特許 7270907 細胞観察システムおよび細胞観察方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-28

(45)【発行日】2023-05-11

(54)【発明の名称】細胞観察システムおよび細胞観察方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/14 20060101AFI20230501BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20230501BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230501BHJP

【ＦＩ】

G01N15/14 D

C12Q1/04

C12M1/34 A

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2019033782

(22)【出願日】2019-02-27

(65)【公開番号】P2020137429

(43)【公開日】2020-09-03

【審査請求日】2021-10-29

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人 日本医療研究開発機構、「医療分野研究成果展開事業・先端計測分析技術・機器開発プログラム」、「三次元像フローサイトメーター基盤技術の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504300181

【氏名又は名称】国立大学法人浜松医科大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000236436

【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100124800

【弁理士】

【氏名又は名称】諏澤 勇司

(74)【代理人】

【識別番号】100113435

【弁理士】

【氏名又は名称】黒木 義樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140442

【弁理士】

【氏名又は名称】柴山 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100110582

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 昌聰

(72)【発明者】

【氏名】菊池 寛利

(72)【発明者】

【氏名】山田 秀直

(72)【発明者】

【氏名】廣津 周

(72)【発明者】

【氏名】山下 大輔

(72)【発明者】

【氏名】岡崎 茂俊

【審査官】北条 弥作子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５１０５９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２６７０２１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００５－０２１８３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／０６７７７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１９７６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】山田秀直， 血中循環腫瘍細胞検出のためのトモグラフィック位相イメージングフローサイトメトリー，Med Imag Tech，2016年03月，Vol. 34 No.2，pp.95-102

【文献】粟辻安浩，ディジタルホログラフィ －３次元動画像高精度計測が可能な技術，システム／制御／情報，2008年，Vol.52 No.11，pp.407－413

【文献】大貫一朗，４章 撮像面位相差センサを用いたカメラ，映像情報メディア学会誌，2014年，Vol.68, No.3，pp.203-207

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ １５／１４

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｃ１２Ｑ １／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

流路を流体とともに移動する細胞を観察する細胞観察システムであって、
第１光学系および第１撮像素子を含み、前記流路における前記細胞の移動方向に関して第１位置にある前記細胞から前記第１光学系を経て前記第１撮像素子に到達した光を前記第１撮像素子により受光して前記細胞を撮像する第１撮像装置と、
フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第２光学系および第２撮像素子を含み、前記流路における前記細胞の移動方向に関して前記第１位置より下流の第２位置にある前記細胞から前記第２光学系を経て前記第２撮像素子に到達した光を前記第２撮像素子により受光して前記細胞を撮像する第２撮像装置と、
前記第１撮像装置の前記第１撮像素子による撮像により得られた画像に基づいて前記流路の断面における前記細胞の通過位置を求め、その求めた通過位置に基づいて前記フォーカス調整信号を生成して前記第２撮像装置の前記第２光学系に与える制御装置と、
を備える細胞観察システム。

【請求項2】

前記制御装置は、前記通過位置に基づいて前記第２光学系のフォーカスを調整すべきであるか否かを判断し、前記第２光学系のフォーカスを調整すべきであると判断した場合に前記フォーカス調整信号を前記第２撮像装置に与える、
請求項１に記載の細胞観察システム。

【請求項3】

前記第１撮像装置は定量位相顕微鏡である、
請求項１または２に記載の細胞観察システム。

【請求項4】

前記第２撮像装置は定量位相顕微鏡または位相トモグラフィック顕微鏡である、
請求項１または２に記載の細胞観察システム。

【請求項5】

前記第１撮像装置は定量位相顕微鏡であり、
前記第２撮像装置は位相トモグラフィック顕微鏡である、
請求項１または２に記載の細胞観察システム。

【請求項6】

前記制御装置は、位相差オートフォーカス技術、像面位相差フォーカス技術またはデジタルホログラフィを用いるオートフォーカス技術により、前記画像に基づいて前記通過位置を求める、
請求項１～５の何れか１項に記載の細胞観察システム。

【請求項7】

流体力学的集束効果を利用して前記流路において前記流体を層流として流す、
請求項１～６の何れか１項に記載の細胞観察システム。

【請求項8】

流路を流体とともに移動する細胞を観察する細胞観察方法であって、
第１光学系および第１撮像素子を含む第１撮像装置を用いて、前記流路における前記細胞の移動方向に関して第１位置にある前記細胞から前記第１光学系を経て前記第１撮像素子に到達した光を前記第１撮像素子により受光して前記細胞を撮像する第１撮像ステップと、
フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第２光学系および第２撮像素子を含む第２撮像装置を用いて、前記流路における前記細胞の移動方向に関して前記第１位置より下流の第２位置にある前記細胞から前記第２光学系を経て前記第２撮像素子に到達した光を前記第２撮像素子により受光して前記細胞を撮像する第２撮像ステップと、
前記第１撮像ステップの後であって前記第２撮像ステップの前に、前記第１撮像装置の前記第１撮像素子による撮像により得られた画像に基づいて前記流路の断面における前記細胞の通過位置を求め、その求めた通過位置に基づいて前記フォーカス調整信号を生成して前記第２撮像装置の前記第２光学系に与えるフォーカス調整指示ステップと、
を備える細胞観察方法。

【請求項9】

前記フォーカス調整指示ステップにおいて、前記通過位置に基づいて前記第２光学系のフォーカスを調整すべきであるか否かを判断し、前記第２光学系のフォーカスを調整すべきであると判断した場合に前記フォーカス調整信号を前記第２撮像装置に与える、
請求項８に記載の細胞観察方法。

【請求項10】

前記第１撮像装置として定量位相顕微鏡を用いる、
請求項８または９に記載の細胞観察方法。

【請求項11】

前記第２撮像装置として定量位相顕微鏡または位相トモグラフィック顕微鏡を用いる、
請求項８または９に記載の細胞観察方法。

【請求項12】

前記第１撮像装置として定量位相顕微鏡を用い、
前記第２撮像装置として位相トモグラフィック顕微鏡を用いる、
請求項８または９に記載の細胞観察方法。

【請求項13】

前記フォーカス調整指示ステップにおいて、位相差オートフォーカス技術、像面位相差フォーカス技術またはデジタルホログラフィを用いるオートフォーカス技術により、前記画像に基づいて前記通過位置を求める、
請求項８～１２の何れか１項に記載の細胞観察方法。

【請求項14】

流体力学的集束効果を利用して前記流路において前記流体を層流として流す、
請求項８～１３の何れか１項に記載の細胞観察方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞観察システムおよび細胞観察方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

流路を流体とともに移動する細胞を観察する細胞観察システム（フローサイトメータ又はイメージングフローサイトメータ）において、観察の対象である細胞の鮮明な画像を取得するために撮像装置のフォーカシングは重要である。細胞の鮮明な画像を取得することで、例えば、その細胞が、がん患者に含まれるがん細胞（血中循環腫瘍細胞、circulating tumor cells）であるか否かを識別することができる。

【0003】

フローサイトメータは、光電子増倍管およびフォトダイオード等のポイントセンサ型の光検出器を用いたものである。フローサイトメータによる細胞観察では、数ｍ／ｓ～１０ｍ／ｓの流速で細胞を流す。

【0004】

イメージングフローサイトメータは、リニアアレイセンサ又は２次元センサ型の光検出器を用いたものである。イメージングフローサイトメータによる細胞観察では、数ｍｍ／ｓ～数十ｍｍ／ｓの流速で細胞を流すと言われている。この流速は、フローサイトメータによる細胞観察の場合の約１／１０^３である。イメージングフローサイトメータとして、細胞の定量位相像を取得することができる２次元像イメージングフローサイトメータと、細胞の屈折率分布に関する３次元像を取得することができる３次元像イメージングフローサイトメータとがある。

【0005】

一般的に、フローサイトメータにおいては、流体力学的収束効果により、培養液などの流体とともに細胞を流すことで、細胞を流れ方向に沿って略一列にすることができる。この流体力学的収束効果により、撮像装置の光学系のフォーカスを固定したままであっても、フォーカスのあった細胞の画像を取得することができる。流体力学的収束効果による細胞の一列の程度は、サンプル液（細胞懸濁液）とシース液（培養液）との体積比による。この体積比率は、一般的に、これらの液体を押し出すために付加される圧力によって制御される。体積比を小さくすることで、サンプル液柱の直径は小さくなり、その結果、細胞は、より真に一列になる。一方、体積比を大きくすることで、サンプル液柱の直径Δｄは大きくなり、その結果、細胞は、真に一列には流れなくなる。この場合、撮像装置の光学系の光軸方向に厚みをもった範囲に亘って、細胞が流れることになり、フォーカスが合わない細胞の画像が取得される。

【0006】

一方、撮像装置の光学系の焦点深度（ＤＯＦ, depth of focus）より、サンプル液柱の直径Δｄが小さい場合（すなわち、ＤＯＦ＞Δｄ）は、フォーカスがあった細胞の画像が得られる。また、フローサイトメータにおいては、サンプルノズルの位置に影響を与えるような機器の調整を行った場合において、略一列に流れる細胞の流路断面内における位置が変化し、結果、フォーカスの合わない細胞の画像が取得される。また、現在の技術レベルにおいて、撮像光学系のフォーカス調整に要する時間は、一般的に最小１μｓと言われており、十分な応答速度が得られない。この２つの技術的課題を回避するために、本測定前に予備試料またはビーズ等の擬似試料を流し、フォーカス調整を行ってフォーカス面を決定した上で、試験試料を流す。撮像光学系のフォーカス調整に要する時間より短い時間で、細胞が流れる場合には、試験試料を流している間にはフォーカスの再調整を行うことはない。

【0007】

イメージングフローサイトメータでは、撮影対象の細胞が移動することを利用して、リニアアレイセンサ（ＴＤＩセンサ含む）を用いることが多い。リニアアレイセンサでは、流れ方向に垂直な方向の線上毎（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、…）に対象物を、流れ方向に走査して画像を取得する。細胞のような球形の物体を流れ方向での走査にて撮影する場合、最初の線上（Ｌ１）で細胞全体のフォーカスを推定する必要がある。しかし、これは困難である。

【0008】

特許文献１，２に記載された発明では、撮像装置は、撮像光学系とは別に設けた光学系によりフォーカスずれ量を測定し、この測定結果に基づいて撮像光学系のフォーカスを調整する。この撮像装置は、流路における細胞の移動方向に関して共通の位置においてフォーカスずれ量の測定および撮像を行う。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】米国特許出願公開第２００４／０２１７２５号明細書

【文献】特開２００１－２５５２６０号公報

【非特許文献】

【0010】

【文献】Park, Y., Popescu, G.,Badizadegan, K., Dasari, R.R., Feld, M.S.: Fresnel particle tracing in threedimensions using diffraction phase microscopy. Opt. Lett. 32, 811-813 (2007).doi:10.1364/OL.32.000811

【文献】山内豊彦、山田秀直、上田之雄、「定量位相顕微鏡の小型化と各種応用計測 ＝空気定盤不要な卓上二光束干渉顕微鏡＝」、光アライアンス、2017.2. pp.26-29

【文献】山田秀直、山内豊彦、上田之雄、山下豊、「血中循環腫瘍細胞検出のためのトモグラフィック位相イメージングフローサイトメトリー」、Medical Imaging Technology, Vol.34, No.2, pp.95-102 (2016)

【文献】Langehanenberg, P., Kemper, B.,Dirksen, D., von Bally, G.: Autofocusing in digital holographic phase contrastmicroscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl. Opt. 47, D176(2008). doi:10.1364/AO.47.00D176

【文献】Liebling, M., Unser, M.: Autofocusfor digital Fresnel holograms by use of a Fresnelet-sparsity criterion. J. Opt.Soc. Am. A. 21, 2424 (2004). doi:10.1364/JOSAA.21.002424

【文献】Rinehart, M.T., Park, H.S., Wax,A.: Influence of defocus on quantitative analysis of microscopic objects andindividual cells with digital holography. Biomed. Opt. Express. 6, 2067-2075(2015). doi:10.1364/BOE.6.002067

【文献】一朗大貫: 4. 撮像面位相差センサを用いたカメラ. 映像情報メディア学会誌. 68, 203-207 (2014).doi:10.3169/itej.68.203

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

特許文献１，２に記載された発明では、流路に細胞を流す速さは、フォーカスずれ量の測定および撮像光学系のフォーカス調整に要する時間により制限される。次に流れてくる細胞の光軸方向の位置が前の細胞と同じであるという保証がないことから、この発明では、細胞の流速はフォーカシング速度（フォーカスずれ量の測定および撮像光学系のフォーカス調整に要する時間）により制限される。

【0012】

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、フォーカシング速度による細胞の流速の制限を緩和することができる細胞観察システムおよび細胞観察方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の細胞観察システムは、流路を流体とともに移動する細胞を観察する細胞観察システムであって、(1) 第１光学系および第１撮像素子を含み、流路における細胞の移動方向に関して第１位置にある細胞から第１光学系を経て第１撮像素子に到達した光を第１撮像素子により受光して細胞を撮像する第１撮像装置と、(2) フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第２光学系および第２撮像素子を含み、流路における細胞の移動方向に関して第１位置より下流の第２位置にある細胞から第２光学系を経て第２撮像素子に到達した光を第２撮像素子により受光して細胞を撮像する第２撮像装置と、(3) 第１撮像装置の第１撮像素子による撮像により得られた画像に基づいて流路の断面における細胞の通過位置を求め、その求めた通過位置に基づいてフォーカス調整信号を生成して第２撮像装置の第２光学系に与える制御装置と、を備える。

【0014】

本発明の細胞観察方法は、流路を流体とともに移動する細胞を観察する細胞観察方法であって、(1) 第１光学系および第１撮像素子を含む第１撮像装置を用いて、流路における細胞の移動方向に関して第１位置にある細胞から第１光学系を経て第１撮像素子に到達した光を第１撮像素子により受光して細胞を撮像する第１撮像ステップと、(2) フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第２光学系および第２撮像素子を含む第２撮像装置を用いて、流路における細胞の移動方向に関して第１位置より下流の第２位置にある細胞から第２光学系を経て第２撮像素子に到達した光を第２撮像素子により受光して細胞を撮像する第２撮像ステップと、(3) 第１撮像ステップの後であって第２撮像ステップの前に、第１撮像装置の第１撮像素子による撮像により得られた画像に基づいて流路の断面における細胞の通過位置を求め、その求めた通過位置に基づいてフォーカス調整信号を生成して第２撮像装置の第２光学系に与えるフォーカス調整指示ステップと、を備える。

【0015】

本発明の一側面において、制御装置またはフォーカス調整指示ステップは、通過位置に基づいて第２光学系のフォーカスを調整すべきであるか否かを判断し、第２光学系のフォーカスを調整すべきであると判断した場合にフォーカス調整信号を第２撮像装置に与えてもよい。

【0016】

本発明の一側面において、第１撮像装置は定量位相顕微鏡であってもよい。第２撮像装置は定量位相顕微鏡または位相トモグラフィック顕微鏡であってもよい。第１撮像装置は定量位相顕微鏡であり、第２撮像装置は位相トモグラフィック顕微鏡であってもよい。

【0017】

本発明の一側面において、制御装置またはフォーカス調整指示ステップは、位相差オートフォーカス技術、像面位相差フォーカス技術またはデジタルホログラフィを用いるオートフォーカス技術により、画像に基づいて通過位置を求めてもよい。

【0018】

また、本発明の一側面において、流体力学的集束効果を利用して流路において流体を層流として流してもよい。

【発明の効果】

【0019】

本発明によれば、フォーカシング速度による細胞の流速の制限を緩和することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、細胞観察システム１の構成を示す図である。

【図2】図２は、流路１０の構造の一例を示す図である。

【図3】図３は、細胞３０の相互間の間隔のヒストグラムの例である。

【図4】図４は、撮像装置１００Ａの構成を示す図である。

【図5】図５は、制御装置６０から与えられるカメラトリガ信号が指示するタイミングで撮像素子１２０が撮像を行う場合のタイミングチャートである。

【図6】図６は、撮像装置１００Ｂの構成を示す図である。

【図7】図７は、撮像装置１００Ｃの構成を示す図である。

【図8】図８は、撮像装置１００Ｄの構成を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

【0022】

図１は、細胞観察システム１の構成を示す図である。細胞観察システム１は、流路１０を流体２０とともに移動する細胞３０を観察するものである。細胞観察システム１は、第１撮像装置４０、第２撮像装置５０、制御装置６０および解析装置７０を備える。

【0023】

例えば、流路１０はフローセルであり、流体２０は培養液であり、細胞３０は赤血球，白血球およびＣＴＣ等である。細胞３０は培養液に懸濁された状態で準備される。その懸濁液濃度は例えば１０^６個／ｍＬとされる。その細胞懸濁液は流路１０に導かれる。流体力学的集束効果により、流路１０中を細胞３０が略一直線上を移動するようにする。

【0024】

第１撮像装置４０は、第１光学系４１および第１撮像素子４２を含む。第１光学系４１は、流路１０における細胞３０の移動方向に関して第１位置にある細胞３０から到達した光を第１撮像素子４２の受光面へ導く。第１撮像素子４２は、第１光学系４１と光学的に接続されており、受光面に到達した光を受光して細胞３０を撮像する（第１撮像ステップ）。

【0025】

第２撮像装置５０は、第２光学系５１および第２撮像素子５２を含む。第２光学系５１は、流路１０における細胞３０の移動方向に関して第２位置にある細胞３０から到達した光を第２撮像素子５２の受光面へ導く。第２撮像素子５２は、第２光学系５１と光学的に接続されており、受光面に到達した光を受光して細胞３０を撮像する（第２撮像ステップ）。第２位置は、第１位置より下流にある。

【0026】

第２光学系５１は、制御装置６０から与えられるフォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される。そのフォーカス調整後に第２撮像素子５２は細胞３０を撮像することで、フォーカスの合った細胞３０の鮮明な画像を取得することができる。第２撮像素子５２による撮像動作は、制御装置６０から与えられるカメラトリガ信号が指示するタイミングで行われてもよいし、一定のフレームレートで連続して行われてもよい。

【0027】

制御装置６０は、第１撮像装置４０の第１撮像素子４２と電気的に接続され、第２撮像装置５０の第２光学系５１および第２撮像素子５２と電気的に接続されている。制御装置６０は、第１撮像素子４２による撮像により得られた画像を入力し、その画像を解析することで、流路１０の断面における細胞３０の通過位置を求める。そして、制御装置６０は、その求めた通過位置に基づいてフォーカス調整信号を生成し、そのフォーカス調整信号を第２光学系５１に与える（フォーカス調整指示ステップ）。また、制御装置６０は、第２撮像素子５２による撮像のタイミングを指示するカメラトリガ信号を第２撮像素子５２に与える。

【0028】

制御装置６０は、プロセッサであるＣＰＵ（Central ProcessingUnit）、記憶媒体であるＲＡＭ（Random Access Memory）又はＲＯＭ（Read Only Memory）、キーボードまたはマウス等の入力部、液晶ディスプレイ等の表示部、及び入出力モジュールを含んで構成された汎用のコンピュータであってもよい。制御装置６０は、例えばマイコンまたはＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）等を用いて専用機として構成されてもよい。

【0029】

解析装置７０は、第２撮像装置５０の第２撮像素子５２と電気的に接続されている。解析装置７０は、第２撮像素子５２による撮像により得られた画像を入力し、その画像を解析することで、その画像の細胞３０の種類を識別する。解析装置７０は、プロセッサであるＣＰＵ、記憶媒体であるＲＡＭ又はＲＯＭ、キーボードまたはマウス等の入力部、液晶ディスプレイ等の表示部、及び入出力モジュールを含んで構成された汎用のコンピュータであってもよい。

【0030】

流路１０は、例えばガラス等の透明な材料からなるパイプ構造を有し、その内部に流体２０とともに細胞３０を流す。流体２０は例えば細胞培養液である。撮像位置（第１位置、第２位置）において、流路１０の壁面は平面であるのが好ましく、また、流路１０の断面形状が長方形（正方形を含む。）であるのが好ましい。このようにすることで、細胞に関して歪みの小さい画像を取得することができる。

【0031】

流路１０に流体２０を流す場合、層流（Laminar flow）条件にて流体２０を流すのが好ましい。層流条件ではなく乱流条件とすると、培養液などの流体２０の流線が光軸に対して垂直な面内に収まらない場合が多く、したがって、流線に沿って流れる細胞３０は撮像位置（第１位置、第２位置）において光軸方向の位置が異なるので、フォーカス調整の効果が表れにくい。

【0032】

流路１０に流体２０を流す場合、撮像位置（第１位置、第２位置）より上流において、予め流路１０の断面における或る一定領域（例えば中心付近領域）に細胞３０を集束させておくことが好ましい。この集束を実現する方法として、流体力学的集束（Hydrodynamic focusing）、超音波集束（Acousticfocusing）および慣性集束（Inertial focusing）などが知られている。このような方法により細胞３０を予め流路１０の中心付近に集束させておくことで、フォーカスずれ量をある一定の幅（Δｄ）に制限することができる。

【0033】

本実施形態の細胞観察方法は、上記の第１撮像装置４０および第２撮像装置５０を用いて、流路１０を流体２０とともに移動する細胞３０を観察するものである。

【0034】

第１撮像ステップにおいて、第１光学系４１および第１撮像素子４２を含む第１撮像装置４０を用いて、流路１０における細胞３０の移動方向に関して第１位置にある細胞３０から第１光学系４１を経て第１撮像素子４２に到達した光を第１撮像素子４２により受光して細胞を撮像する。この撮像により得られた画像データは制御装置６０へ送られる。

【0035】

第２撮像ステップにおいて、フォーカス調整信号に基づいてフォーカスが調整される第２光学系５１および第２撮像素子５２を含む第２撮像装置５０を用いて、第１位置より下流の第２位置にある細胞３０から第２光学系５１を経て第２撮像素子５２に到達した光を第２撮像素子５２により受光して細胞を撮像する。この撮像により得られた細胞の画像は、解析装置７０により解析されて細胞の種類が識別され、また、表示部に表示される。

【0036】

第１撮像ステップの後であって第２撮像ステップの前のフォーカス調整指示ステップにおいて、制御装置６０により、第１撮像装置４０の第１撮像素子４２による撮像により得られた画像に基づいて、流路１０の断面における細胞３０の通過位置を求める。そして、その求めた通過位置に基づいてフォーカス調整信号を生成して第２撮像装置５０の第２光学系５１に与える。

【0037】

図２は、流路１０の構造の一例を示す図である。この構造は、流体力学的集束効果を利用して流路１０において流体２０を層流として流すものである。撮像位置（第１位置、第２位置）より上流において、流路１０の中にノズル１１が挿入されている。ノズル１１から細胞懸濁液（サンプル液）が流路１０に供給され、ノズル１１を中心とした同心円管からシース液が流路１０に供給される。サンプル液およびシース液それぞれに与える圧力により流量を調整することができ、サンプル液に含まれる細胞３０を流路１０の中心付近に集束させることができる。サンプル液の流量をＱsaとし、シース液の流量をＱshとすると、集束幅Δｄは２液の流量比（Ｑsh／Ｑsa）に依存する。また、細胞３０の平均流速Ｖは、２液の流路によって決まり、流路断面積をＳとすると、Ｖ＝（Ｑsh＋Ｑsa）／Ｓ で表される。例えば、Ｑsh＝３０μＬ／min、Ｑsa＝２μＬ／min、Ｓ＝０.２５^２ｍｍ^２ とすると、平均流速Ｖは８.５ｍｍ／ｓとなる。

【0038】

ノズル１１から供給される前の初期の細胞懸濁液濃度は、一般的に１ｘ１０^６個／ｍＬである。この場合の体積分率は約０.１％であり、細胞懸濁液中における細胞３０の存在は極めて疎である。したがって、流路１０の中央付近に細胞３０を集束させて、局所的に細胞濃度を高めても、細胞３０の相互間の間隔は、細胞３０の大きさ（一般的に１０μｍ程度）に比べて十分に大きい。図３は、細胞３０の相互間の間隔Ｌのヒストグラムの例である。このヒストグラムは、流体力学的集束効果を利用して上記の流速および細胞懸濁液濃度の条件とした場合のものである。この例では、細胞３０の相互間の平均間隔は３２０μｍである。

【0039】

図４は、撮像装置１００Ａの構成を示す図である。撮像装置１００Ａは、透過照明光学系を有する構成であり、第１撮像装置４０として用いられ得る。撮像装置１００Ａは、対物レンズ１１１および結像レンズ１１２を含む結像光学系１１０、撮像素子１２０、光源１３０、ならびに照射光学系１４０を備える。

【0040】

光源１３０は、細胞３０に照射すべき光を出力するものである。光源１３０はレーザ光源（例えばＨｅＮｅレーザ光源）であってもよい。照射光学系１４０は、光源１３０と光学系に接続されており、光源１３０から出力された光を流路１０内の細胞３０に照射する。照射光学系１４０は、ビーム形成光学系として、流路１０における細胞３０の移動方向に対して垂直方向に長いビーム断面を有するライン状の光を細胞３０に照射するのが、光のエネルギー効率の点で好適である。また、ライン状の光を細胞３０に照射する場合には、撮像素子１２０としてリニアアレイセンサを用いることができ、そのリニアアレイセンサの露光時間を短縮することができるので、より速く流れる細胞３０についても鮮明な画像を取得することができる。

【0041】

照射光学系１４０は、ライン状の光を細胞３０に照射する為に、集光レンズ、シングルモード光ファイバ、コリメータレンズおよびシリンドリカルレンズを含む構成とすることができる。この場合、光源１３０から出力された光は、集光レンズにより光ファイバの入射端に集光され、光ファイバにより導光される。導光された光は、光ファイバの出射端から出射され、その出射端に設けられたコリメータレンズにより平行光とされる。その後、その平行光は、シリンドリカルレンズにより１軸方向のみに集光されることにより、細胞集束付近にてライン状ビームに形成される。

【0042】

結像光学系１１０は、第１撮像装置４０の第１光学系４１に相当し、対物レンズ１１１および結像レンズ１１２を含む。対物レンズ１１１および結像レンズ１１２は、細胞３０からの光を撮像素子１２０の受光面へ導く。例えば、対物レンズ１１１の倍率は２０倍であり、対物レンズ１１１のＮＡは０.４５であり、結像レンズ１１２の焦点距離は２００ｍｍである。対物レンズ１１１の光軸方向の位置を調整し、流路１０の中心にフォーカスを合わせておく。結像光学系１１０は固定焦点となる。

【0043】

撮像素子１２０は、第１撮像装置４０の第１撮像素子４２に相当する。撮像素子１２０は、リニアアレイセンサであってもよい。例えば、撮像素子１２０としてＢａｓｌｅｒ社製ラインセンサ（型番raL2048-80km）が好適に用いられる。このラインセンサの１画素の大きさは７ｘ７μｍである。撮像素子１２０は、所定のラインレートにて連続的に撮影動作させればよい。

【0044】

制御装置６０は、第１撮像装置４０としての撮像装置１００Ａにより取得された画像に基づいて、フォーカスずれ量（流路１０の断面における基準位置に対する細胞３０の通過位置の偏位量）を、次のようにして求める。制御装置６０は、ラインセンサである撮像素子１２０から次々出力される１次元画像を、その順に並べることで二次元画像を作成する。例えばＭ個の１次元画像（１行Ｎ列）をＭ個並べることで、二次元画像（Ｍ行Ｎ列）を得ることができる。撮像素子１２０から１次元画像の出力が続く限り二次元画像の画素数は多くなっていく一方であるが、ＦＩＦＯ（First-in first-out）メモリを用いることで、古い画像データを消去して、一定画素数の直近の二次元画像を記憶しておくことができる。

【0045】

制御装置６０は、その二次元画像中に所望の細胞を示す部分画像があるか否かを検知し、その細胞を示す部分画像を切り出す。これに際しては、各画素の輝度が閾値を超えるか否かに基づいて、所望の細胞を示す部分画像があるか否かを検知する。そして、その細胞を示す部分画像を含む矩形画像を切り出す。

【0046】

制御装置６０は、位相差オートフォーカス技術、像面位相差フォーカス技術またはデジタルホログラフィを用いるオートフォーカス技術により、この矩形画像に基づいて、結像光学系１１０のフォーカス面（撮像素子１２０の受光面に対する共役面）からの細胞３０のずれ量ΔＺを求める。この矩形画像はずれ量ΔＺに応じてボケたものとなるので、ボケ量からずれ量ΔＺを求めることができる（非特許文献１参照）。ずれ量ΔＺは正負の値を取り得る。制御装置６０は、このずれ量ΔＺに基づいてフォーカス調整信号を生成し、そのフォーカス調整信号を第２撮像装置５０の第２光学系５１に与える。

【0047】

制御装置６０は、細胞の通過位置（ずれ量ΔＺ）に基づいて第２光学系５１のフォーカスを調整すべきであるか否かを判断し、第２光学系５１のフォーカスを調整すべきであると判断した場合にフォーカス調整信号を第２撮像装置５０に与えることとしてもよい。例えば、第２光学系５１の焦点深度が大きく、ずれ量ΔＺが小さい場合、制御装置６０はフォーカス調整信号を第２撮像装置５０に与えなくてもよい。また、今回撮像しようとする細胞のずれ量ΔＺが前回撮像した細胞のずれ量と同じであれば、第２光学系５１のフォーカス位置を動かす必要がないので、制御装置６０はフォーカス調整信号を第２撮像装置５０に与えなくてもよい。

【0048】

第２撮像装置５０も、撮像装置１００Ａと略同様の構成を有することができる。ただし、第２撮像装置５０として撮像装置１００Ａが用いられる場合、照射光学系１４０は細胞３０に対して光をライン状ではなく面状に照射するのが好適であり、撮像素子１２０は２次元アレイセンサであるのが好適である。また、結像光学系１１０は、制御装置６０から与えられるフォーカス調整信号を受けて、フォーカスを調整することができる。このとき、ずれ量ΔＺに応じて対物レンズ１１１を光軸方向に移動させるのが好適である。これにより、結像光学系１１０が合焦し、フォーカスの合った鮮明な細胞３０の画像が撮像素子１２０により取得される。

【0049】

第２撮像装置５０として撮像装置１００Ａが用いられる場合、撮像素子１２０は、結像光学系１１０のフォーカス調整動作と関係なく、一定のフレームレートで連続して撮像を行ってもよい。また、撮像素子１２０は、制御装置６０から与えられるカメラトリガ信号が指示するタイミングで撮像を行ってもよい。

【0050】

図５は、制御装置６０から与えられるカメラトリガ信号が指示するタイミングで撮像素子１２０が撮像を行う場合のタイミングチャートである。第１撮像装置４０が細胞を撮像する第１位置と、第２撮像装置５０が細胞を撮像する第２位置と、の間の細胞移動方向に沿った間隔をＬとする。細胞の平均流速をＶとする。第１撮像装置４０および第２撮像装置５０それぞれによる撮像の時間差Ｔｄは、Ｔｄ＝Ｌ／Ｖ で表される。第１撮像装置４０において撮像および画像データの送出に要する時間をＴａとする。制御装置６０において画像データに基づいてずれ量ΔＺを算出してフォーカス調整信号を生成するのに要する時間（フォーカスずれ量の測定に要する時間）をＴｂとする。制御装置６０は、第１撮像装置４０が細胞を撮像した時刻から時間（Ｔａ＋Ｔｂ）だけ経過した後にフォーカス調整信号を第２撮像装置５０へ出力する。また、制御装置６０は、第２撮像装置５０の第２光学系５１がフォーカス調整に要する時間Ｔｃを勘案して、フォーカス調整信号を出力した時刻から時間（Ｔｄ－Ｔａ－Ｔｂ）だけ経過した後にカメラトリガ信号を第２撮像装置５０へ出力する。これらのパラメータの間に、Ｔａ＋Ｔｂ＋Ｔｃ＜Ｔｄ なる関係がある。

【0051】

第１撮像装置４０および第２撮像装置５０それぞれは、図４に示された透過照明光学系を有する構成の他、様々な構成とすることができる。第１撮像装置４０および第２撮像装置５０それぞれは、落射照明光学系を有する構成であってもよい。第１撮像装置４０は、マッハツェンダ干渉計またはマイケルソン干渉計等の干渉光学系を有する構成（例えば定量位相顕微鏡（非特許文献２参照））であってもよい。第２撮像装置５０は、定量位相顕微鏡または位相トモグラフィック顕微鏡（非特許文献３参照）であってもよい。第１撮像装置４０は定量位相顕微鏡であって、第２撮像装置５０は位相トモグラフィック顕微鏡であってもよい。以下では、撮像装置１００Ａの変形例として、落射照明光学系を有する撮像装置１００Ｂ（図６）、干渉光学系を有する撮像装置１００Ｃ（図７）、および、結像光学系において結像レンズとしてセパレータレンズを有する撮像装置１００Ｄ（図８）、それぞれについて説明する。

【0052】

図６は、撮像装置１００Ｂの構成を示す図である。撮像装置１００Ｂは、落射照明光学系を有する構成であり、対物レンズ１１１および結像レンズ１１２を含む結像光学系１１０、撮像素子１２０、光源１３０、ならびに照射光学系１４０を備え、更にミラー１５１およびビームスプリッタ１５２を備える。

【0053】

ミラー１５１は、光源１３０から出力され照射光学系１４０によりビーム形成された光をビームスプリッタ１５２へ反射させる。ビームスプリッタ１５２は、対物レンズ１１１と結像レンズ１１２との間の光路上に設けられている。ビームスプリッタ１５２は、ミラー１５１から到達した光の一部を反射させて対物レンズ１１１へ入射させるとともに、対物レンズ１１１から到達した光の一部を透過させて結像レンズ１１２へ入射させる。この場合、細胞の暗視野照明像を取得することができる。

【0054】

ビームスプリッタ１５２に替えて、励起光を反射させ蛍光を透過させるダイクロイックミラーが設けられてもよい。光源１３０は励起光を出力し、励起光が照射された細胞から蛍光が発生する。ダイクロイックミラーは、ミラー１５１から到達した励起光を反射させて対物レンズ１１１へ入射させるとともに、対物レンズ１１１から到達した蛍光を透過させて結像レンズ１１２へ入射させる。この場合、細胞の蛍光像を取得することができる。

【0055】

図７は、撮像装置１００Ｃの構成を示す図である。撮像装置１００Ｃは、干渉光学系を有する構成であり、対物レンズ１１１および結像レンズ１１２を含む結像光学系１１０、撮像素子１２０、光源１３０、ならびに照射光学系１４０を備え、更にビームスプリッタ１６１、ミラー１６２、ミラー１６３およびビームスプリッタ１６４を備える。

【0056】

ビームスプリッタ１６１は、光源１３０と照射光学系１４０との間の光路上に設けられている。ビームスプリッタ１６１は、光源１３０から出力された光を入力し、その光の一部を反射させ残部を透過させることで、光を２分岐する。照射光学系１４０は、ビームスプリッタ１６１を透過した光を入力する。

【0057】

ビームスプリッタ１６４は、結像レンズ１１２と撮像素子１２０との間の光路上に設けられている。ビームスプリッタ１６４は、結像レンズ１１２から到達した光を入力するとともに、ビームスプリッタ１６１で反射され更にミラー１６２，１６３で反射されて到達した光を入力して、両光を合波して撮像素子１２０へ出力する。

【0058】

ビームスプリッタ１６１からビームスプリッタ１６４に至るまでの光学系は、マッハツェンダ干渉計を構成している。撮像素子１２０は細胞の干渉像を取得することができる。また、ビームスプリッタ１６１からビームスプリッタ１６４に至るまでの二つの光路の間の光路長差を変化させて各光路長差において干渉像を取得し、これら複数の干渉像を解析することで、細胞の位相画像を取得することができる。

【0059】

なお、この図に示される光学系はマッハツェンダ干渉計であるが、マイケルソン干渉計の光学系としてもよい。

【0060】

これまで説明した構成例では、撮像装置１００Ａ，１００Ｂまたは１００Ｃが第１撮像装置４０として用いられる場合、撮像素子１２０は、画素が１次元配列されたリニアアレイセンサであってもよいし、画素が２次元配列された２次元アレイセンサであってもよい。後者の場合、照射光学系１４０から出力される光の断面形状は、ライン状ではなく、円形または四角形等とされる。

【0061】

撮像装置１００Ａ，１００Ｂまたは１００Ｃが第２撮像装置５０として用いられる場合も、撮像素子１２０は、画素が１次元配列されたリニアアレイセンサであってもよいし、画素が２次元配列された２次元アレイセンサであってもよい。前者の場合、照射光学系１４０から出力される光の断面形状は、ライン状であるのが好ましい。

【0062】

また、制御装置６０は、第１撮像装置４０により取得された細胞の画像についてデジタルリフォーカシング処理（非特許文献４～６参照）を行い、フォーカスがあった像に基づいて第２撮像装置５０が撮像を行うべきか否かを判断して、第２撮像装置５０が撮像を行うべきであると判断した場合にカメラトリガ信号を第２撮像装置５０に与えることとしてもよい。

【0063】

オートフォーカス（ＡＦ）の方法として、コントラストＡＦ、位相差ＡＦおよび像面位相差ＡＦがよく知られている（非特許文献７）。これらのうち、コントラストＡＦは、レンズを前後に動かす機械的な駆動を伴うことから、本実施形態において用いるには好適でない。一方、位相差ＡＦおよび像面位相差ＡＦは、レンズの機械的な駆動が不要であり、ずれ量ΔＺ及びその方向（ΔＺの正負）が分かるので、本実施形態において好適に用いることができる。

【0064】

図８に示される構成は、位相差ＡＦによりずれ量ΔＺを求めることができるものである。図８は、撮像装置１００Ｄの構成を示す図である。撮像装置１００Ｄは、図４に示された透過照明光学系を有する構成の撮像装置１００Ａと比較すると、結像光学系１１０において結像レンズとしてセパレータレンズ１１３を有する点で相違する。この構成の場合、前述したデジタルリフォーカシング処理を行うことができない。したがって、第１撮像装置４０により取得された細胞の画像に基づいて第２撮像装置５０が撮像を行うべきか否かを判断することができず、カメラトリガ信号を第２撮像装置５０に与えることができない。

【0065】

本実施形態では、フォーカシング速度による細胞の流速の制限を緩和して、高速に移動している細胞であっても該細胞の鮮明な（ぼけの小さい）画像を取得することができる。したがって、流路を流れる細胞の検査のスループットを向上させることができる。流路における流体の流れが完全な層流でなく、細胞が空間的にランダムに移動している場合であっても、該細胞の鮮明な（ぼけの小さい）画像を取得することができる。第１撮像装置および第２撮像装置の双方または何れか一方において撮像素子としてラインセンサを用いることができるので、その場合には、第１撮像装置および第２撮像装置の双方において撮像素子として２次元センサを用いる場合と比較して、安価にシステムを構成することができる。

【符号の説明】

【0066】

１…細胞観察システム、１０…流路、２０…流体、３０…細胞、４０…第１撮像装置、４１…第１光学系、４２…第１撮像素子、５０…第２撮像装置、５１…第２光学系、５２…第２撮像素子、６０…制御装置、７０…解析装置、１００Ａ～１００Ｄ…撮像装置、１１０…結像光学系、１１１…対物レンズ、１１２…結像レンズ、１２０…撮像素子、１３０…光源、１４０…照射光学系、１５１…ミラー、１５２…ビームスプリッタ、１６１…ビームスプリッタ、１６２…ミラー、１６３…ミラー、１６４…ビームスプリッタ。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】