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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-28
(45)【発行日】2023-05-11
(54)【発明の名称】抗ＸＩ因子抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/36 20060101AFI20230501BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230501BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230501BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230501BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20230501BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230501BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20230501BHJP
【ＦＩ】
C07K16/36 ZNA
C12P21/08
A61K39/395 N
A61P43/00 111
A61P7/02
C12N15/13
C12N15/63 Z
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2019543277
(86)(22)【出願日】2017-12-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-03-12
(86)【国際出願番号】 CN2017119856
(87)【国際公開番号】W WO2018145533
(87)【国際公開日】2018-08-16
【審査請求日】2020-12-23
(31)【優先権主張番号】201710073984.X
(32)【優先日】2017-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】513243561
【氏名又は名称】上海仁会生物制▲やく▼股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＢＥＮＥＭＡＥ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．９１６ Ｚｉｐｉｎｇ Ｒｏａｄ，Ｚｈｏｕｐｕ Ｔｏｗｎ，Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ａｒｅａ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００３２１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ウェンイ
(72)【発明者】
【氏名】ユ，クアン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，シャオウ
【審査官】中村 俊之
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５０４３７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】Prevention of vascular graft occlusion and thrombus-associated thrombin generation by inhibition of factor XI，BLOOD，2009年，VOLUME 113, NUMBER 4，936-944
【文献】Identification of a Factor IX Binding Site on the Third Apple Domain of Activated Factor XI，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1996年，Vol. 271, No. 46，29023-29028
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｐ ７／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＦＸＩまたはＦＸＩａに特異的に結合する単離された抗ＦＸＩまたは抗ＦＸＩａ抗体、またはヒト化抗体であって、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、および免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む抗体、またはそのＦａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖであって、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが配列番号１５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１５６のＣＤＲ―Ｌ２、および配列番号１５７のＣＤＲ―Ｌ３を含み、ならびに免疫グロブリン重鎖可変ドメインが配列番号１５８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１５９のＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号１６０のＣＤＲ－Ｈ３を含む、または免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが配列番号１９９、および免疫グロブリン重鎖可変ドメインが配列番号２００であり、あるいは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが配列番号２０１、および免疫グロブリン重鎖可変ドメインが配列番号２０２である、前記抗体、またはそのＦａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ。
【請求項2】
抗体、またはヒト化抗体はヒトＦＸＩまたはＦＸＩａのＡ３ドメインに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体、またはヒト化抗体。
【請求項3】
抗体は配列番号１５３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび配列番号１５４の免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体、またはそのヒト化抗体を含む医薬組成物。
【請求項5】
対象における血栓の形成を阻害するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
敗血症を治療または予防するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項7】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体、またはそのヒト化抗体を産生する方法であって、抗体をコードする核酸を発現ベクターにクローニングすること、および、それを宿主細胞で発現させることを含む方法。
【請求項8】
発現した抗体を宿主細胞から精製することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
発現ベクターはｐＴＴ５ベクターまたはｐｃＤＮＡ（商標）３ベクターである、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
宿主細胞はＣＨＯ細胞またはＨＥＫ１９３Ｔ細胞である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）および／またはその活性型因子ＸＩａ（ＦＸＩａ）、ならびにＦＸＩおよび／またはＦＸＩａのフラグメントに結合することができる抗体、ならびに止血を損なうことがない血栓症を治療するための抗凝固剤としての使用を含むその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
血栓症は、血管内の血液凝固を伴う状態であり、それによって患部の血流を遮断または閉塞する。血栓が循環系に沿って心臓、脳、肺のような極めて重要な身体部分に移動し、心臓発作、脳卒中、肺塞栓症などを引き起こす場合、この状態は重篤な合併症につながる可能性がある。血栓症は、ヘパリンおよびワーファリンのような抗凝固剤によって治療または予防することができる。これらの現在利用可能な治療法の最も一般的な有害作用は出血である。したがって、患者は治療後に密接にモニターする必要があるため、これらの治療法は用量および患者コンプライアンスによって制限される。
【0003】
副作用を最小限に抑えた効果的な血栓症治療または予防が必要である。本開示は当技術分野における必要性を満たす。
【発明の概要】
【0004】
本明細書では、ある特定の実施形態において、凝固因子ＸＩ（ＦＸＩ）および／またはその活性型因子ＸＩａ（ＦＸＩａ）、ならびにＦＸＩおよび／またはＦＸＩａのフラグメントに結合する抗体が提供される。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は組換え抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗体はＦＸＩおよび／またはＦＸＩａのＡ３ドメインに結合する。一部の実施形態では、抗体は配列番号１１～１６、２７～３２、４３～４８、５９～６４、７５～８０、９１～９６、１０７～１１２、１２３～１２８、１３９～１４４、１５５～１６０、１７１～１７６、および１８７～１９２のアミノ酸配列からなる、または含む、１つまたは複数のＣＤＲを含む。
【0005】
本明細書では、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防するための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本明細書で開示された１つもしくは複数の抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、１つもしくは複数の薬学的に許容される補助剤、担体、賦形剤、保存剤、またはそれらの組合せをさらに含む。
【0006】
本明細書では、本明細書で開示された抗ＦＸＩおよび／もしくは抗ＦＸＩａ抗体、またはいずれかの抗体の機能性フラグメントをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクター、およびベクターを含む宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞の核酸によってコードされる抗体またはその機能性フラグメントを産生することができる発現ベクターである。
【0007】
本明細書では、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防するために使用する、本明細書で開示された１つまたは複数の抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含むキットが提供される。あるいは、キットは、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防するために使用する、本明細書で開示された１つまたは複数の抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含む医薬組成物を含む。ある特定の実施形態では、キットは使用説明書をさらに含む。
【0008】
本明細書では、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防する方法が提供される。方法は、本明細書で開示された１つまたは複数の抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体の治療有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む。あるいは、方法は、抗ＦＸＩ抗体、抗ＦＸＩａ抗体、またはいずれかの抗体の機能性フラグメントを含有する医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
【0009】
本明細書では、血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態を治療および／または予防するための医薬を配合する、本明細書で開示された抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体の使用が提供される。
【0010】
本明細書では、本明細書で開示された抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を産生する方法が提供される。方法は、抗体をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換するステップ、および宿主細胞で抗体を発現させるステップを伴う。方法は発現した抗体を宿主細胞から精製することをさらに含むことができる。さらに、修飾組換え抗体が対応するヒト抗体の活性を保持するように、精製された抗体は修飾を受けることができる。あるいは、本明細書で開示された抗体を、ハイブリドーマの培養から産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ヒト血漿におけるＡＰＴＴアッセイによる５つの抗ＦＸＩ抗体の影響を示す図である。０～４００ｎＭの範囲の濃度で５つの異なる抗体を添加したヒト血漿を、実施例２に記載のＡＰＴＴアッセイで試験した。試験した５つの抗体には、１９Ｆ６（Ａ）、３４Ｆ８（Ｂ）、４２Ａ５（Ｃ）、１Ａ６（Ｄ）、および１４Ｅ１１（Ｅ）が含まれた。抗体１Ａ６および１４Ｅ１１を本実験の陽性対照として使用した。
【図2】サル血漿において、抗体１９Ｆ６（Ａ）、３４Ｆ８（Ｂ）、および４２Ａ５（Ｃ）がＡＰＴＴアッセイに及ぼす影響を示す図である。０～４００ｎＭの範囲の濃度で３つの異なる抗体を添加したサル血漿を、実施例３に記載のＡＰＴＴアッセイで試験した。
【図3-1】固定化ｈ－１９Ｆ６（Ａ）、ｈ－３４Ｆ８（Ｂ）、およびｈ－４２Ａ５（Ｃ）へのＦＸＩ結合のＳＰＲセンサーグラム、ならびに固定化ｈ－１９Ｆ６（Ｄ）、ｈ－３４Ｆ８（Ｅ）、およびｈ－４２Ａ５（Ｆ）へのＦＸＩａ結合のＳＰＲセンサーグラムを示す図である。データは１：１結合モデルに適合させ、ＦＸＩの試験濃度（０．００５～１ｎｇ／ｍＬ）での曲線適合がセンサーグラムに重ねて表示されている。各曲線は、ＦＸＩまたはＦＸＩａの異なる試験濃度を示す。
【図3-2】固定化ｈ－１９Ｆ６（Ａ）、ｈ－３４Ｆ８（Ｂ）、およびｈ－４２Ａ５（Ｃ）へのＦＸＩ結合のＳＰＲセンサーグラム、ならびに固定化ｈ－１９Ｆ６（Ｄ）、ｈ－３４Ｆ８（Ｅ）、およびｈ－４２Ａ５（Ｆ）へのＦＸＩａ結合のＳＰＲセンサーグラムを示す図である。データは１：１結合モデルに適合し、ＦＸＩの試験濃度（０．００５～１ｎｇ／ｍＬ）での曲線適合がセンサーグラムに重ねて表示されている。各曲線は、ＦＸＩまたはＦＸＩａの異なる試験濃度を示す。
【図4】ヒトＦＸＩａがＳ－２３６６を加水分解することを阻害する、抗体ｈ－１９Ｆ６（Ａ）、ｈ－３４Ｆ８（Ｂ）、およびｈ－４２Ａ５（Ｃ）の濃度応答曲線を示す図である。
【図5】ＦＩＸからＦＩＸａへのＦＸＩａを介した活性化に及ぼす抗体ｈ－１９Ｆ６（Ａ）およびｈ－４２Ａ５（Ｂ）の阻害効果を示す図である。ヒトＦＩＸ（２００ｎＭ）を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中のＦＸＩａ（５ｎＭ）とともに、室温で１μＭ対照ＩｇＧまたはｈ－１９Ｆ６またはｈ－４２Ａ５とインキュベートした。指定された間隔で試料を回収し、ＦＩＸならびにＦＩＸａをヤギ抗ヒトＦＩＸ ＩｇＧ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用してウエスタンブロットで測定した。
【図6】カニクイザルのＡＰＴＴへ及ぼす抗体ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５の影響を示す図である。サルに指示用量のｈ－３４Ｆ８（Ａ）、ｈ－１９Ｆ６（Ｂ）、およびｈ－４２Ａ５（Ｃ）を静脈内投与した。エクスビボ凝固時間ＡＰＴＴを投与前（０時間）、および投与後０．５、１、３、６、１２、および２４時間に測定した。
【図7】カニクイザルのＰＴへ及ぼす抗体ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５の影響を示す図である。サルに示された用量のｈ－３４Ｆ８（Ａ）、ｈ－１９Ｆ６（Ｂ）、およびｈ－４２Ａ５（Ｃ）を静脈内投与した。エクスビボ凝固時間ＰＴを投与前（０時間）、および投与後０．５、１、３、６、１２、および２４時間に測定した。
【図8】カニクイザルのＡＶシャント血栓症へ及ぼす抗体ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５の影響を示す図である。漸増するレベルのｈ－３４Ｆ８（Ａ）、ｈ－１９Ｆ６（Ｂ）、またはｈ－４２Ａ５（Ｃ）がサルに静脈内投与され（ｈ－３４Ｆ８およびｈ－１９Ｆ６についてはｎ＝３、ｈ－４２Ａ５についてはｎ＝４）、ＡＶシャント血栓症のサルモデルにおける投与前からの血栓重量の変化を測定した。ビヒクルに対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図9】カニクイザルの出血時間へ及ぼす抗体ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５の影響を示す図である。漸増するレベルのｈ－３４Ｆ８（Ａ）、ｈ－１９Ｆ６（Ｂ）、またはｈ－４２Ａ５（Ｃ）がサルに静脈内投与され（３４Ｆ８およびｈ－１９Ｆ６についてはｎ＝３、ｈ－４２Ａ５についてはｎ＝４）、投与前および各投与後３０分の出血時間を評価した。
【図10】抗体ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５の抗血栓効果を示す図である。４群のサル（ｎ＝５）にビヒクル、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、またはｈ－４２Ａ５を２時間静脈内投与し、血栓症を誘導するために各動物の左大腿動脈にＦｅＣｌ３を適用した。８０％血栓性閉塞（Ａ）および１００％血栓性閉塞（Ｂ）までの時間を、血流速度をモニタリングすることによって測定した。ビヒクルに対して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。
【図11】抗体ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、またはｈ－４２Ａ５での治療は、サルにおいて出血時間を延長しなかったことを示す図である。４群のサル（ｎ＝５）にビヒクル、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、またはｈ－４２Ａ５を静脈内投与し、テンプレート出血時間を投与前および投与後１時間に測定した。ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５治療群の個々の出血時間を、それぞれ（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）に示す。ビヒクル、ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、またはｈ－４２Ａ５で治療したときの出血時間の変化を（Ｄ）に示す。
【図12】サル血漿の凝固時間へ及ぼす抗体ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５の影響を示す図である。４群のサル（ｎ＝５）にビヒクル、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、またはｈ－４２Ａ５をそれぞれ静脈内投与し、血漿調製ならびにＡＰＴＴおよびＰＴ凝固時間定量のために、投与前および投与後約３時間に血液を回収した。ＡＰＴＴ変化およびＰＴ変化をそれぞれ（Ａ）および（Ｂ）に示す。ビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図13】ヒトＦＸＩのアミノ酸配列（配列番号２０３）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明の以下の説明は、本発明のさまざまな実施形態を示すことのみを意図している。したがって、論じられた特定の修正は、本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱しない範囲で、さまざまな均等物、変更、および修正を行うことができることは、当業者には明らかであり、そのような同等の実施形態が本明細書に含まれることが理解される。
【0013】
内因性経路および外因性経路の両者がインビボ血液凝固カスケードに含まれる。接触活性化経路とも呼ばれる内因性経路は、表面界面との接触によって開始され、ＦＸＩＩの活性化をもたらす。内因性経路は、ＦＸＩ、ＦＩＸおよびＦＶＩＩＩも含む。組織因子（ＴＦ）経路とも呼ばれる外因性経路は、血管損傷によって開始され、ＴＦ－ＦＶＩＩａの活性化複合体の形成をもたらす。これらの２つの経路は合流して共通の経路を活性化し、プロトロンビンからトロンビンへの変換を引き起こし、最終的に架橋フィブリン血栓の形成をもたらす。本明細書で開示された抗体は、ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａに結合し、血液凝固の内因性経路を標的とする。ＦＸＩの構造とＦＸＩの血液凝固への関与は、さまざまな刊行物で報告されている。例えば、Ｅｍｓｌｅｙら、Ｂｌｏｏｄ、１１５（１３）：２５６９～２５７７（２０１０）を参照されたく、その内容を参照により組み込むものとする。
【0014】
抗ＦＸＩまたは抗ＦＸＩａ抗体
本明細書では、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはＦＸＩもしくはＦＸＩａのフラグメントに結合し、血栓の形成を阻害する抗体が提供される。これらの抗体は、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはＦＸＩもしくはＦＸＩａのフラグメント（例えば、Ａ３ドメインを含むフラグメント）に結合し、最大安全用量よりはるかに低い濃度で阻害効果を示すことができる。例えば、一部の実施形態では、０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．から３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．の間の抗体用量は、カニクイザルのＦＸＩからＦＸＩａへの変換に対して阻害効果を示す。さらに、本明細書で開示された抗体は、ヘパリンのような従来の抗凝固剤と比較して出血を引き起こす危険性が最小限であるため、安全性に優れた抗凝固剤として使用することができる。
本明細書では、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはＦＸＩもしくはＦＸＩａのフラグメントに結合し、血栓の形成を阻害する抗体が提供される。これらの抗体は、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはＦＸＩもしくはＦＸＩａのフラグメント（例えば、Ａ３ドメインを含むフラグメント）に結合し、最大安全用量よりはるかに低い濃度で阻害効果を示すことができる。例えば、一部の実施形態では、０．１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．から３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．の間の抗体用量は、カニクイザルのＦＸＩからＦＸＩａへの変換に対して阻害効果を示す。さらに、本明細書で開示された抗体は、ヘパリンのような従来の抗凝固剤と比較して出血を引き起こす危険性が最小限であるため、安全性に優れた抗凝固剤として使用することができる。
【0015】
本明細書で使用される場合、組成物または方法に関して「含む」という用語は、組成物または方法が少なくとも列挙された要素を含むことを意味する。「から本質的になる」という用語は、組成物または方法が列挙された要素を含み、組成物または方法の新規で基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない１つまたは複数の追加要素をさらに含んでよいことを意味する。例えば、列挙された要素から本質的になっている組成物は、これらの列挙された要素に加えて、単離および精製方法からの１つまたは複数の微量混入物質、リン酸緩衝食塩水などの薬学的に許容される担体、保存剤などを含んでもよい。「からなる」という用語は、組成物または方法が列挙された要素のみ含むことを意味する。各々の連結用語によって定義された実施形態は本発明の範囲内にある。
【0016】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の抗原、例えばＦＸＩ、ＦＸＩａ、またはＦＸＩもしくはＦＸＩａの特定のドメインもしくはフラグメント、例えばＡ３ドメインに特異的に結合するか、または免疫学的に反応する免疫グロブリン分子もしくはその免疫学的に活性な部分を表す。ある特定の実施形態では、本方法、組成物、およびキットで使用する抗体は、完全長免疫グロブリン分子であり、２本の重鎖と２本の軽鎖を含み、それぞれの重鎖と軽鎖には３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。天然の抗体に加えて「抗体」という用語は、合成抗体、細胞内抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ペプチボディーおよびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、多重特異性抗体、デュアルスペシフィック抗体、抗イディオタイプ抗体、ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディー）のような免疫グロブリンの遺伝子操作型または他の修飾型も含む。本明細書で開示された抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体が免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分であるこれらの実施形態では、抗体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆａｂ’ Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド結合したＦｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、またはダイアボディーであってもよい。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分であるものを含む本明細書で開示された抗体は、特定の抗原、例えばＦＸＩもしくはＦＸＩａに結合する能力、またはＡ３ドメインのようなＦＸＩもしくはＦＸＩａの特定のフラグメントに結合する能力を保持する。
【0017】
一部の実施形態では、本明細書で開示された抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体は、ヒトもしくは非ヒト宿主細胞を含む哺乳動物細胞株の発現に伴うリン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ニトロシル化、グリコシル化または脂質化のような翻訳後修飾を受けている。組換え抗体を産生する技術、ならびに組換え抗体のインビトロおよびインビボでの修飾の技術は、当技術分野で知られている。例えば、Ｌｉｕら、ｍＡｂｓ、６（５）：１１４５～１１５４（２０１４）を参照されたく、その内容を参照により組み込むものとする。
【0018】
また、本明細書で開示された抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体をコードするポリヌクレオチドまたは核酸が開示される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む。本明細書で開示された抗体またはその機能性フラグメントをコードする核酸を、ｐＴＴ５哺乳動物発現ベクターのようなベクターにクローニングすることができ、核酸を発現させて抗体またはその機能性フラグメントを産生できるように、ベクターはプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントをさらに含むことができる。
【0019】
本明細書で開示された抗体のいくつかの例の、ＶＨおよびＶＬおよびＣＤＲの配列を含む核酸（ＤＮＡ）および／またはアミノ酸（ＰＲＴ）配列を以下の表１に列挙する。
【表1】
【0020】
本明細書のある特定の実施形態では、ヒト化抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体が提供される。ヒトに天然に存在する抗体との類似性を高めるために抗体が修飾されるような、非ヒト種由来の抗体をヒト化するためのさまざまな技術が当技術分野で知られている。天然の抗体の各抗原結合ドメインに、６つのＣＤＲが存在する。これらのＣＤＲは、抗体がその３次元構造をとるときに抗原結合ドメインを形成するために特異的に配置された、アミノ酸の短い非連続配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる抗原結合ドメインの残りのアミノ酸は、分子間可変性が少なく、足場を形成してＣＤＲの正しい配置を可能にする。
【0021】
例えば、本明細書で開示された抗体のヒト化は、マウスまたはラットを免疫化することにより産生されるモノクローナル抗体のＣＤＲ移植により達成することができる。マウスモノクローナル抗体のＣＤＲは、ヒトフレームワークに移植でき、続いて、ヒト定常領域に結合して、ヒト化抗体が得られる。簡単に述べれば、ヒト生殖系列抗体配列データベース、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）、ＩＮＮ（医薬品国際一般名称、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ Ｎａｍｅｓ）データベース、およびその他の適切なデータベースは検索可能で、抗体に最も類似したフレームワークを検索により同定できる。さらに、ドナー残基へのいくつかの逆突然変異は、ヒトアクセプターフレームワークで行われる。一部の実施形態では、可変領域は、ヒトＩｇＧ定常領域へ連結される。例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４Ｆｃドメインを使用することができる。既存の技術に基づいて、非ヒト種によって産生されたモノクローナル抗体をヒト化することは、当業者の範囲内である。
【0022】
いくつかの例のヒト化抗体の可変領域の配列を、以下の表２に示す。
【表2】
【0023】
本明細書で提供される抗体は、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはそのフラグメント（例えば、Ａ３ドメインを含むフラグメント）に対する結合親和性を保持しながら、それらのアミノ酸配列に１つまたは複数の変異を含む、本明細書で開示された配列の変種を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号９、１０、２５、２６、４１、４２、５７、５８、７３、７４、８９、９０、１０５、１０６、１２１、１２２、１３７、１３８、１５３、１５４、１６９、１７０、１８５、１８６、および１９７～２０２、またはＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／もしくはそのフラグメントに対する結合親和性を保持するそのフラグメントからなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変領域を含む。
【0024】
本開示には、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはそのフラグメント（例えば、Ａ３ドメインを含むフラグメント）へ結合する抗体をコードする核酸の変種も含まれる。一部の実施形態では、抗体をコードする核酸は、配列番号１、２、１７、１８、３３、３４、４９、５０、６５、６６、８１、８２、９７、９８、１１３、１１４、１２９、１３０、１４５、１４６、１６１、１６２、１７７、および１７８からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％と同一である核酸配列を有する可変領域、またはＦＸＩ、ＦＸＩａ、および／またはそのフラグメントに対する結合親和性を有するポリペプチドをコードするそのフラグメントを含む。
【0025】
医薬組成物
本明細書で開示された抗体は、医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、保存剤、またはそれらの組合せをさらに含んでもよい。医薬組成物は、例えば、注射用製剤、凍結乾燥製剤、液体製剤、その他のさまざまな製剤を有することができる。製剤および投与経路に応じて、補助剤、担体、賦形剤、保存のような適した添加物を選択する。例えば、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９６（１）：１～２６（２００７）を参照されたく、その内容を参照により組み込むものとする。
本明細書で開示された抗体は、医薬組成物に製剤化することができる。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、保存剤、またはそれらの組合せをさらに含んでもよい。医薬組成物は、例えば、注射用製剤、凍結乾燥製剤、液体製剤、その他のさまざまな製剤を有することができる。製剤および投与経路に応じて、補助剤、担体、賦形剤、保存のような適した添加物を選択する。例えば、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９６（１）：１～２６（２００７）を参照されたく、その内容を参照により組み込むものとする。
【0026】
医薬組成物は、組成物を使用するための使用説明書とともにキットに含めることができる。
【0027】
治療方法
血栓症を患っている、および／または血栓症を発症する危険性が高まっている対象の血栓症を治療および／または予防する方法が本明細書で提供される。対象における血栓の形成を阻害する方法も提供される。内因性経路に介在するために、これらの方法は、本明細書で提供された治療有効量の抗ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ抗体を投与することを伴う。一部の実施形態では、これらの方法は、本明細書で提供される抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
血栓症を患っている、および／または血栓症を発症する危険性が高まっている対象の血栓症を治療および／または予防する方法が本明細書で提供される。対象における血栓の形成を阻害する方法も提供される。内因性経路に介在するために、これらの方法は、本明細書で提供された治療有効量の抗ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ抗体を投与することを伴う。一部の実施形態では、これらの方法は、本明細書で提供される抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。
【0028】
本明細書で開示された方法は、それを必要とする対象の血栓症に関連する合併症もしくは状態を予防および／または治療するために使用することができる。血栓症は、塞栓性脳卒中、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、および肺塞栓症（ＰＥ）のような静脈血栓症、急性冠不全症候群（ＡＣＳ）のような動脈血栓症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、および末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、のような多数の合併症または状態を引き起こすか、またはそれと関連している。血栓症と関連する他の状態は、例えば、手術患者、動けない患者、がんの患者、心不全の患者、妊娠中の患者、または血栓症を引き起こす可能性のある他の病状を有する患者、におけるＶＴＥの高い危険性を含む。本明細書で開示された方法は、予防的抗凝固剤療法、すなわち血栓予防に関する。これらの方法は、上記に開示された血栓症関連合併症を患う対象に、本明細書で開示された治療有効量の抗ＦＸＩおよび／またはＦＸＩａ抗体、または抗ＦＸＩおよび／もしくはＦＸＩａ抗体を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを伴う。抗体または医薬組成物は、血栓症関連の合併症もしくは状態を治療または予防するために、単独でまたは任意の他の治療法と組み合わせて投与することができる。
【0029】
それを必要とする対象の敗血症を治療および／または予防する方法も提供される。敗血症患者に抗凝固剤を投与して、死亡率または罹患率を改善することが試みられた。しかし、抗凝固剤によって引き起こされる望ましくない出血のために、試みは失敗した。本明細書で開示された抗体は、抗生物質のような敗血症を治療するための他の治療薬と組み合わせて二次療法として使用することができる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物の対象、好ましくはヒトを表す。「それを必要とする対象」は、血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態と診断されているか、または血栓症または血栓症に関連する合併症もしくは状態を発症する危険性が高い対象を表す。「対象」および「患者」という語句は、本明細書で同じ意味で使用される。
【0031】
状態に関して本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、状態を部分的または完全に緩和すること、状態を予防すること、状態の発生または再発の可能性を減らすこと、状態の進行または進展を遅らせること、または状態に関連する１つもしくは複数の症状の進展を除外する、軽減する、もしくは遅らせることを表す。血栓症および／または血栓症に関連する合併症もしくは状態に関しては、「治療すること」は、既存の血栓が大きくなるのを予防もしくは遅らせること、および／または血栓の形成を予防もしくは遅らせることを表す場合がある。一部の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、抗体またはその機能性フラグメントを投与されていない対象と比較して、対象の血栓の数またはサイズが減少していることを意味する。一部の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、本明細書で開示された抗体または医薬組成物を受けている対象では、そのような治療を受けていない対象と比較して、血栓症および／または血栓症関連状態もしくは合併症の１つまたは複数の症状が軽減されていることを意味する。
【0032】
本明細書で使用される場合、抗体または医薬組成物の「治療有効量」は、血栓症の治療および／または予防のような、対象において所望の治療効果をもたらす抗体または医薬組成物の量である。ある特定の実施形態では、治療有効量は、最大の治療効果を生じる抗体または医薬組成物の量である。他の実施形態では、治療有効量は、最大の治療効果よりも少ない治療効果をもたらす。例えば、治療有効量は、最大の治療効果をもたらす投薬量に関連する１つまたは複数の副作用を回避する一方で、治療効果を生じる量であってもよい。特定の組成物の治療有効量は、これに限定されるものではないが、治療組成物の特性（例えば、活性、薬物動態、薬物動力学、およびバイオアベイラビリティ）、対象の生理的状態（例えば、年齢、体重、性別、疾患タイプおよびステージ、病歴、一般的な物理的状態、所与の投薬量に対する応答性、および他の現在の薬剤）、組成物中の任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、および防腐剤の特質、ならびに投与経路、を含むさまざまな因子に基づいて異なる。臨床および薬理学の当業者は、日常業務の実験、すなわち抗体または医薬組成物の投与に対する対象の応答をモニタリングし、その結果投薬量を調整することにより、治療有効量を決定することができるだろう。追加の手引きについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２０１２、ならびにＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１２版、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０１１を参照されたく、本明細書でその全開示内容を参照により組み込むものとする。
【0033】
一部の実施形態では、本明細書で開示された抗体の治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【0034】
皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、髄腔内投与、または腹腔内投与、のような適した投与経路を選択することは、当業者の範囲内である。それを必要とする対象を治療するために、抗体または医薬組成物は、即時放出、放出制御または持続放出のために連続的または間欠的に投与することができる。さらに、抗体または医薬組成物は、１日３回、１日２回、または１日１回、３日間、５日間、７日間、１０日間、２週間、３週間、または４週間の期間にわたり投与することができる。抗体または医薬組成物は、所定の時間にわたって投与してもよい。あるいは、特定の治療ベンチマークに達するまで、抗体または医薬組成物を投与してもよい。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の治療ベンチマークを評価して、抗体または医薬組成物の投与を継続するかどうかを決定するステップを含む。
【0035】
抗体を産生する方法
また、本明細書で開示された抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を産生する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、これらの方法は、抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体をコードする核酸をベクターにクローニングし、宿主細胞をベクターで形質転換し、宿主細胞を培養して抗体を発現させるステップを伴う。発現させた抗体は、任意の既知の技術を使用して宿主細胞から精製することができる。ｐＴＴ５ベクター、およびｐｃＤＮＡ３ベクターのようなさまざまな発現ベクター、ならびにＣＨＯ細胞（例えばＣＨＯ－Ｋ１およびＥｘｐｉＣＨＯ）、およびＨＥＫ１９３Ｔ細胞のようなさまざまな宿主細胞株を使用することができる。
また、本明細書で開示された抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体を産生する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、これらの方法は、抗ＦＸＩおよび／または抗ＦＸＩａ抗体をコードする核酸をベクターにクローニングし、宿主細胞をベクターで形質転換し、宿主細胞を培養して抗体を発現させるステップを伴う。発現させた抗体は、任意の既知の技術を使用して宿主細胞から精製することができる。ｐＴＴ５ベクター、およびｐｃＤＮＡ３ベクターのようなさまざまな発現ベクター、ならびにＣＨＯ細胞（例えばＣＨＯ－Ｋ１およびＥｘｐｉＣＨＯ）、およびＨＥＫ１９３Ｔ細胞のようなさまざまな宿主細胞株を使用することができる。
【0036】
上記に開示された方法により産生された抗体も本開示に含まれる。抗体は、１つまたは複数の翻訳後修飾を受けている場合がある。
【0037】
以下の例は、実施形態をより良く説明するために提供され、請求項に係る実施形態の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の材料が言及されている限り、それは単に説明の目的のためであり、本発明を限定することは意図されていない。当業者は、発明能力を行使することなく、および本発明の範囲から逸脱しない範囲で、同等の手段または反応物を開発してもよい。本発明の範囲内にとどまる一方で、本明細書に記載の手順に多くの変更を行うことができることが理解されるであろう。そのような変更が本発明の範囲内に含まれることは、本発明者らの意図である。
【実施例】
【0038】
実施例１：抗ＦＸＩ抗体の生成および配列決定
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＷｉｓｔａｒラットをヒトＦＸＩで免疫し、免疫応答の良好な動物の脾細胞をハイブリドーマの調製のために回収し、限界希釈法によるサブクローニングを行った。所望の抗ＦＸＩ抗体３Ｇ１２、５Ｂ２、７Ｃ９、７Ｆ１、１３Ｆ４、１９Ｆ６、２１Ｆ１２、３４Ｆ８、３８Ｅ４、４２Ａ５、４２Ｆ４、および４５Ｈ１を発現している１２のモノクローナルハイブリドーマクローンを、捕捉ＥＬＩＳＡおよび機能性スクリーニングを使用して得た。
ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＷｉｓｔａｒラットをヒトＦＸＩで免疫し、免疫応答の良好な動物の脾細胞をハイブリドーマの調製のために回収し、限界希釈法によるサブクローニングを行った。所望の抗ＦＸＩ抗体３Ｇ１２、５Ｂ２、７Ｃ９、７Ｆ１、１３Ｆ４、１９Ｆ６、２１Ｆ１２、３４Ｆ８、３８Ｅ４、４２Ａ５、４２Ｆ４、および４５Ｈ１を発現している１２のモノクローナルハイブリドーマクローンを、捕捉ＥＬＩＳＡおよび機能性スクリーニングを使用して得た。
【0039】
これらの抗体の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列を決定するために、標準ＲＴ－ＰＣＲ法によって、対応するハイブリドーマ細胞からＶＬおよびＶＨをコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＣＤＲの配列を含む例となる抗体のＶＬおよびＶＨ配列を表１に示す。
【0040】
実施例２：活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイおよびプロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイを使用したヒト血漿における抗凝固活性の定量
ＡＰＴＴアッセイは内因性および一般的な凝固経路の活性を測定し、一方ＰＴアッセイは外因性および一般的な凝固経路の活性を測定する。本実験で試験した抗体は、１９Ｆ６、３４Ｆ８、４２Ａ５、１Ａ６および１４Ｅ１１であった。対照抗体の可変領域の配列は、米国特許第８，３８８，９５９号および米国特許出願公開第２０１３／０１７１１４４号から入手し、ＩｇＧ４に再フォーマット化した。これらの抗体を、次いで、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞システムを使用して発現させた。Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．から購入した標準ヒト血漿を、０～４００ｎＭのさまざまな濃度の等量のさまざまな抗体と５分間混合した後、ＣＡ６００分析器で試験した。ＡＰＴＴアッセイでは、５０μＬの血漿－抗体混合物と２５μＬのＡＰＴＴ試薬（ＳＭＮ １０４４５７０９、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）とを３７℃で４分間混合した。次いで２５μＬのＣａＣｌ２溶液（２５ｍＭ、ＳＭＮ １０４４６２３２、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）を添加し、血栓形成の時間を測定した。ＰＴアッセイでは、５０μＬの血漿－抗体混合物を等量のＰＴ試薬（ＳＭＮ １０４４６４４２、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）と３７℃で混合し、血栓形成の時間を測定した。
ＡＰＴＴアッセイは内因性および一般的な凝固経路の活性を測定し、一方ＰＴアッセイは外因性および一般的な凝固経路の活性を測定する。本実験で試験した抗体は、１９Ｆ６、３４Ｆ８、４２Ａ５、１Ａ６および１４Ｅ１１であった。対照抗体の可変領域の配列は、米国特許第８，３８８，９５９号および米国特許出願公開第２０１３／０１７１１４４号から入手し、ＩｇＧ４に再フォーマット化した。これらの抗体を、次いで、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞システムを使用して発現させた。Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．から購入した標準ヒト血漿を、０～４００ｎＭのさまざまな濃度の等量のさまざまな抗体と５分間混合した後、ＣＡ６００分析器で試験した。ＡＰＴＴアッセイでは、５０μＬの血漿－抗体混合物と２５μＬのＡＰＴＴ試薬（ＳＭＮ １０４４５７０９、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）とを３７℃で４分間混合した。次いで２５μＬのＣａＣｌ２溶液（２５ｍＭ、ＳＭＮ １０４４６２３２、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）を添加し、血栓形成の時間を測定した。ＰＴアッセイでは、５０μＬの血漿－抗体混合物を等量のＰＴ試薬（ＳＭＮ １０４４６４４２、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）と３７℃で混合し、血栓形成の時間を測定した。
【0041】
図１に示すように、試験したすべての抗体は、比較的低濃度、例えば最大１００ｎＭ（または１４Ｅ１１では最大２００ｎＭ）で濃度依存的にＡＰＴＴを増加させ、一方これらの抗体はＰＴへは有意の影響を及ぼさなかった（データは示さない）。試験したすべての抗体は、凝固の内因性経路を阻害するが外因性経路を阻害しないことを、これらの結果は示している。
【0042】
実施例３：活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイを使用した非ヒト種の血漿における抗凝固活性の定量
凝固に及ぼす１９Ｆ６、３４Ｆ８および４２Ａ５を含むさまざまな抗体の影響を、実施例２の記載と同じ方法を使用して、マウス、ラット、およびサルの血漿で評価した。試験した抗体はいずれもマウスおよびラット血漿のＡＰＴＴに影響を及ぼさなかったが、図２に示すように、それらはすべて比較的低濃度で濃度依存的にサル血漿のＡＰＴＴを増加させ、このことは試験した抗体がサルＦＸＩ／ＦＸＩａと交差活性を持つが、マウスまたはラットＦＸＩ／ＦＸＩａとは持たないことを示す。
凝固に及ぼす１９Ｆ６、３４Ｆ８および４２Ａ５を含むさまざまな抗体の影響を、実施例２の記載と同じ方法を使用して、マウス、ラット、およびサルの血漿で評価した。試験した抗体はいずれもマウスおよびラット血漿のＡＰＴＴに影響を及ぼさなかったが、図２に示すように、それらはすべて比較的低濃度で濃度依存的にサル血漿のＡＰＴＴを増加させ、このことは試験した抗体がサルＦＸＩ／ＦＸＩａと交差活性を持つが、マウスまたはラットＦＸＩ／ＦＸＩａとは持たないことを示す。
【0043】
実施例４：抗ＦＸＩ抗体のヒト化
治療薬としてのマウスモノクローナル抗体の直接使用は、短い半減期およびヒト抗マウス抗体応答の誘発により妨げられてきた。この問題に対する１つの解決策はマウス抗体をヒト化することである。いくつかの抗体は、ＣＤＲ移植によるヒト化を受けた。各マウス抗体のＶＬおよびＶＨの両方に適したヒトアクセプターフレームワークを特定し、選択されたヒトフレームワークにさまざまな数の逆突然変異を導入して、得られた抗体の構造および／または機能を維持した。これらのヒト化抗体の親和性および機能が、対応する非修飾抗体よりも実質的に劣っていない場合、修飾された抗体はヒト化に成功したと考えられた。それぞれｈ－１９Ｆ６、ｈ－３４Ｆ８、およびｈ－４２Ａ５、と記載された１９Ｆ６、３４Ｆ８および４２Ａ５の３つのヒト化ＶＨおよびＶＬ配列を表２に示す。
治療薬としてのマウスモノクローナル抗体の直接使用は、短い半減期およびヒト抗マウス抗体応答の誘発により妨げられてきた。この問題に対する１つの解決策はマウス抗体をヒト化することである。いくつかの抗体は、ＣＤＲ移植によるヒト化を受けた。各マウス抗体のＶＬおよびＶＨの両方に適したヒトアクセプターフレームワークを特定し、選択されたヒトフレームワークにさまざまな数の逆突然変異を導入して、得られた抗体の構造および／または機能を維持した。これらのヒト化抗体の親和性および機能が、対応する非修飾抗体よりも実質的に劣っていない場合、修飾された抗体はヒト化に成功したと考えられた。それぞれｈ－１９Ｆ６、ｈ－３４Ｆ８、およびｈ－４２Ａ５、と記載された１９Ｆ６、３４Ｆ８および４２Ａ５の３つのヒト化ＶＨおよびＶＬ配列を表２に示す。
【0044】
実施例５：ヒトＦＸＩに対する抗ＦＸＩ抗体の親和性の定量
ＦＸＩ／ＦＸＩａに対する抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器で実行された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して測定した。本明細書で開示された抗体の可変領域をヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインに連結することによりヒト化抗体を構築し、組換え体をＣＨＯ細胞で発現させた。これらの抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体で予め固定化されたＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップに捕捉された。
ＦＸＩ／ＦＸＩａに対する抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器で実行された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して測定した。本明細書で開示された抗体の可変領域をヒトＩｇＧ４Ｆｃドメインに連結することによりヒト化抗体を構築し、組換え体をＣＨＯ細胞で発現させた。これらの抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体で予め固定化されたＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップに捕捉された。
【0045】
次いで異なる濃度の精製抗原ＦＸＩまたはＦＸＩａ（０．００５～１μｇ／ｍＬ）をＣＭ５チップに１８０秒間流して抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体と会合させ、その後１８００秒間解離させた。結合データを収集し、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、ＦＸＩ／ＦＸＩａと試験抗体との親和性を分析した。固定化ｈ－１９Ｆ６、ｈ－３４Ｆ８、およびｈ－４２Ａ５に結合するＦＸＩ／ＦＸＩａのＳＰＲセンサーグラムを図３に示す。図３に示すように、各抗体の応答（ＲＵ）は、ＦＸＩまたはＦＸＩａの濃度が増加するにつれて高くなった。ＦＸＩおよびＦＸＩａに対するｈ－１９Ｆ６、ｈ－３４Ｆ８、およびｈ－４２Ａ５の解離定数（ＫＤ）を算出し、表３に詳述した。ＦＸＩおよびＦＸＩａに対する各抗体の親和性は、両者の差が１０倍未満であるため、同一であると見なされる。
【表3】
【0046】
実施例６：ＦＸＩ上の抗ＦＸＩ抗体の結合部位の決定
ＦＸＩ上の１９Ｆ６および４２Ａ５の結合部位を、ＳＰＲ技術を使用して決定した。簡潔に述べれば、ヒトＩｇＧ捕捉抗体はＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップ上に予め固定化され、組換えｈ－１９Ｆ６またはｈ－４２Ａ５はチップ内を流れることにより捕捉された。抗体の流れる時間を調整することにより、等量（１５相対ユニット）のｈ－１９Ｆ６とｈ－４２Ａ５とが捕捉された。次いで、個々のアップルドメイン（ａｐｐｌｅ ｄｏｍａｉｎ）が、ヒトプレカリクレイン（ＦＸＩ／ＰＫキメラ）の対応するドメインに置換された野生型ＦＸＩまたはキメラＦＸＩをチップに１８０秒間流してｈ－１９Ｆ６またはｈ－４２Ａ５と会合させ、その後１８００秒間解離させた。ＳＰＲアッセイではＦＸＩの１種類の濃度（野生型またはキメラ）のみが試験されたため、結合データは高性能速度論モードで分析された。結果は、ＦＸＩのＡ３ドメインが対応するＰＫドメインと置換された場合を除き、ｈ－１９Ｆ６とｈ－４２Ａ５の両方がＦＸＩならびにＦＸＩ／ＰＫキメラに結合することを示し、このことは、ＦＸＩ上のｈ－１９Ｆ６およびｈ－４２Ａ５の一部または完全なエピトープがＡ３ドメインに位置することを示している。
ＦＸＩ上の１９Ｆ６および４２Ａ５の結合部位を、ＳＰＲ技術を使用して決定した。簡潔に述べれば、ヒトＩｇＧ捕捉抗体はＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップ上に予め固定化され、組換えｈ－１９Ｆ６またはｈ－４２Ａ５はチップ内を流れることにより捕捉された。抗体の流れる時間を調整することにより、等量（１５相対ユニット）のｈ－１９Ｆ６とｈ－４２Ａ５とが捕捉された。次いで、個々のアップルドメイン（ａｐｐｌｅ ｄｏｍａｉｎ）が、ヒトプレカリクレイン（ＦＸＩ／ＰＫキメラ）の対応するドメインに置換された野生型ＦＸＩまたはキメラＦＸＩをチップに１８０秒間流してｈ－１９Ｆ６またはｈ－４２Ａ５と会合させ、その後１８００秒間解離させた。ＳＰＲアッセイではＦＸＩの１種類の濃度（野生型またはキメラ）のみが試験されたため、結合データは高性能速度論モードで分析された。結果は、ＦＸＩのＡ３ドメインが対応するＰＫドメインと置換された場合を除き、ｈ－１９Ｆ６とｈ－４２Ａ５の両方がＦＸＩならびにＦＸＩ／ＰＫキメラに結合することを示し、このことは、ＦＸＩ上のｈ－１９Ｆ６およびｈ－４２Ａ５の一部または完全なエピトープがＡ３ドメインに位置することを示している。
【0047】
実施例７：抗体によるＦＸＩａの機能的中和
特異的な発色基質、Ｓ－２３６６（Ｄｉａｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．）の切断を測定することによって、ヒトＦＸＩａ活性を決定した。抗体の阻害活性を試験するために、抗体ｈ－１９Ｆ６、ｈ－３４Ｆ８およびｈ－４２Ａ５を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に最終濃度５ｎＭのＦＸＩａとともに、５分間、室温で予めインキュベートした。次いで等量の１ｍＭ Ｓ－２３６６を添加してＦＸＩａ切断反応を開始し、Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して４０５ｎｍの吸光度変化を連続的にモニターした。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析し、図４に示す。ｈ－１９Ｆ６、ｈ－３４Ｆ８、およびｈ－４２Ａ５の見掛けのＫｉの計算値は、それぞれ０．６７、２．０８、および１．４３ｎＭである。したがって、試験した３つの抗体はすべて、比較的低濃度でＦＸＩａに十分な阻害効果を示した。
特異的な発色基質、Ｓ－２３６６（Ｄｉａｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．）の切断を測定することによって、ヒトＦＸＩａ活性を決定した。抗体の阻害活性を試験するために、抗体ｈ－１９Ｆ６、ｈ－３４Ｆ８およびｈ－４２Ａ５を、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に最終濃度５ｎＭのＦＸＩａとともに、５分間、室温で予めインキュベートした。次いで等量の１ｍＭ Ｓ－２３６６を添加してＦＸＩａ切断反応を開始し、Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して４０５ｎｍの吸光度変化を連続的にモニターした。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析し、図４に示す。ｈ－１９Ｆ６、ｈ－３４Ｆ８、およびｈ－４２Ａ５の見掛けのＫｉの計算値は、それぞれ０．６７、２．０８、および１．４３ｎＭである。したがって、試験した３つの抗体はすべて、比較的低濃度でＦＸＩａに十分な阻害効果を示した。
【0048】
実施例８：抗体によるＦＸＩａが媒介するＦＩＸ活性化の阻害
ヒトＦＩＸ（２００ｎＭ）を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中のＦＸＩａ（５ｎＭ）とともに、室温で１μＭ対照ＩｇＧまたはｈ－１９Ｆ６またはｈ－４２Ａ５とインキュベートした。０、１５、３０、４５、および６０分間隔で、５０μＬの試料をドデシル硫酸試料緩衝液中に回収した。試料を１０％非還元ゲル上でサイズ分画し、ポリフッ化ビニリデン膜へ移した。ＦＩＸならびにＦＩＸａレベルを決定するために、ヤギ抗ヒトＦＩＸ ＩｇＧ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用してウエスタンブロット法を行った。図５に示すように、ｈ－１９Ｆ６とｈ－４２Ａ５は両者とも、対照と比較して、ＦＸＩによって誘導されるＦＩＸａ形成を阻害する。
ヒトＦＩＸ（２００ｎＭ）を、５ｍＭ ＣａＣｌ２を含むＰＢＳ中のＦＸＩａ（５ｎＭ）とともに、室温で１μＭ対照ＩｇＧまたはｈ－１９Ｆ６またはｈ－４２Ａ５とインキュベートした。０、１５、３０、４５、および６０分間隔で、５０μＬの試料をドデシル硫酸試料緩衝液中に回収した。試料を１０％非還元ゲル上でサイズ分画し、ポリフッ化ビニリデン膜へ移した。ＦＩＸならびにＦＩＸａレベルを決定するために、ヤギ抗ヒトＦＩＸ ＩｇＧ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用してウエスタンブロット法を行った。図５に示すように、ｈ－１９Ｆ６とｈ－４２Ａ５は両者とも、対照と比較して、ＦＸＩによって誘導されるＦＩＸａ形成を阻害する。
【0049】
実施例９：カニクイザルの凝固時間に及ぼす抗ＦＸＩ抗体の影響の評価
カニクイザルに、指示された用量のさまざまな抗体を静脈内投与した。投与前および投与後０．５、１、３、６、１２、および２４時間に、上肢の表在静脈から血液を回収し、ＡＰＴＴおよびＰＴ定量用にクエン酸添加血漿を調製した。ＡＰＴＴ試験では、５０μＬの希釈した血漿試料と２５μＬのＡＰＴＴ試薬（ＳＭＮ １０４４５７０９、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）とを混合し、３７℃で４分間インキュベートした。次いで２５μＬのＣａＣｌ２溶液（２５ｍＭ、ＳＭＮ １０４４６２３２、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）を添加し、血栓形成の時間を測定した。ＰＴ試験では、５０μＬの希釈した血漿試料を、等量のＰＴ試薬（ＳＭＮ １０４４６４４２、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）と混合し、３７℃でインキュベートし、血栓形成の時間を測定した。試験した３つの抗体はすべて、図６に示すように用量依存的にＡＰＴＴを増加させ、図７に示すようにいずれもＰＴに影響を及ぼさなかった。
カニクイザルに、指示された用量のさまざまな抗体を静脈内投与した。投与前および投与後０．５、１、３、６、１２、および２４時間に、上肢の表在静脈から血液を回収し、ＡＰＴＴおよびＰＴ定量用にクエン酸添加血漿を調製した。ＡＰＴＴ試験では、５０μＬの希釈した血漿試料と２５μＬのＡＰＴＴ試薬（ＳＭＮ １０４４５７０９、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）とを混合し、３７℃で４分間インキュベートした。次いで２５μＬのＣａＣｌ２溶液（２５ｍＭ、ＳＭＮ １０４４６２３２、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）を添加し、血栓形成の時間を測定した。ＰＴ試験では、５０μＬの希釈した血漿試料を、等量のＰＴ試薬（ＳＭＮ １０４４６４４２、Ｓｙｍｅｎｓ Ｉｎｃ．）と混合し、３７℃でインキュベートし、血栓形成の時間を測定した。試験した３つの抗体はすべて、図６に示すように用量依存的にＡＰＴＴを増加させ、図７に示すようにいずれもＰＴに影響を及ぼさなかった。
【0050】
実施例１０：カニクイザルの動静脈（ＡＶ）シャント血栓症および尾静脈出血モデルにおける抗ＦＸＩ抗体の影響の評価
血栓症と出血時間の両者を、試験した各抗体の複数用量について同じ動物で評価した。本実験に含まれる抗体は、ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ４２Ａ５であった。簡潔に述べれば、出血時間と血栓症を、投与前と抗体の各投与後３０分で連続的に評価した。出血／血栓症の評価は、投与前および漸増する３つの用量レベル（０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇ）の投与後の４回行った。
血栓症と出血時間の両者を、試験した各抗体の複数用量について同じ動物で評価した。本実験に含まれる抗体は、ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ４２Ａ５であった。簡潔に述べれば、出血時間と血栓症を、投与前と抗体の各投与後３０分で連続的に評価した。出血／血栓症の評価は、投与前および漸増する３つの用量レベル（０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇ）の投与後の４回行った。
【0051】
ＡＶシャント血栓症の場合、予め計量した１０ｃｍ長の絹糸を含むシャントデバイスを大腿動脈と大腿静脈のカニューレを接続するために適用し、シャントに１０分間血液を流した。次いで、糸をシャントから除去し、再び計量した。糸の血栓重量は、血流の前後の糸重量の差として算出された。
【0052】
出血時間の評価のために、２ｍＬのシリンジを動物の尾静脈に挿入した。シリンジ内の血液量の増加が止まったとき、経過時間を出血時間として手動で記録した。
【0053】
【0054】
実施例１１：カニクイザルの塩化第二鉄誘導動脈血栓症およびテンプレート出血時間に及ぼす抗ＦＸＩ抗体の影響の評価
カニクイザルに１．５ｍｇ／ｋｇのＺｏｌｅｔｉｌで予め麻酔をかけ、挿管し、人工呼吸器で換気した。麻酔はイソフルランで維持された。血圧、心拍数、および体温は、手順全体の間モニターされた。ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５を含む試験した抗体、またはビヒクル対照を、ＦｅＣｌ３適用の２時間前に注射により四肢静脈から投与した。左大腿動脈を露出させ、鈍的切開により分離した。ドップラー血流プローブを動脈に設置し、血流を連続的に記録した。ＦｅＣｌ３を適用前に、血流を少なくとも５分間測定した。次いで２片のろ紙を予めＦｅＣｌ３に浸し、プローブの上流の血管の外膜表面に１０分間適用した。ろ紙を除去した後、適用部位を生理食塩水で洗浄した。血流が０に下がるまで、連続的に測定した。８０％閉塞（ベースライン血流の２０％に血流が低下する）までの時間および１００％閉塞（血流が０に低下する）までの時間を記録した。同一の動物で、投与前および投与１時間後にテンプレート出血時間を評価した。
カニクイザルに１．５ｍｇ／ｋｇのＺｏｌｅｔｉｌで予め麻酔をかけ、挿管し、人工呼吸器で換気した。麻酔はイソフルランで維持された。血圧、心拍数、および体温は、手順全体の間モニターされた。ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５を含む試験した抗体、またはビヒクル対照を、ＦｅＣｌ３適用の２時間前に注射により四肢静脈から投与した。左大腿動脈を露出させ、鈍的切開により分離した。ドップラー血流プローブを動脈に設置し、血流を連続的に記録した。ＦｅＣｌ３を適用前に、血流を少なくとも５分間測定した。次いで２片のろ紙を予めＦｅＣｌ３に浸し、プローブの上流の血管の外膜表面に１０分間適用した。ろ紙を除去した後、適用部位を生理食塩水で洗浄した。血流が０に下がるまで、連続的に測定した。８０％閉塞（ベースライン血流の２０％に血流が低下する）までの時間および１００％閉塞（血流が０に低下する）までの時間を記録した。同一の動物で、投与前および投与１時間後にテンプレート出血時間を評価した。
【0055】
３つの抗体すべてがＦｅＣｌ３誘導動脈血栓症へ及ぼす影響を研究した。４群のサルをビヒクル対照、ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、またはｈ－４２Ａ５でそれぞれ２時間治療し、血栓症を誘導するために各動物の左大腿動脈にＦｅＣｌ３を適用した。下流の血流速度をモニターした。ビヒクル対照群の８０％および１００％血栓性閉塞までの時間は、それぞれ１４．６６±１．３０分および１８．５０±１．７６分であった。０．３ｍｇ／ｋｇのｈ－３４Ｆ８またはｈ－４２Ａ５で予め治療すると、それぞれ、図１０に示すように、８０％閉塞までの時間が５９．５３±１６．９５分および４０．８０±７．９４分に有意に遅延し、１００％閉塞までの時間が７０．４０±２０．７６分および５０．６１±９．４８分に有意に遅延した。図１０に示すように、８０％閉塞（２６．４３±５．７２分）および１００％閉塞（３２．７８±５．０９分）までの時間の延長も、ｈ－１９Ｆ６で治療したサルで観察されたが、ビヒクル対照群と比較した場合、統計的に有意な差はなかった。
【0056】
テンプレート出血時間に関して、抗体が止血に及ぼす影響を評価した。各試験品について、投与前と投与後１時間の間に有意差は認められなかった（図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃ）。ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５治療後の出血時間の変化は、ビヒクル対照治療後の出血時間の変化と変わらなかった（図１１Ｄ）。
【0057】
抗体がサル血漿のエクスビボ凝固時間に及ぼす影響も評価した。予想通り、図１２Ａに示すように、０．３ｍｇ／ｋｇのｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、およびｈ－４２Ａ５による治療は、ＡＰＴＴをそれぞれ３．２９±０．２０、１．６７±０．０９、および２．８７±０．１０倍有意に延長したが、ビヒクル対照治療ではＡＰＴＴの増加は観察されなかった。さらに、図１２Ｂに示すように、ｈ－３４Ｆ８、ｈ－１９Ｆ６、またはｈ－４２Ａ５による治療はＰＴに影響を及ぼさなかった。
【0058】
したがって、本明細書で開示された抗体は、凝固の内因性経路を効率的に阻害する一方で、長期出血の有害作用がないことが予想外に見いだされた。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】