特許 7267914 ＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する二重特異性抗体、及び多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される免疫療法薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-24

(45)【発行日】2023-05-02

(54)【発明の名称】ＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する二重特異性抗体、及び多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される免疫療法薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20230425BHJP

   A61K 31/454 20060101ALI20230425BHJP

   A61K 31/522 20060101ALI20230425BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230425BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230425BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20230425BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20230425BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 T ZNA

A61K31/454

A61K31/522

A61P35/00

A61P43/00 121

C12N15/13

C12N15/62 Z

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2019523769

(86)(22)【出願日】2017-11-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-01-09

(86)【国際出願番号】 EP2017078109

(87)【国際公開番号】W WO2018083204

(87)【国際公開日】2018-05-11

【審査請求日】2020-10-30

(31)【優先権主張番号】16196874.8

(32)【優先日】2016-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】515191372

【氏名又は名称】エンクマフ エスアーエールエル

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ヴー， ミン ディエム

(72)【発明者】

【氏名】シュトライン， クラウス

(72)【発明者】

【氏名】パイヴァ， ブルーノ ダヴィド ロウレンソ

(72)【発明者】

【氏名】サン ミゲル イスキエルド， ヘスス フェルナンド

【審査官】大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０２０３３２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５００８７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５２０２４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／０８７５３１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ、Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多発性骨髄腫を治療するために使用するための、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、二重特異性抗体と、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される、免疫療法薬とを含む組み合わせ物であって、前記第１の結合部分は、
ｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、または
ｉｖ）配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域
を含む、組み合わせ物。

【請求項2】

多発性骨髄腫の治療のための組成物であって、前記組成物は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体を含み、前記第１の結合部分は、
ｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、または
ｉｖ）配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域
を含み、
前記組成物は、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と組み合わせて投与されることを特徴とする、組成物。

【請求項3】

多発性骨髄腫の治療のための組成物であって、前記組成物は、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬を含み、
前記組成物は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体と組み合わせて投与されることを特徴とし、前記第１の結合部分は、
ｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、または
ｉｖ）配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域
を含む、組成物。

【請求項4】

前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはＭＤＸ－１１０５である、請求項１に記載の組み合わせ物あるいは請求項２または３に記載の組成物。

【請求項5】

治療有効量の
ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、前記第１の結合部分は、
ｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、または
ｉｖ）配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域
を含む、二重特異性抗体、及び
ｂ）サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を含む、多発性骨髄腫疾患を罹患している患者における多発性骨髄腫細胞溶解を達成するための治療用の組み合わせ物。

【請求項6】

ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、前記第１の結合部分は、
ｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、または
ｉｖ）配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域
を含む、二重特異性抗体、
ｂ）サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬、及び
ｃ）薬学的に許容可能な担体、及び多発性骨髄腫の治療を必要とする対象に前記二重特異性抗体と前記免疫療法薬を併用して投与するための説明書
を含む、多発性骨髄腫の治療のための製品。

【請求項7】

医薬の製造方法であって、前記方法は、
治療有効量の
ａ））ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、前記第１の結合部分は、
ｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、または
ｉｖ）配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域
を含む、二重特異性抗体、および
ｂ）サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を用いる工程を含み、
前記方法は、薬学的に許容可能な担体において前記二重特異性抗体と前記免疫療法薬を組み合わせる工程を含む、多発性骨髄腫の治療のための医薬の製造方法。

【請求項8】

ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、前記第１の結合部分は、
ｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、
ｉｉｉ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域、または
ｉｖ）配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域
を含む、医薬組成物、及び
ｂ）サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬を含む医薬組成物
を含む、多発性骨髄腫の治療のためのキット。

【請求項9】

前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはＭＤＸ－１１０５である、請求項５に記載の治療用の組み合わせ物、請求項６に記載の製品、あるいは請求項８に記載のキット。

【請求項10】

前記二重特異性抗体の前記第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域を含む、請求項１または４に記載の組み合わせ物、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物、請求項５または９に記載の治療用の組み合わせ物、請求項６または９に記載の製品、あるいは請求項８または９に記載のキット。

【請求項11】

前記二重特異性抗体の前記第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域を含む、請求項１または４に記載の組み合わせ物、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物、請求項５または９に記載の治療用の組み合わせ物、請求項６または９に記載の製品、あるいは請求項８または９に記載のキット。

【請求項12】

前記二重特異性抗体の前記第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域を含む、請求項１または４に記載の組み合わせ物、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物、請求項５または９に記載の治療用の組み合わせ物、請求項６または９に記載の製品、あるいは請求項８または９に記載のキット。

【請求項13】

前記二重特異性抗体の前記第１の結合部分が、配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域を含む、請求項１または４に記載の組み合わせ物、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物、請求項５または９に記載の治療用の組み合わせ物、請求項６または９に記載の製品、あるいは請求項８または９に記載のキット。

【請求項14】

前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、またはＭＤＸ－１１０５である、請求項７に記載の医薬の製造方法。

【請求項15】

前記二重特異性抗体の前記第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域を含む、請求項７または１４に記載の医薬の製造方法。

【請求項16】

前記二重特異性抗体の前記第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域を含む、請求項７または１４に記載の医薬の製造方法。

【請求項17】

前記二重特異性抗体の前記第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域を含む、請求項７または１４に記載の医薬の製造方法。

【請求項18】

前記二重特異性抗体の前記第１の結合部分が、配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域、ならびに配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域を含む、請求項７または１４に記載の医薬の製造方法。

【請求項19】

前記二重特異性抗体及び前記免疫療法薬が、異なる投与経路で投与されるか、または異なる処置スケジュールに従って投与されることを特徴とする、請求項１または４に記載の組み合わせ物あるいは請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

前記二重特異性抗体及び前記免疫療法薬が、一緒に投与されることを特徴とする、請求項１または４に記載の組み合わせ物あるいは請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及びヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する二重特異性抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＴＮＦＲＳＦ７（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０２２２３）としても知られている）は、分化形質細胞で優先的に発現する腫瘍壊死レセプタースーパーファミリーのメンバーである（Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．１９９２、Ｍａｄｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９８）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞の成熟、成長及び生存に関与する非グリコシル化ＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＢＣＭＡは、ＴＮＦスーパーファミリーの２つのリガンド（ＢＣＭＡに対する高親和性リガンドであるＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）と、ＢＣＭＡに対する低親和性リガンドであるＢ細胞活性化因子ＢＡＦＦ（ＴＨＡＮＫ、ＢｌｙＳ、Ｂリンパ球刺激因子、ＴＡＬＬ－１及びｚＴＮＦ４））のレセプターである。ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦは、構造的な類似性と重複性を示すが、別個のレセプター結合特異性を示す。ネガティブレギュレーターＴＡＣＩも、ＢＡＦＦとＡＰＲＩＬの両方に結合する。ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦのＢＣＭＡ及び／またはＴＡＣＩへの配位結合により、転写因子ＮＦ－κＢが活性化し、生存促進性Ｂｃｌ－２ファミリーメンバー（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ｂｃｌ－ｗ、Ｍｃｌ－１、Ａ１）の発現と、アポトーシス促進性因子（例えば、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍなど）のダウンレギュレーションが増大するので、アポトーシスが阻害され、生存が促進される。（Ｒｉｃｋｅｒｔ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２０１１）２４４（１）：１１５－１３３に論評されているように、）この複合作用によって、Ｂ細胞の分化、増殖、生存及び抗体産生が促進される。

【0003】

ＢＣＭＡに対する抗体は、例えば、Ｇｒａｓ Ｍ－Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９５）１０９３－１１０６、ＷＯ２００１２４８１１、ＷＯ２００１２４８１２、ＷＯ２０１０１０４９４９及びＷＯ２０１２１６３８０５に説明されている。ＢＣＭＡに対する抗体と、リンパ腫及び多発性骨髄腫の治療のためにその抗体を使用することについては、例えば、ＷＯ２００２０６６５１６及びＷＯ２０１０１０４９４９で言及されている。ＷＯ２０１３１５４７６０とＷＯ２０１５０５２５３８は、ＢＣＭＡ認識部分とＴ細胞活性化部分とを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関するものである。Ｒｙａｎ，ＭＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．６（２００７）３００９－３０１８は、リガンドブロッキング活性を持つ抗ＢＣＭＡ抗体であって、ネイキッド抗体または抗体－薬物コンジュゲート体として、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株への細胞傷害性を促進し得る抗体に関するものである。Ｒｙａｎによって、阻害ＢＣＭＡ抗体のＳＧ１は、インビトロにおいて、核因子κＢのＡＰＲＩＬ依存的な活性化を用量依存的にブロックすることが示された。Ｒｙａｎは、ＡＰＲＩＬのＢＣＭＡへの結合を有意には阻害しない抗体ＳＧ２についても言及した。

【0004】

過去直近に、例えば、ＩｇＧ抗体形態と一本鎖ドメインを、例えば、融合することによって、広範な組み換え二重特異性抗体形態が開発されてきた（例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ，ｍＡｂｓ ４：２，（２０１２）１－１６を参照されたい）。可変ドメインのＶＬとＶＨまたは定常ドメインのＣＬとＣＨ１が互いに入れ替わっている二重特異性抗体は、ＷＯ２００９０８０２５１及びＷＯ２００９０８０２５２に説明されている。

【0005】

ミスペアリングした副産物の問題を回避するためのアプローチ（「ノブ・イントゥ・ホール」として知られている）は、変異をＣＨ３ドメインに導入して接触界面を改変することによって、２つの異なる抗体重鎖の対合を引き起こすことを目指すものである。一方の鎖上では、嵩高いアミノ酸を、側鎖の短いアミノ酸で置き換えて、「ホール」を作った。逆に、他方のＣＨ３ドメインには、大型の側鎖を持つアミノ酸を導入して、「ノブ」を作った。これらの２つの重鎖（及び２つの同一の軽鎖（両方の重鎖に適するものでなければならない））を共発現させることによって、ホモ二量体の形成（「ホール－ホール」または「ノブ－ノブ」）に対して、高い収量のヘテロ二量体の形成（「ノブ－ホール」）が観察された（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９，６１７－６２１（１９９６）及びＷＯ１９９６０２７０１１）。ヘテロ二量体の割合は、ファージディスプレイのアプローチと、ジスルフィド架橋の導入を用いて、２つのＣＨ３ドメインの相互作用面をリモデリングして、ヘテロ二量体を安定化させることによって、さらに高めることができた（Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６ （１９９８）６７７－６８１；Ａτｗｅｌｌ Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２７０（１９９７）２６－３５）。ノブ・イントゥ・ホール技術の新たなアプローチは、例えば、ＥＰ１８７０４５９Ａ１に説明されている。この形態は、非常に魅力的に思えるが、臨床に向けた進展について説明しているデータは、現時点では見られない。この方策の重大な制約の１つは、ミスペアリングと不活性分子の形成を防ぐために、２つの親抗体の軽鎖が同一である必要がある点である。そのため、この技術は、第１の標的と第２の標的に対する２つの抗体から開始して、２つの標的に対する組み換え二重特異性抗体を容易に開発するのには適さない。これらの抗体の重鎖及び／または同一の軽鎖のいずれかを最適化する必要があるからである。Ｘｉｅ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８６（２００５）９５－１０１は、Ｆｃ部分のノブ・イントゥ・ホール技術と組み合わせて、ｓｃＦｖを用いる二重特異性抗体の形態について言及している。

【0006】

Ｔリンパ球のＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、細胞表面で共発現したＴＣＲアルファ（α）／ベータ（β）ヘテロ二量体またはＴＣＲガンマ（γ）／デルタ（δ）ヘテロ二量体のいずれかとともに、ＣＤ３標識化ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ゼータ（ζ）及びエータ（η）というインバリアントサブユニットからなる。ヒトＣＤ３εは、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）で説明されている。

【0007】

現状の技術で説明されている抗ＣＤ３ε抗体は、ＳＰ３４である（Ｙａｎｇ ＳＪ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）１３７；１０９７－１１００）。ＳＰ３４は、霊長類ＣＤ３とヒトＣＤ３の両方と反応する。ＳＰ３４は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手可能である。現状の技術で説明されているさらなる抗ＣＤ３抗体は、ＵＣＨＴ－１である（ＷＯ２００００４１４７４を参照されたい）。現状の技術で説明されているさらなる抗ＣＤ３抗体は、ＢＣ－３である（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＧｖＨＤの第Ｉ相／ＩＩ相試験で使用されたもの、Ａｎａｓｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５４：８４４（１９９２））。ＳＰ３４は、ＣＤ３のε鎖のみに存在するエピトープを認識する（Ｓａｌｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３０４７を参照されたい）が、ＵＣＨＴ－１とＢＣ－３は、ε鎖とγ鎖の両方によって構成されるエピトープを認識するという点で、ＳＰ３４は、ＵＣＨＴ－１及びＢＣ－３とは異なる。さらなる抗ＣＤ３抗体は、ＷＯ２００８１１９５６５、ＷＯ２００８１１９５６６、ＷＯ２００８１１９５６７、ＷＯ２０１００３７８３６、ＷＯ２０１００３７８３７、ＷＯ２０１００３７８３８及びＵＳ８２３６３０８（ＷＯ２００７０４２２６１）で説明されている。さらなる抗ＣＤ３抗体のＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬの配列は、配列番号７及び８に示されている。

【0008】

ＣＤ３とＢＣＭＡに対する二重特異性抗体は、ＷＯ２００７１１７６００、ＷＯ２００９１３２０５８、ＷＯ２０１２０６６０５８及びＷＯ２０１２１４３４９８で言及されている。ＢＣＭＡに対する抗体のＣＡＲ化合物は、ＷＯ２０１３１５４７６０、ＷＯ２０１３１５４７６０及びＷＯ２０１４１４０２４８で言及されている。

【0009】

モノクローナル抗体の細胞媒介エフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のような機能）は、Ｕｍａｎａ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）１７６－１８０及びＵＳ６６０２６８４に記載されているように、Ａｓｎ２９７においてオリゴ糖組成を操作することによって、高めることができる。ＷＯ１９９９０５４３４２、ＷＯ２００４０６５５４０、ＷＯ２００７０３１８７５、ＷＯ２００７０３９８１８、Ｈｒｉｓｔｏｄｏｒｏｖ Ｄ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｒ，Ｌｉｎｄｅｎ Ｌ．，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｏｃｔ ２５．（Ｅｐｕｂ）も、抗体のグリコシル化による操作を行って、Ｆｃ媒介細胞傷害性を高めることに関するものである。

【0010】

ヒンジ領域とＣＨ２ドメインのいくつかのアミノ酸残基も、モノクローナル抗体の細胞媒介エフェクター機能に影響を及ぼす（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１０９８（１９９３）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６，３１９（１９９５），Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）］Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）］。したがって、このようなアミノ酸の改変により、細胞媒介エフェクター機能を高めることができる。このような抗体の改変を行って、細胞媒介エフェクター機能を向上させることは、ＥＰ１９３１７０９、ＷＯ２０００４２０７２で言及されており、この改変は、Ｆｃ部分において、２３４位、２３５位、２３６位、２３９位、２６７位、２６８位、２９３位、２９５位、３２４位、３２７位、３２８位、３３０位及び３３２位のアミノ酸（複数可）を置換することを含む。さらなる抗体の改変を行って、細胞媒介エフェクター機能を向上させることは、ＥＰ１６９７４１５で言及されており、この改変は、ＥＵ番号付けによる２７７位、２８９位、３０６位、３４４位または３７８位のアミノ酸を荷電アミノ酸、極性アミノ酸または非極性アミノ酸で置換することを含む。

【0011】

抗体の形態と、二重特異性及び多重特異性抗体の形態は、ペプボディ（ＷＯ２００２４４２１５）、新規抗原レセプター（「ＮＡＲ」）（ＷＯ２００３０１４１６１）、ダイアボディ－ダイアボディ二量体「ＴａｎｄＡｂ」（ＷＯ２００３０４８２０９）、ポリアルキレンオキサイド改変ｓｃＦｖ（ＵＳ７１５０８７２）、ヒト化ウサギ抗体（ＷＯ２００５０１６９５０）、合成免疫グロブリンドメイン（ＷＯ２００６０７２６２０）、共有結合型ダイアボディ（ＷＯ２００６１１３６６５）、フレキシボディ（ＷＯ２００３０２５０１８）、ドメイン抗体ｄＡｂ（ＷＯ２００４０５８８２２）、ワクチボディ（ＷＯ２００４０７６４８９）、新世界霊長類フレームワークを有する抗体（ＷＯ２００７０１９６２０）、切断リンカーを有する抗体－薬物コンジュゲート体（ＷＯ２００９１１７５３１）、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体（ＷＯ２０１００６３７８５）、ＩｇＧ４様ＣＨ３ドメインを有する二重特異性抗体（ＷＯ２００８１１９３５３）、ラクダ抗体（ＵＳ６８３８２５４）、ナノボディ（ＵＳ７６５５７５９）、ＣＡＴダイアボディ（ＵＳ５８３７２４２）、標的抗原及びＣＤ３に対する二重特異性（ｓｃＦｖ）_２（ＵＳ７２３５６４１）、）、ｓＩｇＡ ｐｌ抗体（ＵＳ６３０３３４１）、ミニボディ（ＵＳ５８３７８２１）、ＩｇＮＡＲ（ＵＳ２００９１４８４３８）、改変ヒンジ領域及びＦｃ領域を有する抗体（ＵＳ２００８２２７９５８、ＵＳ２００８０１８１８９０）、三機能性抗体（ＵＳ５２７３７４３）、トリオマブ（ＵＳ６５５１５９２）、トロイボディ（ＵＳ６２９４６５４）でもある。

【0012】

ＷＯ２０１４１２２１４３には、抗ヒトＢＣＭＡ抗体であって、ＥＬＩＳＡアッセイで４０５ｎｍにおけるＯＤとして測定した場合に、前記抗体の結合が、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって、ＡＰＲＩＬの非存在下における前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合と比べて２０％超低下しないことと、前記抗体が、ＡＰＲＩＬ単独の場合と比べて、ＡＰＲＩＬ依存的なＮＦ－κＢの活性化を２０％超変化させないこと、ＡＰＲＩＬの非存在下において、前記抗体が、前記抗体の非存在下と比べて、ＮＦ－κＢの活性化を２０％超変化させないことを特徴とする抗体が開示されている。ＷＯ２０１４１２２１４４には、ヒトＣＤ３εとヒトＢＣＭＡという２つの標的に特異的に結合する二重特異性抗体であって、ＷＯ２０１４１２２１４３の抗ヒトＢＣＭＡ抗体を含む抗体が開示されている。特に、二重特異性Ｔ細胞結合剤としての治療上の用途に関して、独自の特性を持つ抗ヒトＢＣＭＡ抗体は、ＣＤＲ領域として、配列番号１５のＣＤＲ１Ｈ、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ、配列番号１８のＣＤＲ１Ｌ、配列番号１９のＣＤＲ３Ｌ及び配列番号２０のＣＤＲ３Ｌを含むことによって特徴付けられる抗体８３Ａ１０であり、ＷＯ２０１４１２２１４３及びＷＯ２０１４１２２１４４にも開示されている。

【0013】

サリドマイド化合物は、２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオン及びその誘導体、例えば、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ１２２（ＣＡＳ登録番号１３９８０５３－４５－６）またはＣＣ－２２０（ＣＡＳ登録番号１３２３４０３－３３－３）である。多発性骨髄腫の治療のためのサリドマイドの使用は、Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９６（２０００），２９４３－２９５０で説明されている。

【0014】

抗ＣＤ３８抗体は、例えば、ダラツムマブ（ＵＳ２０１５０２４６１２３）、イサツキシマブ（ＵＳ８８７７８９９）、ＭＯＲ２０２（ＷＯ２０１２０４１８００）、及びＡＢ１９及びＡＢ７９（ＵＳ８３６２２１１）。抗ＣＤ３８抗体は、ＷＯ２００６０９９８７５、ＷＯ２０１１１５４４５３、ＷＯ２０１４０６８１１４、及びＷＯ２００７０４２３０９にも言及されている。多発性骨髄腫の治療における抗ＣＤ３８モノクローナル抗体の使用は、例えば、Ｌｏｋｈｏｒｓｔ ＨＭ；Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ（２０１５）３７３ １２０７－１９によって議論されている。

【0015】

抗ＰＤ－１抗体は、例えば、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標）、ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ、ピディリズマブ、ラムブロリズマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、及びＲＥＧＮ２８１０である。抗ＰＤ－１抗体は、例えば、ＷＯ２００８１５６７１、ＷＯ２０１３１７３２２３、ＷＯ２０１５０２６６３４、ＵＳ７５２１０５１、ＵＳ８００８４４９、ＵＳ８３５４５０９、ＷＯ２００９１１４３３５、ＷＯ２０１５０２６６３４、ＷＯ２００８１５６７１２、ＷＯ２０１５０２６６３４、ＷＯ２００３０９９１９６、ＷＯ２００９１０１６１１、ＷＯ２０１０／０２７４２３、ＷＯ２０１０／０２７８２７、ＷＯ２０１０／０２７８２８、ＷＯ２００８／１５６７１２、及びＷＯ２００８／１５６７１２で説明されている。

【0016】

抗ＰＤ－Ｌｌ抗体は、例えば、アテゾリズマブ、ＭＤＸ－１１０５、デュルバルマブ及びアベルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば、ＷＯ２０１５０２６６３４、ＷＯ２０１３／０１９９０６、ＷＯ２０１００７７６３４、ＵＳ８３８３７９６、ＷＯ２０１００７７６３４、ＷＯ２００７００５８７４、及びＷＯ２０１６００７２３５で説明されている。

【0017】

ＷＯ２０１２０６６０５８は、総括的に言えば、１つ以上のさらなる治療剤とも組み合わせた、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する二重特異性剤を言及している。多くのそのような薬剤が記載され、中でも、レナリドマイドのようなサリドマイド誘導体も言及されている。ＷＯ２０１２１４３４９８は、総括的に言えば、多発性骨髄腫の治療または改善において使用される抗ＢＣＭＡ抗体療法、及び抗ＣＤ２０抗体及び／または抗ＣＤ３８抗体及び／または抗ＣＳｌ抗体療法も言及している。ＷＯ２０１６０８７５３１は、Ｔ細胞増殖治療と一緒に、ＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する二重特異性抗体の使用を開示しており、「Ｔ細胞増殖治療」とは、例えば、チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１）などの、Ｔ細胞の増殖または拡張を誘導する治療処置または生物処置を指す。ＷＯ２０１６０１４５６５は、ＢＣＭＡに特異的なキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、及び、総括的に言えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体断片に関するものである。
本発明の二重特異性抗体及びそれぞれの抗ＢＣＭＡ抗体は、それら全体が参照により本明細書に援用される現在保留中のＥＰ１５１７９５４９．９及びＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６８５４９に開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0018】

【文献】国際公開第２００１／０２４８１１号

【文献】国際公開第２００１／０２４８１２号

【文献】国際公開第２０１／０１０４９４９号

【文献】国際公開第２０１２／１６３８０５号

【文献】国際公開第２００２／０６６５１６号

【非特許文献】

【0019】

【文献】Ｒｉｃｋｅｒｔ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２０１１）２４４（１）：１１５－１３３

【文献】Ｇｒａｓ Ｍ－Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９５）１０９３－１１０６

【文献】Ｒｙａｎ，ＭＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．６（２００７）３００９－３０１８

【文献】Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ，ｍＡｂｓ ４：２，（２０１２）１－１６

【文献】Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９，６１７－６２１（１９９６）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0020】

本発明は、多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及びヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する二重特異性抗体を含む。
本発明は、一実施形態では、
ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、二重特異性抗体と
ｂ）多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される、免疫療法薬とを含み、
前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする。

【0021】

本発明は、一実施形態では、
ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、及び
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を、そのような治療を必要とする患者に投与することを特徴とする、多発性骨髄腫の治療方法であって、
前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、方法を含む。

【0022】

二重特異性抗体と免疫療法薬は、治療有効量で使用される。

【0023】

本発明は、一実施形態では、
ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、及び
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を含むことを特徴とする、多発性骨髄腫疾患を罹患している患者における多発性骨髄腫細胞溶解を達成するための治療用の組み合わせであって、
前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、治療用の組み合わせを含む。

【0024】

二重特異性抗体と免疫療法薬は、治療有効量で使用される。

【0025】

本発明は、一実施形態では、
ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、
前記第１の結合部分は、薬学的に許容可能な担体において、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とし、
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬、
ｃ）薬学的に許容可能な担体、及び多発性骨髄腫の治療を必要とする対象に前記二重特異性抗体と前記免疫療法薬を併用して投与するための説明書
を含むことを特徴とする、製品を含む。

【0026】

二重特異性抗体と免疫療法薬は、治療有効量で使用される。

【0027】

本発明は、一実施形態では、
ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、
前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とし、
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を用いて、
ｃ）薬学的に許容可能な担体において前記二重特異性抗体と前記免疫療法薬を組み合わせることを特徴とする、医薬の製造方法を含む。

【0028】

二重特異性抗体と免疫療法薬は、治療有効量で使用される。

【0029】

本明細書に記載されている二重特異性抗体及び免疫療法薬は、
ａ）本発明による多発性骨髄腫の治療における併用、
ｂ）本発明による多発性骨髄腫の治療方法、
ｃ）本発明による多発性骨髄腫疾患を罹患している患者における多発性骨髄腫細胞溶解を達成するための治療用の組み合わせ
ｄ）本発明による製品、及び
ｅ）本発明による医薬の製造方法
において使用するためのものである。

【0030】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９（Ｔａｋｅｄａ）及びＡｂ１９（Ｔａｋｅｄａ）からなる群から選択される抗ＣＤ３８抗体であることを含む。

【0031】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、サリドマイド、レナリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、及びポマリドマイドからなる群から選択されるサリドマイド化合物であることを含む。

【0032】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６及びｈ４０９Ａ１７からなる群から選択される抗ＰＤ１抗体であることを含む。

【0033】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、アベルマブ、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、及びＭＤＸ－１１０５からなる群から選択される抗ＰＤ－Ｌｌ抗体であることを含む。

【0034】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、レナリドマイドであり、第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ａ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｂ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とすることを含む。

【0035】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、ＣＣ－１２２またはＣＣ－２２０であり、第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ａ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｂ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とすることを含む。

【0036】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、ダラツムマブであり、第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ａ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｂ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とすることを含む。

【0037】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、ペムブロリズマブであり、第１の結合部分が、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ａ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｂ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とすることを含む。

【0038】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、レナリドマイドであり、第１の結合部分が、配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１３のＶＬ領域、または配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を含むことを特徴とすることを含む。

【0039】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、ＣＣ－１２２またはＣＣ－２２０であり、第１の結合部分が、配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１３のＶＬ領域、または配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を含むことを特徴とすることを含む。

【0040】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、ダラツムマブであり、第１の結合部分が、配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１３のＶＬ領域、または配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を含むことを特徴とすることを含む。

【0041】

本発明は、一実施形態では、前記免疫療法薬が、ペムブロリズマブであり、第１の結合部分が、配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１３のＶＬ領域、または配列番号１０のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を含むことを特徴とすることを含む。

【0042】

本発明による第１の結合部分は、ＣＤＲ３Ｈ領域及びＣＤＲ３Ｌ領域として、抗体８３Ａ１０と同じＣＤＲ領域を含む（抗体８３Ａ１０については、本文中で後述の表１Ａ及び１Ｂを参照されたい）。

【0043】

本発明による第１の結合部分は、一実施形態では、ＣＤＲ３Ｈ領域及びＣＤＲ３Ｌ領域として、抗体８３Ａ１０と同じＣＤＲ領域を含むが、抗体８３Ａ１０と比べて、患者の骨髄穿刺液中のＭＭ細胞を殺傷させるのに特に強力かつ効率的な利点を示す。

【0044】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域と、
ａ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｂ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｃ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｄ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｅ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、ならびに
ｆ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域の群から選択した、
ＣＤＲ１Ｈ領域、ＣＤＲ２Ｈ領域、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むことを特徴とする。

【0045】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ａ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｂ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｃ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする。

【0046】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号１２、１３及び１４のＶＬ領域からなる群から選択したＶＬ領域を含むことを特徴とし、４９位のアミノ酸が、アミノ酸のチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びヒスチジン（Ｈ）の群から選択されている。一実施形態では、４９位のアミノ酸は、配列番号１２においてＥであるか、配列番号１３においてＳであるか、または配列番号１４においてＨである。

【0047】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号１２、１３及び１４のＶＬ領域からなる群から選択したＶＬ領域を含むことを特徴とし、７４位のアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）である。一実施形態では、７４位のアミノ酸は、配列番号１４においてＡである。

【0048】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＣＤＲ３Ｈ領域、ＣＤＲ１Ｌ領域、ＣＤＲ２Ｌ領域及びＣＤＲ３Ｌ領域として、抗体８３Ａ１０と同じＣＤＲ領域を含む。
本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＶＬ領域と、
ａ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域、
ｂ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域、または
ｃ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むことを特徴とする抗体を含む。

【0049】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号１２のＶＬ領域と、配列番号３８、３９及び４０のＶＨ領域を含む群から選択したＶＨ領域とを含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号１２のＶＬ領域を含むことを特徴とし、４９位のアミノ酸が、アミノ酸のチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びヒスチジン（Ｈ）の群から選択されている。一実施形態では、４９位のアミノ酸は、Ｅである。

【0050】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＬ領域として、配列番号１２、１３及び１４のＶＬ領域からなる群から選択したＶＬ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１２のＶＬ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１３のＶＬ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１４のＶＬ領域を含むことを特徴とする。

【0051】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨ領域として、配列番号３８、３９及び４０からなる群から選択したＶＨ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨ領域として、配列番号３８のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１２のＶＬ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨ領域として、配列番号３９のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１２のＶＬ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＶＨ領域として、配列番号４０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１２のＶＬ領域を含むことを特徴とする。

【0052】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分はさらに、カニクイザルＢＣＭＡにも特異的に結合することを特徴とする。一実施形態では、本発明の抗体は、ＢＣＭＡへの結合に関しては、ｃｙｎｏ／ヒト親和性ギャップが１．５～５、１．５～１０または１．５～１６である（表５）。

【0053】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、カニクイザルＣＤ３にも特異的に結合することを特徴とする。一実施形態では、二重特異性抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体は、Ｍａｂ ＣＤ３のｃｙｎｏ／ヒトギャップが１．２５～５または０．８～１．０である。

【0054】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、Ｆｃ部分を有するかまたはＦｃ部分を有さない抗体であり、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディまたはタンデムｓｃＦｖなど）、抗体模倣物（ＤＡＲＰｉｎなど）、ネイキッド単特異性抗体または抗体薬物コンジュゲート体が含まれる。一実施形態では、多重特異性抗体、二重特異性抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディまたはタンデムｓｃＦｖが、ＢＣＭＡとＣＤ３に特異的に結合する。

【0055】

第１の結合部分に基づいて、Ｆｃ部分を有するかまたは有さない様々な形態であって、現状の技術で知られている形態（例えば、上記の「背景技術」を参照されたい）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖなど）、及び抗体模倣物（ＤＡＲＰｉｎなど）で、ＢＣＭＡに対する抗体－薬物コンジュゲート体、及びＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する多重特異性または二重特異性抗体を生成でき、これらのいずれも、本発明の実施形態である。二重特異性抗体の形態は、現状の技術において周知であり、例えば、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ＲＥ，ｍＡｂｓ ４：２ １－１６（２０１２）；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．，Ｈｕｄｓｏｎ ＰＪ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（２００５）１１２６－１１３６、Ｃｈａｎ ＡＣ，Ｃａｒｔｅｒ ＰＪ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０，３０１－３１６（２０１０）及びＣｕｅｓｔａ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２８（２０１１）３５５－３６２にも説明されている。

【0056】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＢＣＭＡ ＶＨとして、配列番号１０のＶＨ領域を含むことを特徴とする。

【0057】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＢＣＭＡ ＶＬが、配列番号１２、１３及び１４のＶＬ領域からなる群から選択されていることを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＢＣＭＡ ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１２のＶＬ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＢＣＭＡ ＶＨとして、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１３のＶＬ領域を含むことを特徴とする。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、ＢＣＭＡ ＶＨとして、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１４のＶＬ領域を含むことを特徴とする。

【0058】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号１２、１３及び１４のＶＬ領域からなる群から選択したＶＬ領域を含むことを特徴とし、４９位のアミノ酸が、アミノ酸のチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びヒスチジン（Ｈ）の群から選択されている。一実施形態では、４９位のアミノ酸は、Ｅ（配列番号１２）、Ｓ（配列番号１３）またはＨ（配列番号１４）である。本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号１２、１３及び１４のＶＬ領域からなる群から選択したＶＬ領域を含むことを特徴とし、７４位のアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）である。一実施形態では、７４位のアミノ酸は、配列番号１４においてＡである。

【0059】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＢＣＭＡ ＶＨと、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域、配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域を含むＢＣＭＡ ＶＬ、ならびに
ａ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域、
ｂ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域、または
ｃ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むことを特徴とする。

【0060】

ＢＣＭＡとＣＤ３に対する二重特異性抗体は、一実施形態では、
ａ）前記標的のＣＤ３及びＢＣＭＡの１つに特異的に結合する抗体の軽鎖と重鎖、
ｂ）前記標的のもう一方に特異的に結合する抗体の軽鎖と重鎖、可変ドメインのＶＬとＶＨまたは定常ドメインのＣＬとＣＨ１が互いに入れ替わっている
を含むことを特徴とする。

【0061】

一実施形態では、前記抗ＣＤ３抗体部分のＶＨドメインは、前記抗ＢＣＭＡ抗体部分のＣＨ１またはＣＬドメインに連結されている。一実施形態では、前記抗ＣＤ３抗体部分のＶＬドメインは、前記抗ＢＣＭＡ抗体部分のＣＨ１またはＣＬドメインに連結されている。

【0062】

一実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体部分のＦａｂ断片を１個以下と、抗ＢＣＭＡ抗体部分のＦａｂ断片を２個以下と、Ｆｃ部分、一実施形態では、ヒトＦｃ部分を１個以下含む。一実施形態では、抗ＣＤ３抗体部分の１個以下のＦａｂ断片と、抗ＢＣＭＡ抗体部分の１個以下のＦａｂ断片は、Ｆｃ部分に連結されており、連結は、Ｆａｂ断片（複数可）のヒンジ領域へのＣ末端結合を介して行われている。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体部分の第２のＦａｂ断片は、そのＣ末端を介して、抗ＣＤ３抗体部分のＦａｂ断片のＮ末端またはＦｃ部分のヒンジ領域（したがって、Ｆｃ部分と抗ＣＤ３抗体部分との間）のいずれかに連結されている。好ましい二重特異性抗体は、図１～３に示されている。

【0063】

特に好ましいのは、示されているようなＦａｂ断片とＦｃ部分のみを含むとともに、「ａａ置換」を含むかまたは含まない下記の二重特異性抗体である。
Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３（二重特異性形態、図１Ａまたは１Ｂ）、
Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３－Ｆａｂ ＢＣＭＡ（二重特異性形態、図２Ａまたは２Ｂ）、
Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆａｂ ＣＤ３（二重特異性形態、図２Ｃまたは２Ｄ）、
Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３－Ｆａｂ ＢＣＭＡ（二重特異性形態、図３Ａまたは３Ｂ）、
Ｆｃ－Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆａｂ ＣＤ３（二重特異性形態、図３Ｃまたは３Ｄ）。

【0064】

図１～３に示されているように、「Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ、「Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３」及び「Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３」とは、Ｆａｂ断片（複数可）が、そのＣ末端を介して、Ｆｃ断片のＮ末端に結合していることを意味する。「Ｆａｂ ＣＤ３－Ｆａｂ ＢＣＭＡ」とは、Ｆａｂ ＣＤ３断片が、そのＮ末端によって、Ｆａｂ ＢＣＭＡ断片のＣ末端に結合していることを意味する。「Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆａｂ ＣＤ３」とは、Ｆａｂ ＢＣＭＡ断片が、そのＮ末端によって、Ｆａｂ ＣＤ３断片のＣ末端に結合していることを意味する。

【0065】

一実施形態では、二重特異性抗体は、前記抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂ断片であって、そのＣ末端によって、前記二重特異性抗体のＣＤ３抗体部分のＮ末端に連結されている第２のＦａｂ断片を含む。一実施形態では、前記第１の抗ＣＤ３抗体部分のＶＬドメインは、前記第２の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＨ１またはＣＬドメインに連結されている。

【0066】

一実施形態では、二重特異性抗体は、前記抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂ断片であって、そのＣ末端によって、（前記抗ＢＣＭＡ抗体の第１のＦａｂ断片のように）Ｆｃ部分に連結されているとともに、そのＮ末端によって、ＣＤ３抗体部分のＣ末端に連結されている第２のＦａｂ断片を含む。一実施形態では、前記抗ＣＤ３抗体部分のＣＨ１ドメインは、前記第２の抗ＢＣＭＡ抗体部分のＶＨドメインに連結されている。

【0067】

一実施形態では、二重特異性抗体は、前記ＣＤ３抗体Ｆａｂ断片のＣ末端にＮ末端が連結しているＦｃ部分を含む。一実施形態では、二重特異性抗体は、その第１のＮ末端によって、前記ＣＤ３抗体Ｆａｂ断片のＣ末端に連結されているＦｃ部分と、そのＣ末端によって、Ｆｃ部分の第２のＮ末端に連結されている前記抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂ断片とを含む。一実施形態では、ＣＤ３抗体Ｆａｂ断片のＣＬドメインは、Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されている。一実施形態では、ＢＣＭＡ抗体Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインは、Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されている。

【0068】

Ｆａｂ断片は、現状の技術に従って、適切なリンカーを用いて、連結し合っている。一実施形態では、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ１）３リンカーを使用する（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ ＤＫ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９４ Ａｕｇ；７（８）：１０２７－３３及びＭａｃｋ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｊｕｌｙ １８，１９９５ ｖｏｌ．９２ ｎｏ．１５ ７０２１－７０２５）。リンカーがペプチドリンカーである場合には、このような共有結合は通常、それぞれのＦａｂ断片のＶＬドメイン及び／またはＶＨドメイン、リンカー、ならびに適切な場合には、Ｆｃ部分鎖をコードする核酸を用いて、生化学的な組み換え手段によって行う。

【0069】

本発明の一実施形態では、ＢＣＭＡとＣＤ３に対する二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体部分の可変ドメインＶＨ（さらには「ＣＤ３ ＶＨ」ともいう）が、重鎖ＣＤＲ１Ｈとして、配列番号１の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ２Ｈとして、配列番号２の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ３Ｈとして、配列番号３の重鎖ＣＤＲを含み、抗ＣＤ３抗体部分の可変ドメインＶＬ（さらには「ＣＤ３ ＶＬ」ともいう）が、軽鎖ＣＤＲ１Ｌとして、配列番号４の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ２Ｌとして、配列番号５の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ３Ｌとして、配列番号６の軽鎖ＣＤＲを含むことを特徴とする。

【0070】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３ε抗体部分の可変ドメインが、配列番号７及び８のものであることを特徴とする。

【0071】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体部分（二重特異性抗体の第２の結合部分）が、そのＮ末端で、抗ＢＣＭＡ抗体部分（二重特異性抗体の第１の結合部分）のＣ末端に連結されており、抗ＣＤ３抗体部分の可変ドメインのＶＬとＶＨ、または定常ドメインのＣＬとＣＨ１が、互いに入れ替わっていることを特徴とするものである。

【0072】

一実施形態では、前記抗ＣＤ３抗体部分のＶＨドメインは、前記抗ＢＣＭＡ抗体部分のＣＨ１またはＣＬドメインに連結されている。一実施形態では、前記抗ＣＤ３抗体部分のＶＬドメインは、前記抗ＢＣＭＡ抗体部分のＣＨ１またはＣＬドメインに連結されている。

【0073】

このような抗体部分は、一実施形態では、それぞれの抗体のＦａｂ断片である。

【0074】

本発明のさらなる実施形態では、軽鎖の可変ドメインのＶＬと、抗ＣＤ３抗体部分または抗ＢＣＭＡ抗体部分のそれぞれの重鎖の可変ドメインＶＨが、互いに入れ替わっている二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体部分または抗ＢＣＭＡ抗体部分の定常ドメインＣＬを含むことを特徴とし、その１２４位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、それぞれの定常ドメインＣＨ１では、１４７位のアミノ酸と２１３位のアミノ酸が独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。一実施形態では、抗体は、ＣＤ３の結合に関して一価である。一実施形態では、定常ドメインＣＬの１２４位でのアミノ酸置換に加えて、１２３位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されている（さらには「電荷バリアント交換」ともいう）。一実施形態では、抗体は、ＣＤ３の結合に関して一価であり、１２４位のアミノ酸はＫであり、１４７位のアミノ酸はＥであり、２１３位のアミノ酸はＥであり、１２３位のアミノ酸はＲである。一実施形態では、二重特異性抗体は、加えて、同じ抗ＢＣＭＡ結合部分（一実施形態では、Ｆａｂ断片）をもう１つ含む。これは、第１の抗ＢＣＭＡ結合部分が、電荷バリアント交換を含む場合には、第２の抗ＢＣＭＡ結合部分は、同じ電荷バリアント交換を含むことも意味する。（全てのアミノ酸の番号付けは、Ｋａｂａｔによるものである。）

【0075】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖の可変ドメインＶＬと第２の重鎖の可変ドメインＶＨが、互いに入れ替わっている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含むことを特徴とし、
ｃ）ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインのＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインのＣＨ１において、１４７位のアミノ酸と、２１３位のアミノ酸が独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている（Ｋａｂａｔによる番号付け）抗体に関するものである（例えば、図１Ａ、２Ａ、２Ｃ、３Ａ、３Ｃを参照されたい）。
一実施形態では、１つ前の段落で説明した前記二重特異性抗体はさらに、前記二重特異性抗体が、加えて、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらには「ＢＣＭＡ－Ｆａｂ」ともいう）を含み、前記ＢＣＭＡ－Ｆａｂの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されている（Ｋａｂａｔによる番号付け）ことを特徴とし、前記ＢＣＭＡ－Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸と２１３位のアミノ酸が独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている（Ｋａｂａｔによる番号付け）（例えば、図２Ａ、２Ｃを参照されたい）。

【0076】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、
ａ）ＢＣＭＡに特異的に結合する第１の抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の抗体の第２の軽鎖の可変ドメインＶＬと第２の重鎖の可変ドメインＶＨが、互いに入れ替わっている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含むことを特徴とし、
ｃ）ｂ）の前記第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の前記第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸と、２１３位のアミノ酸が独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている（Ｋａｂａｔによる番号付け）前記抗体に関する。

【0077】

一実施形態では、第１または第２の軽鎖の定常ドメインＣＬの１２４位でのアミノ酸置換に加えて、１２３位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されている。

【0078】

一実施形態では、定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、リシン（Ｋ）で置換されており、定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸と２１３位のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）で置換されている。一実施形態では、加えて、定常ドメインＣＬにおいて、１２３位のアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）で置換されている。

【0079】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片（さらには「ＣＤ３－Ｆａｂ」ともいう）１つと、抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂ断片（さらには「ＢＣＭＡ－Ｆａｂ（複数可）」ともいう）１つと、Ｆｃ部分とからなり、そのＣＤ３－ＦａｂとＢＣＭＡ－Ｆａｂは、そのＣ末端を介して、前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されている。ＣＤ３－ＦａｂまたはＢＣＭＡ－Ｆａｂのいずれかは、ａａ置換を含み、ＣＤ３－Ｆａｂは、交叉を含む（図１Ａ及び１Ｂ）。

【0080】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、１つのＣＤ３－Ｆａｂと、１つのＢＣＭＡ－Ｆａｂと、Ｆｃ部分（前記Ｆｃ部分のヒンジ領域には、ＣＤ３－ＦａｂとＢＣＭＡ－Ｆａｂが、そのＣ末端を介して連結されている）と、第２のＢＣＭＡ－Ｆａｂ（そのＣ末端によって、ＣＤ３－ＦａｂのＮ末端に連結されている）とからなる。このＣＤ３－Ｆａｂは、交叉を含み、ＣＤ３－Ｆａｂまたは両方のＢＣＭＡ－Ｆａｂのいずれかは、ａａ置換を含む（図２Ａ及び２Ｂ）。特に好ましいのは、ＢＣＭＡ－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＣＤ３－Ｆａｂ－ＢＣＭＡ－Ｆａｂを含む二重特異性抗体であって、そのＢＣＭＡ－Ｆａｂが両方ともａａ置換を含み、ＣＤ３－Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨの交叉を含む抗体である（図２Ａ）。特に好ましいのは、ＢＣＭＡ－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＣＤ３－Ｆａｂ－ＢＣＭＡ－Ｆａｂからなる二重特異性抗体であって、そのＢＣＭＡ－Ｆａｂが両方とも、Ｑ１２４Ｋ、Ｅ１２３Ｒ、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅというａａ置換を含み、ＣＤ３－Ｆａｂが、ＶＬ／ＶＨの交叉を含む抗体である。特に好ましいのは、ＢＣＭＡ－Ｆａｂが両方とも、ＣＤＲとして、抗体２１、２２または４２のＣＤＲを含むか、ＶＨ／ＶＬとして、抗体２１、２２または４２のＶＨ／ＶＬを含むことである（抗体２１、２２及び４２については、本文中で後述の表１Ａ及び１Ｂを参照されたい）。

【0081】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、２つのＢＣＭＡ－ＦａｂとＦｃ部分からなり、１つのＢＣＭＡ－ＦａｂとＣＤ３ Ｆａｂが、そのＣ末端を介して、前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されており、第２のＢＣＭＡ－Ｆａｂが、そのＣ末端によって、ＣＤ３－ＦａｂのＮ末端に連結されている。このＣＤ３－Ｆａｂは、交叉を含み、ＣＤ３－Ｆａｂまたは両方のＢＣＭＡ－Ｆａｂのいずれかは、ａａ置換を含む（図２Ａ及び２Ｂ）。

【0082】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、２つのＢＣＭＡ－Ｆａｂと、Ｆｃ部分（前記Ｆｃ部分のヒンジ領域には、ＢＣＭＡ－Ｆａｂが、そのＣ末端を介して連結されている）と、ＣＤ３－Ｆａｂ（そのＣ末端によって、１つのＢＣＭＡ－ＦａｂのＮ末端に連結されている）とからなる。このＣＤ３－Ｆａｂは、交叉を含み、ＣＤ３－Ｆａｂまたは両方のＢＣＭＡ－Ｆａｂのいずれかは、ａａ置換を含む（図２Ｃ及び２Ｄ）。

【0083】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、１つのＣＤ３－Ｆａｂ（そのＣ末端を介して、前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されている）と、ＢＣＭＡ－Ｆａｂ（そのＣ末端によって、ＣＤ３－ＦａｂのＮ末端に連結されている）とからなる。このＣＤ３－Ｆａｂは、交叉を含み、ＣＤ３－ＦａｂまたはＢＣＭＡ－Ｆａｂのいずれかは、ａａ置換を含む（図１Ａ及び１Ｂ）。

【0084】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、１つのＣＤ３－Ｆａｂ（そのＣ末端を介して、前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されている）と、ＢＣＭＡ－Ｆａｂ（そのＣ末端によって、ＣＤ３－ＦａｂのＮ末端に連結されている）とからなる。このＣＤ３－Ｆａｂは、交叉を含み、ＣＤ３－ＦａｂまたはＢＣＭＡ－Ｆａｂのいずれかは、ａａ置換を含む（図３Ａ及び３Ｂ）。

【0085】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、１つのＢＣＭＡ－Ｆａｂ（そのＣ末端を介して、前記Ｆｃ部分のヒンジ領域に連結されている）と、ＣＤ３－Ｆａｂ（そのＣ末端によって、ＢＣＭＡ－ＦａｂのＮ末端に連結されている）とからなる。このＣＤ３－Ｆａｂは、交叉を含み、ＣＤ３－ＦａｂまたはＢＣＭＡ－Ｆａｂのいずれかは、ａａ置換を含む（図３Ｃ及び３Ｄ）。

【0086】

Ｆａｂ断片は、現状の技術に従って、適切なリンカーを用いて、化学的に連結し合っている。一実施形態では、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ１）３リンカーを使用する（Ｄｅｓｐｌａｎｃｑ ＤＫ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９４ Ａｕｇ；７（８）：１０２７－３３及びＭａｃｋ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｊｕｌｙ １８，１９９５ ｖｏｌ．９２ ｎｏ．１５ ７０２１－７０２５）。２つのＦａｂ断片間の連結は、重鎖間で行われている。したがって、第１のＦａｂ断片のＣＨ１のＣ末端が、第２のＦａｂ断片のＶＨのＮ末端（非交叉の場合）またはＶＬ（交叉の場合）に連結されている。Ｆａｂ断片とＦｃ部分との連結は、ＣＨ１とＣＨ２との連結として行われている。

【0087】

ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片は、一実施形態では、同じ抗体に由来しており、一実施形態では、ＣＤＲ配列、可変ドメイン配列ＶＨ及びＶＬ、及び／または定常ドメイン配列ＣＨ１及びＣＬが同一である。一実施形態では、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体の第１のＦａｂ断片と第２のＦａｂ断片のアミノ酸配列は、同一である。一実施形態では、ＢＣＭＡ抗体は、抗体２１、２２もしくは４２のＣＤＲ配列を含む抗体、抗体２１、２２もしくは４２のＶＨ配列とＶＬ配列を含む抗体、または抗体２１、２２もしくは４２のＶＨ配列と、ＶＬ配列と、ＣＨ１配列と、ＣＬ配列を含む抗体である。

【0088】

一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆａｂ断片及びＦｃ部分として、抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片を１個以下と、抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂ断片を２個以下と、Ｆｃ部分、一実施形態では、ヒトＦｃ部分を１個以下含む。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体の第２のＦａｂ断片は、そのＣ末端を介して、抗ＣＤ３抗体のＦａｂ断片のＮ末端、またはＦｃ部分のヒンジ領域のいずれかに連結されている。一実施形態では、連結は、ＢＣＭＡ－ＦａｂのＣＨ１と、ＣＤ３－ＦａｂのＶＬの間で行われている（ＶＬ／ＶＨの交叉の場合）。

【0089】

一実施形態では、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分、一実施形態では、Ｆａｂ断片は、重鎖ＣＤＲ１として、配列番号１の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ２として、配列番号２の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ３として配列番号３の重鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＨと、抗ＣＤ３ε抗体の軽鎖ＣＤＲ１として、配列番号４の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ２として、配列番号５の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ３として、配列番号６の軽鎖ＣＤＲを含む（ＣＤＲ Ｍａｂ ＣＤ３）可変ドメインＶＬとを含むことを特徴とする。一実施形態では、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体部分は、可変ドメインが、配列番号７及び８のものである（ＶＨＶＬ ＭＡＢ ＣＤ３）ことを特徴とする。

【0090】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトＢＣＭＡとヒトＣＤ３εの細胞外ドメインに特異的に結合し、
ｉ）配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１（２×）（セット１ 抗体２１のＴＣＢ）と、
ｉｉ）配列番号４８、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４（２×）（セット２ 抗体２２のＴＣＢ）と、
ｉｉｉ）配列番号４８、配列番号５５、配列番号５６及び配列番号５７（２×）（セット３ 抗体４２のＴＣＢ）と、
のポリペプチドからなる群から選択した、重鎖と軽鎖のセットを含むことを特徴とするものである。
本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、抗体のＣＨ３ドメイン間の元来の界面を構成する界面で、一方の重鎖のＣＨ３ドメインと、他方の重鎖のＣＨ３ドメインがそれぞれ、交わることを特徴とし、前記界面が、二重特異性抗体の形成を促すように変更されており、その変更は、
ａ）その二重特異性抗体において、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元来の界面であって、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元来の界面と交わる界面において、アミノ酸残基が、側鎖体積のより大きいアミノ酸残基で置換されていることによって、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内に突起が作られ、その突起が、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の空隙に配置可能になるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
ｂ）二重特異性抗体において、第２のＣＨ３ドメインの元来の界面であって、第１のＣＨ３ドメインの元来の界面と交わる界面において、アミノ酸残基が、側鎖体積のより小さいアミノ酸残基で置換されていることによって、第２のＣＨ３ドメインの界面内に空隙が作られ、その空隙の中に、第１のＣＨ３ドメインの界面内の突起が配置可能になるように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていることと、
を特徴とする。

【0091】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、側鎖体積のより大きい前記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択されていることを特徴とする。

【0092】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、側鎖体積のより小さい前記アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択されていることを特徴とする。

【0093】

一実施形態では、このような二重特異性抗体は、両方のＣＨ３ドメインがさらに、各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸として、システイン（Ｃ）を導入することによって変更されていることを特徴とする。

【0094】

一実施形態では、このような二重特異性抗体は、両方の重鎖の定常重鎖ドメインＣＨ３の一方が、定常重鎖ドメインＣＨ１で置換されているとともに、他方の定常重鎖ドメインＣＨ３が、定常軽鎖ドメインＣＬで置換されていることを特徴とする。

【0095】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、１００ｎＭの前記抗体の濃度で、２４時間後に、調製ＢＣＭＡ発現細胞の２０％以上の細胞の細胞死を誘導する（親Ｆｃ部分を有する同じ抗体を対照として用いた、同じ条件下での対照に対するＡＤＣＣによる）改変Ｆｃ部分を含む。このような抗体は、一実施形態では、ネイキッド抗体である。

【0096】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、Ａｓｎ２９７において、フコースの量が、オリゴ糖（糖）の総量の６０％以下である抗体である（例えば、ＵＳ２０１２０３１５２６８を参照されたい）。

【0097】

一実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒトＦｃ部分に導入されているとともに、配列番号５５及び５６に開示されているアミノ酸置換を含む。

【0098】

本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、抗ＢＣＭＡ抗体のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはそれぞれのＣＡＲ Ｔ細胞である。このような実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、第１の結合部分の一本鎖ＶＨ及びＶＬドメインと、ＣＤ３ゼータ膜貫通及びエンドドメインからなる。好ましくは、ＣＤ３ゼータドメインは、スペーサーを介して、前記ＶＬドメインのＣ末端と連結されており、ＶＬドメインのＮ末端は、スペーサーを介して、前記ＶＨドメインのＣ末端に連結されている。ＢＣＭＡ抗体のキメラ抗原レセプターと、有用な膜貫通ドメイン及びエンドドメインと、その生成方法は、例えば、Ｒａｍａｄｏｓｓ ＮＳ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊ．，ＤＯＩ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．５ｂ０１８７６（２０１５），Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＲＯ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．ＤＯＩ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１２－２４２２（２０１３）、ＷＯ２０１５０５２５３８及びＷＯ２０１３１５４７６０に説明されている。

【0099】

本発明の一実施形態では、第１の結合部分は、抗原結合断片、特に、Ｆａｂ断片として、説明されているＣＬ及びＣＨ１配列とともに、そのＣＤＲ配列及び／またはＶＨ／ＶＬ配列によって本明細書に説明されているようなＭａｂ２１、Ｍａｂ２２、Ｍａｂ４２、Ｍａｂ２７、Ｍａｂ３３及びＭａｂ３９（抗体Ｍａｂ２１、２２、４２、２７、３３、３９については、本文中で後述の表１Ａ及び１Ｂを参照されたい）である。一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃ部分を有するかまたは有さない、特に、２＋１形態を含み、及び二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖は、特に、表１Ａに記載されている通りである。

【0100】

抗ＢＣＭＡ抗体は、二重特異性形態で、特に、２＋１形態で、１０ｎＭ以上、１ｆＭ以下の濃度で、４８時間の処置後、多発性骨髄腫（ＭＭ）骨髄穿刺液中のヒト悪性形質細胞を少なくとも８０％になるまで除去する。抗ＢＣＭＡ抗体は、１～５０ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡで、抗体８３Ａ１０の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ファージディスプレイライブラリー（ＶＨライブラリー、ＶＬライブラリー）を１～３ラウンドパニングし、上記のような二重特異性Ｔ細胞結合剤として、上記のような特性を有する可変軽鎖と可変重鎖を選択することを特徴とする。好ましくは、パニングは、ラウンド１では、５０ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡ、ラウンド２では、２５ｎＭのｃｙＢＣＭＡ、ラウンド３では、１０ｎＭのｃｙＢＣＭＡを用いて、３ラウンド行う。好ましくは、ライブラリーは、軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２または重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２のいずれかにおいてランダム化する。好ましくは、抗体８３Ａ１０の対応するＶＨまたはＶＬをさらに含むＦａｂ断片として、それぞれ、５０ｐＭ～５ｎＭのＫｄでｈｕＢＣＭＡに、０．１ｎＭ～２０ｎＭのＫｄでｃｙｎｏＢＣＭＡに結合する軽鎖及び重鎖を同定する。好ましくは、二重特異性形態は、図２Ａの形態であり、ＣＤ３ Ｆａｂのそれぞれの定常ドメインＶＬとＶＨであって、互いに入れ替わっているＶＬとＶＨと、両方のＢＣＭＡ Ｆａｂ内において、ＣＨ１ドメインにおけるＫ２１３Ｅ及びＫ１４７Ｅというアミノ酸交換と、ＣＬドメインにおけるＥ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋというアミノ酸交換とを含む。

【0101】

本明細書で言及されている二重特異性抗体は、
ａ）宿主細胞を
ｂ）前記抗体分子の軽鎖と重鎖をコードする核酸分子を含むベクターで形質転換する工程と、
ｃ）前記抗体分子の合成を可能にする条件で、宿主細胞を培養する工程と、
ｄ）前記抗体分子を前記培養物から回収する工程と、
によって調製することができる。

【0102】

本明細書で言及されている二重特異性抗体は、
ｅ）宿主細胞を
ｆ）第１の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖と重鎖をコードする核酸分子を含むベクターと、
ｇ）第２の標的に特異的に結合する抗体であって、可変ドメインのＶＬとＶＨまたは定常ドメインのＣＬとＣＨ１が互いに入れ替わっている抗体の軽鎖と重鎖をコードする核酸分子を含むベクター
で形質転換する工程と、
ｈ）前記抗体分子の合成を可能にする条件で、宿主細胞を培養する工程と、
ｉ）前記抗体分子を前記培養物から回収する工程と、
によって調製することができる。

【0103】

本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及びヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する二重特異性抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物である。

【0104】

本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及びヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する二重特異性抗体を含む、医薬として用いるための医薬組成物である。

【0105】

本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及びヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、医薬組成物である。本発明のさらなる実施形態は、多発性骨髄腫の治療で医薬として併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む医薬組成物である。

【0106】

一実施形態では、併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、本発明による二重特異性抗体は、多発性骨髄腫（ＭＭ）のような形質細胞障害、または下記のように、ＢＣＭＡを発現するその他の形質細胞障害の治療に用いることができる。ＭＭは、骨髄コンパートメントにおける異常な形質細胞の単クローン性増殖と蓄積によって特徴付けられる、形質細胞の悪性腫瘍である。ＭＭは、同じＩｇＧ遺伝子の再構成と体細胞超変異を有する循環クローン性形質細胞も伴う。ＭＭは、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）という無症状な前がん性の状態であって、低レベルの骨髄形質細胞と単クローナルタンパク質によって特徴付けられる状態から発症する。ＭＭ細胞は、低速度で増殖する。ＭＭは、複数の構造的な染色体変化（例えば、不均衡転座）の進行的な発生に起因する。ＭＭは、悪性形質細胞と骨髄微小環境（例えば、正常な骨髄間質細胞）の相互作用を伴う。活動性のＭＭの臨床的徴候としては、モノクローナル抗体のスパイク、骨髄において過密な形質細胞、溶解性骨病変、及び破骨細胞の過剰刺激に起因する骨破壊が挙げられる（Ｄｉｍｏｐｕｌｏｓ ＆ Ｔｅｒｐｏｓ，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１０；２１ ｓｕｐｐｌ ７：ｖｉｉ１４３－１５０）。形質細胞、すなわち、ＢＣＭＡを発現する形質細胞を伴う別の形質細胞障害は、全身性ループスエリテマトーデス（ＳＬＥ）であり、ループスとしても知られている。ＳＬＥは、身体のあらゆる部分に影響を及ぼし得る全身性自己免疫疾患であり、免疫系が自己の細胞と組織を攻撃し、その結果、慢性炎症と組織の損傷が生じることで表される。ＳＬＥは、抗体－免疫複合体が関与して、さらなる免疫応答を引き起こすＩＩＩ型過剰反応である（Ｉｎａｋｉ ＆ Ｌｅｅ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２０１０；６：３２６－３３７）。さらなる形質細胞障害は、形質細胞性白血病とＡＬアミロイドーシスである（実施例１９及び２０も参照されたい）。これらのいずれの形質細胞障害においても、本発明による抗体によって、形質細胞／悪性形質細胞を除去することは、上記のような疾患に罹患している患者に有益であると予測される。

【0107】

本発明のさらなる実施形態は、医薬として併用して使用される、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体である。好ましくは、第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする。

【0108】

本発明のさらなる実施形態は、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、医薬として用いるための医薬組成物である。好ましくは、第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする。

【0109】

本発明のさらなる実施形態は、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、エフェクター機能の向上した前記二重特異性抗体を含む、医薬として用いるための医薬組成物である。好ましくは、第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする。

【0110】

本発明のさらなる実施形態は、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、エフェクター機能が低下した前記二重特異性抗体を含む、医薬として用いるための医薬組成物である。好ましくは、第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする。

【0111】

本発明のさらなる実施形態は、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬と一緒に、ダイアボディとして前記二重特異性抗体を含む、医薬として用いるための医薬組成物である。好ましくは、第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする。

【0112】

一実施形態では、二重特異性抗体と、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬とは、１週間に１回または２回、一実施形態では皮下投与によって、（例えば、一実施形態では、０．１～２．５、好ましくは２５ｍｇ／ｍ^２／週、好ましくは２５０ｍｇ／ｍ^２／週の用量範囲で）投与する。二重特異性抗体は、その優れた細胞傷害性活性により、Ｔ細胞二重特異性ではない（すなわち、一方のアームにおいて、ＣＤ３に結合しない）従来の単特異性抗体または従来の二重特異性抗体と少なくとも同程度の（またはこれらの従来の抗体よりもさらに少ない）臨床用量範囲で投与できる。二重特異性抗体と、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬とでは、臨床現場においては、皮下投与（例えば、０．１～２５０ｍｇ／ｍ^２／週の用量範囲）が好ましいと想定されている。加えて、血清中のＡＰＲＩＬとＢＡＦＦのレベルが高い患者（例えば、多発性骨髄腫患者）では、二重特異性抗体の用量を増やす必要がないこともある。リガンドの競合による影響を受けないと見られるからである。これに対して、他のリガンドブロッキング／競合型抗ＢＣＭＡ抗体の用量は、上記の患者では、増やす必要があることがある。二重特異性抗体の別の利点は、排泄半減期が約４～１２日であり、これにより、週に少なくとも１回または２回の投与が可能になることである。

【0113】

一実施形態では、二重特異性抗体は、週に１回／２回の静脈内経路によって、ただし、好ましくは皮下投与を介して、（例えば、２００～２０００ｍｇ／ｍ／週範囲の用量で、４週間）処置することを可能にする特性を持つ抗体である。二重特異性抗体では、臨床現場においては、皮下投与（例えば、疾患の適応に応じて、２００～２０００ｍｇ／ｍ^２／週の用量範囲）が可能であるとともに、好ましいことが想定されている。加えて、血清中のＡＰＲＩＬとＢＡＦＦが高い患者（例えば、多発性骨髄腫患者）では、二重特異性抗体（例えば、非リガンドブロッキング／競合型抗体）では、用量を増やす必要がないことがある。リガンドの競合による影響を受けないと見られるからである。これに対して、他のリガンドブロッキング／競合型の抗ＢＣＭＡ抗体の用量は、上記の患者では、増やす必要があることがあり、これにより、皮下投与の技術的（例えば製薬上の）困難度が高くなる。二重特異性抗体の別の利点は、Ｆｃ部分を含むことに基づき、このことは、４～１２日の排泄半減期と関連し、週に少なくとも１回または２回の投与を可能にする。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
多発性骨髄腫を治療するために併用して使用するための、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、二重特異性抗体と、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される、免疫療法薬とであって、前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択される、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、前記二重特異性抗体及び前記免疫療法薬。
（項目２）
前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、及びアテゾリズマブからなる群から選択されることを特徴とする、項目１に記載の、多発性骨髄腫を治療するために併用して使用するための、二重特異性抗体及び免疫療法薬。
（項目３）
多発性骨髄腫の治療方法であって、前記方法は、
治療有効量の
ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、及び
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を、そのような治療を必要とする患者に投与することを特徴とし、
前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択される、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、前記方法。
（項目４）
前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、及びアテゾリズマブからなる群から選択されることを特徴とする、項目３に記載の方法。
（項目５）
治療有効量の
ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、及び
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を含むことを特徴とする、多発性骨髄腫疾患を罹患している患者における多発性骨髄腫細胞溶解を達成するための治療用の組み合わせ物であって、
前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択される、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、前記治療用の組み合わせ物。
（項目６）
前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びＭＤＸ－１１０５からなる群から選択されることを特徴とする、項目５に記載の治療用の組み合わせ物。
（項目７）
ａ）薬学的に許容可能な担体における、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択される、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、二重特異性抗体、
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬、
ｃ）薬学的に許容可能な担体、及び多発性骨髄腫の治療を必要とする対象に前記二重特異性抗体と前記免疫療法薬を併用して投与するための説明書
を含むことを特徴とする、製品。
（項目８）
前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びＭＤＸ－１１０５からなる群から選択されることを特徴とする、項目７に記載の製品。
（項目９）
治療有効量の
ａ））ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であって、前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択される、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、二重特異性抗体、
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を用いて、
ｃ）薬学的に許容可能な担体において前記二重特異性抗体と前記免疫療法薬を組み合わせることを特徴とする、医薬の製造方法。
（項目１０）
前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びＭＤＸ－１１０５からなる群から選択されることを特徴とする、項目９に記載の医薬の製造方法。

【図面の簡単な説明】

【0114】

【図1】定められているとおりのＦａｂ断片（ＣＤ３とＢＣＭＡに特異的である）とＦｃ部分のみを含む二重特異性二価抗体であり、（Ａ）は、Ｆａｂ ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）－Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３、（Ｂ）は、Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）である。ＲＫ／ＥＥのａａ置換は、生成の際に、ＬＣのミスペアリング／副生物を軽減するために、ＣＬ－ＣＨ１に導入されたものである。Ｆａｂ ＣＤ３には、ＬＣのミスペアリングと副生物を軽減するために、ＶＬ－ＶＨの交叉が含まれている。

【図2】定められているとおりのＦａｂ断片（ＣＤ３とＢＣＭＡに特異的である）とＦｃ部分のみを含む好ましい二重特異性三価抗体であり、（Ａ）は、Ｆａｂ ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）－Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３－Ｆａｂ ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）、（Ｂ）は、Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）－Ｆａｂ ＢＣＭＡ、（Ｃ）は、Ｆａｂ ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）－Ｆｃ－Ｆａｂ ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）－Ｆａｂ ＣＤ３、（Ｄ）は、Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆｃ－Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆａｂ ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）である。ＲＫ／ＥＥのａａ置換は、生成の際に、ＬＣのミスペアリング／副生物を低減するために、ＣＬ－ＣＨ１に導入されたものである。Ｆａｂ ＣＤ３には、ＬＣのミスペアリングと副生物を軽減するために、ＶＬ－ＶＨの交叉が含まれているのが好ましい。Ｆａｂ ＣＤ３とＦａｂ ＢＣＭＡは、フレキシブルリンカーによって、互いに連結されているのが好ましい。

【図3】定められているとおりのＦａｂ断片（ＣＤ３とＢＣＭＡに特異的である）とＦｃ部分のみを含む二重特異性二価抗体であり、（Ａ）は、Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３－Ｆａｂ ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）、（Ｂ）は、Ｆｃ－Ｆａｂ ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）－Ｆａｂ ＢＣＭＡ、（Ｃ）は、Ｆｃ－Ｆａｂ ＢＣＭＡ（ＲＫ／ＥＥ）－Ｆａｂ ＣＤ３、（Ｄ）は、Ｆｃ－Ｆａｂ ＢＣＭＡ－Ｆａｂ ＣＤ３（ＲＫ／ＥＥ）である。Ｆａｂ ＣＤ３には、ＬＣのミスペアリングと副生物を軽減するために、ＶＬ－ＶＨの交叉が含まれているのが好ましい。Ｆａｂ ＣＤ３とＦａｂ ＢＣＭＡは、フレキシブルリンカーによって、互いに連結されている。

【図4-1】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体（ＢＣＭＡ×ＣＤ３－ＴＣＢ）によって誘導された、Ｈ９２９ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解率である（ＬＤＨ放出量によって測定したものである）。２１－ＴＣＢｃｖ（●）、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって誘導された、Ｈ９２９ＭＭ細胞の溶解率の濃度応答曲線を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比較したものである。ＴＣＢまたはＴＣＢｃｖという用語の定義については、上記を参照されたい。実験で使用されたＴＣＢｃｖ（図４～１６及び図１９～２１に結果が示されている）は、図２Ａに示されている形態を有した（ｃｖは、電荷バリアントａａ置換を意味する）。いずれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体でも、Ｈ９２９細胞は濃度依存的に殺傷されたが、対照ＴＣＢでは、殺傷は観察されなかった。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というエフェクター細胞：腫瘍標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率を用いて、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー３（Ｂ）、ドナー４（Ｃ）、ドナー５（Ｄ）で行った（実施例８を参照されたい）。

【図4-2】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体（ＢＣＭＡ×ＣＤ３－ＴＣＢ）によって誘導された、Ｈ９２９ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解率である（ＬＤＨ放出量によって測定したものである）。２１－ＴＣＢｃｖ（●）、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって誘導された、Ｈ９２９ＭＭ細胞の溶解率の濃度応答曲線を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比較したものである。ＴＣＢまたはＴＣＢｃｖという用語の定義については、上記を参照されたい。実験で使用されたＴＣＢｃｖ（図４～１６及び図１９～２１に結果が示されている）は、図２Ａに示されている形態を有した（ｃｖは、電荷バリアントａａ置換を意味する）。いずれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体でも、Ｈ９２９細胞は濃度依存的に殺傷されたが、対照ＴＣＢでは、殺傷は観察されなかった。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というエフェクター細胞：腫瘍標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率を用いて、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー３（Ｂ）、ドナー４（Ｃ）、ドナー５（Ｄ）で行った（実施例８を参照されたい）。

【図5-1】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、Ｌ３６３ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（ＬＤＨ放出量によって測定したものである）。２１－ＴＣＢｃｖ（●）、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって誘導された、Ｌ３６３ＭＭ細胞の溶解率の濃度応答曲線を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比較したものである。いずれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体でも、Ｌ３６３細胞の濃度依存的な殺傷が観察されたが、対照ＴＣＢでは、殺傷は観察されなかった。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というＥ：Ｔ比を用いて、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー２（Ｂ）、ドナー３（Ｃ）、ドナー４（Ｄ）、ドナー５（Ｅ）で行った（実施例９を参照されたい）。

【図5-2】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、Ｌ３６３ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（ＬＤＨ放出量によって測定したものである）。２１－ＴＣＢｃｖ（●）、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって誘導された、Ｌ３６３ＭＭ細胞の溶解率の濃度応答曲線を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比較したものである。いずれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体でも、Ｌ３６３細胞の濃度依存的な殺傷が観察されたが、対照ＴＣＢでは、殺傷は観察されなかった。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というＥ：Ｔ比を用いて、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー２（Ｂ）、ドナー３（Ｃ）、ドナー４（Ｄ）、ドナー５（Ｅ）で行った（実施例９を参照されたい）。

【図5-3】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、Ｌ３６３ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（ＬＤＨ放出量によって測定したものである）。２１－ＴＣＢｃｖ（●）、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって誘導された、Ｌ３６３ＭＭ細胞の溶解率の濃度応答曲線を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比較したものである。いずれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体でも、Ｌ３６３細胞の濃度依存的な殺傷が観察されたが、対照ＴＣＢでは、殺傷は観察されなかった。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というＥ：Ｔ比を用いて、ＰＢＭＣドナー１（Ａ）、ドナー２（Ｂ）、ドナー３（Ｃ）、ドナー４（Ｄ）、ドナー５（Ｅ）で行った（実施例９を参照されたい）。

【図6-1】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＲＰＭＩ－８２２６ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（ＬＤＨ放出量によって測定したものである）。２１－ＴＣＢｃｖ（●）、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって誘導された、ＲＰＭＩ－８２２６ＭＭ細胞の溶解率の濃度応答曲線を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比較したものである。いずれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体でも、ＲＰＭＩ－８２２６細胞の濃度依存的な殺傷が観察されたが、対照ＴＣＢでは、殺傷は観察されなかった。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というＥ：Ｔ比を用いて、ＰＢＭＣドナー２（Ａ）、ドナー３（Ｂ）、ドナー４（Ｃ）、ドナー５（Ｄ）で行った（実施例１０を参照されたい）。

【図6-2】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＲＰＭＩ－８２２６ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（ＬＤＨ放出量によって測定したものである）。２１－ＴＣＢｃｖ（●）、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって誘導された、ＲＰＭＩ－８２２６ＭＭ細胞の溶解率の濃度応答曲線を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比較したものである。いずれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体でも、ＲＰＭＩ－８２２６細胞の濃度依存的な殺傷が観察されたが、対照ＴＣＢでは、殺傷は観察されなかった。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というＥ：Ｔ比を用いて、ＰＢＭＣドナー２（Ａ）、ドナー３（Ｂ）、ドナー４（Ｃ）、ドナー５（Ｄ）で行った（実施例１０を参照されたい）。

【図7-1】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＪＪＮ－３ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（フローサイトメトリーによって測定したものである）。ＪＪＮ－３ＭＭ細胞は、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比べて、濃度依存的に殺傷された。アネキシンＶ陽性ＪＪＮ－３細胞の割合（Ａ、Ｃ）と腫瘍細胞の溶解の割合（Ｂ、Ｄ）を割り出し、プロットした。特定濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＪＪＮ－３細胞の溶解の割合は、以下のように割り出した。ＴＣＢを含まないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数から、所定のＴＣＢ濃度におけるアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数を減じてから、ＴＣＢを含まないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数で除した。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というＥ：Ｔ比を用いて、ドナー１（Ａ、Ｂ）及びドナー２（Ｃ、Ｄ）という２つのＰＢＭＣドナーで行った（実施例１１を参照されたい）。

【図7-2】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＪＪＮ－３ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（フローサイトメトリーによって測定したものである）。ＪＪＮ－３ＭＭ細胞は、２２－ＴＣＢｃｖ（▲）、４２－ＴＣＢｃｖ（■）によって、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（○、破線）と比べて、濃度依存的に殺傷された。アネキシンＶ陽性ＪＪＮ－３細胞の割合（Ａ、Ｃ）と腫瘍細胞の溶解の割合（Ｂ、Ｄ）を割り出し、プロットした。特定濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＪＪＮ－３細胞の溶解の割合は、以下のように割り出した。ＴＣＢを含まないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数から、所定のＴＣＢ濃度におけるアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数を減じてから、ＴＣＢを含まないアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数で除した。実験は、１０個のＰＢＭＣと１個のＭＭ細胞というＥ：Ｔ比を用いて、ドナー１（Ａ、Ｂ）及びドナー２（Ｃ、Ｄ）という２つのＰＢＭＣドナーで行った（実施例１１を参照されたい）。

【図8】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、自己骨髄浸潤Ｔ細胞の存在下における多発性骨髄腫患者骨髄腫形質細胞（患者の全骨髄穿刺液）のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（マルチパラメーターフローサイトメトリーによって測定したものである）。アネキシンＶ陽性骨髄腫形質細胞の割合を割り出し、ＴＣＢ濃度に対してプロットした。患者の骨髄腫形質細胞の濃度依存的な特異的溶解が観察されたが、８色のマルチパラメーターパネルに基づいたところ、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞の溶解は観察されなかった。試験したＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢによる骨髄腫形質細胞の細胞死は誘導されなかった。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（Ａ）よりも、４２－ＴＣＢｃｖ（Ｂ）及び２２－ＴＣＢｃｖ（Ｃ）の方が、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の殺傷を誘導するのに強力であった（実施例１３を参照されたい）。

【図9】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、自己骨髄浸潤Ｔ細胞の存在下における多発性骨髄腫患者骨髄腫形質細胞（患者の全骨髄穿刺液）のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（フローサイトメトリーによって測定したものである）。アネキシンＶ陰性骨髄腫形質細胞の割合を割り出し、ＴＣＢ濃度に対してプロットした。患者の骨髄腫形質細胞の濃度依存的な特異的溶解が観察されたが、非悪性骨髄細胞の溶解は観察されなかった（データは示されていない）。試験したＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢでは、骨髄腫形質細胞の細胞死の誘導は観察されなかった（データは示されていない）。生存（アネキシンＶ陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的な減少によって映し出されているように、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも、４２－ＴＣＢｃｖ及び２２－ＴＣＢｃｖの方が、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の殺傷を誘導するのに強力であった。患者００１（Ａ）及び患者００７（Ｂ）における代表実験であった（実施例１３を参照されたい）。

【図10-1】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、自己骨髄浸潤Ｔ細胞の存在下における多発性骨髄腫患者骨髄腫形質細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解度である（フローサイトメトリーによって測定したものである）。ヨウ化プロピジウム陰性骨髄腫形質細胞の割合を割り出し、培地対照（ＭＣ）に対する生存骨髄形質細胞の割合をＴＣＢ濃度に対してプロットした。患者の骨髄腫形質細胞の濃度依存的な特異的溶解が観察された（Ａ～Ｇ）が、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）の溶解は観察されなかった（Ｈ）。試験したＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢでは、骨髄腫形質細胞の細胞死の誘導は観察されなかった。生存（ヨウ化プロピジウム陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的な減少によって映し出されているように、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも、４２－ＴＣＢｃｖ及び２２－ＴＣＢｃｖの方が、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の殺傷を誘導するのに強力であった。対応する統計的検定のＰ値が５％未満（^＊）、１％未満（^＊＊）または０．１％未満（^＊＊＊）であった場合に、作用を統計的に有意であるとみなした。実験は、患者１（Ａ）、患者２（Ｂ）、患者３（Ｃ）、患者４（Ｄ）、患者５（Ｅ）、患者６（Ｆ）及び患者７（Ｇ、Ｈ）から採取した骨髄穿刺液試料を用いて行った（実施例１３を参照されたい）。

【図10-2】同上。

【図10-3】同上。

【図10-4】同上。

【図11A】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、骨髄形質細胞の存在下における骨髄腫患者骨髄Ｔ細胞（患者の全骨髄穿刺液）の活性化である（マルチパラメーターフローサイトメトリー（８色の染色パネル）によって測定したものである）。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（Ａ）、４２－ＴＣＢｃｖ（Ｂ）及び２２－ＴＣＢｃｖ（Ｃ）において、Ｔ細胞の活性化の大きさを比較した（実施例１４を参照されたい）。

【図11B】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、骨髄形質細胞の存在下における骨髄腫患者骨髄Ｔ細胞（患者の全骨髄穿刺液）の活性化である（マルチパラメーターフローサイトメトリー（８色の染色パネル）によって測定したものである）。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（Ａ）、４２－ＴＣＢｃｖ（Ｂ）及び２２－ＴＣＢｃｖ（Ｃ）において、Ｔ細胞の活性化の大きさを比較した（実施例１４を参照されたい）。

【図11C】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、骨髄形質細胞の存在下における骨髄腫患者骨髄Ｔ細胞（患者の全骨髄穿刺液）の活性化である（マルチパラメーターフローサイトメトリー（８色の染色パネル）によって測定したものである）。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（Ａ）、４２－ＴＣＢｃｖ（Ｂ）及び２２－ＴＣＢｃｖ（Ｃ）において、Ｔ細胞の活性化の大きさを比較した（実施例１４を参照されたい）。

【図12】カニクイザルに０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖを１回静脈内（ＩＶ）注射した後、血清試料（黒色の記号及び実線）と骨髄試料（白色の記号及び破線）から、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの濃度を測定した。血清試料の採取は、投与前と、投与から３０分後、９０分後、１８０分後、７時間後、２４時間後、４８時間後、９６時間後、１６８時間後、３３６時間後、５０４時間後に行った。骨髄試料は、投与前と、投与から９６時間後及び３３６時間後に採取した（実施例１６を参照されたい）。

【図13】８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇ）を１回ＩＶ注射した後に、カニクイザルで観察された末梢Ｔ細胞の再分布である。動物Ａ及びＢ、Ｃ及びＤ、ならびにＥ及びＦには、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、及び０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖをそれぞれＩＶ注射した。血中Ｔ細胞の絶対数（血液１μＬ当たりのＣＤ２＋細胞）を、処置からの経過時間に対してプロットした（実施例１６を参照されたい）。

【図14A】８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（０．３ｍｇ／ｋｇ）を１回ＩＶ注射後に、カニクイザルで観察された、血中形質細胞の減少である（マルチパラメーターフローサイトメトリーによって測定したものである）。６色の染色パネルに基づき、形質細胞（ＰＣ）を同定し、リンパ球全体におけるＰＣの割合を測定し、等高線図でプロットした（Ａ）。カニクイザルにおいて０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖで処置後、血中形質細胞の除去動態をプロットした（Ｂ）（実施例１６を参照されたい）。

【図14B】８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（０．３ｍｇ／ｋｇ）を１回ＩＶ注射後に、カニクイザルで観察された、血中形質細胞の減少である（マルチパラメーターフローサイトメトリーによって測定したものである）。６色の染色パネルに基づき、形質細胞（ＰＣ）を同定し、リンパ球全体におけるＰＣの割合を測定し、等高線図でプロットした（Ａ）。カニクイザルにおいて０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖで処置後、血中形質細胞の除去動態をプロットした（Ｂ）（実施例１６を参照されたい）。

【図15】ＰＢＭＣ－ヒト化ＮＯＧマウスを用いたＨ９２９ヒト骨髄腫異種移植モデルにおいて、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された抗腫瘍活性である。０日目（ｄ０）に、ヒト多発性骨髄腫Ｈ９２９細胞を免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒγ（ｎｕｌｌ）（ＮＯＧ）の右側の背側腹側部に、皮下（ＳＣ）注射した。１５日目（ｄ１５）に、ヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに１回、腹腔内（ＩＰ）注射した。続いて、マウスを慎重に、種々の処置群と対照群（ｎ＝９／群）に無作為に分け、統計的検定を行って、群間の均質性について検定した。実験群は、対照の未処置群と、対照ＴＣＢ処置群と、２．６ｎＭ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖで処置した群と、２．６ｎＭ／ｋｇのＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（ＢＣＭＡ×ＣＤ３（ｓｃＦｖ）_２）で処置した群であった。尾静脈注射による、抗体での処置は、１９日目（ｄ１９）、すなわち、Ｈ９２９腫瘍細胞をＳＣ注射してから１９日後に開始した。ＴＣＢ抗体による処置スケジュールは、１週間に１回、最長で３週間ＩＶ投与する（すなわち、合わせて３回ＴＣＢ抗体を注射する）ことから構成されていた。試験中に、腫瘍体積（ＴＶ）をノギスによって測定し、ＴＶの群間比較によって進行を評価した。ＴＶ（ｍｍ３）を腫瘍注射からの経過日数に対してプロットした。処置初日のｄ１９には、平均腫瘍体積は、ビヒクルで処置する対照群（Ａ）では３００±１６１ｍｍ３に、２．６ｎＭ／ｋｇの対照ＴＣＢ処置群（Ａ）では３１５±１４８ｍｍ３に、２．６ｎＭ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ群（Ｂ）では２９３±１３５ｍｍ３に、２．６ｎＭ／ｋｇのＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）群（Ｃ）では３０７±１３８ｍｍ３に達していた。（Ａ）対照群（ビヒクル対照（実線）と対照ＴＣＢ（破線）を含む）、（Ｂ）８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群、及び（Ｃ）ＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）に関して、実験群ごとの各個別マウスのＴＶを腫瘍注射からの経過日数に対してプロットした。黒色の矢印は、ＩＶ注射によってＴＣＢで処置したことを示している。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群では、９匹のマウスのうち６匹（６７％）において、腫瘍が退縮し、ｄ１９、すなわち、１回目のＴＣＢによる処置を行った日に記録したＴＶまでを下回り、腫瘍の退縮は、試験終了まで維持された。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）処置群のマウスのうち、腫瘍が退縮しなかった３匹は、ｄ１９のＴＶがそれぞれ、３７６ｍｍ３、４０２ｍｍ３及び５２２ｍｍ３であった。これに対して、週に１回のスケジュールで３週間、等モル用量のＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）で処置した９匹のマウスでは、いずれかの時点に腫瘍が退縮したマウスはいなかった（０％）（実施例１７を参照されたい）。

【図16】ｄ１９～ｄ４３に腫瘍成長（ＴＧ）率を算出し、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群とＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）との間で比較した。腫瘍成長率（ＴＧ（％）として定義した）は、ＴＧ（％）＝１００×（解析群のＴＶ中央値）／（対照のビヒクル処置群のＴＶ中央値）で算出することによって割り出した。倫理的な理由から、マウスは、ＴＶが少なくとも２０００ｍｍ３に達したら安楽死させた。ＴＧ（％）は、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群において一貫してかつ有意に低下したとともに、ＴＧ（％）は、ＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）よりも常に低かった（実施例１７を参照されたい）。

【図17A】ＥＬＩＳＡから選択した７０個のクローンの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。全ての実験は、ＧＬＣ及びＧＬＭセンサーチップを備えたＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６というバイオセンサーとカップリング試薬とともに、ランニングバッファーとしてＰＢＳＴ（１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて、２５℃で行った。固定化は、３０μｌ／分で、ＧＬＭチップ上に行った。下記の標準的なアミンカップリング手順を用いて、ｐＡｂ（ヤギ）抗ｈｕＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２特異的Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を垂直方向にカップリングした。６個の全てのリガンドチャネルを５分間、ＥＤＣ（２００ｍＭ）とスルホ－ＮＨＳ（５０ｍＭ）の混合物で活性化した。表面が活性化したらすぐに、ｐＡｂ（ヤギ）抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２特異的抗体（５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５）を６個の全てのチャネルにわたって５分間注入した。そして、１Ｍのエタノールアミン－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を５分注射することによって、チャネルをブロックした。最終的な固定化レベルは、全てのチャネルにおいて同程度で、１１０００～１１５００ＲＵの範囲であった。５つの別個の水平チャネル全体に沿って（３０μｌ／分で）５分間同時に注入することによって、Ｆａｂバリアントをｅ．ｃｏｌｉ上清から捕捉して、上清中のＦａｂの濃度に応じて、２００～９００ＲＵの範囲のレベルを得て、馴化培地を６個目のチャネルに沿って注入して、二重参照目的で「インライン」ブランクを用意した。ヒトＢＣＭＡ及びｃｙｎｏＢＣＭＡの希釈系列を３分間（５０ｎＭ／分、１０ｎＭ／分、２ｎＭ／分、０．４ｎＭ／分、０．０８ｎＭ／分、０ｎＭ／分、５０μｌ／分）、垂直チャネルに沿って注入することによって、１ショットの動態測定を行った。解離を５分間モニタリングした。ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ．２．１で動態データを解析した。反応スポットデータの処理には、インラインバッファーブランクを用いて、インタースポットリファレンスとダブルリファレンス工程を適用することを含めた（Ｍｙｓｚｋａ，１９９９）。マストランスポートなしに、１ショットの注入を繰り返して得た処理データを単純１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。

【図17B】同上。

【図18】ＨＥＫ－ｈｕＢＣＭＡ細胞でのＢＣＭＡ抗体の結合親和性である（フローサイトメトリーによって測定したものである）。抗ＢＣＭＡ抗体を第１の抗体として用いてから、二次的なＰＥ標識抗ヒトＦｃを検出抗体として用いた。ＨＥＫ細胞上のｈｕＢＣＭＡへの抗体Ｍａｂ２１、Ｍａｂ２２、Ｍａｂ２７、Ｍａｂ３９及びＭａｂ４２の結合性は、Ｍａｂ８３Ａ１０のｈｕＢＣＭＡ－ＨＥＫ細胞への結合性よりも有意には高くないことが分かった。

【図19】カニクイザルにおいて、１回ＩＶまたはＳＣ注射後に、血清及び骨髄で測定された４２－ＴＣＢｃｖの濃度である。動物に、４２－ＴＣＢｃｖ）を１回、ＩＶまたはＳＣ注射し、ＰＫ評価のために、末梢静脈を介して、投与前、投与から３０分後、９０分後、１８０分後、７時間後、２４時間後、４８時間後、９６時間後、１６８時間後、３３６時間後、５０４時間後という各時点に、血液試料を採取した。血清を分離するために、血液試料をチューブ内で６０分間、室温で凝固させた。クロットを遠心分離によってスピンダウンした。得られた血清は、さらなる解析を行うまで、－８０℃で直接保存した。大腿骨において、麻酔／鎮痛処置下で、投与前と、投与から９６時間後及び３３６時間後に、ＰＫ評価用の骨髄試料も採取した。血清を分離するために、骨髄試料をチューブ内で６０分間、室温で凝固させた。クロットを遠心分離によってスピンダウンした。さらなる解析を行うまで、得られた骨髄を－８０℃で直接保存した。ＰＫデータの解析と評価を行った。Ｗａｔｓｏｎパッケージ（ｖ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗａｌｔｍａｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）またはＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎシステム（ｖ．６．３、Ｃｅｒｔａｒａ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて、標準的なノンコンパートメント解析を行った。多発性骨髄腫患者の骨髄穿刺液における４２－ＴＣＢｃｖの有効濃度範囲は、１０ｐｍ～１０ｎＭ（灰色の区域）に相当する。括弧内の濃度の単位は、ｎＭである。

【図20】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、自己Ｔ細胞または骨髄浸潤Ｔ細胞の存在下における形質細胞性白血病患者骨髄白血病細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解率である（フローサイトメトリーによって測定したものである）。ヨウ化プロピジウム陰性骨髄腫形質細胞の割合を割り出し、培地対照（ＭＣ）に対する生存骨髄形質細胞白血病細胞の割合をＴＣＢ濃度に対してプロットした。患者形質細胞白血病細胞の濃度依存的な特異的溶解が観察された（Ａ、Ｂ）が、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）の溶解は観察されなかった（データは示されていない）。試験したＴＣＢ抗体の最高濃度において、対照ＴＣＢでは、骨髄腫形質細胞の細胞死の誘導は観察されなかった。生存（ヨウ化プロピジウム陰性）骨髄腫形質細胞の濃度依存的な減少によって映し出されているように、４２－ＴＣＢｃｖは、患者の骨髄形質細胞白血病細胞の殺傷を誘導するのに非常に強力であった。対応する統計的検定のＰ値が５％未満（^＊）、１％未満（^＊＊）または０．１％未満（^＊＊＊）であった場合に、作用を統計的に有意であるとみなした。図には、患者１（Ａ）及び患者２（Ｂ）の骨髄試料から得られた結果が示されている（実施例２０も参照されたい）。

【図21】抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、サリドマイド誘導体（レナリドマイド）または免疫療法誘導体（抗ＰＤｌ及び抗ＣＤ３８抗体）と組み合わせた、Ｈ９２９ＭＭ細胞のリダイレクトＴ細胞による溶解率である（フローサイトメトリーによって測定したものである）。Ｈ９２９ＭＭ細胞をヒト白血球（ｎ＝１または５）と共培養し、準最適濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体Ａ）８３Ａ１０－ＴＣｃｖ（１０ｐＭ）またはＢ）４２－ＴＣＢｃｖ（１０ｐＭ）を単独で、または準最適濃度のレナリドマイド（１μＭ）、抗ＰＤ－１（１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３８ダラツムマブ（１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせてチャレンジした。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（ｎ＝５）を、レナリドマイドまたは抗ＣＤ３８ダラツムマブと組み合わせることで、それらの抗ＭＭ有効性をそれぞれ４倍及び２．５倍に著しく向上させた（Ａ）。４２－ＴＣＢｃｖ（ｎ＝ｌ）をレナリドマイドまたはダラツムマブと組み合わせることでも、ＭＭ細胞株を殺傷するためのそれらの抗ＭＭ有効性を向上させた（Ｂ）。

【発明を実施するための形態】

【0115】

「ＢＣＭＡ、標的ＢＣＭＡ、ヒトＢＣＭＡ」という用語は、本明細書で使用する場合、分化形質細胞において優先的に発現する腫瘍壊死レセプタースーパーファミリーのメンバーであるヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＴＲ１７＿ＨＵＭＡＮ、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０２２２３）としても知られている）に関するものである。ＢＣＭＡの細胞外ドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔによれば、１～５４位（または５～５１位）のアミノ酸からなる。「ＢＣＭＡに対する抗体、抗ＢＣＭＡ抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ＢＣＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体に関するものである。

【0116】

「ＢＣＭＡに特異的に結合する、またはＢＣＭＡに結合する」とは、その抗体が治療剤として、ＢＣＭＡを標的とするのに有用となるように、十分な親和性で、標的ＢＣＭＡに結合できる抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体の無関係な非ＢＣＭＡタンパク質への結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定した場合、その抗体のＢＣＭＡへの結合よりも、約１０倍、好ましくは１００倍超小さい。一実施形態では、ＢＣＭＡに結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、１０^－８Ｍ以下、好ましくは１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、好ましくは１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍである。一実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡのエピトープのうち、異なる種のＢＣＭＡ間で、好ましくは、ヒトとカニクイザルの間で、加えて、好ましくは、マウスＢＣＭＡとラットＢＣＭＡでも保存されているエピトープに結合する。「ＣＤ３とＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性抗体、ＣＤ３とＢＣＭＡに対する二重特異性抗体」とは、両方の標的に結合するためのそれぞれの定義を指す。ＢＣＭＡ（またはＢＣＭＡとＣＤ３）に特異的に結合する抗体は、他のヒト抗原には結合しない。したがって、ＥＬＩＳＡでは、このような無関係な標的のＯＤ値は、特定のアッセイの検出限界のＯＤ値（好ましくは０．３ｎｇ／ｍＬ超）以下となるか、またはプレートに結合したＢＣＭＡを含まないかもしくは非トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞を含む対照試料のＯＤ値以下となる。

【0117】

好ましくは、抗ＢＣＭＡ抗体は、ヒトＢＣＭＡ、ならびにヒト以外の哺乳動物由来のＢＣＭＡ、好ましくはカニクイザル、マウス及び／またはラット由来のＢＣＭＡからなるＢＣＭＡ群に特異的に結合している。「ｃｙｎｏ／ヒトギャップ」とは、カニクイザルＢＣＭＡへのＫＤ［Ｍ］／ヒトＢＣＭＡへのＫＤ［Ｍ］という親和性比を指す（詳細については、実施例３を参照されたい）。「Ｍａｂ ＣＤ３のｃｙｎｏ／ヒトギャップ」とは、本明細書で使用する場合、カニクイザルＣＤ３へのＫＤ［Ｍ］／ヒトＣＤ３へのＫＤ［Ｍ］という親和性比を指す。一実施形態では、本発明の二重特異性抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体は、Ｍａｂ ＣＤ３のｃｙｎｏ／ヒトギャップが１．２５～５または０．８～１．０であることを示す。本発明による二重特異性抗体は、一実施形態では、カニクイザルＣＤ３にも特異的に結合することを特徴とする。一実施形態では、本発明の二重特異性抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体は、Ｍａｂ ＣＤ３のｃｙｎｏ／ヒトギャップが１．２５～５または０．８～１．０であることを示す。好ましくは、ｃｙｎｏ／ヒトギャップは、抗ＢＣＭＡ抗体と抗ＣＤ３抗体において、同じ範囲内である。

【0118】

「ＡＰＲＩＬ」という用語は、本明細書で使用する場合、組み換えトランケート型マウスＡＰＲＩＬ（１０６～２４１位のアミノ酸、ＮＰ＿０７６００６）に関するものである。ＡＰＲＩＬは、Ｒｙａｎ，２００７（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ；６（１１）：３００９－１８）に記載されているようにして生成できる。

【0119】

「ＢＡＦＦ」という用語は、本明細書で使用する場合、Ｇｏｒｄｏｎ，２００３（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；４２（２０）：５９７７－５９８３）に記載されているようにして生成できる組み換えトランケート型ヒトＢＡＦＦ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９Ｙ２７５（ＴＮ１３Ｂ＿ＨＵＭＡＮ）に関するものである。好ましくは、本発明による、Ｈｉｓタグ化ＢＡＦＦを使用する。好ましくは、Ｈｉｓタグ化ＢＡＦＦは、８２～２８５位のＢＡＦＦ残基をコードするＤＮＡ断片を発現ベクターにクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグとの融合を行ってから、トロンビン切断部位との融合を行い、前記ベクターを発現させ、回収したタンパク質をトロンビンによって切断することによって生成する。

【0120】

抗ＢＣＭＡ抗体は、ＥＬＩＳＡによって、プレートに結合させたＢＣＭＡを用いて、ヒトＢＣＭＡへの結合について解析する。このアッセイでは、プレートに結合させたＢＣＭＡをある量、好ましくは１．５μｇ／ｍＬと、０．１ｐＭ～２００ｎＭの範囲の濃度（複数可）の抗ＢＣＭＡ抗体を使用する。

【0121】

「ＮＦ－κＢ」という用語は、本明細書で使用する場合、組み換えＮＦ－κＢ ｐ５０（受託番号（Ｐ１９８３８）に関するものである。ＮＦ－κＢ活性は、ＮＣＩ－Ｈ９２９ＭＭ細胞（ＣＲＬ－９０６８（商標））の抽出物のＤＮＡ結合ＥＬＩＳＡによって測定できる。０．１μｇ／ｍＬのＴＮＦ－α、１０００ｎｇ／ｍＬの熱処理済みのＨＴトランケート型ＢＡＦＦ、１０００ｎｇ／ｍＬのトランケート型ＢＡＦＦ、０．１ｐＭ～２００ｎＭのアイソタイプ対照で処理していないかまたは処理したＮＣＩ－Ｈ９２９ＭＭ細胞を、０．１ｐＭ～２００ｎＭの抗ＢＣＭＡ抗体を含めるか、または含めずに、２０分インキュベートする。ＮＦ－κＢ活性は、ＮＦ－κＢコンセンサス配列に結合したｐ６５からの化学発光シグナルを検出する機能性ＥＬＩＳＡを用いてアッセイできる（ＵＳ６１５００９０）。

【0122】

「さらなる標的」という用語は、本明細書で使用する場合、好ましくはＣＤ３εを意味する。「第１の標的及び第２の標的」という用語は、第１の標的としてのＣＤ３と、第２の標的としてのＢＣＭＡを意味するか、または第１の標的としてのＢＣＭＡと、第２の標的としてのＣＤ３を意味する。

【0123】

「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、本明細書で使用する場合、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）で説明されているヒトＣＤ３εに関するものである。「ＣＤ３εに対する抗体、抗ＣＤ３ε抗体」という用語は、ＣＤ３εに特異的に結合する抗体に関するものである。一実施形態では、本抗体は、重鎖ＣＤＲ１Ｈとして、配列番号１の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ２Ｈとして、配列番号２の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ３Ｈとして配列番号３の重鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＨと、軽鎖ＣＤＲ１Ｌとして、配列番号４の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ２Ｌとして、配列番号５の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ３Ｌとして、配列番号６の軽鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＬとを含む。一実施形態では、本抗体は、配列番号７（ＶＨ）と配列番号８（ＶＬ）の可変ドメインを含む。

【0124】

「抗ＣＤ３８抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体に関するものである。本発明の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブ（ＵＳ２０１５０２４６１２３）である。本発明の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、イサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４、ＵＳ８８７７８９９）である。本発明の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ＭＯＲ２０２（ＷＯ２０１２０４１８００）である。本発明の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、Ａｂ７９（ＵＳ８３６２２１１）である。本発明の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、Ａｂ１９（ＵＳ８３６２２１１）である。このような抗ＣＤ３８抗体の用量は、現状の技術によって行われ、それぞれの処方情報で説明されている。例えば、ダラツムマブの用量は通常、１６ｍｇ／ｋｇである（ｗｗｗ．ｅｍａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ）。

【0125】

「サリドマイド化合物」または「サリドマイド及び免疫療法誘導体」という用語は、本明細書で使用する場合、２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３－ジオン及びその免疫療法誘導体に関するものである。本発明の実施形態では、サリドマイド化合物は、サリドマイド（ＣＡＳ登録番号５０－３５－１）、レナリドマイド（ＣＡＳ登録番号１９１７３２－７２－６）、ポマリドマイド（ＣＡＳ登録番号１９１７１－１９－８）、ＣＣ１２２（ＣＡＳ登録番号１３９８０５３－４５－６）及びＣＣ－２２０（ＣＡＳ登録番号１３２３４０３－３３－３）及びそれぞれの塩（好ましくは、ＨＣｌ塩１：１）からなる群から選択されるが、それらに限定されない。ＣＣ－１２２の化学式は、２，６－ピペリジンジオン，３－（５－アミノ－２－メチル－４－オキソ－３（４Ｈ－キナゾリニル），塩酸塩（１：１）であり、ＣＣ－２２０の化学式は、２，６－ピペリジンジオン、３－［１，３－ジヒドロ－４－［［４－（４－モルホリニルメチル）フェニル］メトキシ］－１－オキソ－２Ｈ－イソインドール－２－イル］－，（３Ｓ）－，塩酸塩（１：１）である。ＣＣ－２２０の調製方法は、例えば、ＵＳ２０１１０１９６１５０で説明されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0126】

サリドマイド化合物の用量は、現状の技術によって行われ、それぞれの処方情報で説明されている。例えば、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標）（レナリドマイド）用量は通常、反復２８日サイクルの１～２１日目に、１日１回経口で２５ｍｇであり（ｗｗｗ．ｒｅｖｌｉｍｉｄ．ｃｏｍ）、多発性骨髄腫の治療のためのＰＯＭＡＬＹＳＴ（登録商標）（ポマリドマイド）用量は通常、反復２８日サイクルの１～２１日目に、１日１回４ｍｇで経口摂取される（ｗｗｗ．ｃｅｌｇｅｎｅ．ｃｏｍ）。一実施形態では、３－（５－アミノ－２－メチル－４－オキソ－４Ｈ－キナゾリン－３－イル）－ピペリジン－２，６－ジオンは、１日当たり約５～約５０ｍｇの量で投与される。

【0127】

一実施形態では、ＣＣ－１２２及びＣＣ－２２０は、１日当たり約５～約２５ｍｇの量で投与される。別の実施形態では、ＣＣ－１２２及びＣＣ－２２０は、１日当たり約５、１０、１５、２５、３０または５０ｍｇの量で投与される。別の実施形態では、１日当たり１０または２５ｍｇのＣＣ－１２２及びＣＣ－２２０が投与される。一実施形態では、ＣＣ－１２２及びＣＣ－２２０は、１日２回投与される。

【0128】

「抗ＰＤ－１抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体に関するものである。このような抗体は、例えば、ＷＯ２０１５０２６６３４（ＭＫ－３４７５、ペムブロリズマブ）、ＵＳ７５２１０５１、ＵＳ８００８４４９、及びＵＳ８３５４５０９で説明されている。ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標）、ＭＫ－３４７５，．）は、ＷＯ２００９／１１４３３５，Ｐｏｏｌｅ，Ｒ．Ｍ．Ｄｒｕｇｓ（２０１４）７４：１９７３；Ｓｅｉｗｅｒｔ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３２，５ｓ（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ６０１１）にも説明されている。本発明の実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ＭＫ－３４７５であり（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．２，ｐａｇｅｓ １６１－１６２（２０１３））、これは、ＷＯ２０１５０２６６３４の図６に示されている重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含む。ペムブロリズマブのアミノ酸配列は、ＷＯ２００８１５６７１２で説明されている（軽鎖ＣＤＲ配列番号１５、１６及び１７、及び重鎖ＣＤＲ配列番号１８、１９及び２０）。本発明の実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ニボルマブである（ＢＭＳ－９３６５５８，ＭＤＸ １１０６；ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１，ｐａｇｅｓ ６８－６９（２０１３）、ＷＯ２００６／１２１１６８、ＷＯ２０１５０２６６３４に示されるアミノ酸配列）。本発明の実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ピディリズマブである（ＣＴ－０１１、ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ－１としても知られる；アミノ酸配列については、ＷＯ２００３／０９９１９６；ＷＯ２００９／１０１６１１，Ｆｒｉｅｄ Ｉ．ｅｔ ａｌ．；Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ（２０１４）１６（ｓｕｐｐｌ ５）：ｖｌｌｌ－ｖｌｌ２を参照されたい）。本発明の実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ＭＥＤＩ－０６８０である（ＡＭＰ－５１４，ＷＯ２０１０／０２７４２３，ＷＯ２０１０／０２７８２７，ＷＯ２０１０／０２７８２８，Ｈａｍｉｄ Ｏ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３３，２０１５（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ＴＰＳ３０８７）。本発明の実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ＰＤＲ００１である（Ｎａｉｎｇ Ａ．ｅｔ ａｌ．；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４，２０１６（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ３０６０）。本発明の実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ＲＥＧＮ２８１０である（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＫＰｅｔ ａｌ．；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４，２０１６（ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ ３０２４））。本発明の実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ラムブロリズマブである（ＷＯ２００８／１５６７１２）。本発明の実施形態では、ＰＤ－１抗体は、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６またはｈ４０９Ａ１７であり、これは、ＷＯ２００８／１５６７１２で説明されている。このような抗ＰＤ－１抗体の用量は、現状の技術によって行われ、それぞれの処方情報で説明されている。例えば、キイトルーダ（登録商標）は通常、３週間ごとに２ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で投与される（ｈｔｔｐ：／／ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｈｅａｌｔｈ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ）。

【0129】

「抗ＰＤ－Ｌｌ抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体に関するものである。このような抗体は、例えば、ＷＯ２０１５０２６６３４、ＷＯ２０１３／０１９９０６、ＷＯ２０１０／０７７６３４及びＵＳ８３８３７９６で説明されている。本発明の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＰＤＬ３２８０Ａである（アテゾリズマブ，ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０，ＷＯ２０１０／０７７６３４，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＤＦ．Ｅｔ ａｌ．，ＪＣＯ Ｍａｒｃｈ １０，２０１６ ｖｏｌ．３４ ｎｏ．８ ８３３－８４２）。本発明の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＤＸ－１１０５である（ＢＭＳ－９３６５５９，ＷＯ２００７／００５８７４，Ｐａｔｒｉｃｋ Ａ．Ｏｔｔ ＰＡ ｅｔ ａｌ．，ＤＯＩ：１０．１１５８／１０７８－０４３２，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ－１３－０１４３）。本発明の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６である（デュルバルマブ，ＷＯ２０１６／０４０２３８ Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５３（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｐ１５２）。本発明の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１ ８Ｃである（アベルマブ，Ｄｉｓｉｓ ＭＬ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ３３，Ｎｏ １５＿ｓｕｐｐｌ （Ｍａｙ ２０ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），２０１５：５５０９）。本発明の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＷＯ２０１６００７２３５で説明されているように、配列番号１６のＶＨ配列と配列番号１７のＶＬ配列とを含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。このような抗ＰＤ－Ｌ１抗体の用量は、現状の技術によって行われ、それぞれの処方情報で説明されている。例えば、アテゾリズマブは通常、３週間ごとに６０分かけて静脈内注入として１２００ｍｇの濃度で投与される（ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ）。

【0130】

「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、モノクローナル抗体を指す。抗体は、２対の「軽鎖」（ＬＣ）と「重鎖」（ＨＣ）からなる（このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖のペアは、本明細書では、ＬＣ／ＨＣと略称する）。このような抗体の軽鎖と重鎖は、いくつかのドメインからなるポリペプチドである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略称する）と重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの抗体クラス）と、任意に応じて、重鎖定常ドメインＣＨ４（ＩｇＥ及びＩｇＭの抗体クラス）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインＶＬと軽鎖定常ドメインＣＬを含む。可変ドメインのＶＨとＶＬはさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）という超可変性の領域であって、その領域よりも保存性の高い領域（フレームワーク領域（ＦＲ）という）に挟まれた領域に細分できる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順序で配列されている３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成されている。重鎖と軽鎖の「定常ドメイン」は、抗体の標的への結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を呈する。「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、少なくとも、抗原であるＣＤ３とＢＣＭＡのそれぞれへの特異的結合に必要となる抗体部分も含む。したがって、前記抗体部分が、本発明による二重特異性抗体に含まれる場合には、このような抗体（または抗体部分）は、一実施形態では、Ｆａｂ断片であることができる。抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、ジ－ｓｃＦｖまたは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であることもできる。

【0131】

特徴的性質が保持されている限りは、「抗体」という用語には、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び遺伝子操作抗体（バリアントまたは変異体抗体）が含まれる。特に好ましいのは、ヒトまたはヒト化抗体、特に組み換えヒトまたはヒト化抗体としての抗体である。さらなる実施形態は、異種特異的抗体（二重特異性、三重特異的など）と、例えば細胞傷害性小分子とのその他のコンジュゲート体である。

【0132】

「二重特異性抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、一実施形態では、２対の重鎖及び軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）のうちの１対が、ＣＤ３に特異的に結合し、もう一方が、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体を指す。この用語は、現状の技術による他の形態の二重特異性抗体、一実施形態では、二重特異性一本鎖抗体も指す。

【0133】

「ＴＣＢ」という用語は、本明細書で使用する場合、ＢＣＭＡとＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体を指す。「８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ」という用語は、本明細書で使用する場合、ＢＣＭＡとＣＤ３に特異的に結合する二重特異性抗体のうち、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７（２×）及び配列番号４８の重鎖と軽鎖の組み合わせによって定められているとともに、図２Ａに示されており、ＥＰ１４１７９７０５に説明されているような抗体を指す。「２１－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ、４２－ＴＣＢｃｖ」という用語は、本明細書で使用する場合、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１（２×）の重鎖と軽鎖の組み合わせによって定められるようなＭａｂ２１の二重特異性抗体、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４（２×）の重鎖と軽鎖の組み合わせによって定められるようなＭａｂ２２の二重特異性抗体、及び配列番号４８、配列番号５５、配列番号５６及び配列番号５７－（２×）の重鎖と軽鎖の組み合わせによって定められるようなＭａｂ４２の二重特異性抗体をそれぞれ指す。

【0134】

「ネイキッド抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ＢＣＭＡに特異的に結合し、Ｆｃ部分を含み、治療剤、例えば細胞障害剤または放射性標識とコンジュゲートしていない抗体を指す。「コンジュゲート抗体、薬物コンジュゲート体」という用語は、本明細書で使用する場合、ＢＣＭＡに特異的に結合するとともに、治療剤、例えば細胞障害剤または放射性標識とコンジュゲートしている抗体を指す。

【0135】

「二重特異性一本鎖抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、一実施形態では、２つの結合ドメイン（１つは、ＢＣＭＡに特異的に結合し、もう一方は、一実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する）を含む１本のポリペプチド鎖を指す。各結合ドメインは、抗体重鎖由来の可変領域（「ＶＨ領域」）を１つ含み、第１の結合ドメインのＶＨ領域は、ＣＤ３分子に特異的に結合し、第２の結合ドメインのＶＨ領域は、ＢＣＭＡに特異的に結合する。２つの結合ドメインは任意に応じて、短いポリペプチドスペーサーによって、互いに連結されている。ポリペプチドスペーサーの非限定例は、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｇ－Ｓ）及びこのリピートである。加えて、各結合ドメインは、抗体軽鎖由来の可変領域（「ＶＬ領域」）を１つ含んでよく、第１の結合ドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域と、第２の結合ドメインのＶＨ領域及びＶＬ領域を互いに対合させて、それらが合わさって、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインのそれぞれに特異的に結合できるようにするのに十分に長いポリペプチドリンカーを介して、第１の結合ドメインと第２の結合ドメインのそれぞれのＶＨ領域とＶＬ領域が互いに連結されている（例えば、ＥＰ０６２３６７９を参照されたい）。二重特異性一本鎖抗体は、例えば、Ｃｈｏｉ ＢＤ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｊｕｌ；１１（７）：８４３－５３及びＷｏｌｆ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．２００５ Ｓｅｐ １５；１０（１８）：１２３７－４４でも言及されている。

【0136】

「ダイアボディ」という用語は、本明細書で使用する場合、同じポリペプチド鎖上で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖（ＶＨ）可変ドメイン（ＶＨ－ＶＬ）（同じ鎖上の２つのドメイン間を対合させるには短すぎるペプチドリンカーによって連結されている）を含む二価及び二重特異性の抗体小断片を指す（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７（１９９８），７６３－７７２）。これにより、別の鎖の相補的ドメインとの対合が起こり、２つの機能的な抗原結合部位を持つ二量体分子のアセンブリーが促される。本発明の二重特異性ダイアボディを構築するためには、抗ＣＤ３抗体と抗ＢＣＭＡ抗体のＶドメインを融合して、ＶＨ（ＣＤ３）－ＶＬ（ＢＣＭＡ）、ＶＨ（ＢＣＭＡ）－ＶＬ（ＣＤ３）という２本の鎖を作製する。それぞれの鎖自体は、各抗原に結合できないが、他方の鎖との対合により、抗ＣＤ３抗体と抗ＢＣＭＡ抗体の機能的な抗原結合部位が再現される。２つのｓｃＦｖ分子は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメイン間のリンカーであって、分子内での二量体形成には短すぎるリンカーとともに共発現し、自己アセンブルして、対向する２つの結合部位によって、二重特異性分子を形成する。例として、ＢＣＭＡとＣＤ３に対する結合ドメインをコードする可変領域はそれぞれ、ＰＣＲによって、説明されているようにして得たＤＮＡコンストラクトから増幅して、Ｋｉｐｉｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００，６９－７７（１９９７ａ）に説明されているように、ｐＨＯＧのようなベクターにクローニングできるようにできる。続いて、この２つのｓｃＦｖコンストラクトを１つの発現ベクターにおいて所望の配向で組み合わせることによって、ＶＨ－ＶＬリンカーを短くして、鎖自体のバックフォールディングを防ぐ。これらのＤＮＡセグメントは、終止コドンとリボソーム結合部位（ＲＢＳ）によって分離する。ＲＢＳにより、バイシストロニックなメッセージとして、ｍＲＮＡの転写が可能になり、このメッセージは、リボソームによって２つのタンパク質に翻訳され、これらのタンパク質が非共有結合で相互作用して、ダイアボディ分子を形成する。ダイアボディには、他の抗体断片のように、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において、機能的な形態かつ高収量（最大Ｉｇ／ｌ）で、発現できるという利点がある。

【0137】

「タンデムｓｃＦｖ」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、ＷＯ０３／０２５０１８及びＷＯ０３／０４８２０９に説明されているような一本鎖Ｆｖ分子（すなわち、免疫グロブリンの重鎖可変ドメインＶＨと軽鎖可変ドメインＶＬの会合によって形成される分子）を指す。このようなＦｖ分子（ＴａｎｄＡｂｓ（登録商標）として知られている）は、４つの抗体可変ドメインを含み、（ｉ）ＶＨ／ＶＬまたはＶＬ／ＶＨの配向で、抗原結合ｓｃＦｖを形成することによって、４つの可変ドメインのうちの最初の２つまたは最後の２つのいずれかが、同じ鎖内で、互いに分子内で結合し、（ｉｉ）もう一方の２つのドメインが、他方の鎖の対応するＶＨドメインまたはＶＬドメインと分子内で結合して、抗原結合ＶＨ／ＶＬ対を形成する。好ましい実施形態では、ＷＯ０３／０２５０１８で言及されているように、このようなＦｖ分子の単量体は、１つの単量体の２つの隣接ドメインが、抗原結合ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ ｓｃＦｖユニットを形成する少なくとも４つの可変ドメインを含む。

【0138】

「ＤＡＲＰｉｎ」という用語は、本明細書で使用する場合、例えばＵＳ２００９０８２２７４に説明されているような二重特異性アンキリンリピート分子を指す。これらの分子は、ヒトゲノムで見ることができるとともに、最も豊富なタイプの結合タンパク質の１つである天然のアンキリンタンパク質に由来する。ＤＡＲＰｉｎライブラリーモジュールは、初期デザインでは２２９個のアンキリンリピート、その後の精緻化では別の２２００個のアンキリンリピートを用いて、天然のアンキリンリピートタンパク質配列によって定められる。これらのモジュールは、ＤＡＲＰｉｎライブラリー用のビルディングブロックとしての役割を果たす。ライブラリーモジュールは、ヒトゲノム配列に似ている。ＤＡＲＰｉｎは、４～６個のモジュールで構成されている。各モジュールは、約３．５ｋＤａであるので、平均的なＤＡＲＰｉｎのサイズは、１６～２１ｋＤａである。結合剤の選択は、リボソームディスプレイによって行い、このリボソームディスプレイは、完全に無細胞であり、Ｈｅ Ｍ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ ＭＪ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２００７，Ｎｏｖ；３５（Ｐｔ ５）：９６２－５に説明されている。

【0139】

「Ｔ細胞二重特異性エンゲージャー」という用語は、約５５キロダルトンの１本のペプチド鎖上において、異なる抗体の２つの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）または４つの異なる遺伝子に由来するアミノ酸配列からなる融合タンパク質である。ｓｃＦｖのうちの１つは、ＣＤ３レセプターを介してＴ細胞に結合し、もう一方は、ＢＣＭＡに結合する。

【0140】

哺乳動物の抗体重鎖には、ギリシャ文字でα、δ、ε、γ及びμと示される５つの種類がある（Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ，Ｊｒ ｅｔ ａｌ （２００１）．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。存在する重鎖の種類によって、抗体のクラスが定まり、これらの鎖はそれぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体で見られる（Ｒｈｏａｄｅｓ ＲＡ，Ｐｆｌａｎｚｅｒ ＲＧ （２００２）．Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。それぞれの重鎖は、サイズと組成が異なり、α鎖及びγ鎖は、約４５０個のアミノ酸を含み、μ鎖及びε鎖は、約５５０個のアミノ酸を有する。

【0141】

各重鎖には、定常領域と可変領域という２つの領域がある。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体では同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。γ、α及びδ重鎖には、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３（一列になっている）という３つの定常ドメインと、柔軟性を加えるためのヒンジ領域で構成された定常領域があり（Ｗｏｏｆ Ｊ，Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４（２００４）８９－９９）、μ及びε重鎖には、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４という４つの定常ドメインで構成された定常領域がある（Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ，Ｊｒ ｅｔ ａｌ （２００１）．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．５ｔｈ ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変領域は、異なるＢ細胞によって産生される抗体においては異なるが、１つのＢ細胞またはＢ細胞クローンによって産生される全ての抗体では同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０個のアミノ酸の長さであり、１つの抗体ドメインで構成されている。

【0142】

哺乳動物では、軽鎖には２つの種類しかなく、それらは、ラムダ（λ）及びカッパ（κ）と呼ばれている。軽鎖には、１つの定常ドメインＣＬと１つの可変ドメインＶＬという２つの連続的なドメインがある。軽鎖の概ねの長さは、２１１～２１７個のアミノ酸分である。一実施形態では、軽鎖は、カッパ（κ）軽鎖であり、定常ドメインＣＬは、一実施形態では、カッパ（Ｋ）軽鎖（定常ドメインＣＫ）に由来する。

【0143】

「ａａ置換」とは、本明細書で使用する場合、定常ドメインＣＨ１では、１４７位及び２１３位のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）による独立したアミノ酸置換を指し、定常ドメインＣＬでは、１２４位のアミノ酸が、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されていることを指す。一実施形態では、加えて、定常ドメインＣＬにおいて、１２３位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されている。一実施形態では、１２４位のアミノ酸はＫであり、１４７位のアミノ酸はＥであり、２１３位のアミノ酸はＥであり、１２３位のアミノ酸はＲである。ａａ置換は、ＣＤ３ Ｆａｂ、または１つもしくは２つのＢＣＭＡ Ｆａｂのいずれかに存在する。電荷バリアントとしての、ＢＣＭＡとＣＤ３に対する二重特異性抗体は、ＥＰ１４１７９７０５に説明されており、参照により開示されている（さらに、「それぞれ、電荷バリアント、電荷バリアント交換」という）。

【0144】

本明細書における全てのアミノ酸番号付けは、Ｋａｂａｔに従っている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２）。

【0145】

「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、１つのアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を指す。

【0146】

本発明による「抗体」は、いずれかのクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、好ましくはＩｇＧもしくはＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２、好ましくはＩｇＧ１）であることができ、それにより、本発明による二価の二重特異性抗体の由来元である両方の抗体は、同じサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など、好ましくはＩｇＧ１）、好ましくは同じアロタイプ（例えば、Ｃａｕｃａｓｉａｎ）のＦｃ部分を有する。

【0147】

「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づき定義されている。本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、Ｆｃ部分として、一実施形態では、ヒト由来のＦｃ部分を含むとともに、好ましくは、ヒト定常領域の他の全ての部分を含む。抗体のＦｃ部分は、補体の活性化、Ｃ１ｑの結合、Ｃ３の活性化及びＦｃレセプターの結合に直接関与する。抗体が補体系に及ぼす影響は、ある特定の条件に左右されるが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分の所定の結合部位によって生じる。このような結合部位は、現状の技術において知られており、例えば、Ｌｕｋａｓ，ＴＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．，ａｎｄ Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．，ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８－３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ＭｏＩ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４及びＥＰ０ ３０７ ４３４によって説明されている。

【0148】

このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９である（番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである）。抗体のサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３は通常、補体の活性化、Ｃ１ｑの結合及びＣ３の活性化を示すが、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。一実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒトＦｃ部分である。

【0149】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域のＦｃバリアントを含み、前記Ｆｃバリアントは、Ｐｒｏ３２９の位置のアミノ酸置換と、少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換を含み（残基は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号が付されている）、前記抗体は、野生型ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体よりも、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ及び／またはＦＣγＲＩＩＡ及び／またはＦＣγＲＩに対する親和性が低下しており、前記抗体によって誘導されるＡＤＣＣは、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣの少なくとも２０％まで低下している。具体的な実施形態では、二重特異性抗体における野生型ヒトＦｃ領域のＰｒｏ３２９は、グリシンもしくはアルギニン、またはＦｃ／Ｆｃγレセプターの界面内のプロリンサンドイッチ（Ｆｃの３２９位のプロリンと、ＦｃγＲＩＩＩのトリプトファン残基Ｔｒｐ８７及びＴｉｐ１１０との間に形成されている）を破壊するのに十分に大きいアミノ酸残基で置換されている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ ４０６，２６７－２７３（２０ Ｊｕｌｙ ２０００））。本発明のさらなる態様では、Ｆｃバリアントにおける少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓであり、さらに、別の実施形態では、前記少なくとも１つのさらなるアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅである。このようなＦｃバリアントは、ＷＯ２０１２１３０８３１に詳細に説明されている。

【0150】

「エフェクター機能」とは、本明細書で使用する場合、抗体Ｆｃ領域とＦｃレセプターまたはリガンドとの相互作用に起因する生化学的なイベントを意味する。エフェクター機能としては、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣが挙げられるが、これらに限らない。「エフェクター細胞」とは、本明細書で使用する場合、１つ以上のＦｃレセプターを発現するとともに、１つ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系細胞を意味する。エフェクター細胞としては、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びγδＴ細胞が挙げられるが、これらに限らず、エフェクター細胞は、いずれかの生物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルが挙げられるが、これらに限らない）に由来してよい。「ライブラリー」とは、本明細書においては、いずれかの形態のＦｃバリアントセットを意味し、核酸またはアミノ酸配列のリスト、可変位における核酸またはアミノ酸置換のリスト、ライブラリー配列をコードする核酸を含む物理的ライブラリー、またはＦｃバリアントタンパク質を精製形態もしくは非精製形態で含む物理的ライブラリーが挙げられるが、これらに限らない。

【0151】

「Ｆｃガンマレセプター」または「ＦｃγＲ」とは、本明細書で使用する場合、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域と結合するとともに、ＦｃγＲ遺伝子によって実質的にコードされるタンパク質のファミリーのいずれかのメンバーを意味する。ヒトにおいては、このファミリーとしては、アイソフォームのＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）と、アイソフォームのＦｃγＲＩＩａ（アロタイプのＨ１３１とＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１とＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）と、アイソフォームのＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプのＶ１５８とＦ１５８を含む）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプのＦｃγＲＩＩＩｂ－ＮＡ１とＦｃγＲＩＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５）と、いずれかの未発見のヒトＦｃγＲ、またはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが挙げられるが、これらに限らない。ＦｃγＲは、いずれかの生物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルが挙げられるが、これらに限らない）に由来してよい。マウスＦｃγＲとしては、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）及びＦｃγＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）、ならびにいずれかの未発見のマウスＦｃγＲ、またはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが挙げられるが、これらに限らない。

【0152】

「エフェクター機能の向上したＦｃバリアント」とは、本明細書で使用する場合、少なくとも１つのアミノ酸の改変により、親Ｆｃ配列とは異なるＦｃ配列を意味するか、または、例えば、Ａｓｎ２７９における、エフェクター機能を高めるグリコシル化の改変のようなその他の改変に関するものである。このような修飾は、例えば、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３－５６４；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：２６５７－２６６２；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：５３－５９；Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７－１５４３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２：１１９８０－１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，／／７７ｍｕｎｏ／Ｌｅｔｔ ４４：１１１－１１７；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｆａｓｅｂ Ｊ ９：１１５－１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５４：１０１－１０４；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：４９６３－４９６９；Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２６１３－２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４１７８－４１８４；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１９２５－１９３３；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：１６－２６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１－２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１－６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０：４８７－４９０；ＵＳ５６２４８２１；ＵＳ５８８５５７３；ＵＳ６１９４５５１；ＷＯ２０００４２０７２；ＷＯ１９９９５８５７２で言及されている。このようなＦｃの改変には、本発明によれば、Ｆｃ部分の操作済みグリコフォームも含まれる。「操作済みグリコフォーム」とは、本明細書で使用する場合、Ｆｃポリペプチドに共有結合している糖鎖組成物であって、親Ｆｃポリペプチドの糖鎖組成物とは化学的に異なる前記糖鎖組成物を意味する。操作済みグリコフォームは、いずれかの方法によって、例えば、操作済みまたはバリアント発現株を用いることによって、１つ以上の酵素、例えばＤ１－４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）との共発現によって、Ｆｃポリペプチドを様々な生物もしくは様々な生物由来の細胞株において発現させることによって、またはＦｃポリペプチドを発現させた後に、糖鎖（複数可）を改変することによって生成してよい。操作済みグリコフォームの生成方法は、当該技術分野において知られており、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１７６－１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７４：２８８－２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２６７３３－２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：３４６６－３４７３）；ＵＳ６６０２６８４；ＷＯ２０００６１７３９；ＷＯ２００１２９２４６；ＷＯ２００２３１１４０；ＷＯ２００２３０９５４；Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（商標）の技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；グリコシル化操作技術のＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）（ＧＬＹＣＡＲＴ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））で言及されている。操作済みグリコフォームとは典型的には、親Ｆｃポリペプチドとは異なる糖鎖またはオリゴ糖組成物を指す。

【0153】

本発明の一実施形態では、エフェクター機能の向上したＦｃバリアントを含む二重特異性抗体は、ＦｃガンマレセプターＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩ、ＣＤ１６ａ）に対する結合親和性が高い。ＦｃγＲＩＩＩに対する高い結合親和性とは、ＣＤ１６ａ／Ｆ１５８に対して、結合性が、ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ ＤＧ４４もしくはＣＨＯ Ｋ１細胞など）で発現させた参照としての親抗体（９５％フコシル化）と比べて、少なくとも１０倍向上しているか、または／及び１００ｎＭの抗体濃度で、固定化したＣＤ１６ａを用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、ＣＤ１６ａ／Ｖ１５８に対して、結合性が、親抗体と比べて少なくとも２０倍向上していることを示す。ＦｃγＲＩＩＩの結合は、現状の技術による方法によって、例えば、抗体のＦｃ部分のアミノ酸配列を改変すること、または抗体のＦｃ部分のグリコシル化によって向上させることができる（例えば、ＥＰ２２３５０６１を参照されたい）。Ｍｏｒｉ，Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５５（２００７）１０９及びＳａｔｏｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．６（２００６）１１６１－１１７３は、アフコシル化抗体を生成するためのＦＵＴ８（α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ）遺伝子ノックアウトＣＨＯ株に関するものである。

【0154】

「キメラ抗体」という用語は、ある供給源または種に由来する可変領域、すなわち結合領域と、異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部を含む抗体であって、通常、組み換えＤＮＡ技術によって調製する抗体を指す。マウス可変領域とヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明に含まれる「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明による特性、特に、Ｃ１ｑの結合及び／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）の結合に関する特性をもたらすために、定常領域が、元の抗体の定常領域から改変または変更されている形態である。このようなキメラ抗体は、「クラススイッチ抗体」ともいう。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体の生成方法は、従来の組み換えＤＮＡを伴い、遺伝子のトランスフェクション技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１－６８５５；米国特許第５，２０２，２３８号及び同第５，２０４，２４４号を参照されたい。

【0155】

「ヒト化抗体」という用語は、親免疫グロブリンの特異性と特異性が異なる免疫グロブリンのＣＤＲを含むように、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されている抗体を指す。好ましい実施形態では、「ヒト化抗体」を調製するために、マウスＣＤＲが、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植されている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３－３２７；及びＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８－２７０を参照されたい。本発明に含まれる「ヒト化抗体」のその他の形態は、本発明による特性、特に、Ｃ１ｑの結合及び／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）の結合に関する特性をもたらすために、定常領域がさらに、元の抗体の定常領域から改変または変更されている抗体である。

【0156】

「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有する抗体を含むように意図されている。ヒト抗体は、現状の技術において周知である（ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８－３７４）。ヒト抗体は、免疫によって、内因性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーまたは選択部分を産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）で産生させることもできる。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入はヒト抗体の生成をもたらす（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１－２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５－２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３－４０を参照されたい）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーで生成することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１－３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１－５９７）。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に使用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；及びＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６－９５）。本発明によるキメラ抗体とヒト化抗体に関してすでに述べたように、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、本発明による特性、特に、Ｃ１ｑの結合及び／またはＦｃＲの結合に関する特性をもたらすために、例えば、Ｆｃ部分の「クラススイッチ」、すなわち、変更または変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４への変更及び／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）によって、定常領域において改変されている抗体も含む。

【0157】

「組み換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、宿主細胞（ＮＳＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞など）から単離した抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体、または宿主細胞にトランスフェクションした組み換え発現ベクターを用いて発現させた抗体のように、組み換え手段によって調製、発現、作製または単離されるあらゆるヒト抗体を含むように意図されている。このような組み換えヒト抗体は、再構成された形態の可変領域と定常領域を有する。組み換えヒト抗体は、インビボで体細胞超変異を受けたものである。したがって、この組み換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列とＶＬ配列に由来及び関連しているが、天然では、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内に存在するとは限らない配列である。

【0158】

「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖の可変領域（ＶＨ））とは、本明細書で使用する場合、軽鎖及び重鎖の各ペアのうち、抗体の結合に直接関与するペアを示す。可変ヒト軽鎖と可変ヒト重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインには、配列が広く保存されているとともに、３つの「超可変領域」（すなわち、相補性決定領域、ＣＤＲ）によってつながっている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれる。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションをとり、ＣＤＲは、このβシート構造を連結するループを形成し得る。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって三次元構造に保たれ、もう一方の鎖のＣＤＲと共に、結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、抗体の結合特異性／親和性において、特に重要な役割を果たすので、本発明のさらなる目的をもたらす。「ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む結合部分」とは、これらの領域が前記ＢＣＭＡまたはＣＤ３結合剤分のそれぞれのＶＨ及びＶＬ領域であることを意味する。

【0159】

「超可変領域」または「抗体の標的結合部分」という用語は、本明細書で使用するときには、抗体のアミノ酸残基のうち、標的の結合を担うアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書で定義されているような超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖と重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ１ドメイン、ＣＤＲ１ドメイン、ＦＲ２ドメイン、ＣＤＲ２ドメイン、ＦＲ３ドメイン、ＣＤＲ３及びＦＲ４ドメインを含む。各鎖のＣＤＲは、このようなフレームワークアミノ酸によって隔てられている。特に、重鎖のＣＤＲ３は、標的の結合への寄与度が最も大きい領域である。ＣＤＲ領域とＦＲ領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の標準的な定義によって定められる。「ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ及びＣＤＲ３Ｈ」という用語は、本明細書で使用する場合、可変ドメインＶＨに位置する、重鎖の各ＣＤＲを指す。「ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ及びＣＤＲ３Ｌ」という用語は、本明細書で使用する場合、可変ドメインＶＬに位置する、軽鎖の各ＣＤＲを指す。

【0160】

重鎖ドメインＣＨ３と置き換わる定常重鎖ドメインＣＨ１は、いずれかのＩｇクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のものであることができる。重鎖ドメインＣＨ３と置き換わる定常軽鎖ドメインＣＬは、ラムダ（λ）またはカッパ（κ）のタイプ、好ましくはカッパ（κ）のタイプであることができる。

【0161】

「標的」または「標的分子」という用語は、本明細書で使用する場合、同義的に用いられており、ヒトＢＣＭＡを指す。二重特異性抗体においては、この用語は、ＢＣＭＡと第２の標的を指す。好ましくは、二重特異性抗体においては、この用語は、ＢＣＭＡとＣＤ３を指す。

【0162】

「エピトープ」という用語には、抗体に特異的に結合できるいずれかのポリペプチド決定基が含まれる。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的に活性な表面基を含み、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特性及びまたは特定の電荷特性を有してよい。エピトープは、標的の領域のうち、抗体が結合する領域である。

【0163】

概して、抗体の軽鎖と重鎖をコードする２つのベクターが存在する。二重特異性抗体においては、第１の標的に特異的に結合する前記抗体の軽鎖と重鎖をコードする２つのベクターと、さらに、第２の標的に特異的に結合する前記抗体の軽鎖と重鎖をコードする２つのベクターが存在する。これらの２つのベクターの一方は、それぞれの軽鎖をコードし、２つのベクターのうちのもう一方は、それぞれの重鎖をコードする。しかしながら、抗体を調製するための代替的な方法では、宿主細胞を形質転換するのに、第１の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖と重鎖をコードする第１のベクターを１つのみと、第２の標的に特異的に結合する抗体の軽鎖と重鎖をコードする第２のベクターを１つのみ使用することができる。

【0164】

「核酸または核酸分子」という用語は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子を含むように意図されている。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0165】

本明細書で使用する場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は、同義的に用いられており、これらの呼称にはいずれも、子孫が含まれる。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という用語には、初代対象細胞と、継代数にかかわらず、初代対象細胞に由来する培養物とが含まれる。全ての子孫は、意図的または偶発的変異により、ＤＮＡ量がまったく同一でない場合もあることも分かる。元の形質転換細胞でスクリーニングしたものと同じ機能または生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。別個の名称が意図されている場合は、文脈から明らかとなるであろう。

【0166】

「形質転換」という用語は、本明細書で使用する場合、ベクター／核酸を宿主細胞に移入するプロセスを指す。強力な細胞壁バリアのない細胞を宿主細胞として使用する場合には、例えば、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｈ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７８）５４６ｆｆによって説明されているようなリン酸カルシウム沈殿法によって、トランスフェクションを行う。しかしながら、ＤＮＡを細胞に導入する他の方法（核注入またはプロトプラスト融合による方法など）も用いてよい。原核細胞または相当な細胞壁コンストラクトを含む細胞を使用する場合には、例えば、トランスフェクション方法の１つは、Ｃｏｈｅｎ ＳＮ，ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ １９７２，６９（８）：２１１０－２１１４によって説明されているような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理である。

【0167】

形質転換を用いて抗体を組み換え生成することは、現状の技術において周知であり、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３－２０２；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１－２８２；Ｋａｕｆｍａｎ，ＲＪ．，ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１－１６１；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４８（１９９８）８７０－８８０の総説論文と、ＵＳ６３３１４１５及びＵＳ４８１６５６７に説明されている。

【0168】

本明細書で使用する場合、「発現」とは、核酸をｍＲＮＡに転写するプロセス、及び／またはその後、転写したｍＲＮＡ（転写産物ともいう）をペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳するプロセスを指す。転写産物と、コードされたポリペプチドは、遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞での発現には、ｍＲＮＡのスプライシングが含まれる場合がある。

【0169】

「ベクター」とは、挿入されている核酸分子を宿主細胞内及び／または宿主細胞間に移入する核酸分子、特には自己複製核酸分子である。この用語には、ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への挿入（例えば、染色体への組み込み）を行うように主に機能するベクターと、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製を行うように主に機能するベクターの複製と、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写及び／または翻訳を行うように機能する発現ベクターが含まれる。記載したような機能の２つ以上を果たすベクターも含まれる。

【0170】

「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞に導入すると、ポリペプチドに転写及び翻訳できるポリヌクレオチドである。「発現系」とは通常、所望の発現産物を産生するように機能できる発現ベクターで構成された好適な宿主細胞を指す。

【0171】

抗体は、組み換え手段によって生成するのが好ましい。このような方法は、現状の技術において広く知られており、原核細胞及び真核細胞でタンパク質を発現させてから、抗体ポリペプチドを単離して、通常は、薬学的に許容可能な純度まで精製することを含む。タンパク質の発現では、軽鎖と重鎖、またはそれらの断片をコードする核酸を標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母またはＥ．ｃｏｌｉ細胞のような適切な原核または真核宿主細胞で行い、その細胞（上清または溶解後の細胞）から抗体を回収する。二重特異性抗体は、全細胞、細胞溶解液、または部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在してよい。精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィー及び当該技術分野において周知のその他の技術を含む標準的な技術によって、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質を取り除く目的で行う。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。

【0172】

ＮＳ０細胞での発現は、例えば、Ｂａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９－１２３；及びＢａｒｎｅｓ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１－２７０によって説明されている。一過性発現は、例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０（２００２）Ｅ９によって説明されている。可変ドメインのクローニングは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３－３８３７；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５－４２８９；及びＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７－８７によって説明されている。好ましい一過性発現系（ＨＥＫ２９３）は、Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｋ．によって、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１９９９）７１－８３において、ならびにＳｃｈｌａｅｇｅｒ，Ｅ．－Ｊ．によって、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１－１９９で説明されている。

【0173】

原核生物に適する制御配列としては、例えば、プロモーターと、任意に応じてオペレーター配列と、リボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーターと、エンハンサーと、ポリアデニル化シグナルを用いることが知られている。

【0174】

抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地から分離するのが好適である。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、従来の手順を用いて、容易に単離及びシークエンシングされる。ハイブリドーマ細胞は、上記のようなＤＮＡとＲＮＡの供給源としての役割を果たすことができる。このＤＮＡは、単離したら、発現ベクターに挿入してよく、その後、発現ベクターをトランスフェクションしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞など）に、この発現ベクターをトランスフェクションして、その宿主細胞において、組み換えモノクローナル抗体を合成させる。

【0175】

抗体のアミノ酸配列バリアント（または変異体）は、ヌクレオチドの適切な変化を抗体ＤＮＡに導入することによって、またはヌクレオチド合成によって調製する。しかしながら、このような改変は、例えば、上に記載されているように、非常に限られた範囲でのみ行うことができる。例えば、このような改変によって、上記の抗体特性（ＩｇＧアイソタイプ及び標的の結合など）は変化しないが、組み換えによる生成の収量、タンパク質の安定性が向上したり、または精製が促されたりし得る。

【0176】

本発明の一実施形態では、二重特異性抗体の代わりに、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）が使用され、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに対する抗原認識部分と、膜貫通部分と、Ｔ細胞活性化部分を含み、抗原認識部分は、本発明による抗体（ここでは、二重特異性抗体ではない）であることを特徴とする。次に、このようなＣＡＲは通常、前記ＣＡＲをコードする配列を含む、ベクター、好ましくは、レトロウイルスベクターを用いることで、免疫エフェクター細胞（これには「ＣＡＲ Ｔ細胞」という用語が本明細書で使用される）に移される。このようなＣＡＲ Ｔ細胞は次いで、前記免疫療法薬と組み合わせて使用される。

【0177】

コードされる抗体は、定められているように、その抗原結合断片であることもできる。このような「ＢＣＭＡ ＣＡＲ」の構造と生成は、例えば、ＷＯ２０１３１５４７６０、ＷＯ２０１５０５２５３８、ＷＯ２０１５０９０２２９及びＷＯ２０１５０９２０２４で説明されている。

【0178】

一実施形態では、二重特異性抗体の代わりに、
（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）認識部分と、
（ｉｉ）スペーサードメインと、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインと、
を含み、ＢＣＭＡ認識部分が、ＢＣＭＡに特異的に結合するモノクローナル抗体であることを特徴とし、モノクローナル抗体が、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域と、
ａ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｂ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｃ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｄ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｅ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、ならびに
ｆ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、ＣＤＲ１Ｌ及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むことを特徴とする、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはそれぞれのＣＡＲ Ｔ細胞を使用する。

【0179】

Ｔ細胞活性化部分は、いずれかの好適な分子に由来するか、またはその分子から得たいずれかの好適な部分であることができる。一実施形態では、例えば、Ｔ細胞活性化部分は、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、当該技術分野において知られているいずれかの分子に由来するか、またはその分子から得たいずれかの膜貫通ドメインであることができる。例えば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ分子またはＣＤ２８分子から得るか、またはその分子に由来することができる。ＣＤ８は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）のコレセプターとしての役割を果たす膜貫通糖タンパク質であり、主に、細胞傷害性Ｔ細胞の表面に発現する。ＣＤ８の最も一般的な形態は、ＣＤ８アルファ鎖とＣＤ８ベータ鎖で構成される二量体として存在する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞上で発現し、Ｔ細胞の活性化に必要な共刺激シグナルをもたらす。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）とＣＤ８６（Ｂ７．２）のレセプターである。好ましい実施形態では、ＣＤ８アルファとＣＤ２８は、ヒトのものである。膜貫通ドメインに加えて、Ｔ細胞活性化部分はさらに、細胞内（すなわち、細胞質）Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８分子、ＣＤ３ゼータ分子もしくはこれらの改変型、ヒトＦｃレセプターガンマ（ＦｃＲγ）鎖、ＣＤ２７分子、ＯＸ４０分子、４－ＩＢＢ分子、または当該技術分野において知られているその他の細胞内シグナル伝達分子から得るか、またはその分子に由来することができる。上で論じたように、ＣＤ２８は、Ｔ細胞の共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ３ゼータは、ＴＣＲと会合してシグナルを生成するとともに、免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。４－１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られている）は、強力な共刺激シグナルをＴ細胞に伝達して、Ｔリンパ球の分化を促すとともに、Ｔリンパ球の長期的な生存を増進する。一実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、４－１ＢＢ、ＯＸ４０及びＣＤ２７は、ヒトのものである。

【0180】

このようなＣＡＲまたはそれぞれのＣＡＲ Ｔ細胞は、
ａ）本発明による多発性骨髄腫の治療における併用、
ｂ）本発明による多発性骨髄腫の治療方法、
ｃ）本発明による多発性骨髄腫疾患を罹患している患者における多発性骨髄腫細胞溶解を達成するための治療用の組み合わせ
ｄ）本発明による製品、及び
ｅ）本発明による医薬の製造方法
において使用するために、本明細書に記載されている免疫療法薬と一緒である。

【0181】

Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）結合剤は、濃度／腫瘍細胞レセプター占有度依存型の細胞殺傷能が非常に高い（例えば、インビトロ細胞殺傷アッセイでのＥＣ_５０が、ピコモル以下または低ピコモル範囲である。Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００２）。Ｔ細胞二重特異性結合剤（ＴＣＢ）は、従来の単特異性抗体よりもはるかに低い用量で投与する。例えば、ブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３）は、急性リンパ性白血病の治療では、５～１５μｇ／ｍ^２／日の静脈内持続投与量（すなわち、わずか０．３５～０．１０５ｍｇ／ｍ^２／週）で、または、非ホジキンリンパ腫の治療では、６０μｇ／ｍ^２／日で投与し、これらの用量における血清中濃度は、０．５～４ｎｇ／ｍｌの範囲である（Ｋｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１２；Ｔｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１１；Ｇｏｅｂｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１１）。低用量のＴＣＢは、患者において高い有効性を発揮し得るので、二重特異性抗体では、薬物皮下投与が可能であるとともに、臨床現場において好ましい（好ましくは、０．１～２．５、好ましくは２５ｍｇ／ｍ^２／週、好ましくは２５０ｍｇ／ｍ２／週の用量範囲である）ことが想定されている。これらの低い濃度／用量／レセプター占有度でも、ＴＣＢは、かなりの有害イベントを引き起こし得る（Ｋｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１２）。したがって、腫瘍細胞の占有度／被覆度を制御するのが重要である。血清中のＡＰＲＩＬとＢＡＦＦのレベルが高いとともに、変化し得る患者（例えば、多発性骨髄腫患者、Ｍｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｂｌｏｏｄ １０３（８）：３１４８－３１５７）では、それぞれの腫瘍細胞に結合するＴＣＢの数と、腫瘍細胞占有度は、ＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦからかなりの影響を受け得る。しかし、本発明で使用される前記抗体、腫瘍細胞占有度、有効性／安全性をそれぞれ用いることによって、本発明による抗体の用量を増やす必要がないこともある。前記抗体は、ＡＰＲＩＬ／ＢＡＦＦのリガンドの競合による影響を受けないと見られるからである。二重特異性抗体の別の利点は、Ｆｃ部分を含むことに基づくものであり、これにより、Ｆｃ部分を含まないＴＣＢであって、患者の携行するポンプを用いて静脈内持続投与を必要とするＴＣＢ（例えば、ブリナツモマブ）と比べて、排泄半減期が約４～１２日まで長くなり、週に少なくとも１回または２回の投与が可能になる。

【0182】

二重特異性抗体の生物学的特性は、いくつかの研究において、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖとの比較で調査されている。例えば、Ｈ９２９ＭＭ細胞株において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体の２１－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ、４２－ＴＣＢｃｖがＴ細胞リダイレクト型細胞傷害性を誘導する力を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖと比較して測定した（実施例８、表１２、図４）。本発明で使用される抗体を調べたところ、解析から、Ｈ９２９細胞の濃度依存的な殺傷と、ＥＣ５０値はそれぞれ、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖについて割り出したＥＣ５０値よりも高いと分かったことが示され、二重特異性抗体が、ＴＣＢとしてのＭａｂ８３Ａ１０よりも、Ｈ９２９ＭＭ細胞の殺傷を誘導する作用が弱いことが示唆された。驚くべきことに、ＲＰＭＩ－８２２６ＭＭ細胞株と、さらにはＪＪＮ－３細胞株（それぞれ、実施例１０及び１１、表１３、ならびに１４及び１５、図６及び７）でＴ細胞リダイレクト型細胞傷害性を測定したところ、逆の結果が観察され、二重特異性抗体では、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも低いＥＣ５０、すなわち、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも高い能力が示された。本発明者を驚かせたことに、二重特異性抗体では、８３Ａ１０ ＴＣＢｃｖと直接比較したところ、ＭＭ患者から新たに採取した骨髄穿刺液において、下記のようないくつかの利点が見られた（注：考え得る最良の比較を行えるように、全ての骨髄穿刺液においても常に、全てのＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体を同じ濃度で試験した）。

【0183】

－骨髄腫細胞の殺傷力が高かった。すなわち、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの場合よりも低い濃度でも、同じ殺傷率（％）であったとともに、殺傷に関する濃度応答曲線が、左にシフトした（実施例１３、表１８、１９及び２０、図８、９及び１０）。二重特異性抗体では、７つの異なる患者骨髄穿刺液において１ｎＭの濃度でも、ヨウ化プロピジウム陰性生存多発性骨髄腫癌細胞の対照に対する減少率は、７７．１～１００％であった。１ｎＭの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖでは、同じ７つの骨髄穿刺液において、３７．１～９８．３％の減少率しか得られなかった（表２０及び２１）。

【0184】

－二重特異性抗体では、７つの骨髄穿刺液による同じ実験において、試験した最高濃度（１０ｎＭ）で、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも高い最高殺傷率が得られた（表２０及び２１）。

【0185】

－２２－ＴＣＢｃｖ／４２－ＴＣＢｃｖを用いると、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖに応答しない患者が、応答者に変わり得る。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖに対する殺傷応答が観察されなかった２つの骨髄患者試料において、驚くべきことに、本発明による、ＴＣＢとしての抗体によって、殺傷を確認できた（図９Ａ及び９Ｂ）。

【0186】

本発明で使用されるＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＴＣＢは、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＢＣＭＡと、マウス及びラットのＢＣＭＡに結合し、ＣＤ３結合剤が、カニクイザルＣＤ３にも結合する場合には、カニクイザルにおける毒物学的検査に適し、または、ＣＤ３結合剤が、マウス／ラットＢＣＭＡに結合する場合には、マウス／ラットにおける毒物学的検査に適する。驚くべきことに、ｃｙｎｏＢＣＭＡに対する結合親和性は、ヒトＢＣＭＡに対する結合親和性に非常に近い。ＳＰＲを用いて、ヒト及びｃｙｎｏＢＣＭＡに対する結合親和性を測定した（実施例２、表４）。ｃｙｎｏＢＣＭＡに対する親和性をヒトＢＣＭＡに対する親和性で除することによって、測定した親和性データから、ｃｙｎｏ／ヒトギャップ（ｃｙｎｏＢＣＭＡとヒトＢＣＭＡの親和性比、ＫＤ）を算出した（実施例３、表５）。８３Ａ１０では、ｃｙｎｏ／ヒトギャップは１５．３であることが分かった（すなわち、ｃｙｎｏに対する結合親和性は、ヒトＢＣＭＡに対する結合親和性よりも１５．３倍低い）。本発明者らを驚かせたことに、二重特異性抗体のｃｙｎｏ／ヒトギャップは、１５．４～１．７であり、これは８３Ａ１０の場合と同程度であり、または大半において、それよりも良好なｃｙｎｏ／ヒトギャップである（表５）。ＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＴＣＢで用いるＣＤ３結合剤は、カニクイザルＣＤ３に対する交差反応性を有するので、薬物動態と薬力の調査結果をカニクイザルから得ることができる（実施例１６を参照されたい）。また、カニクイザルにおける毒物学的調査によって、ヒトにおける薬理学的作用と毒物学的作用が予測され、カニクイザル機構に対する交差反応性は、患者にとって有益である。本発明で使用されるＢＣＭＡ抗体は、マウスＢＣＭＡにも結合する（例えば、ＳＰＲによって測定した場合のクローン２２及び４２のＫｄは、０．９ｎＭ及び２．５ｎＭである）実施例１．１．１Ａ．４の表２Ｄを参照されたい）。ＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＴＣＢのＣＤ３結合剤は、マウスＣＤ３に対する交差反応性を有さない。

【0187】

要約すると、ＲＰＭＩ－８２２６及びＪＪＮ－３のようなＢＣＭＡ低発現ＭＭ細胞株の殺傷、特に、患者骨髄穿刺液中のＭＭ細胞の殺傷と、加えて、ＢＣＭＡに対する結合親和性における、非常に有利なｃｙｎｏ／ヒトギャップに関する効能と有効性の利点により、本発明で使用される抗体と各ＴＣＢは本質的に、ＭＭ患者の治療用として有望な薬剤となる。加えて、本発明で使用される抗ＢＣＭＡ×ＣＤ３ ＴＣＢｃｖは、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖとして、長い排泄半減期、週に１回の投与（静脈内、皮下）での有効性、凝集傾向が低いかまたは存在しない点のような有利な特性を有するとともに、高い純度と良好な収量で製造できる。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1B】

【表2A】

【表2B】

下記の（２＋１）Ｆｃ含有抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢを作製するために、上記の表２Ｂに示されているそれぞれのコンストラクト／配列番号を使用した。
８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ：４５、４６、４７（×２）、４８（図２Ａ）
２１－ＴＣＢｃｖ：４８、４９、５０、５１（×２）（図２Ａ）
２２－ＴＣＢｃｖ：４８、５２、５３、５４（×２）（図２Ａ）
４２－ＴＣＢｃｖ：４８、５５、５６、５７（×２）（図２Ａ）

【0188】

以下に、本発明の具体的な実施形態を列挙する。
Ｉ．多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む、二重特異性抗体と、サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される、免疫療法薬とであって、前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、二重特異性抗体及び免疫療法薬。

【0189】

ＩＩ．前記免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ1９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、及びアテゾリズマブからなる群から選択されることを特徴とする、実施形態Ｉに記載の、多発性骨髄腫を治療するために併用して使用される、二重特異性抗体及び免疫療法薬。

【0190】

ＩＩＩ．ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、及び
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を、そのような治療を必要とする患者に投与することを特徴とする、多発性骨髄腫の治療方法であって、
前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、方法。

【0191】

二重特異性抗体と免疫療法薬は、治療有効量で使用される。

【0192】

ＩＶ．免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、及びアテゾリズマブからなる群から選択されることを特徴とする、実施形態ＩＩＩに記載の方法。

【0193】

Ｖ．ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、及び
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を含むことを特徴とする、多発性骨髄腫疾患を罹患している患者における多発性骨髄腫細胞溶解を達成するための治療用の組み合わせであって、
前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする、治療用の組み合わせ。

【0194】

二重特異性抗体と免疫療法薬は、治療有効量で使用される。

【0195】

ＶＩ．免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びＭＤＸ－１１０５からなる群から選択されることを特徴とする、実施形態Ｖに記載の治療用の組み合わせ。

【0196】

ＶＩＩ．ａ）ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体、前記第１の結合部分は、薬学的に許容可能な担体において、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とし、
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬、
ｃ）薬学的に許容可能な担体、及び多発性骨髄腫の治療を必要とする対象に前記二重特異性抗体と前記免疫療法薬を併用して投与するための説明書
を含むことを特徴とする、製品。

【0197】

ＶＩＩＩ．免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びＭＤＸ－１１０５からなる群から選択されることを特徴とする、実施形態ＶＩＩに記載の製品。

【0198】

ＩＸ．ａ））ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する第１の結合部分と、ヒトＣＤ３ε（ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合部分とを含む二重特異性抗体であり、前記第１の結合部分は、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ｉ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｉｉ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、または
ｉｉｉ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とし、
ｂ）サリドマイド及びその免疫療法誘導体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体からなる群から選択される免疫療法薬
を用いて、
ｃ）薬学的に許容可能な担体において前記二重特異性抗体と前記免疫療法薬を組み合わせることを特徴とする、医薬の製造方法。

【0199】

二重特異性抗体と免疫療法薬は、治療有効量で使用される。

【0200】

Ｘ．免疫療法薬が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１９、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、ＣＣ－１２２、ＣＣ－２２０、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ニボルマブ、ＭＥＤＩ－０６８０、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ラムブロリズマブ、ＭＤＸ－１１０６、ＢＧＢ－１０８、ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、ｈ４０９Ａ１７、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びＭＤＸ－１１０５からなる群から選択されることを特徴とする、実施形態ＩＸに記載の医薬の製造方法。

【0201】

以下に、本発明による第１の結合部分の具体的実施形態を列挙する。
１．ＢＣＭＡに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域と、
ａ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｂ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｃ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｄ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｅ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、ならびに
ｆ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｈ領域、ＣＤＲ２Ｈ領域、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むことを特徴とする前記抗体。

【0202】

２．ＢＣＭＡに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域と、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域とを含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域と、
ａ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｂ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域または
ｃ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする前記抗体。

【0203】

３．ＶＬ領域として、配列番号１２、１３及び１４のＶＬ領域からなる群から選択したＶＬ領域を含むことを特徴とする、実施形態１または２に記載の抗体。

【0204】

４．ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１２のＶＬ領域を含むことを特徴とする、実施形態１～３のいずれか１項に記載の抗体。

【0205】

５．ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１３のＶＬ領域を含むことを特徴とする、実施形態１～３のいずれか１項に記載の抗体。

【0206】

６．ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１４のＶＬ領域を含むことを特徴とする、実施形態１～３のいずれか１項に記載の抗体。

【0207】

７．ＶＬ領域の４９位のアミノ酸が、アミノ酸のチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びヒスチジン（Ｈ）の群から選択されていることを特徴とする、実施形態１または２に記載の抗体。

【0208】

８．ＶＬ領域の７４位のアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）であることを特徴とする、実施形態７に記載の抗体。

【0209】

９．ＢＣＭＡに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域と、配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域とを含むＶＬ領域と、
ａ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域、
ｂ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域、または
ｃ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする前記抗体。

【0210】

１０．配列番号１２のＶＬ領域と、配列番号３８、３９及び４０のＶＨ領域を含む群から選択したＶＨ領域とを含むことを特徴とする、実施形態９に記載の抗体。

【0211】

１１．ＶＬ領域の４９位のアミノ酸が、アミノ酸のチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びヒスチジン（Ｈ）の群から選択されていることを特徴とする、実施形態９または１０に記載の抗体。

【0212】

１２．ＶＬ領域の７４位のアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）であることを特徴とする、実施形態９または１０に記載の抗体。

【0213】

１３．カニクイザルＢＣＭＡにも特異的に結合するとともに、ＣＤ３εに特異的に結合する追加のＦａｂ断片を含むことを特徴とする、実施形態１～１２のいずれか１項に記載の抗体。

【0214】

１４．Ｆｃを有するかまたはＦｃ部分を有さない抗体であることを特徴とする、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の抗体。

【0215】

以下に、本発明による二重特異性抗体の具体的実施形態を列挙する。
１５．ＢＣＭＡとＣＤ３εに特異的に結合する二重特異性抗体であって、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域と、
ａ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｂ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｃ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｄ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｅ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、ならびに
ｆ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｈ領域、ＣＤＲ２Ｈ領域、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むことを特徴とする前記二重特異性抗体。

【0216】

１６．ヒトＢＣＭＡ（さらには「ＢＣＭＡ」ともいう）とヒトＣＤ３ε（さらには「ＣＤ３」ともいう）という細胞外ドメインである２つの標的に特異的に結合する二重特異性抗体であって、配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域と、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域及び配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域、ならびに
ａ）配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｂ）配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域または
ｃ）配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする前記抗体。

【0217】

１７．ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含むことを特徴とする、実施形態１５または１６に記載の二重特異性抗体。

【0218】

１８．ＢＣＭＡ ＶＬが、配列番号１２、１３及び１４のＶＬ領域からなる群から選択されていることを特徴とする、実施形態１５～１６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0219】

１９．ＢＣＭＡ ＶＨ領域として、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１２のＶＬ領域を含むか、ＢＣＭＡ ＶＨとして、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１３のＶＬ領域を含むか、またはＢＣＭＡ ＶＨとして、配列番号１０のＶＨ領域を含み、ＶＬ領域として、配列番号１４のＶＬ領域を含むことを特徴とする、実施形態１４～１８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0220】

２０．ＶＬ領域の４９位のアミノ酸が、アミノ酸のチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びヒスチジン（Ｈ）の群から選択されていることを特徴とする、実施形態１５または１９のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0221】

２１．ＶＬ領域の７４）位のアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）であることを特徴とする、実施形態１５～２０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0222】

２２．ＢＣＭＡとＣＤ３に特異的に結合する二重特異性であって、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域を含むＶＨ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域と、配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域と、
ａ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域、
ｂ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域、または
ｃ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むＶＬ領域とを含むことを特徴とする前記抗体。

【0223】

２３．配列番号１２のＶＬ領域と、配列番号３８、３９及び４０のＶＨ領域を含む群から選択したＶＨ領域とを含むことを特徴とする、実施形態２２に記載の二重特異性抗体。

【0224】

２４．ＶＬ領域の４９位のアミノ酸が、アミノ酸のチロシン（Ｙ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びヒスチジン（Ｈ）の群から選択されていることを特徴とする、実施形態２２または２３に記載の二重特異性抗体。

【0225】

２５．ＶＬ領域の７４位のアミノ酸が、トレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）であることを特徴とする、実施形態２２～２４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0226】

２６．本発明による抗ＢＣＭＡ抗体と、抗ＣＤ３抗体とを含むことを特徴とし、
ａ）実施形態１～７のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖と重鎖と、
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する抗体の軽鎖と重鎖であり、可変ドメインのＶＬとＶＨ、または定常ドメインのＣＬとＣＨ１が互いに入れ替わっている、実施形態１５～２５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0227】

２７．抗ＣＤ３抗体部分のＦａｂ断片を１個以下と、抗ＢＣＭＡ抗体部分のＦａｂ断片を２個以下と、Ｆｃ部分を１個以下含むことを特徴とする、実施形態１５～２６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0228】

２８．前記ＣＤ３抗体Ｆａｂ断片のＣ末端と、前記ＢＣＭＡ抗体Ｆａｂ断片の１つのＣ末端とに、そのＮ末端が連結しているＦｃ部分を含むことを特徴とする、実施形態１５～２７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0229】

２９．前記抗ＢＣＭＡ抗体（ＢＣＭＡ抗体部分）の第２のＦａｂ断片であって、前記二重特異性抗体の前記抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３抗体部分）の前記Ｆａｂ断片のＮ末端に、Ｃ末端が連結されている前記第２のＦａｂ断片を含むことを特徴とする、実施形態１５～２８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0230】

３０．前記抗ＣＤ３抗体Ｆａｂ断片のＶＬドメインが、前記第２の抗ＢＣＭＡ抗体Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインに連結されていることを特徴とする、実施形態２９に記載の二重特異性抗体。

【0231】

３１．抗ＣＤ３抗体部分の可変ドメインのＶＨ（さらには「ＣＤ３ ＶＨ」という）が、重鎖ＣＤＲ１として、配列番号１の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ２として、配列番号２の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ３として、配列番号３の重鎖ＣＤＲを含み、抗ＣＤ３抗体部分の可変ドメインＶＬ（さらには「ＣＤ３ ＶＬ」という）が、軽鎖ＣＤＲ１として、配列番号４の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ２として、配列番号５の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ３として、配列番号６の軽鎖ＣＤＲを含むことを特徴とする、実施形態１５～３０のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0232】

３２．抗ＣＤ３ε抗体部分の可変ドメインが、配列番号７及び８のものであることを特徴とする、実施形態１５～３１のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。

【0233】

３３．ヒトＢＣＭＡとヒトＣＤ３εの細胞外ドメインである２つの標的に特異的に結合する二重特異性抗体であって、
ａ）請求項１～７のいずれか１項に記載の第１の抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖と、
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、前記第２の抗体の第２の軽鎖の可変ドメインＶＬと第２の重鎖の可変ドメインＶＨが、互いに入れ替わっている第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含むことを特徴とし、
ｃ）ａ）の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ａ）の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸と、２１３位のアミノ酸が独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている（Ｋａｂａｔによる番号付け）（例えば、図１Ａ、２Ａ、２Ｃ、３Ａ、３Ｃを参照されたい）ことを特徴とする前記抗体。

【0234】

３４．加えて、前記第１の抗体のＦａｂ断片（さらには「ＢＣＭＡ－Ｆａｂ」ともいう）を含み、前記ＢＣＭＡ－Ｆａｂの定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、前記ＢＣＭＡ－Ｆａｂの定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸と、２１３位のアミノ酸が独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている（Ｋａｂａｔによる番号付け）（例えば、図２Ａ、２Ｃを参照されたい）ことを特徴とする、請求項３３に具体的に記載の二重特異性抗体。

【0235】

３５．ヒトＢＣＭＡとヒトＣＤ３εの細胞外ドメインである２つの標的に特異的に結合する二重特異性抗体であって、
ａ）請求項１～７のいずれか１項に記載の第１の抗体の第１の軽鎖と第１の重鎖と、
ｂ）ＣＤ３に特異的に結合する第２の抗体の第２の軽鎖及び第２の重鎖であって、第２の抗体の前記第２の軽鎖の可変ドメインＶＬと第２の重鎖の可変ドメインＶＨが、互いに入れ替わっている前記第２の軽鎖及び第２の重鎖とを含むことを特徴とし、
ｃ）ｂ）の前記第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、ｂ）の前記第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸と、２１３位のアミノ酸が独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている（Ｋａｂａｔによる番号付け）前記抗体。

【0236】

３６．ヒトＢＣＭＡとヒトＣＤ３εの細胞外ドメインである２つの標的に特異的に結合する二重特異性抗体であって、
ｉ）配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５１（２×）（セット１ 抗体２１のＴＣＢ）と、
ｉｉ）配列番号４８、配列番号５２、配列番号５３及び配列番号５４（２×）（セット２ 抗体２２のＴＣＢ）と、
ｉｉｉ）配列番号４８、配列番号５５、配列番号５６及び配列番号５７（２×）（セット３ 抗体４２のＴＣＢ）と、
のポリペプチドからなる群から選択した、重鎖と軽鎖のセットを含むことを特徴とする前記抗体。

【0237】

３７．ＢＣＭＡに対する抗原認識部分と、Ｔ細胞活性化部分とを含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはそれぞれのＣＡＲ Ｔ細胞であって、前記抗原認識部分が、実施形態１～１４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片であることを特徴とする前記キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはそれぞれのＣＡＲ Ｔ細胞。

【0238】

３８．（ｉ）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）認識部分と、
（ｉｉ）スペーサードメインと、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインと、
を含むことを特徴とする、実施形態３７に記載のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはそれぞれのＣＡＲ Ｔ細胞。

【0239】

３９．前記抗原認識部分が、ＢＣＭＡに特異的に結合するモノクローナル抗体または抗体断片であることを特徴とし、配列番号１７のＣＤＲ３Ｈ領域と、配列番号２０のＣＤＲ３Ｌ領域と、
ａ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２３のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２４のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｂ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２５のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２６のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｃ）配列番号２１のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号２７のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号２８のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｄ）配列番号２９のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３０のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、
ｅ）配列番号３４のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３５のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域、ならびに
ｆ）配列番号３６のＣＤＲ１Ｈ領域及び配列番号３７のＣＤＲ２Ｈ領域と、配列番号３１のＣＤＲ１Ｌ領域及び配列番号３２のＣＤＲ２Ｌ領域
の群から選択した、ＣＤＲ１Ｈ領域、ＣＤＲ２Ｈ領域、ＣＤＲ１Ｌ領域及びＣＤＲ２Ｌ領域の組み合わせとを含むことを特徴とする、実施形態３７または３８に記載のキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはそれぞれのＣＡＲ Ｔ細胞。

【0240】

一実施形態では、二重特異性抗体の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、４０５ｎｍにおけるＯＤとして測定した場合、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって、ＡＰＲＩＬの非存在下における前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合と比べて２０％超低下せず、ＡＰＲＩＬ依存的なＮＦ－κＢの活性化をＡＰＲＩＬと比べて２０％超変化させず、前記抗体の非存在下と比べて、ＡＰＲＩＬの非存在下におけるＮＦ－κＢの活性化を２０％超変化させない。

【0241】

一実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイで、４５０ｎｍにおけるＯＤとして測定した場合に、６．２５ｎＭの濃度における二重特異性抗体の結合は、１４０ｎｇ／ｍｌのマウスＡＰＲＩＬによって、ＡＰＲＩＬの非存在下における前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合と比べて１０％超低下せず、好ましくは１％超低下しない。ＥＬＩＳＡアッセイで、４５０ｎｍにおけるＯＤとして測定した場合に、５０ｎＭの濃度における前記抗体の結合は、１４０ｎｇ／ｍｌのマウスＡＰＲＩＬによって、ＡＰＲＩＬの非存在下における前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合と比べて１０％超低下しない。

【0242】

一実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイで、４０５ｎｍにおけるＯＤとして測定した場合に、前記抗体の結合は、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって、かつ１００ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦによって、それぞれＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦの非存在下における前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合と比べて２０％超低下せず、この抗体は、ＡＰＲＩＬ単独の場合と比べて、ＡＰＲＩＬ依存的なＮＦ－κＢの活性化を２０％超変化させず、ＢＡＦＦ単独の場合と比べて、ＢＡＦＦ依存的なＮＦ－κＢの活性化を２０％超変化させず、前記抗体の存在しない状態と比べて、ＢＡＦＦとＡＰＲＩＬの非存在下におけるＮＦ－κＢの活性化を２０％超変化させない。

【0243】

一実施形態では、前記ＥＬＩＳＡで測定した場合、前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合は、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって、１５％超低下せず、前記ＥＬＩＳＡで測定した場合、１０００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって２０％超低下せず、前記ＥＬＩＳＡで測定した場合、１０００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって１５％超低下しない。

【0244】

一実施形態では、前記抗体のヒトＢＣＭＡへの結合は、前記ＥＬＩＳＡで測定した場合、１００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって低下せず、１００ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦによって、１５％超低下せず、前記ＥＬＩＳＡで測定した場合、１０００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって低下せず、１０００ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦによって、２０％超低下せず、前記ＥＬＩＳＡで測定した場合、１０００ｎｇ／ｍｌのＡＰＲＩＬによって低下せず、１０００ｎｇ／ｍｌのＢＡＦＦによって１５％超低下しない。

【0245】

一実施形態では、二重特異性抗体は、ＡＰＲＩＬ依存型のＮＦ－ｋＢの活性化を１５％超変化させず、ＢＡＦＦ依存型のＮＦ－ｋＢの活性化を１５％変化させず、ＡＰＲＩＬとＢＡＦＦの非存在下におけるＮＦ－κＢの活性化を１５％超変化させない。

【0246】

一実施形態では、２．５μｇ／ｍｌの濃度でのＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦのそれぞれの存在または非存在下で、５ｎＭ、好ましくは５０ｎＭ及び１４０ｎＭの濃度における本抗体のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８（商標））への結合として測定した場合、本抗体のＢＣＭＡへの結合は、ＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦのそれぞれの非存在下における前記抗体のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞への結合と比べて、ＡＰＲＩＬによって低下せず、ＢＡＦＦによって２５％超、２０％超及び１０％超低下しない。

【0247】

一実施形態では、下記の実施例、配列表及び図は、本発明、添付の特許請求の範囲で定められている真の範囲の理解を助ける目的で示されている。本発明の趣旨から逸脱せずに、定められている手順を修正できることが分かる。

【0248】

材料及び一般的な方法
組み換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９で説明されているように、標準的な方法を用いて、ＤＮＡを操作した。分子生物学的な試薬は、メーカーの指示に従って用いた。ヒト免疫グロブリンの軽鎖と重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２に示されている。抗体鎖のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，（１９９１）に従って、番号付けと言及を行った。

【0249】

遺伝子の合成
ａ）化学合成によって作製したオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを調製した。ＰＣＲ増幅を含め、オリゴヌクレオチドをアニーリング及びライゲーションすることによって、特有の制限エンドヌクレアーゼ切断サイトに挟まれた長さ６００～１８００ｂｐの遺伝子セグメントをアセンブリーしてから、示されている制限部位、例えばＫｐｎｌ／ＳａｄまたはＡｓｃｌ／ＰａＣｌを介して、ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベースのｐＧＡ４クローニングベクターにクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングによって確認した。遺伝子合成断片は、所定の仕様によって、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に依頼した。

【0250】

ｂ）必要に応じて、所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いたＰＣＲによって生成するか、または自動遺伝子合成によって、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ産物から、Ｇｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に合成してもらうかのいずれかであった。特有の制限エンドヌクレアーゼ切断サイトに挟まれた遺伝子セグメントを標準的な発現ベクターまたはさらなる解析用のシークエンシングベクターにクローニングした。市販のプラスミド精製キットを用いて、形質転換細菌から、プラスミドＤＮＡを精製した。プラスミド濃度は、ＵＶ分光法によって割り出した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングによって確認した。遺伝子セグメントを好適な制限部位とともに設計して、それぞれの発現ベクターにサブクローニングを可能にした。必要に応じて、真核細胞での分泌のためにタンパク質をターゲティングするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列によって、タンパク質コード遺伝子を設計した。

【0251】

ＤＮＡ配列の決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖シークエンシングによって決定した。

【0252】

ＤＮＡとタンパク質の配列解析と配列データ管理
配列のマッピング、解析、アノテーション及び例示には、Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウェアパッケージバージョン９．２を用いた。

【0253】

発現ベクター
ａ）下に説明されているように、記載されている抗体鎖を含む融合遺伝子をＰＣＲ及び／または遺伝子合成によって生成し、既知の組み換え方法及び組み換え技術を用いて、該当する核酸セグメントを連結することによって、例えば、それぞれのベクターにおける独特の制限部位を用いてアセンブルした。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡシークエンシングによって検証した。一過性トランスフェクションのために、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ培養物から調製したプラスミドによって、大量のプラスミドを調製する（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）。

【0254】

ｂ）抗ＢＣＭＡ抗体発現ベクターの作製のために、哺乳動物細胞株での発現用に最適化されたそれぞれの汎用レシピエント発現ベクターに事前に挿入したヒトＩｇＧ１定常重鎖またはｈｕｍＩｇＧ１定常軽鎖のいずれかとインフレームで、重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列の可変領域をサブクローニングした。抗体発現は、ＣＭＶエンハンサーとＭＰＳＶプロモーターを含むキメラＭＰＳＶプロモーターに続いて、５’ＵＴＲ、イントロン及びＩｇカッパＭＡＲエレメントによって駆動する。ＣＤＳの３’末端で、合成ｐｏｌｙＡシグナル配列によって、転写を終結させる。全てのベクターは、真核細胞での分泌のためにタンパク質をターゲティングするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を有する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＥＢＮＡ発現細胞でのエピソーマルプラスミドの複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。

【0255】

ｃ）ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ベクターの作製用として、ＩｇＧ１由来の二重特異性分子は少なくとも、ＣＤ３とＢＣＭＡという２つの別個の抗原決定基に特異的に結合できる２つの抗原結合部分からなる。抗原結合部分は、可変領域と定常領域をそれぞれ含む重鎖と軽鎖で構成されたＦａｂ断片である。Ｆａｂ断片の少なくとも１つは、ＶＨとＶＬが置き換えられた「クロスｆａｂ」断片であった。Ｆａｂ断片内のＶＨとＶＬを置き換えることにより、異なる特異性のＦａｂ断片が、同じドメイン配列を有さないようにする。この二重特異性分子デザインは、ＣＤ３に関しては一価であり、ＢＣＭＡに関しては二価であり、一方のＦａｂ断片は、内側のクロスＦａｂのＮ末端に融合した（２＋１）。この二重特異性分子は、その分子の半減期を長くするために、Ｆｃ部分を含んでいた。このコンストラクトの概略図が図２に示されており、このコンストラクトの好ましい配列は、配列番号３９～５２に示されている。これらの分子は、ポリマーベースの溶液を用いて、哺乳動物発現ベクターを、懸濁液で増殖したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクションすることによって作製する。２＋１クロスＦａｂ－ＩｇＧ コンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：２：１：１の比（「ベクターＦｃ（ノブ）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖クロスＦａｂ」：「ベクター重鎖クロスＦａｂ」）でトランスフェクションした。

【0256】

細胞培養技術
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃで説明されているような標準的な細胞培養技術を使用する。

【0257】

ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ系）での一過性発現
それぞれの哺乳動物発現ベクターをＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞に一過性にコトランスフェクションし、ポリマーベースの溶液を用いて、その細胞を懸濁液で培養することによって二重特異性抗体を発現させた。６ｍＭのＬ－グルタミンを添加したＥｘ－Ｃｅｌｌ培地に、トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を１ｍＬ当たり１５０万個の生存細胞で播種した。最終産物の体積１ｍＬごとに、２００万個の生存細胞を遠心分離した（５分、２１０×ｇ）。その上清を吸引除去し、その細胞を１００μＬのＣＤ ＣＨＯ培地に再懸濁した。１００μＬのＣＤ ＣＨＯ培地において１μｇのＤＮＡ（重鎖：改変重鎖：軽鎖：改変軽鎖の比＝１：１：２：１）を混合することによって、最終産物の体積１ｍＬごとのＤＮＡを調製した。ポリマーベースの溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を０．２７μＬ加えた後、その混合物を１５秒ボルテックスし、室温で１０分静置した。１０分後、再懸濁した細胞とＤＮＡ／ポリマーベースの溶液の混合物を合わせてから、適切な容器に移し、その容器を振とう装置（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れた。３時間のインキュベート時間の後、６ｍＭのＬ－グルタミンと、１．２５ｍＭのバルプロ酸と、１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）とを添加したＥｘ－Ｃｅｌｌ培地８００μＬを、最終産物の体積１ｍＬごとに加えた。２４時間後、供給液７０μＬを最終産物の体積１ｍＬごとに加えた。７日後、または細胞の生存率が７０％以下になったら、細胞を上清から遠心分離及び滅菌ろ過によって分離した。親和性工程と１回または２回の研磨工程（陽イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーであった）によって、抗体を精製した。必要なときには、追加の研磨工程を用いた。組み換え抗ＢＣＭＡヒト抗体と二重特異性抗体は、ポリマーベースの溶液を用いて、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクションすることによって、懸濁液中で作製した。この細胞には、形態に応じて、２つまたは４つのベクターをトランスフェクションした。ヒトＩｇＧ１の場合には、一方のプラスミドが重鎖をコードし、もう一方のプラスミドが軽鎖をコードした。二重特異性抗体の場合には、４つのプラスミドをコトランスフェクションした。これらのうちの２つは、２つの異なる重鎖をコードし、残りの２つは、２つの異なる軽鎖をコードした。６ｍＭのＬ－グルタミンを添加したＦ１７培地に、トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を１ｍＬ当たり１５０万個の生存細胞で播種した。

【0258】

タンパク質の定量
抗体の０．１％溶液の吸光度の理論値を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、抗体濃度の定量を行った。この値は、アミノ酸配列をベースとし、ＧＰＭＡＷというソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ ｄａｔａ）によって計算した。

【0259】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔというゲル系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの指示に従って使用する。具体的には、１０％または４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）と、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔランニングバッファー添加剤を含む）またはＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用する。

【0260】

タンパク質の精製
プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによる精製
親和性工程では、６ＣＶの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。同じバッファーによる洗浄工程後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）による溶出工程によって、抗体をカラムから溶出させた。所望の抗体を含む画分を０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）によってすぐに中和し（１：１０）、プールし、遠心分離によって濃縮した。この濃縮物を滅菌ろ過し、陽イオン交換クロマトグラフィー及び／またはサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに処理した。

【0261】

陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
陽イオン交換クロマトグラフィー工程では、濃縮したタンパク質を、親和性工程で用いた溶出バッファーによって１：１０で希釈し、陽イオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に充填した。平衡化バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス（ｐＨ５．０））と洗浄バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５．０））での２回の洗浄工程の後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ８．５）を用いたグラジエントでタンパク質を溶出させた。所望の抗体を含む画分をプールし、遠心分離によって濃縮し、滅菌ろ過し、サイズ排除工程でさらに処理した。

【0262】

解析サイズ排除クロマトグラフィーによる精製
サイズ排除工程では、濃縮したタンパク質をＸＫ１６／６０ ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と、処方バッファーとしてのＴｗｅｅｎ２０を含むかまたは含まない２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）に注入した。単量体を含む画分をプールし、遠心分離によって濃縮し、滅菌バイアルに滅菌ろ過した。

【0263】

純度と単量体含有率の測定
最終的なタンパク質調製物の純度は、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））によって、単量体含有率は、ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬという解析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ））によって、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムのｐＨ６．７のバッファーにおいて割り出した。

【0264】

ＬＣ－ＭＳ解析による分子量の確認
糖鎖除去
分子の均一な調製を確認するために、最終的なタンパク質溶液をＬＣ－ＭＳ解析によって解析した。糖鎖によって付与される不均一性を取り除くために、コンストラクトをＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理した。したがって、２Ｍのトリス２μｌを濃度０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質２０μｇに加えることによって、タンパク質溶液のｐＨをｐＨ７．０に調整した。ＰＮＧａｓｅＦを０．８μｇ加えて、１２時間、３７℃でインキュベートした。

【0265】

ＬＣ－ＭＳ解析－オンライン検出
ＴＯＦ６４４１という質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）に接続したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１２００で、ＬＣ－ＭＳ法を行った。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム、ＰＲ１０００－８（粒径８μｍ、４．６×２５０ｍｍ、カタログ番号７１９５１０）で、クロマトグラフィーによる分離を行った。溶離液Ａは、水中の５％のアセトニトリルと０．０５％（ｖ／ｖ）のギ酸、溶離液Ｂは、９５％のアセトニトリルと、５％の水と、０．０５％のギ酸であった。流速は１ｍｌ／分であり、分離は、４０℃で、上記のような処理によって得たタンパク質試料６μｇ（１５μｌ）によって行った。

【表A】

【0266】

最初の４分間は、溶出液を廃棄物入れに流して、質量分析計を塩の混入から保護した。ＥＳＩ源は、乾燥ガス流量１２ｌ／分、温度３５０℃、ネブライザー圧６０ｐｓｉで稼働させた。ＭＳスペクトルは、正イオンモードの使用で、フラグメンター電圧３８０Ｖ、質量範囲７００～３２００ｍ／ｚを用いて得た。ＭＳデータは、計器のソフトウェアによって、４～１７分で得た。

【0267】

ヒトＰＢＭＣの血液からの単離
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、地元の血液バンクまたは健常なヒトドナーの新鮮な血液から得た濃縮リンパ球調製物（バフィーコート）から、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅによる密度遠心分離によって調製した。簡潔に述べると、血液を滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅグラジエント（Ｓｉｇｍａ、Ｈ８８８９）上に慎重に重層した。３０分、４５０×ｇにて室温で遠心分離後（ブレーキはオフにした）、界面相を含め、ＰＢＭＣ上の血漿部分を廃棄した。ＰＢＭＣを新たな５０ｍｌのファルコンチューブに移し、そのチューブにＰＢＳを充填して、総体積を５０ｍｌにした。この混合物を室温で１０分、４００×ｇで遠心分離した（ブレーキはオンにした）。上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（４℃、１０分間、３５０×ｇでの遠心分離工程）。得られたＰＢＭＣ集団を自動（ＶｉＣｅｌｌ）で計数し、アッセイを開始するまで、インキュベーターにおいて、１０％のＦＣＳと１％のＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｋ０３０２）とを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃において、５％ ＣＯ_２で保存した。

【0268】

一次カニクイザルＰＢＭＣのヘパリン処理血液からの単離
下記のように、健常なカニクイザルドナーの新鮮な血液から、密度遠心分離によって、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。ヘパリン処理血液を滅菌ＰＢＳによって１：３で希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地（Ａｘｏｎ Ｌａｂ＃１１１４５４５）を滅菌ＰＢＳで９０％まで希釈した。２倍量の希釈血液を１倍量の希釈密度グラジエント上で重層し、ＰＢＭＣ画分を遠心分離によって３０分、５２０×ｇで、ブレーキなしで、室温で分離した。ＰＢＭＣバンドを新たな５０ｍｌのファルコンチューブに移し、滅菌ＰＢＳで遠心分離によって１０分、４００×ｇにおいて４℃で洗浄した。低速遠心分離を１回行って、血小板を除去し（１５分、１５０×ｇ、４℃）、得られたＰＢＭＣ集団を自動で計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、すぐにさらなるアッセイで使用した。

【実施例】

【0269】

実施例１：抗ＢＣＭＡ抗体の作製
実施例１．１：抗原とツール試薬の作製
実施例１．１．１：組み換え可溶性ヒトＢＣＭＡ細胞外ドメイン
ファージディスプレイ選択の際に抗原として用いるヒト、カニクイザル及びマウスＢＣＭＡの細胞外ドメインをＮ末端単量体Ｆｃ融合体として、ＨＥＫ ＥＢＮＡ細胞で一過性に発現させ、ビオチンリガーゼＢｉｒＡの共発現を介して、レセプター鎖（Ｆｃノブ１５鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端にあるａｖｉタグ認識配列において、インビボで部位特異的にビオチン化した。ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインは、４位のメチオニンから５３位のアスパラギンまで、カニクイザルＢＣＭＡの細胞外ドメインは、４位のメチオニンから５２位のアスパラギンまでを含んでいた。これらをＮ末端でヒトＩｇＧ１のヒンジに融合して、ノブ・イントゥ・ホール技術によって、未融合のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分（ホール鎖）とヘテロ二量化するのを可能にした。

【0270】

実施例１．１．１Ａ：成熟による抗ＢＣＭＡ抗体の作製
１．１．１Ａ．１ ライブラリーと選択
８３Ａ１０抗体に基づき、２つのライブラリーを構築した。これらのライブラリーを軽鎖（８３Ａ１０Ｌ１／Ｌ２）のＣＤＲ１及びＣＤＲ２または重鎖（８３Ａ１０Ｈ１／Ｈ２）のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のいずれかにおいてランダム化する。これらの各ライブラリーは、増幅とアセンブルという続く２つの工程によって構築した。最終的なアセンブル産物は、クローン８３Ａ１０のプラスミド調製に基づき、同様に処理したアクセプターベクターとともに、８３Ａ１０Ｌ１／Ｌ２ライブラリーではＮｃｏＩ／ＢｓｉＷＩ、８３Ａ１０Ｈ１／Ｈ２ライブラリーではＭｕｎＩ及びＮｈｅＩで消化した。それぞれのライブラリーのために、消化済みランダム化（部分的）Ｖドメインと、消化済みアクセプターベクター（複数可）を、ａ．ｍ．８３Ａ１０ Ｌ１／Ｌ２ライブラリー（３／１０）、８３Ａ１０ Ｈ１／Ｈ２ライブラリー（３／１０）という量（ｖドメインの量（μｇ）／ベクターの量（μｇ））でライゲーションし、８３Ａ１０ Ｌ１／Ｌ２ライブラリーと８３Ａ１０ Ｈ１／Ｈ２ライブラリーの精製済みライゲーション体をそれぞれプールして、２つの各ライブラリーにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の１５個の形質転換体に用いて、８３Ａ１０ Ｌ１／Ｌ２ライブラリーでは、２．４４×１０^１０個、ａ．ｍ．８３Ａ１０ Ｈ１／Ｈ２ライブラリーでは、１．４×１０^１０個という最終的なライブラリーサイズを得た。これらのＦａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、精製した。

【0271】

１．１．１Ａ．２ クローンの選択
選択は、Ｆｃとａｖｉタグの上流にクローニングしたヒトまたはｃｙｎｏ Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）の細胞外ドメインに対して行った。選択前に、Ｆｃ除去物質をニュートラアビジンプレートに、５００ｎＭの濃度でコーティングした。選択は、下記のパターンに従って行った。

【0272】

１）固定化したＦｃ除去物質に、ライブラリー８３Ａ１０ Ｌ１／Ｌ２ライブラリーまたは８３Ａ１０ Ｈ１／Ｈ２ライブラリーの約１０^１２個のファージミド粒子を１時間結合させる。２）（ライブラリー及び選択ラウンドに応じて、）ライブラリー８３Ａ１０ Ｌ１／Ｌ２ライブラリーまたは８３Ａ１０ Ｈ１／Ｈ２ライブラリーの未結合のファージミド粒子を５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭまたは２ｎＭのヒトまたはｃｙｎｏＢＣＭＡに２０分移す。３）磁気ストレプトアビジンビーズを１０分加える。４）１０×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０と１０×１ｍｌのＰＢＳを用いて、磁気ストレプトアビジンビーズを洗浄する。５）１００ｍＭのＴＥＡ（トリエチルアミン）１ｍｌを１０分加えることによって、ファージ粒子を溶出し、１Ｍのトリス（登録商標）／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を５００ｕｌ加えることによって中和する。６）対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞を再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３に感染させてから、次の選択ラウンドでの使用のために、続いてファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿を行う。

【0273】

選択は、３ラウンドにわたって行い、条件は、２つのライブラリーのそれぞれにおいて５つのストリームラインで、個別に調節した。詳細には、選択パラメーターは以下のとおりである。

【0274】

ストリームライン１（ラウンド１では、５０ｎＭのｈｕＢＣＭＡ、ラウンド２では、２５ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡ、ラウンド３では１０ｎＭのｈｕＢＣＭＡ）、
ストリームライン２（ラウンド１では、５０ｎＭのｈｕＢＣＭＡ、ラウンド２では、１０ｎＭのｈｕＢＣＭＡ、ラウンド３では、２ｎＭのｈｕＢＣＭＡ）、
ストリームライン３（ラウンド１では、５０ｎＭのｈｕＢＣＭＡ、ラウンド２では、２５ｎＭのｈｕＢＣＭＡ、ラウンド３では、１０ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡ）、
ストリームライン４（ラウンド１では、５０ｎＭのｈｕＢＣＭＡ、ラウンド２では、２５ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡ、ラウンド３では、１０ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡ）、
ストリームライン５（ラウンド１では、５０ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡ、ラウンド２では、２５ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡ、ラウンド３では、１０ｎＭのｃｙｎｏＢＣＭＡ）。

【0275】

Ｍａｂ２１ ＢＣＭＡ抗体、Ｍａｂ２２ ＢＣＭＡ抗体、Ｍａｂ３３ ＢＣＭＡ抗体及びＭａｂ４２ ＢＣＭＡ抗体の重鎖は、ｃｙｎｏＢＣＭＡのみを用いたストリームライン５に由来していた。

【0276】

１．１．１Ａ．３ スクリーニング方法
個々のクローンを１ｍｌの培養物として、９６ウェルの形態において細菌で発現させ、上清に対してＥＬＩＳＡによるスクリーニングを行った。特異的結合剤は、ヒトＢＣＭＡ及びｃｙｎｏＢＣＭＡにおいては、５×バックグラウンドよりもシグナルが高く、Ｆｃ除去物質においては、３×バックグラウンドよりもシグナルが低いものとして定めた。ニュートラアビジン９６ウェルストリッププレートを１０ｎＭのｈｕＢＣＭＡ、１０ｎＭのｃｙＢＣＭＡまたは５０ｎＭのＦｃ除去物質でコーティングしてから、Ｆａｂ含有細菌上清を加え、二次抗体の抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰを用いることによって、Ｆｌａｇタグを介して、特異的に結合したＦａｂを検出した。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを１ｍｌの培養物として、９６ウェルの形態において、細菌で発現させ、上清に対して、動態スクリーニング実験のＰｒｏｔｅＯｎを行った。５００個の陽性クローンが同定され、その大半の親和性は同程度であった。

【0277】

１．１．１Ａ．４ 可溶性ＦａｂとＩｇＧによる表面プラズモン共鳴スクリーニング
７０個のクローンをさらにＳＰＲによって試験した。全ての実験は、２５℃で、ランニングバッファーとしてのＰＢＳＴ（１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）を用いて行った。ＧＬＣ及びＧＬＭセンサーチップを備えたＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサーと、カップリング試薬（１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、スルホ－Ｎ－ヒロドキシスクシンイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミンプロピル）－カルボジイミドヒドロクロライド［ＥＤＣ］及びエタノールアミン）は、Ｂｉｏｒａｄ Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。固定化は、３０μｌ／分で、ＧＬＭチップ上に行った。下記の標準的なアミンカップリング手順を用いて、ｐＡｂ（ヤギ）抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２特異的Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を垂直方向にカップリングした。６個の全てのリガンドチャネルを５分間、ＥＤＣ（２００ｍＭ）とスルホ－ＮＨＳ（５０ｍＭ）の混合物で活性化した。表面が活性化したらすぐに、ｐＡｂ（ヤギ）抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２特異的抗体（５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５）を６個の全てのチャネルにわたって５分間注入した。最終的に、１Ｍのエタノールアミン－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を５分注入することによって、チャネルをブロックした。最終的な固定化レベルは、全てのチャネルにおいて同程度で、１１０００～１１５００ＲＵの範囲であった。５つの別個の水平チャネル全体に沿って（３０μｌ／分で）５分間同時に注入することによって、Ｆａｂバリアントをｅ．ｃｏｌｉ上清から捕捉して、上清中のＦａｂの濃度に応じて、２００～９００ＲＵの範囲のレベルを得て、馴化培地を６個目のチャネルに沿って注入して、二重参照目的で『インライン』ブランクを用意した。ヒトＢＣＭＡ、ｃｙｎｏＢＣＭＡ及びマウスＢＣＭＡの希釈系列を３分間、垂直チャネルに沿って注入することによって（５０ｎＭ／分、１０ｎＭ／分、２ｎＭ／分、０．４ｎＭ／分、０．０８ｎＭ／分、０ｎＭ／分、５０μｌ／分）、１ショットの動態測定を行った。解離を５分間モニタリングした。ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ．２．１で動態データを解析した。反応スポットデータの処理には、インラインバッファーブランクを用いて、インタースポットリファレンスとダブルリファレンス工程を適用することを含めた（Ｍｙｓｚｋａ，１９９９）。マストランスポートなしに、１ショットの注入を繰り返して得た処理データを単純１：１ラングミュア結合モデルに当てはめた（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。

【0278】

６ウェル形態における、ＨＥＫ産生物の上清由来のＩｇＧの測定のために、５つの別個の水平チャネル全体に沿って（３０μｌ／分で）５分間同時に注入することによって、ＩｇＧバリアントをＨＥＫ２９３上清から捕捉して、２００～４００ＲＵの範囲のレベルを得て、馴化培地を６個目のチャネルに沿って注入して、二重参照目的で『インライン』ブランクを用意した。ヒトＢＣＭＡ、ｃｙｎｏＢＣＭＡ及びマウスＢＣＭＡの希釈系列を３分間、垂直チャネルに沿って注入することによって（２５ｎＭ／分、５ｎＭ／分、１ｎＭ／分、０．２ｎＭ／分、０．０４ｎＭ／分、０ｎＭ／分、５０μｌ／分）、１ショットの動態測定を行った。解離を５分間モニタリングした。動態データを上記のようにして解析した。ＯＳＫ測定値が表２Ｄにまとめられており、ｉ／ｍは、測定値不確定である。ｈｕＢＣＭＡに対する親和性は、約５０ｐｍ～５ｎＭであることが分かった。ｃｙｎｏＢＣＭＡに対する親和性は、約２ｎＭ～２０ｎＭであることが分かった（いくつかのクローンは、この範囲から外れていた。図１７を参照されたい）。

【0279】

１．１．１Ａ５．ＨＣ及びＬＣクローンのさらなる選択
本発明者は、経験から、ｈｕＢＣＭＡ、ｃｙｎｏＢＣＭＡ、マウスＢＣＭＡへの結合特性と比率（異なるアッセイで測定したもの）に基づき、これらの７０個のクローンから、さらなる２７個のクローンを選択した。これらのクローンから、４個のＶＨクローンと、９個のＶＬクローンを選択し、それにより、ＶＨ／ＶＬの組み合わせは３４個得られた。ＨＥＫ－ｈｕＢＣＭＡ細胞での結合親和性を測定した（図１８及び表２Ｅ）。ＨＥＫ細胞上のｈｕＢＣＭＡへの抗体Ｍａｂ２１、Ｍａｂ２２、Ｍａｂ２７、Ｍａｂ３９及びＭａｂ４２の結合性は、Ｍａｂ８３Ａ１０のｈｕＢＣＭＡ－ＨＥＫ細胞への結合性よりも有意には高くないことが分かった。しかしながら、ｈｕＢＣＭＡ、ｃｙｎｏＢＣＭＡへの親和性、二重特異性抗体としてのＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株Ｈ９２９、Ｌ３６３及びＲＰＭＩ－８２２６への結合（フローサイトメトリーによるもの）、骨髄腫細胞Ｈ９２９、Ｌ３６３及びＲＰＭＩ－８２２６と、患者骨髄穿刺液から得た生存骨髄腫形質細胞の殺傷効能、ならびにカニクイザルにおける薬物動態（ＰＫ））及び薬力（ＢＣＭＡ陽性細胞の殺傷）データのような全体的な特性により、Ｍａｂ２１、Ｍａｂ２２、Ｍａｂ２７、Ｍａｂ３３、Ｍａｂ３９及びＭａｂ４２を選択した。

【表2C】

【表2D-1】

【表2D-2】

【表2E】

【0280】

実施例１．２：ツールとしてのＢＣＭＡ発現細胞
実施例１．２．１：ＢＣＭＡを表面上に発現するヒト骨髄腫細胞株と、細胞表面上のＢＣＭＡレセプター数の定量化
ＢＣＭＡの発現を５つのヒト骨髄腫細胞株（ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６、Ｕ２６６Ｂ１、Ｌ－３６３及びＪＪＮ－３）でフローサイトメトリーによって評価した。ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞（（Ｈ９２９）ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８（商標））は、１０～２０％の熱不活化ＦＣＳとともに、８０～９０％のＲＰＭＩ １６４０において培養し、２ｍＭのＬ－グルタミンと、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムと、５０μＭのメルカプトエタノールを含むことができた。ＲＰＭＩ－８２２６細胞（（ＲＲＭＩ）ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１５５（商標））は、９０％のＲＰＭＩ １６４０と１０％の熱不活化ＦＣＳを含む培地で培養した。Ｕ２６６Ｂ１（（Ｕ２６６）ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１９６（登録商標））細胞は、２ｍＭのＬ－グルタミンと、１０ｍＭのＨＥＰＥＳと、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムと、４５００ｍｇ／Ｌのグルコースと、１５００ｍｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、１５％の熱不活化ＦＣＳとを含むように改変したＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。Ｌ－３６３細胞株（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ４９）は、８５％のＲＰＭＩ１６４０と１５％の熱不活化ＦＣＳで培養した。ＪＪＮ－３細胞株（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ５４１）は、４０％のダルベッコＭＥＭ＋４０％のイスコブＭＤＭ＋２０％の熱不活化ＦＢＳで培養した。簡潔に述べると、細胞を回収し、洗浄し、生存数について計数し、９６ウェル丸底プレートの１ウェル当たりに５０，０００個の細胞で再懸濁し、１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＢＣＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ５４８３４、マウスＩｇＧ１）とともに、３０分、４℃で（インターナリゼーションを防ぐため）インキュベートした。マウスＩｇＧ１をアイソタイプ対照として用いた（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５４１２１）。続いて、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分）、２回洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウス二次抗体とともに、３０分、４℃でインキュベートした。インキュベート時間の終わりに、細胞を遠心分離し（３５０×ｇで５分）、ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１００ｕｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａというソフトウェアを実行しているＣａｎｔｏＩＩという装置で解析した。骨髄腫細胞株Ｈ９２９、ＲＰＭＩ－８２２６及びＵ２６６Ｂ１の表面膜上でのＢＣＭＡレセプターの相対的定量数をＱＩＦＩＫＩＴ解析（Ｄａｋｏ、＃Ｋ００７８、メーカーの指示に従った）によって評価した。Ｈ９２９細胞は、最も高い密度でヒトＢＣＭＡを発現し、他の骨髄腫細胞株よりも最大で５～６倍高かった。ＢＣＭＡの発現が中程度／低い骨髄腫細胞であるＵ２６６及びＬ３６３と、ＢＣＭＡの発現が低い骨髄腫細胞であるＲＰＭＩ－８２２６と、ＢＣＭＡの発現が非常に低い骨髄腫細胞であるＪＪＮ－３と比べて、Ｈ９２９は、ＢＣＭＡの発現が高い骨髄腫細胞株と考えられる。表３には、各実験（ｎ＝５）当たりにおける、ヒト多発性骨髄腫細胞株の細胞表面上の相対的なＢＣＭＡレセプター数がまとめられている。

【表3】

【0281】

実施例２：ＢＣＭＡ結合アッセイ：表面プラズモン共鳴
抗ＢＣＭＡ抗体の組み換えＢＣＭＡへの結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による評価は、以下のとおりである。全てのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、２５℃で、ＨＢＳ－ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）をランニングバッファーとして用いて行った。抗ＢＣＭＡ抗体と組み換えＢＣＭＡ Ｆｃ（ｋｉｈ）（ヒト及びカニクイザル）との相互作用の結合活性を割り出した。説明書に従って、ビオチン化組み換えヒト及びカニクイザルＢＣＭＡ Ｆｃ（ｋｉｈ）をＳＡチップ上に直接カップリングした（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）。固定化レベルは、２００～７００ＲＵの範囲であった。抗ＢＣＭＡ抗体を２倍の濃度範囲（１．９５～５００ｎＭ）で、３０μＬ／分の流量で、フローセルに１２０秒にわたって流した。解離を１８０秒間モニタリングした。バルク屈折率差は、参照フローセルで得られた応答を減じることによって補正した。この実施例では、標準的なアミンカップリングキットで説明されているように、事前に活性化及び不活性化した空の表面上に抗ＢＣＭＡ抗体を流した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、見かけ動態定数を導き、相互作用の二価性にかかわらず、比較目的で、速度式を１：１ラングミュア結合で数値積分によって当てはめを行った。抗ＢＣＭＡ抗体と組み換えヒトＢＣＭＡ Ｆｃ（ｋｉｈ）との相互作用の親和性も割り出した。標準的なアミンカップリングキット（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、抗ヒトＦａｂ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＣＭ５チップにｐＨ５．０で直接カップリングした。固定化レベルは、約６５００ＲＵであった。抗ＢＣＭＡ抗体を９０秒、２５ｎＭで捕捉させた。組み換えヒトＢＣＭＡ Ｆｃ（ｋｉｈ）を４倍の濃度範囲（１．９５～５００ｎＭ）で、３０μＬ／分の流量で、フローセルに１２０秒にわたって流した。解離を１２０秒間モニタリングした。バルク屈折率差は、参照フローセルで得られた応答を減じることによって補正した。その際、抗ヒトＦａｂ抗体が固定化されている表面（ただし、抗ＢＣＭＡ抗体ではなく、ＨＢＳ－ＥＰを注入した表面）の上に、組み換えＢＣＭＡを流した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、動態定数を導き、速度式を１：１ラングミュア結合で数値積分によって当てはめを行った（表４）。

【表4-1】

【表4-2】

【0282】

実施例３：ヒト／カニクイザル（ｈｕ／ｃｙｎｏ）親和性ギャップ
実施例２に記載されている親和性の値に基づき、抗ＢＣＭＡ抗体のヒトＢＣＭＡに対する親和性とカニクイザルＢＣＭＡに対する親和性を比較し、ｃｙｎｏ／ｈｕ親和性比（ギャップ）の値を算出した（表５）。親和性ｃｙｎｏ／ｈｕギャップは、抗体のカニクイザルＢＣＭＡへの親和性をヒトＢＣＭＡへの親和性で除した値として計算したものであり、ＢＣＭＡ抗体が、カニクイザルＢＣＭＡのｘ倍の結合親和性でヒトＢＣＭＡに結合することを意味し、ｘ＝ｃｙｎｏ／ｈｕギャップ値である。結果は表５に示されている。

【表5-1】

【表5-2】

【0283】

実施例４：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の作製
ＷＯ２０１４／１２２１４４（参照により援用する）に従って、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を作製した。

【0284】

実施例４．１：抗ＣＤ３抗体
「ＣＤ３εまたはＣＤ３」という用語は、本明細書で使用する場合、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７７６６（ＣＤ３Ｅ＿ＨＵＭＡＮ）で説明されているヒトＣＤ３εに関するものである。「ＣＤ３に対する抗体、抗ＣＤ３抗体」という用語は、ＣＤ３εに結合する抗体に関するものである。好ましくは、この抗体は、重鎖ＣＤＲ１として、配列番号１の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ２として、配列番号２の重鎖ＣＤＲを含み、重鎖ＣＤＲ３として配列番号３の重鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＨと、軽鎖ＣＤＲ１として、配列番号４の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ２として、配列番号５の軽鎖ＣＤＲを含み、軽鎖ＣＤＲ３として、配列番号６の軽鎖ＣＤＲを含む可変ドメインＶＬとを含む。好ましくは、この抗体は、配列番号７（ＶＨ）と配列番号８（ＶＬ）の可変ドメインを含む。上記のような抗ＣＤ３抗体を用いて、下記の実施例で用いたＴ細胞二重特異性抗体を作製した。

【0285】

実施例４．２：Ｆｃを含む２＋１形態の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の作製
対応する抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ１抗体の完全な重鎖と軽鎖をコードするｃＤＮＡと、抗ＣＤ３ ＶＨ及びＶＬ ｃＤＮＡを出発物質として使用した。それぞれの二重特異性抗体において、対応する抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖及び軽鎖と、上記の抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖を含む４本のタンパク質鎖が関与した。重鎖のミスペアリング、例えば、抗ＣＤ３抗体の２本の重鎖のミスペアリングによる副生物の形成を最小限に抑えるために、ＷＯ２００９０８０２５１とＷＯ２００９０８０２５２に説明されているように、「ノブ・イントゥ・ホール変異」と、操作されたジスルフィド結合とを有する変異ヘテロ二量体Ｆｃ領域を用いる。軽鎖のミスペアリング、例えば、抗ＢＣＭＡ抗体の２本の軽鎖のミスペアリングによる副生物の形成を最小限に抑えるために、ＷＯ２００９０８０２５１とＷＯ２００９０８０２５２で説明されている手法を用いて、抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖に、ＣＨ１×定常カッパの交叉を適用する。

【0286】

ａ）２＋１形態を有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体、すなわち、ＢＣＭＡに対して二価であり、ＣＤ３に対して一価である二重特異性（Ｆａｂ）_２×（Ｆａｂ）抗体は、効能、有効性の予測及び安全性に関する利点を有することとなる。腫瘍標的のＢＣＭＡに優先的に結合するとともに、ＣＤ３抗体不足が回避されるので、薬剤暴露が腫瘍に集中する可能性が高くなるからである。

【0287】

事前に選択したヒトＢＣＭＡ抗体用に、２＋１形態の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性（すなわち、ＢＣＭＡに対して二価であり、ＣＤ３に対して一価であり、Ｆｃを有する二重特異性（Ｆａｂ）_２×（Ｆａｂ）抗体を作製した。対応する抗ＢＣＭＡ ＩｇＧ１抗体の完全Ｆａｂ（重鎖ＶＨ及びＣＨ１ドメイン＋軽鎖ＶＬ及びＣＬドメイン）をコードするｃＤＮＡと、抗ＣＤ３ ＶＨ及びＶＬ ｃＤＮＡを出発物質として使用した。それぞれの二重特異性抗体において、対応する抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖及び軽鎖と、上記の抗ＣＤ３抗体の重鎖及び軽鎖をそれぞれ、Ｆｃ領域とともに含む４本のタンパク質鎖が関与した。

【0288】

簡潔に述べると、各二重特異性抗体は、ａ）対応するＢＣＭＡ抗体の完全軽鎖ｃＤＮＡと、ｂ）ｓｐｌｉｃｅ－ｏｖｅｒｌａｐ－ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲのような標準的な分子生物学的方法によって作製した融合ｃＤＮＡであって、（Ｎ末端からＣ末端の順で）分泌リーダー配列と、対応する上記の抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂ（ＶＨの後にＣＨ１ドメインを含む）と、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒという配列を有するフレキシブルグリシン（Ｇｌｙ）－セリン（Ｓｅｒ）リンカーと、対応する上記の抗ＢＣＭＡ抗体のＦａｂ（ＶＨの後にＣＨ１ドメインを含む）と、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒという配列を有するフレキシブルグリシン（Ｇｌｙ）－セリン（Ｓｅｒ）リンカーと、上記抗ＣＤ３抗体のＶＨと、ヒト軽鎖ｃＤＮＡの定常カッパドメインとで構成される融合タンパク質をコードする融合ｃＤＮＡと、ｃ）ｓｐｌｉｃｅ－ｏｖｅｒｌａｐ－ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣのような標準的な分子生物学的方法によって作製した融合ｃＤＮＡであって、（Ｎ末端からＣ末端の順で）分泌リーダー配列と、上記抗ＣＤ３抗体のＶＬと、ヒトＩｇＧ１ ｃＤＮＡの定常ＣＨ１ドメインとで作成した融合タンパク質をコードする融合ｃＤＮＡとをそれぞれコードする４つの哺乳動物発現ベクターを同時にコトランスフェクションすることによって作製した。ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１抗体の作製のために、上記の方法を用いて、哺乳動物細胞へのコトランスフェクションと、抗体の作製及び精製を行うのに際して、１つ修正があり、抗体の精製において、第１の捕捉工程は、プロテインＡを用いるのではなく、代わりに、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のように、ヒトカッパ軽鎖定常領域に結合する樹脂を詰めたアフィニティクロマトグラフィーカラムを用いて行う。加えて、ジスルフィドを加えて、安定性と収量を高めるとともに、イオン架橋を形成する追加の残基を加えて、ヘテロ二量化の生成を高めることができる（ＥＰ１８７０４５９Ａ１）。

【0289】

ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ベクターを作製するには、ＩｇＧ１由来の二重特異性分子は、ＣＤ３とＢＣＭＡという２つの別個の抗原決定基に特異的に結合できる２つの抗原結合部位から少なくともなる。これらの抗原結合部位は、それぞれ可変領域と定常領域を含む重鎖と軽鎖で構成されるＦａｂ断片であった。Ｆａｂ断片の少なくとも１つは、Ｆａｂの重鎖と軽鎖の定常ドメインが入れ替わっている「クロスＦａｂ」断片であった。Ｆａｂ断片内の重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインを入れ替えることにより、異なる特異性のＦａｂ断片が、同じドメイン配置を有さず、その結果、軽鎖を入れ替えないようにする。この二重特異性分子のデザインは、ＣＤ３に関しては一価であり、ＢＣＭＡに関しては二価であり、１つのＦａｂ断片は、内側のクロスＦａｂのＮ末端に融合されている（２＋１）。半減期が長くなるように、この二重特異性分子には、Ｆｃ部分を含めた。このコンストラクトの概略図は、図１～３に示されており、好ましいコンストラクトの配列は、表２Ａに示されている。これらの分子は、ポリマーベースの溶液を用いて、哺乳動物発現ベクターを、懸濁液で増殖したＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞にコトランスフェクションすることによって作製した。２＋１クロスＦａｂ－ＩｇＧコンストラクトの調製のために、細胞に、対応する発現ベクターを１：２：１：１の比（「ベクターＦｃ（ノブ）」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖クロスＦａｂ」：「ベクター重鎖クロスＦａｂ」）でトランスフェクションした。

【0290】

実施例４．３：比較用の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の作製
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体ＢＣＭＡ５０－ｓｃ（Ｆｖ）_２（ＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）としても知られている）の作製と使用したアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３０７２４０６とＷＯ２０１３０７２４１５によるものであった。

【0291】

実施例５：電荷バリアントを有する抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｆｃ含有（２＋１）Ｔ細胞二重特異性抗体の作製と精製
ＷＯ２０１４／１２２１４４（参照により援用する）に従って、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を作製及び精製した。

【0292】

この二重特異性抗体の作製のために、各哺乳動物発現ベクターをＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞に一過性にコトランスフェクションし、ポリマーベースの溶液を用いて、その細胞を懸濁液で培養することによって、二重特異性抗体を発現させた。６ｍＭのＬ－グルタミンを添加したＥｘ－Ｃｅｌｌ培地に、トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ細胞を１ｍＬ当たり１５０万個の生存細胞で播種した。最終産物の体積１ｍＬごとに、２００万個の生存細胞を遠心分離した（５分、２１０×ｇ）。その上清を吸引し、その細胞を１００μＬのＣＤ ＣＨＯ培地に再懸濁した。１００μＬのＣＤ ＣＨＯ培地において１μｇのＤＮＡ（重鎖：改変重鎖：軽鎖：改変軽鎖の比＝１：１：２：１）を混合することによって、最終産物の体積１ｍＬごとのＤＮＡを調製した。ポリマーベースの溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を０．２７μＬ加えた後、その混合物を１５秒ボルテックスし、室温で１０分静置した。１０分後、再懸濁した細胞とＤＮＡ／ポリマーベースの溶液の混合物を合わせてから、適切な容器に移し、その容器を振とう装置（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れた。３時間のインキュベート時間の後、６ｍＭのＬ－グルタミンと、１．２５ｍＭのバルプロ酸と、１２．５％のＰｅｐｓｏｙ（５０ｇ／Ｌ）とを添加したＥｘ－Ｃｅｌｌ培地８００μＬを、最終産物の体積１ｍＬごとに加えた。２４時間後、フィード液７０μＬを最終産物の体積１ｍＬごとに加えた。７日後、または細胞の生存率が７０％以下になったら、細胞を上清から遠心分離及び滅菌ろ過によって分離した。親和性工程と１回または２回の研磨工程（陽イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーであった）によって、抗体を精製した。必要なときには、追加の研磨工程を用いた。

【0293】

親和性工程では、６ＣＶの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したプロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に上清を充填した。同じバッファーによる洗浄工程後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）による溶出工程によって、抗体をカラムから溶出させた。所望の抗体を含む画分を０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）によってすぐに中和し（１：１０）、プールし、遠心分離によって濃縮した。この濃縮物を滅菌ろ過し、陽イオン交換クロマトグラフィー及び／またはサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに処理した。

【0294】

陽イオン交換クロマトグラフィー工程では、濃縮したタンパク質を、親和性工程で用いた溶出バッファーによって１：１０で希釈し、陽イオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＳ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に充填した。平衡化バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス（ｐＨ５．０））と洗浄バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５．０））での２回の洗浄工程の後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ８．５）を用いたグラジエントでタンパク質を溶出させた。所望の抗体を含む画分をプールし、遠心分離によって濃縮し、滅菌ろ過し、サイズ排除工程でさらに処理した。

【0295】

サイズ排除工程では、濃縮したタンパク質をＸＫ１６／６０ ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と、処方バッファーとしてのＴｗｅｅｎ２０を含むかまたは含まない２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）に注入した。単量体を含む画分をプールし、遠心分離によって濃縮し、滅菌バイアルに滅菌ろ過した。

【0296】

抗体の０．１％溶液の吸光度の理論値を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、抗体濃度の定量を行った。この値は、アミノ酸配列をベースとし、ＧＰＭＡＷというソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ ｄａｔａ）によって計算した。

【0297】

最終的なタンパク質調製物の純度は、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））によって、単量体含有率は、ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬという解析用サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ））によって、２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭのＬ－アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムのｐＨ６．７のバッファーにおいて割り出した。

【0298】

最終的なタンパク質調製物の分子量を確認するとともに、この分子の均一な調製を確認するために、最終的なタンパク質溶液、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を用いた。まず、糖鎖除去工程を行った。糖鎖によって付与される不均一性を取り除くために、コンストラクトをＰＮＧａｓｅＦ（ＰｒｏＺｙｍｅ）で処理した。したがって、２Ｍのトリス２μｌを濃度０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質２０μｇに加えることによって、タンパク質溶液のｐＨをｐＨ７．０に調整した。ＰＮＧａｓｅＦを０．８μｇ加えて、１２時間、３７℃でインキュベートした。続いて、ＬＣ－ＭＳのオンライン検出を行った。ＬＣ－ＭＳ法は、ＴＯＦ６４４１という質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ）に接続したＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１２００で行った。Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ Ｐｏｌｙｓｔｅｒｅｎｅカラム、ＲＰ１０００－８（粒径８μｍ、４．６× ２５０ｍｍ、カタログ番号７１９５１０）で、クロマトグラフィーによる分離を行った。溶離液Ａは、水中の５％のアセトニトリルと０．０５％（ｖ／ｖ）のギ酸、溶離液Ｂは、９５％のアセトニトリルと、５％の水と、０．０５％のギ酸であった。流速は１ｍｌ／分であり、分離は、４０℃で、上記のような処理によって得たタンパク質試料６μｇ（１５μｌ）によって行った。

【0299】

最初の４分間は、溶出液を廃棄物入れに流して、質量分析計を塩の混入から保護した。ＥＳＩ源は、乾燥ガス流量１２ｌ／分、温度３５０℃、ネブライザー圧６０ｐｓｉで稼働させた。ＭＳスペクトルは、正イオンモードの使用で、フラグメンター電圧３８０Ｖ、質量範囲７００～３２００ｍ／ｚを用いて得た。ＭＳデータは、計器のソフトウェアによって、４～１７分で得た。

【0300】

ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の図１０には、８３Ａ１０－ＴＣＢ及び８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体に関して、異なる精製方法の後の最終的なタンパク質調製物のＣＥ－ＳＤＳ（非還元）のグラフが示されている。プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製工程を８３Ａ１０－ＴＣＢ抗体に対して行ったところ、純度は３０％未満、単量体含有率は８２．８％であった（Ａ）。陽イオン交換クロマトグラフィー（ｃＩＥＸ）と、最終的なサイズ排除クトマトグラフィー（ｒｅ－ＳＥＣ）工程を含む追加の精製工程を最終的なタンパク質調製物に行ったところ（Ａ）、純度は９３．４％まで向上したが、単量体含有率は同じままであったとともに、収率は、０．４２ｍｇ／Ｌまで大きく低下した。しかしながら、特定の電荷改変を８３Ａ１０抗ＢＣＭＡ Ｆａｂ ＣＬ－ＣＨ１に施したところ（すなわち８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体）、追加のｒｅ－ＳＥＣ精製工程を含むにもかかわらず、収率が７．９倍低く、単量体含有率が１７．２％低い産生／精製プロファイルを有する（Ｂ）と比べて、９５．３％の純度、１００％の単量体含有率、及び最大で３．３ｍｇ／Ｌの収率によって判断されるように、ＰＡ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣによる精製工程を行っても、ＴＣＢ分子の優れた産生／精製プロファイルをすでに観察することができた（Ｃ）。

【0301】

続いて、８３Ａ１０－ＴＣＢと８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体の産生／精製プロファイルを比較するために、直接比較物の作製作業を行って、抗体に施したＣＬ－ＣＨ１の電荷改変の利点をさらに評価した。８３Ａ１０－ＴＣＢと８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの分子はいずれも、図２ａに示されているような分子形態のものである。図１１に示されているように、８３Ａ１０－ＴＣＢと８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの抗体の特性を並列で測定し、１）ＰＡアフィニティクロマトグラフィーのみを行う（Ａ、Ｂ）、２）ＰＡアフィニティクロマトグラフィー後にＳＥＣを行う（Ｃ、Ｄ）、及び３）ＰＡアフィニティクロマトグラフィーの後に、ＳＥＣを行ってから、ｃＩＥＸとｒｅ－ＳＥＣを行う（Ｅ、Ｆ）各精製工程後に比較した。８３Ａ１０－ＴＣＢ及び８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体に関する、各精製方法の後の最終的なタンパク質溶液のＣＥ－ＳＤＳ（非還元）のグラフは、ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の図１１に示されている。ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の図１１Ａ及び１１Ｂに示されているように、電荷バリアントをＴＣＢ抗体に適用することによる改善は、ＰＡアフィニティクロマトグラフィーのみによる精製後に、すでに観察された。この直接比較試験では、ＰＡアフィニティクロマトグラフィー精製工程を８３Ａ１０－ＴＣＢ抗体に行ったところ、純度は６１．３％、収率は２６．２ｍｇ／Ｌ、単量体含有率は６３．７％であった（１１Ａ）。これに対して、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体をＰＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製したところ、全ての特性は改善し、純度は８１．０％に向上し、収率は５１．５ｍｇ／Ｌに向上し、単量体含有率は６８．２％となった（１１Ｂ）。ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の図１２Ａ及び１２Ｂで見られるように、さらにＳＥＣ精製工程を最終的なタンパク質調製物に行ったところ、８３Ａ１０－ＴＣＢの純度は６９．５％、収率は１４．１ｍｇ／Ｌ、単量体含有率は７４．７％となった（Ｃ）のに対して、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖでは、純度が９１．０％まで、単量体含有率が８３．９％まで向上し、収率が１０．３ｍｇ／Ｌとなった（Ｄ）。この特有の実験では、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの収率は、８３Ａ１０－ＴＣＢよりも若干低かった（すなわち、２７％低かった）が、適当な分子の割合は、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの方が８３Ａ１０－ＴＣＢよりもかなり高く、ＬＣ－ＭＳによって測定したところ、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖは９０％、８３Ａ１０－ＴＣＢは４０～６０％であった。第３の直接比較では、別の精製バッチ（産生は同じ）のそれぞれの最終的なタンパク質調製物であって、ＰＡアフィニティクロマトグラフィー精製工程のみを行った後の調製物、約１Ｌ（等量）とともに、ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の図１１Ｃ及び１１Ｄで見られる、８３Ａ１０－ＴＣＢと８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの最終的なタンパク質調製物をプールした。続いて、プールしたタンパク質調製物をｃＩＥＸ精製法及びＳＥＣ精製法によってさらに精製した。ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の図１１Ｅ及び１１Ｆに示されているように、電荷バリアントを有するＴＣＢ抗体では、電荷バリアントを有さないＴＣＢ抗体と比べて、産生／精製プロファイルの改善が一貫して観察された。いくつかの精製法工程（すなわち、ＰＡ＋／－ＳＥＣ＋ｃＩＥＸ＋ＳＥＣ）を用いて、８３Ａ１０－ＴＣＢ抗体を精製した後は、４３．１％の純度に達したに過ぎず、９８．３％の単量体含有率を達成できたが、収率は損なわれ、０．４３ｍｇ／Ｌまで低下した。ＬＣ－ＭＳによって測定したところ、適当な分子の割合は低いままで、６０～７０％であった。結局、最終的なタンパク質調製物の品質は、インビトロで用いるには許容不可能であった。まったく対照的なことに、複数回の同じ精製工程を同じ順序で８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体に行ったところ、純度は９６．２％、単量体含有率は９８．９％に達したとともに、適当な分子は、ＬＣ－ＭＳによって測定したところ、９５％となった。しかしながら、収率は、ｃＩＥＸ精製工程の後、０．６４ｍｇ／Ｌまで大きく低下した。これらの結果から、純度の向上、単量体含有率の向上、適当な分子の割合の向上、及び収率の向上は、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体で、２つの標準的な精製工程、すなわち、ＰＡアフィニティクロマトグラフィーとＳＥＣの後のみに達成できるが（ＥＰ１４１７９７０５の図１１Ｄ）、このような特性は、８３Ａ１０－ＴＣＢでは、追加の精製工程を行っても実現できなかった（ＥＰ１４１７９７０５の図１１Ｅ）ことが示されている。

【0302】

ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の表１２には、ＰＡ精製工程後の８３Ａ１０－ＴＣＶｃｖと８３Ａ１０－ＴＣＢの特性を比較した結果がまとめられている。ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の表１３には、ＰＡ精製工程及びＳＥＣ精製工程後の８３Ａ１０－ＴＣＶｃｖと８３Ａ１０－ＴＣＢの特性を比較した結果がまとめられている。ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の表１４には、ＰＡ、ＳＥＣ＋ＰＡのみの後に、ｃＩＥＸ及びｒｅ－ＳＥＣによる精製工程を行った後の８３Ａ１０－ＴＣＶｃｖと８３Ａ１０－ＴＣＢの特性を比較した結果がまとめられている。ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の表１２～１４では、太字の値は、８３Ａ１０－ＴＣＢと８３Ａ１０－ＴＣＶｃｖを比べた際に、特性が優れている方を示している。典型的でないとみられる例外（すなわち、収率、量のそれぞれ。ＥＰ１４１７９７０５（参照により援用する）の表１３を参照されたい）を除き、３つの直接比較実験から得られた産生／精製パラメーター及び値は全て、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの方が８３Ａ１０－ＴＣＢよりも優れていた。全体的な結果から、産生／精製特性における利点は、ＣＬ－ＣＨ１の電荷改変をＴＣＢ抗体に施すことによって得ることができることと、すでに高品質な状態となっているとともに、非常に良好な展開性特性を有するタンパク質調製物を得るのに必要なのは、２回の精製工程のみ（すなわち、ＰＡアフィニティクロマトグラフィーとＳＥＣ）であることが明確に示されている。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの産生／精製特性の改善に基づき、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖと同じ方法で、電荷バリアントを有する状態で、２１－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ、２７－ＴＣＢｃｖ、３３－ＴＣＢｃｖ、３９－ＴＣＢｃｖ及び４２－ＴＣＢｃｖを作製した。

【表6】

【表7-1】

【表7-2】

【表8-1】

【0303】

実施例６：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体のＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株への結合（フローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（２１－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ、４２－ＴＣＢｃｖ、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ）の、ＢＣＭＡ発現細胞Ｈ９２９、Ｌ３６３及びＲＰＭＩ－８２２６のヒトＢＣＭＡへの結合について、フローサイトメトリーによって解析した。ＭＫＮ４５（ＢＣＭＡを発現しないヒト胃腺癌細胞株）をネガティブ対照として使用した。簡潔に述べると、培養した細胞を回収及び計数し、ＶｉＣｅｌｌを用いて、細胞の生存率を評価した。続いて、生存細胞をＢＳＡ含有ＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、１ｍｌ当たり２×１０^６個の細胞に調整した。さらに、この細胞懸濁液１００μｌを丸底９６ウェルプレートの各ウェルに分け、抗ＢＣＭＡ抗体または対応するＩｇＧ対照３０μｌとともに３０分、４℃でインキュベートした。全ての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（及びＴＣＢ対照）を滴定し、１～３００ｎＭの最終濃度範囲で解析した。続いて、細胞を遠心分離し（５分、３５０×ｇ）、１２０μｌ／ウェルのＦＡＣＳ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、再懸濁し、さらに３０分、４℃で、蛍光色素コンジュゲートＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ，１０９－１１６－１７０）とともにインキュベートした。続いて、細胞をＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄し、ＢＤ Ｆｉｘａｔｉｏｎバッファー（＃ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５４６５５）を１ウェル当たり１００ｕｌ用いて、４℃で２０分間固定し、ＦＡＣＳバッファー１２０μｌに再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて解析した。該当する場合には、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＥＣ５０を算出し、表８には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体のＨ９２９細胞への結合に関して、表９には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体のＬ３６３細胞への結合に関して、表１０には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体のＲＰＭＩ－８２２６細胞への結合に関して、最大結合の５０％に達するのに必要な抗体濃度を示すＥＣ５０値がまとめられている。アスタリスクは、Ｐｒｉｓｍというソフトウェアによって推定及び算出された推定ＥＣ５０値を示している。２１－ＴＣＢｃｖのＬ３６３細胞への結合と、２２－ＴＣＢｃｖのＲＰＭＩ－８２２６細胞へのＥＣ５０値は、推定できなかった。

【表8-2】

【表9】

【表10】

【0304】

実施例７：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体がＣＤ３陽性Ｔ細胞及びＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株に結合した際の活性化Ｔ細胞からのサイトカインの産生（サイトカイン放出アッセイＣＢＡ解析）
ヒトＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞（ＲＰＭＩ－８２２６、ＪＪＮ－３）の存在または非存在下で、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体が、デノボのＴ細胞媒介性サイトカイン産生を誘導する能力について解析した。簡潔に述べると、ヒトＰＢＭＣをバフィーコートから単離し、１ウェル当たり３０万個の細胞を丸底９６ウェルプレートに播種した。あるいは、健常なドナーから得た全血２８０μｌをディープウェル９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。ＢＣＭＡ陽性腫瘍標的細胞を加えて、最終的なＥ：Ｔ比を１０：１とした。最終濃度が０．１ｐＭ～１０ｎＭになるように、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体と対照を加える。最長で２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベート後、アッセイプレートを５分間、３５０×ｇで遠心分離し、続いて次の解析のために、上清を新たなディープウェル９６ウェルプレートに移す。ＣＢＡ解析をＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩで、メーカーの指示書に従って、Ｈｕｍａｎ Ｔｈｌ／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｔ ＩＩ（ＢＤ＃５５１８０９）、またはヒトグランザイムＢ（ＢＤ＃５６０３０４）、ヒトＩＦＮ－γＦｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２６９）、ヒトＴＮＦ－αＦｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７３）、ヒトＩＬ－１０ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７４）、ヒトＩＬ－６ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７６）、ヒトＩＬ－４ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７２）、ヒトＩＬ－２ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７０）というＣＢＡ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔを組み合わせたもののいずれかを用いて行った。表１３には、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖが、サイトカインの産生と、セリンプロテアーゼのグランザイムＢ（細胞傷害性Ｔ細胞機能のマーカー）の濃度依存的な増加を誘導したことが示されている。表１１には、それぞれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度において分泌されたサイトカイン／プロテアーゼのＥＣ５０値と量が示されている。

【表11】

【0305】

実施例８：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＢＣＭＡ高発現Ｈ９２９骨髄腫細胞へのリダイレクトＴ細胞による細胞傷害性（比色ＬＤＨ放出アッセイ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体が、ＢＣＭＡ高発現ＭＭ細胞において、細胞上のＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合を介してコンストラクトを架橋したときに、Ｔ細胞媒介性アポトーシスを誘導する可能性を解析した。簡潔に述べると、ヒトＢＣＭＡ高発現Ｈ９２９多発性骨髄腫標的細胞をＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで回収し、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。おおむね、１ウェル当たり３０，０００個の細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、それぞれのコンストラクト希釈液を所望の最終濃度で加え（三連）、最終濃度は０．１ｐＭ～１０ｎＭであった。適切な比較のために、全てのＴＣＢコンストラクト及び対照を同じモル濃度に調整した。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）をウェルに加えて、最終的なＥ：Ｔ比を１０：１（１個の腫瘍標的細胞に約３～５個のＴ細胞というＥ：Ｔ比に相当）とした。ネガティブ対照群は、エフェクター細胞または標的細胞のみによって表した。正規化のために、標的細胞を最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とともにインキュベートして、細胞死を誘導することによって、Ｈ９２９ＭＭ標的細胞の最大溶解状態（＝１００％）を求めた。最小溶解状態（＝０％）は、エフェクター細胞のみ、すなわち、いずれのＴ細胞二重特異性抗体も加えずにコインキュベートした標的細胞によって表した。続いて、３７℃、５％ＣＯ_２でのインキュベートから２０～２４時間または４８時間後に、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をメーカーの指示書に従って用いて、アポトーシス／壊死を起こしたＭＭ標的細胞から上清に放出されたＬＤＨを測定した。ＬＤＨ放出率を抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度に対して濃度応答曲線でプロットした。Ｐｒｉｓｍというソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出率の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として割り出した。図４に示されているように、全ての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（２１－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ、４２－ＴＣＢｃｖ及び８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ）が、ＢＣＭＡ陽性Ｈ９２９骨髄腫細胞の濃度依存的な殺傷（ＬＤＨの放出によって測定）を誘導した。Ｈ９２９細胞の溶解は、特異的であった。ＢＣＭＡ陽性標的細胞には結合せず、Ｔ細胞上のＣＤ３のみに結合する対照ＴＣＢ抗体は、試験した濃度のうちの最高濃度においても、ＬＤＨの放出を誘導しなかったからである。表１２には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体によって誘導された、ＢＣＭＡ高発現Ｈ９２９細胞のリダイレクトＴ細胞による殺傷のＥＣ５０値がまとめられている。

【表12】

【0306】

実施例９：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＢＣＭＡ中／低発現Ｌ３６３骨髄腫細胞へのリダイレクトＴ細胞による細胞傷害性（ＬＤＨ放出アッセイ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体が、ＢＣＭＡ中／低発現ＭＭ細胞において、細胞上のＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合を介してコンストラクトを架橋したときに、Ｔ細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力も解析した。簡潔に述べると、ヒトＢＣＭＡ中／低発現Ｌ３６３多発性骨髄腫標的細胞をＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで回収し、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。およそ、１ウェル当たり３０，０００個の細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、それぞれのコンストラクト希釈液を加えて所望の最終濃度にし（三連）、最終濃度は、０．１ｐＭ～１０ｎＭである。適切な比較のために、全てのＴＣＢコンストラクト及び対照を同じモル濃度に調整する。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）をウェルに加えて、最終的なＥ：Ｔ比を１０：１（１個の腫瘍標的細胞に約３～５個のＴ細胞というＥ：Ｔ比に相当）とした。ネガティブ対照群は、エフェクター細胞または標的細胞のみによって表した。正規化のために、標的細胞を最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とともにインキュベートして、細胞死を誘導することによって、ＭＭ標的細胞の最大溶解状態（＝１００％）を求めた。最小溶解状態（＝０％）は、エフェクター細胞のみ、すなわち、いずれのＴ細胞二重特異性抗体も加えずにコインキュベートした標的細胞によって表した。続いて、３７℃、５％ＣＯ_２でのインキュベートから２０～２４時間後に、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をメーカーの指示書に従って用いて、アポトーシス／壊死を起こしたＭＭ標的細胞から上清に放出されたＬＤＨを測定した。ＬＤＨ放出率を抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度に対して濃度応答曲線でプロットした。Ｐｒｉｓｍというソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出率の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として割り出した。図５に示されているように、全ての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（２１－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ、４２－ＴＣＢｃｖ及び８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ）が、ＢＣＭＡ陽性Ｌ３６３骨髄腫細胞の濃度依存的な殺傷（ＬＤＨの放出によって測定）を誘導した。Ｌ３６３細胞の溶解は、特異的であった。ＢＣＭＡ陽性標的細胞には結合せず、Ｔ細胞上のＣＤ３のみに結合する対照ＴＣＢ抗体は、試験した濃度のうちの最高濃度においても、ＬＤＨの放出を誘導しなかったからである。表１３には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体によって誘導された、ＢＣＭＡ中／低発現Ｌ３６３細胞のリダイレクトＴ細胞による殺傷のＥＣ５０値がまとめられている。

【表13-1】

【0307】

実施例１０：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＢＣＭＡ中／低発現ＲＰＭＩ－８２２６骨髄腫細胞へのリダイレクトＴ細胞による細胞傷害性（ＬＤＨ放出量アッセイ）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体が、ＢＣＭＡ中／低発現ＭＭ細胞において、細胞上のＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合を介してコンストラクトを架橋したときに、Ｔ細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力を解析した。簡潔に述べると、ヒトＢＣＭＡ中／低発現Ｌ３６３多発性骨髄腫標的細胞をＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで回収し、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。およそ、１ウェル当たり３０，０００個の細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、それぞれのコンストラクト希釈液を加えて所望の最終濃度にし（三連）、最終濃度は、０．１ｐＭ～１０ｎＭである。適切な比較のために、全てのＴＣＢコンストラクト及び対照を同じモル濃度に調整する。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）をウェルに加えて、最終的なＥ：Ｔ比を１０：１（１個の腫瘍標的細胞に約３～５個のＴ細胞というＥ：Ｔ比に相当）とした。ネガティブ対照群は、エフェクター細胞または標的細胞のみによって表した。正規化のために、標的細胞を最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とともにインキュベートして、細胞死を誘導することによって、ＭＭ標的細胞の最大溶解状態（＝１００％）を求めた。最小溶解状態（＝０％）は、エフェクター細胞のみ、すなわち、いずれのＴ細胞二重特異性抗体も加えずにコインキュベートした標的細胞によって表した。続いて、３７℃、５％ＣＯ_２でのインキュベートから２０～２４時間後に、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をメーカーの指示書に従って用いて、アポトーシス／壊死を起こしたＭＭ標的細胞から上清に放出されたＬＤＨを測定した。ＬＤＨ放出率を抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度に対して濃度応答曲線でプロットした。Ｐｒｉｓｍというソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出率の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として割り出した。図６に示されているように、全ての抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（２１－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ、４２－ＴＣＢｃｖ及び８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ）が、ＢＣＭＡ陽性ＲＰＭＩ－８２２６骨髄腫細胞の濃度依存的な殺傷（ＬＤＨの放出によって測定）を誘導した。ＲＰＭＩ－８２２６細胞の溶解は、特異的であった。ＢＣＭＡ陽性標的細胞には結合せず、Ｔ細胞上のＣＤ３のみに結合する対照ＴＣＢ抗体は、試験した濃度のうちの最高濃度においても、ＬＤＨの放出を誘導しなかったからである。表１３には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体によって誘導された、ＢＣＭＡ中／低発現ＲＰＭＩ－８２２６細胞のリダイレクトＴ細胞による殺傷のＥＣ５０値がまとめられている。

【表13-2】

【0308】

実施例１１：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＢＣＭＡ低発現ＪＪＮ－３骨髄腫細胞へのリダイレクトＴ細胞による細胞傷害性（フローサイトメトリー及びＬＤＨ放出）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体が、ＢＣＭＡ低発現ＭＭ細胞において、細胞上のＢＣＭＡへの抗原結合部分の結合を介してコンストラクトを架橋したときに、Ｔ細胞媒介性アポトーシスを誘導する能力を解析した。簡潔に述べると、ヒトＢＣＭＡ低発現ＪＪＮ－３多発性骨髄腫標的細胞をＣｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで回収し、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。およそ、１ウェル当たり３０，０００個の細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、それぞれのコンストラクト希釈液を添加して所望の最終濃度にし（三連）、最終濃度は、０．１ｐＭ～１０ｎＭである。適切な比較のために、全てのＴＣＢコンストラクト及び対照を同じモル濃度に調整する。ヒトＰＢＭＣ（エフェクター細胞）をウェルに加えて、最終的なＥ：Ｔ比を１０：１（１個の腫瘍標的細胞に約３～５個のＴ細胞というＥ：Ｔ比に相当）とした。ネガティブ対照群は、エフェクター細胞または標的細胞のみによって表した。正規化のために、標的細胞を最終濃度１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とともにインキュベートして、細胞死を誘導することによって、ＭＭ標的細胞の最大溶解状態（＝１００％）を求めた。最小溶解状態（＝０％）は、エフェクター細胞のみ、すなわち、いずれのＴ細胞二重特異性抗体も加えずにコインキュベートした標的細胞によって表した。ｉ）３７℃、５％ＣＯ_２でのインキュベートから４８時間後に、培養した骨髄腫細胞を回収し、洗浄し、アポトーシスを起こした骨髄腫細胞を割り出すために、蛍光色素コンジュゲート抗体とアネキシンＶで染色した。染色パネルには、ＣＤ１３８－ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８－ＦＩＴＣ／ＣＤ５－ＢＶ５１０／ＣＤ５６－ＰＥ／ＣＤ１９－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ７／ＣＤ４５－Ｖ４５０／アネキシンＶ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５が含まれていた。用いた蛍光色素標識抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とＣａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）から購入した。取得は、マルチカラーフローサイトメーターと、インストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａというソフトウェアを実行しているＣａｎｔｏＩＩという装置、またはＣｅｌｌＱＵＥＳＴというソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒというフローサイトメーター）を用いて行った。データ解析には、Ｐａｉｎｔ－Ａ－Ｇａｔｅ Ｐｒｏというプログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。ＪＪＮ－３細胞でアネキシンＶを測定し、アネキシンＶ陽性ＪＪＮ－３細胞の割合を抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度に対してプロットした。所定のＴＣＢ濃度におけるアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数を測定して、ＴＣＢを含めなかった場合のアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数から減じて、ＴＣＢを含めなかった場合のアネキシンＶ陰性ＪＪＮ－３細胞の絶対数で除することによって、特定濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＪＪＮ－３細胞の溶解率も割り出した。図７には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（２２－ＴＣＢｃｖ、４２－ＴＣＢｃｖ及び８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ）が、ＢＣＭＡ低発現ＪＪＮ－３骨髄腫細胞の濃度依存的な殺傷（フローサイトメトリーによって測定）を誘導したことが示されている。ＪＪＮ－３細胞の溶解は、特異的であった。ＢＣＭＡ陽性標的細胞には結合せず、Ｔ細胞上のＣＤ３のみに結合する対照ＴＣＢ抗体は、試験した濃度のうちの最高濃度においても、アネキシンＶ陽性ＪＪＮ－３細胞の増加またはＪＪＮ－３細胞の溶解を誘導しなかったからである。表１４には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体によって誘導されたアネキシンＶ陽性ＪＪＮ－３細胞の割合が、表１５には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体によって誘導された、ＪＪＮ－３細胞の溶解率がまとめられている。

【0309】

３７℃、５％ＣＯ_２でのインキュベートから２０～２４時間または４８時間後に、ＬＤＨの検出も行った。続いて、ＬＤＨ検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）をメーカーの指示書に従って用いて、アポトーシス／壊死を起こしたＪＪＮ－３ＭＭ標的細胞から上清に放出されたＬＤＨを測定した。ＬＤＨ放出率を抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度に対して濃度応答曲線でプロットした。Ｐｒｉｓｍというソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いてＥＣ５０値を測定し、最大ＬＤＨ放出率の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として割り出した。

【表14】

【表15-1】

【表15-2】

【0310】

実施例１２：多発性骨髄腫患者由来の骨髄腫形質細胞でのＢＣＭＡの発現
対象とする腫瘍標的を発現するヒト細胞株は、非常に有用であり、Ｔ細胞の存在下で腫瘍細胞への細胞傷害性を誘導するＴＣＢ抗体能を測定して、ＥＣ５０値を割り出すため、かつＴＣＢ分子をランク付けするための実用的なツールである。しかしながら、容易に入手可能で実用的であるにもかかわらず、ヒト骨髄腫細胞株には、分子レベルのばらつきが非常に大きいことによって特徴付けられる非常に複雑な疾患である多発性骨髄腫の不均一性を示さないという注意点がある。加えて、骨髄腫細胞株の一部の細胞は、他の細胞よりもＢＣＭＡを強く発現する（例えば、Ｈ９２９細胞とＲＰＭＩ－８２２６細胞を比べた場合）ので、骨髄腫細胞株は、同じ強度及び密度ではＢＣＭＡレセプターを発現せず、細胞レベルでのこのような不均一性は、異なる患者間でも観察され得る。多発性骨髄腫分野における重要なオピニオンリーダーとの学究的な協力を通じて、患者試料におけるＢＣＭＡの発現と密度の判定と、臨床患者試料による抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体の評価について検討している。地元の倫理委員会のガイドラインとヘルシンキ宣言に従って、インフォームドコンセントを行ってから、血液と骨髄穿刺液を多発性骨髄腫患者から採取する。

【0311】

ａ）マルチパラメーターフローサイトメトリー（平均蛍光強度）によって検出した、ＢＣＭＡの発現
骨髄の骨髄腫細胞でのＢＣＭＡレセプターの発現を割り出すために、新たに単離した全骨髄穿刺液を用いて、免疫表現型の解析を行った。免疫表現型の解析には、赤血球溶解Ｋ_３－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で抗凝固処理した全骨髄試料を用いた。直接免疫蛍光技術とマルチカラー染色（ＣＤ１３８^＋ ＣＤ３８^＋ ＣＤ４５^＋ ＣＤ１９^－ ＣＤ５６^＋として同定された悪性形質細胞の特異的同定と、免疫表現型の特徴付けを目的としたもの）を用いて、１つのチューブ当たり合計２×１０^６個の細胞を染色、溶解してから、洗浄した。続いて、少なくともＣＤ３８－ＦＩＴＣ／ＣＤ５６－ＰＥ／ＣＤ１９－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ７／ＣＤ４５－Ｖ４５０／ＢＣＭＡ－ＡＰＣを含む蛍光色素コンジュゲート抗体のパネルを用いて、細胞を染色した。用いた蛍光色素標識抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とＣａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）から購入する。自家作製のＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ抗体を免疫表現型の解析で使用した。取得は、マルチカラーフローサイトメーターと、インストールされたソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａというソフトウェアを実行しているＣａｎｔｏＩＩという装置、またはＣｅｌｌＱＵＥＳＴというソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒというフローサイトメーター）を用いて行った。データ解析には、Ｐａｉｎｔ－Ａ－Ｇａｔｅ Ｐｒｏというプログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。悪性形質細胞集団にゲーティングを行って、ＢＣＭＡの発現を測定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を割り出し、骨髄腫患者間で比較した。

【表16】

【0312】

ｂ）ＢＣＭＡに特異的な抗原結合能の測定（定量フローサイトメトリー解析）
Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ）の方法を用いて、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の細胞表面での、ＢＣＭＡに特異的な抗原結合能（ＳＡＢＣ）を定量化した。ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ）で最終濃度２５μｇ／ｍｌ（または飽和濃度）まで希釈した５０μｌのマウス抗ヒトＢＣＭＡ ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃３５７５０２）またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃４０１５０１）で、全骨髄穿刺液から単離した骨髄腫形質細胞を染色し、染色は、３０分、４℃で遮光下において行った。次に、個々のウェルと細胞にセットアップビーズまたはキャリブレーションビーズ１００μｌを加え、それらのビーズをＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。フルオレセインコンジュゲート抗マウス二次抗体を（飽和濃度で）含む２５μｌのＦＡＣＳバッファー（Ｑｉｆｉｋｉｔによって提供されているもの）に、細胞とビーズを再懸濁した。細胞とビーズは、４５分、４℃で遮光下において染色した。細胞を１回洗浄し、全ての試料を１００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。マルチカラーフローサイトメーターと、インストールされているソフトウェア（例えばＦＡＣＳ Ｄｉｖａというソフトウェアを実行しているＣａｎｔｏＩＩという装置、またはＣｅｌｌＱＵＥＳＴというソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒというフローサイトメーター）で、試料をすぐに解析した。

【表17】

【0313】

実施例１３：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、自己骨髄浸潤Ｔ細胞の存在下における骨髄患者骨髄腫形質細胞へのリダイレクトＴ細胞による細胞傷害性（マルチパラメーターフローサイトメトリー）
多発性骨髄腫に対する候補ＴＣＢ抗体の前臨床評価の際、インビトロでの最も有意義かつ重大な特徴付けの１つは、そのＴＣＢ分子が、患者のＴ細胞を活性化して、患者の骨髄由来の一次骨髄腫形質細胞のリダイレクトＴ細胞による殺傷を誘導できたかである。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体が、骨髄の骨髄腫形質細胞のリダイレクトＴ細胞による殺傷を誘導する作用を評価するために、全骨髄穿刺液を多発性骨髄腫患者からＥＤＴＡコーティングチューブ内に採取し、すぐに細胞培養アッセイに用いた。フローサイトメトリーによって、エフェクター細胞と、全骨髄試料に存在する腫瘍細胞との比率（Ｅ：Ｔ比）を判定及び測定した。簡潔に述べると、２００μｌの骨髄試料を９６ディープウェルプレートに移した。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体と対照抗体の希釈液を滅菌培地において調製し、その調製物１０μｌを各ウェルに、０．１ｐＭ～３０ｎＭの範囲の最終濃度になるように加えた。骨髄－抗体懸濁液をゆっくり振とうすることによって混合してから、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートし、パラフィンフィルムで密封する。インキュベーション期間の経過後、ＣＤ１３８－ＡＰＣＣ７５０／ＣＤ３８－ＦＩＴＣ／ＣＤ５－ＢＶ５１０／ＣＤ５６－ＰＥ／ＣＤ１９－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ７／ＣＤ４５－Ｖ４５０／ＢＣＭＡ－ＡＰＣ／アネキシンＶ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５を含む抗体パネルに基づき調製した対応するＦＡＣＳ抗体溶液２０μｌを９６－Ｕ底プレートに加えた。蛍光色素標識抗体をＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）及びＣａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）から購入したとともに、自社作製のＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＢＣＭＡ抗体を使用した。続いて、試料を１５分間、遮光下で室温においてインキュベートし、回収し、マルチカラーフローサイトメーターを用いて解析した。ＣＤ１３８^＋ ＣＤ３８^＋ ＣＤ４５^＋ ＣＤ１９^－ ＣＤ５６^＋ 骨髄腫細胞集団にゲーティングを行ったアネキシンＶ陽性発現を評価することによって、骨髄腫細胞の細胞死を判定した。続いて、骨髄腫細胞死の割合を割り出した。所定のＴＣＢ濃度におけるアネキシンＶ陰性骨髄腫形質細胞の絶対数を測定し、ＴＣＢを含めなかった場合のアネキシンＶ陰性骨髄腫形質細胞の絶対数からその値を減じて、ＴＣＢを含めなかった場合のアネキシンＶ陰性骨髄腫形質細胞の絶対数で除することによって、特定濃度の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解率も割り出した。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の特異性を確認するために、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞のような他のタイプの骨髄細胞におけるアネキシンＶの発現も測定した。図８に示されているように、患者骨髄腫形質細胞では、濃度依存的な特異的溶解が見られたが、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞の溶解は観察されなかった。加えて、ＣＤ３のみに結合し、ＢＣＭＡには結合しない対照ＴＣＢは、最も高いＴＣＢ抗体濃度において、骨髄腫形質細胞の細胞死を誘導しなかった。表１８に示されているように、最高濃度（３０ｎＭ）におけるアネキシンＶ陽性患者骨髄の骨髄腫細胞の割合は、４２－ＴＣＢｃｖでは５２．５４％、２２－ＴＣＢｃｖでは５５．７２％までに達したのに対して、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖでは２９．３１％であったことから、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の殺傷を誘導するには、４２－ＴＣＢｃｖと２２－ＴＣＢｃｖの方が、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも強力であると結論付けられた。

【表18】

【0314】

５人の異なるＭＭ患者から得た骨髄穿刺液における別の試験では、アネキシンＶ陰性細胞集団にゲーティングを行い、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度に対してプロットすることによって、生存骨髄腫形質細胞の割合を割り出した。ＥＣ５０値を測定し、最大生存骨髄腫形質細胞の５０％をもたらすＴＣＢ抗体濃度として割り出した。それぞれの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の存在下における生存骨髄腫形質細胞の最大値として、ＥＭＡＸ（％）を割り出した。５つの骨髄腫患者骨髄穿刺液試料の大半において、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖは、２２－ＴＣＢｃｖ及び４２－ＴＣＢｃｖよりも、骨髄腫形質細胞の溶解を誘導する能力がはるかに劣っていた（表２６、図９には、例として、５人の患者のうちの２人の濃度応答曲線が示されている）。２２－ＴＣＢｃｖまたは４２－ＴＣＢｃｖで処理した５つの患者試料のうちの５つで、生存骨髄腫細胞の濃度依存的な減少が観察されたのに対して、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖでは、５つの患者試料のうち、１つのみであった。表１９には、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖと、２２－ＴＣＢｃｖ及び４２－ＴＣＢｃｖとの比較、ならびに抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体が骨髄の骨髄腫形質細胞の生存能に及ぼす作用が示されている。２２－ＴＣＢｃｖ及び４２－ＴＣＢｃｖの方が、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも、それぞれの患者試料において、ＥＭＡＸ（％）値が低かったことにより示されているように、これらの結果から、２２－ＴＣＢｃｖ及び４２－ＴＣＢｃｖの方が、５つの患者試料のうちの４つで、生存骨髄腫形質細胞が少なかった（すなわち、骨髄腫形質細胞の溶解が多く見られた）ことが明確に示されている。患者の骨髄腫形質細胞の濃度依存的な特異的溶解が観察されたが、非悪性骨髄細胞の溶解は観察されなかった（データは示されていない）。

【表19】

【0315】

本発明で使用される新規な抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖと比較してさらに調べた際には、新たに採取した７つの患者全骨髄試料／穿刺液をＣＤ１３８磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色し、ａｕｔｏＭＡＣＳという細胞分離カラムに通し、十分な残存数のＭＭ形質細胞（通常４％超の骨髄腫形質細胞）を含む回収済み画分をさらなる実験で使用した。２４ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり５００，０００個の細胞をインキュベートし、４８時間培養した。０．１．ｐＭ～１０ｎＭの最終ＴＣＢ濃度になるように、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体と対照抗体の希釈液をそれぞれのウェルに加えた。各投与時点は、三連で行った。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎｅ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、ヨウ化プロピジウム／ＣＤ１３８－ＦＩＴＣによる二重染色によって、形質細胞と骨髄微小環境の細胞の生存能を調べた。ＦＡＣＳＤｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、データ解析を行った。図１０に示されているように、バープロットには、それぞれの培地対照（ＭＣ）の三連における平均に対して正規化された平均値が示されている。統計的解析では、片側ｔ検定を用いた。１０ｎＭの濃度における、ＭＭ形質細胞の成長の最大阻害率（ＩＭＡＸ１０）と、１ｎＭで測定した阻害率（ＩＭＡＸ１）はそれぞれ、培地対照に対する割合で求めた。培地対照との比較における、対照ＴＣＢ抗体（１０ｎＭ）の最大阻害率も示した。ＩＭＡＸ値の演算（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１３）を除き、Ｒ３．１．１９及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ２．１３１０を用いて演算処理を行った。その対応する統計的検定のＰ値が、５％未満（^＊）、１％未満（^＊＊）または０．１％未満（^＊＊＊）であった場合に、作用を統計的に有意なものとみなした。図１０Ａ～１０Ｇに示されているように、結果から、２２－ＴＣＢｃｖ及び４２－ＴＣＢｃｖでは、７つの患者試料のうち７つにおいて、生存骨髄腫形質細胞が８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも少なかった（すなわち、骨髄の骨髄腫形質細胞の溶解数が多かった）ことが明確に示されている。表２０には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、患者骨髄穿刺液由来の生存骨髄腫形質細胞の培地対照に対する割合が示されている。表２１には、ＩＭＡＸ１０とＩＭＡＸ１の値が示されている。これらの結果から、患者骨髄の骨髄腫形質細胞の殺傷を誘導するには、２２－ＴＣＢｃｖと４２－ＴＣＢｃｖの方が、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも明らかに強力であることが示されている。骨髄形質細胞（ＢＭＰＣ）の特異的溶解が、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導されたとともに、全ての骨髄患者試料で観察されたにもかかわらず、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）は、それぞれの試料において、影響を受けなかった（図１０Ｈ、７つの患者試料の代表的なもの）。

【表20-1】

【表20-2】

【表21-1】

【表21-2】

【0316】

実施例１４：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、患者骨髄Ｔ細胞のＴ細胞活性化（マルチパラメーターフローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体が、骨髄腫患者のＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞（すなわち、骨髄浸潤Ｔ細胞（ＭＩＬ））の活性化を誘導するかを評価するために、４８時間のインキュベート後のそれぞれの処置群、未処置群及び対照群由来の試料も、ＣＤ８／ＣＤ６９／ＴＩＭ－３／ＣＤ１６／ＣＤ２５／ＣＤ４／ＨＬＡ－ＤＲ／ＰＤ－１という８個のマーカーを含む抗体パネルに基づき調製したＦＡＣＳ抗体溶液で染色した。続いて、試料を１５分間、遮光下で室温においてインキュベートし、回収し、マルチカラーフローサイトメーターを用いて解析した。ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞集団にゲーティングを行ったＣＤ２５、ＣＤ６９及び／またはＨＬＡ－ＤＲ陽性発現を評価することによって、Ｔ細胞の活性化を割り出した。続いて、Ｔ細胞の活性化の割合を測定した。図１１には、多発性骨髄腫患者由来の骨髄浸潤ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞でのＣＤ６９及びＣＤ２５の濃度依存的なアップレギュレーションが示されている。表２２には、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体によって誘導された、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞でのＣＤ６９及びＣＤ２５の発現の増大（１人の患者から得たデータ）がまとめられている。

【表22-1】

【表22-2】

【0317】

実施例１５：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、患者骨髄Ｔ細胞のＴ細胞機能（サイトカインの産生）の向上（多重ビーズベースのイムノアッセイ／フローサイトメトリー）
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ及び４２－ＴＣＢｃｖ）が、骨髄腫患者の骨髄浸潤ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞のＴ細胞活性化と機能の向上を誘導するかを評価するために、４８時間のインキュベート後のそれぞれの処置群、未処置群及び対照群の培養物から上清を回収し、サイトカインとセリンプロテアーゼの含有量を測定した。サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）解析をマルチカラーフローサイトメーターで、メーカーの指示書に従って、Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｋｉｔ ＩＩ（ＢＤ＃５５１８０９）、またはヒトグランザイムＢ（ＢＤ＃５６０３０４）、ヒトＩＦＮ－γ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２６９）、ヒトＴＮＦ－α Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７３）、ヒトＩＬ－１０ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７４）、ヒトＩＬ－６ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７６）、ヒトＩＬ－４ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７２）、ヒトＩＬ－２ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤ＃５５８２７０）というＣＢＡ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔを組み合わせたもののいずれかを用いて行う。

【0318】

実施例１６：カニクイザルにおける薬物動態／薬力（ＰＫ／ＰＤ）試験
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢｃｖ抗体の利点のうち、その他の二重特異性抗体（（ｓｃＦｖ）_２（例えば、ＷＯ２０１３０７２４１５及びＷＯ２０１３０７２４０６に記載されているようなＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーＢｉＴＥ（登録商標））など）を上回ることができた明白な利点は、患者の携行するポンプを介して、数週間から数カ月間投与する治療を必要とする（ｓｃＦｖ）_２の非常に短い排泄半減期（例えば１～４時間）に比べて、インビボにおいて、排泄半減期がかなり長いこと／クリアランスが低いことであり、これにより、１週間に２回または１回のＩＶまたはＳＣ投与が可能になり得る（Ｔｏｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１１；２９（１８）：２４９３－８）。週に２回または１回の投与により、患者にとっての利便性が大きく向上し、リスク（例えば、ポンプの不具合、カテーテルによる問題など）も大きく低下する。

【0319】

ａ）抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体のインビボでの排泄半減期／クリアランスを確かめるために、ＡＡＡＬＡＣ認証済みの熟練のＣＲＯで、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体（８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ、２２－ＴＣＢｃｖ及び４２－ＴＣＢｃｖ）を用いた１回用量の薬物動態（ＰＫ）薬力（ＰＤ）試験を行った。生物学的にナイーブな成体カニクイザル（約２歳、体重約３ｋｇ）を少なくとも４０日間馴化し、体重、臨床観察結果及び臨床病態検査結果に基づき選択した。カニクイザルは、個々のタトゥーと色分けしたケージカードによって同定した。カニクイザルに対する全ての手順（飼育、健康モニタリング、拘束、投与などを含む）と倫理上の改正は、生物医学的研究で使用する動物の保護に関する規定を執行する現行の国内法規に従って行った。カニクイザルを、直近の試験前体重に基づき、無作為に処置群に割り当てた。許容不能な試験前所見が見られたカニクイザルを除外してから、試験前体重に関してバランスを取るように設計されたＰｒｉｓｔｉｍａ（登録商標）システムに含まれるコンピュータープログラムを用いて、極端な体重のカニクイザルを除外し、残りのカニクイザルを処置群に無作為に分けた。カニクイザルは、０．００３ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ及び０．３ｍｇ／ｋｇという３つの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ処置群に割り当てた（ｎ＝２匹。すなわち、１つの群当たり雌１匹、雄１匹）。カニクイザルに、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖを１回ｉ．ｖ．注射し、ＰＫ評価のために、投与前、投与から３０分後、９０分後、１８０分後、７時間後、２４時間後、４８時間後、９６時間後、１６８時間後、３３６時間後、５０４時間後という採取スケジュールと下記手順に従って、末梢静脈を介して、各時点に少なくとも０．８ｍＬの血液試料を採取した。血清を分離するために、血液試料をチューブ内で６０分間、室温で凝固させた。クロットを遠心分離によってスピンダウンした（少なくとも１０分、１２００ｇ、＋４℃）。得られた血清（約３００μＬ）は、さらなる解析を行うまで、－８０℃で直接保存した。大腿骨において、麻酔／鎮痛処置下で、投与前、投与から９６時間後及び３３６時間後という採取スケジュールに従って、ＰＫ評価用の骨髄試料も採取した。血清を分離するために、骨髄試料をチューブ内で６０分間、室温で凝固させた。クロットを遠心分離によってスピンダウンした（少なくとも１０分、１２００ｇ、＋４℃）。得られた骨髄（約１ｍＬ）は、さらなる解析を行うまで、－８０℃で直接保存した。ＰＫデータの解析と評価を行う。Ｗａｔｓｏｎパッケージ（ｖ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗａｌｔｍａｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）またはＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎシステム（ｖ．６．３、Ｃｅｒｔａｒａ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて、標準的なノンコンパートメント解析を行う。図１２及び表２３に示されているように、ＩＶ注射後、様々な時点に採取した血清試料から、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの血清中濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。表２４には、各処理群において、ＥＬＩＳＡによって測定した、骨髄中の８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの濃度が示されている（ＢＬＱは、定量化レベル未満を意味する）。

【0320】

二重特異性抗体の潜在的な臨床用途に関連するいくつかの情報は、図１２、表２３及び表２４から得ることができる。
－ＭＭ患者由来の骨髄穿刺液では、１ｎＭまたは１０ｎＭの濃度の、本発明のＴＣＢは、ＭＭ形質細胞の顕著な殺傷またはさらには完全な殺傷を誘導し、０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で、注射時点から１６８時間（７日目）の区間において、約１ｎＭ～４ｎＭの血漿濃度が得られたことから、週に１回、約０．０３ｍｇ／ｋｇの用量による治療が実現可能であり得ることが示された（２００ｎｇ／ｍｌは、約１ｎＭに相当する）。

【0321】

－図１２には、調査した用量範囲において、ＰＫが概ね用量線形的であり、平均濃度が用量に比例しており、臨床療法に有用な特性であることが示されている。

【0322】

－ＭＭは、主に骨髄で見られる疾患であり、骨髄で検出される８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの濃度は、血清中濃度に近く（表２４）、例えば、注射から９６時間後に、約１ｎＭ及び２ｎＭの骨髄中濃度が測定されたが、これらは、本発明で使用されるＴＣＢの濃度であって、ＭＭ患者から新たに採取した骨髄穿刺液において、ＭＭ形質細胞の顕著な殺傷が観察される濃度であり、このことからも、利便的な投与間隔（週に１回など）に好適であることが繰り返し示されている。

【0323】

－注射から２４～５０４時間後において、排泄は、概ね一次であるとともに、排泄半減期は約６～８日であり、このことからも、例えば週に１回の投与に好適であることが繰り返し示されている。

【表23】

【表24-1】

【表24-2】

【0324】

薬力（ＰＤ）測定：フローサイトメトリーによるＰＤ評価を行うために、７．５％のＫ３ ＥＤＴＡを含むチューブに、血液試料（採取時点：投与前、投与から２４時間後、４８時間後、９６時間後、１６８時間後、３３６時間後、５０４時間後、）と、骨髄試料（採取時点：投与前、投与から９６時間後及び３３６時間後）を採取し、１回用量としてｉ．ｖ．投与した８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖが、血液、骨髄形質細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞に及ぼす作用を評価する。表面マーカーの「溶血・洗浄」型直接免疫蛍光染色法を適用した。簡潔に述べると、ＣＤ４５／ＣＤ２／ＣＤ１６／ＣＤ２０／ＣＤ２７／ＣＤ３８またはＣＤ４５／ＣＤ２／ＣＤ１６／ＣＤ４／ＣＤ２５／ＣＤ８を含む２つの抗体混合物とともに、１００μＬの血液または骨髄を遮光下で３０分、＋４℃でインキュベートした。赤血球を溶解するために、溶血バッファー溶液２ｍＬを試料に加え、１５分、室温で遮光下においてインキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、染色バッファー（ＰＢＳ２％ウシ胎仔血清）で洗浄した。染色した試料は、同日にサイトメーターでデータの取得を行うまで、冷蔵保存し、光から保護した。ＦＡＣＳデータの取得は、４８８及び６３５のレーザー線のＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを搭載したＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメーターで行った。データの収集と解析には、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａというソフトウェアを用いた。二重プラットフォームで、血液分析装置（ＡＤＶＩＡ（商標）１２０、Ｓｉｅｍｅｎｓ）によるＷＢＣ数に基づき、絶対細胞数の計数を行った。図１３に示されているように、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖを１回用量でＩＶ処置した全てのカニクイザルにおいて、循環Ｔ細胞数の減少によって示されているように、末梢Ｔ細胞の再分布が観察された。図１４Ａに示されているように、処置したカニクイザルにおいては、０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖで処置してから２４時間後にすでに、血中形質細胞（ＢＣＭＡ陽性細胞）の減少が観察されたが、全Ｂ細胞（ＢＣＭＡ陰性細胞）の減少は見られなかった。図１４ｂには、カニクイザルにおいて、０．３ｍｇ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖで処置した後の血中形質細胞の減少動態が示されている。

【0325】

サイトカイン解析（ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ）用の血漿を得るためにも、投与前、投与から３０分後、９０分後、１８０分後、７時間後、２４時間後、４８時間後、９６時間後、１６８時間後という採取スケジュールに従って、血液試料を処理した。氷水浴中に保持したプラスチックチューブに血液試料を入れてから、遠心分離した（少なくとも１０分、１２００ｇ、＋４℃）。得られた血漿は、解析するまで、直接－８０℃で保存した。多重ビーズベースのサイトカインイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって、サイトカイン解析を行う。Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ４．１というソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてデータを解析し、５パラメーターロジスティック回帰モデル（５ＰＬ）を使用する。

【0326】

ｂ）さらなる試験において、カニクイザルを４２－ＴＣＢｃｖまたは２２－ＴＣＢｃｖで処置した。カニクイザル（ｎ＝２／群）には、４２－ＴＣＢｃｖを１回、ＩＶ注射（０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇ）もしくはＳＣ注射（０．０１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇ）注射するか、または２２－ＴＣＢｃｖ（０．１ｍｇ／ｋｇ）を１回、ＩＶ注射するかした。指定の採取スケジュールに従った時点に、血液試料と骨髄試料を採取し、それに応じて、ＰＫ及びＰＤの測定（免疫表現型分析及びサイトカイン産生）のために処理した。

【0327】

カニクイザルに、４２－ＴＣＢｃｖまたは２２－ＴＣＢｃｖ（ＩＶのみ）を１回ＩＶまたはＳＣ注射し、ＰＫ評価のために、投与前、投与から３０分後、９０分後、１８０分後、７時間後、２４時間後、４８時間後、９６時間後、１６８時間後、３３６時間後、５０４時間後という採取スケジュールと下記手順に従って、末梢静脈を介して、各時点の血液試料を採取した。血清を分離するために、血液試料をチューブ内で６０分間、室温で凝固させた。クロットを遠心分離によってスピンダウンした（少なくとも１０分、１２００ｇ、＋４℃）。得られた血清（約３００μＬ）は、さらなる解析を行うまで、－８０℃で直接保存した。大腿骨において、麻酔／鎮痛処置下で、投与前、投与から９６時間後及び３３６時間後という採取スケジュールに従って、ＰＫ評価用の骨髄試料も採取した。血清を分離するために、骨髄試料をチューブ内で６０分間、室温で凝固させた。クロットを遠心分離によってスピンダウンした（少なくとも１０分、１２００ｇ、＋４℃）。得られた骨髄（約１ｍＬ）は、さらなる解析を行うまで、－８０℃で直接保存した。ＰＫデータの解析と評価を行った。Ｗａｔｓｏｎパッケージ（ｖ７．４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗａｌｔｍａｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）またはＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎシステム（ｖ．６．３、Ｃｅｒｔａｒａ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＵＳＡ）を用いて、標準的なノンコンパートメント解析を行った。図１９及び表２４Ａ～Ｄに示されているように、ＩＶまたはＳＣ注射後、様々な時点に採取した血清試料と骨髄試料から、４２－ＴＣＢｃｖの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。多発性骨髄腫患者の骨髄穿刺液における４２－ＴＣＢｃｖの有効濃度範囲は、１０ｐｍ～１０ｎＭ（灰色の区域）に相当する。括弧内の濃度の単位は、ｎＭである。ＢＬＱは、定量化レベル未満、ｉ／ｍは、測定値不確定である。

【表24A-1】

【表24A-2】

【表24B】

【表24C-1】

【表24C-2】

【表24D】

【0328】

表２４Ａ及び２４Ｃの結果により、週に１回またはさらには２週間に１回の４２－ＴＣＢｃｖによる処置に適する魅力的な血清中濃度プロファイルが示されている。ＩＶ投与及びＳＣ投与後の血清中濃度の曲線下面積ＡＵＣを割り出し、ＡＵＣ値を比較したところ、４２－ＴＣＢｃｖのＳＣ注射において、１００％近い高いバイオアベイラビリティが示された。加えて、これらの結果から、４２－ＴＣＢｃｖの骨髄中濃度は、４２－ＴＣＢｃｖの血清中濃度と非常に近いことが示されている。４２－ＴＣＢｃｖの血清中濃度は、骨髄（すなわち、骨髄腫腫瘍細胞が多く存在する主な位置）において利用可能な４２－ＴＣＢｃｖの濃度を十分に表すことができた。

【0329】

薬力（ＰＤ）測定値は、ＰＫ測定値を裏付けるための有用な情報である。さらなるＰＤ解析を行った。血液由来のカニクイザルＣＤ２０^＋Ｂ細胞も、細胞表面にＢＣＭＡを発現し、血中の形質細胞よりも顕著に頻度が高い（絶対数が多い）。抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢｃｖ抗体の信頼性の高い薬力学的作用として、また、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ、４２－ＴＣＢｃｖ及び２２－ＴＣＢｃｖの間で、インビボでの有効性を比較する目的で、血中Ｂ細胞の除去を使用した。フローサイトメトリーと、血液分析装置によって得たＷＢＣ数とからなる二重のプラットフォームに基づき、絶対Ｂ細胞数を算出し、投与前、１０分のＩＶ注入から２４時間後、４８時間後、９６時間後及び１９６時間後という時点に測定した。Ｂ細胞除去率は、下記のように算出した。
＝［投与前における絶対Ｂ細胞数］－［各時点における絶対Ｂ細胞数］／［投与前における絶対Ｂ細胞数］×１００

【表24E-1】

【表24E-2】

【0330】

１回用量をＩＶ注射後のカニクイザルにおいて、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞の除去を誘導するには、４２－ＴＣＢｃｖと２２－ＴＣＢｃｖの方が、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも強力である（表２４Ｅを参照されたい）。これらの３つの分子は、同じ分子構造とＣＤ３結合部を有するので、カニクイザルにおける有効性の差は主に、それぞれのＢＣＭＡ抗体に起因すると見られた。

【0331】

ＩＶ注射後のカニクイザルにおけるＢＣＭＡ発現Ｂ細胞の除去が、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢｃｖ抗体の力学的な薬力作用によるものかを確かめるために、ＩＶ注射から４日（９６時間）後及び３週間（３３６時間）後に、ＢＣＭＡ陽性細胞（すなわち標的細胞）が濃縮された骨髄において、活性化ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞（すなわち、エフェクター細胞）の増加を測定した。フローサイトメトリーと、血液分析装置によって得たＷＢＣ数からなる二重のプラットフォームに基づき、絶対ＣＤ８^＋ ＣＤ２５^＋活性化Ｔ細胞数を算出した。

【表24F】

【0332】

１回用量をＩＶ注射後のカニクイザルにおいてＴ細胞の活性化を誘導するには、４２－ＴＣＢｃｖと２２－ＴＣＢｃｖの方が、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖよりも強力である（表２４Ｆを参照されたい）。これらの３つの分子は、同じ分子構造とＣＤ３結合部を有するので、カニクイザルにおける薬力学的作用の差は主に、それぞれのＢＣＭＡ抗体に起因すると見られた。これらの結果から、骨髄中及び血中のＢＣＭＡ陽性Ｂ細胞の除去は、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢｃｖ抗体によって誘導される、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化によるものである可能性が最も高いことが示されている。

【0333】

実施例１７：ＰＢＭＣ－ヒト化ＮＯＧマウスを用いた、Ｈ９２９ヒト骨髄腫異種移植モデルにおける、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された抗腫瘍活性
Ｆｃ含有抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢｃｖ抗体は、排泄半減期が長いことにより、等モル用量で、週に１回のスケジュールで投与した（ｓｃＦｖ）_２ベースの二重特異性抗体（ＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）など）よりも有効と見られた。ＰＢＭＣ－ヒト化ＮＯＧマウスにおいて、Ｈ９２９ヒト骨髄腫異種移植モデルで、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖとＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（ＷＯ２０１３０７２４１５及びＷＯ２０１３０７２４０６に記載されているようなもの）のインビボ作用を比較及び評価した。ＮＯＧマウスは、ヒト化マウスモデルに適する。常在ＮＫ細胞集団を含む免疫細胞を完全に欠損しているので、ヒト異種細胞の腫瘍の生着への許容性が高いからである（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８；３２４：５３－７６）。簡潔に述べると、試験の０日目（ｄ０）に、５０：５０でマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を含む１００μｌのＲＰＭＩ １６４０ 培地中の５×１０^６個のヒト骨髄腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９（ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８（商標））を、８～１０週齢の免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒγ（ｎｕｌｌ）（ＮＯＧ）雌マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｒｙ，Ｄａｎｅｍａｒｋ）の右側の背側腹側部に皮下（ＳＣ）注射した。Ｈ９２９腫瘍細胞のＳＣ移植の２４時間～７２時間前に、全てのマウスに、γ源（１．４４Ｇｙ、^６０Ｃｏ、ＢｉｏＭｅｐ、Ｂｒｅｔｅｎｉｅｒｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）で全身照射を行った。１５日目（ｄ１５）に、ＮＯＧマウスに、２×１０^７個のヒトＰＢＭＣ（５００μｌのＰＢＳ１×、ｐＨ７．４中）を１回腹腔内（ＩＰ）注射した。ヒトＰＢＭＣの特徴付けは、免疫表現型分析（フローサイトメトリー）によって行った。続いて、Ｖｉｖｏ ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）というソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、マウスを慎重に、種々の処置群と対照群（ｎ＝９匹／群）に無作為に分け、統計的検定（分散分析）を行って、群間の均質性について検定した。１９日目（ｄ１９）、すなわち、Ｈ９２９腫瘍細胞をＳＣ注射してから１９日後であって、全てのマウスにおいて、腫瘍体積が少なくとも１００～１５０ｍｍ^３に達した時点（ビヒクルで処置した対照群では、平均腫瘍体積が３００±１６１ｍｍ^３、２．６ｎＭ／ｋｇの対照ＴＣＢで処置した群では、３１５±１４８ｍｍ^３、２．６ｎＭ／ｋｇの８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ群では、２９３±１３５ｍｍ^３、２．６ｎＭ／ｋｇのＢＣＭＡ５０－（ｓｃＦｖ）_２（ＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標））群では、３０７±１３８ｍｍ^３）に、抗体による処置を開始した。ＴＣＢ抗体による処置スケジュールは、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖですでに得た薬物動態の結果に基づくもので、３週間まで、週に１回ＩＶ投与すること（すなわち、ＴＣＢ抗体を合わせて３回注射すること）から構成されていた。宿主マウスをヒトＰＢＭＣで再構成（ｄ１９）してから４日後に、１回目の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ抗体（それぞれ、２．６ｎＭ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈注射した。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ及び対照ＴＣＢｃｖで処置した全ての群のマウスにおいて、各処置の１時間前、２回目の処置の２時間前及び最後に、血液試料を頸静脈／下顎静脈穿刺（麻酔下）によって採取した。凝固活性化剤の入ったチューブ（Ｔ ＭＧチューブ、チェリーレッドのキャップ、Ｃａｐｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標））に、血液試料をすぐに移した。チューブを室温で３０分置いて、凝固させた。続いて、クロット／血清の分離のために、チューブを１，３００ｇで５分間遠心分離した。血清アリコートを調製し、液体窒素で急速冷凍し、さらなる解析を行うまで、－８０℃で保存した。試験中に、腫瘍体積（ＴＶ）をノギスによって測定し、ＴＶの群間比較によって進行を評価した。腫瘍成長率（ＴＧ（％）として定義した）は、ＴＧ（％）＝１００×（解析群のＴＶ中央値）／（対照ビヒクル処置群のＴＶ中央値）によって割り出した。倫理的な理由から、ＴＶが少なくとも２０００ｍｍ^３に達したら、マウスを安楽死させた。図１５には、（Ａ）対照群（ビヒクル対照（実線）と対照ＴＣＢ（破線）を含む）、（Ｂ）８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群、及び（Ｃ）ＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）という実験群ごとに、各個別マウスのＴＶが示されている。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群では、９匹のマウスのうち６匹（６７％）において、腫瘍が退縮し、ｄ１９、すなわち、１回目のＴＣＢによる処置を行った日に記録したＴＶまでを下回り、腫瘍の退縮は、試験終了まで維持された。８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）処置群のマウスは、腫瘍が退縮を示さず、ｄ１９に、ＴＶがそれぞれ、３７６ｍｍ^３、４０２ｍｍ^３及び５２２ｍｍ^３であった。これに対して、週に１回のスケジュールで３週間、等モル用量のＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）で処置した９匹のマウスのうち、いずれかの時点に、腫瘍が退縮したマウスはいなかった（０％）。表２５には、全ての実験群における経時的な腫瘍体積の進行が示されている。ｄ１９～ｄ４３に腫瘍成長率を算出し、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群とＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）群との間で比較した（図１６）。結果から、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（２．６ｎＭ／ｋｇ）群においては、ＴＧ（％）が一貫してかつ顕著に低下するとともに、ＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）（２．６ｎＭ／ｋｇ）と比べると、そのＴＧ（％）が常に低いことが示されている。表２６には、１９～４３日目における腫瘍体積（ＴＶ）の中央値と腫瘍成長率（ＴＧ（％））が示されている。全体的な結果から、等モル用量で、週に１回のスケジュールで３週間投与するとき、インビボで抗腫瘍活性を誘導するには、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖの方がＢＣＭＡ５０－ＢｉＴＥ（登録商標）よりも優れていることが明確に示されている。

【表25-1】

【表25-2】

【表25-3】

【表25-4】

【表25-5】

【表25-6】

【表25-7】

【表25-8】

【表26-1】

【表26-2】

【0334】

実施例１９：自己Ｔ細胞の存在下において、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、形質細胞性白血病（ＰＣＬ）患者の末梢血単核球細胞または骨髄穿刺液由来の形質細胞へのリダイレクトＴ細胞による細胞傷害性（フローサイトメトリーによって測定したもの）
形質細胞性白血病（ＰＣＬ）は、原発的に発症するかまたは臨床的に既存の多発性骨髄腫（ＭＭ）に起因するかのいずれかである、骨髄腫の白血病異型である。現在利用可能な治療は、かなり限られており、主に、ＭＭ薬と化学療法を組み合わせたものから構成されている。これまで、侵襲性と致死性の高いこの疾患用に明示的に登録された療法はなかった。ＢＣＭＡは、正常形質細胞の生存において不可欠な役割を果たし、形質細胞性白血病患者の形質細胞性白血病の治療に、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体を用いることができる。Ｆｉｃｏｌｌを用いる密度勾配またはその他の匹敵する方法によって、形質細胞を８０％超含む高白血球数の形質細胞性白血病患者試料に由来する、新たな末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、２４時間及び４８時間、０．１ｐＭ～３０ｎＭの抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の濃度または対照抗体とともに、３７℃で、加湿空気環境においてインキュベートした。形質細胞性白血病患者の全骨髄穿刺液も試料として用いることができる。各投与時点は、三連で行う。全集団と、ＣＤ１３８陽性細胞のアネキシン／ヨウ化プロピジウム染色によって、Ｄｉｖａというソフトウェア（ＢＤ）を用いるＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで、アポトーシスを割り出す。ヨウ化プロピジウム／ＣＤ１３８－ＦＩＴＣ二重染色によって、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎｅ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、形質細胞及びＰＢＭＣ全集団の生存能を調べる。ＦＡＣＳＤｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎｅ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、データ解析を行う。それぞれの培地対照（ＭＣ）の三連における平均に対して、平均値を正規化する。統計的解析では、片側ｔ検定を使用する。１０ｎＭの濃度における、ＰＣＬ細胞の成長の最大阻害率（ＩＭＡＸ１０）と、１ｎＭにおいて測定した阻害率（ＩＭＡＸ１）をそれぞれ、培地対照に対する割合で求める。培地対照との比較における、対照ＴＣＢ抗体の最大阻害率（１０または３０ｎＭ）も測定する。

【0335】

ＩＭＡＸ値（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１３）を除き、Ｒ３．１．１９及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ２．１３１０を用いて演算処理を行う。対応する統計的検定のＰ値が５％未満（^＊）、１％未満（^＊＊）または０．１％未満（^＊＊＊）である場合に、作用を統計的に有意であるとみなす。形質細胞性白血病患者試料由来のＰＢＭＣ ＣＤ１３８^＋形質細胞において、ＢＣＭＡの発現も測定するとともに、エフェクター細胞と腫瘍細胞の比率（Ｅ：Ｔ）も割り出す。図２０に示されているように、これらの結果から、２つの形質細胞性白血病患者試料では、培地対照と比べて、４２－ＴＣＢｃｖによって、生存骨髄形質細胞白血病細胞が顕著に低下した（すなわち、骨髄形質細胞白血病細胞の溶解が多く見られた）ことが明確に示されている。表２７には、１０ｎＭ（ＩＭＡＸ１０）及び１ｎＭ（ＩＭＡＸ１）の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、患者骨髄穿刺液または末梢血由来の形質細胞白血病細胞の最大阻害率（培地対照に対するもの）が示されている。これらの結果から、４２－ＴＣＢｃｖが、患者骨髄形質細胞白血病細胞の殺傷を誘導するのに非常に強力であることが示されている。骨髄形質細胞白血病細胞の特異的溶解が、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導されたとともに、骨髄試料で観察された（ＰＣＬ患者１）にもかかわらず、骨髄微小環境（ＢＭＭＥ）は、それぞれの試料において、影響を受けなかった（データは示されていない）。

【0336】

ＥＭ９０１の使用によるＰＣＬ患者における悪性形質細胞の殺傷は、強力である。しかし、１０ｎＭの最高濃度で試験した２つの患者試料のうちの少なくとも１つで、殺傷は、５０％をほんの少しだけ上回る。ＥＭ９０１とサリドマイドまたはＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＤ３８抗体のいずれかの組み合わせによる実験は、このような組み合わせの強力な利益、例えば、ＥＭ９０１の、例えば、１０ｎＭまたは他の濃度で高い殺傷％を示すであろう。

【表27】

【0337】

実施例２０：自己Ｔ細胞の存在下で、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体によって誘導された、ＡＬアミロイドーシス患者由来の骨髄形質細胞へのリダイレクトＴ細胞による細胞傷害性（フローサイトメトリーによって測定したもの）
ＡＬアミロイドーシスは、骨髄の傷害を原因とする希少疾患であり、通常、５０～８０歳の人が罹患し、患者の３分の２は男性である。ＡＬアミロイドーシスは、形質細胞による抗体／免疫グロブリンタンパク質の異常な産生によって映し出される。ＡＬアミロイドーシスでは、抗体の軽鎖（ＬＣ）がミスフォールディングし、ＬＣのミスフォールディングした異常なタンパク質に起因して、アミロイドが形成される。これらのミスフォールディングアミロイドタンパク質は、組織、神経及び器官の中及び周囲に沈着する。器官、神経または組織にアミロイドが蓄積すると、それらの機能を徐々に損傷し、悪影響を与える。ＡＬアミロイドーシス患者は、１つ以上の器官を冒されることが多い。ＢＣＭＡは、正常形質細胞の生存において不可欠な役割を果たすので、ＡＬアミロイドーシスにおける形質細胞の殺傷における抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体の作用を評価するのは非常に理にかなっている。新たに採取したＡＬアミロイドーシス患者全骨髄試料／穿刺液を直接、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体に暴露するか、またはＣＤ１３８磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、ａｕｔｏＭＡＣＳという細胞分離カラムに通し、十分な残存数のＡＬアミロイドーシス形質細胞（通常、４％超）を含む回収画分を、さらなる実験で用いる。２４ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり５００，０００個の細胞をインキュベートし、４８時間培養する。０．１ｐＭ～３０ｎＭの最終ＴＣＢ濃度になるように、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢ抗体と対照抗体の希釈液を各ウェルに加える。各投与時点は、三連で行う。ヨウ化プロピジウム／ＣＤ１３８－ＦＩＴＣ二重染色によって、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎｅ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、形質細胞と骨髄微小環境の細胞の生存能を調べる。ＦＡＣＳＤｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎｅ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、データ解析を行う。さらに、ＥＭ９０１と、サリドマイドまたは抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＤ３８抗体との組み合わせも、同じ実験設定で試験する。種々の濃度のＥＭ９０１ならびに組み合わせパートナーを試験する。

【0338】

それぞれの培地対照（ＭＣ）の三連における平均に対して、平均値を正規化する。統計的解析では、片側ｔ検定を使用する。１０ｎＭの濃度における、ＰＣＬ細胞の成長の最大阻害率（ＩＭＡＸ１０）と、１ｎＭにおいて測定した阻害率（ＩＭＡＸ１）をそれぞれ、培地対照に対する割合で求める。培地対照との比較における、対照ＴＣＢ抗体の最大阻害率（１０または３０ｎＭ）も測定する。組み合わせで得られた結果から、例えば、ｘｎＭの、例えば、レナリドマイドなどの存在下における、例えば、１０ｎＭ ＥＭ９０９１での最大阻害率からも同じ値を割り出す。ＩＭＡＸ値（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ２０１３）を除き、Ｒ３．１．１９及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ２．１３１０を用いて演算処理を行う。対応する統計的検定のＰ値が、５％未満（^＊）、１％未満（^＊＊）または０．１％未満（^＊＊＊）である場合に、作用を統計的に有意であるとみなす。ＡＬアミロイドーシス患者試料由来の骨髄ＣＤ１３８^＋形質細胞において、ＢＣＭＡの発現も測定するとともに、エフェクター細胞と腫瘍細胞の比率（Ｅ：Ｔ）を割り出す。

【0339】

実施例２１：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体と免疫療法薬との併用
抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体（すなわち、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖまたは４２－ＴＣＢｃｖ）を、異なる種類の免疫療法を表す３つの薬物：レナリドマイド、抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＤ３８抗体ダラツムマブと組み合わせた。Ｈ９２９ＭＭ細胞を、加湿された５％ＣＯ_２インキュベーター中で、３７℃にて、１０％ ＦＢＳ、０．５％ ゲンタマイシン及び１％ Ｌ－グルタミンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地において、健常なドナー（ｎ＝１または５）由来のヒト白血球と共培養し、準最適濃度の８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖ（１０ｐＭ）（ｎ＝５）または４２－ＴＣＢｃｖ（１０ｐＭ）（ｎ＝１）を単独で、またはレナリドマイド（１μＭ）、抗ＰＤ－１抗体（１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３８抗体ダラツムマブ（１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせてチャレンジした。図２１Ａに示されているように、８３Ａ１０－ＴＣＢｃｖをレナリドマイドまたはダラツムマブと組み合わせることで、それらの抗ＭＭ有効性をそれぞれ４倍及び２．５倍に著しく向上させた。図２１Ｂ及び表２８は、１人の健常なドナー由来のＨ９２９細胞及び白血球を、４２－ＴＣＢｃｖ（１０ｐＭ）に、レナリドマイド（１μＭ）、抗ＰＤ－１抗体（１０μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３８抗体ダラツムマブ（１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせて４８時間の培養で暴露させた際のＭＭ細胞溶解のパーセンテージを示す。４２－ＴＣＢｃｖをレナリドマイドまたはダラツムマブと組み合わせることでも、ＭＭ細胞株を殺傷するためのそれらの抗ＭＭ有効性を向上させた。

【表28】

【0340】

実施例２２：抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ Ｔ細胞二重特異性抗体と、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体とのインビボ併用
ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞上のそのレセプターＰＤ－１に係合する際にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断し、Ｔ細胞応答のダウンモジュレーションを阻害する、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢと抗体（抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれか）との付加または相乗的な組み合わせは、インビトロの代わりに、ＭＭ異種移植モデルまたはＭＭマウスモデルなどのインビボ設定で最適に観察することができる。簡潔に述べると、試験の０日目（ｄ０）に、５０：５０でマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地１００μｌ中の５×１０^６個のヒト骨髄腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９（ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ－９０６８商標）を、８～１０週齢の免疫不全ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ ＩＬ２ｒγ（ｎｕｌｌ）（ＮＯＧ）雌マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｒｙ，Ｄａｎｅｍａｒｋ）の右側の背側腹側部に皮下（ＳＣ）注射する。１５日目（ｄ１５）に、ＮＯＧマウスに、２×１０^７個のヒトＰＢＭＣ（ＰＢＳ１×（ｐＨ７．４）５００μＬ中）を１回、腹腔内（ＩＰ）注射した。ヒトＰＢＭＣの特徴付けは、免疫表現型分析（フローサイトメトリー）によって行う。続いて、マウスを慎重に、種々の処置群と対照群（ｎ＝９匹／群）に無作為に分け、統計的検定（分散分析）を行って、群間の均質性について検定する。１９日目（ｄ１９）に、すなわち、Ｈ９２９腫瘍細胞のＳＣ注射後の１９日目に、全てのマウスにおいて、腫瘍体積が少なくとも１００～１５０ｍｍ^３に達したら、抗体による処置を開始する。ＴＣＢ抗体による処置スケジュールは、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３ ＴＣＢで事前に得られた薬物動態結果に基づいており、３週間まで、１週間に１回、ＩＶ投与すること（すなわち、ＴＣＢ抗体を合わせて３回注射すること）から構成されていた。宿主マウスをヒトＰＢＭＣで再構成（ｄ１９）してから２～４日後に、１回目の週用量の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体（用量：０．１～０．５ｍｇ／ｋｇ）を単独で、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（これも週１回与えた（用量：１～１０ｍｇ／ｋｇ））と組み合わせて尾静脈注射した。試験中に、腫瘍体積（ＴＶ）をノギスによって測定し、ＴＶの群間比較によって進行を評価する。腫瘍成長率（ＴＧ（％）として定義した）は、ＴＧ（％）＝１００×（解析群のＴＶ中央値）／（対照ビヒクル処置群のＴＶ中央値）によって割り出す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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