特許 7271474 炎症性サイトカインレベル阻害剤およびサイトカイン放出症候群の治療薬物を製造するに用いられる医薬組成物の用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-04-28

(45)【発行日】2023-05-11

(54)【発明の名称】炎症性サイトカインレベル阻害剤およびサイトカイン放出症候群の治療薬物を製造するに用いられる医薬組成物の用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/41 20060101AFI20230501BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20230501BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230501BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230501BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230501BHJP

【ＦＩ】

A61K36/41

A61P37/02

A61P3/10

A61P43/00 121

A61P37/06

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020094306

(22)【出願日】2020-05-29

(65)【公開番号】P2021091651

(43)【公開日】2021-06-17

【審査請求日】2020-05-29

(31)【優先権主張番号】16/710,004

(32)【優先日】2019-12-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515142145

【氏名又は名称】國璽幹細胞應用技術股▲分▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100197642

【弁理士】

【氏名又は名称】南瀬 透

(74)【代理人】

【識別番号】100099508

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 久

(74)【代理人】

【識別番号】100182567

【弁理士】

【氏名又は名称】遠坂 啓太

(72)【発明者】

【氏名】蔡侑珍

(72)【発明者】

【氏名】▲黄▼奇英

(72)【発明者】

【氏名】莊明熙

(72)【発明者】

【氏名】林珀丞

(72)【発明者】

【氏名】李家▲シン▼

【審査官】石井 裕美子

(56)【参考文献】

【文献】日本臨床（増刊） 最新がん薬物療法学，2014年，Vol.72,Suppl.2，pp.309-314

【文献】J Sci Food Agric，2016年，Vol.96，pp.1772-1776

【文献】International Journal of Molecular Sciences，2019年03月04日，Vol.20，Article No.1103

【文献】Food and Chimical Toxicology，2019年01月14日，Vol.125，pp.333-340

【文献】Scientific Reports，2018年，Vol.8,No.1，Article No.12471

【文献】FEBS Letters，1982年，Vol.148,No.1，pp.17-20

【文献】Life Sciences，2002年，Vol.70,No.7，pp.821-831

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受ける個体に対し投与することで、前記個体の細胞内においてＣＡＲ－Ｔ細胞療法により産生されたＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の量を低下させるための炎症性サイトカインレベル阻害剤として用いられる医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、１０μｇ／ｍＬ以上のグラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物を含み、かつ、前記個体に対し投与６時間後に、前記個体の細胞内におけるＩＦＮ－γの量を少なくとも７２．５％以上減少させると共に、ＩＬ－６の量を少なくとも３７．５％以上減少させることができ、
前記グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物は、グラプトペタルム・パラグアエンセの乾燥粉末をメタノールに溶解し、遠心分離により上清液を除去した後、ジメチルスルホキシドを添加してから、懸濁液を収集して遠心分離を行うことにより得られるものであることを特徴とする医薬組成物。

【請求項2】

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受ける個体に対し投与することで、前記個体の細胞内においてＣＡＲ－Ｔ細胞療法により産生されたＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の量を低下させるための炎症性サイトカインレベル阻害剤として用いられる医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、１０μｇ／ｍＬ以上のグラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物を含み、かつ、前記個体に対し投与２４時間後に、前記個体の細胞内におけるＩＦＮ－γの量を少なくとも７７．７％以上減少させると共に、ＩＬ－６の量を少なくとも１９．４％以上減少させることができ、
前記グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物は、グラプトペタルム・パラグアエンセの乾燥粉末をメタノールに溶解し、遠心分離により上清液を除去した後、ジメチルスルホキシドを添加してから、懸濁液を収集して遠心分離を行うことにより得られるものであることを特徴とする医薬組成物。

【請求項3】

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受ける個体に対し投与することで、前記個体の細胞内においてＣＡＲ－Ｔ細胞療法により産生されたＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の量を低下させるための炎症性サイトカインレベル阻害剤として用いられる医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、１０μｇ／ｍＬ以上の紅景天抽出物を含み、かつ、前記個体に対し投与６時間後に、前記個体の細胞内におけるＩＦＮ－γの量を少なくとも３６．３％以上減少させると共に、ＩＬ－６の量を少なくとも３５．２％以上減少させることができ、
前記紅景天抽出物は、紅景天の乾燥粉末を水に溶解してから遠心分離を行うことにより得られるものであることを特徴とする医薬組成物。

【請求項4】

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受ける個体に対し投与することで、前記個体の細胞内においてＣＡＲ－Ｔ細胞療法により産生されたＩＦＮ－γ及びＩＬ－６の量を低下させるための炎症性サイトカインレベル阻害剤として用いられる医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、１０μｇ／ｍＬ以上の紅景天抽出物を含み、かつ、前記個体に対し投与２４時間後に、前記個体の細胞内におけるＩＦＮ－γの量を少なくとも６２．９％以上減少させると共に、ＩＬ－６の量を少なくとも２４．３％以上減少させることができ、
前記紅景天抽出物は、紅景天の乾燥粉末を水に溶解してから遠心分離を行うことにより得られるものであることを特徴とする医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、個体におけるサイトカインのレベルを低下させるために用いられる手段に関し、特に、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の新規な療法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、がんの治療薬は、主に低分子化学薬品や高分子抗体であったが、現在、治療アプローチは、すでに細胞治療のレベルに達している。しかしながら、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）は広く研究されている。それは、特定の受容体を持ち、腫瘍細胞などの特異性を認識する細胞を標的とする。現在、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を行うことについて、ＦＤＡにより承認されている製薬会社は、世界において、単にノバルティス社と、ギリアド・サイエンシズ社の２社がある。臨床試験により、この治療法は、寛解率が高く、全生存期間が延長されたことが示されている。

【0003】

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、臨床的に効果的であるが、いくつかの副作用、さらには死さえある。最も一般的な副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）である。ＣＡＲ－Ｔ細胞が患者に注入されると、Ｔ細胞は癌細胞を殺し、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、ＩＬ－６などのサイトカインの放出を引起し、患者の発熱、低血圧、呼吸不全の原因となる。したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の再注入によって引起されるこれらの免疫スト－ムを制御する方法は、ＣＡＲ－Ｔ療法の課題である。

【発明の概要】

【0004】

そのため、薬剤のスクリーニングと試験を数回行った後、出願人は、フェノチアジン誘導体、グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物、紅景天抽出物、及びヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤などの複数の化合物又は組成物が、炎症性サイトカインの産生を阻害できることを発見し、したがって、抗腫瘍効果を低下させる潜在的なリスクによる不必要な免疫抑制を回避しながら、患者の免疫応答を治療するための新しい方法を提供した。

【0005】

上記のように、本発明は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法により引起されたサイトカイン放出症候群又は炎症性サイトカインの過剰産生により媒介される障害をさらに治療することができる、個体における炎症性サイトカインのレベルを低下させる新しい方法を提供する。
具体的に、本発明に係わる技術思想の一つによれば、必要とする個体に対し治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、個体における炎症性サイトカインのレベルを低下させる方法であって、前記医薬組成物は、フェノチアジン誘導体、グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物、紅景天抽出物、及び、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つを含んでおり、前記フェノチアジン誘導体は、トリフルオペラジン又はチオリダジンであり、前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリドである、ことを特徴とする個体における炎症性サイトカインのレベルを低下させる方法を提供する。

【0006】

また、本発明に係わる技術思想の他の一つによれば、必要とする個体に対し治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法により引起された１つ又は複数の炎症性サイトカインの過剰産生を伴うサイトカイン放出症候群を治療する方法であって、前記医薬組成物は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法中又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法後に投与されると共に、フェノチアジン誘導体、グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物、紅景天抽出物、及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つを含んでおり、前記フェノチアジン誘導体は、トリフルオペラジン又はチオリダジンであり、前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリドである、ことを特徴とするサイトカイン放出症候群を治療する方法を提供する。

【0007】

さらに本発明に係わる別の技術思想の一つによれば、個体における炎症性サイトカインのレベルを低下させる医薬組成物であって、前記医薬組成物は、フェノチアジン誘導体、グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物、紅景天抽出物、及び、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つを含んでおり、前記フェノチアジン誘導体は、トリフルオペラジン又はチオリダジンであり、前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリドである、ことを特徴とする医薬組成物を提供する。

【0008】

さらに本発明に係わる別の技術思想の一つによれば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法により引起された１つ又は複数の炎症性サイトカインの過剰産生を伴うサイトカイン放出症候群を治療する医薬組成物であって、前記医薬組成物は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法中又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法後に投与されると共に、フェノチアジン誘導体、グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物、紅景天抽出物、及びヒストン脱アセチル化酵素阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つを含んでおり、前記フェノチアジン誘導体は、トリフルオペラジン又はチオリダジンであり、前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリドである、ことを特徴とする医薬組成物を提供する。

【0009】

本発明は、個体における炎症性サイトカインレベル阻害剤を調製するために用いられる医薬組成物の用途において、前記医薬組成物は、フェノチアジン誘導体、グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物、紅景天抽出物、及びヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つを含む、ことを特徴とする個体における炎症性サイトカインレベル阻害剤を調製するために用いられる医薬組成物の用途を提供できる。

【0010】

本発明の一実施例によれば、炎症性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０、及びＩＬ－６からなる群から選択される少なくとも１つである。

【0011】

本発明の一実施例によれば、フェノチアジン誘導体は、トリフルオペラジン又はチオリダジンである。

【0012】

本発明の一実施例によれば、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤は、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリドである。

【0013】

本発明の一実施例によれば、細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、チオリダジンを含有する医薬組成物の投与６時間後に、少なくとも１８．６％減少した。細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、チオリダジンを含む医薬組成物の投与２４時間後に、少なくとも２８．２％以上減少した。

【0014】

本発明の一実施例によれば、細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、グラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物を含む医薬組成物の投与６時間後に、少なくとも７２．５％以上減少した。細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、グラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物を含む医薬組成物を投与２４時間後に、少なくとも７７．７％以上減少した。

【0015】

本発明の一実施例によれば、細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、紅景天抽出物を含む医薬組成物の投与６時間後に、少なくとも３６．３％以上減少した。細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、紅景天抽出物を含む医薬組成物の投与２４時間後に、少なくとも６２．９％以上減少した。

【0016】

本発明の一実施例によれば、細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、チオリダジンを含有する医薬組成物の投与６時間後に、少なくとも２０．７％以上減少した。細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、チオリダジンを含有する医薬組成物の投与２４時間後に、少なくとも３９．５％以上減少した。

【0017】

本発明の一実施例によれば、細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、グラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物を含む医薬組成物の投与６時間後に、少なくとも３７．５％以上減少した。細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、グラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物を含む医薬組成物の投与２４時間後に、少なくとも１９．４％以上減少した。

【0018】

本発明の一実施例によれば、細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、紅景天抽出物を含有する医薬組成物の投与６時間後に、少なくとも３５．２％以上減少した。細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、紅景天抽出物を含有する医薬組成物の投与２４時間後に、少なくとも２４．３％以上減少した。

【0019】

本発明の別の態様は、サイトカイン放出症候群の治療薬物を調製するために用いられる医薬組成物の用途であって、前記医薬組成物は、フェノチアジン誘導体、グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物、紅景天抽出物、及びヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つを含む、ことを特徴とするサイトカイン放出症候群の治療薬物を調製するために用いられる医薬組成物の用途に関する。

【0020】

本発明の一実施例によれば、サイトカイン放出症候群は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法により引起される。医薬組成物は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法中又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法後に投与される。

【0021】

本発明の一実施例によれば、サイトカイン放出症候群は、１つ又は複数の炎症性サイトカインの過剰産生に関する。

【0022】

本発明のさらに別の態様は、炎症、自己免疫疾患、糖尿病、アテローム性動脈硬化症及び癌などのサイトカインの過剰産生により媒介される障害を治療する方法に関する。

【0023】

以下に、本発明に係わる１つ又は複数の実施例を詳細に説明する。本発明に係わる特徴は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲からより明らかになるであろう。前記に述べた一般的な説明及び以下に示す詳細な説明は、例示のみを目的として例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していないことに留意されたい。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】本発明の実施例１におけるトリフルオペラジン（ＴＦＰ）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図1B】本発明の実施例１におけるトリフルオペラジン（ＴＦＰ）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図2A】本発明の実施例１におけるチオリダジン（ＴＨＺ）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図2B】本発明の実施例１におけるチオリダジン（ＴＨＺ）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図3A】本発明の実施例１におけるグラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物（ＨＨ－Ｆ３）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図3B】本発明の実施例１におけるグラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物（ＨＨ－Ｆ３）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図4A】本発明の実施例１における紅景天抽出物（Ｒｒ－ＥｔＯＨ）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図4B】本発明の実施例１における紅景天抽出物（Ｒｒ－ＥｔＯＨ）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図5A】本発明の実施例１におけるヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド（ＳＡＨＡ）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図5B】本発明の実施例１におけるヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド（ＳＡＨＡ）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図6A】本発明の実施例２におけるトリフルオペラジン（ＴＦＰ）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図6B】本発明の実施例２におけるトリフルオペラジン（ＴＦＰ）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図7A】本発明の実施例２におけるチオリダジン（ＴＨＺ）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図7B】本発明の実施例２におけるチオリダジン（ＴＨＺ）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図8A】本発明の実施例２におけるグラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物（ＨＨ－Ｆ３）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図8B】本発明の実施例２におけるグラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物（ＨＨ－Ｆ３）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図9A】本発明の実施例２における紅景天抽出物（Ｒｒ－ＥｔＯＨ）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図9B】本発明の実施例２における紅景天抽出物（Ｒｒ－ＥｔＯＨ）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図10A】本発明の実施例３におけるチオリダジン（ＴＨＺ）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図10B】本発明の実施例３におけるチオリダジン（ＴＨＺ）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【図11A】本発明の実施例４におけるグラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物（ＨＨ－Ｆ３）の細胞生存率試験の結果を示す図である。

【図11B】本発明の実施例４におけるグラプトペタルム・パラグアイエンセ抽出物（ＨＨ－Ｆ３）のサイトカイン放出試験の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

ここで、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、文脈により明確に矛盾しない限り、本明細書で使用される単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。

【0026】

本明細書で特に定義しない限り、「治療、治療する、又は療法」という用語は、特定の疾患又は障害を有する患者への投与の行為を意味し、その行為は患者の疾患又は障害、又は１つ以上の症状の重症度を軽減することができるし、或いは、疾患又は障害の進行を遅らせるか遅延させることができる。

【0027】

ここで、「有効量」とは、患者に直接的又は間接的に投与（投与、又は投薬）された医薬品の適切な投与期間の後に、炎症性サイトカインのレベルを低下させる効果を達成できる特定量を意味する。

【0028】

本明細書では、「個体」又は「患者」という用語は、相互に交換可能に使用することができる。「個体」又は「患者」という用語は、限定されないが、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びその類似の動物などを含む、化合物及び／又は方法によりそれぞれ治療する可能な動物、並びにヒト、非ヒト霊長類動物を指す。特に明記しない限り、「個体」又は「患者」には、男性と女性の両方の性別が含まれる場合がある。さらに、本発明の医薬組成物及び／又は方法による治療を受けるのに適した個体又は患者、好ましくはヒトも含まれる。

【0029】

本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に示される数値は、可能な限り正確に本明細書に提示されている。しかし、どの数値にも、それぞれのテスト測定で見られる標準偏差から必然的に生じる特定のばらつきが含まれている。
本明細書では、「約」という用語は一般に、実際の値が特定の値又は範囲の上下１０％、５％、１％、又は０．５％以内であることを意味する。あるいは、「約」という用語は、当業者によって考慮された場合、実際の値が平均の許容可能な標準誤差内にあることを示す。
実例中又は別に明記されている場合を除き、本明細書で使用されるすべての範囲、量、値、及び百分率（例えば、材料の量、時間、温度、操作条件、合計率及びその類似ものなどを記述するため）は、「約」という単語によって修正されると理解されたい。
そのため、逆に明確に述べられていない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に開示されている数値パラメータは、すべて近似値であり、しかも必要に応じて変化する可能性がある。せめて各数値パラメータは、少なくとも報告された有効数字の数を考慮して、通常の四捨五入の手法を適用することによって解釈されるべきである。

【0030】

本発明の一実施態様では、必要とする個体に対し治療有効量の医薬組成物を投与することにより行われる個体の炎症性サイトカインのレベルを低下させる方法であって、前記医薬組成物は、フェノチアジン誘導体、グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物、紅景天抽出物、及びヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする個体の炎症性サイトカインのレベルを低下させる方法が提供される。

【0031】

上記に従って、開示された医薬組成物は、周知の製薬プロセスにより調製され得る。本発明の１つの実施態様では、本発明に開示される医薬組成物は、任意の適切な投与ルート、例えば、カプセル、懸濁液、又は錠剤（糖衣錠）のような経口的な投与ルート、又は、例えば筋肉内注射、静脈内、皮下、又は腹腔内の注射のような非経口的な投与ルートによる全身投与モードにより投与されてもよい。さらに、いくつかの実施例では、本発明で開示される医薬組成物は、経粘膜又は経皮手段、例えば、局所皮膚施用、又は気管支、鼻腔、もしくは経口吸入、又は点鼻薬のような点滴によって投与してもよいし、直腸投与することもできる。

【0032】

経口投与の場合、本発明に開示される医薬組成物は、賦形剤と共に投与されてもよく、又は賦形剤なしで投与されてもよい。また、本発明の医薬組成物は、その中に様々な助剤、崩壊剤、顆粒結合剤、又は滑沢剤を含有する固体剤形のような錠剤（糖衣錠）に調製することもできる。さらに、一例では、ラクトース又は高分子量ポリエチレングリコールも使用することができる。さらに、場合によって、任意の薬学的活性成分の放出速度は、コーティング又は被覆、例えば腸溶性コーティングでさらに改善することができる。 他の例では、本発明の医薬組成物は、リポソーム構造又は生体模倣細胞外マトリックス系構造に製剤化することも、ハード及びソフトゼラチンカプセルに充填することも、キットで生分解性顆粒にカプセル化することもできる。

【0033】

また、本発明において、薬学的に許容される賦形剤とは、医薬製剤の他の成分と適合性であり、有機体、例えば封入材料、又は吸収促進剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、サプリメント、充填剤、香味剤、保湿剤、潤滑剤、香料、防腐剤、噴射剤、離型剤、殺菌剤、甘味剤、可溶化剤、湿潤剤、及びこれらの混合物などの様々な添加剤と適合性のあるものを意味する。

【0034】

本発明での使用に適した助剤の例としては、例えば、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、又はグリシンであってよい。本発明での使用に適した崩壊剤の例としては、例えば、デンプン、アルギン酸、又は特定のケイ酸塩であってよい。本発明での使用に適した粒状結合剤の例としては、例えば、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、又はアカシアであってよい。本発明での使用に適した粒状結合剤の例としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、又はタルクであってよい。本発明での使用に適した賦形剤の例としては、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、又はトラガカントガムであってよい。

【0035】

いくつかの実施例では、本発明の医薬組成物は、経口投与に適した液体剤形、例えば、経口懸濁液、乳濁液、マイクロエマルジョン、及び／又はエリキシルに調製される。そのような液体剤形の場合、本発明の医薬組成物の活性成分は、様々な甘味料又は香味料、着色剤又は染料と共にさらに製剤化されてよく、必要に応じて、水、アルコール、プロピレングリコール、又はグリセリン、又はｐＨを維持するために使用されるバッファー液などの乳化剤及び／又は懸濁剤、又は希釈剤を加える。

【0036】

同様に、他の実施例では、本発明の医薬組成物を含有する液体製剤は、無菌の注射可能な溶液又は懸濁液、例えば静脈内、筋肉内、皮下、又は腹腔内注射による投与に適した溶液に調製される。

【0037】

いくつかの実施例では、本発明に開示される医薬組成物は、手術、放射線療法、又は化学療法などの癌の一次療法の治療効果を改善するために、追加の補助治療薬として使用されてよい。本発明に開示される医薬組成物は、単独で、又は従来の薬学的に許容される補助剤と組み合わせて適用されることができ、例えば、経口的に又は食物とともに個体に投与されてよい。

【0038】

いくつかの実施例では、本発明の方法は、個体における癌の治療効果を改善するために、さらに、本発明の医薬組成物を個体に投与する前、最中又は後に、手術、放射線療法、又は化学療法などの癌の別の一次治療手段を個体に施用することを含む。

【実施例】

【0039】

本開示をより十分で完全に説明するために、本発明の実施態様及び具体的な例について例示的に説明するが、これらは、本発明が実施又は利用される特定の例の唯一の形態を表すことを意図していない。いくつかの特定例の特徴及び構造、ならびにこれらの特定例を作業するための過程及び順序は、実施例に含まれる。しかしながら、他の例でも、同じ又は同等の機能及び順序が達成できる。

【0040】

まず、本発明の実施例における試験の標準的な作業過程について説明する。

【0041】

＜細胞培養及び試薬＞
本実施例では、台湾生物資源保存及び研究センター（ＢＣＲＣ）から購入のヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株（クローンＥ６－１、ＡＴＣＣ ＴＩＢ １５２）及びＴＨＰ－１を使用した。細胞は、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／Ｌグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）ペニシリンーストレプトマイシン（ＨｙＣｌｏｎｅ（ハイクローン）、ユタ州ローガン市）、及び１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ; ハイクローン）を含むように調整された２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、アメリカカリフォルニア州カールスバッド市）で維持された。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターに保存された。細胞に対する継代培養を行う場合には、３×１０^６細胞／ｍＬ以下の細胞密度を維持すべきである。

【0042】

＜試薬及び薬剤＞
本実施例では、シグマ アルドリッチ（アメリカミズーリ州セントルイス市）から購入したイオノマイシン、ホルボール １２－ミリスタート １３－アセタート（ＰＭＡ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、トリフルオペラジン（ＴＦＰ）、チオリダジン（ＴＨZ）、ヒドロキサミン酸サブエロイルアニリド（ＳＡＨＡ）を使用した。

【0043】

メーカの説明によると、細胞毒性分析に使用される３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム（ＭＴＳ）は、ＣｅｌｌＴｉｌｔｅｒ ９６（登録商標） Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン市）から購入したものである。

【0044】

グラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物及び紅景天抽出物は、米国特許第８６８６０３０号に示されている方法により調製して得られることができる。その開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【0045】

すなわち、グラプトペタルム・パラグアエンセ（ＧＰと呼ばれる）の葉を粉砕し、－２０℃で粉末に凍結乾燥し、抽出前に２５℃のモイスチャーバスターに保存した。最初に、１．５ｇのＧＰ粉末を１０ｍＬの１００％メタノール（ＭｅＯＨ）で５分間ボルテックスしてから、１５００ｇで５分間遠心分離した。上清液を除去した後、１０ｍＬのＨ_２Ｏ、１００％アセトン、１００％メタノール、１００％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、１００％ＤＭＳＯ及び３０％ＤＭＳＯを各ペレットに添加して再懸濁し、各抽出液を得た。懸濁液を５分間ボルテックスすることにより混合し、１５００ｇで５分間２回遠心分離し、９３００ｇで５分間再度遠心分離し、室温で層流により０．４５μｍフィルターを使用して濾過した。

【0046】

次に、３０％ＤＭＳＯ上清液をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０カラムで４つの画分（ＨＨ－Ｆ１、ＨＨ－Ｆ２、ＨＨ－Ｆ３、ＨＨ－Ｆ４）に分画し、各画分をさらにＵＶ検出器付き高速液体クロマトグラフィー（ ＨＰＬＣ）により分析する。本発明では、ＨＨ－Ｆ３を選択することが好ましい。

【0047】

同様に、紅景天（ＲＳと呼ばれる）の植物を凍結乾燥して粉末にし、抽出前に２５℃のモイスチャーバスターに保存した。１．５ｇのＲＳ粉末を１０ｍＬのＨ_２Ｏに溶解し、１５００ｇで５分間遠心分離した後、０．４５μｍフィルターを使用して、層流により室温で濾過した。サンプルは－２０℃で１５０ｍｇ／ｍＬの貯蔵液として保存され、本発明ではＲｒ－ＥｔＯＨと名付けられた。

【0048】

＜Ｔ細胞の活性化モデリング及びサイトカイン測定＞
Ｊｕｒｋａｔ細胞を４８ウェル培養プレ－トにおける培地に５．０×１０^５細胞／ｍＬの密度で播種した。インタ－フェロンガンマ（ＩＦＮ－γ; ＩＦＮＧ）の産生を促進するために、ＰＭＡとイオノマイシンを組み合わせた刺激細胞を培地に使用するか、又は使用しないとする。ＴＨＰ－１細胞としては、ＩＬ－ ６産生を促進するＬＰＳ処理されたのを使用するか又は使用しないとする。

【0049】

培養上清液を遠心分離により回収し、サイトカイン分析のために－２０℃で保存した。ＩＦＮ－γとＩＬ－ ６の濃度は、ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカカリフォルニア州カールスバッド）によってメーカの説明に従って測定された。

【0050】

＜細胞生存率分析＞
細胞生存率は、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定された。分析は、ＭＴＳを各ウェルに３７℃、５％ＣＯ_２で３時間添加することにより行われた。ホルマザンの量は、生細胞によって変換され、次に、９６ウェルプレートリーダーで４９０ｎｍの吸光度を記録する。

【0051】

以下、添付図面を参照しながら本発明の好適な実施例を解釈することにより、本発明を詳細に説明する。

【0052】

《実施例１》
ＩＦＮ－γ産生を誘導するために、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を上記のように培養し、イオノマイシンを加えＰＭＡとで２４時間刺激した後、それぞれ表１に示す候補薬物で培養した。６時間及び２４時間を経過した直後、細胞生存率分析及びサイトカイン分析に用いられる上清液を収集した。サイトカインの濃度は、メーカの説明に従って、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により測定された。

【0053】

細胞生存率の結果及び細胞生存率で正規化されたＩＦＮ－γの濃度を表１に示す。また、結果は、図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図 ２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂにさらに示される。

【0054】

【表1】

【0055】

上記の表１から分かるように、細胞生存率に関しては、イオノマイシンを加えＰＭＡとを使用した前培養による２４時間後に、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞の細胞生存率が約８０～９０％に低下した。そして、薬物治療による６時間と２４時間後、細胞生存率の低下は３０％未満であり、これは上記の薬物が細胞に深刻な損傷を引起こさないことを示している。さらに、ＨＨ－Ｆ３は、ＰＭＡ及びイオノマイシンによって引起される細胞の損傷を回復することができ、細胞の生存率を高める。

【0056】

さらに、ＩＦＮ－γ含有量に関して、上記の表１から、ＰＭＡ及びイオノマイシンの存在下でＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を刺激してＩＦＮ－γを産生することができることが分かった。そして、薬物治療による６時間と２４時間後、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの含有量を減少させることができた。それらの中で、ＴＦＰ及びＳＡＨＡに比べて、チオリダジン（ＴＨＺ）、ＨＨ－Ｆ３及びＲｒ－ＥｔＯＨは、細胞に対しより強い影響を及ぼした。ＩＦＮ－γの含有量は、これら３つの薬剤の濃度と培養時間の増加に伴って低くなっている。

【0057】

より具体的には、細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、それぞれ１μＭ、５μＭ、及び１０μＭのチオリダジンを含む医薬組成物の投与６時間後、それぞれ１８．６％、２３．７％、及び３６．２％減少した。細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、それぞれ１μＭ、５μＭ、及び１０μＭのチオリダジンを含有する医薬組成物の投与２４時間後、それぞれ２８．２％、５７．７％、及び５２．２％減少した。

【0058】

細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬのグラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物（ＨＨ－Ｆ３）を含む医薬組成物の投与６時間後、それぞれ７２．５％、８０．８％、９０．８％減少した。細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、及び４０μｇ／ｍＬのグラプトペタルムパラグアイエンス抽出物（ＨＨ－Ｆ３）を含む医薬組成物の投与２４時間後にそれぞれ７７．７％、８７．１％、及び９４．４％減少した。

【0059】

細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬの紅景天抽出物（Ｒｒ－ＥｔＯＨ）を含む医薬組成物の投与６時間後、それぞれ３６．３％、５７．２％、及び６０．９％減少した。細胞内におけるＩＦＮ－γの含有量は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬの紅景天抽出物（Ｒｒ－ＥｔＯＨ）を含む医薬組成物の投与２４時間後、それぞれ６２．９％、６７．０％、７６．６％減少した。

【0060】

《実施例２》
ＩＬ－ ６産生を誘導するために、ＴＨＰ－１細胞を上記のように培養し、ＬＰＳで１６時間刺激した後、それぞれ表２に示すような候補薬物で培養した。６時間後及び２４時間後、細胞生存率分析及びサイトカイン分析に用いられる上清液を収集した。サイトカインの濃度は、ＩＬ－ ６ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってメーカの説明に従って測定された。

【0061】

細胞生存率の結果及び細胞生存率で正規化されたＩＬ－ ６濃度を表２に示す。また、結果は、図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ、図７Ｂ、図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ、及び図９Ｂにさらに示される。

【0062】

【表2】

【0063】

上記の表２から分かるように、ＩＬ－６の含有量に関しては、、ＰＭＡ及びイオノマイシンの存在下で、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を刺激して、ＩＬ－６を産生することができる。そして、薬物治療による６時間と２４時間後、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞のＩＬ－６含有量が減少さられることができた。それらの中で、ＴＦＰに比べて、チオリダジン（ＴＨＺ）、ＨＨ－Ｆ３及びＲｒ－ＥｔＯＨは、細胞により強い影響を及ぼした。ＩＬ－６の含有量は、これらの３つの薬物の濃度と培養時間の増加に伴って低くなっている。

【0064】

より具体的には、細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、それぞれ１μＭ、５μＭ、及び１０μＭのチオリダジンを含有する医薬組成物の投与６時間後、それぞれ２０．７％、３７．１％、及び４５．９％減少した。細胞内におけるＩＬ－６含有量は、それぞれ１μＭ、５μＭ、及び１０μＭのチオリダジンを含む医薬組成物の投与２４時間後、それぞれ３９．５％、５１．８％、及び６５．２％減少した。

【0065】

細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬのグラプトペタルム・パラグアエンセ抽出物（ＨＨ－Ｆ３）を含む医薬組成物の投与６時間後、３９．２％、３７．５％、及び３８．５％減少した。細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、それぞれ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬのグラプトペタルムパラグアイエンス抽出物（ＨＨ －Ｆ３）を含む医薬組成物の投与２４時間後、それぞれ２６．３％、１９．４％、及び２２．３％減少した。

【0066】

細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬの紅景天抽出物（Ｒｒ－ＥｔＯＨ）を含む医薬組成物の投与６時間後、それぞれ３５．２％、４７．５％、４４．６％減少した。細胞内におけるＩＬ－６の含有量は、それぞれ１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬの紅景天抽出物（Ｒｒ－ＥｔＯＨ）を含む医薬組成物の投与２４時間後、それぞれ２４．３％、２４．９％、及び２４．５％減少した。

【0067】

《実施例３》
この実施例では、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、５．０×１０^５細胞／ｍＬの密度で４８ウェル培養プレ－トにおける異なる培地に播種され、各培地は、以下の表３に示される割合でＰＭＡ、イオノマイシン、及びＴＨＺを含む。

【0068】

２４時間及び４８時間後、細胞生存率分析及びサイトカイン分析に用いられる上清液を収集した。サイトカインの濃度は、ヒトＩＦＮ－γＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってメーカの説明に従って測定された。細胞生存率結果及び細胞生存率で正規化されたＩＦＮ－γの濃度を表３に示す。また、結果も図１０Ａと図１０Ｂに示される。

【0069】

【表3】

【0070】

上記の表３に示した結果から、２４時間及び４８時間の培養後のグループ３の正規化されたＩＦＮ－γは、それぞれ３４．９ｐｇ／ｍＬ及び３２．６ｐｇ／ｍＬで、グループ２のそれらより４６．５％及び１８．７％低かったことが明確に分かる。２４時間及び４８時間の培養後のグループ４の正規化されたＩＦＮ－γは、それぞれ３５．７ｐｇ／ｍＬ及び３９．７ｐｇ／ｍＬで、グループ２のそれよりも４５．３％及び１．０％低かった。ＴＨＺとＰＭＡとイオノマイシンの併用による処理は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるサイトカイン誘導を大幅に減衰した。結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法中に薬物を個体に投与することでサイトカイン産生を妨げることが示された。

【0071】

さらに、グループ２、３、及び４の間の細胞生存率に大きな差はないため、ＴＨＺが細胞生存率に影響を与えないことは明らかである。

【0072】

《実施例４》
この実施例では、Ｊｕｒｋａｔ細胞を５．０×１０^５細胞／ｍＬの密度で４８ウェル培養プレ－トにおける異なる培地に播種し、各培地は、以下の表４に示す比率でＰＭＡ、イオノマイシン、及びＨＨ－Ｆ３を含む。

【0073】

２４時間、３０時間、及び４８時間後、細胞生存率分析及びサイトカイン分析に用いられる上清液を収集した。サイトカインの濃度は、ヒトＩＦＮ－γＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってメーカの説明に従って測定された。細胞生存率結果及び細胞生存率で正規化されたＩＦＮ－γの濃度を表４に示す。また、結果も図１１Ａ及び図１１Ｂに示されている。

【0074】

【表4】

【0075】

上記の表４に示した結果から、２４時間、３０時間、及び４８時間の培養後に、グループ３の正規化されたＩＦＮ－γは、それぞれ３９．５pg/mL、２４．９pg/mL、及び２３．７pg/mLで、グループ２よりも３９．５％、５０．４％、３５．４％低かったことが明確に分かる。２４時間、３０時間、及び４８時間の培養後に、グループ４の正規化されたＩＦＮ－γは、それぞれ２９．０pg/mL、１９．１pg/mL、及び２０．５pg/mLで、グループ２よりも５５．６％、６２．０％、及び４４．１％低かった。２４時間、３０時間、及び４８時間の培養後に、グループ５の正規化されたＩＦＮ－γは、それぞれ２４．２pg/mL、１３．９pg/mL、及び１８．２pg/mLで、グループ２よりも６２．９％、７２．３％、５０．４％低かった。ＨＨ－Ｆ３とＰＭＡとイオノマイシンとの共同処理は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるサイトカイン誘導を大幅に減衰させた。その結果は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法中に薬物を個体に投与することでサイトカイン産生を妨げることが示された。

【0076】

さらに、細胞生存率に関して、グループ３～５の細胞生存率は、グループ２よりも高く、ＨＨ－Ｆ３がＰＭＡ及びイオノマイシンによって引起された細胞損傷を回復し、細胞生存率を高めることができることを示している。

【0077】

本発明は、チオリダジン（ＴＨＺ）の抗精神病薬がＩＦＮ－γ産生の細胞におけるＩＦＮ－γの表現を大幅に減少させたことを示している。ＨＨ－Ｆ３及びＲｒ－ＥｔＯＨの漢方薬の治療は、ＩＦＮ－γ分泌量の減少に大きな影響を与えることが研究されており、Ｔ細胞におけるＩＬ－ ６分泌にも影響を及ぼした。さらに、治療後の細胞の生存率はほとんど影響を受けなかった。その結果から分かるように、チオリダジン（ＴＨＺ）、ＨＨ－Ｆ３、及びＲｒ－ＥｔＯＨの候補薬は免疫抑制効果を有すると共に、サイトカイン放出症候群の潜在的な治療法を提供することができる。

【0078】

さらに、薬物アプロ－チの共同治療を使用することにより、ＨＨ－Ｆ３とチオリダジンはサイトカイン産生を減少させることもできる。その結果から分かるように、ＨＨ－Ｆ３及びチオリダジンは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗癌治療におけるサイトカイン放出症候群の予防に用いることができる。

【0079】

上記の具体的な実施例は、本発明の特徴及び効果を例示するためにのみ使用され、本発明の実施範囲を限定することを意図するものではない。本発明の趣旨及び技術的範囲から逸脱しない限り、本発明で開示された内容に基づいて行われた同等の変更及び修正は、いずれも、後述する特許請求の範囲に含まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】