特許 7268019 スペルミジン産生のための微生物細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-24

(45)【発行日】2023-05-02

(54)【発明の名称】スペルミジン産生のための微生物細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20230425BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230425BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230425BHJP

   C12P 13/00 20060101ALI20230425BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230425BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20230425BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20230425BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20230425BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20230425BHJP

【ＦＩ】

C12N1/19

C12N1/15 ZNA

C12N1/21

C12P13/00

C12N15/09 Z

C12N15/53

C12N15/54

C12N15/55

C12N15/60

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2020523674

(86)(22)【出願日】2018-07-13

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-09-10

(86)【国際出願番号】 SE2018050763

(87)【国際公開番号】W WO2019013696

(87)【国際公開日】2019-01-17

【審査請求日】2021-06-07

(31)【優先権主張番号】1750933-2

(32)【優先日】2017-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE

(73)【特許権者】

【識別番号】520011050

【氏名又は名称】クリシア リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キン、ジンフー

(72)【発明者】

【氏名】クリボルクコ、アナスタシア

(72)【発明者】

【氏名】ダビッド、フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】ニールセン、イェンス

【審査官】林 康子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／１４４２４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第０１／００９３５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００９－５０１５５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】Pirkov I et al，FEBS Journal，2008年，Vol 275 No 16，4111-4120

【文献】Umeyama T et al，ACS Synthetic Biology，2013年，Vol 2 No 8，425-430

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｐ １３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

スペルミジンを産生することが可能な微生物細胞であって、
前記微生物細胞が、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．５０）およびスペルミジン合成酵素（ＥＣ ２．５．１．１６）の過剰発現のために遺伝子修飾され；
前記微生物細胞が、メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）（ＥＣ ２．４．２．２８）、および分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ）（ＥＣ ２．６．１．５、ＥＣ ２．６．１．５７、ＥＣ ２．６．１．４２）からなる群から選択されるメチオニンサルベージ経路中の少なくとも１つの酵素の過剰発現により、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）生合成の促進のために遺伝子修飾され、
前記微生物細胞が、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素（ＯＡＺ）の活性の減弱、またはＯＡＺ１をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊のために遺伝子修飾され、並びに
前記微生物細胞が、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）（ＥＣ ４．１．１．１７）の過剰発現のために遺伝子修飾される、
上記微生物細胞。

【請求項2】

前記微生物細胞が、さらにＮ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）（ＥＣ ２．３．１．１）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．２．８）、Ｎ－アセチル－γ－グルタミルリン酸レダクターゼ（ＥＣ １．２．１．３８）、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１１）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（ＥＣ ３．５．１．１６）、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．３５）からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現のために遺伝子修飾される、請求項１に記載の微生物細胞。

【請求項3】

前記微生物細胞が、Ｌ－オルニチントランスアミナーゼ（ＥＣ ２．６．１．１３）、および／もしくはオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）（ＥＣ ２．１．３．３）の活性の減弱、またはＬ－オルニチントランスアミナーゼをコードする遺伝子、およびＯＴＣをコードする遺伝子からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の欠失もしくは破壊のために遺伝子修飾される、請求項１又は２に記載の微生物。

【請求項4】

前記微生物細胞が、Ｓ－アデノシルメチオニン合成酵素（ＭＡＴ）（ＥＣ ２．５．１．６）の過剰発現によるＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）生合成の促進のために遺伝子修飾される、請求項１～３のいずれか一項に記載の微生物細胞。

【請求項5】

前記微生物細胞が、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）（ＥＣ １．５．１．２０）の過剰発現によるＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）生合成の促進のために遺伝子修飾される、請求項１～４のいずれか一項に記載の微生物細胞。

【請求項6】

前記微生物細胞が、ホスホリボシル二リン酸（ＰＲＰＰ）５－アミドトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．２．１４）の過剰発現によるＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）生合成の促進のために遺伝子修飾される、請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物細胞。

【請求項7】

前記微生物細胞が、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドのメチオニンへの変換の促進のために遺伝子修飾される、請求項１～６のいずれか一項に記載の微生物細胞。

【請求項8】

前記微生物細胞が、ホモセリンデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．１．１．３］；ホモセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３１］；Ｏ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼ［ＥＣ ２．５．１．４９］（Ｏ－アセチルホモセリンアミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼとも称される）；および５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ（ＭＥＴＥ）［ＥＣ ２．１．１．１４］からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現による、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドのメチオニンへの変換の促進のために遺伝子修飾される、請求項７に記載の微生物細胞。

【請求項9】

前記微生物細胞が、ピルビン酸塩のＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへの変換の促進のために遺伝子修飾される、請求項１～８のいずれか一項に記載の微生物細胞。

【請求項10】

前記微生物細胞が、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ ６．４．１．１）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．６．１．１）、アスパラギン酸キナーゼ（ＡＫ）（ＥＣ ２．７．２．４）、およびアスパラギン酸βセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．２．１．１１）からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現による、ピルビン酸塩のＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへの変換の促進のために遺伝子修飾される、請求項９に記載の微生物細胞。

【請求項11】

前記微生物細胞が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩメディエーター複合体のサブユニットであるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１１（配列番号：３１）の過剰発現のために遺伝子修飾される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の微生物細胞。

【請求項12】

前記微生物細胞が、スペルミン合成酵素（ＥＣ ２．５．１．２２）の過剰発現によるスペルミン生合成の促進のために遺伝子修飾される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の微生物細胞。

【請求項13】

前記微生物細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＲ１（配列番号：３０）および／またはＰＤＲ２（配列番号：１２９）の過剰発現のために遺伝子修飾される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の微生物細胞。

【請求項14】

微生物細胞からのスペルミジンの産生に好適な培養培地中および培養条件において、請求項１～１３のいずれか一項に記載の微生物細胞を培養すること、ならびに
前記培養培地および／または前記微生物細胞からスペルミジンを収集すること、
を含む、スペルミジンを産生する方法。

【請求項15】

食品添加物としての、請求項１～１３のいずれか一項に記載の微生物細胞の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は全体として遺伝子操作微生物の開発に関する。より具体的には、本発明は、経済的な様式で長寿促進化合物スペルミジンを産生することができる微生物細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

スペルミジンは、微生物、植物および動物において普遍的に見出される、低分子量の脂肪族窒素化合物である。細胞内で、それはＬ－オルニチン（Ｌ－アルギニン生合成における中間体）に由来する。近年、この化合物は、微生物から哺乳動物の範囲の多様な生物体において寿命を増進することを示した。加えて、スペルミジン取込みが多様な加齢関連病態（癌、多発性硬化症、骨粗鬆症、心血管性疾患、記憶障害、皮膚加齢、および脱毛を包含する）に対して緩和または保護することも示された。したがって、この化合物の経済的で確実で持続可能な供給を得ることについての興味が増している。

【0003】

複数の発明は、スペルミジンの化学的合成を記載している。しかしながら、これらの方法は、高価な基質の問題、鏡像異性的純度の低さ、または環境に優しくないことのいずれかに悩まされる。

【0004】

スペルミジンは、生物源（コムギ胚芽等）にも由来し得る。しかしながら、最も多くスペルミジンを生ずる天然源でさえおよそ２００μｇ／ｇのレベルでしかスペルミジンを産生せず、純粋産物を得ることを非常に高価にする。

【0005】

微生物源からのスペルミジンの産生はこれらの問題を克服することができた。しかしながら、微生物性源は天然では低レベルのスペルミジンのみを産生し、したがって、追加の操作が経済的に実現可能な産生レベルを得るために要求される。今日まで、ほんの少数の研究しか、スペルミジンを過剰産生する微生物細胞の操作を記載していない。

【0006】

Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ［１］は、スペルミジン産生遺伝子を過剰発現させてスペルミジンを過剰産生させる（３５ｍｇ／Ｌのスペルミジンをもたらす）ことと組み合わせた、酵母細胞におけるオルニチン代謝の操作を記載した。

【0007】

Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ［２］およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ［３］は、細胞内スペルミジンの産生促進のために操作された酵母細胞を報告した。これらの細胞において、ＯＡＺ１（スペルミジン生合成経路のフィードバック阻害に関与するタンパク質であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）抗酵素をコードする）およびポリアミン輸送タンパク質をコードするＴＰＯ１が破壊されて、ＯＤＣに対するフィードバック阻害の緩和およびスペルミジン分泌の防止のそれぞれを介して細胞内スペルミジン値を増加させた。これは、スペルミジン合成遺伝子と組み合わせて、グラム乾燥細胞重量（ＤＣＷ）あたり１．１ｍｇのスペルミジンの含有量で、細胞スペルミジン含有量の増加を導いた。

【0008】

Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ［４］は、ＯＡＺ１の破壊、輸送担体ＴＰＯ１の発現、および発酵の至適化と組み合わせて、酵母においてスペルミジン合成遺伝子を過剰発現させ、バッチで６３．６ｍｇ／Ｌ、およびフェドバッチで最大２２４ｍｇ／Ｌ（２．２ｍｇ／ｇ糖）のスペルミジンがもたらされることを報告した。

【0009】

しかしながら、微生物細胞中でのスペルミジン産生について、当分野での改善のための余地が依然として存在する。

【発明の概要】

【0010】

本発明の主要な目的はスペルミジン産生のために改善された微生物細胞を提供することである。かかる細胞は、スペルミジンの発酵ベースの産生のために使用され得る。本明細書において開示される微生物細胞および方法は、スペルミジン産生に関与する補因子または補基質（特にＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ））の合成および再生に関連する経路の修飾と、スペルミジン経路遺伝子の過剰発現を組み合わせる。ＳＡＭは後続してＳ－アデノシルメチオニンアミン（ｄＳＡＭ）へ変換され、スペルミジン合成において使用され得る。

【0011】

実施形態の態様は、スペルミジンを産生することが可能な微生物細胞に関する。微生物細胞は、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼおよび／またはスペルミジン合成酵素の過剰発現のために遺伝子修飾される。微生物細胞は、ＳＡＭ生合成の促進のためにも遺伝子修飾される。

【0012】

実施形態の別の態様はスペルミジンを産生する方法に関する。方法は、培養培地中で、および微生物細胞からのスペルミジンの産生に好適な培養条件において、実施形態に従う微生物細胞を培養することを含む。方法は、培養培地および／または微生物細胞からスペルミジンを収集することも含む。

【0013】

実施形態のさらなる態様は、食品添加物としての実施形態に従う微生物細胞の使用に関する。

【0014】

微生物細胞中でスペルミジン産生を増加させる以前の取り組みは、ＳＡＭデカルボキシラーゼの過剰発現と、プトレシンをスペルミジンへ変換する遺伝子の過剰発現を組み合わせていた。ｄＳＡＭのレベルの増加はスペルミジン産生のために有益であることが示されたが、研究は、ＳＡＭそれ自体がスペルミジン産生についての制限因子であることを報告していない。本発明者は、ＳＡＭそれ自体がスペルミジン産生について実際は限定することを意外にも見出した。ｄＳＡＭ（それは主にスペルミジンおよびスペルミンの産生に関与する）とは異なり、ＳＡＭが細胞中でよくみられる補基質であるので、これは意外なことであった。この補基質の前駆物質プールを増加させること、および／またはＳＡＭのリサイクルを増加させることによって、スペルミジン産生を有意に増加させることができた。以前に報告されたストラテジーとこのストラテジーを組み合わせることによって、本発明者は、＞１ｇ／Ｌおよび＞３０ｍｇ／ｇ ＤＣＷのスペルミジンの記録を生ずることができ、これは、以前のプロセスを上回る有意な改善を表わした。

【0015】

実施形態は、さらなる目的およびその利点と共に、添付の図面と一緒に以下の記載を参照することによって最も良好に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】真核生物微生物細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）中でのグルコースからスペルミジンの産生を導く生来の経路の概説。区画化無しににもかかわらず、類似する反応が原核生物の微生物においても起こる。オルニチン経路を経由してスペルミジン産生を増加させるのに標的とされ得る重要な反応について、ＥＣ番号を示す。ＥＣ番号の隣の上向き灰色矢印は遺伝子修飾を経由して増加する反応を表わす一方で、下向き矢印は減少する反応を表わす。

【図2】ＳＡＭ経路を経由してスペルミジン産生を増加させる、本発明において標的とされる反応の概説。重要な反応についてＥＣ番号を示す。ＥＣ番号の隣の上向き灰色矢印は遺伝子修飾を経由して増加する反応を表わす一方で、下向き矢印は減少する反応を表わす。略語：ＳＡＭ：Ｓ－アデノシルメチオニン、ｄＳＡＭ：Ｓ－アデノシルメチオニンアミン、ＭＴＡ：５’－メチルチオアデノシン、ＭＲＰ：Ｓ－メチル－５－チオ－Ｄ－リボース１－リン酸、ＭＯＢ：４－メチルチオ－２－オキソブタン酸、ＴＨＦ：メチレンテトラヒドロ葉酸、Ｈ２Ｓ：硫化水素。

【図3】異種経路遺伝子の過剰発現による微生物細胞中でのスペルミジンの産生。この例において、スペルミジンはプトレシンおよびＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドの縮合から産生される。異種酵素のカルボキシ（ノル）スペルミジンデヒドロゲナーゼ（ＣＡＳＤＨ／ＣＡＮＳＤＨ）［ＥＣ １．５．１．４３］およびカルボキシ（ノル）スペルミジンデカルボキシラーゼ（ＣＡＳＤＣ／ＣＡＮＳＤＣ）［ＥＣ ４．１．１．９６］を、酵母細胞中で過剰に発現させる。酵素を、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（プラスミドＹＰ１）またはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（プラスミドＹＰ２）のいずれかから採取する。酵母中でのこれらの酵素の過剰発現はスペルミジン産生の増加をもたらす。

【図4】スペルミジン合成遺伝子の過剰発現とＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒド形成へ導く経路のアップレギュレーションを組み合わせることによる、微生物細胞中でのスペルミジンの産生。Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドに向けたフラックスの増加を、異種のアスパラギン酸キナーゼ（Ｃｇｌｙｃｍ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（Ｃｇａｓｄ）、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＣｇａｓｐＢ）の過剰発現によって達成した。加えて、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＯＭ６）をコードする内在性遺伝子の前へ弱いＫｅｘ２ｐプロモーターを挿入することによって、競合するホモセリンデヒドロゲナーゼ反応に向けたフラックスを減少させた。すべての修飾を酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて遂行した。図は、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドに向けたフラックスを増加させて、競合反応へのフラックスを減少させることが、スペルミジン生合成遺伝子の過剰発現単独に比較して、スペルミジンの産生の増加をもたらすことを示す。

【図5】スペルミジン合成遺伝子（Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．５０）およびスペルミジン合成酵素（ＥＣ ２．５．１．１６）が挙げられる）の過剰発現に加えて、プトレシン生合成経路（「ＳＰＤの増加」）、およびメチオニンサルベージ経路のアップレギュレーションを組み合わせることによる、微生物細胞中でのスペルミジンの産生。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で、内在性ＭＥＵ１遺伝子の過剰発現を介してメチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）［ＥＣ ２．４．２．２８］の活性を増加させること、または内在性ＢＡＴ２遺伝子の過剰発現を介して分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ）［ＥＣ ２．６．１．４２］）の活性を増加させることのいずれかは、メチオニンサルベージ経路を介するフラックスの増加およびスペルミジン産生の増加を可能にした。

【図6】フェドバッチ発酵経由の微生物細胞中でのスペルミジンの産生。最も良好に産生する株（ＳＰＤＣ１０）をグルコース限定フェドバッチ条件下で増殖させ、最大１．４ｇ／Ｌのスペルミジンの産生がもたらされた。

【図7】例１～４におけるプラスミド発現のために使用したコンストラクトのマップ。

【図8】スペルミジン合成遺伝子（Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．５０）およびスペルミジン合成酵素（ＥＣ ２．５．１．１６）が挙げられる）の過剰発現に加えて、プトレシン生合成経路（「ＳＰＤの増加」）、およびメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴ）［ＥＣ ２．５．１．６］の過剰発現を組み合わせることによる、微生物細胞中でのスペルミジンの産生。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ（ＳｓＭＡＴ）からの変異ＭＡＴまたはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ ＪＰＣＭ５（ＳｉＭＡＴ）からのＭＡＴのいずれかの過剰発現を介してＭＡＴの活性を増加させることは、ＭＡＴを過剰発現しない株に比較して、スペルミジン産生の増加をもたらした。

【図9】スペルミジン合成遺伝子（Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．５０）およびスペルミジン合成酵素（ＥＣ ２．５．１．１６）が挙げられる）の過剰発現に加えて、プトレシン生合成経路（「ＳＰＤの増加」）、およびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）［ＥＣ １．５．１．２０］の過剰発現を組み合わせることによる、微生物細胞中でのスペルミジンの産生。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で、酵母Ｍｅｔ１３ｐ Ｎ末端触媒ドメインおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＭＴＨＦＲ（ＡｔＭＴＨＦＲ－１）Ｃ末端調節ドメイン（ＳｃＡｔＭＴＨＦＲ）から構成されたキメラＭＴＨＦＲの過剰発現を介してＭＴＨＦＲの活性を増加させることは、ＭＴＨＦＲを過剰発現しない株に比較して、スペルミジン産生の増加をもたらした。

【図10】スペルミジン合成遺伝子（Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．５０）およびスペルミジン合成酵素（ＥＣ ２．５．１．１６）が挙げられる）の過剰発現に加えて、プトレシン生合成経路（「ＳＰＤの増加」）、および多剤応答に関与する転写因子（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＲ１およびＰＤＲ２）の過剰発現を組み合わせることによる、微生物細胞中でのスペルミジンの産生。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でのＰＤＲ１またはＰＤＲ２の過剰発現は、任意のＰＤＲを過剰発現しない株に比較して、スペルミジン産生の増加をもたらした。

【図11】スペルミジン合成遺伝子（Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．５０）およびスペルミジン合成酵素（ＥＣ ２．５．１．１６）が挙げられる）の過剰発現に加えて、プトレシン生合成経路（「ＳＰＤの増加」）、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩメディエーター複合体のサブユニット（特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１１）の過剰発現を組み合わせることによる、微生物細胞中でのスペルミジンの産生。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でのＴＥＦ１またはＣＹＣ１プロモーターのいずれかの制御下でのＧＡＬ１１の過剰発現は、ＧＡＬ１１を過剰発現しない株に比較して、スペルミジン産生の増加をもたらした。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、本発明の実施形態が示される添付の図面および実施例を参照してここで以下に記載されるだろう。この記載は、本発明が実装され得るすべての異なる手法の羅列、または本発明へ追加され得るすべての特色を詳述することを意図しない。例えば、一実施形態に関して示された特色は他の実施形態へと取り込まれ、特定の実施形態に関して示された特色はその実施形態から削除され得る。したがって、本発明は、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書において説明される任意の特色または特色の組み合わせを除外または省略できることを企図する。加えて、本明細書において示唆される様々な実施形態への多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者へ明らかになり、それは本発明から逸脱しない。したがって、以下の記載は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例証することを意図し、すべての順列、組み合わせおよびその変形を余す所なく規定することを意図しない。

【0018】

本明細書において特別に定義されない限り、本明細書において使用される科学用語および専門用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するだろう。

【0019】

一般的に、本明細書において記載される、生化学、酵素学、分子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションの技法と関連して使用される呼称は、周知であり、当技術分野において通常使用されるものである。

【0020】

本明細書において言及される従来の方法および技法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ［第２版］Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年中の、例えばそのセクションの１．２１「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ」、１．５３「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ」、１．８５「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ Ｔｈａｔ Ｃｏｎｔａｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｌａｓｍｉｄｓ」、６「Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｏｆ ＤＮＡ」、１４「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ ＤＮＡ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」、および１７「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」中でより詳細に説明される。

【0021】

本明細書の全体にわたって参照される酵素委員会（ＥＣ）番号（本明細書において「クラス」とも呼ばれる）は、例えばＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ ０－１２－２２７１６４－５）によってｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙのために出版された、「Ｅｎｚｙｍｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｎ ｔｈｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ」、Ｗｅｂｂ，Ｅ．Ｃ．（１９９２）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：として利用可能な資料「Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」（１９９２年、サプリメント６～１７を含む）中の、ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）に従う。これは、各々の酵素クラスによって触媒される化学的反応に基づく番号順の分類スキームである。

【0022】

本明細書において本発明の記載で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、本発明を限定することは意図されない。

【0023】

本明細書において引用されるすべての出版物、特許出願、特許および他の参照は、参照が示される文章および／またはパラグラフに関連する教示のために、それらの全体を参照することによって援用される。

【0024】

文脈が特別に指示しない限り、本明細書において記載される本発明の様々な特色は任意の組み合わせで使用され得ることが特に意図される。さらに、本発明は、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書において説明される任意の特色または特色の組み合わせを除外または省略できることも企図する。例証のために、組成物が構成要素Ａ、ＢおよびＣからなることを明細書が述べるならば、Ａ、ＢもしくはＣのうちの任意のものまたはその組み合わせは、単独または任意の組み合わせで省略および棄権できることが特に意図される。

【0025】

本発明の記載および添付された請求項中で使用される時、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が特別に明らかに指摘しない限り、複数形を同様に包含することが意図される。

【0026】

さらに本明細書において使用される時、「および／または」は、付随するリストされた項目の１つまたは複数のうちの任意のおよびすべての組み合わせに加えて、代替（「または」）で解釈された場合の組み合わせの欠如を参照および網羅する。

【0027】

本明細書の記載および請求項の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という単語ならびにその単語の変形（例えば「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）は、「を包含するがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味し、他の部分、添加物、構成要素、整数またはステップを除外しない。本明細書の記載および請求項の全体にわたって、単数は、文脈が特別に要求しない限り複数を網羅する。特に、不定冠詞が使用される場合に、本明細書は、文脈が特別に要求しない限り、単数に加えて複数も企図するとして理解される。

【0028】

本明細書において使用される時、～から本質的に「なること」（“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ” ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）という移行句は、請求項の範囲が、請求項中で列挙された規定の材料またはステップおよび請求された発明の基礎的および新規の特徴（複数可）に実質的に影響しないものを網羅するように解釈されることを意味する。したがって、～から本質的に「なること」という用語は、本発明の請求項中で使用した場合に、「含むこと」と同等であると解釈されることは意図されない。

【0029】

本発明の理解を容易にするために、多くの用語を以下に定義する。

【0030】

本明細書において使用される時、「ポリアミン」という用語は、２つ以上の第１級アミノ基を有する有機化合物を指す。ポリアミンについての例としては、プトレシン、カダバリン（ｃａｄａｖａｒｉｎｅ）、スペルミジンおよびスペルミンが挙げられる。

【0031】

さらに本明細書において使用される時、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ＤＮＡの断片または部分、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡを包含する）を指し、そのうちの任意のものは、一本鎖もしくは二本鎖、直線状もしくは分岐状、またはそのハイブリッドであり得る。本明細書において提供された核酸分子および／またはヌクレオチド配列は、５’から３’方向で左側から右側で本明細書において提示され、米国配列ルール（３７ＣＦＲ§§１．８２１～１．８２５）およびＷｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ）Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５中で説明されるように、ヌクレオチド特性を表わすためのスタンダードコードを使用して表わされる。ｄｓＲＮＡが合成的に産生される場合に、稀な塩基（イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチンおよびその他等）も、アンチセンス、ｄｓＲＮＡおよびリボザイム対合のために使用され得る。例えば、ウリジンおよびシチジンのＣ－５プロピンアナログを含有するポリヌクレオチドは、高い親和性によりＲＮＡへ結合することおよび遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤であることが示されている。他の修飾（ＲＮＡのホスホジエステル骨格またはリボース糖基中の２’－ヒドロキシへの修飾等）も行うことができる。

【0032】

本明細書において使用される時、「組換え体」という用語は、使用される場合に、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）がクローニングステップ、制限ステップおよび／またはライゲーションステップの様々な組み合わせの産物であり、天然システム中で見出される内在性核酸とは区別可能な、構造的なコーディング配列または非コーディング配列を有するコンストラクトをもたらすことを意味する。

【0033】

本明細書において使用される時、「遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＡＭＯ）および同種のものを産生するのに使用することが可能な核酸分子を指す。遺伝子は、機能的タンパク質または遺伝子産物を産生するのに使用することが可能であってもなくてもよい。遺伝子は、コーディング領域および非コーディング領域（例えばイントロン、調節エレメント、プロモーター、エンハンサー、終結配列、ならびに／または５’非翻訳領域および３’非翻訳領域）の両方を含むことができる。遺伝子は「単離」され得、それによって、その天然状態で核酸に付随して通常は見出される構成要素が実質的にまたは本質的にない核酸が意味される。かかる構成要素としては、他の細胞材料、組換え体産生からの培養培地、および／または核酸の化学合成において使用される様々な化学物質が挙げられる。

【0034】

本明細書において定義される「破壊された遺伝子」は、部分的または完全に非機能的な遺伝子および遺伝子産物をもたらす、遺伝子への任意の突然変異または修飾を包含する。かかる突然変異または修飾は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失、置換、挿入、標的化配列の添加、および同種のものを包含するがこれらに限定されない。さらに、遺伝子の破壊は、遺伝子の転写を制御する制御エレメントの突然変異または修飾（プロモーター、ターミネーターおよび／または促進エレメントにおける突然変異または修飾等）によって、同様にまたはあるいは、達成され得る。かかる事例において、生来の修飾されていない制御エレメントに比較して、かかる突然変異または修飾は、部分的または完全に遺伝子の転写の喪失（すなわちより低い転写または低減した転写）をもたらす。その結果として、低減した（もしあれば）量の遺伝子産物が、転写および翻訳に続いて利用可能であろう。さらに、遺伝子の破壊は遺伝子からの局在化シグナルの追加または除去も伴うことができ、その生来の細胞内区画中での遺伝子産物の存在の減少をもたらす。

【0035】

遺伝子破壊の目的は、遺伝子産物の利用可能な量を低減すること（遺伝子産物の任意の産生を完全に阻止することを包含する）、または生来または野生型の遺伝子産物に比較して、酵素活性を欠損するかもしくはより低い酵素活性を有する遺伝子産物を発現することである。

【0036】

本明細書において使用される時、「欠失」または「ノックアウト」という用語は、無効であるかまたはノックアウトされる遺伝子を指す。

【0037】

酵素に関する場合に「減弱された活性」という用語は、対照または野生型の状態に比較して、その生来の区画中での酵素の活性の減少を指す。酵素の減弱された活性をもたらす操作は、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失、置換、挿入、標的化配列の添加、標的化配列の除去、または同種のものを包含するがこれらに限定されない。さらに、酵素活性の減弱は、酵素をコードする遺伝子の転写を制御する制御エレメントの突然変異または修飾（プロモーター、ターミネーターおよび／または促進エレメントにおける突然変異または修飾等）によって、同様にまたはあるいは、達成され得る。減弱された酵素活性をもたらす修飾を含有する細胞は、かかる修飾を含有していない細胞に比較して、酵素のより低い活性を有するだろう。酵素の減弱された活性は、機能を持たない遺伝子産物（例えば野生型ポリペプチドの活性に比較して、活性を本質的に有していない（例えば約１０％または場合によっては５％未満の）ポリペプチド）のコードによって達成され得る。

【0038】

遺伝子のコドン至適化バージョンは、細胞の中へ導入される外来性遺伝子を指し、そこで遺伝子のコドンは特定の細胞に関して至適化されている。一般的に、すべてのｔＲＮＡは、種を超えて同等にまたは同じレベルで発現されるとは限らない。遺伝子配列のコドン至適化は、その結果として最も優勢なｔＲＮＡに一致させるためにコドンを変化させること（すなわち所与の細胞中で比較的より優勢なｔＲＮＡによって認識される同義コドンにより、優勢でないｔＲＮＡによって認識されるコドンを変化させること）を包含する。この手法で、コドン至適化遺伝子からのｍＲＮＡがより効率的に翻訳される。コドンおよび同義コドンは好ましくは同じアミノ酸をコードする。

【0039】

本明細書において使用される時、「対立遺伝子」という用語は、所与の遺伝子のバリアント形態を指す。これは、遺伝子によってコードされたアミノ酸のうちの１つまたは複数が除去されるかまたは異なるアミノ酸によって置き換えられる、遺伝子の突然変異型を包含し得る。

【0040】

本明細書において使用される時、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指示するように互換的に使用される。「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は修飾も包含し、それらには、脂質付加、糖鎖付加、糖鎖付加、硫酸化、ヒドロキシル化、Ｌ－グルタミン酸残基のγ－カルボキシル化、およびＡＤＰ－リボシル化が含まれるがこれらに限定されない。

【0041】

本明細書において使用される時、「酵素」という用語は、細胞中で化学的反応または生化学的反応を触媒するタンパク質として定義される。通常、本発明によれば、酵素をコードするヌクレオチド配列は、スペルミジンを産生する能力を細胞へ付与するために細胞中の対応する遺伝子の十分な発現を引き起こすヌクレオチド配列（プロモーター）へ、作動可能に連結される。

【0042】

本明細書において使用される時、「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」という用語は、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡの領域を指す。

【0043】

本明細書において使用される時、「ゲノム」という用語は、宿主細胞中のプラスミドおよび染色体の両方を網羅する。例えば、宿主細胞の中へ導入された本開示のコード核酸は、それらが染色体へ組み込まれるかまたはプラスミドに局在させられるかにかかわらず、ゲノムの部分であり得る。

【0044】

本明細書において使用される時、「プロモーター」という用語は、１つまたは複数の遺伝子の転写を制御する機能を有し、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流に所在する、核酸配列を指す。この文脈における好適なプロモーターは、構成的および誘導可能な天然のプロモーターに加えて、当業者に周知の操作されたプロモーターを包含する。

【0045】

真核生物宿主細胞（酵母細胞等）中での使用に好適なプロモーターは、ＰＤＣ、ＧＰＤ１、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１およびＴＤＨのプロモーターであり得る。他の好適なプロモーターとしては、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＣＵＰ１、ＨＩＳ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＴＰＩ、ＡＯＸ１およびＥＮＯ１のプロモーターが挙げられる。

【0046】

原核生物宿主細胞中での使用に好適なプロモーターとしては、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃオペロンプロモーター、ｔｒｃプロモーター、λプロモーターおよび同種のものが挙げられる。原核生物細胞に中での使用に好適な強いプロモーターの非限定例としては、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ５、Ｔ７、Ｔｒｃ、Ｔａｃおよび同種のものが挙げられる。枯草菌が宿主細胞として選択される場合に、例示的なプロモーターとしては、Ｐｒプロモーター、Ｓｐｏｌプロモーター、タックプロモーターおよびＬａｄプロモーターが挙げられる。

【0047】

本明細書において使用される時、「ターミネーター」という用語は、特別に指摘されなければ、「転写終結シグナル」を指す。ターミネーターは、ポリメラーゼの転写を妨害または停止する配列である。本明細書において使用される時、本開示に従う「組換え真核生物細胞」は、内在性核酸配列の追加コピー（複数可）を含有するか、または、真核生物細胞中で天然に存在しないポリペプチドもしくはヌクレオチドの配列により形質転換されるかもしくは遺伝子修飾される、細胞として定義される。野生型真核生物細胞は、本明細書において使用される時、組換え真核生物細胞の親細胞として定義される。

【0048】

本明細書において使用される時、本開示に従う「組換え原核生物細胞」は、内在性核酸配列の追加コピー（複数可）を含有するか、または、原核生物細胞中で天然に存在しないポリペプチドもしくはヌクレオチド配列により形質転換されるかもしくは遺伝子修飾される、細胞として定義される。野生型原核生物細胞は、本明細書において使用される時、組換え原核生物細胞の親細胞として定義される。

【0049】

本明細書において使用される時、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅｓ）」、「増加された（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「増加すること（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「促進する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「促進された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」、「促進すること（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」および「促進（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」という用語（およびその文法的変化形）は、対照に比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％。５００％もしくはそれ以上、またはその中の任意の範囲の上昇を指示する。

【0050】

本明細書において使用される時、「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「低減する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低減された（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、「減退する（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」および「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」という用語、ならびに類似の用語は、対照に比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％。５００％もしくはそれ以上、またはその中の任意の範囲の減少を意味する。

【0051】

遺伝子の発現の低減は、本明細書において使用される時、遺伝子の転写を低減する、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を低減する、および／またはｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質の翻訳後プロセシングを低減する、遺伝子修飾を包含する。かかる遺伝子修飾としては、遺伝子の制御配列（プロモーターおよびエンハンサー等）へ適用された、挿入（複数可）欠失（複数可）、置き換え（複数可）または突然変異（複数可）が挙げられる。例えば、遺伝子のプロモーターをより少ない活性のまたは誘導可能なプロモーターによって置き換えて、それによって遺伝子の低減された転写をもたらすことができる。同様に、プロモーターのノックアウトは遺伝子の発現の低減（典型的にはゼロ）をもたらすだろう。

【0052】

本明細書において使用される時、本発明のヌクレオチド配列の「部分」または「断片」という用語は、参照核酸またはヌクレオチド配列に比べて低減された長さであり、参照核酸またはヌクレオチド配列に同一またはほとんど同一（例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９８％、９９％同一）のコンティグヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、それらからから本質的になる、および／またはそれらからなる、ヌクレオチド配列を意味すると理解されるだろう。本発明に従うかかる核酸断片または部分は、適切な場合、それが構成物であるより大きなポリヌクレオチド中に含まれ得る。

【0053】

相同性を有する異なる核酸またはタンパク質は、本明細書において「ホモログ」と称される。ホモログという用語は、同じおよび他の種からのホモロガスな配列、ならびに同じおよび他の種からのオルソロガスな配列を包含する。「相同性」は、位置的な同一性のパーセントに関して２つ以上の核酸および／またはアミノ酸配列の間の類似性のレベル（すなわち配列の類似性または同一性）を指す。相同性は、異なる核酸またはタンパク質の中での類似する機能的特性の概念も指す。したがって、本発明の組成物および方法は、本発明のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列へのホモログをさらに含む。「オルソロガス」は、本明細書において使用される時、種形成の間に共通の先祖遺伝子から生じた、異なる種におけるホモロガスなヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を指す。本発明のヌクレオチド配列のホモログは、実質的な配列同一性（例えば前記ヌクレオチド配列へ少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および／または１００％）を有する。

【0054】

「過剰発現する（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）」「過剰発現する（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｓ）」または「過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、本明細書において使用される時、遺伝子のより高いレベルの活性（例えば遺伝子の転写）；ｍＲＮＡのタンパク質へのより高いレベルの翻訳；および／またはその生来または対照（例えば過剰発現されている特定の異種または組換えのポリペプチドにより形質転換されなかった）の状態における細胞中でよりも、より高いレベルの遺伝子産物（例えばポリペプチド）の産生を指す。過剰発現される遺伝子の典型例は、遺伝子の生来のプロモーターに比較して、別のプロモーターの転写制御下の遺伝子である。同様にまたはあるいは、遺伝子の制御エレメント（エンハンサー等）中の他の変化を使用して、特定の遺伝子を過剰発現させることができる。さらに、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳に影響する（すなわち増加する）修飾を、あるいはまたは加えて使用して、本明細書において使用される遺伝子の過剰発現を達成することができる。これらの用語は、遺伝子のコピー数の増加ならびに／または細胞中のｍＲＮＡおよび／もしくは遺伝子産物の量の増加も指し得る。過剰発現は、対照レベルに比較して、細胞中で２５％、５０％、１００％、２００％、５００％、１０００％もしくは２０００％高いレベル、またはその中の任意の範囲をもたらし得る。

【0055】

本明細書において使用される時、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、タンパク質または遺伝子に関して使用される場合に、「外来性」または「異種」という用語は、それが導入される細胞、生物体、ゲノム、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列の一部として、天然に存在しない核酸、タンパク質または遺伝子を指す（天然に存在するヌクレオチド配列の天然に存在しない複数のコピーを包含する）。かかる外来性遺伝子は、別の種もしくは株からの遺伝子、宿主細胞中で天然に存在する遺伝子の修飾、変異もしくは進化バージョン、もしくは宿主細胞中で天然に存在する遺伝子のキメラバージョン、または融合遺伝子であり得る。これらの前者の事例において、修飾、突然変異または進化は、遺伝子のヌクレオチド配列中の変化を引き起こして、それによって、宿主細胞中で天然に存在する遺伝子に比較して、別のヌクレオチド配列を備えた修飾、変異または進化した遺伝子が得られる。進化した遺伝子は、進化した遺伝子をコードし、野生型または生来の遺伝子に比較して、異なるヌクレオチド配列を備えた新しい遺伝子を引き出す遺伝子修飾（進化圧への突然変異または曝露等）によって得られる遺伝子を指す。モザイク遺伝子は１つまたは複数のコーディング配列の部分の組み合わせを介して形成されて、新しい遺伝子を産生する。これらの修飾は、融合遺伝子（それは全遺伝子配列を単一リーディングフレームへとマージし、多くの場合それらのもとの機能を多くの場合保持する）とは異なる。

【0056】

「内在性の」、「生来の」または「野生型の」核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列は、天然に存在するかまたは内在性の核酸、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたはアミノ酸配列を指す。したがって、例えば、「野生型ｍＲＮＡ」は、生物体中で天然に存在するかまたは内在性のｍＲＮＡである。「ホモロガスな」核酸配列は、それが導入される宿主細胞に天然に付随するヌクレオチド配列である。

【0057】

本明細書において使用される時、「修飾された」という用語は、それが生物体に関して使用される場合に、そのように修飾されていない他の点では同一の宿主生物と比較して、スペルミジンの産生を増加させるように修飾された宿主生物を指す。原理上は本開示に従うかかる「修飾」は、前記修飾を受けない他の点では同一の生物体におけるかかる産生と比較して、宿主生物におけるスペルミジンの産生を適切に変更する、任意の生理的修飾、遺伝子修飾、化学修飾または他の修飾を含み得る。大部分の実施形態において、しかしながら、修飾は遺伝子修飾を含むだろう。ある特定の実施形態において、本明細書において記載される時、修飾は宿主細胞の中へ遺伝子を導入することを含む。いくつかの実施形態において、修飾は、少なくとも１つの生理的修飾、化学修飾、遺伝子修飾または他の修飾を含み；他の実施形態において、修飾は、２つ以上の化学修飾、遺伝子修飾、生理的修飾または他の修飾を含む。２つ以上の修飾が行われるある特定の態様において、かかる修飾の使用は、生理的修飾、遺伝子修飾、化学修飾、または他の修飾の任意の組み合わせ（例えば１つまたは複数の遺伝子修飾（複数可）、化学修飾（複数可）および／または生理的修飾（複数可））を含み得る。ポリペプチドの活性をブーストする遺伝子修飾は、ポリペプチドをコードする遺伝子の１つまたは複数のコピーを導入すること（それは同じ活性を有するポリペプチドをコードする、宿主細胞中に既に存在する任意の遺伝子とは区別され得る）；遺伝子の転写または翻訳を増加させるために細胞中に存在する遺伝子を変更すること（例えば１つもしくは複数のヌクレオチドを改変すること、１つもしくは複数のヌクレオチドへ追加の配列を添加すること、１つもしくは複数のヌクレオチドを置き換えること、例えば調節配列、プロモーター配列もしくは他の配列から配列を欠失させること、または調節配列、プロモーター配列もしくは他の配列をスワップさせること）；および活性をブーストするために（例えば酵素活性を増加させること、フィードバック阻害を減少させること、特異的な細胞内所在位置を標的化すること、ｍＲＮＡの安定性をブーストすること、タンパク質安定性をブーストことによって）、ポリペプチドをコードする遺伝子の配列（例えば非コーディングまたはコーディング）を変更すること、を包含するがこれらに限定されない。ポリペプチドの活性を低減する遺伝子修飾は、ポリペプチドをコードする遺伝子の一部またはすべてを欠失させること；ポリペプチドをコードする遺伝子を破壊する核酸配列を挿入すること；遺伝子の転写もしくは翻訳または遺伝子によってコードされるｍＲＮＡもしくはポリペプチドの安定性を低減するために細胞中に存在する遺伝子を変化させること（例えば１つもしくは複数のヌクレオチドへ追加の配列を添加すること、１つもしくは複数のヌクレオチドを改変すること、１つもしくは複数のヌクレオチドから配列を欠失させること、１つもしくは複数のヌクレオチドを置き換えること、またはプロモーター配列、調節配列もしくは他の配列をスワップすること（例えば１つまたは複数のヌクレオチドを置き換えること）によって）、を包含するがこれらに限定されない。

【0058】

「過剰産生」という用語は、宿主細胞におけるスペルミジンの産生を参照して本明細書において使用され、宿主細胞が、非修飾宿主細胞または野生型細胞と比較して、宿主細胞の代謝経路に関与する異なるポリペプチドをコードする核酸配列の導入により、または他の修飾の結果として、より多くのスペルミジンを産生していることを指示する。

【0059】

本明細書において使用される時、「フラックス」、「代謝フラックス」または「炭素フラックス」という用語は、所与の反応または反応のセットを介する分子のターンオーバーの率を指す。代謝経路中のフラックスは、経路に関与する酵素によって調節される。フラックスの増加の状態によって特徴づけられる経路または反応は、対照に比較して、所与の基質からの産物の生成率の増加を有する。フラックスの減少の状態によって特徴づけられる経路または反応は、対照に比較して、所与の基質からの産物の生成率の減少を有する。対象となる産物に向けたフラックスは、競合反応を除去または減少させることによって、または前記産物の生成に関与する酵素の活性の増加によって、増加され得る。

【0060】

本明細書において使用される時、「プトレシン生合成経路（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）」、「プトレシン生合成経路（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ）」または「プトレシン経路」という用語は、炭素源（グルコース等）からのプトレシンの合成に向けたフラックスを駆動する酵素反応に加えて、プトレシン形成を低減する競合反応および抑制反応を指す。プトレシンの合成に向けたフラックスを駆動する酵素反応は、ピルビン酸塩をアセチル－ＣｏＡへ、アセチル－ＣｏＡをα－ケトグルタル酸塩へ、α－ケトグルタル酸塩をオルニチンへ、およびオルニチンをプトレシンへ変換する反応を包含するがこれらに限定されない（図１を参照）。この経路から中間体を消耗する競合反応は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．３．３］およびＬ－オルニチントランスアミナーゼ［ＥＣ ２．６．１．１３］によって触媒される酵素反応を包含する。さらに、抑制反応は、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素（ＯＡＺ）の産生を包含し、それは、オルニチンデカルボキシラーゼ（そうでなければオルニチンのプトレシンへの脱カルボキシル化を触媒する）のインヒビターである。プトレシン生合成の増加は、プトレシンに向けたフラックスならびに／または競合反応および抑制反応のダウンレギュレーションを駆動する酵素ステップのうちの任意のものの過剰発現によって達成することができる。

【0061】

本明細書において使用される時、「スペルミジン生合成経路（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）」、「スペルミジン生合成経路（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ）」または「スペルミジン経路」という用語は、プトレシンをスペルミジンへと変換する酵素によるプトレシン生合成経路に関与する反応の組み合わせを指す。これらの反応に関与する酵素の非限定実施例は、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）［ＥＣ ２．５．１．１６］、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ［ＥＣ ４．１．１．５０］、カルボキシ（ノル）スペルミジンデヒドロゲナーゼ（ＣＡＳＤＨ／ＣＡＮＳＤＨ）［ＥＣ １．５．１．４３］、およびカルボキシ（ノル）スペルミジンデカルボキシラーゼ（ＣＡＳＤＣ／ＣＡＮＳＤＣ）［ＥＣ ４．１．１．９６］である。この用語は、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）形成に関与する反応を網羅しない。

【0062】

本明細書において使用される時、「Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の合成に関与する酵素」、「Ｓ－アデノシルメチオニン経路」または「Ｓ－アデノシルメチオニン生合成経路」という用語は、炭素源（グルコース等）からのＳ－アデノシルメチオニンの合成のために要求される酵素反応を指す。これは、ピルビン酸塩をオキサロ酢酸塩へ、オキサロ酢酸塩をアスパラギン酸塩へ、アスパラギン酸塩をＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへ、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドをメチオニンへ、およびメチオニンをＳ－アデノシルメチオニンへ変換することに関与する反応を包含するがこれらに限定されない。加えて、これは、メチオニンサルベージ経路に関与する反応、葉酸合成および５－メチルテトラヒドロ葉酸への変換に関与する反応、ならびに硫酸同化に関与する反応を包含する（図２）。この用語は、ＳＡＭのＳ－アデノシルメチオニンアミン（ｄＳＡＭ）への脱カルボキシル化に関与する反応を網羅しない。

【0063】

本明細書において使用される時、「ベクター」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、それがその発現を確実にする追加ヌクレオチドへ作動可能に連結される、直線状または環状のＤＮＡ分子として定義される。

【0064】

酵母細胞の文脈において「導入すること」は、核酸分子が細胞の内部への接近を獲得するような様式で、細胞と核酸分子を接触させることを意味する。したがって、ポリヌクレオチドおよび／または核酸分子は、単一の形質転換事象において、分離した形質転換事象において、酵母細胞に導入され得る。したがって、「形質転換」という用語は、本明細書において使用される時、異種核酸の細胞の中への導入を指す。酵母細胞の形質転換は安定的または一過性であり得る。

【0065】

ポリヌクレオチドの文脈における「一過性形質転換」は、ポリヌクレオチドが細胞の中へ導入され、細胞のゲノムの中へ組み込まれないことを意味する。

【0066】

細胞の中へ導入されたポリヌクレオチドの文脈における「安定的に導入すること」または「安定的に導入された」によって、導入されたポリヌクレオチドが細胞のゲノムの中へ安定的に取り込まれ、したがって細胞がポリヌクレオチドにより安定的に形質転換されることが意図される。「安定的な形質転換」または「安定的に形質転換された」は、本明細書において使用される時、核酸分子が細胞の中へ導入され、細胞のゲノムの中へ組み込まれることを意味する。それゆえ、組み込む核酸分子は、その子孫によって、より詳細には、複数の続く世代の子孫によって受け継がれ得る。安定的な形質転換は、本明細書において使用される時、例えばミニ染色体として染色体外に維持される核酸分子も指し得る。

【0067】

一過性形質転換は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンブロット（それらは生物体の中へ導入された１つまたは複数の核酸分子によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することができる）によって検出され得る。細胞の安定的な形質転換は、例えば生物体（例えば酵母）の中へ導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列による、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出され得る。細胞の安定的な形質転換は、例えば酵母または他の生物体の中へ導入された核酸分子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列による、細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出され得る。細胞の安定的な形質転換は、当技術分野において周知であるような、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅反応（核酸分子の標的配列（複数可）とハイブリダイズする特異的なプライマー配列を用い、標的配列（複数可）の増幅がもたらされ、それはスタンダードな方法に従って検出され得る）によっても検出され得る。形質転換は、当技術分野において周知の直接的なシーケンシングおよび／またはハイブリダイゼーションプロトコールによっても検出され得る。

【0068】

本発明の実施形態は、本明細書において定義されるようなポリペプチドのバリアントも網羅する。本明細書において使用される時、「バリアント」は、配列内の１つまたは複数のアミノ酸は他のアミノ酸で置換されるという点で、アミノ酸配列が由来する塩基配列とは異なるポリペプチドを意味する。例えば、配列番号：１のバリアントは、配列番号：１へ少なくとも約５０％同一のアミノ酸配列（例えば少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％同一）を有し得る。バリアントおよび／または断片は、バリアント配列が、本明細書において規定の非バリアントアミノ酸配列を有する酵素へ類似または同一の機能的酵素活性特徴を有するという点で機能的なバリアント／断片である（および、これは本明細書の全体にわたって使用される時「機能的バリアント」という用語の意味である）。

【0069】

提示されたアミノ酸配列のうちの任意のものの「機能的バリアント」または「機能的断片」は、したがって、非バリアント配列と同じ酵素カテゴリー内にとどまる（すなわち同じＥＣ番号を有する）任意のアミノ酸配列である。酵素が特定のカテゴリー内に入るかどうか決定する方法は、当業者（発明の技能の使用無しに酵素カテゴリーを決定できる）に周知である。好適な方法は、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙから得られ得る。

【0070】

アミノ酸が幅広く類似する特性を備えた異なるアミノ酸により置き換えられる場合に、アミノ酸置換は「保存的である」と考慮され得る。非保存的置換は、アミノ酸が異なるタイプのアミノ酸により置き換えられる場合である。

【0071】

「保存的置換」によって、同じクラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換が意味され、そこでクラスは以下のように定義される。
アミノ酸クラスの例
非極性：Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｗ
非荷電極性：Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
酸性：Ｄ、Ｅ
塩基性：Ｋ、Ｒ、Ｈ。

【0072】

当業者に周知であるように、配列の中へ挿入されるアミノ酸の側鎖が、置換されたアミノ酸の側鎖と類似する結合および接触を形成することができるので、保存的置換によってポリペプチドの一次構造を変更することは、そのポリペプチドの活性を有意に変更しないだろう。置換がポリペプチドの立体配座の決定において重要な領域中にある場合でさえ、これはそうある。

【0073】

本発明の複数の実施形態において、本明細書の他の箇所で定義されるように、もし非保存的置換がポリペプチドの酵素活性を妨げなければ、これは可能である。酵素の置換バージョンは、かかる非置換酵素と同じ酵素クラス（上で検討されたＮＣ－ＩＵＢＭＢ命名法を使用して決定されるような）中にとどまるように特徴を保持しなくてはいけない。

【0074】

大まかに言って、保存的置換よりも少ない非保存的置換は、ポリペプチドの生物学的活性を変更せずに可能であり得る。任意の置換の（および実際は任意のアミノ酸の欠失または挿入の）効果の決定は、完全に当業者のルーチンの能力内にあり、当業者はバリアントポリペプチドが本発明の態様に従う酵素活性を保持するかどうかを容易に決定することができる。例えば、ポリペプチドのバリアントが本発明の範囲内にある（すなわち上で定義されるような「機能的バリアントまたは断片」である）かどうかを決定する場合に、当業者は、バリアントまたは断片が本明細書の他の箇所で言及されるＮＣ－ＩＵＢＭＢ命名法を参照して定義されるように基質を変換する酵素活性を保持するかどうかを決定するだろう。すべてのかかるバリアントは本発明の範囲内である。

【0075】

スタンダードの遺伝コードを使用して、ポリペプチドをコードするさらなる核酸配列は、本明細書において開示されるものに加えて、当業者によって容易に考えられ製造され得る。核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡであり得、ＤＮＡ分子である場合にそれは例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。本明細書の他の箇所で記載されるように、核酸は発現ベクター内に含有され得る。

【0076】

本発明の実施形態は、したがって、本発明の実施形態によって企図されるポリペプチドをコードするバリアント核酸配列を網羅する。核酸配列に関して「バリアント」という用語は、ポリヌクレオチド配列からのまたはその配列への、１つまたは複数のヌクレオチド（複数可）の任意の置換、変形、修飾、置き換え、欠失または添加を意味し、但し、ポリヌクレオチドによってコードされた結果として生じたポリペプチド配列は、基本的な配列によってコードされたポリペプチドと少なくとも同じまたは類似する酵素特性を提示する。この用語は、対立遺伝子バリアントを包含し、本発明の実施形態のポリヌクレオチド配列へ実質的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（「プローブ配列」）も包含する。かかるハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーの条件でまたはそれらの条件の間で起こり得る。一般論として、低ストリンジェンシー条件は、プローブ配列の計算されたかまたは実際の融解温度（Ｔｍ）の約４０～４８℃下の温度（例えば実験室のおおよその周囲温度～約５５℃）で０．３３０～０．８２５ＭのＮａＣｌバッファー溶液中で洗浄ステップが行われるハイブリダイゼーションとして定義される一方で、高いストリンジェンシー条件は、プローブ配列の計算されたかまたは実際のＴｍの約５～１０℃下の温度（例えば約６５℃）で０．０１６５～０．０３３０ＭのＮａＣｌバッファー溶液中での洗浄を包含する。バッファー溶液は例えばＳＳＣバッファー（０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０１５Ｍのクエン酸三ナトリウム）であり得、低ストリンジェンシー洗浄は３×ＳＳＣバッファー中で行われ、高ストリンジェンシー洗浄は０．１×ＳＳＣバッファー中で行われる。核酸配列のハイブリダイゼーションに関与するステップは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ［第２版］Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９年（例えばそのセクション１１中の「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」）（参照することによって本明細書に援用される）中で記載される。

【0077】

好ましくは、核酸配列バリアントは、本発明の実施形態の核酸配列と共通するヌクレオチドを約５５％以上有し、より好ましくは、少なくとも６０％、６５％、７０％、８０％、８５％、または場合によっては９０％、９５％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する。

【0078】

本発明のバリアント核酸は、特定の宿主細胞における発現のためにコドンを至適化され得る。

【0079】

本明細書において使用される時、「配列同一性」は、２つのヌクレオチド配列または２つのペプチドもしくはタンパク質配列の間の配列類似性を指す。類似性を配列アライメントによって決定して、配列間の構造的および／または機能的な関係性を決定する。

【0080】

アミノ酸配列間の配列同一性は、デフォルトパラメーター設定（タンパク質アライメントのために、ギャップコストＥｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１）を使用して、例えばｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを経由してＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、米国）から利用可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌを使用して、配列のアライメントを比較することによって決定され得る。本明細書中で言及される配列比較およびパーセンテージ同一性はこのソフトウェアを使用して決定された。配列同一性のレベルを例えば配列番号：１へ比較する場合に、高い同一性オーバーラップの短い領域を回避し、同一性の高い全体的な査定をもたらすために、これは好ましくは配列番号：１の全長に比べて行われるべきである（すなわち全体的なアライメント法が使用される）。例えば、例えば５つのアミノ酸を有する短いポリペプチド断片は、配列番号：１の全体内の５つのアミノ酸領域への１００％同一の配列を有するかもしれないが、この断片が、配列番号：１中の位置に等価な他の位置でも同一のアミノ酸を有するより長い配列の一部を形成しなければ、これは１００％のアミノ酸同一性を提供しない。比較される配列中の等価な位置が同じアミノ酸によって占有される場合に、その時分子はその位置で同一である。同一性のパーセンテージとしてのアライメントのスコアリングは、比較される配列によって共有される位置での同一のアミノ酸の数の関数である。配列を比較する場合に、至適アライメントは、配列の１つまたは複数の中へギャップを導入して、配列中の可能な挿入および欠失を考慮することを要求し得る。比較されている配列中の同一の分子の同じ数について、可能な限り少ないギャップによる配列アライメント（２つの比較された配列間のより高い関係性を反映する）が、多くのギャップによるものよりも高いスコアを達成するように、配列比較法は、ギャップペナルティを用いることができる。最大パーセント同一性の計算は、ギャップペナルティを考慮して、至適アライメントを産生することを包含する。上記のように、パーセンテージ配列同一性は、デフォルトパラメーター設定を使用して、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏｏｌを使用して決定され得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムはＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）ｖｏｌ．４８：４４３－５３中で出版された。

【0081】

実施形態の態様は、スペルミジンを産生することが可能な微生物細胞に関する。微生物細胞は、プトレシン生合成の促進のために遺伝子修飾される。微生物細胞は、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）生合成の促進のためにも遺伝子修飾される。

【0082】

したがって、実施形態の態様は、スペルミジンを産生することが可能な微生物細胞に関する。微生物細胞は、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ［ＥＣ ４．１．１．５０］およびスペルミジン合成酵素［ＥＣ ２．５．１．１６］からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現のために遺伝子修飾される。微生物細胞は、ＳＡＭ生合成の促進のためにも遺伝子修飾される。

【0083】

本実施形態は、高レベルのスペルミジンを産生する能力を有する微生物細胞に関する。一般的な実施形態において、微生物細胞は、プトレシンのスペルミジンへの変換の促進およびＳＡＭ生合成の促進のために遺伝子修飾される。様々な実施形態に従うさらなる遺伝子修飾は、本明細書において開示される時、特に選択された遺伝子のダウンレギュレーションまたは減弱を含み、そこで、この遺伝子は、スペルミジンの消費経路および／または分解経路に関与する酵素をコードする。さらなるスペルミジン産生能力は、特に選択された遺伝子のダウンレギュレーション、減弱、欠失または過剰発現によって改善され、そこで、この遺伝子は、スペルミジン合成経路、５’－メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）サイクル、Ｌ－オルニチン合成および／またはＬ－グルタミン酸合成の経路に関与する酵素および／またはタンパク質をコードする。さらなる実施形態において、スペルミジン過剰産生は、スペルミジン形成のための補因子として作用するプロピルアミンドナーの生合成を導く経路における修飾と上記の修飾を組み合わせることによって得られる。かかる修飾は、プロピルアミンドナーの産生の原因である酵素ステップをコードする内在性遺伝子または異種遺伝子の過剰発現ならびに競合反応および／または抑制反応のダウンレギュレーションを包含し得る。さらなるスペルミジン産生能力は、ポリアミンエクスポートタンパク質をコードする遺伝子の過剰発現、ポリアミン取込みタンパク質をコードする遺伝子のダウンレギュレーション、およびポリアミン毒性と関連する様々なタンパク質の発現の修飾によって改善され、非常に有効な全体のプロセスを付与する。

【0084】

以下において、本発明の様々な実施形態はより詳細に記載されるだろう。

【0085】

一実施形態において、微生物細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｎａｄｓｏｎｉａ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｈａｆｆｉａ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、およびＡｓｈｂｙａ属からなる群から選択される、真核生物細胞である。特定の実施形態において、真菌細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｈａｅｒｉｃａ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｌｉｄｅｖｏｒａｎｓであり得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは好ましい酵母種である。

【0086】

ある特定の実施形態において、微生物細胞は、原核生物細胞（細菌細胞または古細菌細胞等）である。細菌は、光合成細菌（例えばシアノバクテリア）でもあり得る。

【0087】

一実施形態において、微生物細胞は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｓｐｉｒｉｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属からなる群から選択される、原核生物細胞である。使用され得る原核生物細胞の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび／ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍが挙げられる。

【0088】

開示された本発明の目的は、スペルミジン産生の増加のために操作された微生物細胞を提供することである。微生物細胞におけるスペルミジン産生を増加させる以前の取り組みは、細胞のオルニチンおよびプトレシンの産生経路への修飾がスペルミジン産生の改善をもたらしたことを報告し、それらの前駆体が限定的であったことを示唆する。プトレシンにおける限定は株特異的かもしれないが、本発明を評価する場合にプトレシンが限定的ではないことを保証し、スペルミジンの高力価を達成するために、より高レベルのプトレシンを産生するように以前に操作した株中でのＳＡＭ生合成経路を試験することを選択した。この株は、オルニチン（プトレシンへの前駆物質）およびプトレシンに向けたフラックスを増加させる修飾を含み、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼのダウンレギュレーション、オルニチンアミノトランスフェラーゼの欠失、ミトコンドリアアミノ酸輸送体ＡＧＣ１の過剰発現、ミトコンドリアオルニチンインポーターＯＲＴ１の過剰発現、ＮＡＤＰ＋依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼの過剰発現、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）抗酵素をコードする遺伝子の欠失、およびオルニチンデカルボキシラーゼの過剰発現が挙げられる。以前の研究において、本発明者は、これらの修飾が、使用されたバックグラウンド株のバックグラウンドにおいてオルニチンおよびプトレシンの産生を改善したことを見出したが、その代りにまたは同様に、他の修飾を使用して類似する効果を達成することができた（［５］および他によって示されるように）。したがって、本明細書において提示される本発明の修飾は、上記の修飾を欠損する株（例えばプトレシンに向けたフラックスを増加させる異なる修飾を有する微生物株、高レベルのプトレシンを天然に産生できる株、またはプトレシンを供給される株）においてでさえ、スペルミジン産生を改善する。

【0089】

一実施形態において、微生物細胞がプトレシンをスペルミジンへ変換する能力が、増加される。これは、スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ）［ＥＣ ２．５．１．１６］の活性の増加によって達成され得る。例えば、ＳＰＤＳの活性の増加は、ＳＰＤＳのコード遺伝子を過剰発現させることによって達成され得る。ＳＰＤＳコード遺伝子は、任意の公知の種（例えばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）からのものであり得る。一実施形態において、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍからのＳＰＤＳ（配列番号：１９）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＥ．ｃｏｌｉの中へ導入される。例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓからの他の異種ＳＰＤＳも、真核生物細胞または原核生物細胞中で過剰発現され得る。あるいはまたは加えて、内在性ＳＰＤＳが過剰発現され得る。スペルミジン合成酵素の活性の増加は、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ［ＥＣ ４．１．１．５０］の活性の増加とも組み合わせられ得る。これは、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を過剰発現させることによって達成され得る。あるいは、スペルミジン合成酵素の活性の増加の代わりに、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のかかる過剰発現が使用され得る。例えば、内在性Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＳＰＥ２；配列番号：２１）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得る。あるいは、内在性ｓｐｅＤ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で過剰発現され得る。例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（Ｚｅａ ｍａｙｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）からの他の異種Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼも、真核生物細胞または原核生物細胞中で過剰発現され得る。

【0090】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ［ＥＣ ４．１．１．５０］およびスペルミジン合成酵素［ＥＣ ２．５．１．１６］からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現のために遺伝子修飾される。図１中で示されるように、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼは、ＳＡＭからのＳ－アデノシルメチオニンアミンの合成を触媒する。スペルミジン合成酵素は、このＳ－アデノシルメチオニンアミンをプトレシンと一緒に使用して、所望される産物スペルミジンを産生する。

【0091】

一実施形態において、Ｌ－オルニチンのプトレシンへの変換が増加される。これは、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）［ＥＣ ４．１．１．１７］の活性の増加によって達成され得る。一実施形態において、ＯＤＣの活性は、ＯＤＣをコードする生来の遺伝子の過剰発現によって増加され得る。例えば、ＳＰＥ１（配列番号：２０）がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得るか、またはｓｐｅＣ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション：ＮＰ＿４１７４４０）がＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現され得る。あるいは、異種ＯＤＣは、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍから発現され得る。

【0092】

加えてまたはあるいは、オルニチンのプトレシンへの変換は、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素（ＯＡＺ）の活性の低減によっても増加され得る。ＯＡＺは、ＯＤＣへ結合して、プロテアソームによるユビキチン非依存性分解を刺激するＯＤＣのレギュレーターである。したがって、ＯＡＺの活性の低減は、ＯＤＣレベルの増加を促進することができる。ＯＡＺ活性の低減は、例えばＯＡＺをコードする生来の遺伝子の破壊またはダウンレギュレートによって達成され得る。例えば、一実施形態において、ＯＡＺ（ＯＡＺ１；配列番号：２３）をコードする生来の遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で破壊される。

【0093】

さらに、スペルミジン値は、細胞中のＬ－オルニチン濃度の増加によって増加され得る。これは、例えば細胞中のオルニチンを利用する反応の活性を減少させることによって達成され得る。例えば、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．３．３］（それはオルニチンをシトルリンへ変換する）の活性は、減少され得る。これは、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする生来の遺伝子の発現のダウンレギュレートすることによって達成され得る。例えば、一実施形態において、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする生来のＡＲＧ３遺伝子（配列番号：２４）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートされ得る。別の実施形態において、Ｌ－オルニチントランスアミナーゼ［ＥＣ ２．６．１．１３］（それはオルニチンのＬ－グルタミン酸γ－セミアルデヒドへの変換を触媒する）の活性は、減少される。これは、例えばＬ－オルニチントランスアミナーゼ活性をコードする内在性遺伝子（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でＣＡＲ２（配列番号：１１７））の破壊によって達成され得る。

【0094】

細胞質Ｌ－オルニチンの生産の増加のための他のストラテジーは、例えばアセチルグルタミン酸合成酵素［ＥＣ ２．３．１．１］、アセチルグルタミン酸キナーゼ［ＥＣ ２．７．２．８］およびＮ－アセチル－γ－グルタミル－リン酸レダクターゼ［ＥＣ １．２．１．３８］、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．６．１．１１］、アセチルオルニチンデアセチラーゼ［ＥＣ ３．５．１．１６］、ならびに／またはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３５］の活性の増加による、グルタミン酸塩からのＬ－オルニチン産生経路を介するフラックスの増加を包含し得る。好ましい実施形態において、これらの酵素の活性はサイトゾル中で増加され得る。これは、例えばこれらの活性をコードする細菌性Ｌ－オルニチン生合成遺伝子（例えばＥ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのａｒｇＡ（配列番号：１０３～１０４）、ａｒｇＢ（配列番号：１０５～１０６）、ａｒｇＣ（配列番号：１０７～１０８）、ａｒｇＤ（配列番号：１０９～１１０）、ａｒｇＪ／ａｒｇＥ（配列番号：１１１～１１２））の細胞中での発現／過剰発現、または内在性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅオルニチン生合成遺伝子（例えばＡＲＧ２（配列番号：１１３）、ＡＲＧ５、６（配列番号：１１４）、ＡＲＧ８（配列番号：１１５）および／またはＡＲＧ７（配列番号：１１６））のサイトゾルへの標的化によって達成され得る。

【0095】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）［ＥＣ ４．１．１．１７］；Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）［ＥＣ ２．３．１．１］（アミノ酸－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼとも称される）；アセチルグルタミン酸キナーゼ［ＥＣ ２．７．２．８］；Ｎ－アセチル－γ－グルタミル－リン酸レダクターゼ［ＥＣ １．２．１．３８］；アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．６．１．１１］（アセチルオルニチントランスアミナーゼとも称される）；アセチルオルニチンデアセチラーゼ［ＥＣ ３．５．１．１６］およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３５］（グルタメートＮ－アセチルトランスフェラーゼとも称される）からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0096】

図１中でより明らかに示されるように、上で言及される酵素は、炭素源（グルコース等）からのプトレシンの合成を包含するプトレシン生合成経路に関与する。より詳細には、上で言及された酵素は、α－ケトグルタル酸塩（それはこの場合はトリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルのアウトプットである）からのプトレシンの合成に関与する。

【0097】

一実施形態において、微生物細胞は、オルニチンデカルボキシラーゼ抗酵素（ＯＡＺ）；Ｌ－オルニチントランスアミナーゼ［ＥＣ ２．６．１．１３］（オルニチンアミノトランスフェラーゼとも称される）；および／もしくはオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）［ＥＣ ２．１．３．３］の活性の減弱、またはＯＡＺをコードする遺伝子、Ｌ－オルニチントランスアミナーゼをコードする遺伝子、およびＯＴＣをコードする遺伝子からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子の欠失もしくは破壊のために遺伝子修飾される。

【0098】

ＯＴＣおよびＬ－オルニチントランスアミナーゼは、オルニチンのシトルリンおよびグルミン酸γ－セミアルデヒドへの変換に関与する酵素である（図１を参照）。したがって、これらの２つの酵素は、中間体のオルニチンを消耗する経路に関与し、それによって基質としてオルニチンを使用することでＯＤＣと競合する。これらの酵素の活性の減弱またはこれらの酵素をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊は、それによってＯＤＣのためのより高い量のオルニチン、およびそれによって微生物細胞におけるプトレシンの産生の促進をもたらすだろう。

【0099】

ＯＡＺはＯＤＣのインヒビターであり、それによってオルニチンからのプトレシンの合成におけるＯＤＣの活性を低減する。

【0100】

一実施形態において、上記の修飾のうちの任意のものは、ＳＡＭのレベルの増加を導く経路とさらに組み合わせられ得るか、またはこの経路は上記の修飾に依存せずに使用され得る。次いで、ＳＡＭは、Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼによってｄＳＡＭへ脱カルボキシル化され、それはスペルミジン形成のためのプロピルアミンドナーとして供される。例えば、好ましい実施形態において、ＳＡＭの生合成の増加は、Ｓ－アデノシルメチオニン合成酵素（ＭＡＴ）［ＥＣ ２．５．１．６］（それはＡＴＰのアデノシル基をメチオニンの硫黄原子へ転移してＳＡＭを形成することを触媒する）の活性の増加によって達成され得る。例えば、ＭＡＴの活性の増加は、ＭＡＴのコード遺伝子を過剰発現させることによって達成され得る。ＭＡＴコード遺伝子は、任意の公知の種（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からであり得る。１つの好ましい実施形態において、ＭＡＴをコードする生来のＳＡＭ２遺伝子の過剰発現は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で達成される。生来のＳＡＭ１遺伝子も過剰発現され得る。あるいは、ＭＡＴをコードする内在性Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｅｔＫ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得る。加えて、他の真核生物源または原核生物源からの異種のＭＡＴは、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａからの細胞中で発現され得る。例えば、一実施形態において、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍからの異種のＭＡＴ（配列番号：２５）は、微生物細胞中で過剰発現される。別の実施形態において、ＭＡＴの突然変異対立遺伝子が発現される。例えば、リジン１８、ロイシン３１、イソロイシン６５および／またはアスパラギン酸３４１が、それぞれアルギニン、プロリン、バリンおよび／またはグリシンへと変異される（Ｋ１８Ｒ、Ｌ３１Ｐ、Ｉ６５Ｖ、Ｄ３４１Ｇ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓからのＭＡＴ（配列番号：１）は、微生物細胞中で発現され得る。同様に、リジン２１における好ましくはアルギニンへの突然変異を備えたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＭＡＴ（Ｋ２１Ｒ）（配列番号：２）も発現され得る。

【0101】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、Ｓ－アデノシルメチオニン合成酵素（ＭＡＴ）［ＥＣ ２．５．１．６］（メチオニンアデノシルトランスフェラーゼとも称される）の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0102】

ＭＡＴは、図２中で示されるようにメチオニンからのＳＡＭの合成に関与する。

【0103】

一実施形態において、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルの増加は、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）［ＥＣ １．５．１．２０］（それは、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸の５－メチルテトラヒドロ葉酸（メチオニン生合成においてホモシステインをメチル化するために使用される）への還元を触媒する）の活性の増加によって増加される。例えば、ＭＴＨＦＲの活性の増加は、ＭＴＨＦＲのコード遺伝子を過剰発現させることによって達成され得る。ＭＴＨＦＲコード遺伝子は、任意の公知の種（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からであり得る。１つの好ましい実施形態において、ＭＴＨＦＲをコードする生来のＭＥＴ１３遺伝子（配列番号：２６）および／またはＭＥＴ１２遺伝子の過剰発現は、修飾されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で達成される。別の実施形態において、キメラＭＴＨＦＲ（それは高レベルのＳＡＭの蓄積に起因する抑制を受けない）は、微生物細胞中で発現され得る。例えば酵母Ｍｅｔ１３ｐのＮ末端触媒ドメインおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＭＴＨＦＲ（ＡｔＭＴＨＦＲ－１）のＣ末端調節ドメインのかかるキメラＭＴＨＦＲが構成され得る（配列番号：３）。加えて、他の真核生物源または原核生物源からの異種のＭＴＨＦＲは、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属の種、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｆｏｒｍｉｃａｃｅｔｉｃｕｍからの微生物細胞中で発現／過剰発現され得る。

【0104】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）［ＥＣ １．５．１．２０］の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0105】

５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸（Ｎ５，Ｎ１０－メチレンテトラヒドロ葉酸；５，１０－ＣＨ_２－ＴＨＦ）はＭＴＨＦＲによって使用される基質であって、５－メチルテトラヒドロ葉酸（５－ＭＴＨＦ、またはレボメ葉酸）を生成し、それは次にはメチオニンの産生における基質である（図２を参照）。

【0106】

特定の実施形態において、微生物細胞は、酵母Ｍｅｔ１３ｐのＮ末端触媒ドメインおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＭＴＨＦＲのＣ末端調節ドメインを含むキメラＭＴＨＦＲの過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0107】

別の実施形態において、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のレベルは、葉酸濃度の増加によって増加される。これは、例えば葉酸補足によって達成され得る。これは、葉酸合成経路を介するフラックスを増加させることによって（例えばこの経路における酵素の活性を増加させるによって）も実現され得る。例えば、３－デオキシｄ－アラビノ－ヘプツロソン酸－７－リン酸合成酵素［ＤＡＨＰＳ］［ＥＣ ２．５．１．５４］、５官能性ＡＲＯＭタンパク質［ＥＣ ４．２．３．４、４．２．１．１０、１．１．１．２５、２．７．１．７１、２．５．１．１９］、コリスミ酸合成酵素［ＥＣ ４．２．３．５］、パラ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）合成酵素［ＥＣ ６．３．５．８］、アミノデオキシコリスミ酸リアーゼ［ＥＣ ４．１．３．３８］、葉酸合成タンパク質［ＥＣ ４．１．２．２５、２．７．６．３、２．５．１．１５］、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ［ＥＣ ３．５．４．１６］、ジヒドロ葉酸合成酵素［ＥＣ ６．３．２．１２］、ジヒドロ葉酸レダクターゼ［ＥＣ １．５．１．３］、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．２．１］、またはグリシン切断複合体の活性である。これは、これらの活性をコードする内在性遺伝子を過剰発現させることによって達成され得る。例えば、内在性遺伝子ＡＲＯ３、ＡＲＯ４、ＡＲＯ１、ＡＲＯ２、ＡＢＺ１、ＡＢＺ２、ＦＯＬ１、ＦＯＬ２、ＦＯＬ３、ＤＦＲ１、ＳＨＭ２、ＳＨＭ１、ＬＰＤ１、ＧＣＶ２、ＧＣＶ１またはＧＣＶ３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞中で過剰発現され得る。

【0108】

別の実施形態において、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルは、プリン生合成経路（それは補因子（ＡＴＰおよびＧＴＰ）を供給することができる）を介するフラックスを増加することによって増加される。これは、経路における酵素の活性の増加によって達成され得る。例えば、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．４．２．１４］（それはプリン生合成における第１のコミットされたステップを触媒する）の活性は、増加され得る。これは、この酵素をコードする内在性遺伝子の過剰発現によって達成され得る。例えば、内在性ＡＤＥ４遺伝子（配列番号：２７）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得る。あるいは、内在性ｐｕｒＦ遺伝子（配列番号：２８）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で過剰発現され得る。あるいは、フィードバック調節を受けない、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼをコードする遺伝子の突然変異対立遺伝子が発現され得る。例えば、アスパラギン酸３１０、リジン３３３および／またはアラニン４１７が、好ましくはそれぞれバリン、グルタミンおよびトリプトファンによって置き換えられる、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉからのＡＤＥ４（Ｄ３１０Ｖ、Ｋ３３３Ｑ、Ａ４１７Ｗ、配列番号：４）は、真核生物細胞または原核生物細胞中で発現され得る。あるいは、アスパラギン酸２９３、リジン３１６および／またはセリン４００が、好ましくはバリン、グルタミンおよびトリプトファンによって置き換えられる、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓからの変異ＰｕｒＦ（Ｄ２９３、Ｋ３１６、Ｓ４００Ｗ、配列番号：５）は、微生物細胞中で発現され得る。

【0109】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、ホスホリボシル二リン酸（ＰＲＰＰ）５－アミドトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．４．２．１４］（アミドホスホリボシルトランスフェラーゼとも称される）の過剰発現のために遺伝子修飾される。この酵素の過剰発現は、微生物細胞中のＡＴＰおよび／またはＧＴＰのレベルを増加することを一般的に導くだろう。増加レベルのＡＴＰおよび／またはＧＲＰは、今度は例えば微生物細胞中のＳＡＭ生合成において使用され得る。

【0110】

特定の実施形態において、微生物細胞は、Ｄ３１０Ｖ、Ｋ３３３ＱおよびＡ４１７Ｗからなる群から選択される、アミノ酸残基の少なくとも１つの突然変異を備えたＡｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ ＡＤＥ４遺伝子を含む。別の特定の実施形態において、微生物細胞は、Ｄ２９３Ｖ、Ｋ３１６ＱおよびＳ４００Ｗからなる群から選択される、少なくとも１つの突然変異を備えたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ ＰｕｒＦ遺伝子を含む。

【0111】

別の実施形態において、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルは、メチオニンサルベージ経路を経由してポリアミン合成から形成された５’－メチルチオアデノシンの再利用によって増加される。例えば、メチオニンサルベージ経路を介するフラックスは増加され得る。これは、この経路における酵素（メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）［ＥＣ ２．４．２．２８］、５’－メチルチオリボース－１－リン酸イソメラーゼ（ＭＲＩ）［ＥＣ ５．３．１．２３］、５’－メチルチオリブロース－１－リン酸デヒドラターゼ（ＭＤＥ）［ＥＣ ４．２．１．１０９］、２，３－ジオキソメチオペンタン（ｄｉｏｘｏｍｅｔｈｉｏｐｅｎｔａｎｅ）－１－リン酸エノラーゼ／ホスファターゼ［ＥＣ ３．１．３．７７］、アシレズクトンジオキシゲナーゼ［ＥＣ １．１３．１１．５４］、または分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ）［ＥＣ ２．６．１．５、ＥＣ ２．６．１．５７、ＥＣ ２．６．１．４２］等）の活性の増加によって行われ得る。例えば、ＭＴＡＰの増加した活性は、ＭＴＡＰのコード遺伝子を過剰発現させることによって達成され得る。ＭＴＡＰコード遺伝子は、任意の公知の種（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からであり得る。１つの好ましい実施形態において、ＭＴＡＰをコードする生来のＭＥＵ１遺伝子（配列番号：１７）の過剰発現は、修飾されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で達成される。あるいは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＵ１遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ中でも発現され得る。別の好ましい実施形態において、生来のＢＡＴ２遺伝子（配列番号：１８）（それは分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼをコードする）の過剰発現は、修飾されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で達成され得る。加えて、遺伝子ＭＲＩ１（配列番号：１１８）、ＭＤＥ１（配列番号：１１９）、ＵＴＲ４（配列番号：１２０）、ＡＤＩ１（配列番号：１２１）、ＡＲＯ８（配列番号：１２２）、ＡＲＯ９（配列番号：１２３）、またはＢＡＴ１（配列番号：１２４）（それらは、それぞれ５－メチルチオリボース－１－リン酸イソメラーゼ、メチルチオリブロース－１－リン酸デヒドラターゼ、２，３－ジオキソメチオペンタン－１－リン酸エノラーゼ／ホスファターゼ、アシレズクトンジオキシゲナーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼＩ、芳香族アミノトランスフェラーゼＩＩ、およびミトコンドリア分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）アミノトランスフェラーゼをコードする）も過剰発現され得る。この経路は、原核生物宿主中でも過剰発現され得る。例えば、経路における酵素ステップは、Ｅ．ｃｏｌｉの中へ導入され得る。これは、内在性ｔｙｒＢ遺伝子（それはＥ．ｃｏｌｉ中でＢＡＴをコードする）と組み合わせられる可能性があり得る。加えて、他の真核生物源または原核生物源からの異種遺伝子は、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓから発現され得る。

【0112】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）［ＥＣ ２．４．２．２８］（Ｓ－メチル－５’－チオアデノシンホスホリラーゼとも称される）；５－メチルチオリボース－１－リン酸イソメラーゼ（ＭＲＩ）［ＥＣ ５．３．１．２３］（Ｓ－メチル－５－チオリボース－１－リン酸イソメラーゼとも称される）；メチルチオリブロース－１－リン酸デヒドラターゼ（ＭＤＥ）［ＥＣ ４．２．１．１０９］；２，３－ジオキソメチオペンタン－１－リン酸エノラーゼ／ホスファターゼ［ＥＣ ３．１．３．７７］（アシレズクトン合成酵素とも称される）；アシレズクトンジオキシゲナーゼ［ＥＣ １．１３．１１．５４］；および分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ）［ＥＣ ２．６．１．４２］（チロシントランスアミナーゼ［ＥＣ ２．６．１．５］および芳香族アミノ酸トランスアミナーゼ［ＥＣ ２．６．１．５７］とも称される）からなる群から選択される、メチオニンサルベージ経路における少なくとも１つの酵素の過剰発現のために遺伝子修飾される。特定の実施形態において、微生物細胞は、ＭＴＡＰおよび／またはＢＡＴの過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0113】

図２中で示されるように、メチオニンサルベージ経路は、５’－メチルチオリボース（ＭＲＰ）および４－メチルチオ－２－オキソ酪酸塩（ＭＯＢ）を経由して５’－メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）からメチオニンを合成することを含む。次いでサルベージ経路からのメチオニンは、ＳＡＭの産生のために基質として使用され得る。

【0114】

別の実施形態において、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルは、ＳＡＭ産生のための細胞内メチオニン利用度を増加させることによって増加される。これは、例えばメチオニン補給によって達成され得る。あるいは、細胞内のメチオニンは、中間体のＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドに由来し得る。例えば、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドからのメチオニン形成の原因である経路を介するフラックスは、増加され得る。これは、経路における酵素（ホモセリンデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．１．１．３］、ホモセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３１］、Ｏ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼ［ＥＣ ２．５．１．４９］、およびＮ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＭＥＴＥ）［ＥＣ ２．１．１．１４］等）の活性の増加によって行われ得る。例えば、好ましい実施形態において、Ｏ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼの活性は、Ｏ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼ（ＭＥＴ１７またはＳＴＲ２）をコードする内在性遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現させるによって増加され得る。別の好ましい実施形態において、他の生物体（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ（ｏａｈ１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の種、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ｍｅｔＹ）等）からのＯ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼをコードする異種遺伝子も、酵母細胞または細菌細胞中で過剰発現され得る。別の好ましい実施形態において、Ｎ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインメチルトランスフェラーゼの活性も増加され得る。これは、例えばＭＥＴＥ（ＭＥＴ６）をコードする内在性遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現させることによって行われ得る。別の好ましい実施形態において、他の生物体（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ（ＭｅｔＥ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ（ｍｅ－８）またはＥ．ｃｏｌｉ（ｍｅｔＥ）等）からのＭＥＴＥをコードする異種遺伝子は、微生物細胞中で過剰発現され得る。別の実施形態において、ホモセリンデヒドロゲナーゼおよびホモセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３１］の活性は、内在性遺伝子ＨＯＭ６（配列番号：１２７）および／またはＭＥＴ２をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現させることによっても増加され得る。別の実施形態において、これらの酵素の活性は、他の源（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、またはＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等）からのこれらの酵素をコードする異種遺伝子を微生物細胞中で過剰発現させるによって増加され得る。好ましい実施形態において、Ｚｅａ ｍａｙｓからのホモセリンデヒドロゲナーゼは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現される。加えて、他の真核生物源または原核生物源からの遺伝子は、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓから発現され得る。

【0115】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドのメチオニンへの変換の促進のために遺伝子修飾される。

【0116】

特定の実施形態において、微生物細胞は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．１．１．３］；ホモセリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３１］；Ｏ－アセチルホモセリン（チオール）－リアーゼ［ＥＣ ２．５．１．４９］（Ｏ－アセチルホモセリンアミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼとも称される）；および５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ（ＭＥＴＥ）［ＥＣ ２．１．１．１４］からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0117】

Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドのメチオニンへのこの変換は図２中で示され、上記の酵素を包含する。この合成経路は、それによってＳＡＭの産生において使用される微生物細胞中の基質メチオニンの量を増加させた。

【0118】

別の実施形態において、ＳＡＭ合成のために必要とされるメチオニンは、システインに由来し得る。これは、例えばシスタチオニンγ－シンターゼ（ＣＧＳ）［ＥＣ ２．５．１．４８］（それはシステインをシスタチオニンへと変換する）の活性の増加によって行われ得る。これは、ＣＧＳをコードする内在性遺伝子を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＴＲ２）、Ｅ．ｃｏｌｉ（ｍｅｔＢ）、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｃｇｌ２４４６）中で過剰発現させることによって達成され得る。シスタチオンβリアーゼ［ＥＣ ４．４．１．８］（ＣＢＬ）（それはシスタチオンをホモシステインへ変換する）の活性は、同様にまたはあるいは、増加され得る。これは、シスタチオンβリアーゼ活性をコードする内在性遺伝子（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩＲＣ７もしくはＳＴＲ３、Ｅ．ｃｏｌｉのｍａｌＹもしくはｍｅｔＣ、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＣｇｌ２３０９等）を過剰発現させることによって行われ得る。他の源（例えばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、またはＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）からのＣＧＳおよびＣＢＬをコードする遺伝子も発現され得る。

【0119】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、シスタチオニンγ－シンターゼ［ＥＣ ２．５．１．４８］およびシスタチオンβ－リアーゼ（ＣＢＬ）［ＥＣ ４．４．１．８］からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現によって、システインのメチオニンへの変換の促進のために遺伝子修飾される。この合成経路は、それによってＳＡＭの産生において使用される微生物細胞中の基質メチオニンの量を増加させた。

【0120】

上記の修飾は、セリンをシステインへ変換する酵素とも組み合わせられ得る。例えば、セリンアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．３．１．３０］およびシステインシンターゼＡ［ＥＣ ２．５．１．４７］の活性の組み合わせを介するものである。これは、これらの活性をコードする遺伝子を発現／過剰発現させることによって行われ得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからの遺伝子ｃｙｓＥおよびｃｙｓＫは、原核生物細胞または真核生物細胞中で過剰発現され得る。

【0121】

別の実施形態において、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルは、内在性シスタチオニンβ－シンターゼ（ＣＢＳ）［ＥＣ ４．２．１．２２］（それはセリンおよびホモシステインからのシスタチオニンの合成を触媒する）の活性を低減させることによって増加され得る。これは、例えばシスタチオニンβシンターゼ（ＣＹＳ４）をコードする生来の遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートすることによって行われ得る。あるいは、シスタチオニンγ－リアーゼ（ＣＧＳ）［ＥＣ ４．４．１．１］（それはシスタチオンのシステインへの変換を触媒する）の活性は、低減され得る。これは、例えばシスタチオニンγ－リアーゼ（ＣＹＳ３）をコードする生来の遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートすることによって行われ得る。したがって、一実施形態において、微生物細胞は、シスタチオニンβ－シンターゼ（ＣＢＳ）［ＥＣ ４．２．１．２２］の活性の減弱またはＣＢＳをコードする遺伝子の欠失もしくは破壊のために遺伝子修飾される。

【0122】

この酵素は、ホモシステインのシスタチオニンへの変換（すなわちＣＢＬに比較して反対の反応経路）を触媒する。したがって、ＣＢＳはホモシステインを枯渇させ、それは、今度は微生物細胞中のメチオニンのレベルを減少させる。

【0123】

別の実施形態において、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルは、ピルビン酸塩のＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへの変換を増加させることによって増加され得る。これは、ピルビン酸カルボキシラーゼ［ＥＣ ６．４．１．１］、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．６．１．１］、アスパラギン酸キナーゼ（ＡＫ）［ＥＣ ２．７．２．４］、および／またはアスパラギン酸βセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．２．１．１１］の活性を増加させることによって行われ得る。例えば、好ましい実施形態において、ＡＫの活性は、ＡＫをコードする内在性ＨＯＭ３遺伝子（配列番号：２９）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で、またはｍｅｔＬ／ＬｙｓＣ／ｔｈｒＡ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中で、過剰発現させることによって増加され得る。あるいは、ＡＫの変異バージョンが導入され得る。例えば、ＨＯＭ３の突然変異対立遺伝子（そこで、Ｓｅｒ３９９は交換される（例えばフェニルアラニンへ；Ｓ３９９Ｆ；配列番号：６））が発現され得る。この対立遺伝子はフィードバック調節を受けず、したがってより高いレベルのＬ－４－アスパルチル－リン酸の蓄積をもたらし得る。さらに、他の生物体からのフィードバック耐性対立遺伝子が発現され得る。例えば、グルタミン酸２５７（例えばリジンへ；Ｅ２５７Ｋ；配列番号：７）中の突然変異を備えたＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｂｏｖｉｅｎｉｉからのｍｅｔＬ、またはスレオニン３５９（例えばイソロイシンへ；Ｔ３５９Ｉ）もしくはグルタミン酸２５７（例えばリジンへ；Ｅ２５７Ｋ）中のいずれかまたは両方の（配列番号：８）突然変異を備えた同じ種からのリジン感受性アスパルトキナーゼ３は、微生物細胞の中へ導入され得る。加えて、スレオニン３１１が交換される（例えばイソロイシンへ；Ｔ３１１Ｉ；配列番号：２２）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからのフィードバック耐性ＡＫ（ｌｙｓＣ遺伝子によってコードされる）も、発現され得る。さらに、他の生物体（例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）からのＡＫをコードする遺伝子も、微生物細胞中で発現され得る。

【0124】

ピルビン酸塩のＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへの変換に関与する他の酵素の活性が増加され得る。例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼ［ＥＣ ６．４．１．１］（それはピルビン酸塩をオキサロ酢酸塩へ変換する）の活性は、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする内在性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子（ＰＹＣ１および／またはＰＹＣ２；それぞれ配列番号：１２５および配列番号：１２６）、または変異バージョン（プロリン４５８がセリンにより置き換えられた（Ｐ４５８Ｃ）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｐｙｃ等）の過剰発現によって増加され得る。他の生物体（例えばＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）からのピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子も発現され得る。

【0125】

あるいはまたは加えて、中間体のオキサロ酢酸塩は、ホスホエノールピルビル酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ［ＥＣ ４．１．１．３１］の活性の増加によって生成され得る。これは、ＰＥＰカルボキシラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によって達成され得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＣＫ１遺伝子またはＥ．ｃｏｌｉ Ｐｐｃ遺伝子は、微生物細胞中で過剰発現され得る。あるいは、ロイシン６２０が置換される（例えばセリンによって、Ｌ６２０Ｓ）Ｐｐｃの突然変異バージョンは、微生物細胞中で発現され得る。別の実施形態において、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）［ＥＣ ２．６．１．１］の活性が増加され得る。これは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする内在性遺伝子（例えばＡＡＴ１および／またはＡＡＴ２）をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現させることによって行われ得る。他の生物体（例えばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）からのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子も導入され得る。別の実施形態において、アスパラギン酸βセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．２．１．１１］の活性は、アスパラギン酸βセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＨＯＭ２）をコードする内在性遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現させるによって増加され得る。他の生物体（例えばＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）からのアスパラギン酸βセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子も発現され得る。

【0126】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、ピルビン酸塩のＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへの変換の促進のために遺伝子修飾される。

【0127】

特定の実施形態において、微生物細胞は、ピルビン酸カルボキシラーゼ［ＥＣ ６．４．１．１］、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．６．１．１］、アスパラギン酸キナーゼ（ＡＫ）［ＥＣ ２．７．２．４］、およびアスパラギン酸βセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．２．１．１１］（アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼとも称される）からなる群から選択される、少なくとも１つの酵素の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0128】

図２中で示されるように、これらの酵素は、ピルビン酸塩のＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへの変換を触媒し、それは上記のようにメチオニンおよび次いでＳＡＭへとさらに変換され得る。

【0129】

特定の実施形態において、微生物細胞は、アミノ酸セリン３９９の突然変異を備えたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＨＯＭ３、アミノ酸スレオニン３５９および／またはグルタミン酸２５７の突然変異を備えたＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｂｏｖｉｅｎｉｉ ＡＫ、ならびにスレオニン３１１の突然変異を備えたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＫからなる群から選択される、ＡＫをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。

【0130】

別の実施形態において、スペルミジンは、最初にＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドとプトレシンを縮合してカルボキシスペルミジンを形成し、続いて、脱カルボキシル化してスペルミジンを形成することによって形成され得る。例えば、微生物細胞中のＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドのレベルを促進する上記の修飾は、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドおよびプトレシンを縮合してカルボキシスペルミジンを形成することができる酵素（カルボキシ（ノル）スペルミジンデヒドロゲナーゼ（ＣＡＳＤＨ／ＣＡＮＳＤＨ）［ＥＣ １．５．１．４３］等）をコードする異種遺伝子の発現と組み合わせられ得る。次いでカルボキシスペルミジンは、カルボキシ（ノル）スペルミジンデカルボキシラーゼ（ＣＡＳＤＣ／ＣＡＮＳＤＣ）［ＥＣ ４．１．１．９６］を経由してスペルミジンに変換され得る。例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号：１０～１１であり；タンパク質配列はそれぞれ配列番号：１４９～１５０である）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、またはＶｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓからのＣＡＳＤＨ／ＣＡＮＳＤＨおよびＣＡＳＤＣ／ＣＡＮＳＤＣは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＥ．ｃｏｌｉの細胞中で発現され得る。これは、競合反応へのフラックスの低減とも組み合わせられ得る。例えば、別の実施形態において、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドのホモセリンへの変換が低減される。これは、ホモセリンデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．１．１．３］をコードする内在性酵素のダウンレギュレートによって達成され得る。例えば、内在性ＨＯＭ６（配列番号：１２７）遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートされ得る。

【0131】

別の実施形態において、上記の修飾はスレオニン産生経路へのフラックスの低減と組み合わせられるか、またはこの経路は上記の修飾に依存しないで使用され得る。これは、ホモセリンキナーゼ［ＥＣ ２．７．１．３９］および／またはスレオニン合成酵素［ＥＣ ４．２．３．１；４．２．９９．２］の活性を減少させることによって達成され得る。例えば、ホモセリンキナーゼをコードする内在性ＴＨＲ１遺伝子またはスレオニン合成酵素をコードする内在性ＴＨＲ４遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートまたは破壊され得る。あるいは、内在性ｔｈｒＢまたはｔｈｒＣ遺伝子（これらの活性をコードする）は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でダウンレギュレートまたは破壊され得る。加えて、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ［ＥＣ ４．１．１．２０］の活性は、例えば内在性ｌｙｓＡ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中でダウンレギュレートすることによって低減され得る。

【0132】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、内在性ホモセリンキナーゼ［ＥＣ ２．７．１．３９］および／または内在性スレオニン合成酵素［ＥＣ ４．２．３．１および以前にＥＣ ４．２．９９．２としても公知である］の活性の減弱のために、またはホモセリンキナーゼをコードする内在性遺伝子および／もしくはスレオニン合成酵素をコードする内在性遺伝子の欠失もしくは破壊によって、遺伝子修飾される。

【0133】

これらの酵素は、スレオニン生合成経路（それは図２中で指示されるように基質としてホモセリンを使用する）に関与する。したがって、これらの酵素の活性の減弱またはこれらの酵素をコードする遺伝子の欠失もしくは破壊によって、ホモセリンはスレオニン生合成経路において枯渇されないが、むしろｏ－アセチルホモセリンへとさらに変換され得る。

【0134】

別の実施形態において、ＳＡＭのメチオニンへ戻る変換は、低減され得る。これは、Ｓ－アデノシルメチオニン－ホモシステインメチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．１０］の活性の低減によって行われ得る。例えば、Ｓ－アデノシルメチオニン－ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＳＡＭ４またはＭＨＴ１）をコードする内在性遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートまたは破壊され得る。

【0135】

別の実施形態において、ＳＡＭレベルは、オキサロ酢酸塩のクエン酸塩への変換の低減によって増加される。これは、内在性クエン酸塩合成酵素［ＥＣ ２．３．３．１］の活性の低減によって達成され得る。これは、例えばクエン酸合成酵素（ＣＩＴ１、ＣＩＴ２またはＣＩＴ３等）をコードする内在性遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートすることによって行われ得る。

【0136】

別の実施形態において、オキサロ酢酸塩のミトコンドリアの中への取込みが増加される。これは、オキサロ酢酸塩をミトコンドリアの中へ輸送する輸送体タンパク質の過剰発現によって行われ得る。例えば、オキサロ酢酸塩のためのミトコンドリア内膜輸送体をコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＯＡＣ１は、真核生物細胞中で過剰発現され得る。

【0137】

別の実施形態において、ミトコンドリアからサイトゾルの中へのアスパラギン酸塩の輸送が増加される。これは、アスパラギン酸輸送体の活性の増加によって達成され得る。例えば、内在性ＡＧＣ１（それはミトコンドリアアミノ酸輸送体をコードする）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得る。あるいは、サイトゾル中のアスパラギン酸塩の合成は、ＡＡＴの細胞質バージョン（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＡＴ２または原核生物ＡＡＴ）の発現によって増進され得る。これは、ミトコンドリアオキサロ酢酸輸送体（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＯＡＣ１）の発現を低減することによってサイトゾル中のオキサロ酢酸塩を増加させることとも組み合わせられ得る。加えて、ピルビン酸塩のミトコンドリアの中への輸送は、ミトコンドリアピルビン酸輸送タンパク質（例えばＭＰＣ１またはＭＰＣ２またはＭＰＣ３）の発現をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で減少させることによって減少され得る。

【0138】

別の実施形態において、フラックスは、アスパラギン酸塩を利用する他の内在性反応を低減することによって、アスパラギン酸塩からＬ－アスパラギン酸－４－リン酸（Ｌ－ａｓｐａｒｔａｔｅ－４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）へと増加され得る。かかる反応についての例としては、アルギニノコハク酸合成酵素［ＥＣ ６．３．４．５］、アスパラギン合成酵素［ＥＣ ６．３．５．４］、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボザミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ａｍｉｎｏ ｉｍｉｄａｚｏｌｅｓｕｃｃｉｎｏｃａｒｂｏｚａｍｉｄｅ）合成酵素［ＥＣ ６．３．２．６］、アデニロコハク酸合成酵素［ＥＣ ６．３．４．４］、およびアスパラギン酸トランスカルバミラーゼ［ＥＣ ２．１．３．２］が挙げられる。これは、これらの反応を触媒する酵素をコードする内在性遺伝子をダウンレギュレートすることによって達成され得る。例えば、アルギニノコハク酸合成酵素（ＡＲＧ１）、アスパラギン合成酵素（ＡＳＮ１またはＡＳＮ２）、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボザミド合成酵素（ＡＤＥ１）、アデニロコハク酸合成酵素（ＡＤＥ１２）、および／またはアスパラギン酸トランスカルバミラーゼ（ＵＲＡ２）をコードする遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞中でダウンレギュレートされ得る。

【0139】

別の実施形態において、ＳＡＭレベルは、硫化水素（Ｈ２Ｓ）（ＳＡＭの前駆体）の形成の増加によって増加される。これは、ＡＴＰスルフリラーゼ［ＥＣ ２．７．７．４］、アデニリル硫酸キナーゼ［ＥＣ ２．７．１．２５］、ホスホノアデニリル－硫酸（ＰＡＰＳ）レダクターゼ［ＥＣ １．８．４．８］、および／または亜硫酸レダクターゼ［ＥＣ １．８．１．２］の活性の増加によって硫酸同化経路を介するフラックスを増加させることによって、達成され得る。これは、これらの酵素活性をコードする内在性遺伝子の過剰発現によって達成され得る。例えば、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ５、ＭＥＴ１０および／またはＥＣＭ１７は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得る。チオレドキシンが発現され得る。異種の源（例えばＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属の種、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのこれらの活性をコードする遺伝子も、発現され得る。Ｈ２Ｓの形成は、培地中の硫酸塩の濃度の増加によって増加され得る。別の実施形態において、培地からの硫酸塩の取込みは、硫酸輸送体の発現の増加によって増加され得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの内在性硫酸透過酵素（ＳＵＬ１、ＳＵＬ２および／またはＳＵＬ３）が過剰発現され得る。加えて、異種の硫酸輸送体が導入され得る。さらに、亜硫酸塩の排出は、内在性排出輸送体（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳＳＵ１）の破壊／ダウンレギュレーションによって低減され得る。別の実施形態において、硫酸同化を活性化する転写調節因子が、過剰発現され得る。例えば、内在性遺伝子ＭＥＴ２８およびＭＥＴ３２は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得る。

【0140】

別の実施形態において、スペルミジン形成のためのＳＡＭ利用可能性は、ＳＡＭを利用する他の細胞性反応を減少させることによって増加される。例えば、エルゴステロール生合成に関与する反応は、ダウンレギュレートされ得る。これは、これらの反応に関与する内在性酵素を破壊／ダウンレギュレートすることによって達成され得る。例えば、Δ（２４）－ステロールＣ－メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．１．１．４１；ＥＲＧ６］および／またはＣ－２４（２８）ステロールレダクターゼ［ＥＣ １．３．１．７１；ＥＲＧ４］をコードする内在性遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートされ得る。

【0141】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、内在性Δ（２４）－ステロールＣ－メチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．１．１．４１］（ステロール２４－Ｃ－メチルトランスフェラーゼとも称される）および／もしくは内在性Ｃ－２４（２８）ステロールレダクターゼ［ＥＣ１．３．１．７１］（Δ（２４（２４（１）））－ステロールレダクターゼとも称される）の活性の減弱のために、またはΔ（２４）－ステロールＣ－メチルトランスフェラーゼをコードする内在性遺伝子および／もしくはＣ－２４（２８）ステロールレダクターゼをコードする内在性遺伝子の欠失もしくは破壊によって、遺伝子修飾される。

【0142】

Δ（２４）－ステロールＣ－メチルトランスフェラーゼは、化学反応、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン＋５α－コレスタ－８，２４－ジエン－３β－オール→Ｓ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン＋２４－メチレン－５α－コレスト－８－エン－３β－オールを触媒する。したがって、この酵素はＳＡＭを枯渇させ、そのためそれは好ましくは減弱されるか、または好ましくはその遺伝子は微生物細胞中で欠失もしくは破壊される。内在性Ｃ－２４（２８）ステロールレダクターゼの破壊は、ＳＡＭ蓄積の増加へ結びつけられている。

【0143】

さらなる実施形態において、内在性グリコーゲン分岐酵素［ＥＣ．２．４．１．１８］の活性は低減され得る。例えば、内在性ＧＬＣ３遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でダウンレギュレートされ得る。

【0144】

一実施形態において、微生物細胞は、内在性グリコーゲン分岐酵素の活性の減弱のために、またはグリコーゲン分岐酵素をコードする内在性遺伝子の欠失もしくは破壊によって、遺伝子修飾される。

【0145】

別の実施形態において、ＳＡＭレベルは、より良好な酸素利用可能性、細胞増殖、およびタンパク質発現を増進するために、ヘモグロビンを導入することによって増加され得る。例えば、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ属からのヘモグロビン（ＶＨｂ）（配列番号：９）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現され得る。

【0146】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、ヘモグロビン（好ましくはＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ属のヘモグロビン）の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0147】

ＳＡＭレベルを増加する上記の実施形態のうちの任意のものは、微生物細胞中で組み合わせられ得る。

【0148】

別の実施形態において、上記の修飾の任意のものを使用して、他のポリアミン（スペルミン等）を産生することができる。これは、スペルミン合成酵素［ＥＣ ２．５．１．２２］の活性を増加させることによって達成され、それは、例えばスペルミン合成酵素（ＳＰＥ４、配列番号：１２８）をコードするＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現させることによって行われ得る。あるいは、他の生物体（例えばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）からのスペルミン合成酵素も発現され得る。加えて、スペルミンのスペルミジンへ戻る変換は、ポリアミンオキシダーゼ［ＥＣ １．５．３．１７］の活性を低減することによって（例えばこの酵素（例えばＦＭＳ１）をコードする生来の遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で破壊することによって）低減され得る。

【0149】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、スペルミン生合成の促進のために遺伝子修飾される。特定の実施形態において、微生物細胞は、スペルミン合成酵素［ＥＣ ２．５．１．２２］の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0150】

別の実施形態において、ポリアミンの培地の中へのエクスポートは促進され得る。これは、異なるエクスポートタンパク質（酵母ＴＰＯ１、ＴＰＯ２、ＴＰＯ３、ＴＰＯ４およびＴＰＯ５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭｄｔＪＩ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ＭｄｔＪＩ、哺乳動物ＳＬＣ３Ａ２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ Ｂｌｔ輸送体および／または哺乳動物ＭＤＲ１等）の過剰発現によって達成され得る。加えて、ポリアミンの取込みに関連する遺伝子（酵母ＤＵＲ３、ＳＡＭ３、ＡＧＰ２および／またはＧＡＰ１等）は、ダウンレギュレートまたは欠失され得る。あるいは、ポリアミンの細胞内存在の増加は、ポリアミン輸送体ＴＰＯ１、ＴＰＯ２、ＴＰＯ３、ＴＰＯ４またはＴＰＯ５のダウンレギュレーションまたは欠失によって達成され得る。

【0151】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＯ１、ＴＰＯ２、ＴＰＯ３、ＴＰＯ４およびＴＰＯ５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭｄｔＪＩ、哺乳動物ＳＬＣ３Ａ２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ Ｂｌｔ輸送体、ならびに哺乳動物ＭＤＲ１からなる群から選択される、少なくとも１つのポリアミンエクスポートタンパク質の過剰発現によって、ポリアミンエクスポートの促進のために遺伝子修飾される。

【0152】

別の実施形態において、微生物細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＵＲ３、ＳＡＭ３、ＡＧＰ２およびＧＡＰ１からなる群から選択される、少なくとも１つのポリアミン取込みタンパク質のダウンレギュレーションによって、ポリアミン取込みの低減のために遺伝子修飾される。

【0153】

本発明の別の実施形態において、ポリアミンの培地へのエクスポートは、多剤応答に関与するエクスポーターの調節の原因である転写因子の過剰発現によって増加される。例えば、遺伝子ＰＤＲ１（配列番号：３０）および／またはＰＤＲ２（配列番号：１２９）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得る。

【0154】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＲ１および／またはＰＤＲ２の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0155】

別の実施形態において、ポリアミン毒性への上記の株の耐性が増加される。複数の遺伝子のダウンレギュレーションおよび／または欠失は、酵母におけるポリアミン毒性への耐性の増加が付随した。これは、ＳＲタンパク質キナーゼ（ＳＲＰＫ）（ＳＫＹ１によってコードされる）、推定上のセリン／トレオニンプロテインキナーゼ（ＰＴＫ２によってコードされる）、ＢＲＰ１、およびＦＥＳ１を包含する。加えて、複数の生来の遺伝子の過剰発現は、ポリアミン毒性への耐性の増加が付随した。これはＱＤＲ３およびＹＡＰ１を包含する。上記の遺伝子は、酵母におけるポリアミン毒性への至適の耐性を可能にする様々な組み合わせで、過剰発現および／またはダウンレギュレートされ得る。

【0156】

したがって、一実施形態において、微生物細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞であり、ＳＲタンパク質キナーゼ（ＳＲＰＫ）をコードするＳＫＹ１、推定上のセリン／トレオニンプロテインキナーゼをコードするＰＴＫ２、ＢＲＰ１、およびＦＥＳ１からなる群から選択される、少なくとも１つの遺伝子のダウンレギュレーションのために遺伝子修飾される。

【0157】

別の実施形態において、微生物細胞は、Ｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＱＤＲ３および／またはＹＡＰ１の過剰発現のために遺伝子修飾される。

【0158】

さらなる実施形態において、微生物細胞は、多剤・毒素排出（ＭＡＴＥ）ファミリーのメンバーの過剰発現、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＥＲＣ１の過剰発現、およびより好ましくはＳ５１Ｎ、Ｖ２６３ＩおよびＮ５４５Ｉからなる群から選択される、少なくとも１つの突然変異を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＲＣ１をコードする遺伝子のために、遺伝子修飾される。

【0159】

別の実施形態において、Ｓ－アデノシルメチオニンのレベルは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩメディエーター複合体のサブユニットの過剰発現によって増加される。例えば、ＧＡＬ１１（配列番号：３１）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で過剰発現され得る。

【0160】

したがって、一実施形態において、微生物細胞は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩメディエーター複合体のサブユニットの過剰発現（好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１１の過剰発現）のために遺伝子修飾される。

【0161】

一実施形態において、微生物細胞は、培養培地の１Ｌあたり１００ｍｇを超えるスペルミジン、および／または１ｇのＤＣＷあたり１０ｍｇを超えるスペルミジンを産生することが可能である。

【0162】

特定の実施形態において、微生物細胞は、培養培地の１Ｌあたり２５０ｍｇを超える、好ましくは５００ｍｇを超える、およびより好ましくは７５０ｍｇを超える（１ｇを超える等）スペルミジンを産生することが可能である。

【0163】

代替または追加の特定の実施形態において、微生物細胞は、１ｇのＤＣＷあたり１５ｍｇを超える、好ましくは２５ｍｇを超える、およびより好ましくは３０ｍｇを超えるスペルミジンを産生することが可能である。

【0164】

上記の実施形態が組み合わせられ得る。

【0165】

実施形態の別の態様（それは上記の実施形態のうちの任意のものと随意に組み合わせられ得る）は、スペルミジンを産生することが可能な微生物細胞に関する。微生物細胞は、カルボキシ（ノル）スペルミジンデヒドロゲナーゼ（ＣＡＳＤＨ／ＣＡＮＳＤＨ）［ＥＣ１．５．１．４３］（カルボキシノルスペルミジン合成酵素とも称される）；およびカルボキシノルスペルミジンデカルボキシラーゼ（ＣＡＮＳＤＣ）［ＥＣ ４．１．１．９６］からなる群から選択される酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む。

【0166】

実施形態のこの態様は、それによってプトレシンおよびＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドの縮合を介するスペルミジンを産生することが可能な微生物細胞を提供する。特に、ＣＡＳＤＨは、以下の反応、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒド＋プトレシン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋→カルボキシスペルミジン＋Ｈ_２Ｏ＋ＮＡＤＰ^＋を触媒する。次いでＣＡＮＳＤＣは、カルボキシスペルミジンのスペルミジンへの変換（カルボキシスペルミジン→スペルミジン＋ＣＯ_２）を触媒する。

【0167】

この態様の特定の実施形態において、微生物細胞は、内在性ホモセリンデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．１．１．３］の活性の減弱のために、またはホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする内在性遺伝子の欠失もしくは破壊によって、遺伝子修飾される。

【0168】

実施形態のさらなる態様は、スペルミジンを産生する方法に関する。方法は、培養培地中で、および微生物細胞からのスペルミジンの産生に好適な培養条件において、実施形態のうちの任意のものに従う微生物細胞を培養することを含む。方法は、培養培地および／または微生物細胞からスペルミジンを収集することも含む。

【0169】

一実施形態において、培養培地はメチオニンを含む。

【0170】

実施形態のさらに別の態様は、食品添加物としての実施形態のうちの任意のものに従う微生物細胞の使用に関する。

【0171】

スペルミジンは、先に言及されるように正の効果を有し、例えば寿命を増進することおよび多様な加齢関連病態（癌、多発性硬化症、骨粗鬆症、心血管性疾患、記憶障害、皮膚加齢および脱毛等）に対して緩和または保護することが挙げられる。したがって、実施形態に従う微生物細胞を産生するスペルミジンは、次いで食品添加物として使用され得る。かかる事例において、微生物細胞は、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）微生物細胞である。微生物細胞は、微生物細胞によってエンリッチされることが好適な任意の食物への食品添加物として使用され得る。非限定的であるが例示的な例は、ヨーグルトである。

【実施例】

【0172】

例１
プトレシンおよびＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドをスペルミジンへ変換することができる異種遺伝子の発現によるプトレシンに向けたフラックスの増加による、微生物細胞中でのスペルミジン産生の増加。
本実施例は、プトレシンおよびＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドをスペルミジンへと変換することができる異種酵素の導入が、高レベルのプトレシンを産生するように以前に操作した微生物細胞中でのスペルミジン産生をさらに増加することを実証する。導入された修飾は、高レベルのＬ－オルニチン（プトレシンへの直接的な前駆物質）を産生するように以前に操作した酵母株に主として依存する（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ［５］）。これらの株は、プトレシンに向けたフラックスをさらに増加するように、ならびにさらに異種カルボキシスペルミジンデヒドロゲナーゼ（ＣＡＳＤＨ、カルボキシノルスペルミジン合成酵素としても公知）［ＥＣ １．５．１．４３］およびカルボキシスペルミジンデカルボキシラーゼ（ＣＡＳＤＣ）［ＥＣ ４．１．１．９６］の過剰発現によって、修飾された。

【0173】

プトレシンは、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の作用を経由してオルニチンから合成され得る。酵母において、ＯＤＣは、ＯＤＣ抗酵素（ＯＡＺ）（それはＯＤＣへ結合し、分解の標的とする）を経由して調節される。したがって、本発明者は、同時に、ＯＡＺ（遺伝子ＯＡＺ１によってコードされる）を欠失させ、ＯＤＣ（遺伝子ＳＰＥ１によってコードされる）を過剰発現することによって、プトレシンに向けたフラックスを増加させた。株構築のための実験的な手順は、以下の通りであった。ＳＰＥ１遺伝子をＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡ（プライマーペア９／１０による）からＰＣＲ増幅し、プロモーターＴＥＦ１ｐ（プライマーペア７／８による）およびターミネーターＰＲＭ９ｔ（プライマーペア１１／１２による）へ融合した。もたらされた断片ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔをＫａｎＭＸカセット（それはプラスミドＰＵＣ６からＰＣＲ増幅した）の３’部位へ融合し、断片ＫａｎＭＸ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ（プライマーペア３／１２）を得た。ＯＡＺ１遺伝子座中にＳＰＥ１を組み込み同時にＯＡＺ１遺伝子を欠失させるために、ＯＡＺ１の５’ＯＲＦの３００ｂｐ（プライマーペア１／２による）およびＯＡＺ１の３’ＯＲＦの３００ｂｐ（プライマーペア１３／６による）を、ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、それぞれＤＮＡ断片ＯＡＺ１－ＵＰおよびＯＡＺ１－ＤＯＷＮを得た。次いで、融合ＰＣＲを使用してＯＡＺ１－ＵＰおよびＯＡＺ１－ＤＯＷＮを断片ＫａｎＭＸ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ（プライマーペア１／６による）へ融合し、断片ＯＡＺ１－ＵＰ－ＫａｎＭＸ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ－ＯＡＺ１－ＤＯＷＮを得た。オルニチンを過剰産生する株ＯＲＮ－Ｌ（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２－８ｃ ｕｒａ３－５２ ｈｉｓ３－Δ１ ＡＲＧ３ｐ：：ＫＥＸ２ｐ ｃａｒ２Δ：：ＬｏｘＰ－ＣＴＣ１ｔ－ＡＧＣ１－ｔＨＸＴ７ｐ－ＴＰＩｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ ｕｒａ３：：ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ）（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ［５］）のＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法（Ｇｉｅｔｚ ｅｔ ａｌ［８］）経由の形質転換のために、この断片を使用した。形質転換体をＧ４１８プレート上で選択し、コロニーＰＣＲによって検証し、プトレシンを過剰産生する株ＰＵＴ－Ｂ（ＫａｎＭＸ）（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２－８ｃ ｕｒａ３－５２ ｈｉｓ３－Δ１ ＡＲＧ３ｐ：：ＫＥＸ２ｐ ｃａｒ２Δ：：ＬｏｘＰ－ＣＴＣ１ｔ－ＡＧＣ１－ｔＨＸＴ７ｐ－ＴＰＩｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ ｕｒａ３：：ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ ｏａｚ１Δ：：ＬｏｘＰ－ＫａｎＭＸ－ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ）を得た。この実装において使用したすべてのプライマーを、表４中にリストする。

【0174】

いわゆるカルボキシスペルミジンスペルミジン経路によるスペルミジンの過剰産生を可能にするために、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊＣＡＳＤＨおよびＣｊＣＡＳＤＣ）またはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（ＶｃＣＡＳＤＨおよびＶｃＣＡＳＤＣ）のいずれかからのＣＡＳＤＨおよびＣＡＳＤＣを、評価した。使用されるすべての遺伝子を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）によってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現のためにコドン至適化した。

【0175】

ＤＮＡアセンブラー方法（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ［６］）を、プラスミドＹＰ１（ＣｊＣＡＳＤＨおよびＣｊＣＡＳＤＣを発現する）およびＹＰ２（ＶｃＣＡＳＤＨおよびＶｃＣＡＳＤＣを発現する）の構築のために使用した。プラスミドＹＰ１の構築のために、ＣｊＣＡＳＤＨ（ヌクレオチド配列番号：１０；対応するタンパク質配列番号：１４９）およびＣｊＣＡＳＤＣ（ヌクレオチド配列番号：１１；対応するタンパク質配列番号：１５０）を、それぞれｐＵＣ５７－ＣｊＣＡＳＤＨおよびｐＵＣ５７－ＣｊＣＡＳＤＨから増幅した（それぞれプライマーペア１３２／１３３および１３７／１３６による）。プロモーターＴＰＩ１ｐ（プライマーペア１３０／１３１による）、ＰＧＫ１ｐ（プライマーペア１８／１９による）、ＴＥＦ１ｐ（プライマーペア２０／８による）を、ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡから増幅した。ターミネーターＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔ（プライマーペア１３４／１３５による）を、プラスミドＧＯ４（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ［５］）から増幅した。ターミネーターｐＹＸ２１２ｔを、プラスミドｐＹＸ２１２（プライマーペア９／２９４による）から増幅した。ＴＰＩ１ｐ、ＣｊＣＡＳＤＨ、ＦＢＡ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ（それは互いにオーバーハングを有する）を、融合ＰＣＲによって融合し、断片ＴＰＩ１ｐ－ＣｊＣＡＳＤＨ－ＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔを得た。同じ融合ＰＣＲ手順に従って、ＦＢＡ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、ＣｊＣＡＳＤＣ、ＰＧＫ１ｐ、ＴＥＦ１ｐおよびｐＹＸ２１２ｔを融合して、断片ＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔ－ＣｊＣＡＳＤＣ－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ｐＹＸ２１２ｔ）を構築した。ＵＲＡ３選択マーカーを含有する酵母２μベクターｐＹＸ２１２を使用し、制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩによる消化によって直線化した。ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法に従って、直線化ベクターを、断片ＴＰＩ１ｐ－ＣｊＣＡＳＤＨ－ＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔおよびＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔ－ＣｊＣＡＳＤＣ－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ｐＹＸ２１２ｔと共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１の中へ形質転換し、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択した。細胞密度（６００ｎｍでのＯＤ）をＧＥＮＥＳＹＳ ２０分光測光器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩ ｋｉｔによって形質転換体から抽出したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの中へ形質転換し、一晩の培養後に精製し、プラスミドＹＰ１を得た。

【0176】

プラスミドＹＰ２の構築のために、ＶｃＣＡＳＤＨ（ヌクレオチド配列番号：１２；対応するタンパク質配列番号：１５１）およびＶｃＣＡＳＤＣ（ヌクレオチド配列番号：１３；対応するタンパク質配列番号：１５２）を、それぞれｐＵＣ５７－ＶｃＣＡＳＤＨおよびｐＵＣ５７－ＶｃＣＡＳＤＨから増幅した（それぞれプライマーペア１４０／１４１および１４３／１４２による）。プロモーターＴＰＩ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＴＥＦ１ｐ、ターミネーターＦＢＡ１ｔ、ＣＹＣ１ｔを、上記のように表４中でリストしたプライマーにより、ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡから増幅した。ターミネーターｐＹＸ２１２ｔを、上記のように表４中でリストしたプライマーにより、プラスミドｐＹＸ２１２から増幅した。ＴＰＩ１ｐ、ＶｃＣＡＳＤＨ、ＦＢＡ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ（それは互いにオーバーハングを有する）を、融合ＰＣＲによって融合し、断片ＴＰＩ１ｐ－ＶｃＣＡＳＤＨ－ＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔを得た。プラスミドＹＰ１に関して同じ融合ＰＣＲ手順に従って、ＣＹＣ１ｔ、ＶｃＣＡＳＤＣ、ＰＧＫ１ｐ、ＴＥＦ１ｐおよびｐＹＸ２１２ｔを融合して、断片ＣＹＣ１ｔ－ＶｃＣＡＳＤＣ－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ｐＹＸ２１２ｔを構築した。ＵＲＡ３選択マーカーを含有する酵母２μベクターｐＹＸ２１２を使用し、制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩによる消化によって直線化した。ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法に従って、直線化ベクターを、断片ＴＰＩ１ｐ－ＶｃＣＡＳＤＨ－ＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔおよびＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔ－ＶｃＣＡＳＤＣ－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ｐＹＸ２１２ｔと共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１の中へ形質転換し、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択した。細胞密度（６００ｎｍでのＯＤ）をＧＥＮＥＳＹＳ ２０分光測光器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩ ｋｉｔによって形質転換体から抽出したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの中へ形質転換し、一晩の培養後に精製し、プラスミドＹＰ２を得た。すべてのプラスミドを制限消化およびシーケンシングによって検証した。

【0177】

次いで株ＰＵＴ－Ｂ（ＫａｎＭＸ）（上で記載される）を、対照として作動させるために２つの空プラスミド（ｐＹＸ２１２＋ｐ４２３ＧＰＤ）（株ＳＰＤＣ３をもたらす）、ＣｊＣＡＳＤＨ／ＣｊＣＡＳＤＣを評価するためにＹＰ１およびｐ４２３ＧＰＤ（株ＳＰＤ１１をもたらす）、またはＶｃＣＡＳＤＨ／ＶｃＣＡＳＤＣを評価するためにＹＰ２およびｐ４２３ＧＰＤ（株ＳＰＤ１２をもたらす）のいずれかにより、形質転換した。すべての株をＰＣＲによって検証した。

【0178】

株の性能を、振盪フラスコ培養を経由して三重で比較した。振盪フラスコ培養のために、Ｄｅｌｆｔ培地（Ｈ）を使用し、それは以下のものからなっていた（１リットルあたり）。（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、７．５ｇ；ＫＨ_２ＳＯ_４、１４．４ｇ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５０ｇ；微量金属、１ｍｌ、およびビタミン、１ｍｌ。微量金属溶液は以下のものからなっていた（１リットルあたり）。Ｎａ_２ＥＤＴＡ・５Ｈ_２Ｏ、１９．０ｇ；ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．４５ｇ；ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、１ｇ；ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．４５ｇ；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；Ｈ_３ＢＯ_３、１ｇ、およびＫＩ、０．１０ｇ。微量金属溶液のｐＨを、乾熱減菌の前に２ＭのＮａＯＨにより４．０へ調整した。ビタミン溶液は以下のものを含有していた（１リットルあたり）。ｄ－ビオチン、０．０５ｇ；ｐ－アミノ安息香酸、０．２ｇ；ニコチン酸、１ｇ；パントテン酸カルシウム、１ｇ；ピリドキシン－ＨＣｌ、１ｇ；チアミン－ＨＣｌ、１ｇ、およびミオイノシトール、２５ｇ。ビタミン溶液のｐＨを、２ＭのＮａＯＨにより６．５へ調整した。ビタミン溶液をフィルター滅菌し、４℃で保存した。この培地に、２０ｇ／リットルでグルコースを補足した。単一コロニーを２ｍｌの液体培地の中へ最初に接種し、２４～３６時間培養した。次いで細胞を、最初のＯＤ ０．０５で、２０ｍｌの培地により１００ｍｌ振盪フラスコ中で２００ｒｐｍ、３０℃で５日間（１２０時間）増殖させた。

【0179】

０．１ｍｌの液体培養を採取することによって、発酵サンプルを調製した。発酵サンプルに熱水（ＨＷ）抽出（Ｃａｎｅｌａｓ ｅｔ ａｌ［９］）を行った。０．９ｍｌのＤｅｌｆｔ培地を含有するチューブを、１００℃で１０分間水浴中で予め暖めた。次いで、熱いＤｅｌｆｔ培地を、０．１ｍｌの発酵サンプルの上に迅速に注ぎ、混合物を直ちにボルテックスで撹拌し、サンプルを水浴中に置いた。３０分後に、各々のチューブを５分間氷上に置いた。遠心分離後に、上清を誘導体化のために直接使用した。誘導体化のために、手順はＫｉｍ ｅｔ ａｌ ［２］から適合させた。簡潔には、０．２５ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ_３溶液および０．５ｍｌの塩化ダンシル溶液（アセトン中で５ｍｇ／ｍｌ）を、０．５ｍｌのサンプルへ添加した。次いで反応混合物を、時折振盪して４０℃で１時間暗所でインキュベーションした。反応を、０．１ｍｌの２５％の水酸化アンモニウム、続いて０．３ｍｌのＭｅＯＨの添加によって停止した。２５ｍｍのシリンジフィルター（０．４５μｍナイロン）を介して濾過したサンプルを、Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）２．６μｍ Ｃ１８ １００Åカラム（１００×４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、米国）を装備したＨＰＬＣ検出のために使用した。以下のクロマトグラフィー条件を使用した。励起波長３４０ｎｍ、放射波長５１５ｎｍ、注入したサンプルは１０μｌ、カラム温度４０℃、検出器感度７、捕捉は３．４分で開始した。移動相は、１ｍｌ／分の速度で水およびメタノールであった。溶出プログラムは以下の通りであった。０～５分、５０％～６５％のＭｅＯＨ；５～７．５分、６５％～７５％のＭｅＯＨ；７．５～９．５分、７５％～８７．５％のＭｅＯＨ；９．５～１０．５分、８７．５％～１００％のＭｅＯＨ；１０．５～１１．５分、１００％のＭｅＯＨ；１１．５～１３．５分、１００％～５０％のＭｅＯＨ；１３．５～１６、５０のＭｅＯＨ。

【0180】

結果を表６中で示す。結果は、ＣｊＣＡＳＤＨおよびＣｊＣＡＳＤＣまたはＶｃＣＡＳＤＨおよびＶｃＣＡＳＤＣのいずれかの過剰発現がスペルミジン産生に正の効果を有し（図３）、４２ｍｇ／Ｌのスペルミジンを産生する最も良好な産生する株（ＳＰＤ１２）が有ることを示した。

【0181】

例２
Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドに向けた代謝フラックスの増加による、微生物細胞中でのスペルミジン産生の増加。
本実施例は、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドに向けた代謝フラックスの増加によって微生物細胞におけるスペルミジン産生をさらに増加できることを実証する。これは、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（それはＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドをホモセリンに変換するステップを触媒する）によって触媒される競合反応へのフラックスの低減と組み合わせて、オキサロ酢酸をＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへ変換するための３ステップ経路を過剰発現することによって達成される。

【0182】

オキサロ酢酸からＬ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドへのフラックスを増加させるために、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ［ＥＣ ２．６．１．１］をコードする遺伝子ａｓｐＢ（ＣｇａｓｐＢ）（配列番号：１４）、突然変異Ｔ３１１Ｉを備えたアスパラギン酸キナーゼ［ＥＣ ２．７．２．４］をコードする遺伝子ｌｙｓＣ（Ｃｇｌｙｃｍ）（配列番号：１５）、およびアスパラギン酸－４－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ［ＥＣ １．２．１．１１］をコードする遺伝子ａｓｄ（Ｃｇａｓｄ）（配列番号：１６）を、酵母細胞中での過剰発現のために選択した。すべての遺伝子を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）によってコドン至適化して合成した。Ｇｉｂｓｏｎのアセンブリー方法（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ［７］）を、Ｃｇｌｙｃｍ、ＣｇａｓｄおよびＣｇａｓｐＢを過剰発現するプラスミドＧＰ１の構築のために使用した。プラスミドＧＰ１を構築するために、遺伝子Ｃｇｌｙｃｍ、ＣｇａｓｄおよびＣｇａｓｐＢを、それぞれＰＵＣ５７－Ｃｇｌｙｃｍ、ＰＵＣ５７－ＣｇａｓｄおよびＰＵＣ５７－ＣｇａｓｐＢから（それぞれプライマーペア１８０／１８１、１８５／１８４および１８６／１８７を使用して）増幅した。プロモーターＴＤＨ３ｐ、ＰＧＫ１ｐおよびＴＥＦ１ｐを、それぞれプライマーペア２５／２６、１８／１９および２０／８により酵母ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡから増幅した。ターミネーターＴＤＨ２ｔ－ＡＤＨ１ｔおよびＦＢＡ１ｔ－ＴＰＩ１１ｔを、それぞれプライマーペア１８２／１８３および１３４／１９４によりプラスミドＧＯ４／ＹＯ４（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ［５］）から増幅した。ＴＤＨ３ｐ、Ｃｇｌｙｃｍ、ＴＤＨ２ｔおよびＡＤＨ１１ｔ（それは互いにオーバーハングを有する）を、融合ＰＣＲによって融合し、断片ＴＤＨ３ｐ－Ｃｇｌｙｃｍ－ＴＤＨ２ｔ－ＡＤＨ１１ｔを得た。同じ融合ＰＣＲ手順に従って、Ｃｇａｓｄ、ＰＧＫ１ｐ、ＴＥＦ１ｐ、ＣｇａｓｐＢ、ＦＢＡ１ｔおよびＴＰＩ１ｔをして、断片Ｃｇａｓｄ－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ＣｇａｓｐＢ－ＦＢＡ１ｔ－ＴＰＩ１ｔを構築した。ＨＩＳ３選択マーカーを含有する酵母２μベクターｐ４２３ＧＰＤを、骨格プラスミドとして使用した。これらの断片を一緒にアセンブルして、製造者の指示に従ってＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）によってプラスミドＧＰ１を形成した。Ｅ．ｃｏｌｉから抽出したプラスミドを制限消化およびシーケンシングによって検証した。この実装において使用したすべてのプライマーを、表４中にリストする。

【0183】

Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドをホモセリンへ変換する競合反応に向けたフラックスを減少させるために、この反応をコードする生来の遺伝子（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨＯＭ６）の前へより弱いプロモーターを挿入することによって、この反応を触媒するホモセリンデヒドロゲナーゼ酵素の活性を減少させるように設定した。選択された弱いプロモーターは、ＫＥＸ２プロモーター（ＫＥＸ２ｐ）であった。シームレスの遺伝子挿入を、選択マーカー（それはダイレクトリピートの相同組換えによってループアウトされる）としてＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＵＲＡ３（ＫｌＵＲＡ３）、およびＳＣ＋５－ＦＯＡプレート上での選択を使用することによって遂行した。プロモーター挿入カセットを融合ＰＣＲによって構築した。ＫＥＸ２ｐ（それはＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡから増幅される（プライマーペア２０１／２０２による））を、融合ＰＣＲによりＫｌＵＲＡ３の３’へ融合し（プライマーペア１９９／２００による）、断片ＫｌＵＲＡ３－ＫＥＸ２ｐを得た。プロモーター領域（ＨＯＭ６ ＯＲＦの５’部分）をＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡから増幅した。これらの断片を融合ＰＣＲによって一緒に融合し、プロモーター挿入断片ＨＯＭ６ｐ－リピート－ＫｌＵＲＡ３－ＫＥＸ２ｐ－５’ＨＯＭ６（プライマーペア１９７／２０４による）を得た。次いでこの断片を使用して、プトレシン産生株ＰＵＴ－Ｂ（ＫａｎＭＸ）（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２－８ｃ ｕｒａ３－５２ ｈｉｓ３－Δ１ ＡＲＧ３ｐ：：ＫＥＸ２ｐ ｃａｒ２Δ：：ＬｏｘＰ－ＣＴＣ１ｔ－ＡＧＣ１－ｔＨＸＴ７ｐ－ＴＰＩｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ ｕｒａ３：：ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ ｏａｚ１Δ：：ＬｏｘＰ－ＫａｎＭＸ－ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ）へ形質転換した。クローンをコロニーＰＣＲによって検証した。後続して、正確なモジュール組み込みを備えた３～５のクローンをＹＰＤ液体培地中で一晩培養し、次いでＳＣ－５－ＦＯＡプレート上にプレーティングしてＫｌＵＲＡ３をループアウトさせた。もう一度、正確なクローンをコロニーＰＣＲにより検証し、株ＰＵＴ－Ｂ（ＫａｎＭＸ）－ＨＯＭ６（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２－８ｃ ｕｒａ３－５２ ｈｉｓ３－Δ１ ＡＲＧ３ｐ：：ＫＥＸ２ｐ ｃａｒ２Δ：：ＬｏｘＰ－ＣＴＣ１ｔ－ＡＧＣ１－ｔＨＸＴ７ｐ－ＴＰＩｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ ｕｒａ３：：ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ ｏａｚ１Δ：：ＬｏｘＰ－ＫａｎＭＸ－ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ ＨＯＭ６ｐ：：ＫＥＸ２ｐ）を得た。プラスミドＹＰ２と一緒にプラスミドＧＰ１を、株ＰＵＴ－Ｂ（ＫａｎＭＸ）－ＨＯＭ６の中へ共形質転換し、スペルミジン産生株ＳＰＤ０６を得た。この実装において使用したすべてのプライマーを、表４中にリストする。上の例１中に記載されるように、株を培養および分析した。株ＳＰＤ０６は、Ｌ－アスパラギン酸－４－セミアルデヒドに向けたフラックスを増加する操作無しの類似の株よりも、有意に多くのスペルミジンを産生できたことが見出された（図４）。

【0184】

例３
メチオニンサルベージ経路における代謝フラックスの増加による、微生物細胞中でのスペルミジン産生の増加。
本実施例は、メチオニンサルベージ経路におけるフラックスの増加によってスペルミジン過剰産生株におけるスペルミジン産生を有意に改善できること実証する。特に、これは、この経路における律速酵素（メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（ＭＴＡＰ）および分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼ（ＢＡＴ））の活性の増加によって行われた。メチオニンサルベージ経路におけるフラックスの増加はより高いレベルのＳＡＭを可能にし、脱カルボキシル化Ｓ－アデノシルメチオニン（ｄＳＡＭ）（それはスペルミジン合成のためのアミノプロピルドナーとして作用する）の増加量をもたらす。スペルミジン蓄積のために以前に操作した酵母株中でのスペルミジン産生に対する、メチオニンサルベージ経路の促進の効果を試験した。

【0185】

ＭＴＡＰ［ＥＣ ２．４．２．２８］の活性を増加させるために、内在性ＭＥＵ１遺伝子（ヌクレオチド配列番号：１７；対応するタンパク質配列番号：１４７）を、プラスミドＹＰ６経由の酵母中での過剰発現のために選択した。プラスミドをＤＮＡアセンブラー方法によって構築した。最初に、ＭＥＵ１およびプロモーターＴＰＩｐを、それぞれプライマーペア１５７／１６２および１５６／２９を使用して、ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡから増幅した。ターミネーターｐＹＸ２１２ｔを、プラスミドｐＹＸ２１２（プライマーペア１５／１５９による）から増幅した。ＴＰＩ１ｐ、ＭＥＵ１およびｐＹＸ２１２ｔ（それは互いにオーバーハングを有する）を、融合ＰＣＲによって融合し、断片ＴＰＩ１ｐ－ＭＥＵ１－ｐＹＸ２１２ｔを得た（プライマーペア１５６／１５９による）。ＵＲＡ３選択マーカーを含有する酵母２μベクターｐＹＸ２１２を使用し、制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩによる消化によって直線化した。ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法に従って、直線化ベクターを、断片ＴＰＩ１ｐ－ＭＥＵ１－ｐＹＸ２１２ｔと共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１の中へ形質転換し、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択した。細胞密度（６００ｎｍでのＯＤ）をＧＥＮＥＳＹＳ ２０分光測光器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩ ｋｉｔによって形質転換体から抽出したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの中へ形質転換し、精製し、プラスミドＹＰ６を得た。

【0186】

ＢＡＴ［ＥＣ ２．６．１．４２］の活性を増加させるために、内在性ＢＡＴ２遺伝子（ヌクレオチド配列番号：１８；対応するタンパク質配列番号：１４８）を、プラスミドＹＰ７経由の酵母中での過剰発現のために選択した。ＤＮＡアセンブラー方法をプラスミドＹＰ７の構築のために使用した。ＢＡＴ２およびプロモーターＴＰＩ１ｐを、それぞれプライマーペア１６０／１６１および１５６／２９により、ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡから増幅した。ターミネーターｐＹＸ２１２ｔを、プラスミドｐＹＸ２１２（プライマーペア１５／１５９による）から増幅した。ＴＰＩ１ｐ、ＢＡＴ２およびｐＹＸ２１２ｔ（それは互いにオーバーハングを有する）を、融合ＰＣＲによって融合し、断片ＴＰＩ１ｐ－ＢＡＴ２－ｐＹＸ２１２ｔを得た。ＵＲＡ３選択マーカーを含有する酵母２μベクターｐＹＸ２１２を使用し、制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩによる消化によって直線化した。ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法に従って、直線化ベクターを、断片ＴＰＩ１ｐ－ＢＡＴ２－ｐＹＸ２１２ｔと共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１の中へ形質転換し、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択した。細胞密度（６００ｎｍでのＯＤ）をＧＥＮＥＳＹＳ ２０分光測光器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩ ｋｉｔによって形質転換体から抽出したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの中へ形質転換し、精製し、プラスミドＹＰ７を得た。すべてのプラスミドを消化およびシーケンシングによって検証した。

【0187】

プラスミドＹＰ６またはＹＰ７を、株ＳＰＤ－Ｂ（ＫａｎＭＸ）（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２－８ｃ ｕｒａ３－５２ ｈｉｓ３－Δ１ ＡＲＧ３ｐ：：ＫＥＸ２ｐ ｃａｒ２Δ：：ＬｏｘＰ－ＣＴＣ１ｔ－ＡＧＣ１－ｔＨＸＴ７ｐ－ＴＰＩｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ ｕｒａ３：：ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ ｏａｚ１Δ：：ＬｏｘＰ－ＫａｎＭＸ－ＬｏｘＰ－ｐＹＸ２１２ｔ－ＳＰＥ３－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ－ＤＩＴ１ｔ－ＳＰＥ２－ＴＤＨ３ｐ）（それはプトレシン産生の増加に加えて、スペルミジン合成酵素およびＳ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼの過剰発現経由のプトレシンのスペルミジンへの変換の増加のために以前に操作した）において評価した。この株は例１中で記載されるものと同じ手順を使用して構築した。株ＳＰＤ－Ｂ（ＫａｎＭＸ）を、ｐＹＸ２１２およびＧＯ４（それぞれ空のプラスミドおよびオルニチン産生のための生合成ステップをコードするプラスミド）、ＹＰ６およびＧＯ４、またはＹＰ７およびＧＯ４のいずれかにより形質転換した。これは、それぞれ株ＳＰＤＣ４、ＳＰＤ０７およびＳＰＤ０８をもたらした。すべての株を、上の例１中で記載されるように、シーケンシングによって検証し、培養および分析によって評価した。結果は、ＳＰＤＣ４は既に高レベルのスペルミジンを産生できたが、ＭＥＵ１またはＢＡＴ２のいずれかの過剰発現経由でメチオニンサルベージ経路を介するフラックスを増加することによって、スペルミジン産生を２倍にできたことを示した（図５）。

【0188】

例４
異種スペルミジン合成酵素の過剰発現およびフェドバッチ発酵による、スペルミジン産生のさらなる増加。
本実施例は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（ＴａＳＰＤＳ）からの異種スペルミジン合成酵素［ＥＣ ２．５．１．１６］（それはスペルミジン産生をさらに増加するのに生来の酵母ＳＰＤＳよりも効率的である）の過剰発現と、これまで記載された修飾をさらに組み合わせることができることを実証する。さらに、最も良好な産生株にフェドバッチ発酵を行うことは、スペルミジン産生力価の非常に高い増加を可能にした。

【0189】

したがって、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）からのスペルミジン合成酵素コード遺伝子ＴａＳＰＤＳを選んで、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）によってコドン至適化して合成した。ＳＰＥ１（配列番号：２０）およびＳＰＥ２（配列番号：２１）に付随して、ＴａＳＰＤＳ（配列番号：１９）で、ＯＡＺ１遺伝子座中の染色体組み込みに基づいた共過剰発現を行った。プロモーター、ターミネーター、ＴａＳＰＤＳ（プライマーペア２８３／２８２による）、ＳＰＥ１、ＳＰＥ２、ＫａｎＭＸカセット、約３００ｂｐの５’ＯＡＺ ＯＲＦ、および約３００ｂｐの３’ＯＡＺ１ ＯＲＦを含有する断片を、例１中で記載されるような方法に従って、一緒に融合した。すべての関連する断片を、Ｌ－オルニチンプラットフォーム株ＯＲＮ－Ｌ（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２－８ｃ ｕｒａ３－５２ ｈｉｓ３－Δ１ ＡＲＧ３ｐ：：ＫＥＸ２ｐ ｃａｒ２Δ：：ＬｏｘＰ－ＣＴＣ１ｔ－ＡＧＣ１－ｔＨＸＴ７ｐ－ＴＰＩｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ ｕｒａ３：：ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ）（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ［５］）へ共形質転換した。形質転換体をＧ４１８プレート上で選択した。クローンをコロニーＰＣＲによって検証し、株ＳＰＤ－Ｄ（ＫａｎＭＸ）（ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２－８ｃ ｕｒａ３－５２ ｈｉｓ３－Δ１ ＡＲＧ３ｐ：：ＫＥＸ２ｐ ｃａｒ２Δ：：ＬｏｘＰ－ＣＴＣ１ｔ－ＡＧＣ１－ｔＨＸＴ７ｐ－ＴＰＩｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ ｕｒａ３：：ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ ｏａｚ１Δ：：ＬｏｘＰ－ＫａｎＭＸ－ＬｏｘＰ－ｐＹＸ２１２ｔ－ＴａＳＰＤＳ－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ－ＤＩＴ１ｔ－ＳＰＥ２－ＴＤＨ３ｐ）を得た。

【0190】

次に、上記の遺伝子ＭＥＵ１およびＢＡＴ２を単一のプラスミド（ＹＰ８）へと組み合わせて、ＤＮＡアセンブラー方法を経由して構築した。ＭＥＵ１、ＢＡＴ２、プロモーターＴＰＩ１ｐ、ＴＥＦ１ｐおよびＰＧＫ１ｐ、ターミネーターＦＢＡ１ｔおよびＣＹＣ１ｔを、上の例３中で記載されるように、表４中でリストしたプライマーにより、ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１ＣゲノムＤＮＡから増幅した。ターミネーターｐＹＸ２１２ｔを、上の例３中で記載されるように、表４中でリストしたプライマーにより、プラスミドｐＹＸ２１２から増幅した。ＴＰＩ１ｐ、ＭＥＵ１、ＦＢＡ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、ＢＡＴ２、ＰＧＫ１ｐ、ＴＥＦ１ｐおよびｐＹＸ２１２ｔ（それは互いにオーバーハングを有する）を、融合ＰＣＲによって融合し、断片ＴＰＩ１ｐ－ＭＥＵ１－ＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔ－ＢＡＴ２－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ｐＹＸ２１２ｔを得た。ＵＲＡ３選択マーカーを含有する酵母２μベクターｐＹＸ２１２を使用し、制限酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩによる消化によって直線化した。ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法に従って、直線化ベクターを、断片ＴＰＩ１ｐ－ＭＥＵ１－ＦＢＡ１ｔ－ＣＹＣ１ｔ－ＢＡＴ２－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ｐＹＸ２１２ｔと共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１の中へ形質転換し、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ Ｙｅａｓｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＩＩ ｋｉｔによって形質転換体から抽出したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの中へ形質転換し、精製し、プラスミドＹＰ８を得た。プラスミドを制限消化およびシーケンシングによって検証した。

【0191】

プラスミドＹＰ８を株ＳＰＤ－Ｄ（ＫａｎＭＸ）の中へ形質転換し、株ＳＰＤ１０を得て、それは上記のように培養した場合に１４９ｍｇ／Ｌのスペルミジンを産生することができた。

【0192】

発酵効率を改善し、ＴＹＲ（力価、収率および速度）を増加するために、グルコース制限フェドバッチ発酵を開発した。好気性フェドバッチプロセスを、０．８リットルの作業体積による１ＬのＤａｓＧｉｐベンチ発酵槽中で遂行した。一体化撹拌機（ＤａｓＧｉｐ、Ｊｕｌｉｃｈ、ドイツ）を使用して、８００ｒｐｍでの撹拌を保ち、温度を３０℃で維持した。通気率を１ｖｖｍに設定した。培地のｐＨを、バッチ相の間に２ＮのＫＯＨおよび供給相中で３ＮのＫＯＨの自動添加によって４．０で保った。温度、撹拌、ガス抜き、ｐＨおよびオフガス組成を、ＤａｓＧｉｐモニタリングおよび制御システムを使用して、モニターおよび制御した。溶存酸素濃度をオートクレーブ可能なポーラログラフ酸素電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ、米国）によりモニターし、ＤａｓＧｉｐ制御系を使用するスターラー速度およびガス流速によって３０％より上に保った。発酵からの流出ガスを、二酸化ジルコニウムおよび２ビーム赤外線センサーに基づいたオフガス分析器ＧＡ４を備えたＤａｓＧｉｐ ｆｅｄｂａｔｃｈ ｐｒｏ（登録商標）ガス分析系によって、酸素およびＣＯ_２濃度のリアルタイム決定について分析した。

【0193】

フェドバッチ培養を、１０ｇ／リットルのグルコースを使用してバッチ培養として開始した。グルコース消費相から産生された残存エタノールが完全に枯渇させられた後でのみ、新鮮培地の供給を開始した。供給ストラテジーを、体積についての増殖速度定数を保ってデザインした。指数関数的供給率ν（ｔ）（リットル／時）を、［１０］に従って計算した。

【化1】

式中、ｘ_０、ｓ_０およびＶ_０は、フェドバッチプロセスの開始時の、バイオマス密度（ｇ ＤＣＷ／リットル）、基質濃度（ｇ／リットル）および反応器体積（リットル）であり、Ｙ_ｘｓは、呼吸収率係数（ｇグルコース／ｇ ＤＣＷ）であり；ｓ_ｆは、リザーバー中の増殖制限基質の濃度（ｇグルコース／リットル）であり；μ_０は供給相の間の特定の増殖率（ｈ－１）であり、ｔは供給時間であった。上の等式に従って、供給は、０．０６ ｈ－１の特異的な供給率により指数関数的に増加した。正確な供給率添加を、ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｆｂ－ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤａｓＧｉｐ）のプログラミングにより得て、ＤａｓＧｉｐ制御系を使用して制御した。

【0194】

バッチ培養のために、Ｄｅｌｆｔ培地を使用し、それは以下のものからなっていた（１リットルあたり）。（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５ｇ；ＫＨ_２ＳＯ_４、３ｇ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５０ｇ；０．０５ｍｌ；微量金属、１ｍｌ、およびビタミン、１ｍｌ。微量金属溶液は以下のものからなっていた（１リットルあたり）。Ｎａ_２ＥＤＴＡ・５Ｈ_２Ｏ、１９．０ｇ；ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．４５ｇ；ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、１ｇ；ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．４５ｇ；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；Ｈ_３ＢＯ_３、１ｇ、およびＫＩ、０．１０ｇ。微量金属溶液のｐＨを、乾熱減菌の前に２ＭのＮａＯＨにより４．０へ調整した。ビタミン溶液は以下のものを含有していた（１リットルあたり）。ｄ－ビオチン、０．０５ｇ；ｐ－アミノ安息香酸、０．２ｇ；ニコチン酸、１ｇ；パントテン酸カルシウム、１ｇ；ピリドキシン－ＨＣｌ、１ｇ；チアミン－ＨＣｌ、１ｇ、およびミオイノシトール、２５ｇ。ビタミン溶液のｐＨを、２ＭのＮａＯＨにより６．５へ調整した。ビタミン溶液をフィルター滅菌し、４℃で保存した。この培地に、１０ｇ／リットルでグルコースを補足した。フェドバッチ培養のために使用した供給組成物は、上で記載されるものと同じ組成物を有していたが、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；ＫＨ_２ＳＯ_４；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ビタミン溶液および微量金属溶液の濃度を、３～５倍増加し、グルコース濃度を２００～６００ｇ／リットルに設定した。グルコース制限フェドバッチ発酵は、スペルミジン産生の高い増加を可能にし、スペルミジン力価は１．４ｇ／Ｌほどに増加した（図６）。

【0195】

例５
スペルミジン産生はＳ－アデノシルメチオニン合成酵素（ＭＡＴ）の過剰発現によって増加される。
本実施例は、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の合成を増加させることによってスペルミジン産生を増加できることを実証する。ＳＡＭの合成の増加は、Ｓ－アデノシルメチオニン合成酵素（ＭＡＴ）［ＥＣ ２．５．１．６］（それはＡＴＰのアデノシル基をメチオニンの硫黄原子へ転移してＳＡＭを形成することを触媒する）の過剰発現を介して得られる。スペルミジン産生に対するＭＡＴ過剰発現の効果を研究するために、２つの異種ＭＡＴを酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現させた。第１のＭＡＴは、リジン１８、ロイシン３１、イソロイシン６５および／またはアスパラギン酸３４１が、それぞれアルギニン、プロリン、バリンおよびグリシンへと変異される（Ｋ１８Ｒ、Ｌ３１Ｐ、Ｉ６５Ｖ、Ｄ３４１Ｇ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｉｓからのＭＡＴ（ＳｓＭＡＴ）（タンパク質配列番号：１）であった。第２のＭＡＴは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ ＪＰＣＭ５（ＳｉＭＡＴ、タンパク質配列番号：２５）からであった。

【0196】

各々の遺伝子を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現のためにコドン至適化して合成した。コドン至適化遺伝子のヌクレオチド配列（制限部位ＸｂａＩ／ＸｈｏＩが隣接し、ｋｏｚａｋ配列を含む）は、ＳｓＭＡＴについて配列番号：１３８およびＳｉＭＡＴについて配列番号：１３９である。次いで両方の遺伝子を、プライマーＨＸ－ｆｗｄ／ＨＸ－ｒｅｖを使用してＰＣＲによって増幅した。精製ＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩを使用して消化し、各々をＴＥＦ１プロモーターの制御下のプラスミドｐ４１６ＴＥＦ［１１］の中へクローン化し、プラスミドｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０１（ＳｓＭＡＴを発現する）およびｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０２（ＳｉＭＡＴを発現する）を得た。両方を消化／アガロースゲル電気泳動およびシーケンシングによって確認した。

【0197】

コンストラクトの試験のために使用されたバックグラウンド株は、オルニチンおよびスペルミジン代謝における修飾を含有してスペルミジン産生に向けたフラックスを促進するが、ＳＡＭ代謝における修飾はない、ＳＰＤＧ（ＫａｎＭＸ）であった。この株は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＰＯ４によってコードされたポリアミン輸送体を株ＳＰＤＧ（ＫａｎＭＸ）中で過剰発現させることによって得られた。この遺伝子をＴＰＩ１プロモーターおよびＥＮＤ２ターミネーターの制御下で発現させた。この株は例１中で記載されるものと同じ手順を使用して構築した。もたらされた株の遺伝子型は、ＭＡＴａ ＳＵＣ２ ＭＡＬ２－８ｃ ｕｒａ３－５２ ｈｉｓ３－Δ１ ＡＲＧ３ｐ：：ＫＥＸ２ｐ ｃａｒ２Δ：：ＬｏｘＰ－ＣＴＣ１ｔ－ＡＧＣ１－ｔＨＸＴ７ｐ－ＴＰＩｐ－ＯＲＴ１－ｐＹＸ２１２ｔ ｕｒａ３：：ＬｏｘＰ－ＴＥＦ１ｐ－ＧＤＨ１－ＤＩＴ１ｔ ｏａｚ１Δ：：ＬｏｘＰ－ＫａｎＭＸ－ＬｏｘＰ－ｐＹＸ２１２ｔ－ＴａＳＰＤＳ－ＰＧＫ１ｐ－ＴＥＦ１ｐ－ＳＰＥ１－ＰＲＭ９ｔ－ＤＩＴ１ｔ－ＳＰＥ２－ＴＤＨ３ｐ－ＴＰＩｐ－ＴＰＯ４－ＥＮＤ２ｔである。

【0198】

スペルミジン産生に対するＭＡＴ過剰発現の効果を試験するために、ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法に従って、株ＳＰＤＧ（ＫａｎＭＸ）を、プラスミドｐ４１６ＴＥＦ（対照として使用される空のプラスミド）、プラスミドｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０１、またはプラスミドｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０２のいずれかにより形質転換し、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択した。これは、株ＳＰＤ１３、ＳＰＤ１４およびＳＰＤ１５（それぞれ）をもたらした。

【0199】

株の性能を、振盪フラスコ培養を経由して三重で比較した。振盪フラスコ培養のために、Ｄｅｌｆｔ培地（Ｈ）を使用し、それは以下のものからなっていた（１リットルあたり）。（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、７．５ｇ；ＫＨ_２ＳＯ_４、１４．４ｇ；ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５０ｇ；ヒスチジン、１００ｍｇ；微量金属、１ｍｌ、およびビタミン、１ｍｌ。微量金属溶液は以下のものからなっていた（１リットルあたり）。Ｎａ_２ＥＤＴＡ・５Ｈ_２Ｏ、１９．０ｇ；ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．４５ｇ；ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、１ｇ；ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．４５ｇ；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．３ｇ；Ｈ_３ＢＯ_３、１ｇ、およびＫＩ、０．１０ｇ。微量金属溶液のｐＨを、乾熱減菌の前に２ＭのＮａＯＨにより４．０へ調整した。ビタミン溶液は以下のものを含有していた（１リットルあたり）。ｄ－ビオチン、０．０５ｇ；ｐ－アミノ安息香酸、０．２ｇ；ニコチン酸、１ｇ；パントテン酸カルシウム、１ｇ；ピリドキシン－ＨＣｌ、１ｇ；チアミン－ＨＣｌ、１ｇ、およびミオイノシトール、２５ｇ。ビタミン溶液のｐＨを、２ＭのＮａＯＨにより６．５へ調整した。ビタミン溶液をフィルター滅菌し、４℃で保存した。この培地に、２０ｇ／リットルでグルコースを補足し、ｐＨを６ＭのＫＯＨを使用して６へ調整した。単一コロニーを３ｍｌの液体培地の中へ最初に接種し、２４～３６時間培養した。次いで細胞を、最初のＯＤ ０．１で、２０ｍｌの培地により１００ｍｌ振盪フラスコ中で２００ｒｐｍ、３０℃で３日間（７２時間）増殖させた。

【0200】

株によるスペルミジン産生を例１中で記載されるように分析し、それぞれの培養のＯＤによって正規化した。結果は、いずれかのＭＡＴの発現がスペルミジン産生の増加をもたらすことを示した。空のプラスミド（ＳＰＤ１３）のみを保有する対照に比べて、ＳｓＭＡＴ（ＳＰＤ１４）の発現はスペルミジン産生を６４％増加したが、ＳｉＭＡＴ（ＳＰＤ１５）の発現は産生を９０％増加した（図８）。

【0201】

例６
スペルミジン産生はキメラメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）の過剰発現によって増加される。
本実施例は、スペルミジン産生の増加が、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）［ＥＣ １．５．１．２０］（それは、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸の５－メチルテトラヒドロ葉酸（メチオニン生合成においてホモシステインをメチル化するために使用される）への還元を触媒する）の活性の増加によって増加され得ることを実証する。この実施例において、酵母Ｍｅｔ１３ｐのＮ末端触媒ドメインおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＭＴＨＦＲ（ＡｔＭＴＨＦＲ－１の）Ｃ末端調節ドメイン（ＳｃＡｔＭＴＨＦＲ；タンパク質配列番号：３）から構成されるキメラＭＴＨＦＲを使用した。遺伝子を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現のためにコドン至適化して合成した。コドン至適化遺伝子のヌクレオチド配列（制限部位ＸｂａＩ／ＸｈｏＩが隣接し、ｋｏｚａｋ配列を含む）は、配列番号：１４０である。

【0202】

遺伝子を、プライマーＨＸ－ｆｗｄ／ＨＸ－ｒｅｖを使用してＰＣＲ増幅した。精製ＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＸｈｏＩを使用して消化し、ＴＥＦ１プロモーターの制御下のプラスミドｐ４１６ＴＥＦ［１１］の中へクローン化し、プラスミドｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０３１を得た。プラスミドｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０３を制限消化およびシーケンシングによって確認し、ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法を使用して株ＳＰＤＧ（ＫａｎＭＸ）の中へ形質転換し、続いて、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択し、株ＳＰＤ１６を得た。

【0203】

ＭＴＨＦＲ過剰発現の効果を試験するために、株ＳＰＤ１６および株ＳＰＤ１３（ＭＴＨＦＲを過剰発現しない対照株）を例５中で記載されるように培養し、例１中で記載されるように分析した。スペルミジン産生をそれぞれの培養のＯＤによって正規化した。結果は、ＳｃＡｔＭＴＨＦＲ（株ＳＰＤ１６）の過剰発現が、ＭＴＨＦＲを過剰発現しない株（株ＳＰＤ１３、それは空のプラスミドのみを保有する）に比較して、スペルミジン産生において５０％の増加をもたらすことを示し、ＭＴＨＦＲ活性の増加はスペルミジン産生に対する正の効果を有することを確認した（図９）。

【0204】

例７
スペルミジン産生は、多剤応答に関与するエクスポーターの調節の原因である転写因子の過剰発現によって増加される。
本実施例は、多剤応答に関与する転写因子（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＲ１およびＰＤＲ２）の過剰発現がスペルミジン産生の増加をもたらすことを実証する。

【0205】

ＰＤＲ１（ヌクレオチド配列番号：１４１；対応するタンパク質配列番号：３０）およびＰＤＲ２（ＹＲＲ１としても公知である；ヌクレオチド配列番号：１４２；対応するタンパク質配列番号：１２９）の各々を、それぞれプライマーＰＤＲ１－ｆｗｄ／ＰＤＲＲ１－ｒｅｖおよびＰＤＲ２－ｆｗｄ／ＰＤＲＲ２－ｒｅｖを使用するＰＣＲによって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムから増幅し、それぞれ制限酵素ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩを使用して、プラスミドｐ４１６ＴＥＦの中へクローン化した。これはプラスミドｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０４（ＰＤＲ１を発現する）およびｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０５（ＰＤＲ２発現する）をもたらした。両方のプラスミドを消化／アガロースゲル電気泳動およびシーケンシングによって確認した。次いで、ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法を使用して、プラスミドを株ＳＰＤＧ（ＫａｎＭＸ）の中へ個別に形質転換し、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択し、株ＳＰＤ１７（ｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０４を含有する）およびＳＰＤ１８（ｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０５を含有する）をもたらした。

【0206】

株ＳＰＤ１７およびＳＰＤ１８を、株ＳＰＤ１３（空のｐ４１６ＴＥＦを保有し任意のＰＤＲを過剰発現しない対照株）と一緒に、例５中で記載されるように培養し、例１中で記載されるように分析した。スペルミジン産生をそれぞれの培養のＯＤによって正規化した。結果は、いずれかのＰＤＲの過剰発現がスペルミジン産生に対して正の効果を有することを示した（図１０）。対照（株ＳＰＤ１３、ＰＤＲ１を過剰発現しない）に比較して、ＰＤＲ１（株ＳＰＤ１７）の過剰発現はスペルミジン産生において中等度の９％の増加をもたらしたが、ＰＤＲ２（株ＳＰＤ１８）の過剰発現はスペルミジン産生において９３％の増加をもたらした。

【0207】

例８
スペルミジン産生は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩメディエーター複合体のサブユニットの過剰発現によって増加される。
本実施例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩメディエーター複合体のサブユニット、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１１（配列番号：３１で示されるタンパク質配列）の過剰発現がスペルミジン産生に対して正の効果を有することを示す。

【0208】

遺伝子ＧＡＬ１１（ヌクレオチド配列番号：１４３）を、プライマーＧａｌ１１ｆｗｄ／Ｇａｌ１１－ｒｅｖを使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＣＥＮ．ＰＫ１１３－７Ｄのゲノムから増幅し、制限酵素ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩを使用してプラスミドｐ４１６ＴＥＦおよびｐ４１６ＣＹＣ［１１］の中へクローン化した。これは、プラスミドｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０６（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＥＦ１プロモーターの制御下でクローン化されたＧＡＬ１１を備えた）およびプラスミドｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０７（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＹＣ１プロモーターの制御下でクローン化されたＧＡＬ１１を備えた）をもたらした。両方のプラスミドを消化／アガロースゲル電気泳動およびシーケンシングによって確認した。

【0209】

次いで、ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法を使用して、プラスミドを株ＳＰＤＧ（ＫａｎＭＸ）の中へ個別に形質転換し、ウラシル無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ」）上で選択し、株ＳＰＤ１７（ｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０６を含有する）およびＳＰＤ２０（ｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０７を含有する）をもたらした。株ＳＰＤ１９およびＳＰＤ２０を、株ＳＰＤ１３（空のｐ４１６ＴＥＦを保有しＧＡＬ１１を過剰発現しない対照株）と一緒に、例５中で記載されるように培養し、例１中で記載されるように分析した。スペルミジン産生をそれぞれの培養のＯＤによって正規化した。

【0210】

結果は、ＧＡＬ１１の過剰発現がスペルミジン産生に対して正の効果を有することを示した（図１１）。対照（株ＳＰＤ１３、ＧＡＬ１１を過剰発現しない）に比較して、ＴＥＦ１プロモーターの制御下でのＧＡＬ１１の過剰発現（株ＳＰＤ１９）は、スペルミジン産生において３．４倍の増加をもたらしたが、ＣＹＣ１プロモーターの制御下でのＧＡＬ１１の過剰発現（株ＳＰＤ２０）は、スペルミジン産生において２．５倍の増加をもたらした。

【0211】

例９
スペルミン産生の増加のための酵母菌株の構築。
本実施例の目的は、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルの増加の結果として、スペルミン産生の増加を有する株を構築する方法を記載することである。

【0212】

細胞によるスペルミジン産生を増加させるために、遺伝子Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＰＥ４（ヌクレオチド配列番号：１４４；対応するタンパク質配列番号：１２８）によってコードされるスペルミン合成酵素（ＥＣ ２．５．１．２２）を、過剰発現させることができる。

【0213】

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でＳＰＥ４を過剰発現させるために、ＳＰＥ４をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのゲノムから増幅し、ＴＥＦ１プロモーターの制御下でベクターｐＩＹＣ０４［１２］の中へクローン化し、プラスミドｐＩＹＣ０４－ＳＰＥ４を得た。次いでこのプラスミドを、ｐ４１６ＴＥＦ（空のプラスミド）またはｐＢＰＳＰＤ．ＳＴ０２（ＳｉＭＡＴを発現するｐ４１６ＴＥＦ）のいずれかと共に株ＳＰＤＧ（ＫａｎＭＸ）の中へ共形質転換し、それぞれ株ＳＰＤ２１およびＳＰＤ２２を得た。ＬｉＡｃ／ＳＳキャリアＤＮＡ／ＰＥＧ方法を使用して形質転換を遂行し、ウラシルおよびヒスチジン無しのプレート（「ＳＣ－ＵＲＡ－ＨＩＳ」）上で選択した。もたらされた株を、ヒスチジンを培地へ添加しないこと以外は例５中で記載されているように培養し、例１中で記載されるようにスペルミン産生について分析した。

【0214】

例１０
スペルミジン／スペルミン産生の増加のための細菌細胞の構築。
本実施例の目的は、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）レベルの増加の結果として、スペルミン産生の増加を有する細菌株を構築する方法を記載することである。

【0215】

スペルミジン産生の増加を備えたＥ．ｃｏｌｉ株を生成するために、株Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＬ３１１０（Ｋ１２ Ｗ３１１０由来（ＣＧＳＣ、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）を使用することができる。この株を、内在性または異種のｓｐｅＥ（Ｅ．Ｃ．：２．５．１．１６；配列番号：１４５）、ｓｐｅＤ（ＥＣ ４．１．１．５０；配列番号：１４６）、およびＭＡＴ（ＥＣ ２．５．１．６；配列番号：１３９）遺伝子の過剰発現のためにいずれかプラスミドにより形質転換する。例えば、発現ベクターｐＴＲＣ－ＬＩＣ（プラスミド＃６２３４３；Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国））を使用して、強いＰｔｒｃプロモーターの制御下で前述の遺伝子を系統的に共発現させる。クローニングを、発現ベクター（Ｐｔｒｃプロモーター制御）へ３０ｂｐのオーバーハングプライマーを介する標的遺伝子の増幅を経由して行い、Ｇｉｂｓｏｎクローニングアプローチ［１３］を経由して実行する。スペルミンのテイラー産生のために、真核生物源からの異種スペルミン合成酵素（Ｅ．Ｃ．２．５．１．２２）を発現させる（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来するもの）。例えば、スペルミン合成酵素遺伝子ＳＰＥ４（ＧＩ：３２０１９４２；ヌクレオチド配列番号：１４４；対応するタンパク質配列番号：１２８）を、３０ｂｐオーバーハングプライマーによるＰＣＲを使用してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムＤＮＡ（ＣＥＮ．ＰＫ１１３－１１Ｃ）から増幅し、Ｇｉｂｓｏｎクローニング（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００９）を経由して発現ベクターｐＴＲＣの中へクローン化した。

【0216】

スペルミジン産生の増加を備えたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株を生成するために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ １３０３２を使用することができる。スペルミジン産生の増加のために、遺伝子ｓｐｅＥ（配列番号：１４５）、ｓｐｅＤ（ＥＣ ４．１．１．５０；配列番号：１４６）、およびＭＡＴ（ＥＣ ２．５．１．６；配列番号：１３９）を、プラスミドベースの発現を介して過剰発現させることができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｃ．ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍシャトルベクターｐＭＳ２（ＡＴＴＣ（登録商標）６７１８９ＴＭ）を、選択マーカーとしてのカナマイシンと共に使用することができる。３０ｂｐのオーバーハングプライマーを使用して断片を増幅し、後続して、ｓｐｅＥ、ｓｐｅＤおよびＭＡＴを、シャトルベクターｐＭＳ２の中へＧｉｂｓｏｎクローニング［１３］を経由してＰｔａｃ制御下にクローン化し、発現ベクターｐＦＤＡＭＳ２を生成する。修飾されたＣ．ｇｌｕｔａｎｉｃｕｍ株のＡＴＣＣ １３０３２株の中への形質転換後に（上を参照）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０［１４］中で記載されるように培養する。スペルミンの産生のために、真核生物源からの異種スペルミン合成酵素（Ｅ．Ｃ．２．５．１．２２）をプラスミドベースの発現を経由して発現させる（上を参照）。スペルミン合成酵素は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＳＰＥ４、（ヌクレオチド配列番号：１４４；対応するタンパク質配列番号：１２８））、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｓｉｓ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来し得る。

【表1】

【表2】

【表3】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表4-6】

【0217】

上で記載される実施形態は、本発明の少数の例示的実施例として理解されるべきである。様々な修飾、組み合わせおよび変化が、本発明の範囲から逸脱せずに、実施形態へ行われて得ることは、当業者によって理解されるだろう。特に、異なる実施形態中の異なる部分の解決法は、技術的に可能なところでは他の配置で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は添付された請求項によって定義される。

【0218】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

0007268019000001.app