特許 7267635 Ｃ－Ｍｅｔ調節用の組成物及び肝細胞再生を促進するための用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-24

(45)【発行日】2023-05-02

(54)【発明の名称】Ｃ－Ｍｅｔ調節用の組成物及び肝細胞再生を促進するための用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/36 20060101AFI20230425BHJP

   A61K 31/365 20060101ALI20230425BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230425BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230425BHJP

【ＦＩ】

A61K31/36

A61K31/365

A61P1/16

A61P43/00 111

A61P43/00 121

【請求項の数】 3

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021165585

(22)【出願日】2021-10-07

(65)【公開番号】P2022065631

(43)【公開日】2022-04-27

【審査請求日】2021-10-29

(31)【優先権主張番号】63/092,194

(32)【優先日】2020-10-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520274714

【氏名又は名称】緑茵生技股▲フン▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】Ｇｒｅｅｎｙｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ

【住所又は居所原語表記】５Ｆ．， Ｎｏ．４３， Ｋｅｙａ Ｒｄ．， Ｄａｙａ Ｄｉｓｔ．， Ｔａｉｃｈｕｎｇ Ｃｉｔｙ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】徐榜奎

(72)【発明者】

【氏名】何純誼

(72)【発明者】

【氏名】呉嘉峰

【審査官】福山 則明

(56)【参考文献】

【文献】Journal of Traditional and Complementary Medicine，2019年02月15日，Vo1.2, No.4，p284-294

【文献】Molecules，2017年03月23日，22, 747，p1-12

【文献】PNAS，2004年03月30日，vol.101, no.13，p4477-4482

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／３６

Ａ６１Ｋ ３１／３６５

Ａ６１Ｐ １／１６

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＭＢ化合物（４，７－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ）を有効成分として含む、肝細胞の再生を促進するための組成物であって、
前記ＤＭＢ化合物の濃度が１．２５ｐｐｍ～２０ｐｐｍの範囲である、組成物。

【請求項2】

Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａを有効成分として含む、肝細胞の再生を促進するための組成物であって、
前記Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度が１７．５ｐｐｍ～７０ｐｐｍである、組成物。

【請求項3】

ＤＭＢ化合物（４，７－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ）及びＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａを有効成分として含む、肝細胞の再生を促進するための組成物であって、
前記ＤＭＢ化合物の濃度が１．２５ｐｐｍ～１０ｐｐｍであり、前記Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度が８．７５ｐｐｍ～７０ｐｐｍである、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝疾患の治療に関連する組成物に関し、特に、C-Met調節用の組成物及び肝細胞を促進するために用いられる用途に関する。

【背景技術】

【0002】

肝臓は、人体の代謝反応において中心的役割を果たし、大部分の化学物質が全て肝臓に入り代謝するため、肝臓に有害な物質又はその代謝物の影響を容易に与え、肝機能が損なわれ、有害な物質又はその代謝物以外に、肝臓もウイルスに感染されて肝炎、肝硬変或いは肝癌等を発症していた。

【0003】

肝疾患の初期症状は明らかではなく、かつ肝臓には痛みなどを感じる神経がないため、大部分の患者は、肝機能が異常であるか、又はウイルスに感染されたことに気付かない。したがって、肝疾患を有する大部分の患者は、何らかの症状が現れたときには、かなり病状が進んでいるため臨床上の治療の難易度が増していた。肝炎の治療を例にすると、現在臨床上、病気の原因に応じた薬物療法又は対症療法があり、例えばウイルスによる肝炎の場合、抗ウイルス薬が投与され、脂肪肝による肝炎の場合、体重管理を介して肝炎の悪化を遅らせるが、肝炎が悪化し続けると、肝細胞を壊死させて肝機能に不可逆的な損傷を与え、現在既存の薬物を投与しても回復に難しい。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の主要目的は、肝損傷関連疾患の治療効果を奏するため、肝細胞の修復と再生に関連する複数の遺伝子発現（ｃ－Ｍｅｔ、Ｎｏｔｃｈ等）を調節することによって、損傷した肝細胞を効果的に修復すると共に肝細胞の再生を促進するC-Met調節用の組成物及び肝細胞を促進するための用途を提供することである。

【0005】

本発明の副次的な目的は、肝細胞の成長を促進する効果を奏するため、C-Met調節用の組成物及び肝細胞を促進するための用途を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

これ故に、上記目的を達成するため、本発明は、C-Met調節用の組成物を開示する。その主成分が有効量のＤＭＢ化合物（４，７－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ）及び担体を含有し、前記担体が薬学的に許容される担体又は食品産業上許容される担体であり得る。本発明により開示されるC-Met調節用の組成物を肝疾患に罹った患者に投与することにより、肝臓損傷の状況を効果的に改善できることで、肝疾患の治療効果を奏することができる。

【0007】

本発明の一実施形態において、前記ＤＭＢ化合物の濃度は、１．２５～２０ｐｐｍの範囲である。

【0008】

本発明の別の実施形態において、前記C-Met調節用の組成物は、有効量のＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａをさらに含有し、かつその濃度が８．７５ｐｐｍ以上１４０ｐｐｍ未満である。

【0009】

より良好な肝臓修復効果を奏するため、ＤＭＢとＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度比は、１：２～１：１０であり、ＤＭＢとＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度比が１：５～１：１０であることが好ましい。

【0010】

本発明の別の実施形態は、肝細胞再生を促進する組成物としてＤＭＢ化合物又は／及びＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａを調製しすることであり、肝細胞の修復及び再生に関連する複数の遺伝子発現（ｃ－Ｍｅｔ、Ｎｏｔｃｈ等）を調節し、細胞内のフリーラジカル又は酸化ストレスを低減することから損傷した肝細胞を修復し、正常肝細胞の活性を維持し、再生を促進することで、肝細胞の損傷に関連する疾患の治療効果を奏することができる。

【0011】

前記ＤＭＢの濃度は、１．２５～２０ｐｐｍの範囲であり、前記Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度が８．７５ｐｐｍ以上１４０ｐｐｍ未満であり、前記肝細胞の再生を促進する組成物にＤＭＢ及びＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａを同時に含有する場合、ＤＭＢとＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度比は１：２～１：１０であり、ＤＭＢとＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度比は１：５～１：１０であることが好ましい。

【0012】

本発明の実施形態において、前記肝細胞の再生を促進する組成物は、食品、健康食品又は医薬組成物であり得る。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ベニクスノキタケ菌糸体粉末のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明で開示されるC-Met調節用の組成物の主成分は、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及び／又はＤＭＢ（４，７－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ）を含有し、肝細胞内の細胞再生及び修復に関連する遺伝子発現（ｃ－Ｍｅｔ、Ｎｏｔｃｈ等）を効果的に調節することで、損傷した肝細胞の修復及び肝細胞再生の促進の効果を奏することができる。

【0015】

ここで、ｃ－Ｍｅｔ及びＮｏｔｃｈは、各々肝細胞の修復及び再生の制御経路に関連する遺伝子である。肝細胞が肝毒性薬物によって刺激されるとｃ－Ｍｅｔの発現量が減少し、ｃ－ＭｅｔのダウンレギュレーションによりリガンドＨＧＦとの結合が減少され、肝細胞の修復及び再生のメッセージ伝達を下がる。Ｎｏｔｃｈの発現量は、肝細胞の複製に関連し、肝細胞内のＲＯＳの含有量を低下させて、肝細胞保護効果を奏することができ、すなわち、肝細胞内のＮｏｔｃｈ発現量が増加すると、肝細胞増殖の促進及び肝損傷改善の効果を奏することができる。

【0016】

本発明で開示されるＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及びＤＭＢは、化学合成法で調製することができ、真菌の菌糸体から抽出や精製して得ることもでき、例えばベニクスノキタケ菌糸体粉末をＨＰＬＣ分析したところ、図１に示すように、その中にＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａ（７６～７７分頃の保持時間にピークが出現する）及びＤＭＢ（３２～３３分頃の保持時間にピークが出現する）が含有することが分かる。ここで使用するカラム：Ｃ１８カラム（Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ ＳＴＡＲ，５μｍ，４．５×２５０ｍｍ）、流速：１．０ｍＬ／分、温度：３０℃、注入量：１０μＬ、検出時間：１２０分間、移動相：０．１％ギ酸（Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）、波長：２５４ｎｍである。

【0017】

言及すべき点は、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及びＤＭＢはベニクスノキタケから抽出・精製されることができ、先行技術文献ではベニクスノキタケ抽出物ががん細胞に対して細胞傷害活性を持つが、本発明で開示されるC-Met調節用の組成物の主要効用は、細胞を保護及び修復し、細胞の再生を促進することであり、すなわち本発明で開示されるC-Met調節用の組成物は、細胞に対して毒性が生じず、さらに細胞殺傷能力がないことである。

【0018】

本発明で開示されるｃ－Ｍｅｔ及びＮｏｔｃｈは、各々肝細胞の修復及び再生の制御経路に関連する遺伝子である。具体的には、肝細胞が肝毒性薬物によって刺激されるとｃ－Ｍｅｔの発現量が減少し、ｃ－ＭｅｔのダウンレギュレーションによりリガンドＨＧＦ之との結合を減少させて、肝細胞の修復及び再生のメッセージ伝達を下がる。Ｎｏｔｃｈの発現量は、肝細胞の複製に関連し、肝細胞内のＲＯＳの含有量を低下させて、肝細胞保護効果を奏することができ、すなわち、肝細胞内のＮｏｔｃｈ発現量が増加すると、肝細胞増殖の促進及び肝損傷改善の効果を奏することができる。

【0019】

以下、本発明の技術的特徴及び効果を説明及び検証するため、いくつかの実施例を挙げて図表を参照しつつ、さらに説明する。

【0020】

以下の実施例内で使用される細胞は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に入手できるものであるため、別途特許の寄託は必要とされない。

【0021】

以下の実施例内で使用されるＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及びＤＭＢは、化学合成法で調製して得られたものであり、化学合成法が本発明の属する技術の分野における通常の知識であるため、ここでその説明を省略する。

【0022】

（実施例１：細胞活性の分析（一））
ＦＬ８３Ｂマウスの正常肝細胞を採取していくつかの群（ＦＬ８３Ｂ １×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に分け、各群の細胞量をそれぞれ異なる条件で処理してから２４時間培養した後、市販ＭＴＳ細胞活性分析キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(登録商標) Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）で各群の細胞活性を分析した。各群の細胞の処理条件及び対応する生存率を次の表１～表３に示す。

【0023】

下記表１の結果からも分かる通り、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度が１４０ｐｐｍの時、肝細胞に対して毒性があり、肝細胞の生存率の低下が生じ、また濃度が８．７５～７０ｐｐｍの時、正常肝細胞の活性及び生存率を効果的に維持及び向上できた。表２の結果からも分かる通り、各濃度のＤＭＢを添加すると、正常肝細胞に毒性が生じないだけでなく、肝細胞の成長も助ける。

【0024】

表１と表３の結果を比較すると、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａの添加濃度が同じ条件下で、ＤＭＢを併せて添加した正常肝細胞の生存率は、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａのみが添加された細胞生存率より高いことが分かり、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度が細胞毒性を生じない時、ＤＭＢを添加した場合細胞活性の向上を助け、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度が細胞毒性を生じさせた時、ＤＭＢを添加した場合、肝細胞をＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａで生じた細胞毒性影響から保護し、細胞の活性及び生存率を効果的に向上できることを示している。

【0025】

【0026】

【0027】

【0028】

（実施例２：細胞活性の分析（二））
ＦＬ８３Ｂマウスの正常肝細胞を採取していくつかの群（ＦＬ８３Ｂ １×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に分け、各々先に１０ｍＭアセトアミノフェン（Ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ）で２４時間処理し、肝細胞が損傷したように見えるようにさせ、アセトアミノフェンを除去し、次に異なる濃度のＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及び／又はＤＭＢで２４時間処理した後、市販ＭＴＳ細胞活性分析キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ(登録商標) Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）で各群の細胞活性を分析し、各群の細胞の処理条件及び対応する生存率を下記表４～表６に示す。

【0029】

表４及び表５の結果から分かる通り、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａ或いはＤＭＢの添加は、損傷した肝細胞の修復を助け、かつ肝細胞の活性を増加させることができる。ＤＭＢの濃度がＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａより低い場合、損傷した肝細胞を修復する良い効果を有する。

【0030】

次に、表６の結果から分かる通り、同時にＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及びＤＭＢで損傷した肝細胞を処理すると、肝細胞への修復効果は、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａのみで処理した場合よりも優れ、かつＤＭＢとＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度比が１：２～１：１０の場合において損傷した肝細胞の活性及び生存率の向上を助けることができ、ここで、ＤＭＢとＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａの濃度比が１：５～１：１０の場合、損傷した肝細胞を修復する効果が高くなった。

【0031】

【0032】

【0033】

【0034】

（実施例３：遺伝子発現の分析）
Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑＰＣＲキットで実施例２における異なる濃度のＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及びＤＭＢで処理された細胞内の遺伝子発現を分析し、結果を下記表７～表９に示す。

【0035】

表７～表９の結果から分かる通り、Ａｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及びＤＭＢは、いずれも損傷した肝細胞がｃ－Ｍｅｔ及びＮｏｔｃｈの発現量を増加させるのを助け、損傷した肝細胞の修復及び再生を加速する効果を奏し、かつＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａ及びＤＭＢで細胞を同時に処理すると、損傷した肝細胞内のｃ－Ｍｅｔ及びＮｏｔｃｈの発現量はＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａのみで処理した場合よりも有意に優れ、ＤＭＢがｃ－Ｍｅｔ及びＮｏｔｃｈを調節する能力は高いことを示している。

【0036】

【0037】

【表8】

【0038】

【表9】

【0039】

実施例１～実施例３の結果をまとめると、本発明で開示されるC-Met調節用の組成物は、肝細胞に対して細胞毒性が生じないだけではなく、損傷した肝細胞の修復及び肝細胞再生促進の効果を奏することができるため、有効量のC-Met調節用の組成物を肝疾患の患者に投与した場合、肝臓の損傷を治療し、肝機能向上の効果を奏することができる。

【0040】

（実施例４：安全性試験）
本実施例において慢性Ｂ型肝炎にかかっている計２９名の被験者を２つの群に無作為に分け、ここで、対照群（ｎ＝１４）は、C-Met調節用の組成物を投与したが、抗ウイルス薬ｅｎｔｅｃａｖｉｒを投与せず、治療群（ｎ＝１５）が抗ウイルス薬ｅｎｔｅｃａｖｉｒ及びC-Met調節用の組成物を投与した。

【0041】

本実施例で投与されたC-Met調節用の組成物は、６１４．０１ｐｐｍのＤＭＢ及び３９３７．３９ｐｐｍのＡｎｔｒｏｄｉｎ Ａを含有し、すなわち本実施例で投与されたC-Met調節用の組成物内のＡｎｔｒｏｄｉｎ ＡとＤＭＢの比率が６．５：１程度である。薬投与期間は、４８週間であり、投与治療開始後の１２、２４、３６、４８、６０、７２週目の治療効果及びウイルス学的再発（ｖｉｒｏｌｏｇｏｃａｌ ｒｅｐｌａｐｓｅ）をそれぞれ検出及び記録し、結果を下記表１０及び表１１に示し、表内の空白はデータがないことを意味する。さらに、治療群において、治療中及び治療後のＢ型肝炎ウイルスのｅ抗原の有無の患者の治療効果及び再発状況を分析し、結果を表１２に示し、表内の空白はデータがないことを意味する。表１０～表１２内のウイルス学的再発とは、ヌクレオチド抗Ｂ型肝炎ウイルス薬物の治療終了後少なくとも３ヶ月間隔で２回連続してＢ型肝炎－ＤＮＡが２０００ＩＵ／ｍＬを超えたと定義される。ウイルス学的再発とは、ヌクレオチド抗Ｂ型肝炎ウイルス薬物の治療終了後、ＡＬＴが正常値の２倍以上上昇し、かつＢ型肝炎－ＤＮＡが２０００ＩＵ／ｍＬを超えたと定義された。

【0042】

また、治療群と対照群の血液及び尿を収集し、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＫ－Ｐ）、ｒ－ＧＴ（Ｇａｍｍａ－ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＡＦＴ（Ａｌｐｈａ－Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＴ（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｔｉｍｅ）、ＡＰＴＴ（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐａｒｔｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ Ｔｉｍｅ）、アルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）、グロブリン（Ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、腎臓ＢＵＮ、クレアチニン（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ）、空腹時血糖値（ＧｌｕｃｏｓｅＡＣ）、グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、白血球、赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、血小板、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、平均血小板容積（ＭＰＶ）、尿比重（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒａｖｉｔｙ）、尿ｐＨ、尿路上皮細胞数を検出し、さらに２つの群の各検出指標を分析し、結果を表１３～表４１に示す。

【0043】

上記結果は、本発明で開示されるC-Met調節用の組成物の長期投与が、ウイルス性肝炎患者の健康に悪影響を及ぼさないことを示している。言い換えれば、本発明で開示されるC-Met調節用の組成物は、確実に安全な肝臓保護成分であり、抗ウイルス薬の補助薬として使用できる。

【0044】

【0045】

【0046】

【0047】

【0048】

【0049】

【0050】

【0051】

【0052】

【0053】

【0054】

【0055】

【0056】

【0057】

【0058】

【0059】

【0060】

【0061】

【0062】

【0063】

【0064】

【0065】

【0066】

【0067】

【0068】

【0069】

【0070】

【0071】

【0072】

【0073】

【0074】

【0075】

【図1】