特許 7269938 毒物に対する細胞の保護剤としてのスクレリチンの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-26

(45)【発行日】2023-05-09

(54)【発明の名称】毒物に対する細胞の保護剤としてのスクレリチンの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20230427BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20230427BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20230427BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20230427BHJP

   A61Q 17/00 20060101ALI20230427BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20230427BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230427BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17 ZNA

A61P39/02

A61P17/16

A61K8/64

A61Q17/00

A61Q17/04

A61P43/00 105

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2020535305

(86)(22)【出願日】2018-09-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-11-19

(86)【国際出願番号】 EP2018074455

(87)【国際公開番号】W WO2019048703

(87)【国際公開日】2019-03-14

【審査請求日】2021-08-25

(31)【優先権主張番号】1758347

(32)【優先日】2017-09-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】520083714

【氏名又は名称】サントル サンティフィーク ドゥ モナコ

(73)【特許権者】

【識別番号】520083725

【氏名又は名称】コラリオテック

(74)【代理人】

【識別番号】110000970

【氏名又は名称】弁理士法人 楓国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ベンシャウイア ラシド

(72)【発明者】

【氏名】ブクレ ピエール オリビエ

【審査官】佐々木 大輔

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１３４６６３８（ＣＮ，Ａ）

【文献】特開２０００－３５５５１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０９－２０８４４１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５１４３８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３１００５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００３－２５２７４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０８－５０３９５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５１４８４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】J. Biol. Chem., 2012, Vol.287, No.23, pp.19367-19376

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

スクレリチンを含む、毒物に対する細胞の保護剤として皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項2】

前記毒物は化学物質である、請求項１に記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項3】

前記化学物質は、無機物、揮発性有機化合物、酸化剤、強塩基、強酸、イミダゾール化合物から選択される、請求項２に記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項4】

前記化学物質は、動物性の毒素および毒液を含む生物起源の化学物質から選択される、請求項２に記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項5】

前記化学物質は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド薬剤、抗がん抗生物質を含む細胞傷害性化学療法剤から選択される、請求項２に記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項6】

前記毒物は物理的因子である、請求項１に記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項7】

前記物理的因子は紫外線である、請求項６に記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項8】

皮膚を保護するための、請求項１から７のいずれかに記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項9】

前記細胞は、繊維芽細胞、内皮細胞、または上皮細胞、特にケラチノサイトである、請求項１から８のいずれかに記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項10】

局所投与に適した形態である、請求項１から９のいずれかに記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項11】

前記スクレリチンタンパク質は配列番号３のタンパク質配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１から１０のいずれかに記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項12】

前記スクレリチンは、毒物に曝露または接触する前の皮膚に適用するのに適した形態である、請求項１から１１のいずれかに記載の皮膚科学的処置において使用するための医薬組成物。

【請求項13】

局所塗布に適合した少なくとも１つの添加物または賦形剤の中にスクレリチンを含み、皮膚科学的用途または化粧品用途で使用されることを特徴とする、組成物。

【請求項14】

前記組成物は、細胞に関して細胞傷害性を呈することのないように、４０００ｎｇ／ｍｌ以下の量のスクレリチンを含む、請求項１３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、スクレリチン（Ｓｃｌｅｒｉｔｉｎｅ）、および毒物から細胞を保護する薬剤としてのその使用に関する。

【0002】

本発明の分野は、医薬品工業または化粧品工業に関し、より具体的には、毒物から細胞を保護することを対象とした医薬品組成物または化粧品組成物の処方に関する。

【背景技術】

【0003】

化粧品の分野では、化粧的または皮膚科学的な効果を有する新規な分子が常に探し求められている。市場の需要は、ますます環境および人に優しい天然物に向けられている。

【0004】

サンゴは、その細胞および分子の生理機能がまだ割合に知られておらず、最高で数十年間個別に生存する生物である。サンゴは、細菌、ウイルス、および真菌の攻撃だけでなく、気候の影響による環境の脅威または汚染関連の脅威に常にさらされているにも関わらず、長期間にわたって生き続ける。多くの日和見性または特殊化した寄生性もしくは捕食性の生物もサンゴにとって害となる。したがって、これら全ての有害な影響に対するサンゴの抵抗性は、化粧品、皮膚科学、または医薬の分野において、興味深い効果を有する新規な天然分子の潜在的な源につながる。

【0005】

スクレリチンは、Ｄｅｂｒｅｕｉｌ ｅｔ ａｌ． ゛Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｒｓｔ ｏｒｇａｎｉｃ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｓｃｌｅｒｉｔｅｓ ｏｆ ｒｅｄ ｃｏｒａｌ， Ｃｏｒａｌｌｉｕｍ ｒｕｂｒｕｍ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２ Ｊｕｎ １； ２８７ （２３）： １９３６７－７６ Ｅｐｕｂ ２０１２ Ａｐｒ １３に記載されているように、２０１２年に初めて単離され特徴づけられたタンパク質である。

【0006】

このタンパク質は、八放サンゴ類、より一般的にベニサンゴとして知られるＣｏｒａｌｌｉｕｍ ｒｕｂｒｕｍの骨片の有機基質から抽出される。スクレリチンは、有機基質のＥＤＴＡ可溶性分画中の主なタンパク質である。スクレリチンは、１３５個のアミノ酸からなる配列および２０個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを有する分泌型のリン酸化塩基性タンパク質である。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、毒物に対する細胞の保護剤としてのスクレリチンの使用を提案し、すなわち、本発明は、毒物に対する細胞の保護剤として、治療的処置、有利には皮膚科学的処置において使用するためのスクレリチンに関する。

【0008】

本発明は、毒物に対する細胞の予防および保護に使用するためのスクレリチンに関する。

【0009】

驚くべきことに、サンゴ由来のこのタンパク質は、毒物に対して細胞を保護する効果を有する。

【0010】

有利には、毒物は、化学物質または物理的因子などの様々なタイプのものである。

【0011】

他の観点から、本発明は、好ましくは毒物から皮膚を保護する有利には皮膚科学的および／または化粧品の組成物に関し、その組成物は、局所適用に適合した少なくとも１つの添加物または賦形剤の中にスクレリチンを含むことを特徴とする。

【0012】

本発明の目的、対象、特徴、および利点は、以下の添付の図面に例証された、本発明の実施方法の詳細な記載によって最もよく説明される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】組換えスクレリチンタンパク質の全体構造の模式図である。最初の２０個のアミノ酸はシグナルペプチドを表し、このシグナルペプチドは細胞内でのこのタンパク質の成熟化の過程で切断される（したがって分泌後の成熟タンパク質中には存在しない）。このタンパク質のＣ末端の６つのヒスチジンは、組換えスクレリチンの精製過程に有用なヒスチジンタグ（ＨＩＳｘ６）を表す。

【図2】３日にわたって異なる用量比率でスクレリチンに曝露したａ）内皮細胞、ｂ）ケラチノサイト、ｃ）繊維芽細胞の細胞株の生存率を示すグラフである。

【図3】用量漸増スクレリチンの存在下、６日間にわたって毒物（最終的に１５０ｍＭのイミダゾール）に曝露したヒト内皮細胞の生存率を示すグラフである。

【図4】図３の条件下での６日目の全生細胞数を示す、図３から導いたグラフである。

【図5】紫外線を照射した１日目のヒト繊維芽細胞の倒立位相差顕微鏡画像であり、ａ）およびｂ）は４μｇ／ｍｌのスクレリチンの存在下、ｃ）およびｄ）は４μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、ｅ）およびｆ）はＰＢＳのみの存在下での画像である（上の写真ａ、ｃ、およびｅでは倍率８０Ｘ、下の写真ｂ、ｄ、およびｆでは倍率２００Ｘ）。

【図6】紫外線に曝露した３日目のヒト繊維芽細胞の倒立位相差顕微鏡画像であり、ａ）およびｂ）は４μｇ／ｍｌのスクレリチンの存在下、ｃ）およびｄ）は４μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、ｅ）およびｆ）はＰＢＳのみの存在下での画像である（上の写真ａ、ｃ、およびｅでは倍率２００Ｘ、下の写真ｂ、ｄ、およびｆでは倍率４００Ｘ）。

【0014】

配列の簡単な説明
配列番号１：４６８個のヌクレオチドを含み、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋのカタログにおいて番号ＪＱ６５２４５８で呼ばれる、スクレリチンの天然起源のヌクレオチド配列。

【0015】

配列番号２：バキュロウイルス／昆虫細胞産生系による転写処理を向上させることを目的とした、合成により得られる４８６個のヌクレオチドを含むコドン最適化スクレリチン配列。加えて、それは、その３′末端コード領域に、ヒスチジンタグのための付加的な１８個の塩基対を有する。この最適化配列は、ヒスチジンタグを除き、天然配列に対して、全塩基対４６８個のうちの３４６個の同一性、すなわち７４％のヌクレオチド相同性を有する。

【0016】

配列番号３：天然のスクレリチンの１５５個のアミノ酸タンパク質配列。

【0017】

配列番号４：最適化配列である配列番号２から符号化された組換えスクレリチンのタンパク質配列。それは、ヒスチジンタグを除いて、天然のタンパク質配列に対して１００％の相同性を有する。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明を実施する方法を詳細に概説する前に、場合により組み合わせてまたは代替として使用される任意選択の特徴を以下に述べる。

【0019】

まず、毒物から細胞を保護するための薬剤として、スクレリチンの使用を検討するべきである。

【0020】

有利には、好適であるが限定するものではない変形例によれば、本発明は次のようなものである。
－当該毒物は化学物質であり、
－当該化学物質は、無機物、揮発性有機化合物、酸化剤、強塩基、強酸、イミダゾール化合物から選択される。
－当該化学物質は、動物性の毒素および毒液を含む生物起源の化学物質から選択される。
－当該化学物質は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド薬剤、抗がん抗生物質を含む細胞傷害性化学療法剤の中から選択される。
－当該毒物は物理的因子であり、
－当該物理的因子は紫外線であり、
－スクレリチンは、４０００ｎｇ／ｍｌ以下の用量では細胞に対して細胞傷害性を示さず、
－当該細胞は動物細胞であり、
－当該細胞は皮膚細胞であり、
－使用は皮膚を保護するためであり、
－当該細胞は、繊維芽細胞、内皮細胞、または上皮細胞、特にケラチノサイトであり、
－使用は局所適用によるものであって、スクレリチンは局所投与に適した形態であり、
－スクレリチンの存在下で毒物に曝露された細胞の生存率は、毒物のみに曝露された、すなわちスクレリチンの非存在下での細胞の生存率より３０％高く、
－スクレリチンタンパク質は、配列番号３のタンパク質配列に対して少なくとも９０％の相同性を有し、
－スクレリチンは、毒物に曝露または接触する前の皮膚に適用するのに適した形態である。

【0021】

他の観点から、本発明は、好ましくは毒物から皮膚を保護する有利には皮膚科学的および／または化粧品の組成物に関し、その組成物は、例えば皮膚への局所適用に適合した少なくとも１つの添加物または賦形剤の中にスクレリチンを含むことを特徴とする。

【0022】

１つ可能であることは、当該組成物が、細胞に関して細胞傷害性を呈することのないように、培養培地に４０００ｎｇ／ｍｌ以下の量のスクレリチンを含むことである。

【0023】

他の観点から、本発明は、毒物から皮膚を保護する非治療的方法に関し、この方法は、毒物に曝露または接触する前の皮膚にスクレリチンを含む組成物を適用することを含むことを特徴とする。

【0024】

本発明は、１３５個のアミノ酸からなるタンパク質であるスクレリチンに関する。このタンパク質は、配列番号１のヌクレオチド配列遺伝子によってコードされている。そのヌクレオチド配列に関するスクレリチンのアミノ酸配列を図１に示す。スクレリチンは２０個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含む。

【0025】

本発明によれば、スクレリチンは、哺乳類細胞の遺伝子導入、または、好ましくはバキュロウイルス／昆虫細胞系によって産生される。例えば、スクレリチンは、Ｂｕｃｌｅｚ ＰＯ ｅｔ ａｌ． ゛Ｒａｐｉｄ， ｓｃａｌａｂｌｅ， ａｎｄ ｌｏｗ－ｃｏｓｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ″． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ． ２０１６ Ｍａｙ １１；３：１６０３５． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．３５の論文に記載されている方法を使用して産生される。産生に関しては、スクレリチンは、「タグ」とも呼ばれる精製標識を含んでもよく、例えば、図１に示すように、スクレリチンのアミノ酸配列の後に置かれる６個のヒスチジンを含むヒスチジンタグを含んでもよい。加えて、スクレリチン遺伝子には、配列番号２に表されるように、昆虫細胞（Ｓｆ９型産生細胞株）の内部環境での転写処理を向上させるために、これら本来のコドンの最適化が行われていてもよい。この最適化は、天然の配列である配列番号１と比較して、ヌクレオチド配列が最大で３０％異なることにから生じ得る。

【0026】

本発明は、９０％、好ましくは１００％の相同性で配列番号３のタンパク質配列を少なくとも含む全てのタンパク質を範囲に含む。

【0027】

本発明によれば、スクレリチンは、毒物から細胞を保護する役割を果たす。

【0028】

有利には、毒物にさらされる細胞のための保護剤とは、細胞が６日目の時点で少なくとも６０％の生存率を維持することを可能にする製品を意味すると理解される。その保護剤は毒物の有害な影響を少なくとも部分的に相殺する。したがって、本発明によれば、スクレリチンの存在下で毒物にさらされた細胞と、スクレリチンの非存在下で毒物にさらされた細胞との６日目の細胞生存率の差は、少なくとも３０％である。

【0029】

毒物は細胞に有毒な化学物質または物理的因子であり、すなわち、それらは、細胞を損傷し、特にその毒物に曝露された細胞の生存率を減少させる。

【0030】

化学物質は、細胞傷害性薬剤、すなわち細胞を破壊しかねないほど細胞に有毒な物質を含む。

【0031】

例えば、毒物は以下の少なくとも１つから選択される。
－無機物、揮発性有機化合物、酸化剤、強塩基、強酸、イミダゾール化合物を含む化学物質。
－動物性の毒素および毒液を含む生物起源化学物質の化学物質。
－アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド薬剤、抗がん抗生物質を含む細胞傷害性化学療法剤。

【0032】

物理的因子は、放射線、特に紫外線を含み、紫外線は、ＵＶＡ（すなわち波長が４００ｎｍと３１５ｎｍの間の電磁放射線）、ＵＶＢ（すなわち波長が３１５ｎｍと２８０ｎｍの間の電磁放射線）、およびＵＶＣ（すなわち波長が２８０ｎｍと１００ｎｍの間の電磁放射線）を含む。

【0033】

スクレリチンによって保護される細胞は、ヒト細胞を含む動物性真核細胞である。

【0034】

好ましくは、スクレリチンは皮膚保護剤として使用される。

【0035】

例えば、動物細胞は、繊維芽細胞、上皮細胞、優先的に、ケラチノサイト、または内皮細胞を含む。

【0036】

意外にも、スクレリチンは、これらの細胞に対しては細胞傷害性を有しないようである。つまり、半数致死量すなわちＬＤ_５０は４０００ｎｇ／ｍｌより大きい。この量は、細胞にとって外来性の物質において非常に高い用量である。この毒性がないということは、重要な利点であり、スクレリチンが化粧品への使用および／または皮膚科学的な使用のために検討され得ることを意味する。

【0037】

加えて、スクレリチンは用量依存性の保護効果を有する。

【0038】

スクレリチンは、有利には、毒物から皮膚を優先的に保護するための化粧品用途および／または皮膚科学的用途で使用され得る組成物に導入される。

【0039】

その組成物は局所的な適用を対象とする。局所的とは、適用の範囲が局部的であることを意味する。好ましくは、吸収は、皮膚もしくは経皮の経路により皮膚を通して、または、耳、鼻、肺、膣／子宮内、もしくは眼の経路により粘膜を通してなされる。

【0040】

当該組成物は、局所適用に適した少なくとも１つの添加物または賦形剤を含む。製剤の所望のタイプ（軟膏、クリーム、ジェル、ペースト、乳液）に応じて、最終組成物は１つまたは複数の以下の添加物を含んでもよい。すなわち、水、ワセリン、パラフィン（固体または液体）、マクロゴール（またはポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、セスキオレイン酸ソルビタンまたはモノステアリン酸グリセロールで水和したワセリン（例えば保存料としてソルビン酸を有する）、緩衝化ケトマクロゴール（例えば保存料としてソルビン酸を有する）、アニオン性親水クリーム（グリセロールを有するまたは有しない）、オレイン酸デシル、カルボマー（例えば安定剤としてアミノメチルプロパノールを有する）、冷却用のろう剤（ハクロウ、セチルエステルワックス）、植物油（例えばゴマ油）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、タルク、および医薬製剤に関するヨーロッパ薬局方に好ましく準拠したその他の任意の添加物を含んでもよい。

【0041】

実施例１：スクレリチンの外因的効果－細胞傷害性
様々なヒト細胞株、すなわち内皮細胞、ケラチノサイト、および繊維芽細胞を、０、１００ｎｇ／ｍｌ、および４０００ｎｇ／ｍｌの用量漸増スクレリチンに接触させた。その結果を図２のグラフに示す。

【0042】

上記の各細胞を培養プレートウェル中で培養した。ｔ＝２４ｈの時点で、（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８に処方した）スクレリチンを培養培地１ｍｌあたり０、１００ｎｇまたは４０００ｎｇの用量で完全培養培地に添加し、細胞をスクレリチンに接触させた。

【0043】

スクレリチンを添加した日を、実施例において０日目とした。

【0044】

毎日、ウェル中の細胞について、トリプシン－ＥＤＴＡ剥離プロトコールおよび自動計数（Ｃｏｕｎｔｅｓｓタイプ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に従って細胞計数を行った。トリパンブルー（生体染色剤）を細胞懸濁液に添加することにより、細胞生存率をスライド上で定量化した。

【0045】

ｔ＝３日目の時点で、スクレリチンに曝露した細胞の生存率は、曝露しなかった対照細胞のものと同等またはそれよりもわずかに低いことがわかった。

【0046】

特に、３日目の内皮細胞については、スクレリチン４０００ｎｇ／ｍｌに曝露した細胞の生存率は７８％であるのに対し、スクレリチン１００ｎｇ／ｍｌに曝露した細胞または曝露しなかった細胞の生存率は８５％である。

【0047】

３日目のケラチノサイトについては、スクレリチン４０００ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌに曝露した細胞の生存率は９０％であるのに対し、曝露しなかった細胞の生存率は９２％である。

【0048】

３日目の繊維芽細胞については、４０００ｎｇ／ｍｌに曝露した細胞の生存率は８２％であり、１００ｎｇ／ｍｌに曝露した細胞の生存率は８８％であり、曝露しなかった細胞の生存率は９０％である。

【0049】

結論として、（培養培地１ｍｌあたりのスクレリチン用量４０００ｎｇまで）確認できる初代ヒト細胞へのスクレリチンの細胞傷害性はなかった。

【0050】

実施例２：スクレリチンの外因的効果－化学物質に対する保護
０．４μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、および０．０５μｇ／ｍｌの用量漸増スクレリチン、ならびにイミダゾール誘導体すなわちイミダゾール（ＣＡＳ Ｎｏ．２８８－３２－４）の系統に属する毒物に、初代ヒト内皮細胞を接触させた。

【0051】

上記の細胞を培養プレートウェル中で培養した。ｔ＝２４ｈの時点で、培養培地１ｍｌあたり各用量で完全培養培地にスクレリチンを添加し、細胞をスクレリチンに接触させた。

【0052】

スクレリチンを添加した日を０日目とした。スクレリチンの添加から２４時間後に、培地中の最終濃度１５０ｍＭまで毒物（イミダゾール）を培養培地に添加した。毒物の添加を行ったのが１日目である。

【0053】

毎日、前述のトリプシンプロトコールに従ってウェル中の細胞を計数した。

【0054】

６日目まで毎日、トリプシンプロトコールの後、細胞を、位相差顕微鏡で観察し、計数した。結果を図３のグラフに示す。

【0055】

６日目において、イミダゾールのみに曝露した細胞の生存率は１０％近くであるが、一方、スクレリチンの存在下でイミダゾールに曝露した細胞の生存率は５８％から６８％の間であり、イミダゾールおよびスクレリチンが無い対照細胞の生存率は７８％である。これらの結果を図３に示す。

【0056】

図４において、６日目の生細胞の数を異なる条件下で比較する。イミダゾールのみでの生細胞の数とスクレリチン存在下での生細胞の数の違いは極めて明らかである。

【0057】

したがって、スクレリチンは、イミダゾールから細胞を保護する役割を果たしている。

【0058】

実施例３：スクレリチンの外因的効果－物理的因子に対する保護
スクレリチンの存在または非存在下でヒト初代繊維芽細胞を紫外線に曝露した。

【0059】

上記の細胞を培養プレートウェル中で培養した。ｔ＝２４ｈの時点で、（可能性としてあり得る可溶性血清タンパク質のＵＶ減衰効果を回避するため）培養培地を除去して１Ｘ ＰＢＳに置換した。１Ｘ ＰＢＳ中で最終濃度４μｇ／ｍｌでスクレリチンにその細胞を接触させた。その細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。次に、１０００μＪ／ｃｍ^２の出力で２５４ｎｍの紫外線Ｃ波をその細胞に照射した。照射後５分で、完全培養培地をウェルに添加し、３７℃、ＣＯ_２５％でインキュベーターにてその細胞を培養した。

【0060】

スクレリチンを添加した日を０日目とした。ＵＶＣ照射を行ったのも０日目である。

【0061】

ウェル中の細胞をＪ１およびＪ３で制御した。

【0062】

図５は、照射後１日目の繊維芽細胞プラークの倒立位相差顕微鏡画像（図５のａ、ｃ、およびｅでは倍率８０Ｘ、ならびに図５のｂ、ｄ、およびｆでは倍率２００Ｘ）を示し、図５のａ）およびｂ）は４μｇ／ｍｌのスクレリチン存在下、図５のｃ）およびｄ）は４μｇ／ｍｌのＢＳＡ存在下、図５のｅ）およびｆ）はＰＢＳのみでの画像である。

【0063】

ＰＢＳのみまたはＢＳＡを補充したＰＢＳでは、繊維芽細胞が損傷を受けていることがわかるが、一方、スクレリチンの存在下では、その外観が繊維芽細胞にふさわしいままである。

【0064】

図６は、照射後３日目の繊維芽細胞プラークの倒立位相差顕微鏡画像（図６のａ、ｃ、およびｅでは倍率２００Ｘ、図６のｂ、ｄ、およびｆでは倍率４００Ｘ）を示し、図６のａ）およびｂ）は４μｇ／ｍｌのスクレリチン存在下、図６のｃ）およびｄ）は４μｇ／ｍｌのＢＳＡ存在下、図６のｅ）およびｆ）はＰＢＳのみでの画像である。

【0065】

１日目には、スクレリチンの存在下で照射を受けた繊維芽細胞は、典型的な繊維芽細胞の外観、すなわち非常に細い伸長部分を有する紡錘形または星形を示している。ＢＳＡのみでは、繊維芽細胞は凝縮され、伸長部分は減少しているか存在すらしていない。同様に、ＰＢＳのみでは、繊維芽細胞は凝縮され、伸長部分は減少している。１日目から、ＰＢＳのみまたはＢＳＡのみの存在下で照射を受けた繊維芽細胞は、アポトーシス小体（プログラム細胞死）に典型的な外観を示している。この段階で、ＢＳＡまたはＰＢＳのみでの条件における生細胞の濃度を定量化する試みは、細胞がおそらく照射プロトコールによってかなり傷害を受けており、計数可能な細胞がないため、うまくいかない。ＰＢＳのみまたはＢＳＡのみでは、繊維芽細胞が損傷を受けていることがわかるが、一方、スクレリチンの存在下では、その外観が繊維芽細胞にふさわしいままである。

【0066】

３日目には、その観察結果は、同様であるか、よりいっそう強調され、つまり、スクレリチンの存在下で照射を受けた繊維芽細胞は、典型的な繊維芽細胞の外観、すなわち非常に細い伸長部分を有する紡錘形または星形を示している。ＢＳＡのみでは、繊維芽細胞は凝縮され、伸長部分は減少しているか存在すらしていない。同様に、ＰＢＳのみでは、繊維芽細胞は凝縮され、伸長部分はなくなっている。ＰＢＳのみまたはＢＳＡのみの存在下で照射を受けた繊維芽細胞は、アポトーシス小体に典型的な外観を示している。この段階で、ＢＳＡまたはＰＢＳのみでの条件における生細胞の濃度を定量化する試みは、細胞がおそらく照射プロトコールによってかなり傷害を受けており、計数可能な細胞がないために、うまくいかない。

【0067】

したがって、スクレリチンは、紫外線Ｃ波から細胞を保護する役割を果たしている。紫外線Ｃ波は、短い波長の放射線であり、したがって極めて高いエネルギーを有する。このエネルギーは、生体分子を変化させる相当な能力を紫外線Ｃ波に与える。ＵＶＣ放射線に対するスクレリチンの強い保護効果は、より低いエネルギーを有するＵＶＢ放射線およびＵＶＡ放射線に対するスクレリチンの効果も関心の対象となることを示唆している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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