で影響が見られ、４５個の着床部位のうち、胚吸収部位は３個（６．９８％）、死亡胚は１１個（２５．５８％）であった。
【0271】
各ウサギにおいて、サリドマイドの最高血漿中濃度（ＣＭａｘ＝３時間）が得られるように、最後のサリドマイドの投与から３時間後に、帝王切開を行った（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２０１４）。子宮を除去し、着床部位を計数し、胚の解剖の際に、死亡及び吸収を確認した。ＧＤ８の胚は解剖せずに、ｉｎ ｓｉｔｕで、胎盤部位及び子宮壁に付着した状態で固定した。その着床部位全体を処理し、パラフィン包埋して、免疫組織化学法のために、４マイクロメートルで切片化した。ＧＤ９～１２の胚を胚膜とともに採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、７０％エタノールに移した。固定後、胚膜を除去し、胚を処理し、パラフィン包埋し、免疫組織化学法及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順のために、４マイクロメートルで切片化した。
【0272】
ウサギ胚は、ＳＡＬＬ４に対して染色し、マウス精巣は、ＳＡＬＬ４及びＺＦＰ９１に対して染色した。Ｂｏｎｄ－ＩＩＩという自動スライド染色装置（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で、Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎというシステム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＳ９８００）を用いて、免疫組織化学法（ＩＨＣ）を行った。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を厚さ４マイクロメートルで切片化し、Ｂｏｎｄ－Ｍａｘという装置で脱パラフィンした。抗原回復をＥｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ２（ＥＲ２、ｐＨ９．０）で２０分、１００℃で行った。スライドにおいて、内在性ペルオキシダーゼ活性をＰｅｒｏｘｉｄｅ Ｂｌｏｃｋによって５分間、室温でブロックした。続いて、切片をマウスモノクローナル抗ＳＡＬＬ４ ＥＥ－３０抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１０１１４７）とともに、１：１００の希釈率で６０分間、室温で、または０．２５ｕｇ／ｍｌのウサギモノクローナル抗ＺＦＰ９１抗体（Ｃｅｌｇｅｎｅカスタムクローン１２２－８－６）とともにインキュベートした。マウス精巣では、一次抗体を１５分間、室温でインキュベートし、ポストプライマリー及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ポリマーをその装置のデフォルト条件でインキュベートした。ウサギ組織では、ＳＡＬＬ４一次抗体を６０分間インキュベートし、ポストプライマリー－ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａ９０－１１６Ｐ）を１：２００の希釈率で３０分、室温でインキュベートした。ウサギ組織でＺＡＦＰ９１を染色する際には、ＴＢＳ中の１％Ｔ－Ｘ１００で３０分、ＴＢＳ中の２％正常ヤギ血清＋１％ＢＳＡで３０分、１％ＮＧＳを含むＴＢＳでヤギ抗ウサギＦａｂ断片（非コンジュゲート）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１１－００７－００３）を１／１０に希釈したもので６０分インキュベートしてから、２％ＮＧＳ及び１％ＢＳＡを含むＴＢＳで希釈した一次ＺＦＰ９１抗体で４５分インキュベートするブロック工程を含めた。１％ＮＧＳを含むＴＢＳ中で、ビオチン化二次ヤギ抗ウサギＦａｂ断片（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１１－０６７－００３）を１／８００の希釈率で１５分用いてから、ストレプトアビジン－ＨＲＰをＢｏｎｄ Ｉｎｔｅｎｓｅ Ｒというシステムで検出した。続いて、抗原－抗体複合体を基質の過酸化水素及び色原体のジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）によって可視化した。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水して、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｆｉｌｍ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｒによってカバースリップした。
【0273】
ＳＡＬＬ４ ＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）
【0274】
完全自動化のＳＡＬＬ４ ＩＳＨアッセイをＬｅｉｃａ ＢＯＮＤ ＲＸ ＩＨＣ ＆ ＩＳＨ染色装置で、ＢＯＮＤ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ、カタログ番号ＤＳ９４５５）を用いて行った。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ウサギ胚を厚さ４マイクロメートルで切片化し、６０℃で１時間加熱してから、Ｄｅｗａｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで７２℃において脱パラフィンした。抗原回復をＥｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ２（ＥＲ２、ｐＨ９．０）で１５分、９５℃で行った。カスタム設計したウサギＳＡＬＬ４標的プローブをスライドに添加し、４２℃で２時間インキュベートした。続いて、ＲＮＡｓｃｏｐｅ ＬＳ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＡＣＤ、カタログ番号３２２８００）によって、ＢＯＮＤ ＲＸのデフォルトのＡＣＤ ＩＳＨプロトコールを用いて、ＳＡＬＬ４シグナルを増幅した。フルオロフォアＯｐａｌ ＴＳＡ５７０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号ＦＰ１４８８００１ＫＴ）を１：１５００の希釈率で、３０分のインキュベーションに用いて、ＳＡＬＬ４シグナルを検出した。続いて、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号Ｐ３６９６６）を用いて、スライドを手動でカバースリップした。倍率４倍でスライド全体のスキャンを行ったら、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｅｃｔｒａ３．０というマルチスペクトル画像プラットフォームを用いて、倍率４０倍の画像を取得した。
【0275】
ヒト化セレブロンマウス
【0276】
この試験では、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎｔａｃマウスを使用し、Ｔａｃｏｎｉｃにおいて、特定病原体未感染の状態で維持した。
【0277】
ターゲティング性を高めるために、ネオマイシンカセット挿入部位をターゲティングするように設計されたＸＴＮ（商標）２ ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｇｅｎ）とともに、エキソン２（Ｇｌｕ２４）由来のヒトｃＤＮＡ、ｂＧＨｐＡ及びネオマイシン選択カセットからなるＣＲＢＮドナーベクターを含むＣ５７Ｂｌ／６Ｎｔａｃ ＪＭ８ ＥＳ細胞のエレクトロポレーションによって、ヒトＣＲＢＮ発現マウスを作製した。そのベクターは、ＣＲＢＮが、内在性のマウスプロモーターによって駆動されるとともに、ｂＧＨｐＡで終結する転写産物が、マウスＣＲＢＮ遺伝子のスプライシングを阻害させるように設計した。
【0278】
そのクローンから得られたＰＣＲ産物のシーケンシングにより、５’末端及び３’末端の両方でターゲティングが確認された。ターゲットクローンを胚盤胞に注入し、得られたキメラをＣｒｅリコンビナーゼデリーターマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）と交配して、ネオマイシン耐性カセットを欠失させた。そして、ホモ接合体になるまで、コロニーを交配した。
【0279】
ヒト化セレブロンマウスにおける胚障害の判断
【0280】
サリドマイドを雌のＨＯＭ ｈｕＣＲＢＮマウスに、０ｍｇ／ｋｇ／日（ＲＯ脱イオン水中の１．０％［ｗ／ｖ］カルボキシメチルセルロース［１５００～３０００ｃＰ］）、１００ｍｇ／ｋｇ／日、３００ｍｇ／ｋｇ／日または１０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量レベルで、妊娠６日目から妊娠１５日目［ＧＤ６～１５］まで、１日に１回、強制経口投与した。ＧＤ１５に、生物分析及びトキシコキネティクスの評価のために、投与から０．５時間後、１時間後、３時間後、６時間後及び２４時間後に、試験に割り当てたマウスの顎下静脈から、血液試料を採取した。すべてのマウスは、ＧＤ１８に予定されていた検死まで生存した。マウスを安楽死させ、検査し、肉眼的検死を行った。卵巣及び子宮において、黄体の数及び分布、着床部位、胎盤（大きさ、色及び形）、生存胎児及び死亡胎児、ならびに初期胚吸収及び後期胚吸収を調べた。ペントバルビタールナトリウム（３９０ｍｇ／ｍＬ）の腹腔内注射によって、胎児を安楽死させた。胎児の重さを量り、性別及び外見の異常について調べた。後期吸収胚において、外見の異常及び性別を可能な範囲内で調べた。各胎児の体重を記録した。胎児は、試験番号、同腹児数及び子宮内分布によって個々に識別した。それぞれの同腹における胎児の約半数において、Ｗｉｌｓｏｎの切片化技法の適用によって、内臓の異常を調べた。各胎児をブアン液で固定し、切片をアルコールで保存した。残りの胎児（それぞれの同腹における胎児の約半数）において、アリザリンレッドＳで染色後、骨格の異常を調べた。調べた後、チモールを保存剤として加えたグリセリンにおいて、骨格標本を保持した。
【0281】
６．２ ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＳＡＬＬ４は、サリドマイド及びセレブロン－ＣＲＬ４の直接的な基質である。
ＳＡＬＬ４は、７つのジンクフィンガードメインを含み、そのうちの４つは、セレブロン基質のＩｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓと同じ位置にグリシンを有する。この実施例では、これらの４つのグリシン含有ジンクフィンガーを含む４つのドメインにおいて、完全精製のｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化系で、セレブロン－ＣＲＬ４による、化合物依存的なユビキチン化について試験した（図１を参照されたい）。第１のジンクフィンガードメインには、４０５～４３２位のアミノ酸残基が含まれ、このドメインは、ＴＧＥＲＰＦＶＣＳＶＣＧＨＲＦＴＴＫＧＮＬＫＶＨＦＨＲＨ（配列番号３）という配列を有する。第２のジンクフィンガードメインには、５８９～６１６位のアミノ酸残基が含まれ、このドメインは、ＴＧＥＲＰＦＱＣＫＩＣＧＲＡＦＳＴＫＧＮＬＫＴＨＬＧＶＨ（配列番号４）という配列を有する。第３のジンクフィンガードメインには、８６５～８９２位のアミノ酸残基が含まれ、このドメインは、ＲＱＡＫＱＨＧＣＴＲＣＧＫＮＦＳＳＡＳＡＬＱＩＨＥＲＴＨ（配列番号５）という配列を有する。第４のジンクフィンガードメインには、８９３～９２０位のアミノ酸残基が含まれ、このドメインは、ＴＧＥＫＰＦＶＣＮＩＣＧＲＡＦＴＴＫＧＮＬＫＶＨＹＭＴＨ（配列番号６）という配列を有する。Ｉｋａｒｏｓのジンクフィンガードメイン（１４０～１６８位のアミノ酸残基）をコントロールとして使用したが、このドメインは、ＴＧＥＲＰＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳ（配列番号７）という配列を有する。
ＳＡＬＬ４は、７つのジンクフィンガードメインを含み、そのうちの４つは、セレブロン基質のＩｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓと同じ位置にグリシンを有する。この実施例では、これらの４つのグリシン含有ジンクフィンガーを含む４つのドメインにおいて、完全精製のｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化系で、セレブロン－ＣＲＬ４による、化合物依存的なユビキチン化について試験した（図１を参照されたい）。第１のジンクフィンガードメインには、４０５～４３２位のアミノ酸残基が含まれ、このドメインは、ＴＧＥＲＰＦＶＣＳＶＣＧＨＲＦＴＴＫＧＮＬＫＶＨＦＨＲＨ（配列番号３）という配列を有する。第２のジンクフィンガードメインには、５８９～６１６位のアミノ酸残基が含まれ、このドメインは、ＴＧＥＲＰＦＱＣＫＩＣＧＲＡＦＳＴＫＧＮＬＫＴＨＬＧＶＨ（配列番号４）という配列を有する。第３のジンクフィンガードメインには、８６５～８９２位のアミノ酸残基が含まれ、このドメインは、ＲＱＡＫＱＨＧＣＴＲＣＧＫＮＦＳＳＡＳＡＬＱＩＨＥＲＴＨ（配列番号５）という配列を有する。第４のジンクフィンガードメインには、８９３～９２０位のアミノ酸残基が含まれ、このドメインは、ＴＧＥＫＰＦＶＣＮＩＣＧＲＡＦＴＴＫＧＮＬＫＶＨＹＭＴＨ（配列番号６）という配列を有する。Ｉｋａｒｏｓのジンクフィンガードメイン（１４０～１６８位のアミノ酸残基）をコントロールとして使用したが、このドメインは、ＴＧＥＲＰＦＱＣＮＱＣＧＡＳＦＴＱＫＧＮＬＬＲＨＩＫＬＨＳ（配列番号７）という配列を有する。
【0282】
より具体的には、ＳＡＬＬ４の個々のジンクフィンガードメインをＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ＭＢＰタグを介して精製した。そして、精製したジンクフィンガーをｉｎ ｖｉｔｒｏユビキチン化アッセイで、セレブロンへの結合及びユビキチン化について試験した。精製したジンクフィンガーを、精製したセレブロン－ＣＲＬ４ユビキチンリガーゼ複合体、ならびに精製したユビキチン化カスケード成分Ｕｂａ１、ＵｂｃＨ５ａ、ＵｂｃＨ５ｂ、ＡＴＰ及びユビキチンとともにインキュベートした。ユビキチン化は、セレブロン改変化合物（サリドマイド「ｔｈａｌ」）の存在下のみで観察され、ＤＭＳＯ単独の場合には観察されなかった。
【0283】
図１Ａに示されているように、１つのジンクフィンガードメイン（４０５～４３２位のアミノ酸）が、サリドマイド依存的に、かなり強く、Ｉｋａｒｏｓと同程度にユビキチン化された。精製した系におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのユビキチン化によって、ＳＡＬＬ４タンパク質が、ユビキチン化の際に、サリドマイドと結合したセレブロンと直接相互作用し得ること、及び４０５～４３２位のアミノ酸（配列番号３）のジンクフィンガーが、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの結合の大きな動因であることが示されている。
【0284】
別の実験では、ＳＡＬＬ４タンパク質において、既知のネオ基質（重要な位置にグリシンを含むβ－ヘアピンモチーフ）のセレブロンへの結合を媒介することが示されている構造的特徴の存在についてさらに解析されている。Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓは、ジンクフィンガードメイン内にこのモチーフを有する。この実験で解析した、ＳＡＬＬ４の７つのジンクフィンガードメインは、図１Ｂに示されている。そのうちの４つが、セレブロンへの結合を媒介するのに必要な位置に、グリシンを含む（図１Ｂを参照されたい）。我々のｉｎ ｖｉｔｒｏでのセレブロン－ＣＲＬ４ユビキチン化アッセイ（図１Ｃを参照されたい）で試験するために、これらの４つの個別のジンクフィンガーのヒト型を発現させて、精製した。１つのジンクフィンガードメイン（ＺＦ２、４１０～４３２位のアミノ酸（配列番号１１））は、サリドマイド依存的に、強くユビキチン化され、第２のジンクフィンガードメイン（ＺＦ４、５９４～６１６位のアミノ酸）も、ＺＦ２よりは弱いが、サリドマイドの存在下でユビキチン化された。ＺＦ２は、セレブロンに結合することが示されているＩｋａｒｏｓ及びＺＦＰ９１のジンクフィンガードメインと同程度にユビキチン化された（図１Ｄ）。好ましいジンクフィンガードメインの存在は、セレブロン基質のＩｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓを彷彿させる（Ｉｋａｒｏｓ及びＡｉｏｌｏｓでは、単一のジンクフィンガーモチーフが、セレブロンのリクルート及び分解を媒介する）。
【0285】
他のネオ基質で立証されているように、これらのジンクフィンガーのユビキチン化が、グリシン残基（ＺＦ２のＧ４１６及びＺＦ４のＧ６００）に依存するかを調べるために、追加の実験を行った（図１Ｃ及び図１Ｄを参照されたい）。そのグリシンをアラニンに変異させたところ、両方のジンクフィンガーのユビキチン化は、有意に軽減され、ＩｋａｒｏｓにおいてＧ１５１をアラニンに、ＺＦＰ９１においてＧ４０６をアラニンに変異させた場合に、ユビキチン化の阻止が観察されたことと整合し（図１Ｄを参照されたい）、これらのＳＡＬＬ４ジンクフィンガーが、グリシンを含むβ－ヘアピンモチーフを利用して、セレブロンに結合することが示された。したがって、精製した系における、これらのユビキチン化実験によって、ＳＡＬＬ４ジンクフィンガーが、ユビキチン化の際に、サリドマイドと結合したセレブロンと直接相互作用し得ること、ＺＦ２（４１０～４３２位のアミノ酸）が、セレブロンと相互作用するジンクフィンガーの中で最も顕著なものであること、及びこれらのジンクフィンガーが、グリシンを含むβヘアピンモチーフを通じて結合すると思われることが示されている。
【0286】
続いて、サリドマイドによって誘発される催奇形性を媒介する際に、ＳＡＬＬ４のユビキチン化が果たす役割を探るために、我々は、サリドマイドによって誘発される催奇形性に対する感受性が、ウサギとマウスで異なることを、配列の違いによって説明できるかを調べた。マウスセレブロンは、サリドマイド結合ポケットの周囲に、セレブロンとネオ基質との結合を阻害することが以前示された２つのアミノ酸の違いを含むが、ウサギセレブロンは、これらの変異を含まず、そのセレブロンは、ネオ基質結合部位の周囲区域が、ヒトセレブロンとの間で１００％保存されている（図１Ｅ及び１Ｇを参照されたい）。ヒトＳＡＬＬ４と、マウスオルソログ及びウサギオルソログとのアラインメントによって、ＺＦ２は、ヒトとウサギの間で１００％保存されているが、マウスでは、配列に違いがあることが示されている（図１Ｆ及び１Ｇを参照されたい）。
【0287】
そこで、我々は、サリドマイドによって処理した場合に、ウサギセレブロンがウサギＳＡＬＬ４ジンクフィンガーを、マウスセレブロンがマウスＳＡＬＬ４ジンクフィンガーをユビキチン化し得るかを試験した。図１Ｃに示されているように、ウサギセレブロンは、ウサギジンクフィンガーである３５７～３８５位のアミノ酸（ヒトＺＦ２のオルソログ）をサリドマイド依存的にユビキチン化でき、効率性は、そのヒトタンパク質に匹敵していた。これに対して、マウスセレブロンは、マウスＳＡＬＬ４ジンクフィンガーである４１０～４３８位のアミノ酸（ヒトＺＦ２のオルソログ）をユビキチン化できなかった。そこで我々は、基質の結合を阻害する、マウスセレブロンにおける既知の変異に鑑み、ヒトセレブロンがマウスＳＡＬＬ４を認識し得るかを調べた。ヒトセレブロンは、マウスＳＡＬＬ４ジンクフィンガーをユビキチン化できないことが明らかになり、マウスＳＡＬＬ４における変異は、セレブロンへの結合を阻害するものであり、したがって、ＷＴマウス及びヒトセレブロン（ｈｕＣＲＢＮ）トランスジェニックマウスの両方において、ＳＡＬＬ４の分解が低減されることになることが示された。実際に、グリシンを含むβ－ヘアピンモチーフを有する４つのすべてのマウスＳＡＬＬ４ジンクフィンガーを試験したところ、マウスセレブロンまたはヒトセレブロンのいずれによっても、効率的にユビキチン化されたものはなかった（図１Ｈを参照されたい）。
【0288】
６．３ ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＳＡＬＬ４は、サリドマイド及びセレブロン－ＣＲＬ４の直接的な基質であり、ＳＡＬＬ４のセレブロンへの結合及びＳＡＬＬ４の分解は、ＳＡＬＬ４の残基Ｇ４１６に依存する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析で、ＳＡＬＬ４がセレブロンに直接結合し、ＳＡＬＬ４がユビキチン化されることが示されたことに鑑み、この実施例では、細胞内での結合及びユビキチン化についてさらに調べた。ヒト組織培養細胞での完全長ＳＡＬＬ４のユビキチン化及びプロテアソームによる分解を解析した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析で、ＳＡＬＬ４がセレブロンに直接結合し、ＳＡＬＬ４がユビキチン化されることが示されたことに鑑み、この実施例では、細胞内での結合及びユビキチン化についてさらに調べた。ヒト組織培養細胞での完全長ＳＡＬＬ４のユビキチン化及びプロテアソームによる分解を解析した。
【0289】
完全長ヒトＳＡＬＬ４を安定的に発現する細胞を、セレブロンの存在下または不在下で、サリドマイド、レナリドマイドまたはポマリドミドによって処理した。より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によってセレブロンがノックアウトされており、ＨＡタグを付加したＳＡＬＬ４またはＳＡＬＬ４変異体を安定的に発現するＬｅｎｔｉ－ｘ２９３細胞株に、ＧＳＴ－セレブロンベクターまたは空ベクターをトランスフェクションした。続いて、細胞をサリドマイド（ＴＨＡＬ）、レナリドマイド（ＬＥＮ）またはポマリドミド（ＰＯＭ）で処理して、その化合物に依存的に、ＳＡＬＬ４が分解されるのかをモニタリングした。ＺＦＰ９１は、セレブロンを発現するすべての細胞株で化合物依存的に分解されるコントロール化合物依存的なセレブロン基質としてモニタリングした。アクチンをローディングコントロールとして使用した。
【0290】
ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルが化合物依存的に低下したことが観察され、その低下が、セレブロンの発現に依存することが明らかになった（図２を参照されたい）。続いて、Ｇ４１６（４０５～４３２位のアミノ酸のジンクフィンガーに存在するグリシン）またはＧ６００（５８９～６１６位のアミノ酸のジンクフィンガーに存在するグリシン）のいずれかをアラニンに変異させたＳＡＬＬ４において、化合物依存的な分解をモニタリングした。Ｇ４１６Ａという変異は、ＳＡＬＬ４を安定させるのに充分であり、化合物の誘導によるＳＡＬＬ４の分解を阻止したが、Ｇ６００Ａという変異は、ＳＡＬＬ４を安定させるには充分ではなかったことから、４０５～４３２位のアミノ酸のジンクフィンガーが、細胞において、セレブロンへの結合及び化合物依存的なユビキチン化の大きな動因であることと整合していた。
【0291】
続いて、細胞内での完全長ＳＡＬＬ４のセレブロンへの結合を共免疫沈降によって試験した（図３を参照されたい）。ＨＡタグを付加したＷＴ ＳＡＬＬ４、Ｇ４１６Ａ ＳＡＬＬ４またはＧ６００Ａ ＳＡＬＬ４を細胞から免疫沈降させ、共精製されたセレブロンのレベルをウエスタンブロットによって評価した。簡潔に述べると、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９によってセレブロンがノックアウトされており、ＨＡタグを付加したＳＡＬＬ４またはＳＡＬＬ４変異体を安定的に発現するＬｅｎｔｉ－ｘ２９３細胞株に、ＧＳＴ－セレブロンベクターまたは空ベクターのいずれかをトランスフェクションした。続いて、細胞をサリドマイド（ＴＨＡＬ）、レナリドマイド（ＬＥＮ）またはポマリドミド（ＰＯＭ）で処理し、抗ＨＡビーズを用いて、ＳＡＬＬ４をプルダウンした。そして、共精製されたＧＳＴ－セレブロンの量をウエスタンブロットによって評価した。ＷＴ ＳＡＬＬ４及びＧ６００Ａ ＳＡＬＬ４の両方で、化合物依存的にセレブロンに強力に結合したことが示されたが、Ｇ４１６Ａ変異ＳＡＬＬ４では、結合が有意に阻害されたことから、４０５～４３２位のアミノ酸のＳＡＬＬ４ジンクフィンガーが、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの結合の大きな動因であることが確認された。
【0292】
６．４ ＳＡＬＬ４の分解は、化合物による処理に依存する。
続いて、内在性ＳＡＬＬ４の化合物依存的な分解が確認された（図４を参照されたい）。培養したＮＣＣＩＴ、ＮＥＴＲＡ－２ ｃｌ．Ｄ１及びＡＮ３－ＣＡというがん細胞株を、示されている濃度のサリドマイド、レナリドマイドまたはポマリドミドで１６時間処理してから、細胞試料を、抗ＳＡＬＬ４抗体（ＥＥ－３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）によるウエスタンブロットによって解析した。比較のために、セレブロンの存在を確認する抗セレブロンブロット、及び抗アクチンローディングコントロール）とともに、短期暴露（Ｓ．Ｅ．）及び長期暴露（Ｌ．Ｅ．）の両方の抗ＳＡＬＬ４ウエスタンブロットが示されている。
続いて、内在性ＳＡＬＬ４の化合物依存的な分解が確認された（図４を参照されたい）。培養したＮＣＣＩＴ、ＮＥＴＲＡ－２ ｃｌ．Ｄ１及びＡＮ３－ＣＡというがん細胞株を、示されている濃度のサリドマイド、レナリドマイドまたはポマリドミドで１６時間処理してから、細胞試料を、抗ＳＡＬＬ４抗体（ＥＥ－３０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）によるウエスタンブロットによって解析した。比較のために、セレブロンの存在を確認する抗セレブロンブロット、及び抗アクチンローディングコントロール）とともに、短期暴露（Ｓ．Ｅ．）及び長期暴露（Ｌ．Ｅ．）の両方の抗ＳＡＬＬ４ウエスタンブロットが示されている。
【0293】
これらの細胞株では、内在性ＳＡＬＬ４をウエスタンブロットによって観察でき、サリドマイド、レナリドマイドまたはポマリドミドのいずれかで１６時間処理した後、薬物依存的な分解をモニタリングした。内在性ＳＡＬＬ４が、化合物依存的に有意に分解されたことが観察された。
【0294】
６．５ ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＡＬＬ４の分解
ウサギにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＳＡＬＬ４のサリドマイド依存的なダウンレギュレーションも観察された。ウサギは、サリドマイドによって誘発される催奇形性に対して感受性を持つ種であることが以前に示されている。この実施例では、成体の雄のウサギを３０ｍｇ／ｋｇまたは１５０ｍｇ／ｋｇのサリドマイドで処置した。精巣を解剖し、その後、免疫組織化学法によって、ＳＡＬＬ４の発現レベルを調べたが、その結果は、図５に示されている。
ウサギにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＳＡＬＬ４のサリドマイド依存的なダウンレギュレーションも観察された。ウサギは、サリドマイドによって誘発される催奇形性に対して感受性を持つ種であることが以前に示されている。この実施例では、成体の雄のウサギを３０ｍｇ／ｋｇまたは１５０ｍｇ／ｋｇのサリドマイドで処置した。精巣を解剖し、その後、免疫組織化学法によって、ＳＡＬＬ４の発現レベルを調べたが、その結果は、図５に示されている。
【0295】
別の実験で、妊娠ウサギを１８０ｍｇ／ｋｇのサリドマイドで処置した。その後、胚において、ＳＡＬＬ４レベルを免疫組織化学法によって調べたが、その結果は、図６に示されている。
【0296】
より具体的には、下記の表１に示されているように、妊娠８日目（ＧＤ８）、ＧＤ９、ＧＤ１０、ＧＤ１１及びＧＤ１２に胚を採取するために、５～８月齢である成体の雌のニュージーランドホワイトウサギを管理交配させた。
表１．サリドマイドで処置したウサギにおける着床部位
表１．サリドマイドで処置したウサギにおける着床部位
【表1】
【0297】
ＧＤ８胚を含む子宮の全断面、及びＧＤ９～１２の未処置ウサギ胚の矢状断面で、ＳＡＬＬ４に対する免疫組織化学法を行い、すべての胚葉におけるＳＡＬＬ４タンパク質の発現を明らかにしたところ、明らかな分布パターンが見られた（図６を参照されたい）。ＧＤ８の胚膜では、核内ＳＡＬＬ４が見られたが、胎盤、子宮内膜または子宮壁では見られなかった。ＧＤ９～１２の胚では、ＳＡＬＬ４は、サリドマイド催奇形性試験で悪影響を受けることの多い胚構造体において、同様に分布していたとともに、高いレベルで観察された。神経管及び眼胞（外胚葉）、肢芽及び中腎（中胚葉）、ならびに肝芽及び肺芽（内胚葉）で、最も高いＳＡＬＬ４レベルが観察された（図６を参照されたい）。ＧＤ９、ＧＤ１０及びＧＤ１１では、ＳＡＬＬ４レベルは総じて高く、ＧＤ１２に低下し始めた。
【0298】
サリドマイド処置群の胚では、ＳＡＬＬ４レベルの有意な低下が見られ、この低下は、ＧＤ１２に最も顕著であった（図６を参照されたい）。ＧＤ９以降には、サリドマイド処置群の胚での肉眼的異常が観察されたことから、妊娠感受期にわたって、胚におけるサリドマイド暴露量が相当な量であったことが示された。特によく見られた所見には、胎盤、胚膜、及び肝芽と肺芽に近い胚腹部領域における出血、奇形頭、眼胞の拡張、神経管の拡張及び屈曲、肢芽の短縮、ならびに尾のよじれが含まれていた。すなわち、サリドマイドによって誘発される催奇形性が見られる生物では、胎児の発達時に、関連組織において、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルがサリドマイドによって低下する。
【0299】
【0300】
６．６ ヒトｉＰＳ細胞において、ＳＡＬＬ４は、セレブロン依存的かつプロテアソーム依存的に分解される。
ヒトｉＰＳ細胞でも、サリドマイドの誘導によって、内在性ＳＡＬＬ４タンパク質が分解されることが観察された。ヒトｉＰＳ細胞において、サリドマイドに暴露させたところ、ＳＡＬＬ４レベルが、用量依存的に低下したとともに、ＣＲＩＳＰＲ媒介性の遺伝子編集を介して、セレブロンをノックアウトしたところ、サリドマイドによって誘導される、ＳＡＬＬ４のダウンレギュレーションが、完全にブロックされた（図７Ａ）。サリドマイドによって誘導される、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルの低下は、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２及びＮＥＤＤ８活性化酵素阻害剤ＭＬＮ４９２４（すべてのＣＲＬを不活化させる）によって阻止されたことから、ユビキチンの媒介によるプロテアソーム分解を通じて、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルが低下することが示された（図７Ｂ）。我々は、ＳＡＬＬ４レベルに対するいずれの転写作用も除外するために、ＳＡＬＬ４ ｍＲＮＡのレベルが、サリドマイドによる処理によっては低下しなかったことを確認し（図７Ｅ）、ネオ基質ＧＳＰＴ１で報告されているように、ＳＡＬＬ４ ｍＲＮＡのレベルは、おそらくは、タンパク質が減少した際の恒常性の調節により、むしろ上昇する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのユビキチン化によって最も効率的な基質として特定されたＺＦ２におけるグリシン含有デグロンが、細胞内のＳＡＬＬ４タンパク質の減少に関与するのかを調べるために、サリドマイドで処理したＨＥＫ２９３細胞で、異所的に発現させたＳＡＬＬ４野生型タンパク質、Ｇ４１６Ａ変異体タンパク質及びＧ６００Ａ変異体タンパク質の分解を試験した（図７Ｃを参照されたい）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果と整合して、Ｇ４１６Ａ変異体は、ＳＡＬＬ４のサリドマイド依存的な分解をブロックしたが、Ｇ６００Ａは、ＳＡＬＬ４の分解に対する作用を有さなかったことから、ＺＦ２が、セレブロンへの結合及びＳＡＬＬ４のユビキチン化を媒介する主なジンクフィンガーであることが確認された。同様に、野生型タンパク質、Ｇ４１６Ａ変異体タンパク質及びＧ６００Ａ変異体タンパク質がセレブロンに結合する能力を共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）によって試験した（図７Ｄを参照されたい）。野生型ＳＡＬＬ４及びＧ６００Ａ変異体ＳＡＬＬ４は、セレブロンに結合できたが、Ｇ４１６Ａ変異体では、細胞におけるセレブロンへの結合が阻害された。勘案すると、これらの結果から、ＳＡＬＬ４タンパク質が、他のネオ基質と一致する形で、ＣＲＬ４－ＣＲＢＮ Ｅ３リガーゼにリクルートされ、「Ｇ－モチーフ」デグロンが、ジンクフィンガー２において、重要な残基のＧ４１６の周囲に位置することが示されている。
ヒトｉＰＳ細胞でも、サリドマイドの誘導によって、内在性ＳＡＬＬ４タンパク質が分解されることが観察された。ヒトｉＰＳ細胞において、サリドマイドに暴露させたところ、ＳＡＬＬ４レベルが、用量依存的に低下したとともに、ＣＲＩＳＰＲ媒介性の遺伝子編集を介して、セレブロンをノックアウトしたところ、サリドマイドによって誘導される、ＳＡＬＬ４のダウンレギュレーションが、完全にブロックされた（図７Ａ）。サリドマイドによって誘導される、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルの低下は、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２及びＮＥＤＤ８活性化酵素阻害剤ＭＬＮ４９２４（すべてのＣＲＬを不活化させる）によって阻止されたことから、ユビキチンの媒介によるプロテアソーム分解を通じて、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルが低下することが示された（図７Ｂ）。我々は、ＳＡＬＬ４レベルに対するいずれの転写作用も除外するために、ＳＡＬＬ４ ｍＲＮＡのレベルが、サリドマイドによる処理によっては低下しなかったことを確認し（図７Ｅ）、ネオ基質ＧＳＰＴ１で報告されているように、ＳＡＬＬ４ ｍＲＮＡのレベルは、おそらくは、タンパク質が減少した際の恒常性の調節により、むしろ上昇する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのユビキチン化によって最も効率的な基質として特定されたＺＦ２におけるグリシン含有デグロンが、細胞内のＳＡＬＬ４タンパク質の減少に関与するのかを調べるために、サリドマイドで処理したＨＥＫ２９３細胞で、異所的に発現させたＳＡＬＬ４野生型タンパク質、Ｇ４１６Ａ変異体タンパク質及びＧ６００Ａ変異体タンパク質の分解を試験した（図７Ｃを参照されたい）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果と整合して、Ｇ４１６Ａ変異体は、ＳＡＬＬ４のサリドマイド依存的な分解をブロックしたが、Ｇ６００Ａは、ＳＡＬＬ４の分解に対する作用を有さなかったことから、ＺＦ２が、セレブロンへの結合及びＳＡＬＬ４のユビキチン化を媒介する主なジンクフィンガーであることが確認された。同様に、野生型タンパク質、Ｇ４１６Ａ変異体タンパク質及びＧ６００Ａ変異体タンパク質がセレブロンに結合する能力を共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）によって試験した（図７Ｄを参照されたい）。野生型ＳＡＬＬ４及びＧ６００Ａ変異体ＳＡＬＬ４は、セレブロンに結合できたが、Ｇ４１６Ａ変異体では、細胞におけるセレブロンへの結合が阻害された。勘案すると、これらの結果から、ＳＡＬＬ４タンパク質が、他のネオ基質と一致する形で、ＣＲＬ４－ＣＲＢＮ Ｅ３リガーゼにリクルートされ、「Ｇ－モチーフ」デグロンが、ジンクフィンガー２において、重要な残基のＧ４１６の周囲に位置することが示されている。
【0301】
６．７ ＳＡＬＬ４は、ウサギの精巣では分解されるが、ｈｕＣＲＢＮマウスの精巣では分解されない。
この実施例ではさらに、ｉｎ ｖｉｖｏで、サリドマイドによるＳＡＬＬ４の分解を試験及び比較した。ＳＡＬＬ４は、胎児の発達時に発現するが、成体組織では、精巣で見られる幹細胞のような限られた数の組織で、発現が維持される。我々は、ポジティブコントロールとして、ＳＡＬＬ４のダウンレギュレーションと、既知のセレブロンネオ基質のダウンレギュレーションを比較したいと考えた。サリドマイドは、Ｉｋａｒｏｓの分解を誘発する活性は中程度に過ぎず、ＣＫ１αの分解は誘発しない（本明細書には、データは示されていない）。したがって、免疫組織化学法によって直接比較可能なように、我々は、サリドマイドに対する感受性を有するとともに、組織分布が、Ｉｋａｒｏｓよりも広範であるセレブロンネオ基質を探した。上記のように、ＺＦＰ９１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのユビキチン化解析において、ＣＲＬ４－ＣＲＢＮの直接的な基質であることが確認された。
この実施例ではさらに、ｉｎ ｖｉｖｏで、サリドマイドによるＳＡＬＬ４の分解を試験及び比較した。ＳＡＬＬ４は、胎児の発達時に発現するが、成体組織では、精巣で見られる幹細胞のような限られた数の組織で、発現が維持される。我々は、ポジティブコントロールとして、ＳＡＬＬ４のダウンレギュレーションと、既知のセレブロンネオ基質のダウンレギュレーションを比較したいと考えた。サリドマイドは、Ｉｋａｒｏｓの分解を誘発する活性は中程度に過ぎず、ＣＫ１αの分解は誘発しない（本明細書には、データは示されていない）。したがって、免疫組織化学法によって直接比較可能なように、我々は、サリドマイドに対する感受性を有するとともに、組織分布が、Ｉｋａｒｏｓよりも広範であるセレブロンネオ基質を探した。上記のように、ＺＦＰ９１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのユビキチン化解析において、ＣＲＬ４－ＣＲＢＮの直接的な基質であることが確認された。
【0302】
このため、成体の雄のウサギ及びマウスにおいて、免疫組織化学法によって、精巣でのＳＡＬＬ４及びＺＦＰ９１の発現の変化について試験及び観察を行った。ウサギ及びマウスでは、ＳＡＬＬ４は、細精管の最基底層沿いに位置する細胞サブセット（精原細胞の形態学的特徴を有する）の核内で高度に発現される。サリドマイドで処置したウサギでは、精巣におけるＳＡＬＬ４タンパク質のレベルが用量依存的に低下し、低下は、１５０ｍｇ／ｋｇ／日において顕著であった（図８の左パネルを参照されたい）。デグロンのＺＦＰ９１は、ウサギとヒトの間で保存されており、処置したウサギでは、それに応じて、ＺＦＰ９１が減少する（図８の左パネルを参照されたい）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、サリドマイドで処置しても、ＳＡＬＬ４ ｍＲＮＡのレベルは、分解機序と整合して、変化しないことが示された（図９を参照されたい）。
【0303】
マウスでは、セレブロンに、ネオ基質のリクルート及び分解をブロックするとともに、サリドマイドの催奇形性作用に対する耐性を持つことが示されている種特異的なアミノ酸の違いが見られることが知られている。ＷＴマウスでは、サリドマイドで処理したところ、ＳＡＬＬ４またはＺＦＰ９１の減少は見られなかった（図８の中央パネルを参照されたい）。セレブロンモジュレーターに対する感受性を付与するために、我々は、ヒトセレブロンを発現するように操作されたトランスジェニックマウスを構築した（図１０を参照されたい）。ＺＦＰ９１の配列では、グリシン含有ネオ基質デグロンの周囲の領域が、ヒトとマウスの間で保存されており、したがって、ＺＦＰ９１は、ｈｕＣＲＢＮマウスにおいて、強くダウンレギュレーションされる（図８の右パネルを参照されたい）。これに対して、最大１０００ｍｇ／ｋｇのサリドマイドで７日間処置した後でも、精巣において、ＳＡＬＬ４タンパク質のレベルは変化していない（図８の右パネルを参照されたい）。マウスとウサギにおけるＳＡＬＬ４タンパク質配列の違いによって、ユビキチン化比率の違いを説明できることを示したｉｎ ｖｉｔｒｏでのユビキチン化データと、これらの所見は整合している。
【0304】
６．８ ヒトセレブロントランスジェニックマウスでは、サリドマイドの催奇形性が見られない。
マウスでは、ヒトセレブロンは、ＺＦＰ９１のような、保存されたネオ基質タンパク質を分解させるが、マウスＳＡＬＬ４タンパク質の配列の違いにより、ＳＡＬＬ４は分解させないことがわかったので（第６．７節を参照されたい）、この実施例では、サリドマイドがヒトトランスジェニックマウス（ｈｕＣＲＢＮ）に及ぼす催奇形性作用が特徴付けられている。管理交配したホモ接合体ｈｕＣＲＢＮマウス（１０／群）にサリドマイドを０ｍｇ／ｋｇ／日（コントロール）、１００ｍｇ／ｋｇ／日、３００ｍｇ／ｋｇ／日及び１０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、主要器官形成期（妊娠６～１５日目）に経口投与しても、胎児には、いずれの発生異常も見られなかった。コントロールでは、生存胎児は、１００ｍｇ／ｋｇ／日群で７匹、３００ｍｇ／ｋｇ／日群で９匹、１０００ｍｇ／ｋｇ／日群で８匹であった。試験中、薬物動態を評価して、サリドマイドへの暴露レベルが充分であったか確認したところ、薬物処置群における対応する平均血漿暴露量（曲線下面積）は、３５，１００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ、７８，６００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ及び１４３，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬであった。その後、胎児において、発生異常の発現について調べたところ、発生異常は報告されなかった（サリドマイドで処置したｈｕＣＲＢＮマウスと、未処置のｈｕＣＲＢＮマウスから得た骨格標本の比較が、図１１に示されている）。
マウスでは、ヒトセレブロンは、ＺＦＰ９１のような、保存されたネオ基質タンパク質を分解させるが、マウスＳＡＬＬ４タンパク質の配列の違いにより、ＳＡＬＬ４は分解させないことがわかったので（第６．７節を参照されたい）、この実施例では、サリドマイドがヒトトランスジェニックマウス（ｈｕＣＲＢＮ）に及ぼす催奇形性作用が特徴付けられている。管理交配したホモ接合体ｈｕＣＲＢＮマウス（１０／群）にサリドマイドを０ｍｇ／ｋｇ／日（コントロール）、１００ｍｇ／ｋｇ／日、３００ｍｇ／ｋｇ／日及び１０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、主要器官形成期（妊娠６～１５日目）に経口投与しても、胎児には、いずれの発生異常も見られなかった。コントロールでは、生存胎児は、１００ｍｇ／ｋｇ／日群で７匹、３００ｍｇ／ｋｇ／日群で９匹、１０００ｍｇ／ｋｇ／日群で８匹であった。試験中、薬物動態を評価して、サリドマイドへの暴露レベルが充分であったか確認したところ、薬物処置群における対応する平均血漿暴露量（曲線下面積）は、３５，１００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ、７８，６００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬ及び１４３，０００ｎｇ・ｈｒ／ｍＬであった。その後、胎児において、発生異常の発現について調べたところ、発生異常は報告されなかった（サリドマイドで処置したｈｕＣＲＢＮマウスと、未処置のｈｕＣＲＢＮマウスから得た骨格標本の比較が、図１１に示されている）。
【0305】
これらの結果から、ＳＡＬＬ４が、セレブロン－ＣＲＬ４によるユビキチン化の直接的な化合物依存性基質であることが証明されている。発生過程でＳＡＬＬ４が失われることで、オキヒロ症候群、ＩＶＩＣ症候群、ホルト－オーラム症候群及び肢端－腎－眼症候群における四肢奇形が生じることが知られている。したがって、本実施例における結果によって、ＳＡＬＬ４のダウンレギュレーションは、特定の化合物、例えばサリドマイドによる処置の催奇形性作用の大きな動因であることが示されている。すなわち、ＳＡＬＬ４を用いて、セレブロン調節化合物の毒性を判断することによって、生殖毒性のリスクが低減された化合物のスクリーニング及び選択を可能にできる。ＳＡＬＬ４またはその変異体の存在を利用して、セレブロン調節化合物による治療対象の患者を選択することもできる。
【0306】
本明細書では、例示目的で、具体的な実施形態について説明してきたが、本発明で提供するものの趣旨と範囲から逸脱せずに、各種の修正を行ってよいことは上記から明らかであろう。上で言及した参照文献はいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
（ａ）セレブロン改変化合物を試料に投与すること、及び
（ｂ）前記セレブロン改変化合物が、ＳＡＬＬ４タンパク質の分解を誘発するかを判断することを含む方法。
（態様２）
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）試料を得ること、
（ｂ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、
（ｃ）前記セレブロン改変化合物を前記試料に投与すること、
（ｄ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、
（ｅ）ＳＡＬＬ４の前記第１のレベルと前記第２のタンパク質レベルを比較して、前記セレブロン改変化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断すること、及び
（ｆ）ＳＡＬＬ４の分解を誘発しない前記セレブロン改変化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４の分解の低減を誘導する前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含む前記方法。
（態様３）
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）前記試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めること、
（ｃ）ＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発しない前記セレブロン化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルの低下を誘導する前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含む前記方法。
（態様４）
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｄ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断すること、
（ｃ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発しない前記セレブロン改変化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用の低減を誘導する前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含む前記方法。
（態様５）
前記疾患または障害が、がんである、態様２～４のいずれか１項に記載の方法。
（態様６）
前記がんが、血液がんである、態様５に記載の方法。
（態様７）
前記がんが、固形がんである、態様５に記載の方法。
（態様８）
前記がんが、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病からなる群から選択される、態様６に記載の方法。
（態様９）
前記がんが、多発性骨髄腫である、態様８に記載の方法。
（態様１０）
前記がんが、リンパ腫である、態様８に記載の方法。
（態様１１）
前記がんが、白血病である、態様８に記載の方法。
（態様１２）
ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）とセレブロンとの相互作用によって、またはＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１）とセレブロンとの相互作用によって、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断する、態様４に記載の方法。
（態様１３）
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、
（ａ）試料を得ること、
（ｂ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、
（ｃ）前記セレブロン改変化合物を前記試料に投与すること、
（ｄ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、
（ｅ）ＳＡＬＬ４の前記第１のレベルと前記第２のタンパク質レベルを比較して、前記化合物の催奇形性を判断すること、
を含む前記方法。
（態様１４）
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、
（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）前記試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めることによって、前記化合物の催奇形性を判断すること、
を含む前記方法。
（態様１５）
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、
（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断することによって、前記化合物の催奇形性を判断すること、
を含む前記方法。
（態様１６）
ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）とセレブロンとの相互作用によって、またはＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１）とセレブロンとの相互作用によって、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断する、態様１５に記載の方法。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
（ａ）セレブロン改変化合物を試料に投与すること、及び
（ｂ）前記セレブロン改変化合物が、ＳＡＬＬ４タンパク質の分解を誘発するかを判断することを含む方法。
（態様２）
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）試料を得ること、
（ｂ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、
（ｃ）前記セレブロン改変化合物を前記試料に投与すること、
（ｄ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、
（ｅ）ＳＡＬＬ４の前記第１のレベルと前記第２のタンパク質レベルを比較して、前記セレブロン改変化合物が、ＳＡＬＬ４の分解を誘発するかを判断すること、及び
（ｆ）ＳＡＬＬ４の分解を誘発しない前記セレブロン改変化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４の分解の低減を誘導する前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含む前記方法。
（態様３）
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）前記試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めること、
（ｃ）ＳＡＬＬ４のユビキチン化を誘発しない前記セレブロン化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルの低下を誘導する前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含む前記方法。
（態様４）
疾患または障害を治療するためのセレブロン改変化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｄ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断すること、
（ｃ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を誘発しない前記セレブロン改変化合物、または対照化合物と比べて、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用の低減を誘導する前記セレブロン改変化合物を選択すること、
を含む前記方法。
（態様５）
前記疾患または障害が、がんである、態様２～４のいずれか１項に記載の方法。
（態様６）
前記がんが、血液がんである、態様５に記載の方法。
（態様７）
前記がんが、固形がんである、態様５に記載の方法。
（態様８）
前記がんが、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病からなる群から選択される、態様６に記載の方法。
（態様９）
前記がんが、多発性骨髄腫である、態様８に記載の方法。
（態様１０）
前記がんが、リンパ腫である、態様８に記載の方法。
（態様１１）
前記がんが、白血病である、態様８に記載の方法。
（態様１２）
ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）とセレブロンとの相互作用によって、またはＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１）とセレブロンとの相互作用によって、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断する、態様４に記載の方法。
（態様１３）
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、
（ａ）試料を得ること、
（ｂ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第１のタンパク質レベルを求めること、
（ｃ）前記セレブロン改変化合物を前記試料に投与すること、
（ｄ）前記試料中のＳＡＬＬ４の第２のタンパク質レベルを求めること、
（ｅ）ＳＡＬＬ４の前記第１のレベルと前記第２のタンパク質レベルを比較して、前記化合物の催奇形性を判断すること、
を含む前記方法。
（態様１４）
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、
（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）前記試料中のＳＡＬＬ４のユビキチン化レベルを求めることによって、前記化合物の催奇形性を判断すること、
を含む前記方法。
（態様１５）
セレブロン改変化合物が催奇形性作用を誘発するかの判断方法であって、
（ａ）前記セレブロン改変化合物を試料に投与すること、
（ｂ）ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断することによって、前記化合物の催奇形性を判断すること、
を含む前記方法。
（態様１６）
ＳＡＬＬ４タンパク質の４０５～４３２位のアミノ酸残基（配列番号３）とセレブロンとの相互作用によって、またはＳＡＬＬ４タンパク質の４１０～４３２位のアミノ酸残基（配列番号１１）とセレブロンとの相互作用によって、ＳＡＬＬ４とセレブロンとの相互作用を判断する、態様１５に記載の方法。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F-1】
【図1F-2】
【図1G】
【図1H】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】