知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 株式会社Ｈｙｐｅｒｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-28
(45)【発行日】2023-05-11
(54)【発明の名称】遺伝子導入細胞の免疫応答を回避させるための剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20230501BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230501BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230501BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230501BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230501BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230501BHJP
C12N 15/86 20060101ALN20230501BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20230501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 ZNA
C12N5/10
A61K48/00
A61K45/00
A61P43/00 105
C12N15/63 Z
C12N15/86 Z
C12N15/88 Z
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022104279
(22)【出願日】2022-06-29
【審査請求日】2022-07-19
(31)【優先権主張番号】P 2021215047
(32)【優先日】2021-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522002179
【氏名又は名称】株式会社Ｈｙｐｅｒｉｏｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(74)【代理人】
【識別番号】100168918
【弁理士】
【氏名又は名称】杉江 顕一
(72)【発明者】
【氏名】田村 健一
(72)【発明者】
【氏名】赤平 莉菜
(72)【発明者】
【氏名】嶽北 和宏
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１０１２９３６７（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第１９９６／０３４１０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２１／０２０４２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０２０－１９３２０３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２１／０５０８４８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Nanomedicine, 2021年7月22日，Vol.16, No.19，p.1673-1690
【文献】Pharm. Res., 2013年，Vol.30，p.1642-1651，DOI 10.1007/s11095-013-1009-4
【文献】Bioorganic Chemistry, 2019年，Vol.82，p.178-191，https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2018.02.025
【文献】Organic & Biomolecular Chemistry, 2015年，Issue14，p.4310-4320 (p.1-11)
【文献】The effects of antioxidative additives on electroporation efficacy，Human Gene Therapy, 2011年，Vol.22, No.10，A86
【文献】Advanced Drug Delivery Reviews, 2021年11月8日，Vol.181，114041 (p.1-36)，https://doi.org/10.1016/j.addr.2021.114041
【文献】Biochim. Biophys. Acta., 2010年，Vol.1799 (10-12)，p.775-787，doi:10.1016/j.bbagrm.2010.05.004.
【文献】Int. J. Biomed. Sci., 2017年，Vol.13, No.2，p.48-57
【文献】Stem Cell Research & Therapy, 2013年，Vol.4，15 (p.1-12)
【文献】Mediators of Inflammation, 2012年，Volume 2012, Article ID 416036，p.1-11，doi:10.1155/2012/416036
【文献】FEBS Letters, 2004年，Vol.571，p.50-54，doi:10.1016/j.febslet.2004.06.056
【文献】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2013年，VOL.288, NO.27，pp.19450-19458，DOI 10.1074/jbc.M113.467670
【文献】Biol. Pharm. Bull., 2019年，Vol.42, No.2，p.299-302
【文献】SCIENCE, 1995年，Vol.270，p.286-290，DOI: 10.1126/science.270.5234.286
【文献】Molecular Therapy, 2009年，Vol.17, Supplement 1，S54-S55
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子導入細胞の数を増加させるために用いられる剤であって、ＪＳＨ－２１、ＪＳＨ－２３、ビタミンＥ（ビタミンＣと共に含む態様を除く）、カルシトリオール、ビタミンＤ３、カルシフェジオール、ビタミンＤ２およびビタミンＤからなる群から選択される１または２以上を含むＮＦκＢ核移行阻害剤
を含み、ただしビタミンＥ、カルシトリオール、ビタミンＤ３、カルシフェジオール、ビタミンＤ２およびビタミンＤに関して遺伝子導入試薬に含まれる態様を除く、前記剤。
【請求項2】
細胞が、ヒト細胞である、請求項１に記載の剤。
【請求項3】
ヒト細胞が、ヒト体細胞またはヒト幹細胞である、請求項２に記載の剤。
【請求項4】
ヒト体細胞またはヒト幹細胞が、ヒト多能性幹細胞、ヒト多能性幹細胞由来分化細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト筋芽細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト筋細胞、ヒト血球系細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト神経系細胞、ヒト表皮細胞、ヒト上皮細胞、ヒト内皮細胞、ヒト骨細胞、ヒト軟骨細胞またはヒト脂肪細胞である、請求項３に記載の剤。
【請求項5】
ヒト体細胞またはヒト幹細胞が、ヒト筋芽細胞、ヒト間葉系幹細胞またはヒトＴ細胞である、請求項４に記載の剤。
【請求項6】
導入遺伝子が、一本鎖または二本鎖である、請求項１～５のいずれか一項に記載の剤。
【請求項7】
導入遺伝子とともに投与されることを特徴とする、請求項１～５に記載の剤。
【請求項8】
請求項１～５に記載の剤を投与することを含む、遺伝子導入細胞の産生方法。
【請求項9】
in vitroにおいて遺伝子導入細胞の数を増加させるための方法であって、細胞への遺伝子の導入前または細胞への遺伝子の導入と同時に、
ＪＳＨ－２１、ＪＳＨ－２３、ビタミンＥ（ビタミンＣと共に含む態様を除く）、カルシトリオール、ビタミンＤ３、カルシフェジオール、ビタミンＤ２およびビタミンＤからなる群から選択される１または２以上を含むＮＦκＢ核移行阻害剤、ただしビタミンＥ、カルシトリオール、ビタミンＤ３、カルシフェジオール、ビタミンＤ２およびビタミンＤに関して遺伝子導入試薬に含まれる態様を除く、
を細胞に投与することを含む、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞への遺伝子の導入に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子導入は、細胞に所望の遺伝子を導入する技術であり、遺伝子工学の基礎をなしている。かかる遺伝子導入技術は、遺伝子の機能解析や遺伝子導入作物の作製、さらには遺伝子治療等に応用されている。しかしながら、細胞や組織への遺伝子導入の際には、導入遺伝子自体が引き起こす自然免疫による細胞死が発生することが知られている（非特許文献１）。
【0003】
このような自然免疫による細胞死を回避するため、細胞へのトランスフェクションの際に、導入するメッセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡと称する）をＮ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシチジンなどのさまざまな修飾ヌクレオシドを利用することが行われてきた（非特許文献２）。ここで、導入されたｍＲＮＡは、翻訳の際に、翻訳停止を意味する終始コドンによってタンパク質の生合成を停止する。しかしながら、終始コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡ）のウリジンが、シュードウリジル化されることにより、リボソームが修飾された終始コドンをリードスルーすることが知られている（非特許文献３）。また、生体内に投与されたｍＲＮＡを体内で増幅させる自己増幅型ｍＲＮＡ技術が次世代型のｍＲＮＡ医薬品として脚光を浴びているが、標的細胞におけるＲＤＲＰ媒介のｍＲＮＡ増幅を弱め得ること、修飾ヌクレオシドの効果を最初の１ラウンドの増幅で失われることから、自己増幅型ＲＮＡにおいては、修飾ヌクレオシドの使用が選択肢に入らないことが記載されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Katalin Kariko et al., Mol. Ther. 2008 November; 16 (11): 1833-1840
【文献】Oliwia Andries et al., Journal of Controlled Release 217 (2015) 337-344
【文献】Hironori Adachi, et al., RNA (2020) 26: 1247-1256
【文献】Giulietta Maruggi, et al., Molecular Therapy (2019) 27: 757-772
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、遺伝子導入による免疫応答を回避させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、導入遺伝子自体が引き起こす自然免疫による細胞死が、目的遺伝子が導入された細胞を充分量獲得することを困難にしていることに着目し、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、遺伝子の導入される細胞における自然免疫を抑制することで、自然免疫による細胞死を回避し、遺伝子導入細胞の収量を増加させることができることを見出し、かかる知見に基づき、さらに研究を重ねることで、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は、以下に関するものである。
［１］遺伝子が導入される細胞の、導入遺伝子に対する自然免疫を抑制することにより、遺伝子導入による免疫応答を回避させるための剤。
［２］自然免疫を抑制することが、ＮＦκＢの阻害または自然免疫に関する遺伝子の発現の阻害により行われる、［１］に記載の剤。
［３］ＮＦκＢの阻害が、ＮＦκＢ核移行阻害剤の添加により行われる、［２］に記載の剤。
［４］ＮＦκＢ核移行阻害剤が、ＪＳＨ－２１、ＪＳＨ－２３、ビタミンＥ、カルシトリオール（ビタミンＤ３）、カルシフェジオール、ビタミンＤ２、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ロリプラム、ＳＮ５０またはこれらの誘導体である、［３］に記載の剤。
［５］自然免疫に関する遺伝子が、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ｐ５０、ｐ６５、ＩＲＦ３、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＬＲ、ＭｙＤ８８またはＴＲＩＦである、［２］に記載の剤。
［６］自然免疫に関する遺伝子の発現の阻害が、ｓｉＲＮＡを用いて行われる、［５］に記載の剤。
［１］遺伝子が導入される細胞の、導入遺伝子に対する自然免疫を抑制することにより、遺伝子導入による免疫応答を回避させるための剤。
［２］自然免疫を抑制することが、ＮＦκＢの阻害または自然免疫に関する遺伝子の発現の阻害により行われる、［１］に記載の剤。
［３］ＮＦκＢの阻害が、ＮＦκＢ核移行阻害剤の添加により行われる、［２］に記載の剤。
［４］ＮＦκＢ核移行阻害剤が、ＪＳＨ－２１、ＪＳＨ－２３、ビタミンＥ、カルシトリオール（ビタミンＤ３）、カルシフェジオール、ビタミンＤ２、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ロリプラム、ＳＮ５０またはこれらの誘導体である、［３］に記載の剤。
［５］自然免疫に関する遺伝子が、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ｐ５０、ｐ６５、ＩＲＦ３、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＬＲ、ＭｙＤ８８またはＴＲＩＦである、［２］に記載の剤。
［６］自然免疫に関する遺伝子の発現の阻害が、ｓｉＲＮＡを用いて行われる、［５］に記載の剤。
【0008】
［７］細胞が、ヒト細胞である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の剤。
［８］ヒト細胞が、ヒト筋芽細胞、ヒト間葉系幹細胞またはヒトＴ細胞である、［７］に記載の剤。
［９］導入遺伝子が、一本鎖または二本鎖である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の剤。
［１０］［１］～［６］のいずれか１つに記載の剤を用いて得られた遺伝子導入細胞。
［１１］導入遺伝子およびＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤を投与することにより、遺伝子導入による免疫応答を回避させるための剤。
［１２］in vitroにおいて遺伝子が導入される細胞の、導入遺伝子に対する自然免疫を抑制することを含む、遺伝子導入による免疫応答を回避させる方法。
［８］ヒト細胞が、ヒト筋芽細胞、ヒト間葉系幹細胞またはヒトＴ細胞である、［７］に記載の剤。
［９］導入遺伝子が、一本鎖または二本鎖である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の剤。
［１０］［１］～［６］のいずれか１つに記載の剤を用いて得られた遺伝子導入細胞。
［１１］導入遺伝子およびＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤を投与することにより、遺伝子導入による免疫応答を回避させるための剤。
［１２］in vitroにおいて遺伝子が導入される細胞の、導入遺伝子に対する自然免疫を抑制することを含む、遺伝子導入による免疫応答を回避させる方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明の剤を用いることにより、シュードウリジンなどの修飾ヌクレオシドを用いるよりも、簡便に遺伝子導入細胞による免疫応答を回避することができ、それにより遺伝子導入細胞の収量を増加させることができる。また、本発明の剤を用いることで、簡便に収量を増加させることができるため、充分量の目的遺伝子の遺伝子導入細胞を作製するために要する時間およびコストを削減することができる。さらに、本発明の剤を用いることにより、細胞への導入遺伝子量の許容量が向上するため、導入効率をさらに向上させることができる。
本発明の剤を用いることにより、シュードウリジンなどの修飾ヌクレオシドを用いることなく、遺伝子導入細胞の収量を増加させることができるため、従来修飾ヌクレオシドとしてシュードウリジンを用いた際に必要とされていた終始コドンのリードスルーを防ぐ工夫を省略することができる。また、本発明の剤を用いることにより、自己増幅型ｍＲＮＡ技術のように修飾ヌクレオシドの使用が困難なケースにおいても自然免疫による細胞死を回避できることが期待される。さらに、本発明の剤およびシュードウリジンなどの修飾ヌクレオシドの両方を用いることにより、より強く細胞の自然免疫を抑制することができる。
本発明の剤を用いて得られた細胞は、遺伝子がすでに高確率で導入されており、例えば、体細胞もしくは体性幹細胞から分化、分化転換、リプログラミングなどをした細胞を必要とする対象、または細胞に任意の遺伝子発現性能を付与した細胞を必要とする対象に、本発明の遺伝子導入細胞を投与することができる。または、生体に遺伝子導入する際に併用することで、生体での導入効率の向上や有害事象を回避することが期待できる。
本発明の剤を用いることにより、シュードウリジンなどの修飾ヌクレオシドを用いることなく、遺伝子導入細胞の収量を増加させることができるため、従来修飾ヌクレオシドとしてシュードウリジンを用いた際に必要とされていた終始コドンのリードスルーを防ぐ工夫を省略することができる。また、本発明の剤を用いることにより、自己増幅型ｍＲＮＡ技術のように修飾ヌクレオシドの使用が困難なケースにおいても自然免疫による細胞死を回避できることが期待される。さらに、本発明の剤およびシュードウリジンなどの修飾ヌクレオシドの両方を用いることにより、より強く細胞の自然免疫を抑制することができる。
本発明の剤を用いて得られた細胞は、遺伝子がすでに高確率で導入されており、例えば、体細胞もしくは体性幹細胞から分化、分化転換、リプログラミングなどをした細胞を必要とする対象、または細胞に任意の遺伝子発現性能を付与した細胞を必要とする対象に、本発明の遺伝子導入細胞を投与することができる。または、生体に遺伝子導入する際に併用することで、生体での導入効率の向上や有害事象を回避することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】図１は、本発明の剤を用いてヒト間葉系幹細胞に導入されたＴＥＲＴプラスミドの概略図である。図中、ＥＦ１Ａは、ＥＦ１αプロモーターを、ｈＴＥＲＴは、ヒトＴＥＲＴ遺伝子（配列番号３）を、ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐＡは、シアミンウイルス４０後期ポリＡ付加シグナルを、ｐＵＣ ｏｒｉは、ｐＵＣ複製開始点を、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎは、アンピシリン耐性遺伝子の配列を夫々表す。
【0011】
【0012】
【図6】図６は、ヒト間葉系幹細胞にウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、対照またはカルシトリオールを添加した培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。
【0013】
【図9】図９は、ヒト筋芽細胞にウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、対照またはカルシトリオールを添加した培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。
【0014】
【図12】図１２は、ヒト筋芽細胞にウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡを導入する際に、対照またはＪＳＨ－２３を添加した培養液を用いた場合の、生細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。
【0015】
【図15】図１５は、ヒト間葉系幹細胞にＴＥＲＴプラスミドを導入する際に、対照またはＪＳＨ－２３を添加した培養液を用いた場合の、生細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。
【0016】
【図18】図１８は、ヒト筋芽細胞にＧＦＰウイルスベクターを導入する際に、各混合液（ＧＦＰウイルスベクター：ＭＯＩ０．１、１．５または１０、ポリブレン：０、５または１０、およびカルシトリオールの有無の夫々の組み合わせ）を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。縦軸は、ポリブレンが５μｇ／ｍＬ、ウイルスベクターのＭＯＩが０．１、カルシトリオール無である混合液における細胞数を１としたときの夫々の相対細胞数を示す。
【0017】
【図21】図２１は、本発明の剤を用いてヒト白血病Ｔ細胞に導入されたＧＦＰでタグ付したＣＡＲ－Ｔプラスミドの概略図である。図中、ＣＭＶ（ＣＭＶ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は、ヒトサイトメガロウイルス即時エンハンサー／プロモーターの配列を、Ｋｏｚａｋは、Ｋｏｚａｃ翻訳開始配列を、ＣＤ８－ｌｅａｄｅｒは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８α鎖のリーダーシグナルペプチドの配列を、ＣＤ１９－ｓｃＦＶは、ＣＤ１９抗体由来の単鎖可変フラグメント配列（配列番号１０）を、ＣＤ２８－ｈｉｎｇｅは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ２８のヒンジ領域の配列（配列番号１１）を、ＣＤ２８－ＴＭは、ＣＤ２８の膜貫通領域の配列（配列番号１２）を、ＣＤ２８は、ＣＤ２８細胞内共刺激ドメインの配列（配列番号１３）を、ＣＤ３ｚｅｔａは、Ｔ細胞受容体ＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインの配列を、ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐＡは、シアミンウイルス４０後期ポリＡ付加シグナルを、ＥＧＦＰは、ＥＧＦＰ遺伝子（配列番号１４）を、ＢＧＨ ｐＡは、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを、ｐＵＣ ｏｒｉは、ｐＵＣ複製開始点を、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎは、アンピシリン耐性遺伝子の配列を夫々表す。
【図22】図２２は、ヒト白血病Ｔ細胞にＧＦＰでタグ付けしたＣＡＲ－Ｔプラスミド遺伝子を導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、遺伝子が導入される細胞の、導入遺伝子に対する自然免疫を抑制することにより、遺伝子導入による免疫応答を回避させるための剤およびその方法に関する。
本発明は、遺伝子が導入される細胞の、導入遺伝子に対する自然免疫を抑制することにより、遺伝子導入による免疫応答を回避させるための剤およびその方法に関する。
【0019】
本発明において、自然免疫を抑制することは、遺伝子を導入され得る細胞の自然免疫機能を抑制する、既知の任意の手法を利用することができる。かかる手法としては、これらに限定されるものではないが、自然免疫応答や細胞死に関わる因子の阻害、具体的には、ＮＦκＢの阻害、自然免疫に関する遺伝子の発現を阻害することなどが挙げられる。自然免疫を抑制することは、導入遺伝子および自然免疫機能を抑制する因子を、同時または別々に細胞に投与することによって行ってもよく、具体的には、細胞への遺伝子の導入時に行ってもよく、または遺伝子の導入前の細胞の培養時から行っていてもよい。
ＮＦκＢの阻害は、例えば、ＮＦκＢ阻害剤を用いることによって行われる。ＮＦκＢ阻害剤は、例えば、本発明の剤の構成要素として遺伝子を導入され得る細胞の培養液に添加される。ＮＦκＢ阻害剤としては、ＮＦκＢ核移行阻害剤、ＤＮＡ結合阻害剤、ＩＫＫ阻害剤、ＩＫβ分解阻害剤、ｐ６５アセチル化阻害剤、ＮＦκＢ転写活性阻害剤などが挙げられるが、より高い生存率が確保できるという観点から、ＮＦκＢ核移行阻害剤が好ましい。
ＮＦκＢの阻害は、例えば、ＮＦκＢ阻害剤を用いることによって行われる。ＮＦκＢ阻害剤は、例えば、本発明の剤の構成要素として遺伝子を導入され得る細胞の培養液に添加される。ＮＦκＢ阻害剤としては、ＮＦκＢ核移行阻害剤、ＤＮＡ結合阻害剤、ＩＫＫ阻害剤、ＩＫβ分解阻害剤、ｐ６５アセチル化阻害剤、ＮＦκＢ転写活性阻害剤などが挙げられるが、より高い生存率が確保できるという観点から、ＮＦκＢ核移行阻害剤が好ましい。
【0020】
一態様において、ＮＦκＢ阻害剤として、ＮＦκＢ核移行阻害剤が用いられる。かかる態様において、用いられるＮＦκＢ核移行阻害剤としては、ＪＳＨ－２１、ＪＳＨ－２３、ビタミンＥ、カルシトリオール、ビタミンＤ３、カルシフェジオール、ビタミンＤ２、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ロリプラム、ＳＮ５０といったSubash C Gupta et al., Biochim Biophys Acta. 2010; 1799(10-12): 775-787のTable1に記載されるものおよびこれらの誘導体などが挙げられるが、入手が容易であるという観点から、ＪＳＨ－２３またはカルシトリオールが好ましい。ＮＦκＢ核移行阻害剤が培養液に添加される場合、その濃度は、０．００１～３００μＭであってもよく、好ましくは、０．１～１０μＭである。ＮＦκＢ核移行阻害剤としてＪＳＨ－２３が培養液に添加される場合、その濃度は、０．００１～３００μＭであってもよく、好ましくは、０．１～５０μＭである。ＮＦκＢ核移行阻害剤としてカルシトリオールが培養液に添加される場合、その濃度は、０．００１～１０μＭであってもよく、好ましくは、１μＭである。
【0021】
自然免疫に関する遺伝子の発現の阻害は、任意の既知の方法、例えば、自然免疫に関する遺伝子に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、単鎖ヘアピンＲＮＡ、これらを発現するベクターを用いて行われ、好ましくは、ＲＮＡ干渉を利用した遺伝子サイレンシングによって行われる。ＲＮＡ干渉には、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどが用いられるが、本発明においては、二本鎖であることによる構造安定性並びに短鎖長で合成しやすいという観点から、ｓｉＲＮＡを用いるのが好ましい。本発明において、ＲＮＡ干渉は、例えば、ｓｉＲＮＡなどを、本発明の剤の構成要素として遺伝子を導入される細胞の培養液に添加することによって行われ得る。ｓｉＲＮＡの導入は、製造元の指示に従って行うことができる。ｓｉＲＮＡを培養液に添加する場合、その濃度は、０．１～１００ｎＭであってもよく、好ましくは、５～２０ｎＭである。
また、本発明において、発現の阻害の標的となる遺伝子は、細胞内の自然免疫に関する遺伝子であれば、特に限定されない。かかる遺伝子としては、例えば、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ｐ５０、ｐ６５、ＩＲＦ３、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＬＲ、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦなどが挙げられるが、細胞死を誘発する炎症性サイトカインを特異的に発現阻害するという観点から、ＴＮＦまたはＩＦＮであることが好ましく、ＴＮＦ－αまたはＩＦＮ－αであることがより好ましい。もっとも好ましくは、発現の阻害の標的となる遺伝子は、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－αである。
一態様において、遺伝子導入の免疫応答を回避させることは、in vitroにおける遺伝子導入細胞の収量の増加をもたらす。遺伝子導入細胞の収量の増加は、遺伝子が導入された細胞の数の増加および遺伝子導入効率の増加を含む。また本発明において、遺伝子導入細胞の収量を増加させることは、収量の増加した遺伝子導入細胞を得ることを含む。
また、本発明において、発現の阻害の標的となる遺伝子は、細胞内の自然免疫に関する遺伝子であれば、特に限定されない。かかる遺伝子としては、例えば、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ｐ５０、ｐ６５、ＩＲＦ３、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＬＲ、ＭｙＤ８８、ＴＲＩＦなどが挙げられるが、細胞死を誘発する炎症性サイトカインを特異的に発現阻害するという観点から、ＴＮＦまたはＩＦＮであることが好ましく、ＴＮＦ－αまたはＩＦＮ－αであることがより好ましい。もっとも好ましくは、発現の阻害の標的となる遺伝子は、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－αである。
一態様において、遺伝子導入の免疫応答を回避させることは、in vitroにおける遺伝子導入細胞の収量の増加をもたらす。遺伝子導入細胞の収量の増加は、遺伝子が導入された細胞の数の増加および遺伝子導入効率の増加を含む。また本発明において、遺伝子導入細胞の収量を増加させることは、収量の増加した遺伝子導入細胞を得ることを含む。
【0022】
本発明の剤は、当該技術分野において、遺伝子導入に通常用いることのできる任意の遺伝子の細胞への導入に利用することができる。本発明において、細胞に導入される遺伝子、すなわち、導入遺伝子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。一本鎖の導入遺伝子としては、例えば、ｍＲＮＡやｍｉＲＮＡが挙げられる。二本鎖の導入遺伝子としては、例えば、ウイルスベクターやプラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡが挙げられる。本発明において、導入遺伝子は、特に限定されない。例えば、導入遺伝子として、細胞周期に関わる遺伝子（ＣＤＫファミリー、Ｃｙｃｌｉｎファミリー、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、Ｅ２Ｆおよびそれらの変異体など）、染色体の構造に関連する遺伝子（テロメラーゼ、ＴＥＲＴ、ＺＳＣＡＮ、ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ抗原、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７、Ｒａｓ、Ｒｂ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、レプリカーゼ、Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ２、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓおよびそれらの変異体など）、リプログラミング関連遺伝子（Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、ＡＳＣＬ１、ＰＩＴＸ３、ＮＵＲＲ１、ＬＭＸ１Ａおよびそれらの変異体など）、骨格筋関連遺伝子（ＣＤ５６、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｍｙｆ５、ＭｙｏＤ、Ｍｙｏｍａｋｅｒ、Ｍｙｏｍｉｘｅｒ、Ｍｙｏｓｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ、Ｄｅｓｍｉｎ、Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ、Ｍｙｏｔｉｌｉｎ、Ｌａｍｉｎｉｎ Ａ／Ｃ、ＣＡＶ、ＣＡＰＮ、ＳＧＣＧ、ＴＲＩＭ３２、ＴＣＡＰ、ＦＫＲＰ、ＥＭＤ、ＰＡＢＰ、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＦＣＭＤ、ＰＯＭＥＮＴＩ、Ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＳＥＰＮ１、ＲＹＲＩ、ＭＴＭ、ＴＮＮＴ、ＮＥＢ、ＴＰＭ、ＡＣＴＮ、ＧＮＥ、ＤＹＳＦ、ＣＲＹ ＡＢ、ＡＣＴＡおよびそれらの変異体など）、成長因子に関わる遺伝子（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＢＭＰ、ＰＤＧＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよびそれらのファミリー並びにそれらの変異体など）、転写因子に関わる遺伝子（ＲＵＮＸおよびその変異体を含むＲｕｎｔドメインをはじめ、ヘリックス・ターン・ヘリックス、ヘリックス・ループ・ヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、βシートモチーフおよびそれらの変異体など）、酵素に関わる遺伝子（グルコース－６－ホスファターゼ、ｔ－ＰＡ、コラゲナーゼ、アルグルコシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グリコサミノグリカン分解酵素、β－グルクロニダーゼ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、α－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、およびその変異体など）、膜タンパク質に関わる遺伝子（ネプリライシンを含むＭｏｎｏｔｏｐｉｃをはじめ、Ｐｏｌｙｔｏｐｉｃおよびそれらの変異体など）、キメラ抗原受容体に関わる遺伝子（ＣＡＲおよびその変異体など）、抗体遺伝子（マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、由来を示すサブステムを持たない抗体など）、血液凝固関連因子、血清タンパク質、ホルモン、ワクチン、インターフェロン類、エリスロポエチン類、サイトカイン類、毒素類、融合タンパク質などが挙げられる。本発明において、例えば、上記のような遺伝子を導入することにより、遺伝子が導入された細胞の寿命を長期化するか、または、所望する細胞への分化を促進することができる。
【0023】
本発明において、遺伝子が導入され得る細胞は、当該技術分野において遺伝子導入に通常用いることのできる細胞であれば、特に限定されない。かかる細胞として、例えば、幹細胞（例えば、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来分化細胞、間葉系幹細胞、筋芽細胞、造血幹細胞等）、体細胞（例えば、筋細胞、血球系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞等）、線維芽細胞、神経系細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等）などが挙げられる。本発明において、遺伝子が導入され得る細胞は、当該技術分野において遺伝子導入に通常用いることのできる任意の生物に由来する細胞であってもよい。かかる細胞としては、例えば、哺乳動物に由来する細胞が挙げられる。好ましくは、本発明において、遺伝子が導入され得る細胞は、ヒト由来の細胞である。より好ましくは、本発明において遺伝子が導入され得る細胞は、ヒト間葉系幹細胞、ヒト筋芽細胞、ヒトＴ細胞またはヒト筋細胞などのヒト間葉系幹細胞から分化するヒト細胞である。
【0024】
本発明において、細胞に遺伝子を導入する手法としては、既知の任意の手法を利用して行うことができる。かかる手法として、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ポリブレン法などが挙げられる。
本発明において、リポフェクション法を利用する場合、遺伝子が導入される細胞は、約１，０００～１００，０００細胞／ｃｍ２で播種される。好ましくは、最終的に得られる収量が安定するという観点から、遺伝子が導入される細胞は、約５,０００～２０，０００細胞／ｃｍ２で播種される。遺伝子が導入される細胞が、ヒト間葉系幹細胞またはヒトＴ細胞である場合において、より好ましくは、細胞は、１ｘ１０４細胞／ｃｍ２で播種され、細胞が、ヒト筋芽細胞である場合、より好ましくは、２ｘ１０４細胞／ｃｍ２で播種される。
本発明において、リポフェクション法を利用する場合、遺伝子が導入される細胞は、約１，０００～１００，０００細胞／ｃｍ２で播種される。好ましくは、最終的に得られる収量が安定するという観点から、遺伝子が導入される細胞は、約５,０００～２０，０００細胞／ｃｍ２で播種される。遺伝子が導入される細胞が、ヒト間葉系幹細胞またはヒトＴ細胞である場合において、より好ましくは、細胞は、１ｘ１０４細胞／ｃｍ２で播種され、細胞が、ヒト筋芽細胞である場合、より好ましくは、２ｘ１０４細胞／ｃｍ２で播種される。
【0025】
例えば、リポフェクション法を利用して細胞にｍＲＮＡを導入する場合、ｍＲＮＡは、１～１００ｐｇ／細胞の量となるようにLipofectamine（Thermo Fisher Scientific）などのリポフェクション試薬と混合されて遺伝子が導入される細胞に添加される。好ましくは、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、ｍＲＮＡは、５～２０ｐｇ／細胞の量となるように遺伝子が導入される細胞に添加される。さらに、かかる混合液の添加後は、製造元の指示に従い、細胞を培養することができる。しかしながら、最終的に得られる遺伝子導入細胞の収量が安定するという観点から、遺伝子が導入される細胞が、ヒト間葉系幹細胞またはヒトＴ細胞の場合は約１日間（１８時間）、ヒト筋芽細胞の場合は約２日間（４２時間）培養することが好ましい。
例えば、リポフェクション法を利用して細胞にプラスミドＤＮＡを導入する場合、プラスミドＤＮＡは、１～１００ｐｇ／細胞の量となるようにLipofectamine（Thermo Fisher Scientific）またはViaFect（Promega）またはPEI MAX（Polysciences）などのリポフェクション試薬と混合されて遺伝子が導入される細胞に添加される。好ましくは、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、プラスミドＤＮＡは、５～２０ｐｇ／細胞の量となるように遺伝子が導入される細胞に添加される。
例えば、リポフェクション法を利用して細胞にプラスミドＤＮＡを導入する場合、プラスミドＤＮＡは、１～１００ｐｇ／細胞の量となるようにLipofectamine（Thermo Fisher Scientific）またはViaFect（Promega）またはPEI MAX（Polysciences）などのリポフェクション試薬と混合されて遺伝子が導入される細胞に添加される。好ましくは、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、プラスミドＤＮＡは、５～２０ｐｇ／細胞の量となるように遺伝子が導入される細胞に添加される。
【0026】
本発明において、エレクトロポレーション法を利用する場合、遺伝子が導入される細胞にR buffer（Thermo Fisher Scientific）などのエレクトロポレーション用試薬を添加した細胞溶液は、１ｘ１０６～１ｘ１０８細胞／ｍＬの濃度となるように調製される。好ましくは、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、１ｘ１０６～１ｘ１０７細胞／ｍＬの濃度で調製される。
例えば、エレクトロポレーション法を利用して細胞にプラスミドＤＮＡを導入する場合、プラスミドＤＮＡは、１～１００ｐｇ／細胞の量となるように細胞溶液と混合される。好ましくは、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、プラスミドＤＮＡは、１～５０ｐｇ／細胞の量となるように細胞溶液と混合される。また、例えば、Neon Transfection System（Thermo Fisher Scientific）を使用してエレクトロポレーションを行う場合、Pulse Voltage：９９０～１６５０Ｖ、Pulse Width：１０～４０ｍｓ、Pulse Number：１～３という設定において、最終的な高い導入効率および生存率を達成できる。
例えば、エレクトロポレーション法を利用して細胞にプラスミドＤＮＡを導入する場合、プラスミドＤＮＡは、１～１００ｐｇ／細胞の量となるように細胞溶液と混合される。好ましくは、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、プラスミドＤＮＡは、１～５０ｐｇ／細胞の量となるように細胞溶液と混合される。また、例えば、Neon Transfection System（Thermo Fisher Scientific）を使用してエレクトロポレーションを行う場合、Pulse Voltage：９９０～１６５０Ｖ、Pulse Width：１０～４０ｍｓ、Pulse Number：１～３という設定において、最終的な高い導入効率および生存率を達成できる。
【0027】
本発明において、ポリブレン法を利用する場合、細胞は、約１，０００～１００，０００細胞／ｃｍ２で播種される。好ましくは、最終的に得られる収量が安定するという観点から、約１,０００～２，０００細胞／ｃｍ２で播種される。遺伝子が導入される細胞が、ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞である場合において、より好ましくは、２，０００細胞／ｃｍ２で播種される。
例えば、ポリブレン法を利用して細胞にウイルスベクターを導入する場合、ウイルスベクターは、ＭＯＩ０．１～３０となるように遺伝子が導入される細胞に添加される。好ましくは、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、ウイルスベクターは、ＭＯＩ０．１～１０となるように遺伝子が導入される細胞に添加される。また、ポリブレンは、０～２０μｇ／ｍＬの量となるように遺伝子が導入される細胞に添加されるが、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、好ましくは、０～１０μｇ／ｍＬの量となるようにかかる細胞に添加される。
例えば、ポリブレン法を利用して細胞にウイルスベクターを導入する場合、ウイルスベクターは、ＭＯＩ０．１～３０となるように遺伝子が導入される細胞に添加される。好ましくは、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、ウイルスベクターは、ＭＯＩ０．１～１０となるように遺伝子が導入される細胞に添加される。また、ポリブレンは、０～２０μｇ／ｍＬの量となるように遺伝子が導入される細胞に添加されるが、最終的な導入効率および生存率が高いという観点から、好ましくは、０～１０μｇ／ｍＬの量となるようにかかる細胞に添加される。
【0028】
本発明は、別の側面において、上記の遺伝子導入による免疫応答を回避させるための剤を用いて得られた遺伝子導入細胞に関する。上記のとおり、本発明の剤は、遺伝子が導入される細胞の種類、導入遺伝子の種類を限定することなく、遺伝子が導入される細胞の収量を増加させることができ、本発明の遺伝子導入細胞における、遺伝子および細胞については、上記に列挙した遺伝子および細胞を使用することができる。本発明の遺伝子導入細胞は、例えば、間葉系幹細胞または間葉系幹細胞から分化した細胞を必要とする対象に、１０，０００～１００，０００，０００細胞／ｋｇ体重を投与することができる。
【0029】
本発明は、また別の側面において、導入遺伝子およびＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤を投与することにより、遺伝子導入による免疫応答を回避させるための剤およびその方法に関する。
本発明において、自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、自然免疫に関する遺伝子の発現を阻害する任意の剤であり、これに限定されるものではないが、好ましくは、自然免疫に関する遺伝子に対するｓｉＲＮＡを含む。本発明において、導入遺伝子とＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、同時に投与されてもよく、または個別に投与されてもよい。本発明において、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、細胞に遺伝子を導入する手法の実施時に投与されてもよく、または実施前に予め投与されていてもよい。本発明において、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、これを必要とする対象において、ＮＦκＢ阻害剤が０．０２５～３，０００μｇ／ｋｇ体重の濃度となるように投与されてもよい。ＮＦκＢ阻害剤がＪＳＨ－２３である場合、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、これを必要とする対象において、ＪＳＨ－２３が１～３ｍｇ／ｋｇ体重の濃度となるように投与されてもよい。ＮＦκＢ阻害剤がカルシトリオールである場合、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、これを必要とする対象において、カルシトリオールが１～５，０００ＩＵ／ｋｇ体重の濃度となるように投与されてもよい。本発明において、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、これを必要とする対象において、導入遺伝子が１０～２，０００μｇ／ｋｇ体重の濃度となるように投与されてもよい。
本発明は、さらに別の側面において、遺伝子が導入される細胞の、遺伝子導入による免疫応答を回避させる方法に関する。本発明において自然免疫を抑制させる方法は上記のとおりである。本発明は、in vitroであってもよく、またin vivoであってもよい。一態様において、本発明の方法をin vitroで実施することにより、遺伝子導入細胞の収量が増加される。
本発明において、自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、自然免疫に関する遺伝子の発現を阻害する任意の剤であり、これに限定されるものではないが、好ましくは、自然免疫に関する遺伝子に対するｓｉＲＮＡを含む。本発明において、導入遺伝子とＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、同時に投与されてもよく、または個別に投与されてもよい。本発明において、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、細胞に遺伝子を導入する手法の実施時に投与されてもよく、または実施前に予め投与されていてもよい。本発明において、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、これを必要とする対象において、ＮＦκＢ阻害剤が０．０２５～３，０００μｇ／ｋｇ体重の濃度となるように投与されてもよい。ＮＦκＢ阻害剤がＪＳＨ－２３である場合、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、これを必要とする対象において、ＪＳＨ－２３が１～３ｍｇ／ｋｇ体重の濃度となるように投与されてもよい。ＮＦκＢ阻害剤がカルシトリオールである場合、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、これを必要とする対象において、カルシトリオールが１～５，０００ＩＵ／ｋｇ体重の濃度となるように投与されてもよい。本発明において、導入遺伝子および／またはＮＦκＢ阻害剤または自然免疫に関する遺伝子の発現阻害剤は、これを必要とする対象において、導入遺伝子が１０～２，０００μｇ／ｋｇ体重の濃度となるように投与されてもよい。
本発明は、さらに別の側面において、遺伝子が導入される細胞の、遺伝子導入による免疫応答を回避させる方法に関する。本発明において自然免疫を抑制させる方法は上記のとおりである。本発明は、in vitroであってもよく、またin vivoであってもよい。一態様において、本発明の方法をin vitroで実施することにより、遺伝子導入細胞の収量が増加される。
【実施例】
【0030】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは言うまでもない。
以下の実施例において、試薬・培地・機器などは、次に示すものを用いた。
試薬
・ヒト間葉系幹細胞（ロンザ、製品番号：ＰＴ－２５０１）
・ヒト筋芽細胞（ロンザ、製品番号：ＣＣ－２５８０）
・ヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）（ケー・エー・シー、型番：ＥＣ８８０４２８０３－Ｆ０）
・ウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡ（配列番号１）
・ウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡ（ウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡにおけるウリジンをすべてシュードウリジン（TriLink、製品番号：Ｎ－１０１９－１０）に置換したもの）
・ウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡ（配列番号２）
・ウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡ（ウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡにおけるウリジンをすべてシュードウリジンに置換したもの）
・ＧＦＰウイルスベクター（VectorBuilder、コントロールVector ID：ＶＢ１６０１０９－１０００５）
・ＴＥＲＴプラスミドＤＮＡ（図１に示す）
・ＣＡＲ－ＴプラスミドＤＮＡ（図２１に示す）
・αMEM（ナカライテスク、製品番号：２１４４４－０５）
・MCDB131（GIBCO、製品番号：１０３７２－０１９）
・ＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク、製品番号：３０２６４－８５）
・ウシ胎児血清（以下、血清と称する）（GIBCO、製品番号：２６１４０－０７９）
・ＪＳＨ－２３（abcam、製品番号：ａｂ１４４８２４）
・カルシトリオール（cayman chemical、製品番号：７１８２０）
・OptiMEM（GIBCO、製品番号：３１９８５－０６２）
・Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific、製品番号：１３７７８０７５）
・Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific、製品番号：１１６６８０２７）
・細胞剥離液（GIBCO、製品番号：２６０５－０２８）
・ポリブレン溶液（Vector Builder、製品番号：ＰＬ０００１）
・PureLink（商標）RNA Mini Kit（Thermo Fischer Scientific、製品番号：１２１８３０１８Ａ）
・SuperScript（商標）III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific、製品番号：１８０８００４４）
・ＴＮＦ－αプライマー（フォワード）：ATCAATCGGCCCGACTATCTC（配列番号４）
・ＴＮＦ－αプライマー（リバース）：GCAATGATCCCAAAGTAGACC（配列番号５）
・βアクチンプライマー（フォワード）：AGAAAATCTGGCACCACACC（配列番号６）
・βアクチンプライマー（リバース）：AGAGGCGTACAGGGATAGCA（配列番号７）
・ＩＦＮ－αプライマー（フォワード）：TTCTCTGGGCTGTGATCTGC（配列番号８）
・ＩＦＮ－αプライマー（リバース）：CTGTCCTTCAGGCAGGAGAAA（配列番号９）
・PowerTrack（商標）SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific、製品番号：Ａ４６０１２）
・ｓｉＲＮＡ（ＴＮＦ－α）（Ambion、製品番号：ｓ１４２４７、ｓ１４２４８）
・ｓｉＲＮＡ（ＩＦＮ－α）（Ambion、製品番号：ｓ２２６３４０、ｓ２２６３３７）
・Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Negative Control No.1）（Ambion、製品番号：４３９０８４３）
培地
・基礎培地（ヒト間葉系幹細胞用）：αMEM＋１０％血清
・基礎培地（ヒト筋芽細胞様）：MCDB131＋１０％血清
機器
・ＣＯ２インキュベータ（astec、型番：ＣＰＩ－１６５Ｒ）
・遠心分離機（KUBOTA、型番：５９１１）
・フローサイトメーター（SYSMEX、型番：ＲＦ－５００）
以下の実施例において、試薬・培地・機器などは、次に示すものを用いた。
試薬
・ヒト間葉系幹細胞（ロンザ、製品番号：ＰＴ－２５０１）
・ヒト筋芽細胞（ロンザ、製品番号：ＣＣ－２５８０）
・ヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）（ケー・エー・シー、型番：ＥＣ８８０４２８０３－Ｆ０）
・ウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡ（配列番号１）
・ウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡ（ウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡにおけるウリジンをすべてシュードウリジン（TriLink、製品番号：Ｎ－１０１９－１０）に置換したもの）
・ウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡ（配列番号２）
・ウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡ（ウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡにおけるウリジンをすべてシュードウリジンに置換したもの）
・ＧＦＰウイルスベクター（VectorBuilder、コントロールVector ID：ＶＢ１６０１０９－１０００５）
・ＴＥＲＴプラスミドＤＮＡ（図１に示す）
・ＣＡＲ－ＴプラスミドＤＮＡ（図２１に示す）
・αMEM（ナカライテスク、製品番号：２１４４４－０５）
・MCDB131（GIBCO、製品番号：１０３７２－０１９）
・ＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク、製品番号：３０２６４－８５）
・ウシ胎児血清（以下、血清と称する）（GIBCO、製品番号：２６１４０－０７９）
・ＪＳＨ－２３（abcam、製品番号：ａｂ１４４８２４）
・カルシトリオール（cayman chemical、製品番号：７１８２０）
・OptiMEM（GIBCO、製品番号：３１９８５－０６２）
・Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific、製品番号：１３７７８０７５）
・Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific、製品番号：１１６６８０２７）
・細胞剥離液（GIBCO、製品番号：２６０５－０２８）
・ポリブレン溶液（Vector Builder、製品番号：ＰＬ０００１）
・PureLink（商標）RNA Mini Kit（Thermo Fischer Scientific、製品番号：１２１８３０１８Ａ）
・SuperScript（商標）III Reverse Transcriptase（Thermo Fisher Scientific、製品番号：１８０８００４４）
・ＴＮＦ－αプライマー（フォワード）：ATCAATCGGCCCGACTATCTC（配列番号４）
・ＴＮＦ－αプライマー（リバース）：GCAATGATCCCAAAGTAGACC（配列番号５）
・βアクチンプライマー（フォワード）：AGAAAATCTGGCACCACACC（配列番号６）
・βアクチンプライマー（リバース）：AGAGGCGTACAGGGATAGCA（配列番号７）
・ＩＦＮ－αプライマー（フォワード）：TTCTCTGGGCTGTGATCTGC（配列番号８）
・ＩＦＮ－αプライマー（リバース）：CTGTCCTTCAGGCAGGAGAAA（配列番号９）
・PowerTrack（商標）SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific、製品番号：Ａ４６０１２）
・ｓｉＲＮＡ（ＴＮＦ－α）（Ambion、製品番号：ｓ１４２４７、ｓ１４２４８）
・ｓｉＲＮＡ（ＩＦＮ－α）（Ambion、製品番号：ｓ２２６３４０、ｓ２２６３３７）
・Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Negative Control No.1）（Ambion、製品番号：４３９０８４３）
培地
・基礎培地（ヒト間葉系幹細胞用）：αMEM＋１０％血清
・基礎培地（ヒト筋芽細胞様）：MCDB131＋１０％血清
機器
・ＣＯ２インキュベータ（astec、型番：ＣＰＩ－１６５Ｒ）
・遠心分離機（KUBOTA、型番：５９１１）
・フローサイトメーター（SYSMEX、型番：ＲＦ－５００）
【0031】
例１．ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）およびヒト筋芽細胞（ｈＳＭＭ）へのＧＦＰ ｍＲＮＡ導入におけるＪＳＨ－２３を用いた収量向上
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。ヒト筋芽細胞を、約２０，０００細胞／ｃｍ２となるように別の６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を夫々０．１、１または１０μＭ添加した夫々の細胞についての基礎培地を使用した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した夫々の細胞についての基礎培地を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＧＦＰのｍＲＮＡは、ウリジンを含有するもの、またはウリジンに代えてシュードウリジンを含有するものを用いた。なお、シュードウリジンを含有するものについては、ＪＳＨ－２３を１μＭ添加した夫々の細胞についての基礎培地および、対照としてＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した夫々の細胞についての基礎培地を培養液として用いた。ｍＲＮＡの量はヒト間葉系幹細胞の場合は１０ｐｇ／細胞、ヒト筋芽細胞の場合は５ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。ヒト筋芽細胞を、約２０，０００細胞／ｃｍ２となるように別の６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を夫々０．１、１または１０μＭ添加した夫々の細胞についての基礎培地を使用した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した夫々の細胞についての基礎培地を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＧＦＰのｍＲＮＡは、ウリジンを含有するもの、またはウリジンに代えてシュードウリジンを含有するものを用いた。なお、シュードウリジンを含有するものについては、ＪＳＨ－２３を１μＭ添加した夫々の細胞についての基礎培地および、対照としてＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した夫々の細胞についての基礎培地を培養液として用いた。ｍＲＮＡの量はヒト間葉系幹細胞の場合は１０ｐｇ／細胞、ヒト筋芽細胞の場合は５ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
【0032】
次いで、夫々のリポフェクション溶液を、ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）または、約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。培養後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に夫々置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）、または約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図２～図５に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）、または約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図２～図５に示す。
【0033】
図２は、ヒト間葉系幹細胞にウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。図３は、ヒト間葉系幹細胞にウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。図４は、ヒト筋芽細胞にウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。図５は、ヒト筋芽細胞にウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。各図において縦軸は、対照における細胞数を１としたときの夫々の相対細胞数を示す。図１および図２より、ヒト間葉系幹細胞において、ウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを用いた際は、ＪＳＨ－２３を添加することにより、ＧＦＰ陽性細胞数が増加し、１μＭのＪＳＨ－２３において最も増加することが確認された。試験した条件において、最大７倍以上の収量、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて７倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。またウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを用いた際についても、ＪＳＨ－２３を添加することにより、ＧＦＰ陽性細胞が増加することが確認された。試験した条件において、最大７倍以上の収量を確保することができた。図３および図４より、ヒト筋芽細胞において、ウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡおよびウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡのいずれを用いても、ＪＳＨ－２３を添加することにより、ＧＦＰ陽性細胞数が増加することが確認された。試験した条件において、ウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡにおいては、３倍以上の収量、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて３倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。ウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡにおいては、２倍以上の収量を確保することができた。
【0034】
例２．ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）およびヒト筋芽細胞（ｈＳＭＭ）へのＧＦＰ ｍＲＮＡ導入におけるカルシトリオールを用いた収量向上
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。ヒト筋芽細胞を、約２０，０００細胞／ｃｍ２となるように別の６ウェルプレートに播種した。培養液として、カルシトリオールを１μＭ添加した夫々の細胞についての基礎培地を使用した。対照として、カルシトリオールに代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した夫々の細胞についての基礎培地を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＧＦＰのｍＲＮＡは、ウリジンを含有するもの、またはウリジンに代えてシュードウリジンを含有するものを用いた。ｍＲＮＡの量はヒト間葉系幹細胞の場合は１０ｐｇ／細胞、ヒト筋芽細胞の場合は５ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。ヒト筋芽細胞を、約２０，０００細胞／ｃｍ２となるように別の６ウェルプレートに播種した。培養液として、カルシトリオールを１μＭ添加した夫々の細胞についての基礎培地を使用した。対照として、カルシトリオールに代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した夫々の細胞についての基礎培地を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＧＦＰのｍＲＮＡは、ウリジンを含有するもの、またはウリジンに代えてシュードウリジンを含有するものを用いた。ｍＲＮＡの量はヒト間葉系幹細胞の場合は１０ｐｇ／細胞、ヒト筋芽細胞の場合は５ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
【0035】
次いで、夫々のリポフェクション溶液を、ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）または、約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。培養後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に夫々置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）または、約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図６～図９に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）または、約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図６～図９に示す。
【0036】
図６は、ヒト間葉系幹細胞にウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。図７は、ヒト間葉系幹細胞にウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。図８は、ヒト筋芽細胞にウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。図９は、ヒト筋芽細胞にウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。各図において縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。以上より、ヒト間葉系幹細胞およびヒト筋芽細胞の両方において、ウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡおよびウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡのいずれを用いても、カルシトリオールを添加することにより、ＧＦＰ陽性細胞数が増加することが確認された。試験した条件において、ヒト間葉系幹細胞へのウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡの導入においては、７倍以上の収量、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて７倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。ヒト間葉系幹細胞へのウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡの導入においては、２．７倍以上の収量を確保することができた。また試験した条件において、ヒト筋芽細胞へのウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡの導入においては、５倍以上の収量、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて５倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。ヒト筋芽細胞へのウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＧＦＰ ｍＲＮＡの導入においては、４倍以上の収量を確保することができた。
【0037】
例３．ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）およびヒト筋芽細胞（ｈＳＭＭ）へのＴＥＲＴ ｍＲＮＡ導入におけるＪＳＨ－２３を用いた収量向上
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。ヒト筋芽細胞を、約２０，０００細胞／ｃｍ２となるように別の６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を１μＭ添加した夫々の細胞についての基礎培地を使用した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した夫々の細胞についての基礎培地を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよびＴＥＲＴ ｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＴＥＲＴ ｍＲＮＡは、ウリジンを含有するもの、またはウリジンに代えてシュードウリジンを含有するものを用いた。ｍＲＮＡの量は、ヒト間葉系幹細胞の場合は１０ｐｇ／細胞、ヒト筋芽細胞の場合は５ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。ヒト筋芽細胞を、約２０，０００細胞／ｃｍ２となるように別の６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を１μＭ添加した夫々の細胞についての基礎培地を使用した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した夫々の細胞についての基礎培地を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよびＴＥＲＴ ｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＴＥＲＴ ｍＲＮＡは、ウリジンを含有するもの、またはウリジンに代えてシュードウリジンを含有するものを用いた。ｍＲＮＡの量は、ヒト間葉系幹細胞の場合は１０ｐｇ／細胞、ヒト筋芽細胞の場合は５ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
【0038】
次いで、夫々のリポフェクション溶液を、ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）、または約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。培養後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に夫々置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）、または約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。結果を図１０～図１３に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）（ヒト間葉系幹細胞）、または約２日（４２時間）（ヒト筋芽細胞）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。結果を図１０～図１３に示す。
【0039】
図１０は、ヒト間葉系幹細胞にウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、生細胞数を示すグラフである。図１１は、ヒト間葉系幹細胞にウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、生細胞数を示すグラフである。図１２は、ヒト筋芽細胞にウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、生細胞数を示すグラフである。図１３は、ヒト筋芽細胞にウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、生細胞数を示すグラフである。各図において縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。以上より、ヒト間葉系幹細胞およびヒト筋芽細胞の両方において、ウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡおよびウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡのいずれを用いても、ＪＳＨ－２３を添加することにより、生細胞数が増加することが確認された。試験した条件において、ヒト間葉系幹細胞へのウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡの導入においては、１．５倍以上の細胞、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて１．５倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。ヒト間葉系幹細胞へのウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡの導入においては、１．３倍以上の細胞を確保することができた。また試験した条件において、ヒト筋芽細胞へのウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡの導入においては、７倍以上の細胞、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて７倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。ヒト筋芽細胞へのウリジンに代えてシュードウリジンを含有するＴＥＲＴ ｍＲＮＡの導入においては、５倍以上の細胞を確保することができた。
【0040】
例４．免疫抑制の強化
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）へのＧＦＰ ｍＲＮＡ導入におけるＪＳＨ－２３を用いたＴＮＦ－α発現量の低下
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を１０μＭ添加したαMEM（＋１０％血清）を使用した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加したαMEM（＋１０％血清）を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＧＦＰのｍＲＮＡは、ウリジンに代えてシュードウリジンを含有するものを用いた。ｍＲＮＡの量は１０ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）へのＧＦＰ ｍＲＮＡ導入におけるＪＳＨ－２３を用いたＴＮＦ－α発現量の低下
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を１０μＭ添加したαMEM（＋１０％血清）を使用した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加したαMEM（＋１０％血清）を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＧＦＰのｍＲＮＡは、ウリジンに代えてシュードウリジンを含有するものを用いた。ｍＲＮＡの量は１０ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
【0041】
次いで、夫々のリポフェクション溶液を、ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。培養後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に夫々置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞を、PureLink RNA Mini kitを使用して、製造元のプロトコルに従い、細胞の溶解およびＲＮＡの抽出、精製を行った。
精製したＲＮＡから、SuperScript（商標）III Reverse Transcriptaseを使用して、製造元のプロトコルに従い、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマーならびにPowerTrack（商標）SYBR Green Master Mixを使用して、ｑＰＣＲを行った。測定されたＴＮＦ－αのＣｔ値は、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチンのＣｔ値で正規化した。結果を図１４に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞を、PureLink RNA Mini kitを使用して、製造元のプロトコルに従い、細胞の溶解およびＲＮＡの抽出、精製を行った。
精製したＲＮＡから、SuperScript（商標）III Reverse Transcriptaseを使用して、製造元のプロトコルに従い、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマーならびにPowerTrack（商標）SYBR Green Master Mixを使用して、ｑＰＣＲを行った。測定されたＴＮＦ－αのＣｔ値は、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチンのＣｔ値で正規化した。結果を図１４に示す。
【0042】
図１４は、対照におけるＴＮＦ－αの発現量を１としたときの、シュードウリジンを用いたｍＲＮＡを導入した細胞およびシュードウリジンを用いたｍＲＮＡを、ＪＳＨ－２３を用いて導入した細胞における発現量を示すグラフである。ｍＲＮＡ導入時にシュードウリジンを用いることは、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）の活性化を低減することにより、そのシグナル下流にあるＮＦκＢやＴＮＦ－αの活性化を低減し、細胞死を防ぐことにある。しかしながら、図１４に示されるとおり、シュードウリジンを用いるのみではＴＮＦ－αの発現量は増加している。これに対して、さらにＪＳＨ－２３を用いることにより、シュードウリジンを用いた場合と比べて、よりＴＮＦ－αの発現量が低減されることが確認された。
【0043】
例５．ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）へのＴＥＲＴプラスミド導入におけるＪＳＨ－２３を用いた収量向上
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を１μＭ添加したαMEM（＋１０％血清）を使用した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加したαMEM（＋１０％血清）を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよびＴＥＲＴプラスミドＤＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。プラスミドＤＮＡの量が１０ｐｇ／細胞となるように調製した。
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を１μＭ添加したαMEM（＋１０％血清）を使用した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加したαMEM（＋１０％血清）を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよびＴＥＲＴプラスミドＤＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。プラスミドＤＮＡの量が１０ｐｇ／細胞となるように調製した。
【0044】
次いで、リポフェクション溶液を、ヒト間葉系幹細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した。培養後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に夫々置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。結果を図１５に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。結果を図１５に示す。
【0045】
図１５は、ヒト間葉系幹細胞にＴＥＲＴプラスミドを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、生細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。以上より、ＪＳＨ－２３を添加することにより、生細胞数が増加することが確認された。試験した条件において、１．４倍以上の細胞、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて１．４倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。
【0046】
例６．ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）およびヒト筋芽細胞（ｈＳＭＭ）へのＧＦＰウイルスベクター導入におけるＪＳＨ－２３を用いた収量向上
ヒト間葉系幹細胞を、約２，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。ヒト筋芽細胞を、約２，０００細胞／ｃｍ２となるように別の６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を添加した夫々の細胞についての基礎培地を使用した。ＪＳＨ－２３は、ヒト間葉系幹細胞に用いた培養液には１μＭを、ヒト筋芽細胞に用いた培養液には０．１μＭを添加した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した基礎培地、ヒト間葉系幹細胞の場合はαMEM（＋１０％血清）、ヒト筋芽細胞の場合はMCDB131（＋１０％血清）を培養液として用いた。
ＧＦＰウイルスベクターとポリブレン溶液とを混合し、混合液を調製した。ＧＦＰウイルスベクターの量がＭＯＩ１０に、ポリブレンの量が５μｇ／ｍＬとなるように調製した。
ヒト間葉系幹細胞を、約２，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。ヒト筋芽細胞を、約２，０００細胞／ｃｍ２となるように別の６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を添加した夫々の細胞についての基礎培地を使用した。ＪＳＨ－２３は、ヒト間葉系幹細胞に用いた培養液には１μＭを、ヒト筋芽細胞に用いた培養液には０．１μＭを添加した。対照として、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加した基礎培地、ヒト間葉系幹細胞の場合はαMEM（＋１０％血清）、ヒト筋芽細胞の場合はMCDB131（＋１０％血清）を培養液として用いた。
ＧＦＰウイルスベクターとポリブレン溶液とを混合し、混合液を調製した。ＧＦＰウイルスベクターの量がＭＯＩ１０に、ポリブレンの量が５μｇ／ｍＬとなるように調製した。
【0047】
次いで、上記混合液を、ヒト間葉系幹細胞またはヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて２４時間培養した。培養後、夫々の細胞について、ＧＦＰウイルスベクター、ポリブレンおよびＪＳＨ－２３を含有しない培養液（ウイルス不含培養液）に置換した。
ウイルス不含培養液の添加からから４日後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図１６、図１７に示す。
ウイルス不含培養液の添加からから４日後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図１６、図１７に示す。
【0048】
図１６は、ヒト間葉系幹細胞にＧＦＰウイルスベクターを導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。図１７は、ヒト筋芽細胞にＧＦＰウイルスベクターを導入した際の夫々の培養液における、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。各図の縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。以上より、ヒト間葉系幹細胞およびヒト筋芽細胞の両方において、ＪＳＨ－２３を添加することにより、ＧＦＰ陽性細胞数が増加することが確認された。
【0049】
例７．ヒト筋芽細胞（ｈＳＭＭ）へのＧＦＰウイルスベクター導入におけるカルシトリオールを用いた収量向上
ヒト筋芽細胞を、約２，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、カルシトリオールを１μＭ添加したMCDB131（＋１０％血清）を使用した。対照として、カルシトリオールに代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加したMCDB131（＋１０％血清）を培養液として用いた。
ＧＦＰウイルスベクターとポリブレン溶液とを混合した。ウイルスベクターの量を、ＭＯＩ０．１、５または１０から、ポリブレンの量を、０、５または１０μｇ／ｍＬとなるように夫々混合液を調製した。
次いで、上記混合液を、ヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて２４時間培養した。培養後、ＧＦＰウイルスベクター、ポリブレンおよびＪＳＨ－２３を含有しない培養液（ウイルス不含培養液）に置換した。
ウイルス不含培養液の添加から４日後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図１８に示す。
ヒト筋芽細胞を、約２，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、カルシトリオールを１μＭ添加したMCDB131（＋１０％血清）を使用した。対照として、カルシトリオールに代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加したMCDB131（＋１０％血清）を培養液として用いた。
ＧＦＰウイルスベクターとポリブレン溶液とを混合した。ウイルスベクターの量を、ＭＯＩ０．１、５または１０から、ポリブレンの量を、０、５または１０μｇ／ｍＬとなるように夫々混合液を調製した。
次いで、上記混合液を、ヒト筋芽細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて２４時間培養した。培養後、ＧＦＰウイルスベクター、ポリブレンおよびＪＳＨ－２３を含有しない培養液（ウイルス不含培養液）に置換した。
ウイルス不含培養液の添加から４日後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図１８に示す。
【0050】
図１８は、ヒト筋芽細胞にＧＦＰウイルスベクターを導入する際に、夫々の混合液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。縦軸は、ポリブレンが５μｇ／ｍＬ、ウイルスベクターのＭＯＩが０．１である混合液における細胞数を１としたときの夫々の相対細胞数を示す。以上より、カルシトリオールを添加することにより、ＧＦＰ陽性細胞数が増加することが確認された。いずれの量のウイルスベクターまたはポリブレンについても、カルシトリオールの添加により、ＧＦＰ陽性細胞数が増加することが確認された。トランスダクション条件によっては、約４．５倍増加していた。
【0051】
例８．ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）へのＧＦＰ ｍＲＮＡ導入におけるＪＳＨ－２３を用いた導入遺伝子量の向上
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を１μＭ添加したαMEM（＋１０％血清）またはＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加したαMEM（＋１０％血清）を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ｍＲＮＡの量は１０ｐｇ／細胞または２０ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、ＪＳＨ－２３を１μＭ添加したαMEM（＋１０％血清）またはＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加したαMEM（＋１０％血清）を培養液として用いた。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ｍＲＮＡの量は１０ｐｇ／細胞または２０ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
【0052】
次いで、ｍＲＮＡの量が２０ｐｇ／細胞となるように調製したリポフェクション溶液を、培養液としてＪＳＨ－２３またはＤＭＳＯを添加したαMEM（＋１０％血清）を用いたプレートに夫々添加した。対照として、ｍＲＮＡの量が１０ｐｇ／細胞となるように調製したリポフェクション溶液を、培養液としてＤＭＳＯを添加したαMEM（＋１０％血清）を用いたプレートに添加した。続いてＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に夫々置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図１９に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図１９に示す。
【0053】
図１９は、各条件においてヒト間葉系幹細胞にＧＦＰ ｍＲＮＡを導入した際の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。リポフェクション溶液中のＧＦＰ ｍＲＮＡの量を１０ｐｇ／細胞から２０ｐｇ／細胞に増加させると、ＧＦＰ陽性細胞数が減少するが、ＧＦＰ ｍＲＮＡの量を２０ｐｇ／細胞としても、ＪＳＨ－２３を添加することにより、ＧＦＰ陽性細胞数が増加することが確認された。
一般に、導入遺伝子量を増加させると、死細胞が増加するが、本発明の剤を用いることにより、生存率が高いまま高濃度の遺伝子導入が可能となる。したがって、細胞への遺伝子の導入効率をさらに向上させることができると考えられる。
一般に、導入遺伝子量を増加させると、死細胞が増加するが、本発明の剤を用いることにより、生存率が高いまま高濃度の遺伝子導入が可能となる。したがって、細胞への遺伝子の導入効率をさらに向上させることができると考えられる。
【0054】
例９．ｓｉＲＮＡ（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α）による自然免疫回避
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ｍＲＮＡの量が１０ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液に、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－αのｓｉＲＮＡを５ｎＭとなるように添加した。対照には、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを５ｎＭとなるように添加した。ｓｉＲＮＡを添加したリポフェクション溶液を、夫々製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
ヒト間葉系幹細胞を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。
OptiMEMにLipofectamine RNAiMAXおよび蛍光タンパク質ＧＦＰのｍＲＮＡを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ｍＲＮＡの量が１０ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液に、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－αのｓｉＲＮＡを５ｎＭとなるように添加した。対照には、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを５ｎＭとなるように添加した。ｓｉＲＮＡを添加したリポフェクション溶液を、夫々製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
【0055】
次いで、夫々のリポフェクション溶液を、ヒト間葉系幹細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した。培養後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に夫々置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図２０に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト間葉系幹細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて１８時間培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞剥離液で細胞を剥離し、遠心分離機を用いて６００ｘｇで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図２０に示す。
【0056】
図２０は、ヒト間葉系幹細胞にＧＦＰ ｍＲＮＡを導入する際に、夫々のｓｉＲＮＡを添加したリポフェクション溶液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。以上より、ヒト間葉系幹細胞において、リポフェクションの際にＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－αのｓｉＲＮＡを用いることにより、ＧＦＰ陽性細胞数が増加することが確認された。試験した条件において、１．５倍以上の収量、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて１．５倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。
【0057】
例１０．ヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）へのＣＡＲ－Ｔプラスミド遺伝子導入におけるＪＳＨ－２３を用いた収量向上
ヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、１０％ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。これにＪＳＨ－２３を０．１μＭ添加、あるいは比較のために、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加して用いた。
OptiMEMにLipofectamine 2000およびＧＦＰでタグ付けしたＣＡＲ－Ｔプラスミドを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＣＡＲ－Ｔプラスミドの量は、１ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
ヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として、１０％ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。これにＪＳＨ－２３を０．１μＭ添加、あるいは比較のために、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加して用いた。
OptiMEMにLipofectamine 2000およびＧＦＰでタグ付けしたＣＡＲ－Ｔプラスミドを添加して、リポフェクション溶液を調製した。ＣＡＲ－Ｔプラスミドの量は、１ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
【0058】
次いで、リポフェクション溶液を、ヒト白血病Ｔ細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。培養後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト白血病Ｔ細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞を回収し、遠心分離機を用いて８００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図２２に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト白血病Ｔ細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞を回収し、遠心分離機を用いて８００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。さらに、集めた細胞を、フローサイトメーターを用いて、ＧＦＰの陽性率を測定した。カウントされた細胞数とＧＦＰ陽性率から、ＧＦＰ陽性細胞数の収量を算出した。結果を図２２に示す。
【0059】
図２２は、ヒト白血病Ｔ細胞にＧＦＰでタグ付けしたＣＡＲ－Ｔプラスミド遺伝子を導入する際に、夫々の培養液を用いた場合の、ＧＦＰ陽性細胞数を示すグラフである。縦軸は、対照における細胞数を１としたときの相対細胞数を示す。以上より、ＪＳＨ－２３を添加することにより、ＧＦＰ陽性細胞数が増加することが確認された。試験した条件において、２倍以上の細胞、すなわち、同じ細胞数から開始して、対照に比べて２倍以上の遺伝子導入細胞を確保することができた。
【0060】
例１１．プラスミド遺伝子導入時の免疫抑制の評価
ヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として１０％ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。これにＪＳＨ－２３を０．１μＭ添加、あるいは比較のために、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加して用いた。
OptiMEMにLipofectamine 2000および蛍光タンパク質ＧＦＰでタグ付けしたＣＡＲ―Ｔプラスミドを添加して、リポフェクション溶液を調製した。プラスミドの量は１ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
ヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１）を、約１０，０００細胞／ｃｍ２となるように６ウェルプレートに播種した。培養液として１０％ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。これにＪＳＨ－２３を０．１μＭ添加、あるいは比較のために、ＪＳＨ－２３に代えて、ＤＭＳＯ ０．１％（ｖ／ｖ）を添加して用いた。
OptiMEMにLipofectamine 2000および蛍光タンパク質ＧＦＰでタグ付けしたＣＡＲ―Ｔプラスミドを添加して、リポフェクション溶液を調製した。プラスミドの量は１ｐｇ／細胞となるように調製した。調製したリポフェクション溶液を、製造元の推奨プロトコルに従ってよく混合し、約１５分間室温にて静置した。
【0061】
次いで、リポフェクション溶液を、ヒト白血病Ｔ細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。培養後、リポフェクション溶液を含む培養液を全て除去し、夫々リポフェクション溶液添加前と同じ組成の新たな培養液に置き換えた。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト白血病Ｔ細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞を回収し、遠心分離機を用いて８００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞PureLink RNA Mini kitを使用して、製造元のプロトコルに従い、細胞の溶解およびＲＮＡの抽出・精製を行なった。
精製したＲＮＡから、SuperScript（商標）III Reverse Transcriptaseを使用して、製造元のプロトコルに従い、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマーならびにPowerTrack（商標）SYBR Green Master Mixを使用して、ｑＰＣＲを行った。測定されたＴＮＦ－αのＣｔ値は、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチンのＣｔ値で正規化した。結果を図２３および２４に示す。
さらに６時間後、上記のリポフェクション溶液を新たに調製し、再度ヒト白血病Ｔ細胞を播種したプレートに添加し、ＣＯ２インキュベータで３７℃にて約１日（１８時間）培養した。これらの工程を、遺伝子導入が合計４回となるよう繰り返した。
最後の遺伝子導入から２４時間後に、細胞を回収し、遠心分離機を用いて８００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞を集めた。集めた細胞PureLink RNA Mini kitを使用して、製造元のプロトコルに従い、細胞の溶解およびＲＮＡの抽出・精製を行なった。
精製したＲＮＡから、SuperScript（商標）III Reverse Transcriptaseを使用して、製造元のプロトコルに従い、ｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマーならびにPowerTrack（商標）SYBR Green Master Mixを使用して、ｑＰＣＲを行った。測定されたＴＮＦ－αのＣｔ値は、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチンのＣｔ値で正規化した。結果を図２３および２４に示す。
【0062】
図２３は、ＧＦＰでタグ付したＣＡＲ－Ｔプラスミドを導入した細胞およびＣＡＲ－Ｔプラスミドを、ＪＳＨ－２３を用いて導入した細胞におけるＴＮＦ－αの発現量を示すグラフである。縦軸は、プラスミドを導入しないヒト白血病Ｔ細胞である対照におけるＴＮＦ－αの発現量を１としたときの夫々の相対発現量を示す。図２４は、ＧＦＰでタグ付したＣＡＲ－Ｔプラスミドを導入した細胞およびＣＡＲ－Ｔプラスミドを、ＪＳＨ－２３を用いて導入した細胞におけるＩＦＮ－αの発現量を示すグラフである。縦軸は、プラスミドを導入しないヒト白血病Ｔ細胞である対照におけるＩＦＮ－αの発現量を１としたときの夫々の相対発現量を示す。以上より、ＪＳＨ－２３を用いてＣＡＲ－Ｔプラスミドを導入した場合には、ＪＳＨ－２３を用いずにＣＡＲ－Ｔプラスミドを導入した場合に比べ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α両方の遺伝子の発現量の増加が低減されることが確認された。
【0063】
ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－αは、免疫系の活性の指標であり、それぞれ外来性遺伝子が細胞内に取り込まれた際の免疫応答として発現量が高まる。過剰な免疫応答は細胞死につながるため、免疫応答の抑制は外来遺伝子導入細胞の作製に向けた課題であった。しかしながら、図２３および２４に示されるとおり、ＪＳＨ－２３を用いることにより、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－αの発現量増加の低減、すなわち、免疫応答の抑制が可能となることが見出された。この免疫応答の抑制が、遺伝子導入細胞の収量向上につながると考えられる。
【要約】
【課題】本発明は、遺伝子導入による免疫応答を回避させることを課題とする。
【解決手段】本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、遺伝子の導入される細胞における自然免疫を抑制することで、自然免疫による細胞死を回避し、遺伝子導入細胞の収量を増加させることができることを見出し、かかる知見に基づき、さらに研究を重ねることで、本発明を完成するに至った。
【選択図】図２
【解決手段】本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる中で、遺伝子の導入される細胞における自然免疫を抑制することで、自然免疫による細胞死を回避し、遺伝子導入細胞の収量を増加させることができることを見出し、かかる知見に基づき、さらに研究を重ねることで、本発明を完成するに至った。
【選択図】図２
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】