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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-28
(45)【発行日】2023-05-11
(54)【発明の名称】免疫シナプスを安定化させるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230501BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230501BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230501BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230501BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230501BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20230501BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230501BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230501BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230501BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230501BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K14/705 ZNA
C07K19/00
C12N15/13
C12N15/12
C07K16/18
C12N15/86 Z
C12N5/10
A61P35/00
A61P35/02
A61K35/17
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2022516194
(86)(22)【出願日】2021-07-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-19
(86)【国際出願番号】 KR2021009828
(87)【国際公開番号】W WO2022025638
(87)【国際公開日】2022-02-03
【審査請求日】2022-03-11
(31)【優先権主張番号】10-2020-0094624
(32)【優先日】2020-07-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522096950
【氏名又は名称】ティカロス カンパニー， リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】チェ キョンホ
(72)【発明者】
【氏名】チェ ウンヨン
(72)【発明者】
【氏名】ナム キリ
(72)【発明者】
【氏名】パク ヒョンペ
(72)【発明者】
【氏名】リ ジウン
(72)【発明者】
【氏名】ヨン ヒョラン
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２２－５２１７３８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｎ ５／００－２８
Ｃ０７Ｋ １４／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；（ｂ）細胞外連結部及び膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；
を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）であって、
前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含み、
前記細胞外連結部は、ＣＤ９９由来細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含み、
前記膜通過ドメインは、ＣＤ９９由来膜通過ドメインを含むことを特徴とする、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）。
【請求項2】
前記ＣＤ９９由来膜通過ドメインは、配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項3】
前記ＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号５又は配列番号５のアミノ酸配列のうち、連続する２０～７０個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列で表示されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項4】
前記ＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項5】
前記ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインは、配列番号１３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項6】
前記細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）は、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３エプシロン（ε）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選ばれる細胞内信号伝達ドメイン；及び／又はＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選ばれる共同刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメイン；
を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項7】
前記ＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメインは、配列番号１７又は配列番号１９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項8】
前記抗原結合ドメインは、下記の群から選ばれる抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体：４－１ＢＢ、ＢＣＭＡ、ＢＡＦＦ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡ９、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＣＥＡ、サイクリン、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、ＣＣＬ－ｌ、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＳＰＧ４、ＣＬＤＮ１８、ＣＬＤＮ６、ＣＴＬＡ－４、ｃ－Ｍｅｔ、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ、ｔＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＧ－２、ＥＰＧ－４０、エフリンＢ２、ＥＰＨＡ２、エストロゲン受容体、Ｆｃ受容体、ＦＣＲＬ５、ＦＧＦ２３、ＦＢＰ、ＦＯＬＲ１、ＦＯＬＲ２、ＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ｇｐ１００、ＧＰＣ３、ＧＰＣＲ５Ｄ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ４、ｅｒｂＢダイマー（ｄｉｍｅｒｓ）、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＨＢｓＡｇ、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＬ－２２Ｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＣＯＳ、ＩＧＦ－１受容体、インテグリンαｖβ６、インターフェロン受容体、ＩＦＮγ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１７ＲＡ、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ－３６Ｒ、ｋｄｒ、Ｌ１－ＣＡＭ、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ、ＬＲＲＣ８Ａ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＬＡＧ３、ＭＡＧＥＡｌ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡｌＯ、ＭＳＬＮ、ＣＭＶ、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＡＲＴ－ｌ、ＮＧＦ、ＮＣＡＭ、ＮＲＰ－１、ＮＲＰ－２、胎児性癌抗原、ＰＤ－Ｌ１、ＰＲＡＭＥ、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＳＬＡＭＦ７、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＴＰＢＧ、ＴＡＧ７２、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２及びウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）。
【請求項9】
前記抗原結合断片は、抗体の一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）又はナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）であることを特徴とする、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項10】
抗原結合ドメインのＮ末端に信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項11】
前記信号ペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤ８α信号ペプチドであることを特徴とする、請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項12】
前記キメラ抗原受容体は、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１又は配列番号３３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項13】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。
【請求項14】
請求項１３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項15】
請求項１４に記載の発現ベクターを含むウイルス。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を表面に発現させる免疫細胞。
【請求項17】
前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又は大食細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の免疫細胞。
【請求項18】
請求項１７に記載の免疫細胞を含む癌治療用組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫シナプス安定化に参入するＣＤ９９部位を、キメラ抗原受容体のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として用いる、新しいキメラ抗原受容体、これを含む免疫細胞及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫細胞を用いた抗癌治療法の開発は、Ｔ細胞を中心に発展しており、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の体外培養及び増殖が可能になりながら、抗癌Ｔ細胞治療法も可視的な成果を上げている（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；６（５）：３８３－９３）。しかしながら、患者の体内に存在する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数は非常に少ないため、これらのＴ細胞を体外増殖させて十分のＴ細胞を確保するまでには１ケ月以上の長い期間がかかるという不具合があった。
そこで、治療用抗体分野で蓄積された組換え抗体作製技術に基づき、癌細胞表面に発現する腫瘍抗原を認知する組換え抗体と、Ｔ細胞活性化を誘導する信号伝達ドメインとを連結したキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）遺伝子をＴ細胞に導入することによって短い期間で腫瘍特異的Ｔ細胞を多量確保する技術を開発しており、これらのＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と名付けられた（Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；５（１２）：９２８－４０；Ｒｅｓｔｉｆｏ ＮＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１２（４）：２６９－８１）。
ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤は、特に、血液腫瘍を対象にした臨床試験において劇的な効果を示すことから注目し始められた。すなわち、Ｂリンパ球系血液腫瘍抗原であるＣＤ１９を認知する抗体を用いたＣＡＲ－Ｔ細胞治療では、既存のいかなる治療にも不応した急性リンパ球性白血病患者を対象にした初期臨床試験において９０％の患者（３０名中の２７人）が１ケ月以内に完全寛解をなし、６ケ月全体生存率が７８％に達する、驚くべき治療効果を示した（Ｍａｕｄｅ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１４；３７１（１６）：１５０７－１７．）。このような結果に基づき、２０１７年末に２種のＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤がＦＤＡ承認下に商業化に成功した。
現在ＣＡＲ－Ｔ細胞治療の成功事例は、ＣＤ１９陽性急性白血病に限定されており、固形腫瘍ではその治療効率が劣ると報告されている。その理由の一部は、固形腫瘍が免疫抑制力を保有した腫瘍微細環境をより強固に構築したためと理解される（Ｓｐｒｉｎｇｕｅｌ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１９；３３（５）：５１５－３７）。一例として、ＣＤ１９陽性血液腫瘍も、腫瘍細胞が主に血液中に増殖する白血病に比べて、固形腫瘍を形成するリンパ腫において、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療効率が遥かに劣ることが知られている（Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１７；５４５（７６５５）：４２３－３１）。このため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能をより向上させる努力が切実な状況である（Ｍａｒｄｉａｎａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１９；１１（４９５））。
ＣＡＲタンパク質は、癌抗原を認知する抗体の可変領域（一本鎖可変断片；ｓｃＦｖ）がバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を介して細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）に連結された形態でデザインされている（Ｄｏｔｔｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４；２５７（１）：１０７－２６）。細胞内信号伝達ドメインは、主に、Ｔ細胞受容体の信号伝達サブユニットであるＣＤ３ゼータ（ζ）鎖の細胞内信号伝達ドメインを基本としており（１世代ＣＡＲ）、ここにＴ細胞の成長及び分化を促進する共同刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の細胞内信号伝達ドメインを追加する形態で進化してきた。
現在までＣＡＲタンパク質の変調（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によってＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を向上させようとする努力が続いており、その大部分は、共同刺激分子の信号伝達ドメインを交替したり追加する形式で行われてきた。例えば、現在市販中の２種のＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤はそれぞれ、ＣＤ２８と４－１ＢＢ共同刺激分子の細胞内信号伝達ドメインを使用しており（２世代ＣＡＲ）、以降、ＣＤ２８と４－１ＢＢ細胞内信号伝達ドメインを同時に含むＣＡＲ（３世代ＣＡＲ）などが試みられている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｇｅｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１５；１４（７）：４９９－５０９）。しかし、相対的に、膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）は、現在までｓｃＦｖと細胞内信号伝達ドメインとを連結する物理的な機能のためにしか用いられておらず、この部位に機能性が与えられたＣＡＲデザインは殆ど報告されたたことがない。
本発明では、ＣＤ９９という膜タンパク質が免疫シナプス安定化という新しい機序によってＴ細胞機能を向上させることを確認し、ＣＤ９９の一部の部位をＣＡＲタンパク質のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として用いることにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を向上させることができることを確認し、これを用いた新しいＣＡＲ－Ｔ細胞治療法を開発した。
本背景技術の部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、よって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知らされている先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
そこで、治療用抗体分野で蓄積された組換え抗体作製技術に基づき、癌細胞表面に発現する腫瘍抗原を認知する組換え抗体と、Ｔ細胞活性化を誘導する信号伝達ドメインとを連結したキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）遺伝子をＴ細胞に導入することによって短い期間で腫瘍特異的Ｔ細胞を多量確保する技術を開発しており、これらのＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と名付けられた（Ｋｅｒｓｈａｗ ＭＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；５（１２）：９２８－４０；Ｒｅｓｔｉｆｏ ＮＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１２（４）：２６９－８１）。
ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤は、特に、血液腫瘍を対象にした臨床試験において劇的な効果を示すことから注目し始められた。すなわち、Ｂリンパ球系血液腫瘍抗原であるＣＤ１９を認知する抗体を用いたＣＡＲ－Ｔ細胞治療では、既存のいかなる治療にも不応した急性リンパ球性白血病患者を対象にした初期臨床試験において９０％の患者（３０名中の２７人）が１ケ月以内に完全寛解をなし、６ケ月全体生存率が７８％に達する、驚くべき治療効果を示した（Ｍａｕｄｅ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１４；３７１（１６）：１５０７－１７．）。このような結果に基づき、２０１７年末に２種のＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤がＦＤＡ承認下に商業化に成功した。
現在ＣＡＲ－Ｔ細胞治療の成功事例は、ＣＤ１９陽性急性白血病に限定されており、固形腫瘍ではその治療効率が劣ると報告されている。その理由の一部は、固形腫瘍が免疫抑制力を保有した腫瘍微細環境をより強固に構築したためと理解される（Ｓｐｒｉｎｇｕｅｌ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１９；３３（５）：５１５－３７）。一例として、ＣＤ１９陽性血液腫瘍も、腫瘍細胞が主に血液中に増殖する白血病に比べて、固形腫瘍を形成するリンパ腫において、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療効率が遥かに劣ることが知られている（Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１７；５４５（７６５５）：４２３－３１）。このため、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能をより向上させる努力が切実な状況である（Ｍａｒｄｉａｎａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１９；１１（４９５））。
ＣＡＲタンパク質は、癌抗原を認知する抗体の可変領域（一本鎖可変断片；ｓｃＦｖ）がバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を介して細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）に連結された形態でデザインされている（Ｄｏｔｔｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４；２５７（１）：１０７－２６）。細胞内信号伝達ドメインは、主に、Ｔ細胞受容体の信号伝達サブユニットであるＣＤ３ゼータ（ζ）鎖の細胞内信号伝達ドメインを基本としており（１世代ＣＡＲ）、ここにＴ細胞の成長及び分化を促進する共同刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の細胞内信号伝達ドメインを追加する形態で進化してきた。
現在までＣＡＲタンパク質の変調（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によってＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を向上させようとする努力が続いており、その大部分は、共同刺激分子の信号伝達ドメインを交替したり追加する形式で行われてきた。例えば、現在市販中の２種のＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤はそれぞれ、ＣＤ２８と４－１ＢＢ共同刺激分子の細胞内信号伝達ドメインを使用しており（２世代ＣＡＲ）、以降、ＣＤ２８と４－１ＢＢ細胞内信号伝達ドメインを同時に含むＣＡＲ（３世代ＣＡＲ）などが試みられている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｇｅｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１５；１４（７）：４９９－５０９）。しかし、相対的に、膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）は、現在までｓｃＦｖと細胞内信号伝達ドメインとを連結する物理的な機能のためにしか用いられておらず、この部位に機能性が与えられたＣＡＲデザインは殆ど報告されたたことがない。
本発明では、ＣＤ９９という膜タンパク質が免疫シナプス安定化という新しい機序によってＴ細胞機能を向上させることを確認し、ＣＤ９９の一部の部位をＣＡＲタンパク質のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として用いることにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を向上させることができることを確認し、これを用いた新しいＣＡＲ－Ｔ細胞治療法を開発した。
本背景技術の部分に記載された前記情報は、単に本発明の背景に関する理解を向上させるためのものであり、よって、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって既に知らされている先行技術を形成する情報を含まなくてもよい。
【発明の概要】
【0003】
本発明の目的は、免疫細胞とターゲット細胞との接触部位に形成される免疫シナプスを安定化させることにより、向上した腫瘍治療効果を示すキメラ抗原受容体及びこれを含む免疫細胞を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含むウイルスを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記免疫細胞を含む癌治療用組成物、前記免疫細胞を用いた癌治療方法、癌治療のための前記免疫細胞の用途、及び癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、ＣＤ９９タンパク質由来膜通過ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、また、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、該発現ベクターを含むウイルス、及び前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を提供する。
本発明は、また、前記免疫細胞を含む癌治療用組成物、前記免疫細胞を用いた癌治療方法、癌治療のための前記免疫細胞の用途、及び癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用を提供する。
本発明の他の目的は、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含むウイルスを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記免疫細胞を含む癌治療用組成物、前記免疫細胞を用いた癌治療方法、癌治療のための前記免疫細胞の用途、及び癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用を提供することにある。
上記の目的を達成するために、本発明は、ＣＤ９９タンパク質由来膜通過ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、また、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、該発現ベクターを含むウイルス、及び前記キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を提供する。
本発明は、また、前記免疫細胞を含む癌治療用組成物、前記免疫細胞を用いた癌治療方法、癌治療のための前記免疫細胞の用途、及び癌治療用薬剤の製造のための前記免疫細胞の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【図1】キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）の模式図である。
【図2】ＣＤ９９欠乏Ｔ細胞のＴＣＲ刺激による活性化障害現象を示すものであり、正常マウス（ＷＴ）とＣＤ９９ノックアウトマウス（ＣＤ９９ＫＯ）リンパ節から分離及びＣＦＳＥ標識されたＣＤ８Ｔ細胞の、ＴＣＲ刺激による分裂能及びサイトカイン分泌能の分析結果を示す図である。図２のＡは、ＴＣＲ刺激後２日目及び３日目に細胞分裂によるＣＦＳＥ希釈率流細胞分析（左側）、及び全体Ｔ細胞のうち、ＣＦＳＥ希釈倍数で測定された各分裂回数別細胞群比率（％）（右側）を示すグラフであり、図２のＢは、ＴＣＲ刺激後に、時間によるＩＬ－２又はＩＦＮ－γ生成ＣＤ８Ｔ細胞比率の分析結果を示すグラフである。ｔ－ｔｅｓｔ分析上、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１．
【図3】ＣＤ９９欠乏Ｔ細胞の免疫シナプス障害を示す図である。図３のＡは、ＷＴ細胞又はＣＤ９９－ＫＯ Ｔ細胞と抗原提示細胞との免疫シナプス形成を比較したものであって、抗ＴＣＲβとＬＦＡ－１抗体で染色されたＴ細胞と抗原提示細胞を共同培養した後、３０分経過時の共焦点顕微鏡イメージ（左側）、及びイメージ上でＴＣＲβとＬＦＡ－１の細胞間接触近接（ｐｒｏｘｉｍａｌ）部位と遠位（ｄｉｓｔａｌ）部位における蛍光強度値の比率（右側）を示しており、図３のＢは、免疫シナプス形成時にＦ－アクチンの共焦点顕微鏡分析結果であって、Ｔ細胞と抗原提示細胞の共同培養後３０分経過時に、ファロイジン染色を用いたＦ－アクチンの顕微鏡イメージ（左側）、及び１視野内で密集したＦ－アクチンを表す細胞の比率（５視野以上の合計測定値）（右側）を示す図である。図３のＣ～Ｇは、免疫シナプス形成時にＦ－アクチン力動的再配列分析（抗ＣＤ３抗体でコートされたカバースリップ上で活性化されたＬｉｆｅ－Ａｃｔ蛍光タンパク質発現ＷＴ又はＣＤ９９－ＫＯ Ｔ細胞の実時間共焦点顕微鏡分析）結果を示す図であり、図３のＣは、時間による細胞内Ｆ－アクチンの分布及び細胞形状の変化、図３のＤは、初期細胞拡張にかかる時間、図３のＥは、時間による細胞の断面積変化を示し、図３のＦ及びＧは、葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）厚さの測定及びアクチンマイクロクラスターの細胞の中心部からの距離計測の例示（図３のＦ）、及び測定された結果値の定量分析（図３Ｇ）を示すものである。ｔ－ｔｅｓｔ分析上、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図4】ＣＤ９９欠乏Ｔ細胞免疫シナプスにおいてアクチン及び微小管ネットワーク（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｎｅｔｗｏｒｋ）形成の障害を示す図である。図４のＡ～Ｄは、正常Ｔ細胞及びＣＤ９９欠乏Ｔ細胞の免疫シナプス形成時にＦ－アクチンと微小管（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）の再配列分析（ＷＴ Ｔ細胞及びＣＤ９９－ＫＯ細胞にＬｉｆｅ－Ａｃｔ蛍光タンパク質を発現させ、ＳｉＲ－チューブリン（ｔｕｂｕｌｉｎ）試薬で染色した後、抗ＣＤ３抗体でコートされたカバースリップ上で活性化したＴ細胞の実時間共焦点顕微鏡分析）結果を示す図であり、図４のＡは、時間によるアクチン（レッド）と微小管（シアンブルー）の分布変化、図４のＢは、シナプス形成初期（５分）と後期（２０分）に１細胞内に存在する垂直型（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）微小管の個数（左側）と長さ（右側）の定量分析結果であり、図４のＣは、細胞内Ｆ－アクチンと微小管の配列比較であって、細胞の横断面に沿って分布するアクチンと微小管の相対的定量比較分析（強度：任意的蛍光強度）であり、黄色区域は、葉状仮足領域を表す。図４のＤは、葉状仮足領域の拡大イメージであって、葉状仮足内の微小管（シアンブルー）とアクチン（レッド）分布イメージ（左側）、及びイメージ上の両蛍光の共局在化（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）係数（Ｐｅａｒｓｏｎｓ’ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）の定量分析（右側）を示す。図４のＥは、チューブリンとアクチンの共同免疫沈殿の結果であって、抗ＣＤ３抗体刺激後にＷＴ及びＣＤ９９－ＫＯ Ｔ細胞において抗チューブリン抗体免疫沈殿物の抗チューブリン抗体及び抗アクチン抗体を用いた免疫ブロッティング（左側）、アイソタイプ対照群ＩｇＧ免疫沈殿物の免疫ブロッティング（中央）、及び免疫沈殿実施前の細胞抽出液の免疫ブロッティング（右側）である。ｔ－ｔｅｓｔ分析上、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図5】正常細胞においてＣＤ９９の免疫シナプス細胞膜における位置と細胞質内のアクチン及び微小管分布との相関成分析結果を示す図である。図５のＡは、免疫シナプス細胞膜においてＣＤ９９の位置確認の結果であって、抗ＴＣＲ抗体と抗ＣＤ９９（上位パネル）、又は抗ＬＡＦ－１抗体と抗ＣＤ９９抗体（下位パネル）で染色されたＴ細胞と抗原提示細胞を共同培養して１時間経過時の、共焦点顕微鏡分析イメージ（左側）及びＣＤ９９とＴＣＲβ又はＣＤ９９とＬＦＡ－１との共局在化定数分析（右側）を示している。図５のＢは、免疫シナプスの形成された細胞においてＣＤ９９とＦ－アクチン及びチューブリンの分布を確認した結果であり、ＷＴ－ＣＤ９９－ＧＦＰを発現させるＴ細胞を、抗ＣＤ３抗体でコートされたカバースリップ上で１５分間活性化した後、ファロイジン（上位パネル）又は抗チューブリン抗体（下位パネル）で染色した共焦点顕微鏡イメージ（左側）と、イメージ内の選択された部位（点線四角）においてＷＴ ＣＤ９９－ＧＦＰタンパク質とＦ－アクチン又はチューブリンとの共局在化係数定量分析（右側）の結果である。図５のＣは、ＣＤ９９とアクチン及びチューブリンの共同免疫沈殿分析の結果であって、ＷＴ Ｔ細胞において抗ＣＤ９９抗体免疫沈殿物の抗アクチンと抗チューブリン抗体を用いた免疫ブロッティング（右側レーン）、対照群ＩｇＧ抗体免疫沈殿物の免疫ブロッティング（中央レーン）、及び免疫沈殿実施前の細胞抽出液（左側レーン）の免疫ブロッティング結果である。ｔ－ｔｅｓｔ分析上、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図6】ＣＤ９９タンパク質のアクチン及び微小管との相互作用部位を確認した結果を示す図である。図６のＡは、各ＣＤ９９変異タンパク質の構造デザイン模式図であり、細胞質ドメインミュータント（Ｃｙｔ）、膜通過ドメインミュータント（ＴＭ）、膜通過一部交替ミュータント（ＴＭｒｓｔ－Ｓ、ＴＭｒｓｔ－Ｌ）、及び細胞質領域のうち膜近接領域だけが存在するミュータント（ＣｙｔＪｕｘｔ）の模式図である。図６のＢは、各ＣＤ９９変異タンパク質－ＧＦＰを発現させるＴ細胞の免疫シナプス形成時のＦ－アクチンと微小管の分布であって、Ｌｉｆｅ－Ａｃｔ蛍光タンパク質と各変異タンパク質－ＧＦＰを発現させるＴ細胞をＳｉＲ－チューブリン試薬で染色した後、抗ＣＤ３抗体がコートされたカバースリップで活性化させて１５分経過後の共焦点顕微鏡分析結果であり、単一蛍光及び二重蛍光（ＣＤ９９／チューブリン；チューブリン／Ｆ－アクチン）と細胞形状（ＤＩＣ）イメージである。
【図7】ＣＤ９９バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）ベースのＣＡＲ－Ｔ細胞デザイン及び試験管内活性検証結果を示す図である。図７のＡは、各ＣＡＲタンパク質の構造デザイン模式図であって、ｈＣＤ８Ｌ：ヒトＣＤ８αリーダー、αＣＤ１９ｓｃＦｖ：抗ＣＤ１９抗体（クローンＦＭＣ６３）一本鎖可変断片、ＥＣ：細胞外領域、ＥＣ５８：細胞外５８アミノ酸領域、ＥＣ４５：細胞外４５アミノ酸領域、ＥＣ３５：細胞外３５アミノ酸領域、ＴＭ：膜通過領域、ｊＴＭ：膜近接領域，ｃｙｔ：細胞質領域である。図７のＢは、ＣＡＲ－Ｔ細胞表面のＣＡＲタンパク質の発現度（グラフ上の上位数字：ＣＡＲ陽性細胞の比率（％）、グラフ上の下位数字（ＭＦＩ，ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ；ＣＡＲ陽性細胞の平均蛍光強度）を示す図であり、図７のＣは、各ＣＡＲ－Ｔ細胞のＲａｊｉ－Ｌｕｃリンパ腫細胞に対する殺傷力（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ：ＣＡＲ－Ｔ細胞と一晩中培養後に生存したＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞内のルシフェラーゼ活性値；Ｅ：Ｔ比（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：Ｔａｒｇｅｔ ｒａｔｉｏ）：共同培養されたＣＡＲ－Ｔ細胞（エフェクター）とＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（ターゲット）の細胞数比率）を示すグラフであり、図７のＤは、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ細胞との共同培養後、上清液に分泌されたＩＦＮ－γの量を示すグラフである。
【図8】ＣＤ９９バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）ベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内腫瘍除去増進効果を示す図である。図８のＡ、図８のＢは、ＮＳＧマウスにＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞を静脈注射した後（ｄａｙ ０）、７日目にＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈注射した時、ＣＡＲ－Ｔ細胞注入前（ｄａｙ ６）及び注入後（ｄａｙ １４～９８）の腫瘍細胞の体内増殖度を生物発光画像法（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）で測定した各時間別代表イメージ（図８のＡ）と定量的計測値（図８のＢ）を示す図であり、図８のＣは、前記Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞が接種されたマウスの時間別生存率を示すグラフである。
【図9】ＣＤ９９バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）ベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫シナプス形成増進効果を示す図である。図９のＡ、図９のＢは、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ細胞の共同培養時に免疫シナプスを形成した細胞の共焦点顕微鏡イメージ（１時間経過時）（図９のＡ）、及び時間による定量的推移（１視野当たりに存在するＲａｊｉ細胞中の、Ｔ細胞と結合したＲａｊｉ細胞の比率、３～５視野の合計測定値）（図９のＢ）を示す図である。図９のＣは、Ｒａｊｉ細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞結合体の代表的イメージ（１時間経過時）を示すものであり、図９のＤは、一つのＲａｊｉ細胞に結合するＣＡＲ－Ｔ細胞の平均数字（１時間経過時）を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【0005】
特に断りのない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練したた専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。
ＣＤ９９は、Ｔ細胞をはじめとする種々の細胞群で発現する膜タンパク質であって、細胞間接着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、細胞の移動（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、タンパク質の細胞内移動（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）などに関与するものと知らされてきた（Ｐａｓｅｌｌｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ．２０１８；１２（１）：５５－６８））。Ｔ細胞では共同刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）としてＴ細胞活性化を促進する役割を有することが報告され（Ｏｈ ＫＩ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００７；３９（２）：１７６－８４）、また、ＭＨＣ Ｉ、ＴＣＲなどの細胞膜タンパク質の細胞表面発現を促進することが報告された（Ｓｏｈｎ ＨＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６６（２）：７８７－９４）。このようなＴ細胞活性化過程の機序により、ＣＤ９９が脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ）に移動してＴ細胞内部のアクチン細胞骨格再配列（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を調節する可能性が提示されたが、その具体的な分子機序は研究されたことがない（Ｙｏｏｎ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００３；５４０（１－３）：２１７－２２）。
Ｔ細胞は、樹状細胞のような抗原提示細胞と接触すると、抗原提示細胞の提示するペプチド抗原をＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）から認知し、ＴＣＲ信号を内部に伝達して活性化される。このとき、Ｔ細胞の細胞膜部位は抗原提示細胞の細胞膜部位と強い接触を相当期間持続するが、この接触部位を免疫シナプス（ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｎａｐｓｅ）と通称している（Ｇｒａｋｏｕｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８５（５４２５）：２２１－７）。免疫シナプスの形成は、Ｔ細胞活性化信号伝達に重要な役割を担い、免疫シナプスの形成にはＴ細胞内部のアクチン細胞骨格再配列（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が必須であることがよく知られている（Ｄｕｓｔｉｎ ＭＬ，Ｃｏｏｐｅｒ ＪＡ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１（１）：２３－９）。また、最近ではアクチンの他に微小管細胞骨格も免疫シナプスに関与することが知られたが、その相互関係については明確に研究されたことがない（Ｍａｒｔｉｎ－Ｃｏｆｒｅｃｅｓ ＮＢ，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｄｒｉｄ Ｆ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：１１７４；Ｄｏｇｔｅｒｏｍ Ｍ，Ｋｏｅｎｄｅｒｉｎｋ ＧＨ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１９；２０（１）：３８－５４）。
本発明では、ＣＤ９９が免疫シナプス形成に重要な役割を担い、これは、ＣＤ９９が細胞内部の細胞骨格再配列を媒介するためであることを証明した。また、具体的な機序として、ＣＤ９９がアクチン細胞骨格と既存にあまり研究されていない微小管細胞骨格とをつなぐブリッジ分子として作用することを究明した。
また、ＣＤ９９分子の膜通過ドメインと細胞内膜近接ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）がそれぞれ、微小管とアクチンとの結合に独立した役割を果たしていることを究明した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、ＣＡＲタンパク質の抗体部位を用いて腫瘍細胞表面の抗原に接触すると、正常Ｔ細胞と抗原提示細胞とが接触する時と類似の免疫シナプスが形成されることが知られており、免疫シナプスの形成がＣＡＲ－Ｔ細胞の活性に関連していることが報告された（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１８；１１５（９）：Ｅ２０６８－Ｅ７６）。したがって、免疫シナプス形成が促進されるＣＡＲタンパク質デザインは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を大きく増加させることができる。
ＣＤ９９が細胞骨格再配列と免疫シナプス形成において重要な役割を担うという実験結果に基づき、現ＣＡＲタンパク質の構造のうち、膜通過ドメインを含むＣＡＲバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を、ＣＤ９９の膜通過ドメインを含む構造に置換する場合に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能が向上するかどうかテストした。その結果、ＣＤ９９の一部の細胞外ドメイン、膜通過ドメイン、細胞内膜近接ドメインを含むＣＡＲタンパク質を発現したＣＡＲ－Ｔ細胞が、既存ＣＤ８タンパク質部位を用いたＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて抜群の腫瘍治療効率を示すことを確認した。また、ＣＤ９９由来バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含むＣＡＲ－Ｔ細胞が、既存ＣＤ８バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて抜群の免疫シナプス形成能を保有することが確認された。
結果的に、本発明では、ＣＤ９９部位の移入されたＣＡＲタンパク質を導入することにより、免疫シナプス形成の強化によって機能の向上したＣＡＲ－Ｔ細胞という新しい概念を提示しようとする。
したがって、本発明は、一観点において、
（ａ）抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；
（ｂ）細胞外連結部及び膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；
を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）であって、前記膜通過ドメインは、ＣＤ９９由来膜通過ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）に関する。
本発明において、“バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）”とは、細胞外連結部（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）及び膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含む部位を意味する。
本発明において、“細胞外連結部（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）”とは、抗原結合ドメインと膜通過ドメインとを連結する部位を意味する。
本発明において、前記膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ；ＴＭ）は、ＣＤ９９由来膜通過ドメインの全体又は一部を含むものでよく、前記ＣＤ９９は、配列番号１の配列を有するヒトのＣＤ９９であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
前記配列番号１の配列を有するヒトＣＤ９９は、配列番号２のヌクレオチド配列又はその縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）配列によってコードされてよいが、これに限定されるものではない。
前記配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＣＤ９９において、Ｄ２３～Ｄ１２２番までのアミノ酸配列が、ＣＤ９９の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）であり、Ａ１２３～Ａ１４７までのアミノ酸配列が、ＣＤ９９の膜通過ドメインであり、Ｙ１４８～Ｎ１５８までのアミノ酸配列が、ＣＤ９９の膜近接ドメイン（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）に相当する。
前記“Ｄ２３”のように、アミノ酸の１文字コード（ｏｎｅ－ｌｅｔｔｅｒ ｃｏｄｅ）と数字が結合した表現は、当該数字の位置のアミノ酸残基を意味する。すなわち、Ｄ２３は、２３番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ：Ｄ）であることを意味する。
好ましくは、前記ＣＤ９９由来膜通過ドメインは、配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。前記配列番号３の配列を有するヒトＣＤ９９由来膜通過ドメインは。配列番号４のヌクレオチド配列又はその縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）配列によってコードされてよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記細胞外連結部は、ＣＤ９９由来及び／又はＣＤ８由来細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）、好ましくは、ヒトＣＤ９９由来細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含むことを特徴とし得る。
前記ＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号５で表示されるアミノ酸配列の全部又は一部を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。前記配列番号５の配列を有するヒトＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号６のヌクレオチド配列又はその縮退性配列によってコードされてよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号５又は配列番号５で表示されるアミノ酸配列のうち、連続する２０～７０個、好ましくは３０～６０個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列で表示されることを特徴とし、
より好ましくは、前記ＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
また、本発明において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）をさらに含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記“細胞内膜近接ドメイン”は、キメラ抗原受容体の膜通過ドメインと細胞内信号伝達ドメインとの間に位置することを特徴とし得る。本発明の一実施例において、前記ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインは、アクチンとの相互作用を媒介することによって免疫シナプス形成の安定化に寄与することが確認された。
前記ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインは、ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインの全体又は一部を含むものでよく、好ましくは、配列番号１３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記細胞外連結部は、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）ドメインをさらに含むことを特徴とし得る。
前記ヒンジドメインは、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなり、１～１００個のアミノ酸残基、好ましくは、１０～７０アミノ酸残基を含むことを特徴とし、好ましくは、配列番号１５で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤ８由来ヒンジドメインの全体又は一部を含むものでよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）は、免疫細胞の細胞膜内側、すなわち、細胞質に位置する部分であり、細胞外ドメインに含まれた抗原結合ドメインが標的抗原に結合した時、細胞内に信号を伝達して免疫細胞の免疫反応を活性化させる部位を意味する。
本発明において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３エプシロン（ε）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選ばれる一つ以上の細胞内信号伝達ドメインであることが好ましいが、これに限定されず、より好ましくは、ＣＤ３ゼータ（ζ）であってもよい。本発明に係るＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメインは、配列番号１７又は配列番号１７の配列において１４番目のアミノ酸残基であるグルタミン（Ｑ）がリジン（Ｋ）に置換された配列番号１９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し得るが、これに限定されるものではない。
また、本発明に係る前記細胞内信号伝達ドメインは、さらに共同刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメインを含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。本発明に係る共同刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選ばれる一つ以上の共同刺激ドメインが好ましいが、、これに制限されるものではない。
好ましくは、本発明に係る細胞内信号伝達ドメインは、配列番号１７又は配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメインと、配列番号２１で表示されるアミノ酸配列とを含む４－１ＢＢの共同刺激ドメインを含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
特に、本発明に係るキメラ抗原受容体は、一つ以上の細胞内信号伝達ドメインと、一つ以上の共同刺激ドメインとを含むことを特徴とし得る。
本発明に係るキメラ抗原受容体に一つ以上の細胞内信号伝達ドメインと、一つ以上の共同刺激ドメインとが含まれる場合には、一つ以上の共同刺激ドメインと一つ以上の細胞内信号伝達ドメインとが直列に連結されてよい。この場合、各ドメインは、直接連結されているか、選択的に又は２～１０個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを介して連結されていてよく、好ましくは、このようなリンカー配列としてグリシン－セリン連続配列を挙げることができる。
本発明において、前記キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞の免疫機能促進因子をさらに含むことができ、前記Ｔ細胞の免疫機能促進因子としては、ＩＬ－７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ７）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１又はＣＣＬ１９を挙げることができるが、これに制限されるものではない。Ｔ細胞の免疫機能促進因子と関連してＷＯ２０１６／０５６２２８Ａを参照することができる。
本発明において、前記キメラ抗原受容体は、ＪＡＫ結合モチーフ及びＳＴＡＴ３／５会合モチーフを含むインターロイキン受容体鎖（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈａｉｎ）をさらに含むことができ、例としてＩＬ－２Ｒβを挙げることができるが、これに制限されるものではない。これと関連して、ＷＯ２０１６／１２７２５７Ａを参照することができる。
１世代ＣＡＲでは、癌細胞から特異的に発現する抗原認識部位を含む細胞外ドメイン、膜通過ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインを含み、信号伝達ドメインとしてＣＤ３ζだけを用いたが、癌に対する治療効果がわずかであり、持続時間が短いという問題があった。このような１世代ＣＡＲは、米国登録特許第６，３１９，４９４号に具体的に記載されており、本発明に参照によって組み込まれる。
免疫細胞に対する反応性向上のために、共同刺激ドメイン（ＣＤ２８又はＣＤ１３７／４－１ＢＢ）とＣＤ３ζとを結合した２世代ＣＡＲが製造されたが、１世代ＣＡＲと比較して、体内に残存する含ＣＡＲ免疫細胞の数が顕著に増加した。２世代ＣＡＲは一つの共同刺激ドメインを用いたのに対し、３世代ＣＡＲでは２種類以上の共同刺激ドメインを用いた。生体内ＣＡＲを含む免疫細胞の拡張及び持続性達成のために、共同刺激ドメインを４－１ＢＢ、ＣＤ２８又はＯＸ４０などと結合させることができる。２世代ＣＡＲは米国登録特許第７，７４１，４６５号、第７，４４６，１９０号又は第９，２１２，２２９号に具体的に記載されており、３世代ＣＡＲは米国登録特許第８，８２２，６４７号に具体的に記載されており、本発明に参照によって組み込まれる。
４世代ＣＡＲでは、ＩＬ－１２又はＩＬ－１５のようなサイトカインを暗号化する追加の遺伝子を含み、サイトカインのＣＡＲベースの免疫タンパク質をさらに発現させており、５世代ＣＡＲは、免疫細胞強化のために、インターロイキンレセプター鎖、例えば、ＩＬ－２Ｒβをさらに含む。４世代ＣＡＲは、米国登録特許第１０，３１６，１０２号、５世代ＣＡＲは米国登録特許第１０，３３６，８１０号に具体的に記載されており、本発明に参照によって組み込まれる。
本発明において、前記抗原結合ドメインは、下記の群から選ばれる抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない：
４－１ＢＢ、ＢＣＭＡ（Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＢＡＦＦ（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡ９（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ９，ＣＡＩＸ又はＧ２５０とも知られている。）、ＣＴＡＧ１Ｂ（ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ １Ｂ，ＮＹ－ＥＳＯ－１又はＬＡＧＥ２Ｂとも知られている。）、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、ＣＣＬ－ｌ（Ｃ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ １）、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＳＰＧ４（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ４）、ＣＬＤＮ１８（ｃｌａｕｄｉｎ－１８）、ＣＬＤＮ６、ＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ｃ－Ｍｅｔ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｍｅｔ）、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｔＥＧＦＲ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、ＥＰＧ－２（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ２）、ＥＰＧ－４０（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ４０）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）Ｂ２、ＥＰＨＡ２（ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｆｃ受容体（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＦＣＲＬ５（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｋｅ ５，Ｆｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ ５又はＦＣＲＨ５とも知られている。）、ＦＧＦ２３（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２３）、ＦＢＰ（ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ）、ＦＯＬＲ２（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ）、ＧＤ２（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ２、Ｏ－ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＧＤ２（ＯＧＤ２））、ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）ＧＤ３、ｇｐ１００（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １００）、ｇｌｙｐｉｃａｎ－３（ＧＰＣ３）、ＧＰＣＲ５Ｄ（Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｅｒｂ－Ｂ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ ｄｉｍｅｒｓ、ＨＭＷ－ＭＡＡ（Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＢｓＡｇ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＬＡ－Ａ１（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ１）、ＨＬＡ－Ａ２（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ２）、ＩＬ－２２Ｒａ（ＩＬ－２２ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ）、ＩＬ－１３Ｒａ２（ＩＬ－１３ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ２）、ＩＣＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、ＩＧＦ－１受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）αｖβ６、インターフェロン受容体（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＦＮγ、ＩＬ－２Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－４Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－５Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－６Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－１７ＲＡ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ）、ＩＬ－３１Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－３６Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｋｄｒ（ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｌ１－ＣＡＭ（Ｌ１ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ（ＣＥ７ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＲＲＣ８Ａ（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ Ａ）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＬＡＧ３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）、ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）Ａｌ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡｌＯ、ＭＳＬＮ（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＣＭＶ（ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＭＵＣ１（ｍｕｃｉｎ １）、ＮＫＧ２Ｄ（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｇｒｏｕｐ ２ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ）リガンド（ｌｉｇａｎｄｓ）、ＭＡＲＴ－ｌ（ｍｅｌａｎ Ａ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＮＣＡＭ（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＮＲＰ－１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１）、ＮＲＰ－２（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－２）、胎児性癌抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＲＡＭＥ（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ）、プロゲステロン受容体（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＣＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－Β ｌｉｇａｎｄ）、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＳＬＡＭＦ７（ＳＬＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ７）、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＴＰＢＧ（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，５Ｔ４とも知られている。）、ＴＡＧ７２（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２）、ＴＲＰ１（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １，ＴＹＲＰ１又はｇｐ７５とも知られている。）、ＴＲＰ２（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ、ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｄｅｌｔａ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ又はＤＣＴとも知られている。）、及びウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ １；ＷＴ１）。
本発明において、抗体の“断片”は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）断片などを含む意味で使われる。
“一本鎖Ｆｖ”又は“ｓｃＦｖ”抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成可能にさせるＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
“Ｆｖ”断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインとが、例えば、ｓｃＦｖと強固に事実上共有して連合した二量体からなる。
“Ｆａｂ”断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。“Ｆ（ａｂ’）２”抗体断片は、一般にそれらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端の近傍に共有して連結される一対のＦａｂ断片を含む。
“ナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）”とは、単量体可変抗体ドメイン（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｍａｉｎ）を含有する断片である。主に、単量体重鎖だけで標的特異性を示すラクダなどの抗体ドメインから由来した低分子量の断片からなる。
本発明において、前記抗原結合断片は、抗体の一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）又はナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）であることを特徴とし得る。
本発明において、前記抗原結合ドメインは、好ましくは、抗ＣＤ１９抗体又はそのｓｃＦｖを含むことを特徴とし、前記抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖは、配列番号２３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記抗原結合ドメインのＮ末端部に、さらに信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＳＰ）を含むことを特徴とし得る。本発明において、前記信号ペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、Ｉｇ－ｋａｐｐａ及びＩｇＧ１重鎖からなる群から選ばれる分子から由来することを特徴とし得るが、これに制限されず、好ましくはＣＤ８α信号ペプチドでよく、前記ＣＤ８α信号ペプチドは、配列番号２５で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得る。
好ましい例示として、本発明に係るキメラ抗原受容体は、
配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来細胞外ドメイン；
配列番号３で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来膜通過ドメイン；及び
配列番号１３で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメイン；
を含むことを特徴とする。
また、さらに、
配列番号２１で表示されることを特徴とする４－１ＢＢ共同刺激ドメイン；
配列番号１７又は配列番号１９で表示されることを特徴とするＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメイン；及び／又は
配列番号２５で表示されることを特徴とするＣＤ８信号ペプチドを含むことができるが、これに制限されるものではない。
本発明において、例示的に、ＣＤ１９に対する抗原結合部位を含むキメラ抗原受容体は、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１又は配列番号３３で表示されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するその変異体を含むことができる。
本発明は、他の観点において、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸に関する。
本発明に係るキメラ抗原受容体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）は、コドン最適化によって変形されてよく、これは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に起因するものであって、ポリペプチド又はその変異体断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在するということは、通常の技術者にはよく理解できよう。これらのポリヌクレオチド（核酸）の一部は、任意の自然発生型遺伝子のヌクレオチド配列と最小相同性を保有する。
特に、コドン活用法の相違により、可変的なポリヌクレオチド（核酸）、例えば、ヒト、霊長類及び／又は哺乳動物のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチド（核酸）が好ましい。
本発明において、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸は、
配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
配列番号４で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来膜通過ドメインをコードするヌクレオチド配列；及び
配列番号１４で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインをコードするヌクレオチド配列；
を含み、
さらに、配列番号２２で表示されることを特徴とする４－１ＢＢ共同刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列；
配列番号１８又は配列番号２０で表示されることを特徴とするＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列；及び／又は
配列番号２６で表示されることを特徴とするＣＤ８信号ペプチドをコードするヌクレオチド配列；を含むことができるが、これに限定されるものではない。
好ましくは、配列番号２４で表示されることを特徴とする抗ＣＤ１９抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
好ましい例示として、本発明に係るキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４で表示されるヌクレオチド配列、又は前記ヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する変異体を含むものでよい。
本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含むウイルスに関する。
本発明における用語“ベクター”とは、他の核酸分子を転移させたり或いは輸送できる核酸分子を意味する。転移された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結されるが、例えば、ベクター核酸分子内に挿入される。ベクターは、細胞における自律的複製を指示する配列を含んでもよく、宿主細胞ＤＮＡ内への統合を可能にするのに十分な配列を含んでもよい。。前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選ばれるものであることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記核酸又は前記ベクターは、ウイルス生産細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）に形質注入又はトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）される。“形質注入”又は“トランスフェクション”させるために、原核又は真核宿主細胞内に外因性核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入するために通常用いられる様々な技術、例えば、電気泳動法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション又はリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを用いることができる。
本発明において、ウイルス生産細胞から生産されたウイルスは、免疫細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）される。細胞内に“形質導入”されたウイルスの核酸は、細胞のゲノムに挿入されたり或いは挿入されないまま、キメラ抗原受容体タンパク質を生産するために用いられる。
本発明は、さらに他の観点において、前記キメラ抗原受容体を表面に発現させる免疫細胞に関する。
本発明において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又は大食細胞であることを特徴とし得るが、これに制限されず、好ましくは、Ｔ細胞であることを特徴とし得る。
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）又はＣＡＲ－大食細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であることを特徴とし得る。
本発明において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞；ＣＤ８陽性細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）；ガンマ－デルタＴ細胞；腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）及び末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）から分離したＴ細胞からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
本発明は、さらに他の観点において、前記キメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む癌治療用組成物に関する。
本発明において、“癌”と“腫瘍”は同じ意味で使われ、典型的に、調節されない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態のことを指したり意味する。
本発明のＣＡＲで治療可能な癌は、血管生成された腫瘍の他、血管が生成されないか或いはまだ実質的に血管が生成されていない腫瘍も含む。前記癌は非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば、白血病及びリンパ腫）を含んでもよく、固形腫瘍を含んでもよい。本発明のＣＡＲで治療可能な癌の類型には、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、及び特定白血病又はリンパ性悪性腫瘍、陽性及び悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫及び黒色腫を挙げることができるが、これに制限されない。成人性腫瘍／癌及び小児性腫瘍／癌も含まれる。
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液（又は、造血性）癌の例には、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病及び骨髄芽細胞性、前リンパ球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性リンパ球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（遅延型及び高い段階の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、重鎖疾患、骨髄異形性症候群、毛髪細胞白血病及び骨髄異形性症を含む白血病を挙げることができる。
固形腫瘍は、一般に、皮嚢又は液体区域を含まない異常組織塊りである。固形腫瘍は、陽性又は悪性であり得る。異なる類型の固形腫瘍は、それら（例えば、肉腫、癌腫及びリンパ腫）を形成する細胞の類型に対して名付けられている。肉腫及び癌腫のような固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及びその他肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、直腸癌腫、リンパ性悪性腫瘍、大腸癌、胃癌、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、咽喉頭癌、肝細胞性癌腫、扁平細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、髄質甲状腺癌腫、乳頭状甲状腺癌腫、褐色細胞腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌、髄質癌腫、気管支癌腫、腎臓細胞癌腫、肝腫瘍、胆管癌腫、 絨毛膜癌腫、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ’ ｔｕｍｏｒ）、子宮頸癌、睾丸腫瘍、精上皮腫（ｓｅｍｉｎｏｍａ）、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫及び混合型神経膠腫）、膠芽細胞腫（多形成膠芽細胞腫とも周知されている）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄節芽細胞腫、神経鞘腫頭蓋咽頭腫（Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣細胞腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、松果体腫（ｐｉｎｅａｌｏｍａ）、血管芽細胞腫、聴神経腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏｍａ）、稀突起膠細胞腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、髓膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移）を挙げることができる。
本発明の治療用組成物は、癌の予防又は治療のための組成物であり、本発明の用語、“予防”は、本発明の組成物の投与で癌を抑制させたり進行を遅延させるあらゆる行為を意味し、“治療”とは、癌の発展の抑制、症状の軽減又は除去を意味する。
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞を含む薬学組成物には、薬剤学的に許容される賦形剤がさらに含まれてよい。このような賦形剤の例には、界面活性剤、好ましくはポリソルベート系の非イオン性界面活性剤；中性緩衝塩水、リン酸塩緩衝塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの糖又は糖アルコール類；グリシン、ヒスチジンなどのアミノ酸やタンパク質又はポリペプチド；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、例えば；浸透剤；補助剤；及び保存剤が含まれてよいが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、ヒト以外の哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続又は遅れた放出を提供できるように、当業界に公知の方法を用いて剤形化できる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアゾール、軟質又は硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってよい。
本発明は、さらに他の観点において、前記キメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞を対象体に投与する段階を含む癌治療方法に関する。
本発明は、また、癌治療のための前記免疫細胞の用途に関する。
本発明は、また、癌治療用薬剤製造のための前記免疫細胞の使用に関する。
前記対象体は、腫瘍を持つ哺乳類でよく、具体的にはヒトでよいが、これに限定されるものではない。
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞又はこれを含む組成物は、経口投与、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、静脈内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内投与（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮下投与（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内投与（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、直腸内投与（Ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、鼻内投与（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などで投与されてよいが、これに限定されるものではない。
活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び患者の重症度などの種々の因子によって適宜選択されてよく、本発明に係る治療用組成物は、癌症状を予防、改善又は治療する効果を有する公知の化合物と併用投与できる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：ＣＤ９９由来膜通過タンパク質の機能究明研究
実施例１－１：マウス及び細胞株
ＣＤ９９－ノックアウトマウス（Ｂ６．Ｃｄ９９Ｇｔ（ｐＵ－２１Ｔ）４４Ｉｍｅｇ）は、Ｋｕｍａｍｏｔｏ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓから購入し、Ｈ６０類遺伝子マウス（ｃｏｎｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）（Ｂ６．ＣＨ６０）は、米国Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｒ．Ｄｅｒｒｙ Ｒｏｏｐｅｎｉａｎから提供してもらった。免疫欠乏ＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｒａｊｉリンパ腫細胞は、ＡＴＣＣから購入した。
実施例１－２：ＷＴ、ＣＤ９９－ＫＯマウスＣＤ８ Ｔ細胞株の確立
ＣＤ９９正常（ＷＴ）Ｂ６マウスとＣＤ９９欠乏（ＣＤ９９－ＫＯ）Ｂ６マウスに、Ｂ６．ＣＨ６０マウスから分離した脾臓細胞を、２×１０７ｃｅｌｌｓ／３００μｌずつ腹腔注射した後、３０日目に各マウスから取り出した脾臓細胞（２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と放射線照射（２０００ｒａｄ）したＢ６．ＣＨ６０脾臓細胞（３．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、ヒトＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下に共に培養し、ＷＴとＣＤ９９－ＫＯ Ｈ６０特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させた。これらのＴ細胞を１週の周期で、放射線照射したＢ６．ＣＨ６０脾臓細胞とヒトＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）存在下で共に培養して再活性化を誘導することにより、Ｈ６０特異的正常ＣＤ８Ｔ細胞株とＣＤ９９欠乏ＣＤ８Ｔ細胞株を確立した。
実施例１－３：マウスＣＤ９９正常タンパク質と変異タンパク質発現用レトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）の作製
マウスＣＤ９９正常タンパク質（ＷＴ）及び膜通過ドメイン（ＴＭ）、細胞内信号伝達ドメイン（Ｃｙｔ）変異タンパク質をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで作製して、ｐｃＤＮＡ３－ＹＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３０３３）のＥｃｏＲＩ制限酵素部位にクローニングした。このプラスミドからＣＤ９９－ＹＦＰ ＤＮＡ部分をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ制限酵素で切断して抽出し、ＭＳＣＶ Ｐｕｒｏプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６８４６９）はＸｈｏＩ制限酵素で切断した後、それぞれクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）酵素を処理し、平滑末端クローニング（ｂｌｕｎｔ－ｅｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ）でｐＭＳＣＶ－ＣＤ９９－ＹＦＰ、ｐＭＳＣＶ－ＣＤ９９ＴＭ－ＹＦＰ、ｐＭＳＣＶ－ＣＤ９９Ｃｙｔｏ－ＹＦＰベクターを作製した。各ＣＤ９９タンパク質のアミノ酸配列は、下記の表７に示す。
実施例１－４：ＣＤ９９発現用レトロウイルスの生産及びマウスＴ細胞への形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）
各ＷＴ又は変異ＣＤ９９－ＹＦＰ発現用レトロウイルスプラスミド（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｌａｓｍｉｄ）をポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてレトロウイルスのパッケージング細胞株（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるプラチナム－Ｅ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ）細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）にトランスフェクションした後、２４～４８時間分泌されたレトロウイルスが含まれた培養上清液を収穫しフィルターした（０．４５μｍフィルター）。この培養上清液をポリブレン（４μｇ／ｍｌ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）存在下で、活性化されたＣＤ９９－ＫＯ ＣＤ８Ｔ細胞株に加えてレトロウイルスを形質導入した。次いで、これらの細胞にピューロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ，Ｇｅｏｒｇｉａｃｈｅｍ）を処理し、形質導入された細胞だけを選別させた。その後、ＹＦＰ融合タンパク質を発現させる細胞を流細胞分離器（ＦＡＣＳ－Ａｒｉａ ＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分離して各Ｔ細胞株を確立し、周期的な活性化によって細胞株を維持した。
実施例１－５：Ｔ細胞分裂とサイトカイン生成能確認
正常マウスとＣＤ９９欠乏マウスのリンパ節から得た細胞をＣＦＳＥ（５μＭ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識した後、抗ＣＤ３抗体（１４５－２Ｃ１１、１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）がコートされた９６ウェルプレートに加えた後（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、抗ＣＤ２８抗体（３７．５１、０．５μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と共に培養してＴ細胞を活性化させた。活性化させて２４時間、４８時間、７２時間後に細胞を収穫し、抗ＣＤ８抗体（５３－６．７，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で細胞表面を染色した後、流細胞測定法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳ－ＬＳＲＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＣＤ８Ｔ細胞に染色されたＣＦＳＥの希釈された程度を測定することによって細胞分裂を確認した。
Ｔ細胞のサイトカイン生成能を確認するために、活性化後の各時間帯別に、収穫前４時間にブレフェルジンＡ（３μｇ／ｍｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を処理した細胞を収穫し、パラホルムアルデヒド（４％，ＣｅｌｌＮｅｓｔ）で室温で２０分間固定させた。次いで、トリトン－Ｘ１００（０．５％、Ａｍｒｅｓｃｏ）とＢＳＡ（０．１％、Ｂｏｖｏｇｅｎ）を入れたＰＢＳを加えて、透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した後、抗ＣＤ８抗体、抗ＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＩＦＮ－γ抗体（ＸＭＧ１．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、流細胞測定法により、染色された細胞の分率及び平均蛍光強度を測定した。
実施例１－６：免疫シナプス形成確認のためのＴ細胞共焦点顕微鏡分析
Ｔ細胞と抗原提示細胞間の免疫シナプス形成を観察するために、Ｈ６０抗原を発現させたＤＣ２．４細胞株をＣＭＴＭＲ（１０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）や抗ＩＣＡＭ－１抗体（ＹＮ１／１．７．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、Ｂ６．ＣＨ６０脾臓細胞と混合培養によって活性化されて４日目のＷＴ又はＣＤ９９－ＫＯ ＣＤ８Ｔ細胞株を、抗ＴＣＲβ抗体（Ｈ５７－５９７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＬＦＡ－１抗体（２Ｄ７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）で染色した。その後、両細胞群をそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌずつ混合し、ポリエルリジン（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）のコートされたカバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）上で３０分又は１時間共同培養した。その後、暖かいＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを加えて室温で２０分間固定（ｆｉｘ）した後、カバースリップをガラススライドに移してマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）した。Ｆ－アクチンをイメージング（ｉｍａｇｉｎｇ）しようとする場合、固定後、トリトン－Ｘ１００（０．２５％）を含有したＰＢＳで１０分間透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。その後、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で室温で３０分染色し、ＰＢＳで洗浄した後、ガラススライドに移してマウンティングした。
Ｔ細胞の免疫シナプス断面をイメージングするために、７日間活性化したＴ細胞を分離し、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）のコートされたカバースリップ上で（１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）１５分間培養した後、固定及び透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｚａｔｉｏｎ）を行った。その後、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７と抗α－チューブリン抗体（ＤＭ１Ａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色し、Ｆ－アクチンと微小管ネットワークを観察した。
Ｆ－アクチン及び微小管再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を実時間でイメージングするために、ＷＴ又はＣＤ９９－ＫＯ Ｔ細胞株にＬｉｆｅＡｃｔ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターを電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｍａｘａ）を用いてトランスフェクションし、チューブリン力動性測定のためにＳｉＲ－チューブリンキット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）でチューブリン染色プローブを細胞に浸透させた後、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）がコートされたカバースリップ上で培養しながら、Ｔ細胞が免疫シナプスを作る間のＦ－アクチンと微小管の再配列を毎２０秒ごとに実時間で共焦点顕微鏡を用いて撮影した。全ての顕微鏡撮影は、ＦｌｕｏＶｉｅｗ１０００又はＦｌｕｏＶｉｅｗ３０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用い、イメージ分析は、ＦｌｕｏＶｉｅｗソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ｃｅｌｌＳｅｎｓソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）又はＩｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を用いた。
実施例１－７：免疫沈殿（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）及び免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）
４日間活性化されたＣＤ９９正常又は欠乏Ｔ細胞株を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、生きているＣＴＬだけを収穫し、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃で１５分間培養することによって活性化を誘導した。その後、冷たいＰＢＳで洗浄して刺激を停止させ、細胞を収穫して、ＮＰ－４０（１％、Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）を含有した抽出緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）で４℃で２０分間細胞を溶解させた後、１００μｇの細胞抽出液（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）をタンパク質Ｇセファロースビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄ）（３５μｌ、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）と混ぜて、４℃で１時間前洗浄（ｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇ）を行った。次いで、４℃で抗α－チューブリン抗体、マウスＩｇＧアイソタイプ抗体又は抗ＣＤ９９抗体（ＥＪ２）、ラットＩｇＧアイソタイプ抗体を処理した後、タンパク質Ｇセファロースビーズを用いて免疫沈殿を行った。免疫沈殿物をＳＤＳ－ＰＡＧＥし、ＰＶＤＦ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した後、抗β－アクチン（４Ｃ２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗α－チューブリン、抗ＣＤ９９抗体及び抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ抗体で染色し、Ｗｅｓｔ－Ｆｅｍｔｏ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて発光させた。ＬＡＳ－４０００ｍｉｎｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、当該タンパク質のバンド（ｂａｎｄ）を検出した。
実施例１－８：ＣＡＲ発現用レトロウイルスのベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）の作製
ＣＤ１９標的ＣＤ８バックボーンＣＡＲ（ｈ１９ＢＢｚ）ＯＲＦ ｃＤＮＡは、既存に公開された配列の通り（米国特許２０１３／０２８７７４８Ａ）にＤＮＡ合成を依頼して作製した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＣＤ１９標的ＣＤ９９バックボーンＣＡＲ ＯＲＦ ｃＤＮＡ（Ｆ５８ＢＢｚ、Ｆ４５ＢＢｚ、Ｆ３５ＢＢｚ、Ｆ３５ＢＢｚ－１）は、ＮＣＢＩデータベースのヒトＣＤ９９ ＯＲＦ配列（ＮＭ＿００２４１４．４）からＣＤ９９細胞外ドメイン、膜通過ドメイン及び膜近接ドメインの配列を抜萃し、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ｃｌｏｎｅ ＦＭＣ６３）及びヒト４－１ＢＢ細胞内信号伝達ドメイン、ヒトＣＤ３ゼータ鎖細胞内信号伝達ドメインと、ＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰＣＲを用いて連結して作製した。Ｆ８ＴＪＢＢｚは、ＣＤ１９ｓｃＦｖ及びヒトＣＤ８細胞外ドメインをヒトＣＤ９９膜通過ドメイン及び膜近接ドメイン、ヒト４－１ＢＢ細胞内信号伝達ドメイン、ヒトＣＤ３ゼータ鎖細胞内信号伝達ドメインとＰＣＲを用いて連結して作製した。各ＣＡＲ発現用レトロウイルスのベクターは、ＭＳＣＶ Ｈｕ受容体レトロウイルスプラスミド（ＭＳＣＶ Ｈｕ Ａｃｃｅｐｔｏｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｌａｓｍｉｄ）（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６４２６９）のインサート（ｉｎｓｅｒｔ）を除去した後、各ＣＡＲ ＯＲＦ ｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ制限酵素部位にクローニングして作製した。
本実施例に係るＣＡＲ製造に用いられたドメインの配列情報は、前記表２～表５に記載の通りであり、各ＣＡＲタンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列は、表６及び表８に記載の通りである。
実施例１－９：ＣＡＲ発現用レトロウイルスの生産
各レトロウイルスプラスミドをリポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰｈｏｅｎｉｘ ＥＣＯ細胞株（ＡＴＣＣ）にトランスフェクションした後、２４～４８時間分泌されたエコトロピックレトロウイルス（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）が含まれた培養上清液を、ＰＧ１３レトロウイルスのパッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）に加えてスピン感染（ｓｐｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）した（２５００ｒｐｍ、９０分）。こうにして作製されたＰＧ１３レトロウイルス生産細胞株の培養上清液を収穫しフィルタリング（０．４５μｍフィルター）して細胞残存粒子を除去し、遠心分離型フィルター装置（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ １００ＫＤ ｃｕｔ－ｏｆｆ）を用いて４倍濃縮した後、ＣＡＲ－Ｔ細胞作製のためのレトロウイルス濃縮液として使用した。
実施例１－１０：ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
正常人から白血球成分採血（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）により得られた白血球を、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、１０μｇ／ｍｌ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）がコートされた２４ウェルプレートに、抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、２μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に加えた後、４８時間培養してＴ細胞を活性化させた。活性化されたＴ細胞を２回洗浄した後、レトロウイルス形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）に使用した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ、ＴａＫａＲａ）を４℃で一晩コートした後、洗浄した２４ウェルプレートに２％ ＢＳＡ－ＤＰＢＳを加えて３７℃で３０分間ブロッキング及び洗浄した後、レトロウイルス濃縮液１ｍｌを加えて２０００ｘｇ、３２℃で２時間遠心分離し、レトロウイルスをウェル底面に付着させた。ウイルス濃縮液を除去してウェルを洗浄後、活性化されたＴ細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）１ｍｌをウェルに加え、１０分間の遠心分離（１０００ｘｇ、３２℃）により細胞をレトロウイルスに付着させた。次いで、ヒトＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）存在下で４８時間培養した。このようにレトロウイルス形質導入されたＴ細胞を２回洗浄した後、ヒトＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍｌ）が含まれた新鮮な培養液を加えて３～６日間増殖させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞として使用した。細胞表面のＣＡＲタンパク質の発現は、レトロウイルス形質導入後に３日間増殖されたＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９－Ｃｋタンパク質（ＣＤ１９細胞外部位とヒト免疫グロブリンカッパ鎖定常部位（Ｃｋ）の融合タンパク質）及びＡＰＣの標識された抗Ｃｋ抗体（ａｎｔｉ－Ｃｋ－ＡＰＣ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した後、流細胞測定法（ＦＡＣＳ－Ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。
実施例１－１１：ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ）の作製
ルシフェラーゼを細胞内に人為的に発現させるために、ルシフェラーゼとＧＦＰを同時に発現できるレンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）を作製した。ＥＦ１αプロモータ下に多酵素切断部位（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）を保有すると同時に、ＣＭＶプロモータ下にＧＦＰがクローニングされているビシストロニックレンチウイルスベクター（ｂｉｓｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）（ｐＬＥＣＥ３）（Ｌｅｅ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０２０；１５（１）：ｅ０２２３８１４）の多酵素切断部位に、ｐＧＬ３ベースのプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）から切断して抽出したホタルルシフェラーゼＯＲＦ ｃＤＮＡをクローニングし、ｐＬＥＣＥ３－Ｌｕｃベクターを作製した。ｐＬＥＣＥ３－ｌｕｃプラスミドを３種のレンチウイルスパッケージングプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶｒｅｖ、ｐＭＤ．Ｇ）と共にレンチウイルスパッケージング細胞株（２９３ＦＴ ｃｅｌｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にリポフェクタミン２０００試薬を用いてトランスフェクションし、２４～４８時間後、分泌されたレンチウイルスが含まれた培養上清液を収穫し、遠心分離型フィルター装置を用いて１０倍濃縮した。レンチウイルス濃縮液をＲａｊｉ細胞に加え、ポリブレン（６μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下で、常温で２５００ｒｐｍ、９０分間遠心分離して形質導入した。形質導入されたＲａｊｉ細胞のうち、ＧＦＰ陽性細胞を流細胞分離器（ＦＡＣＳ－Ａｒｉａ ＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分離精製し、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞として使用した。
実施例１－１２：ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷能及び活性化測定
レトロウイルス形質導入して３日間増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞（１．２×１０３～７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）を、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（３×１０４ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）に様々な比率（０．０４～２５：１）で加え、９６ウェルプレートで一晩共同培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）した後、Ｄ－ルシフェリン（６００μｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌを加えて３７℃で１０分間培養し、その時まで生存したＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞でのルシフェラーゼ酵素作用を誘発した。これらの細胞の発光度をミノメーター（Ｔｅｃａｎ）を用いて測定して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を非処理したＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞の発光度と比較して腫瘍細胞の生存率を計算することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷能を計測した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化程度を測定するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ細胞を同数（３×１０４ｃｅｌｌｓ）で混合して９６ウェルプレートで２４時間共同培養した後、培養上清液を収穫した。上清液に分泌されたＩＦＮ－γの量を、ＥＬＩＳＡ法（ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。
実施例１－１３：ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内効能評価
免疫欠乏ＮＳＧマウスにＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（マウス当たりに５×１０５ｃｅｌｌｓ）を静脈注射して７日後、レトロウイルス形質導入して８日間増殖されたＣＡＲ－Ｔ細胞（マウス当たりに５×１０６ｃｅｌｌｓ）を静脈注射した。その後、周期的にＤ－ルシフェリン（マウス当たりに２ｍｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を腹腔注射した後、生物発光イメージング（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）装備（ＩＶＩＳ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で生体内発光度を測定することによって腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）の変化を観察した。
実施例１－１４：ＣＡＲ－Ｔ細胞のＲａｊｉ細胞との免疫シナプス形成能評価
ＣＡＲ－Ｔ細胞と腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）間の免疫シナプス形成を観察するために、ＣＭＴＭＲ（１０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で３０分間染色したＲａｊｉ細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）とＣＡＲ－Ｔ細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）を、ポリエルリジン（Ｐｏｌｙ－Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ）のコートされたカバースリップ上で共同培養し、１５分、３０分、１時間、３時間目に固定した。前述した共焦点顕微鏡撮影方法と同一にＦ－アクチンを染色した後、ＦｌｏｗＶｉｅｗ３０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で撮影し、ｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を用いて分析した。
実施例２：ＣＤ９９欠乏によるＴ細胞免疫シナプス形成障害確認
Ｔ細胞においてＣＤ９９刺激がＴ細胞の活性化を増加させ、ＣＤ９９が、アクチン細胞骨格の含まれた脂質ラフト分画に存在するという既存研究に基づき（Ｗｉｎｇｅｔｔ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１９３（１）：１７－２３）、ＣＤ９９の免疫シナプス形成における役割を検証するために、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞の、ＴＣＲ刺激による活性化及び免疫シナプス形成過程を分析した。ＣＤ９９ノックアウトマウスから分離したＴ細胞の抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激による細胞分裂を分析した結果、正常ＣＤ８Ｔ細胞に比べて初期細胞分裂がだいぶ遅延される現象が観察された。また、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞の初期サイトカイン生成能も、正常Ｔ細胞に比べて減少することが確認された。したがって、ＣＤ９９がＴＣＲ刺激によるＴ細胞活性化過程に関与することが確認された（図２のＡ、Ｂ）。
その具体的な機序を調べるために、Ｔ細胞と抗原提示細胞の共同培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）によって免疫シナプス形成過程を観察した結果、免疫シナプスを構成するＴＣＲとＬＦＡ－１の抗原提示細胞接触部位への密集現象が、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞において正常Ｔ細胞に比べて顕著に減少していることが確認された（図３のＡ）。これに相まって、免疫シナプス形成の細胞骨格を提供するアクチンのシナプス密集現象も、ＣＤ９９欠乏によって著しく減少していることが観察された（図３のＢ）。免疫シナプスにおけるアクチン細胞骨格の再配列をより詳しく観察するために、抗ＣＤ３抗体のコートされたスライド表面を抗原提示細胞の表面として仮装し、Ｔ細胞のスライド接触部位を免疫シナプスと想定した実験システムにおいて、Ｔ細胞がスライド表面に接触した時間によるアクチン再配列を実時間共焦点顕微鏡（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果、ＣＤ９９欠乏によってアクチン重合反応によるＴ細胞接触面形成が遅延され、Ｔ細胞接触面の面積も大きく減少していることが確認された（図３のＣ～Ｅ）。また、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞では、細胞の拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）に関連した葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）部分の厚さが大きく減少し、アクチンマイクロクラスターの位置が免疫シナプスの近接部ではなく周辺部に位置するなど、免疫シナプスの構造的異常も共に観察されることから（図３のＦ、Ｇ）、ＣＤ９９が免疫シナプス形成に中枢的な役割を担うことが確認された。
実施例３：ＣＤ９９欠乏によるアクチン－微小管相互作用の障害確認
免疫シナプス形成においてアクチン細胞骨格再配列と共に微小管ネットワーク（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｎｅｔｗｏｒｋ）の形成が重要な役割を担っていることが近年注目され出したが、アクチン－微小管相互作用についてはあまり知られたところがない。そこで、ＣＤ９９欠乏時にＴ細胞免疫シナプスにおける微小管ネットワークの形成過程を追跡した結果、微小管ネットワーク形成の不安定性が観察された。すなわち、Ｔ細胞活性化時に、微小管は、微小管形成中心（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｃｅｎｔｅｒ，ＭＴＯＣ）から新しく生成され成長する微小管が細胞膜に向けて放射状に伸びるが、ＣＤ９９欠乏時にはこのような放射形微小管の形成が円滑でなく、早く萎縮することが観察された（図４のＡ、Ｂ）。また、Ｔ細胞活性化時に観察されるＭＴＯＣの免疫シナプス中心部位への位置移動も、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞では観察されなかった。特に、一部の微小管は、アクチンに富んだ葉状仮足（ａｃｔｉｎ－ｒｉｃｈ ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）の内部に直角で伸びて行き、細胞膜に存在するアクチンとの相互作用により細胞膜に固定されるが、ＣＤ９９欠乏時に葉状仮足に進入する微小管が顕著に減少することによって、アクチン－微小管相互作用が阻害される可能性が見られた（図４のＣ、Ｄ）。これを裏付けるかのように、正常細胞の細胞抽出液（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）ではアクチンとチューブリンが共同免疫沈殿（ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）されることによって相互結合が観察されるのに対し、ＣＤ９９欠乏細胞ではこのような共同免疫沈殿現象が観察されておらず（図４のＥ）、ＣＤ９９がアクチンと微小管の物理的相互結合に寄与していることが証明された。
実施例４：ＣＤ９９のアクチン及び微小管との相互作用分析
前記結果に基づき、ＣＤ９９が実際に免疫シナプスに位置してアクチンとチューブリンとの結合を媒介するかどうか確認するために、ＣＤ９９の免疫シナプスにおける存在を共焦点顕微鏡で観察した結果、Ｔ細胞活性化時に、ＣＤ９９が免疫シナプス部位に移動することが観察され、特に、アクチン豊富領域（ａｃｔｉｎ－ｒｉｃｈ ａｒｅａ）に分布するＬＦＡ－１と共局在化する（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚｅ）ことが観察された（図５のＡ）。細胞骨格との位置関係を調べた結果、ＣＤ９９がアクチン及び微小管のそれぞれと共局在化する部位があることが観察された（図５Ｂ）。また、活性化されたＴ細胞抽出液においてＣＤ９９はアクチン及びチューブリンのいずれとも共同免疫沈殿することが確認された（図５のＣ）。したがって、ＣＤ９９は、長い間証明されなかった、アクチンと微小管との相互結合を媒介するブリッジ分子の役割を担う膜タンパク質であると解釈された。
実施例５：ＣＤ９９とアクチン及び微小管相互作用におけるＣＤ９９膜通過ドメイン及び細胞質ドメインの役割
ＣＤ９９のアクチン及び微小管との結合部位を同定するために、ＣＤ９９の膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）或いは細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ）を、関連のないタンパク質であるＣＤ４の該当の部位に置換した突然変異タンパク質（ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）をデザインした後、これらのタンパク質をＣＤ９９欠乏Ｔ細胞に発現させた。ＣＤ９９膜通過ドメインがＣＤ４の該当の部位に置換されたタンパク質を、“ＣＤ９９ＴＭミュータント”とし、ＣＤ９９細胞質ドメインがＣＤ４の細胞質ドメインに置換されたタンパク質を“ＣＤ９９Ｃｙｔミュータント”とした（図６のＡ）。各突然変異タンパク質とアクチン及び微小管が共局在するかどうかを共焦点顕微鏡で観察した結果、ＣＤ９９Ｃｙｔミュータントは、微小管とは共局在されるが、拡張される葉状仮足内への微小管の成長が伴われず、プラズマ細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）へも固定されない特徴を示し、アクチンとは共局在がなされないことから、このような現象がＣＤ９９Ｃｙｔミュータントとアクチンとの相互作用が消失したことによることが分かった。これに対し、ＣＤ９９ＴＭミュータントは、アクチンとの共局在は維持されたが、成長して伸びた微小管のテンション及び安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が低下し、葉状仮足の退却及びカタストゥロフィー（ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ）が誘導されない特徴を示し、Ｃ９９ＴＭミュータントと微小管との共局在が消失していることが確認された（図６のＢ）。その結果、ＣＤ９９の細胞質ドメインは、アクチンとの相互作用に必須であって、アクチンと微小管の同伴成長を図る部位であり、膜通過ドメインは、微小管との相互作用に必須であって、アクチンと微小管の同伴収縮を図る部位であることが証明された。ＣＤ９９膜通過ドメインのうち、特定細部部位（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ）が微小管結合に決定的か否かを確認するために、ＴＭミュータントのＣＤ４膜通過ドメインに再びＣＤ９９膜通過ドメインの一部を導入したミュータントを作製して実験した結果、ＣＤ９９膜通過ドメイン全体が微小管結合に必須であることが確認された。ＣＤ９９細胞質ドメインの場合、細胞膜部位の膜遠位部（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｔａｌ ｒｅｇｉｏｎ）が除去され、膜近接部位（膜近接領域）は保持されたミュータントを作製して実験した結果、正常ＣＤ９９タンパク質と類似に、アクチン及び微小管との相互作用が維持されることが観察され、膜近接部位がアクチンとの相互作用に決定的であることが確認された（図６のＡ、Ｂ）。要するに、ＣＤ９９は、膜通過ドメインを用いてアクチン－微小管の同伴収縮に重要であり、細胞内膜近接部位を用いてアクチン－微小管の同伴成長に作用することによって、アクチンと微小管間の相互作用全般を媒介し、力学的不安定（ｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）に寄与することが検証された。
実施例６：ＣＤ９９部分を移入したＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
近年、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤は、ＣＤ１９陽性急性白血病に対する高い治療効率（７０～８０％の完全寛解率）から脚光を浴びているが、固形腫瘍として育つＣＤ１９陽性リンパ腫では治療効率が低いことが知られている（５０％程度の完全寛解率）。したがって、ＣＤ１９陽性リンパ腫をはじめとする固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性は大きく向上する必要がある。
現在、主として用いられているＣＡＲタンパク質のＴ細胞活性化は、主に、細胞内信号伝達ドメインの活性化に依存しており、抗体部位と細胞内信号伝達ドメインを連結するバックボーンであるＣＤ８細胞外及び膜通過ドメインは物理的な連結機能のみを行っている。上記の実施例２～５によれば、ＣＤ９９の細胞膜及び細胞内膜近接部位は、アクチン及び微小管相互作用を媒介することによって、免疫シナプス形成の安定化に寄与することが証明された。したがって、既存のＣＡＲタンパク質デザインにＣＤ９９の細胞膜及び膜近接部位を導入する場合、既存信号伝達機能の他に免疫シナプス安定化という追加機能を付与することにより、より向上したＣＡＲ－Ｔ細胞の作製が可能であると予想できる。
そこで、本実施例では、ＣＤ１９抗原を標的とするＣＡＲタンパク質に対して、ＣＤ９９の一部細胞外ドメイン及び膜通過ドメインと膜近接部位を使用した種々のＣＡＲタンパク質をデザインし、これら新しいＣＡＲタンパク質を発現させるＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。特に、ＣＡＲタンパク質の細胞外ドメインとして様々な長さ（それぞれ、５８個、４５個、３５個アミノ酸残基）のＣＤ９９細胞外ドメイン（Ｆ５８ＢＢｚ、Ｆ４５ＢＢｚ、Ｆ３５ＢＢｚ、Ｆ３５ＢＢｚ－１）或いは既存ＣＡＲタンパク質のＣＤ８細胞外ドメインを使用したＣＡＲタンパク質（Ｆ８ＴＪＢＢｚ）をそれぞれデザインした（表６及び表８、図７のＡ）。その後、これらのタンパク質の遺伝子発現用レトロウイルスを作製し、ヒトＴ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）することによってＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。
このように作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）と試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）機能を分析した結果、各ＣＡＲタンパク質がＴ細胞表面で発現することが、流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）から確認された（図７のＢ）。ＣＡＲ陽性細胞比率で測定される形質導入効率（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、及び平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）で測定される細胞当たりＣＡＲ発現量は、これらのＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞において、既存ＣＤ８バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈ１９ＢＢｚ）に比べて相対的に低かったが（図７のＢ）、ＣＤ１９陽性リンパ腫細胞（Ｒａｊｉ ｃｅｌｌ）に対する細胞殺傷力テストでは、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷力が既存ＣＡＲ－Ｔ細胞のそれに及ぶことが確認された（図７Ｃ）。続いて行われたＴ細胞のサイトカイン分泌能実験では、Ｆ８ＴＪＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞以外の全てのＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞が既存ＣＡＲ－Ｔ細胞と類似であるか、より向上したＩＦＮ－γ分泌能を示した（図７のＤ）。特に、細胞外ドメインの長さが最も短いＦ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞において、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて著しいＩＦＮ－γ生産力を示した。したがって、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞は、低いＣＡＲ発現率にもかかわらず、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞に劣らない腫瘍殺傷力及び活性化機能性を保有していることが確認された。ただし、Ｆ８ＴＪＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、顕著に低いＣＡＲ発現率とサイトカイン分泌能を示し、以降の実験で排除した。
実施例７：ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内抗癌効能改善効果確認
実施例６のＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗癌効能を確認するために、リンパ腫細胞が接種された免疫欠乏マウス（ＮＳＧマウス）にＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後、腫瘍の生体内増殖及びマウスの生存率を測定した。腫瘍の体内増殖を効率的に追跡するために、ルシフェラーゼを人為的に発現させたヒトリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ ｃｅｌｌｓ）を静脈注射し、発光程度を測定する生体発光イメージ法（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ＢＬＩ）を用いて腫瘍細胞群が放出する光の強度を周期的に測定した。
腫瘍を接種して７日後に治療的目的でＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した時、既存ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍の成長を顕著に阻害することが観察された。しかし、時間の経過につれて、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した群では腫瘍の再成長が観察され、結局は、全ての個体が死亡し、治療効能に制限があることが観察された。しかし、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した群では、このような腫瘍の再成長が顕著に遅延され、特に、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した群では全ての腫瘍細胞が除去され、腫瘍の再発が観察されなかった（図８のＡ、Ｂ）。その結果として、既存ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した群は、腫瘍接種後９０日以内に全ての個体が死亡したが、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＦ４５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスは、腫瘍接種して１４０日以後にも死亡した個体が見られず、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞治療群は、実験が終了する１５３日目までも全ての個体が生存した（図８のＣ）。したがって、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞、特に、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞では、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて顕著に改善された治療効能を示すことが確認された。
実施例８：ＣＤ９９部分を導入したＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫シナプス形成能改善
前記観察されたＦ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内抗腫量効果がＣＤ９９バックボーン部位を通じた免疫シナプス強化効果による可能性をテストするために、腫瘍細胞（Ｒａｊｉ ｃｅｌｌ）とＣＡＲ－Ｔ細胞の共同培養時（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）に免疫シナプス形成能を、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した。その結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞と免疫シナプスを形成する腫瘍細胞の比率が、ＣＤ８バックボーンを持つｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞処理群に比べてＦ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞処理群において顕著に増加することが観察された（図９のＡ、Ｂ）。また、特に、Ｆ３５ＢＢｚ Ｔ細胞では、腫瘍細胞当たり結合するＣＡＲ－Ｔ細胞の数が、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて顕著に多いことが確認された（図９のＣ、Ｄ）。したがって、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、腫瘍細胞とはるかに強化した免疫シナプスを形成することが検証された。したがって、ＣＤ９９膜通過ドメイン及び膜近接部位の免疫シナプス形成媒介効果がＣＡＲ－Ｔ細胞でも再現されることから、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の効力増加が免疫シナプス安定化（ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によって現れる効果であることを強く示唆した。
ＣＤ９９は、Ｔ細胞をはじめとする種々の細胞群で発現する膜タンパク質であって、細胞間接着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、細胞の移動（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、タンパク質の細胞内移動（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）などに関与するものと知らされてきた（Ｐａｓｅｌｌｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ．２０１８；１２（１）：５５－６８））。Ｔ細胞では共同刺激分子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）としてＴ細胞活性化を促進する役割を有することが報告され（Ｏｈ ＫＩ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００７；３９（２）：１７６－８４）、また、ＭＨＣ Ｉ、ＴＣＲなどの細胞膜タンパク質の細胞表面発現を促進することが報告された（Ｓｏｈｎ ＨＷ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６６（２）：７８７－９４）。このようなＴ細胞活性化過程の機序により、ＣＤ９９が脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ）に移動してＴ細胞内部のアクチン細胞骨格再配列（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を調節する可能性が提示されたが、その具体的な分子機序は研究されたことがない（Ｙｏｏｎ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００３；５４０（１－３）：２１７－２２）。
Ｔ細胞は、樹状細胞のような抗原提示細胞と接触すると、抗原提示細胞の提示するペプチド抗原をＴＣＲ（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）から認知し、ＴＣＲ信号を内部に伝達して活性化される。このとき、Ｔ細胞の細胞膜部位は抗原提示細胞の細胞膜部位と強い接触を相当期間持続するが、この接触部位を免疫シナプス（ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｎａｐｓｅ）と通称している（Ｇｒａｋｏｕｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８５（５４２５）：２２１－７）。免疫シナプスの形成は、Ｔ細胞活性化信号伝達に重要な役割を担い、免疫シナプスの形成にはＴ細胞内部のアクチン細胞骨格再配列（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）が必須であることがよく知られている（Ｄｕｓｔｉｎ ＭＬ，Ｃｏｏｐｅｒ ＪＡ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１（１）：２３－９）。また、最近ではアクチンの他に微小管細胞骨格も免疫シナプスに関与することが知られたが、その相互関係については明確に研究されたことがない（Ｍａｒｔｉｎ－Ｃｏｆｒｅｃｅｓ ＮＢ，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｄｒｉｄ Ｆ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８；９：１１７４；Ｄｏｇｔｅｒｏｍ Ｍ，Ｋｏｅｎｄｅｒｉｎｋ ＧＨ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１９；２０（１）：３８－５４）。
本発明では、ＣＤ９９が免疫シナプス形成に重要な役割を担い、これは、ＣＤ９９が細胞内部の細胞骨格再配列を媒介するためであることを証明した。また、具体的な機序として、ＣＤ９９がアクチン細胞骨格と既存にあまり研究されていない微小管細胞骨格とをつなぐブリッジ分子として作用することを究明した。
また、ＣＤ９９分子の膜通過ドメインと細胞内膜近接ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）がそれぞれ、微小管とアクチンとの結合に独立した役割を果たしていることを究明した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、ＣＡＲタンパク質の抗体部位を用いて腫瘍細胞表面の抗原に接触すると、正常Ｔ細胞と抗原提示細胞とが接触する時と類似の免疫シナプスが形成されることが知られており、免疫シナプスの形成がＣＡＲ－Ｔ細胞の活性に関連していることが報告された（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１８；１１５（９）：Ｅ２０６８－Ｅ７６）。したがって、免疫シナプス形成が促進されるＣＡＲタンパク質デザインは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を大きく増加させることができる。
ＣＤ９９が細胞骨格再配列と免疫シナプス形成において重要な役割を担うという実験結果に基づき、現ＣＡＲタンパク質の構造のうち、膜通過ドメインを含むＣＡＲバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を、ＣＤ９９の膜通過ドメインを含む構造に置換する場合に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能が向上するかどうかテストした。その結果、ＣＤ９９の一部の細胞外ドメイン、膜通過ドメイン、細胞内膜近接ドメインを含むＣＡＲタンパク質を発現したＣＡＲ－Ｔ細胞が、既存ＣＤ８タンパク質部位を用いたＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて抜群の腫瘍治療効率を示すことを確認した。また、ＣＤ９９由来バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含むＣＡＲ－Ｔ細胞が、既存ＣＤ８バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて抜群の免疫シナプス形成能を保有することが確認された。
結果的に、本発明では、ＣＤ９９部位の移入されたＣＡＲタンパク質を導入することにより、免疫シナプス形成の強化によって機能の向上したＣＡＲ－Ｔ細胞という新しい概念を提示しようとする。
したがって、本発明は、一観点において、
（ａ）抗原結合ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；
（ｂ）細胞外連結部及び膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含むバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）；及び
（ｃ）細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）；
を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）であって、前記膜通過ドメインは、ＣＤ９９由来膜通過ドメインを含むことを特徴とするキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＣＡＲ）に関する。
本発明において、“バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）”とは、細胞外連結部（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）及び膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を含む部位を意味する。
本発明において、“細胞外連結部（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐａｃｅｒ ｄｏｍａｉｎ）”とは、抗原結合ドメインと膜通過ドメインとを連結する部位を意味する。
本発明において、前記膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ；ＴＭ）は、ＣＤ９９由来膜通過ドメインの全体又は一部を含むものでよく、前記ＣＤ９９は、配列番号１の配列を有するヒトのＣＤ９９であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
前記配列番号１の配列を有するヒトＣＤ９９は、配列番号２のヌクレオチド配列又はその縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）配列によってコードされてよいが、これに限定されるものではない。
【表1】
前記“Ｄ２３”のように、アミノ酸の１文字コード（ｏｎｅ－ｌｅｔｔｅｒ ｃｏｄｅ）と数字が結合した表現は、当該数字の位置のアミノ酸残基を意味する。すなわち、Ｄ２３は、２３番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ：Ｄ）であることを意味する。
好ましくは、前記ＣＤ９９由来膜通過ドメインは、配列番号３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。前記配列番号３の配列を有するヒトＣＤ９９由来膜通過ドメインは。配列番号４のヌクレオチド配列又はその縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ）配列によってコードされてよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記細胞外連結部は、ＣＤ９９由来及び／又はＣＤ８由来細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）、好ましくは、ヒトＣＤ９９由来細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）を含むことを特徴とし得る。
前記ＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号５で表示されるアミノ酸配列の全部又は一部を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。前記配列番号５の配列を有するヒトＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号６のヌクレオチド配列又はその縮退性配列によってコードされてよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号５又は配列番号５で表示されるアミノ酸配列のうち、連続する２０～７０個、好ましくは３０～６０個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列で表示されることを特徴とし、
より好ましくは、前記ＣＤ９９由来細胞外ドメインは、配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
また、本発明において、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）をさらに含むことを特徴とし得る。
本発明において、前記“細胞内膜近接ドメイン”は、キメラ抗原受容体の膜通過ドメインと細胞内信号伝達ドメインとの間に位置することを特徴とし得る。本発明の一実施例において、前記ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインは、アクチンとの相互作用を媒介することによって免疫シナプス形成の安定化に寄与することが確認された。
前記ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインは、ＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインの全体又は一部を含むものでよく、好ましくは、配列番号１３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得る。
【表2】
本発明において、前記細胞外連結部は、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）ドメインをさらに含むことを特徴とし得る。
前記ヒンジドメインは、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなり、１～１００個のアミノ酸残基、好ましくは、１０～７０アミノ酸残基を含むことを特徴とし、好ましくは、配列番号１５で表示されるアミノ酸配列を含むＣＤ８由来ヒンジドメインの全体又は一部を含むものでよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記細胞内信号伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）は、免疫細胞の細胞膜内側、すなわち、細胞質に位置する部分であり、細胞外ドメインに含まれた抗原結合ドメインが標的抗原に結合した時、細胞内に信号を伝達して免疫細胞の免疫反応を活性化させる部位を意味する。
本発明において、前記細胞内信号伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ζ）、ＣＤ３ガンマ（γ）、ＣＤ３デルタ（δ）、ＣＤ３エプシロン（ε）、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄからなる群から選ばれる一つ以上の細胞内信号伝達ドメインであることが好ましいが、これに限定されず、より好ましくは、ＣＤ３ゼータ（ζ）であってもよい。本発明に係るＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメインは、配列番号１７又は配列番号１７の配列において１４番目のアミノ酸残基であるグルタミン（Ｑ）がリジン（Ｋ）に置換された配列番号１９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し得るが、これに限定されるものではない。
また、本発明に係る前記細胞内信号伝達ドメインは、さらに共同刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメインを含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。本発明に係る共同刺激（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ－１、ＧＩＴＲ、ＭｙＤ８８、ＤＡＰ１、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選ばれる一つ以上の共同刺激ドメインが好ましいが、、これに制限されるものではない。
好ましくは、本発明に係る細胞内信号伝達ドメインは、配列番号１７又は配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメインと、配列番号２１で表示されるアミノ酸配列とを含む４－１ＢＢの共同刺激ドメインを含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【表3】
特に、本発明に係るキメラ抗原受容体は、一つ以上の細胞内信号伝達ドメインと、一つ以上の共同刺激ドメインとを含むことを特徴とし得る。
本発明に係るキメラ抗原受容体に一つ以上の細胞内信号伝達ドメインと、一つ以上の共同刺激ドメインとが含まれる場合には、一つ以上の共同刺激ドメインと一つ以上の細胞内信号伝達ドメインとが直列に連結されてよい。この場合、各ドメインは、直接連結されているか、選択的に又は２～１０個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを介して連結されていてよく、好ましくは、このようなリンカー配列としてグリシン－セリン連続配列を挙げることができる。
本発明において、前記キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞の免疫機能促進因子をさらに含むことができ、前記Ｔ細胞の免疫機能促進因子としては、ＩＬ－７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ７）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１又はＣＣＬ１９を挙げることができるが、これに制限されるものではない。Ｔ細胞の免疫機能促進因子と関連してＷＯ２０１６／０５６２２８Ａを参照することができる。
本発明において、前記キメラ抗原受容体は、ＪＡＫ結合モチーフ及びＳＴＡＴ３／５会合モチーフを含むインターロイキン受容体鎖（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｈａｉｎ）をさらに含むことができ、例としてＩＬ－２Ｒβを挙げることができるが、これに制限されるものではない。これと関連して、ＷＯ２０１６／１２７２５７Ａを参照することができる。
１世代ＣＡＲでは、癌細胞から特異的に発現する抗原認識部位を含む細胞外ドメイン、膜通過ドメイン及び細胞内信号伝達ドメインを含み、信号伝達ドメインとしてＣＤ３ζだけを用いたが、癌に対する治療効果がわずかであり、持続時間が短いという問題があった。このような１世代ＣＡＲは、米国登録特許第６，３１９，４９４号に具体的に記載されており、本発明に参照によって組み込まれる。
免疫細胞に対する反応性向上のために、共同刺激ドメイン（ＣＤ２８又はＣＤ１３７／４－１ＢＢ）とＣＤ３ζとを結合した２世代ＣＡＲが製造されたが、１世代ＣＡＲと比較して、体内に残存する含ＣＡＲ免疫細胞の数が顕著に増加した。２世代ＣＡＲは一つの共同刺激ドメインを用いたのに対し、３世代ＣＡＲでは２種類以上の共同刺激ドメインを用いた。生体内ＣＡＲを含む免疫細胞の拡張及び持続性達成のために、共同刺激ドメインを４－１ＢＢ、ＣＤ２８又はＯＸ４０などと結合させることができる。２世代ＣＡＲは米国登録特許第７，７４１，４６５号、第７，４４６，１９０号又は第９，２１２，２２９号に具体的に記載されており、３世代ＣＡＲは米国登録特許第８，８２２，６４７号に具体的に記載されており、本発明に参照によって組み込まれる。
４世代ＣＡＲでは、ＩＬ－１２又はＩＬ－１５のようなサイトカインを暗号化する追加の遺伝子を含み、サイトカインのＣＡＲベースの免疫タンパク質をさらに発現させており、５世代ＣＡＲは、免疫細胞強化のために、インターロイキンレセプター鎖、例えば、ＩＬ－２Ｒβをさらに含む。４世代ＣＡＲは、米国登録特許第１０，３１６，１０２号、５世代ＣＡＲは米国登録特許第１０，３３６，８１０号に具体的に記載されており、本発明に参照によって組み込まれる。
本発明において、前記抗原結合ドメインは、下記の群から選ばれる抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない：
４－１ＢＢ、ＢＣＭＡ（Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＢＡＦＦ（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡ９（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ９，ＣＡＩＸ又はＧ２５０とも知られている。）、ＣＴＡＧ１Ｂ（ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ １Ｂ，ＮＹ－ＥＳＯ－１又はＬＡＧＥ２Ｂとも知られている。）、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）、サイクリンＡ２、サイクリンＢ１、ＣＣＬ－ｌ（Ｃ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ １）、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＳＰＧ４（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ４）、ＣＬＤＮ１８（ｃｌａｕｄｉｎ－１８）、ＣＬＤＮ６、ＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、ｃ－Ｍｅｔ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｍｅｔ）、ＤＬＬ３、ＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｔＥＧＦＲ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、ＥＰＧ－２（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ２）、ＥＰＧ－４０（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ４０）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ）Ｂ２、ＥＰＨＡ２（ｅｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ２）、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｆｃ受容体（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＦＣＲＬ５（Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｋｅ ５，Ｆｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇ ５又はＦＣＲＨ５とも知られている。）、ＦＧＦ２３（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２３）、ＦＢＰ（ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＦＯＬＲ１（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ）、ＦＯＬＲ２（ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ）、ＧＤ２（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ＧＤ２、Ｏ－ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＧＤ２（ＯＧＤ２））、ガングリオシド（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）ＧＤ３、ｇｐ１００（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １００）、ｇｌｙｐｉｃａｎ－３（ＧＰＣ３）、ＧＰＣＲ５Ｄ（Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｅｒｂ－Ｂ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、Ｈｅｒ３（ｅｒｂ－Ｂ３）、Ｈｅｒ４（ｅｒｂ－Ｂ４）、ｅｒｂＢ ｄｉｍｅｒｓ、ＨＭＷ－ＭＡＡ（Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＢｓＡｇ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＬＡ－Ａ１（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ１）、ＨＬＡ－Ａ２（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ａ２）、ＩＬ－２２Ｒａ（ＩＬ－２２ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ）、ＩＬ－１３Ｒａ２（ＩＬ－１３ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ２）、ＩＣＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、ＩＧＦ－１受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ１ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）αｖβ６、インターフェロン受容体（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＦＮγ、ＩＬ－２Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－４Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－５Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－６Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－１７ＲＡ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ）、ＩＬ－３１Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＬ－３６Ｒ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｋｄｒ（ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｌ１－ＣＡＭ（Ｌ１ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｌ１－ＣＡＭのＣＥ７エピトープ（ＣＥ７ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ Ｌ１－ＣＡＭ）、ＬＲＲＣ８Ａ（Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｒｉｃｈ Ｒｅｐｅａｔ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ８ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒ Ａ）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＬＡＧ３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）、ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）Ａｌ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ６、ＭＡＧＥＡｌＯ、ＭＳＬＮ（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＣＭＶ（ｍｕｒｉｎｅ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ＭＵＣ１（ｍｕｃｉｎ １）、ＮＫＧ２Ｄ（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｇｒｏｕｐ ２ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ）リガンド（ｌｉｇａｎｄｓ）、ＭＡＲＴ－ｌ（ｍｅｌａｎ Ａ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＮＣＡＭ（ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＮＲＰ－１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１）、ＮＲＰ－２（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－２）、胎児性癌抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＲＡＭＥ（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ）、プロゲステロン受容体（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＣＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－Β ｌｉｇａｎｄ）、ＲＯＲ１（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １）、ＳＬＡＭＦ７（ＳＬＡＭ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ７）、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＴＰＢＧ（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，５Ｔ４とも知られている。）、ＴＡＧ７２（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２）、ＴＲＰ１（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １，ＴＹＲＰ１又はｇｐ７５とも知られている。）、ＴＲＰ２（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）（ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ、ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ ｄｅｌｔａ－ｉｓｏｍｅｒａｓｅ又はＤＣＴとも知られている。）、及びウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ １；ＷＴ１）。
本発明において、抗体の“断片”は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及びナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）断片などを含む意味で使われる。
“一本鎖Ｆｖ”又は“ｓｃＦｖ”抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成可能にさせるＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
“Ｆｖ”断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインとが、例えば、ｓｃＦｖと強固に事実上共有して連合した二量体からなる。
“Ｆａｂ”断片は、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変及び第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。“Ｆ（ａｂ’）２”抗体断片は、一般にそれらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端の近傍に共有して連結される一対のＦａｂ断片を含む。
“ナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）”とは、単量体可変抗体ドメイン（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｏｍａｉｎ）を含有する断片である。主に、単量体重鎖だけで標的特異性を示すラクダなどの抗体ドメインから由来した低分子量の断片からなる。
本発明において、前記抗原結合断片は、抗体の一本鎖可変断片（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）又はナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）であることを特徴とし得る。
本発明において、前記抗原結合ドメインは、好ましくは、抗ＣＤ１９抗体又はそのｓｃＦｖを含むことを特徴とし、前記抗ＣＤ１９抗体のｓｃＦｖは、配列番号２３で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
【表4】
本発明において、前記抗原結合ドメインのＮ末端部に、さらに信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＳＰ）を含むことを特徴とし得る。本発明において、前記信号ペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、Ｉｇ－ｋａｐｐａ及びＩｇＧ１重鎖からなる群から選ばれる分子から由来することを特徴とし得るが、これに制限されず、好ましくはＣＤ８α信号ペプチドでよく、前記ＣＤ８α信号ペプチドは、配列番号２５で表示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし得る。
【表5】
好ましい例示として、本発明に係るキメラ抗原受容体は、
配列番号５、配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来細胞外ドメイン；
配列番号３で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来膜通過ドメイン；及び
配列番号１３で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメイン；
を含むことを特徴とする。
また、さらに、
配列番号２１で表示されることを特徴とする４－１ＢＢ共同刺激ドメイン；
配列番号１７又は配列番号１９で表示されることを特徴とするＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメイン；及び／又は
配列番号２５で表示されることを特徴とするＣＤ８信号ペプチドを含むことができるが、これに制限されるものではない。
本発明において、例示的に、ＣＤ１９に対する抗原結合部位を含むキメラ抗原受容体は、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１又は配列番号３３で表示されるアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するその変異体を含むことができる。
【表6】
本発明は、他の観点において、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸に関する。
本発明に係るキメラ抗原受容体をコードする核酸（ポリヌクレオチド）は、コドン最適化によって変形されてよく、これは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に起因するものであって、ポリペプチド又はその変異体断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在するということは、通常の技術者にはよく理解できよう。これらのポリヌクレオチド（核酸）の一部は、任意の自然発生型遺伝子のヌクレオチド配列と最小相同性を保有する。
特に、コドン活用法の相違により、可変的なポリヌクレオチド（核酸）、例えば、ヒト、霊長類及び／又は哺乳動物のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチド（核酸）が好ましい。
本発明において、前記キメラ抗原受容体をコードする核酸は、
配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
配列番号４で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来膜通過ドメインをコードするヌクレオチド配列；及び
配列番号１４で表示されることを特徴とするＣＤ９９由来細胞内膜近接ドメインをコードするヌクレオチド配列；
を含み、
さらに、配列番号２２で表示されることを特徴とする４－１ＢＢ共同刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列；
配列番号１８又は配列番号２０で表示されることを特徴とするＣＤ３ゼータ（ζ）の細胞内信号伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列；及び／又は
配列番号２６で表示されることを特徴とするＣＤ８信号ペプチドをコードするヌクレオチド配列；を含むことができるが、これに限定されるものではない。
好ましくは、配列番号２４で表示されることを特徴とする抗ＣＤ１９抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
好ましい例示として、本発明に係るキメラ抗原受容体をコードする核酸配列は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２又は配列番号３４で表示されるヌクレオチド配列、又は前記ヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する変異体を含むものでよい。
本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含むウイルスに関する。
本発明における用語“ベクター”とは、他の核酸分子を転移させたり或いは輸送できる核酸分子を意味する。転移された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結されるが、例えば、ベクター核酸分子内に挿入される。ベクターは、細胞における自律的複製を指示する配列を含んでもよく、宿主細胞ＤＮＡ内への統合を可能にするのに十分な配列を含んでもよい。。前記ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターからなる群から選ばれるものであることを特徴とし得るが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記核酸又は前記ベクターは、ウイルス生産細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）に形質注入又はトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）される。“形質注入”又は“トランスフェクション”させるために、原核又は真核宿主細胞内に外因性核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入するために通常用いられる様々な技術、例えば、電気泳動法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション又はリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを用いることができる。
本発明において、ウイルス生産細胞から生産されたウイルスは、免疫細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）される。細胞内に“形質導入”されたウイルスの核酸は、細胞のゲノムに挿入されたり或いは挿入されないまま、キメラ抗原受容体タンパク質を生産するために用いられる。
本発明は、さらに他の観点において、前記キメラ抗原受容体を表面に発現させる免疫細胞に関する。
本発明において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又は大食細胞であることを特徴とし得るが、これに制限されず、好ましくは、Ｔ細胞であることを特徴とし得る。
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）、ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ）又はＣＡＲ－大食細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であることを特徴とし得る。
本発明において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞；ＣＤ８陽性細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）；ガンマ－デルタＴ細胞；腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）及び末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ；ＰＢＭＣ）から分離したＴ細胞からなる群から選ばれることを特徴とし得る。
本発明は、さらに他の観点において、前記キメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む癌治療用組成物に関する。
本発明において、“癌”と“腫瘍”は同じ意味で使われ、典型的に、調節されない細胞成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態のことを指したり意味する。
本発明のＣＡＲで治療可能な癌は、血管生成された腫瘍の他、血管が生成されないか或いはまだ実質的に血管が生成されていない腫瘍も含む。前記癌は非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば、白血病及びリンパ腫）を含んでもよく、固形腫瘍を含んでもよい。本発明のＣＡＲで治療可能な癌の類型には、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、及び特定白血病又はリンパ性悪性腫瘍、陽性及び悪性腫瘍、例えば、肉腫、癌腫及び黒色腫を挙げることができるが、これに制限されない。成人性腫瘍／癌及び小児性腫瘍／癌も含まれる。
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液（又は、造血性）癌の例には、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病及び骨髄芽細胞性、前リンパ球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性リンパ球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（遅延型及び高い段階の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、重鎖疾患、骨髄異形性症候群、毛髪細胞白血病及び骨髄異形性症を含む白血病を挙げることができる。
固形腫瘍は、一般に、皮嚢又は液体区域を含まない異常組織塊りである。固形腫瘍は、陽性又は悪性であり得る。異なる類型の固形腫瘍は、それら（例えば、肉腫、癌腫及びリンパ腫）を形成する細胞の類型に対して名付けられている。肉腫及び癌腫のような固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及びその他肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、ユーイング（Ｅｗｉｎｇ）腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、直腸癌腫、リンパ性悪性腫瘍、大腸癌、胃癌、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、咽喉頭癌、肝細胞性癌腫、扁平細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、髄質甲状腺癌腫、乳頭状甲状腺癌腫、褐色細胞腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌、髄質癌腫、気管支癌腫、腎臓細胞癌腫、肝腫瘍、胆管癌腫、 絨毛膜癌腫、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ’ ｔｕｍｏｒ）、子宮頸癌、睾丸腫瘍、精上皮腫（ｓｅｍｉｎｏｍａ）、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫（例えば、脳幹神経膠腫及び混合型神経膠腫）、膠芽細胞腫（多形成膠芽細胞腫とも周知されている）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄節芽細胞腫、神経鞘腫頭蓋咽頭腫（Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣細胞腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、松果体腫（ｐｉｎｅａｌｏｍａ）、血管芽細胞腫、聴神経腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏｍａ）、稀突起膠細胞腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、髓膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移）を挙げることができる。
本発明の治療用組成物は、癌の予防又は治療のための組成物であり、本発明の用語、“予防”は、本発明の組成物の投与で癌を抑制させたり進行を遅延させるあらゆる行為を意味し、“治療”とは、癌の発展の抑制、症状の軽減又は除去を意味する。
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞を含む薬学組成物には、薬剤学的に許容される賦形剤がさらに含まれてよい。このような賦形剤の例には、界面活性剤、好ましくはポリソルベート系の非イオン性界面活性剤；中性緩衝塩水、リン酸塩緩衝塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの糖又は糖アルコール類；グリシン、ヒスチジンなどのアミノ酸やタンパク質又はポリペプチド；抗酸化剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、例えば；浸透剤；補助剤；及び保存剤が含まれてよいが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、ヒト以外の哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続又は遅れた放出を提供できるように、当業界に公知の方法を用いて剤形化できる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアゾール、軟質又は硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってよい。
本発明は、さらに他の観点において、前記キメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞を対象体に投与する段階を含む癌治療方法に関する。
本発明は、また、癌治療のための前記免疫細胞の用途に関する。
本発明は、また、癌治療用薬剤製造のための前記免疫細胞の使用に関する。
前記対象体は、腫瘍を持つ哺乳類でよく、具体的にはヒトでよいが、これに限定されるものではない。
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させる免疫細胞又はこれを含む組成物は、経口投与、注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、静脈内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内投与（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮下投与（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、腹腔内投与（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、直腸内投与（Ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、鼻内投与（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）などで投与されてよいが、これに限定されるものではない。
活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重及び患者の重症度などの種々の因子によって適宜選択されてよく、本発明に係る治療用組成物は、癌症状を予防、改善又は治療する効果を有する公知の化合物と併用投与できる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
実施例１：ＣＤ９９由来膜通過タンパク質の機能究明研究
実施例１－１：マウス及び細胞株
ＣＤ９９－ノックアウトマウス（Ｂ６．Ｃｄ９９Ｇｔ（ｐＵ－２１Ｔ）４４Ｉｍｅｇ）は、Ｋｕｍａｍｏｔｏ大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓから購入し、Ｈ６０類遺伝子マウス（ｃｏｎｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）（Ｂ６．ＣＨ６０）は、米国Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｒ．Ｄｅｒｒｙ Ｒｏｏｐｅｎｉａｎから提供してもらった。免疫欠乏ＮＳＧマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｒａｊｉリンパ腫細胞は、ＡＴＣＣから購入した。
実施例１－２：ＷＴ、ＣＤ９９－ＫＯマウスＣＤ８ Ｔ細胞株の確立
ＣＤ９９正常（ＷＴ）Ｂ６マウスとＣＤ９９欠乏（ＣＤ９９－ＫＯ）Ｂ６マウスに、Ｂ６．ＣＨ６０マウスから分離した脾臓細胞を、２×１０７ｃｅｌｌｓ／３００μｌずつ腹腔注射した後、３０日目に各マウスから取り出した脾臓細胞（２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と放射線照射（２０００ｒａｄ）したＢ６．ＣＨ６０脾臓細胞（３．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、ヒトＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下に共に培養し、ＷＴとＣＤ９９－ＫＯ Ｈ６０特異的ＣＤ８Ｔ細胞を増殖させた。これらのＴ細胞を１週の周期で、放射線照射したＢ６．ＣＨ６０脾臓細胞とヒトＩＬ－２（５０Ｕ／ｍｌ）存在下で共に培養して再活性化を誘導することにより、Ｈ６０特異的正常ＣＤ８Ｔ細胞株とＣＤ９９欠乏ＣＤ８Ｔ細胞株を確立した。
実施例１－３：マウスＣＤ９９正常タンパク質と変異タンパク質発現用レトロウイルスベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）の作製
マウスＣＤ９９正常タンパク質（ＷＴ）及び膜通過ドメイン（ＴＭ）、細胞内信号伝達ドメイン（Ｃｙｔ）変異タンパク質をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで作製して、ｐｃＤＮＡ３－ＹＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３０３３）のＥｃｏＲＩ制限酵素部位にクローニングした。このプラスミドからＣＤ９９－ＹＦＰ ＤＮＡ部分をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ制限酵素で切断して抽出し、ＭＳＣＶ Ｐｕｒｏプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６８４６９）はＸｈｏＩ制限酵素で切断した後、それぞれクレノウ（ｋｌｅｎｏｗ）酵素を処理し、平滑末端クローニング（ｂｌｕｎｔ－ｅｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ）でｐＭＳＣＶ－ＣＤ９９－ＹＦＰ、ｐＭＳＣＶ－ＣＤ９９ＴＭ－ＹＦＰ、ｐＭＳＣＶ－ＣＤ９９Ｃｙｔｏ－ＹＦＰベクターを作製した。各ＣＤ９９タンパク質のアミノ酸配列は、下記の表７に示す。
【表7】
実施例１－４：ＣＤ９９発現用レトロウイルスの生産及びマウスＴ細胞への形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）
各ＷＴ又は変異ＣＤ９９－ＹＦＰ発現用レトロウイルスプラスミド（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｌａｓｍｉｄ）をポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてレトロウイルスのパッケージング細胞株（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるプラチナム－Ｅ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ）細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）にトランスフェクションした後、２４～４８時間分泌されたレトロウイルスが含まれた培養上清液を収穫しフィルターした（０．４５μｍフィルター）。この培養上清液をポリブレン（４μｇ／ｍｌ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）存在下で、活性化されたＣＤ９９－ＫＯ ＣＤ８Ｔ細胞株に加えてレトロウイルスを形質導入した。次いで、これらの細胞にピューロマイシン（１ｍｇ／ｍｌ，Ｇｅｏｒｇｉａｃｈｅｍ）を処理し、形質導入された細胞だけを選別させた。その後、ＹＦＰ融合タンパク質を発現させる細胞を流細胞分離器（ＦＡＣＳ－Ａｒｉａ ＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分離して各Ｔ細胞株を確立し、周期的な活性化によって細胞株を維持した。
実施例１－５：Ｔ細胞分裂とサイトカイン生成能確認
正常マウスとＣＤ９９欠乏マウスのリンパ節から得た細胞をＣＦＳＥ（５μＭ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識した後、抗ＣＤ３抗体（１４５－２Ｃ１１、１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）がコートされた９６ウェルプレートに加えた後（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、抗ＣＤ２８抗体（３７．５１、０．５μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と共に培養してＴ細胞を活性化させた。活性化させて２４時間、４８時間、７２時間後に細胞を収穫し、抗ＣＤ８抗体（５３－６．７，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で細胞表面を染色した後、流細胞測定法（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳ－ＬＳＲＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＣＤ８Ｔ細胞に染色されたＣＦＳＥの希釈された程度を測定することによって細胞分裂を確認した。
Ｔ細胞のサイトカイン生成能を確認するために、活性化後の各時間帯別に、収穫前４時間にブレフェルジンＡ（３μｇ／ｍｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を処理した細胞を収穫し、パラホルムアルデヒド（４％，ＣｅｌｌＮｅｓｔ）で室温で２０分間固定させた。次いで、トリトン－Ｘ１００（０．５％、Ａｍｒｅｓｃｏ）とＢＳＡ（０．１％、Ｂｏｖｏｇｅｎ）を入れたＰＢＳを加えて、透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した後、抗ＣＤ８抗体、抗ＩＬ－２抗体（ＪＥＳ６－５Ｈ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＩＦＮ－γ抗体（ＸＭＧ１．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、流細胞測定法により、染色された細胞の分率及び平均蛍光強度を測定した。
実施例１－６：免疫シナプス形成確認のためのＴ細胞共焦点顕微鏡分析
Ｔ細胞と抗原提示細胞間の免疫シナプス形成を観察するために、Ｈ６０抗原を発現させたＤＣ２．４細胞株をＣＭＴＭＲ（１０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）や抗ＩＣＡＭ－１抗体（ＹＮ１／１．７．４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、Ｂ６．ＣＨ６０脾臓細胞と混合培養によって活性化されて４日目のＷＴ又はＣＤ９９－ＫＯ ＣＤ８Ｔ細胞株を、抗ＴＣＲβ抗体（Ｈ５７－５９７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＬＦＡ－１抗体（２Ｄ７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）で染色した。その後、両細胞群をそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌずつ混合し、ポリエルリジン（ｐｏｌｙ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）のコートされたカバースリップ（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ）上で３０分又は１時間共同培養した。その後、暖かいＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを加えて室温で２０分間固定（ｆｉｘ）した後、カバースリップをガラススライドに移してマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）した。Ｆ－アクチンをイメージング（ｉｍａｇｉｎｇ）しようとする場合、固定後、トリトン－Ｘ１００（０．２５％）を含有したＰＢＳで１０分間透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。その後、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で室温で３０分染色し、ＰＢＳで洗浄した後、ガラススライドに移してマウンティングした。
Ｔ細胞の免疫シナプス断面をイメージングするために、７日間活性化したＴ細胞を分離し、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）のコートされたカバースリップ上で（１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）１５分間培養した後、固定及び透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｚａｔｉｏｎ）を行った。その後、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７と抗α－チューブリン抗体（ＤＭ１Ａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色し、Ｆ－アクチンと微小管ネットワークを観察した。
Ｆ－アクチン及び微小管再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を実時間でイメージングするために、ＷＴ又はＣＤ９９－ＫＯ Ｔ細胞株にＬｉｆｅＡｃｔ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターを電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｍａｘａ）を用いてトランスフェクションし、チューブリン力動性測定のためにＳｉＲ－チューブリンキット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）でチューブリン染色プローブを細胞に浸透させた後、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）がコートされたカバースリップ上で培養しながら、Ｔ細胞が免疫シナプスを作る間のＦ－アクチンと微小管の再配列を毎２０秒ごとに実時間で共焦点顕微鏡を用いて撮影した。全ての顕微鏡撮影は、ＦｌｕｏＶｉｅｗ１０００又はＦｌｕｏＶｉｅｗ３０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用い、イメージ分析は、ＦｌｕｏＶｉｅｗソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ｃｅｌｌＳｅｎｓソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）又はＩｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を用いた。
実施例１－７：免疫沈殿（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）及び免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）
４日間活性化されたＣＤ９９正常又は欠乏Ｔ細胞株を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、生きているＣＴＬだけを収穫し、抗ＣＤ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃で１５分間培養することによって活性化を誘導した。その後、冷たいＰＢＳで洗浄して刺激を停止させ、細胞を収穫して、ＮＰ－４０（１％、Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）を含有した抽出緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）で４℃で２０分間細胞を溶解させた後、１００μｇの細胞抽出液（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）をタンパク質Ｇセファロースビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄ）（３５μｌ、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）と混ぜて、４℃で１時間前洗浄（ｐｒｅｃｌｅａｒｉｎｇ）を行った。次いで、４℃で抗α－チューブリン抗体、マウスＩｇＧアイソタイプ抗体又は抗ＣＤ９９抗体（ＥＪ２）、ラットＩｇＧアイソタイプ抗体を処理した後、タンパク質Ｇセファロースビーズを用いて免疫沈殿を行った。免疫沈殿物をＳＤＳ－ＰＡＧＥし、ＰＶＤＦ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した後、抗β－アクチン（４Ｃ２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、抗α－チューブリン、抗ＣＤ９９抗体及び抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ抗体で染色し、Ｗｅｓｔ－Ｆｅｍｔｏ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて発光させた。ＬＡＳ－４０００ｍｉｎｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、当該タンパク質のバンド（ｂａｎｄ）を検出した。
実施例１－８：ＣＡＲ発現用レトロウイルスのベクター（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）の作製
ＣＤ１９標的ＣＤ８バックボーンＣＡＲ（ｈ１９ＢＢｚ）ＯＲＦ ｃＤＮＡは、既存に公開された配列の通り（米国特許２０１３／０２８７７４８Ａ）にＤＮＡ合成を依頼して作製した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＣＤ１９標的ＣＤ９９バックボーンＣＡＲ ＯＲＦ ｃＤＮＡ（Ｆ５８ＢＢｚ、Ｆ４５ＢＢｚ、Ｆ３５ＢＢｚ、Ｆ３５ＢＢｚ－１）は、ＮＣＢＩデータベースのヒトＣＤ９９ ＯＲＦ配列（ＮＭ＿００２４１４．４）からＣＤ９９細胞外ドメイン、膜通過ドメイン及び膜近接ドメインの配列を抜萃し、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ｃｌｏｎｅ ＦＭＣ６３）及びヒト４－１ＢＢ細胞内信号伝達ドメイン、ヒトＣＤ３ゼータ鎖細胞内信号伝達ドメインと、ＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＰＣＲを用いて連結して作製した。Ｆ８ＴＪＢＢｚは、ＣＤ１９ｓｃＦｖ及びヒトＣＤ８細胞外ドメインをヒトＣＤ９９膜通過ドメイン及び膜近接ドメイン、ヒト４－１ＢＢ細胞内信号伝達ドメイン、ヒトＣＤ３ゼータ鎖細胞内信号伝達ドメインとＰＣＲを用いて連結して作製した。各ＣＡＲ発現用レトロウイルスのベクターは、ＭＳＣＶ Ｈｕ受容体レトロウイルスプラスミド（ＭＳＣＶ Ｈｕ Ａｃｃｅｐｔｏｒ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｐｌａｓｍｉｄ）（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６４２６９）のインサート（ｉｎｓｅｒｔ）を除去した後、各ＣＡＲ ＯＲＦ ｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ制限酵素部位にクローニングして作製した。
本実施例に係るＣＡＲ製造に用いられたドメインの配列情報は、前記表２～表５に記載の通りであり、各ＣＡＲタンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列は、表６及び表８に記載の通りである。
【表8】
実施例１－９：ＣＡＲ発現用レトロウイルスの生産
各レトロウイルスプラスミドをリポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰｈｏｅｎｉｘ ＥＣＯ細胞株（ＡＴＣＣ）にトランスフェクションした後、２４～４８時間分泌されたエコトロピックレトロウイルス（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）が含まれた培養上清液を、ＰＧ１３レトロウイルスのパッケージング細胞株（ＡＴＣＣ）に加えてスピン感染（ｓｐｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）した（２５００ｒｐｍ、９０分）。こうにして作製されたＰＧ１３レトロウイルス生産細胞株の培養上清液を収穫しフィルタリング（０．４５μｍフィルター）して細胞残存粒子を除去し、遠心分離型フィルター装置（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ １００ＫＤ ｃｕｔ－ｏｆｆ）を用いて４倍濃縮した後、ＣＡＲ－Ｔ細胞作製のためのレトロウイルス濃縮液として使用した。
実施例１－１０：ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
正常人から白血球成分採血（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）により得られた白血球を、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、１０μｇ／ｍｌ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）がコートされた２４ウェルプレートに、抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、２μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に加えた後、４８時間培養してＴ細胞を活性化させた。活性化されたＴ細胞を２回洗浄した後、レトロウイルス形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）に使用した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ、ＴａＫａＲａ）を４℃で一晩コートした後、洗浄した２４ウェルプレートに２％ ＢＳＡ－ＤＰＢＳを加えて３７℃で３０分間ブロッキング及び洗浄した後、レトロウイルス濃縮液１ｍｌを加えて２０００ｘｇ、３２℃で２時間遠心分離し、レトロウイルスをウェル底面に付着させた。ウイルス濃縮液を除去してウェルを洗浄後、活性化されたＴ細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）１ｍｌをウェルに加え、１０分間の遠心分離（１０００ｘｇ、３２℃）により細胞をレトロウイルスに付着させた。次いで、ヒトＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍｌ、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）存在下で４８時間培養した。このようにレトロウイルス形質導入されたＴ細胞を２回洗浄した後、ヒトＩＬ－２（２００ＩＵ／ｍｌ）が含まれた新鮮な培養液を加えて３～６日間増殖させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞として使用した。細胞表面のＣＡＲタンパク質の発現は、レトロウイルス形質導入後に３日間増殖されたＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９－Ｃｋタンパク質（ＣＤ１９細胞外部位とヒト免疫グロブリンカッパ鎖定常部位（Ｃｋ）の融合タンパク質）及びＡＰＣの標識された抗Ｃｋ抗体（ａｎｔｉ－Ｃｋ－ＡＰＣ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した後、流細胞測定法（ＦＡＣＳ－Ｃａｌｉｂｕｒ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。
実施例１－１１：ルシフェラーゼ発現Ｒａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ）の作製
ルシフェラーゼを細胞内に人為的に発現させるために、ルシフェラーゼとＧＦＰを同時に発現できるレンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）を作製した。ＥＦ１αプロモータ下に多酵素切断部位（ｍｕｌｔｉ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）を保有すると同時に、ＣＭＶプロモータ下にＧＦＰがクローニングされているビシストロニックレンチウイルスベクター（ｂｉｓｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）（ｐＬＥＣＥ３）（Ｌｅｅ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０２０；１５（１）：ｅ０２２３８１４）の多酵素切断部位に、ｐＧＬ３ベースのプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）から切断して抽出したホタルルシフェラーゼＯＲＦ ｃＤＮＡをクローニングし、ｐＬＥＣＥ３－Ｌｕｃベクターを作製した。ｐＬＥＣＥ３－ｌｕｃプラスミドを３種のレンチウイルスパッケージングプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶｒｅｖ、ｐＭＤ．Ｇ）と共にレンチウイルスパッケージング細胞株（２９３ＦＴ ｃｅｌｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にリポフェクタミン２０００試薬を用いてトランスフェクションし、２４～４８時間後、分泌されたレンチウイルスが含まれた培養上清液を収穫し、遠心分離型フィルター装置を用いて１０倍濃縮した。レンチウイルス濃縮液をＲａｊｉ細胞に加え、ポリブレン（６μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下で、常温で２５００ｒｐｍ、９０分間遠心分離して形質導入した。形質導入されたＲａｊｉ細胞のうち、ＧＦＰ陽性細胞を流細胞分離器（ＦＡＣＳ－Ａｒｉａ ＩＩ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分離精製し、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞として使用した。
実施例１－１２：ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷能及び活性化測定
レトロウイルス形質導入して３日間増殖したＣＡＲ－Ｔ細胞（１．２×１０３～７．５×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）を、Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（３×１０４ｃｅｌｌｓ／５０μｌ／ｗｅｌｌ）に様々な比率（０．０４～２５：１）で加え、９６ウェルプレートで一晩共同培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）した後、Ｄ－ルシフェリン（６００μｇ／ｍｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）５０μｌを加えて３７℃で１０分間培養し、その時まで生存したＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞でのルシフェラーゼ酵素作用を誘発した。これらの細胞の発光度をミノメーター（Ｔｅｃａｎ）を用いて測定して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を非処理したＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞の発光度と比較して腫瘍細胞の生存率を計算することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺傷能を計測した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化程度を測定するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞とＲａｊｉ細胞を同数（３×１０４ｃｅｌｌｓ）で混合して９６ウェルプレートで２４時間共同培養した後、培養上清液を収穫した。上清液に分泌されたＩＦＮ－γの量を、ＥＬＩＳＡ法（ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。
実施例１－１３：ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内効能評価
免疫欠乏ＮＳＧマウスにＲａｊｉ－Ｌｕｃ細胞（マウス当たりに５×１０５ｃｅｌｌｓ）を静脈注射して７日後、レトロウイルス形質導入して８日間増殖されたＣＡＲ－Ｔ細胞（マウス当たりに５×１０６ｃｅｌｌｓ）を静脈注射した。その後、周期的にＤ－ルシフェリン（マウス当たりに２ｍｇ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を腹腔注射した後、生物発光イメージング（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ）装備（ＩＶＩＳ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で生体内発光度を測定することによって腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）の変化を観察した。
実施例１－１４：ＣＡＲ－Ｔ細胞のＲａｊｉ細胞との免疫シナプス形成能評価
ＣＡＲ－Ｔ細胞と腫瘍細胞（Ｒａｊｉ）間の免疫シナプス形成を観察するために、ＣＭＴＭＲ（１０μＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で３０分間染色したＲａｊｉ細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）とＣＡＲ－Ｔ細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）を、ポリエルリジン（Ｐｏｌｙ－Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ）のコートされたカバースリップ上で共同培養し、１５分、３０分、１時間、３時間目に固定した。前述した共焦点顕微鏡撮影方法と同一にＦ－アクチンを染色した後、ＦｌｏｗＶｉｅｗ３０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で撮影し、ｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を用いて分析した。
実施例２：ＣＤ９９欠乏によるＴ細胞免疫シナプス形成障害確認
Ｔ細胞においてＣＤ９９刺激がＴ細胞の活性化を増加させ、ＣＤ９９が、アクチン細胞骨格の含まれた脂質ラフト分画に存在するという既存研究に基づき（Ｗｉｎｇｅｔｔ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１９３（１）：１７－２３）、ＣＤ９９の免疫シナプス形成における役割を検証するために、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞の、ＴＣＲ刺激による活性化及び免疫シナプス形成過程を分析した。ＣＤ９９ノックアウトマウスから分離したＴ細胞の抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体刺激による細胞分裂を分析した結果、正常ＣＤ８Ｔ細胞に比べて初期細胞分裂がだいぶ遅延される現象が観察された。また、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞の初期サイトカイン生成能も、正常Ｔ細胞に比べて減少することが確認された。したがって、ＣＤ９９がＴＣＲ刺激によるＴ細胞活性化過程に関与することが確認された（図２のＡ、Ｂ）。
その具体的な機序を調べるために、Ｔ細胞と抗原提示細胞の共同培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）によって免疫シナプス形成過程を観察した結果、免疫シナプスを構成するＴＣＲとＬＦＡ－１の抗原提示細胞接触部位への密集現象が、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞において正常Ｔ細胞に比べて顕著に減少していることが確認された（図３のＡ）。これに相まって、免疫シナプス形成の細胞骨格を提供するアクチンのシナプス密集現象も、ＣＤ９９欠乏によって著しく減少していることが観察された（図３のＢ）。免疫シナプスにおけるアクチン細胞骨格の再配列をより詳しく観察するために、抗ＣＤ３抗体のコートされたスライド表面を抗原提示細胞の表面として仮装し、Ｔ細胞のスライド接触部位を免疫シナプスと想定した実験システムにおいて、Ｔ細胞がスライド表面に接触した時間によるアクチン再配列を実時間共焦点顕微鏡（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果、ＣＤ９９欠乏によってアクチン重合反応によるＴ細胞接触面形成が遅延され、Ｔ細胞接触面の面積も大きく減少していることが確認された（図３のＣ～Ｅ）。また、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞では、細胞の拡散（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）に関連した葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）部分の厚さが大きく減少し、アクチンマイクロクラスターの位置が免疫シナプスの近接部ではなく周辺部に位置するなど、免疫シナプスの構造的異常も共に観察されることから（図３のＦ、Ｇ）、ＣＤ９９が免疫シナプス形成に中枢的な役割を担うことが確認された。
実施例３：ＣＤ９９欠乏によるアクチン－微小管相互作用の障害確認
免疫シナプス形成においてアクチン細胞骨格再配列と共に微小管ネットワーク（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｎｅｔｗｏｒｋ）の形成が重要な役割を担っていることが近年注目され出したが、アクチン－微小管相互作用についてはあまり知られたところがない。そこで、ＣＤ９９欠乏時にＴ細胞免疫シナプスにおける微小管ネットワークの形成過程を追跡した結果、微小管ネットワーク形成の不安定性が観察された。すなわち、Ｔ細胞活性化時に、微小管は、微小管形成中心（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ ｃｅｎｔｅｒ，ＭＴＯＣ）から新しく生成され成長する微小管が細胞膜に向けて放射状に伸びるが、ＣＤ９９欠乏時にはこのような放射形微小管の形成が円滑でなく、早く萎縮することが観察された（図４のＡ、Ｂ）。また、Ｔ細胞活性化時に観察されるＭＴＯＣの免疫シナプス中心部位への位置移動も、ＣＤ９９欠乏したＴ細胞では観察されなかった。特に、一部の微小管は、アクチンに富んだ葉状仮足（ａｃｔｉｎ－ｒｉｃｈ ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）の内部に直角で伸びて行き、細胞膜に存在するアクチンとの相互作用により細胞膜に固定されるが、ＣＤ９９欠乏時に葉状仮足に進入する微小管が顕著に減少することによって、アクチン－微小管相互作用が阻害される可能性が見られた（図４のＣ、Ｄ）。これを裏付けるかのように、正常細胞の細胞抽出液（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）ではアクチンとチューブリンが共同免疫沈殿（ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）されることによって相互結合が観察されるのに対し、ＣＤ９９欠乏細胞ではこのような共同免疫沈殿現象が観察されておらず（図４のＥ）、ＣＤ９９がアクチンと微小管の物理的相互結合に寄与していることが証明された。
実施例４：ＣＤ９９のアクチン及び微小管との相互作用分析
前記結果に基づき、ＣＤ９９が実際に免疫シナプスに位置してアクチンとチューブリンとの結合を媒介するかどうか確認するために、ＣＤ９９の免疫シナプスにおける存在を共焦点顕微鏡で観察した結果、Ｔ細胞活性化時に、ＣＤ９９が免疫シナプス部位に移動することが観察され、特に、アクチン豊富領域（ａｃｔｉｎ－ｒｉｃｈ ａｒｅａ）に分布するＬＦＡ－１と共局在化する（ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚｅ）ことが観察された（図５のＡ）。細胞骨格との位置関係を調べた結果、ＣＤ９９がアクチン及び微小管のそれぞれと共局在化する部位があることが観察された（図５Ｂ）。また、活性化されたＴ細胞抽出液においてＣＤ９９はアクチン及びチューブリンのいずれとも共同免疫沈殿することが確認された（図５のＣ）。したがって、ＣＤ９９は、長い間証明されなかった、アクチンと微小管との相互結合を媒介するブリッジ分子の役割を担う膜タンパク質であると解釈された。
実施例５：ＣＤ９９とアクチン及び微小管相互作用におけるＣＤ９９膜通過ドメイン及び細胞質ドメインの役割
ＣＤ９９のアクチン及び微小管との結合部位を同定するために、ＣＤ９９の膜通過ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）或いは細胞質ドメイン（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｏｍａｉｎ）を、関連のないタンパク質であるＣＤ４の該当の部位に置換した突然変異タンパク質（ｍｕｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）をデザインした後、これらのタンパク質をＣＤ９９欠乏Ｔ細胞に発現させた。ＣＤ９９膜通過ドメインがＣＤ４の該当の部位に置換されたタンパク質を、“ＣＤ９９ＴＭミュータント”とし、ＣＤ９９細胞質ドメインがＣＤ４の細胞質ドメインに置換されたタンパク質を“ＣＤ９９Ｃｙｔミュータント”とした（図６のＡ）。各突然変異タンパク質とアクチン及び微小管が共局在するかどうかを共焦点顕微鏡で観察した結果、ＣＤ９９Ｃｙｔミュータントは、微小管とは共局在されるが、拡張される葉状仮足内への微小管の成長が伴われず、プラズマ細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）へも固定されない特徴を示し、アクチンとは共局在がなされないことから、このような現象がＣＤ９９Ｃｙｔミュータントとアクチンとの相互作用が消失したことによることが分かった。これに対し、ＣＤ９９ＴＭミュータントは、アクチンとの共局在は維持されたが、成長して伸びた微小管のテンション及び安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が低下し、葉状仮足の退却及びカタストゥロフィー（ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ）が誘導されない特徴を示し、Ｃ９９ＴＭミュータントと微小管との共局在が消失していることが確認された（図６のＢ）。その結果、ＣＤ９９の細胞質ドメインは、アクチンとの相互作用に必須であって、アクチンと微小管の同伴成長を図る部位であり、膜通過ドメインは、微小管との相互作用に必須であって、アクチンと微小管の同伴収縮を図る部位であることが証明された。ＣＤ９９膜通過ドメインのうち、特定細部部位（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎ）が微小管結合に決定的か否かを確認するために、ＴＭミュータントのＣＤ４膜通過ドメインに再びＣＤ９９膜通過ドメインの一部を導入したミュータントを作製して実験した結果、ＣＤ９９膜通過ドメイン全体が微小管結合に必須であることが確認された。ＣＤ９９細胞質ドメインの場合、細胞膜部位の膜遠位部（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｔａｌ ｒｅｇｉｏｎ）が除去され、膜近接部位（膜近接領域）は保持されたミュータントを作製して実験した結果、正常ＣＤ９９タンパク質と類似に、アクチン及び微小管との相互作用が維持されることが観察され、膜近接部位がアクチンとの相互作用に決定的であることが確認された（図６のＡ、Ｂ）。要するに、ＣＤ９９は、膜通過ドメインを用いてアクチン－微小管の同伴収縮に重要であり、細胞内膜近接部位を用いてアクチン－微小管の同伴成長に作用することによって、アクチンと微小管間の相互作用全般を媒介し、力学的不安定（ｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）に寄与することが検証された。
実施例６：ＣＤ９９部分を移入したＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
近年、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療剤は、ＣＤ１９陽性急性白血病に対する高い治療効率（７０～８０％の完全寛解率）から脚光を浴びているが、固形腫瘍として育つＣＤ１９陽性リンパ腫では治療効率が低いことが知られている（５０％程度の完全寛解率）。したがって、ＣＤ１９陽性リンパ腫をはじめとする固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性は大きく向上する必要がある。
現在、主として用いられているＣＡＲタンパク質のＴ細胞活性化は、主に、細胞内信号伝達ドメインの活性化に依存しており、抗体部位と細胞内信号伝達ドメインを連結するバックボーンであるＣＤ８細胞外及び膜通過ドメインは物理的な連結機能のみを行っている。上記の実施例２～５によれば、ＣＤ９９の細胞膜及び細胞内膜近接部位は、アクチン及び微小管相互作用を媒介することによって、免疫シナプス形成の安定化に寄与することが証明された。したがって、既存のＣＡＲタンパク質デザインにＣＤ９９の細胞膜及び膜近接部位を導入する場合、既存信号伝達機能の他に免疫シナプス安定化という追加機能を付与することにより、より向上したＣＡＲ－Ｔ細胞の作製が可能であると予想できる。
そこで、本実施例では、ＣＤ１９抗原を標的とするＣＡＲタンパク質に対して、ＣＤ９９の一部細胞外ドメイン及び膜通過ドメインと膜近接部位を使用した種々のＣＡＲタンパク質をデザインし、これら新しいＣＡＲタンパク質を発現させるＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。特に、ＣＡＲタンパク質の細胞外ドメインとして様々な長さ（それぞれ、５８個、４５個、３５個アミノ酸残基）のＣＤ９９細胞外ドメイン（Ｆ５８ＢＢｚ、Ｆ４５ＢＢｚ、Ｆ３５ＢＢｚ、Ｆ３５ＢＢｚ－１）或いは既存ＣＡＲタンパク質のＣＤ８細胞外ドメインを使用したＣＡＲタンパク質（Ｆ８ＴＪＢＢｚ）をそれぞれデザインした（表６及び表８、図７のＡ）。その後、これらのタンパク質の遺伝子発現用レトロウイルスを作製し、ヒトＴ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）することによってＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。
このように作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）と試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）機能を分析した結果、各ＣＡＲタンパク質がＴ細胞表面で発現することが、流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）から確認された（図７のＢ）。ＣＡＲ陽性細胞比率で測定される形質導入効率（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、及び平均蛍光強度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）で測定される細胞当たりＣＡＲ発現量は、これらのＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞において、既存ＣＤ８バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈ１９ＢＢｚ）に比べて相対的に低かったが（図７のＢ）、ＣＤ１９陽性リンパ腫細胞（Ｒａｊｉ ｃｅｌｌ）に対する細胞殺傷力テストでは、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷力が既存ＣＡＲ－Ｔ細胞のそれに及ぶことが確認された（図７Ｃ）。続いて行われたＴ細胞のサイトカイン分泌能実験では、Ｆ８ＴＪＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞以外の全てのＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞が既存ＣＡＲ－Ｔ細胞と類似であるか、より向上したＩＦＮ－γ分泌能を示した（図７のＤ）。特に、細胞外ドメインの長さが最も短いＦ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞において、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて著しいＩＦＮ－γ生産力を示した。したがって、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞は、低いＣＡＲ発現率にもかかわらず、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞に劣らない腫瘍殺傷力及び活性化機能性を保有していることが確認された。ただし、Ｆ８ＴＪＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、顕著に低いＣＡＲ発現率とサイトカイン分泌能を示し、以降の実験で排除した。
実施例７：ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内抗癌効能改善効果確認
実施例６のＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）抗癌効能を確認するために、リンパ腫細胞が接種された免疫欠乏マウス（ＮＳＧマウス）にＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した後、腫瘍の生体内増殖及びマウスの生存率を測定した。腫瘍の体内増殖を効率的に追跡するために、ルシフェラーゼを人為的に発現させたヒトリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ－Ｌｕｃ ｃｅｌｌｓ）を静脈注射し、発光程度を測定する生体発光イメージ法（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ＢＬＩ）を用いて腫瘍細胞群が放出する光の強度を周期的に測定した。
腫瘍を接種して７日後に治療的目的でＣＡＲ－Ｔ細胞を注入した時、既存ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍の成長を顕著に阻害することが観察された。しかし、時間の経過につれて、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した群では腫瘍の再成長が観察され、結局は、全ての個体が死亡し、治療効能に制限があることが観察された。しかし、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した群では、このような腫瘍の再成長が顕著に遅延され、特に、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した群では全ての腫瘍細胞が除去され、腫瘍の再発が観察されなかった（図８のＡ、Ｂ）。その結果として、既存ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した群は、腫瘍接種後９０日以内に全ての個体が死亡したが、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＦ４５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスは、腫瘍接種して１４０日以後にも死亡した個体が見られず、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞治療群は、実験が終了する１５３日目までも全ての個体が生存した（図８のＣ）。したがって、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞、特に、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞では、既存ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて顕著に改善された治療効能を示すことが確認された。
実施例８：ＣＤ９９部分を導入したＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫シナプス形成能改善
前記観察されたＦ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内抗腫量効果がＣＤ９９バックボーン部位を通じた免疫シナプス強化効果による可能性をテストするために、腫瘍細胞（Ｒａｊｉ ｃｅｌｌ）とＣＡＲ－Ｔ細胞の共同培養時（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）に免疫シナプス形成能を、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した。その結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞と免疫シナプスを形成する腫瘍細胞の比率が、ＣＤ８バックボーンを持つｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞処理群に比べてＦ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞処理群において顕著に増加することが観察された（図９のＡ、Ｂ）。また、特に、Ｆ３５ＢＢｚ Ｔ細胞では、腫瘍細胞当たり結合するＣＡＲ－Ｔ細胞の数が、ｈ１９ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて顕著に多いことが確認された（図９のＣ、Ｄ）。したがって、Ｆ３５ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の場合、腫瘍細胞とはるかに強化した免疫シナプスを形成することが検証された。したがって、ＣＤ９９膜通過ドメイン及び膜近接部位の免疫シナプス形成媒介効果がＣＡＲ－Ｔ細胞でも再現されることから、ＣＤ９９バックボーンベースのＣＡＲ－Ｔ細胞の効力増加が免疫シナプス安定化（ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）によって現れる効果であることを強く示唆した。
【産業上の利用可能性】
【0006】
本発明では、既存のＴ細胞表面タンパク質のうち、ＣＤ９９の免疫シナプス安定化機能を確認し、ＣＤ９９の膜通過ドメインをバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として含む新しいキメラ抗原受容体を作製した。このようなＣＤ９９ベースのＣＡＲ－Ｔ細胞は、既存バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を保有したＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、腫瘍細胞と遥かに安定した免疫シナプスを形成し、向上した腫瘍治療効率を示すので、癌治療のための免疫細胞治療に有用に利用可能である。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びそれらの等価物によって定義されるといえよう。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A-B】
【図3C】
【図3D-E】
【図3F-G】
【図4A】
【図4B-C】
【図4D-E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A-B】
【図7A】
【図7B】
【図7C-D】
【図8A】
【図8B-C】
【図9A】
【図9B】
【図9C-D】
【配列表】