特許7271693ハイドロキノン誘導体を含む肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用薬学組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-28
(45)【発行日】2023-05-11
(54)【発明の名称】ハイドロキノン誘導体を含む肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用薬学組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/085 20060101AFI20230501BHJP
A61K 31/222 20060101ALI20230501BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20230501BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230501BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20230501BHJP
【ＦＩ】
A61K31/085
A61K31/222
A61P3/04
A61P1/16
A23L33/10
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2021548485
(86)(22)【出願日】2019-09-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-20
(86)【国際出願番号】 KR2019011664
(87)【国際公開番号】W WO2020085644
(87)【国際公開日】2020-04-30
【審査請求日】2022-06-29
(31)【優先権主張番号】10-2018-0128434
(32)【優先日】2018-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】521179836
【氏名又は名称】バイオトクステック カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＴＯＸＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】５３，Ｙｅｏｎｇｕｄａｎｊｉ－ｒｏ，Ｏｃｈａｎｇ－ｅｕｐ Ｃｈｅｏｎｇｗｏｎ－ｇｕ，Ｃｈｅｏｎｇｊｕ－ｓｉ Ｃｈｕｎｇｃｈｅｏｎｇｂｕｋ－ｄｏ ２８１１５，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】カン、ジョン グ
(72)【発明者】
【氏名】カン、ソク モ
(72)【発明者】
【氏名】ペ、フン モ
【審査官】鶴見 秀紀
(56)【参考文献】
【文献】特開２００９－２５６２２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平８－６７６２７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｐ ３／０４
Ａ６１Ｐ １／１６
Ａ２３Ｌ ３３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル又は２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル－４－アセテートを有効成分として含むことを特徴とする肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項2】
前記非アルコール性脂肪肝炎が肥満型非アルコール性脂肪肝炎である請求項１に記載の肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項3】
２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル又は２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル－４－アセテートを有効成分として含むことを特徴とする肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は改善用食品組成物。
【請求項4】
前記非アルコール性脂肪肝炎が肥満型非アルコール性脂肪肝炎である請求項３に記載の肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ハイドロキノン誘導体を含む肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
肥満とは、エネルギーの摂取と消耗との不釣合いによって体内に脂肪が過剰蓄積し、脂肪組織が異常増加した状態のことを指す。肥満は、特別な原因疾患無しに過多な熱量の摂取や運動不足による単純性肥満と、遺伝的要因、内分泌疾患、視床下部の食欲調節中枢異常と薬剤の副作用によって二次的に誘発される症候性肥満とに分類され、全肥満患者の約９５％が単純性肥満である。
【0003】
肥満は、それ自体の危険性よりは、肥満に起因する様々な合併症のため、その深刻性がより一層大きく認識されている。肥満は、高血圧、高脂血症、糖尿病などの代謝症候群、脂肪肝、関節異常、及び癌の発病危険を増加させることが知られている。
【0004】
現在、肥満治療剤の代表には、オルリスタット（Ｏｒｌｉｓｔａｔ）を主原料とするゼニカル（登録商標）（ロシュ）、シブトラミンを主原料とするリダクティル（登録商標）（アボット）などが販売されているが、むかつき、下痢、腹痛、不眠症、血圧上昇、脂肪肝などの副作用があるため、副作用が少ないとともに安全な肥満治療剤の開発が要求されている。
【0005】
最近では、肥満人口の増加による代謝症候群の有病率増加に伴って非アルコール性脂肪肝疾患の有病率も増加の一方である。脂肪肝は、上述のように肥満の合併症として誘発されたり、又はその他様々な原因、例えば、アルコール、糖尿、栄養不良症、薬物の乱用などによって誘発されることが報告されているが、組織検査において５％以上の肝組織に脂肪が沈着した場合と定義される。特に、有意なアルコール摂取、脂肪肝を招く薬物の服用、同伴する他の原因による肝疾患などがないのに、映像検査や組織検査から肝内脂肪沈着の所見が見られる疾患を‘非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＦＬＤ）’というが、ここには単純脂肪肝（ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）と非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）が含まれる。単純脂肪肝は比較的良好な予後を示すが、非アルコール性脂肪肝炎はＮＡＦＬＤ患者の１０～２０％に発病する疾患で、肝内脂肪沈着と共に肝組織損傷を伴う炎症を示し、９～２５％の患者において肝硬変症に進行し、その３０～４０％が肝疾患の合併症によって死亡する致命的な疾病である。
【0006】
非アルコール性脂肪肝炎は、肥満、インスリン耐性などの代謝症候群と密接に関連しているが、まだ、正確な病理機転及び治療方法は知られていない。非アルコール性脂肪肝炎の確定診断は主に組織病理学的検査によってなされ、非アルコール性脂肪肝炎診断の最小限の必須所見としては、脂肪症、肝組織の風船様変性、肝小葉内炎症がある。このような非アルコール性脂肪肝炎を効果的に治療するためには、特に、非アルコール性脂肪肝が脂肪肝炎に進行することを抑えながら脂肪肝炎の炎症を改善させることによって次の段階への進行を抑制することが重要である。さらに、非アルコール性脂肪肝炎に関連したインスリン抵抗性及び内臓脂肪の蓄積などを運動療法又は薬物治療によって減少させることが、治療において非常に重要な管理項目である。
【0007】
非アルコール性脂肪肝炎による社会的費用が増加するにつれて、多くの研究者が治療剤を開発しようと努力してきたが、現在まで非アルコール性脂肪肝疾患に対して臨床的効果が証明された薬物治療はなく、特に、非アルコール性脂肪肝炎の発生や進行を防ぐ治療薬剤は開発されていない。全世界的に非アルコール性脂肪肝炎治療剤として承認された治療剤は皆無であり、患者への安全性と効能を考慮して次善策として選択可能なオフラベル薬物が存在するだけである。インスリン抵抗性改善剤（例えば、ＰＰＡＲｓ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ） ａｇｏｎｉｓｔｓ）やファルネソイドＸ受容体作用剤（Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ Ｘ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＸＲ） ａｇｏｎｉｓｔ）などが臨床開発中であるが、治療効果が証明された薬物はなく、異常脂質症のような副作用を誘発する薬物もある。また、非アルコール性脂肪肝炎の場合、様々な病態生理が関与するため、通常の抗酸化、抗炎症効能だけでは実際の動物実験、臨床試験において十分な治療効能を奏することができない場合が多い。
【0008】
従来、特定のハイドロキノン誘導体が四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘導肝硬変モデルにおいて肝線維化に対して抑制作用を示し、アセトアミノフェン及びα－ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）誘発急性肝損傷モデルにおいて肝機能改善効果を示すことが確認されたことがある（特許文献１－２）。しかしながら、上記の先行文献に記載されたハイドロキノン誘導体が肥満、非アルコール性脂肪肝又は非アルコール性脂肪肝炎に直接の効能を示すかどうかについては、上記の先行文献を含めて如何なる文献にも報告されたことがない。
【0009】
本発明者らは、上記ハイドロキノン誘導体が肥満、内臓脂肪の蓄積、又はインスリン抵抗性のような非アルコール性脂肪肝炎の危険因子に対する改善効果を示すことはもとより、組織病理学的に肝組織内脂肪の蓄積及び肝小葉炎症に対する改善に複合的に作用することによって非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療にも効能を有することを発見し、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【文献】特開平１９９６－６７６２７号
【文献】韓国登録特許第１０－１０４２６９７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明の目的は、ハイドロキノン誘導体を含む肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用薬学組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、一般式１のハイドロキノン誘導体を有効成分として含む肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用薬学組成物に関する。
【0013】
［一般式１］
【0014】
【化1】
【0015】
前記Ｒ１は、炭素数４～８のアルキル基、Ｒ２は、水素原子、炭素数２～６のアルキルカルボニル基又は炭素数２～６のアルコキシカルボニル基を表す。
【0016】
前記薬学組成物において、一般式１のハイドロキノン誘導体が２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル（化合物１）又は２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル－４－アセテート（化合物２）であることが好ましい。
【0017】
前記薬学組成物において、非アルコール性脂肪肝炎は肥満型非アルコール性脂肪肝炎（ｏｂｅｓｅ ＮＡＳＨ）であることが好ましい。
【0018】
本発明の他の態様によれば、前記一般式１のハイドロキノン誘導体を有効成分として含む肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は改善用食品組成物に関する。
【0019】
前記食品組成物において、一般式１のハイドロキノン誘導体が２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル（化合物１）又は２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル－４－アセテート（化合物２）であることが好ましい。
【0020】
前記食品組成物において、非アルコール性脂肪肝炎は肥満型非アルコール性脂肪肝炎であることが好ましい。
【0021】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0022】
本発明は、一般式１のハイドロキノン誘導体を有効成分として含む肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療用薬学組成物に関する。
【0023】
［一般式１］
【0024】
【化2】
【0025】
前記Ｒ１は、炭素数４～８のアルキル基、Ｒ２は水素原子、炭素数２～６のアルキルカルボニル基又は炭素数２～６のアルコキシカルボニル基を表す。
【0026】
前記Ｒ１で表示される炭素数４～８のアルキル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれのものであってもよく、その例としては、各種ブチル基、各種ペンチル基、各種ヘキシル基、各種へプチル基、各種オクチル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロへプチル基、シクロオクチル基などを挙げることができる。このアルキル基としては炭素数４～７の直鎖状のものが好ましく、ｎ－ヘキシル基がより好ましい。
【0027】
また、Ｒ２のうち、炭素数２～６のアルキルカルボニル基は、直鎖状、分岐状のいずれのものであってもよく、例として、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基などを挙げることができる。また、Ｒ２のうち、炭素数２～６のアルコキシカルボニル基は、直鎖状、分岐状のいずれのものであってもよく、例として、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基などを挙げることができる。
【0028】
前記薬学組成物において、一般式１のハイドロキノン誘導体が２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル又は２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル－４－アセテートであることが好ましい。
【0029】
本発明によれば、体重増加又は内臓脂肪の蓄積を抑制して肥満を予防、改善又は治療する効果がある。
【0030】
また、本発明によれば、特に、肝組織内脂肪の蓄積及び肝小葉炎症を抑制するだけでなく、インスリン抵抗性を改善させ、非アルコール性脂肪肝炎を予防、改善又は治療できる効果がある。本発明は、非アルコール性脂肪肝炎の組織病理学的特徴、すなわち、脂肪症、肝組織の風船様変性及び肝小葉内炎症などを示す全ての非アルコール性脂肪肝炎の治療に適用可能であり、好ましくは、肥満型非アルコール性脂肪肝炎の治療に適用可能である。
【0031】
前記一般式１のハイドロキノン誘導体は非常に安全性の高い化合物であることが確認された。特に、２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテルの場合は、臨床試験において単回投与時に、成人１人につき２０００ｍｇまでも異常反応を起こさなかった。１４日間反復投与をした場合にも、成人１人につき１日１０００ｍｇ容量にも異常反応を起こさない、非常に安全性の高い化合物として確認された。したがって、本発明の組成物は、慢性的で且つ長期間の治療を要する肥満又は非アルコール性脂肪肝炎の治療に効果的に利用可能であるという利点がある。
【0032】
本発明の薬学的組成物は経口又は非経口投与でき、好ましくは、経口投与方式で適用される。
【0033】
本発明の薬学的組成物の適当な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々な処方が可能である。一般に、１日の非経口的な投与量は、上述したハイドロキノン誘導体として約０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは約０．０５～５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明の組成物の経口的投与量は、上述したハイドロキノン誘導体として約０．１～５００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは約０．５～２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、これを１～３回に分割して投与することができる。
【0034】
本発明の薬学的組成物は、従来慣用されている方法によって様々な形態で調製することができる。この場合、一般に、製剤用の担体や賦形剤などの、医薬品の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。また、本化合物の生体利用率や安定性を向上させるために、マイクロカプセル、微粉末化、シクロデキストリンなどを用いた包接化などの製剤技術を含む薬物伝達システムを用いることができる。
【0035】
前記組成物を経口投与製剤として利用する場合には、錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤などの形態で用いることができるが、消化管における吸収に適した形態で用いることが好ましい。また、流通性、保存性などの理由によって所望の形態で製剤を提供する場合にも従来の製剤技術を用いることができる。また、非経口投与剤として利用する場合には、注射剤、坐剤、及びテープ、パップ（湿布剤）などの経皮吸収剤などの形態とすることができるが、流通性、保存性などの理由によって固形製剤を使用時に適当な溶剤で溶解して使用することも可能であり、液剤及び半固形剤の形態で提供することも、従来の製剤技術によって可能である。
【0036】
本発明の他の態様によれば、本発明は、有効成分として一般式１のハイドロキノン誘導体を含む食品組成物に関する。
【0037】
本発明の食品組成物は、錠剤やカプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などの補充物形態、飲料、菓子、パン、粥、シリアル食品、麺類、ジェリー、スープ、乳製品、調味料、食用油などのいかなる形態で使用することも可能である。また、食品組成物として使用するときには、本発明の有効成分の効能に影響を与えない範囲において別の有効成分や、ビタミン、ミネラル又はアミノ酸などの栄養素などを多様に組み合させることも可能である。本発明の食品組成物から展開される食品には、補充物、健康食品、機能性食品、特定保健用食品などが含まれる。また、本発明の食品組成物の摂取量は、上述したハイドロキノン誘導体として約０．１～５００ｍｇ／ｋｇ体重とすることが好ましく、約０．５～２００ｍｇ／ｋｇ体重とすることがより好ましく、これを１～３回に分割して摂取することが好ましい。
【発明の効果】
【0038】
本発明の組成物は、一般式１のハイドロキノン誘導体を有効成分として含む薬学組成物であり、内臓脂肪の蓄積を抑制し、肥満を予防、改善又は治療できる効果がある。
【0039】
また、本発明の組成物は、特に肝組織内脂肪の蓄積を抑制し、肝小葉炎症を治療する効果があるだけでなく、インスリン抵抗性を改善させて非アルコール性脂肪肝又は非アルコール性脂肪肝炎を予防、改善又は治療できる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】ＦＦＣ食餌（Ｆａｔ，ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｄｉｅｔ）給餌モデルにおける肝小葉炎症に対する本発明の化合物１の作用を示す図である。
【図2】ＦＦＣ食餌給餌モデルにおける脂肪肝に対する化合物１の作用を示す図である。
【図3】ＦＦＣ食餌給餌モデルにおける非アルコール性脂肪肝疾患活性指数に対する化合物１の作用を示す図である。
【図4】ＭＣＤ食餌（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｉｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｅｔ）８週給餌モデルにおける肝小葉炎症に対する化合物１の作用を示す図である。
【図5】ＭＣＤ食餌８週給餌モデルにおける非アルコール性脂肪肝疾患活性指数に対する化合物１の作用を示す図である。
【図6】ＭＣＤ食餌８週給餌モデルにおけるＡＬＴ数値に対する化合物１の作用を示す図である。
【図7】ＭＣＤ食餌１２週給餌モデルにおける肝小葉炎症に対する化合物１の作用を示す図である。
【図8】ＭＣＤ食餌１２週給餌モデルにおける非アルコール性脂肪肝疾患活性指数に対する化合物１の作用を示す図である。
【図9】高脂肪食餌（Ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ）給餌モデルにおける動物体重に対する化合物１の作用を示す図である。
【図10】高脂肪食餌給餌モデルにおける飼料摂取量に対する化合物１の作用を示す図である。
【図11】高脂肪食餌給餌モデルにおける副睾丸脂肪重量に対する化合物１の作用を示す図である。
【図12】１３週反復毒性試験時に、化合物１の各１日投与容量による体重変化を示す図である。
【図13】インスリン耐性検査時に、時間による血糖の変化を示す図である。
【図14】インスリン耐性検査の結果をｉＡＵＣ値に数値化し、化合物１の処理によるインスリン感受性増加を示す図である。
【図15】高脂肪食餌給餌モデルにおける肝小葉炎症に対する化合物１の作用を示す図である。
【図16】高脂肪食餌給餌モデルにおける非アルコール性脂肪肝疾患活性指数に対する化合物１の作用を示す図である。
【図17】高脂肪食餌給餌モデルにおけるＡＬＴ数値に対する化合物１の作用を示す図である
【図18】高脂肪食餌給餌モデルにおけるＡＳＴ数値に対する化合物１の作用を示す図である。
【図19】高脂肪食餌給餌モデルにおける血中コレステロール数値（Ａ）及び血中中性脂肪（ＴＧ）数値に対する化合物１の作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0041】
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。ただし、本発明は、ここで説明される実施例に限定されず、他の形態として具体化されてもよい。むしろ、ここで紹介される内容が徹底且つ完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
【0042】
［試験例１］ＦＦＣ食餌（Ｆａｔ，ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｄｉｅｔ）給餌非アルコール性脂肪肝炎モデルにおける効能評価
【0043】
（１）試験方法
【0044】
ＦＦＣ食餌（高脂肪、高果糖、高コレステロール食餌）（ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＩＥＴＳ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ．：Ｄ１２０７９Ｂ）を６～７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１６週間食餌して非アルコール性脂肪肝を誘発した後、生検を行って非アルコール性脂肪肝活性指数（ＮＡＳ ｓｃｏｒｅ）が３．２以上である動物だけを分離した。生検２週後、０．５％ ＭＣ（Ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）水溶液だけを投与した陰性対照群（ＦＦＣ ｃｏｎｔｒｏｌ）、０．５％ ＭＣ水溶液に溶解した化合物１投与群（２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル化合物を各３０ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ投与した群）のように３群に試験群を分離して構成する。化合物１は総２ヶ月間投与し、非アルコール性脂肪肝炎に対する改善効能を組織病理学的検査によって評価した。
【0045】
（２）組織病理学的検査方法及び結果
【0046】
組織病理学的検査のために、マウスを犠牲にし、肝組織を分離して、ヘマトキシリン－エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）染色スライドを作製した。すなわち、分離された肝組織を、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で４℃で２４時間固定させた後、流水に水洗し、パラフィンで包埋して、組織を３～４μｍ厚に薄切した。薄切した組織をコーティングスライド上に付けた後、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）でパラフィンを除去し、系列アルコール順（９９％、９５％、９０％、８０％及び７０％エタノール（ＥｔＯＨ））に含水過程を経た後、組織学的染色を行った。薄切した組織をヘマトキシリン染色液で５分間染色後、流水に５分間水洗し、１％ ＨＣｌアルコール及びアンモニアで脱染色した。その後、流水に１０分間水洗した後、再びエオシン染色液で１分間対照染色し、含水の逆方向に脱水過程を経た後に封入した。
【0047】
Ｈ＆Ｅ染色されたスライドを顕微鏡下で検鏡して組織病理学的評価を進行し、表１の基準に基づいて非アルコール性脂肪肝疾患活性指数（ＮＡＦＬＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ：ＮＡＳ）を数値化して記録した。非アルコール性脂肪肝疾患活性指数は、１）脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、２）肝小葉内炎症などの病変（ｌｏｂｕｌａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、３）肝組織の風船様変性（ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）の変化に対する評価点数を合算して算出され、非アルコール性脂肪肝炎の重症度評価に広く用いられている。
【0048】
【表1】
【0049】
図１に示すように、化合物１投与群では、賦形剤である０．５％ ＭＣ（Ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）水溶液だけを投与した陰性対照群（ＦＦＣ ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて肝小葉炎症性細胞浸潤が減少し、炎症に対する改善効果に優れることが確認された。また、化合物１投与群は、濃度依存的に脂肪肝改善効果が見られ（図２）、非アルコール性脂肪肝疾患活性指数が低くなることが確認された（図３）。
【0050】
したがって、本発明は、非アルコール性脂肪肝炎の予防又は治療に優れている効果が確認された。
【0051】
［試験例２］ＭＣＤ食餌（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｉｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｅｔ）８週及び１２週給餌非アルコール性脂肪肝炎モデルにおける効能評価
【0052】
ＭＣＤ食餌（メチオニン－コリン欠乏食餌、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｏｌｉｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｅｔ）モデルは、ベータ－酸化とＶＬＤＬ（Ｖｅｒｙ ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、超低密度脂質タンパク）合成に重要な働きをするメチオニン及びコリンがない食餌を供給することによって脂肪肝を誘発する試験モデルであり、組織病理学的に肝小葉内炎症がひどく誘発されるので、非アルコール性脂肪肝炎の改善効果を観察するためのモデルとして広く用いられている。
【0053】
（１）試験方法
【0054】
１）ＭＣＤ食餌８週給餌試験
【0055】
７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＤ食餌（ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＩＥＴＳ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ：Ａ０２０８２００２Ｂ）を４週間給餌して非アルコール性脂肪肝を誘発した後、４週間さらにＭＣＤ食餌を給餌しながら、次表２のＧ３～Ｇ８試験群構成におけるように、本発明のハイドロキノン誘導体化合物に該当する２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル（化合物１）と比較対照群として他の薬物をマウスに特定投与容量で４週間反復経口投与し、非アルコール性脂肪肝炎に対する改善効能を臨床病理学的検査及び組織病理学的検査によって評価した。
【0056】
【表2】
【0057】
正常対照群は、ＭＣＤ食餌ではなく正常食餌を給餌（ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＩＥＴＳ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ：Ａ０２０８２００３Ｂ）した場合であり、陰性対照群は、ＭＣＤ食餌を給餌した後、賦形剤である０．５％ ＭＣ（Ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）水溶液だけを投与した場合である。比較対照群として、表２のように、ＦＸＲ作用剤であるオベチコール酸（Ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＯＣＡ）、ＰＰＡＲγ作用剤であるピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ，ＰＧＺ）、抗酸化剤であるレスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，ＲＳＶ）及びＤＤＢ（Ｂｉｐｈｅｎｙｌ Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）系列肝機能保護剤（ＤＤＢ ｃｏｍｐｌｅｘ）を使用して効能対比実験とした。レスベラトロール及びＤＤＢ系列肝機能保護剤の投与容量は２００ｍｇ／ｋｇに設定した。オベチコール酸及びピオグリタゾンの１日投与容量は、ＦＤＡ及びＥＭＡ提出許可資料から報告された毒性容量と、論文などに報告された有効容量及び副作用容量を参考して、それぞれ３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ及び１０ｍｇ／ｋｇと、上の表２のように設定した。
【0058】
オベチコール酸の場合、ＣＤ－１（ＩＣＲ）マウスを用いた７日反復投与毒性試験（３、５０、１７５、３００ｍｇ／ｋｇ濃度）時に、１７５ｍｇ／ｋｇ濃度で動物の死亡のような深刻な副作用が現れることが報告されたことがある（ＦＤＡ ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＩＮＴ－７４７）ＮＤＡ ｐａｃｋａｇｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｒｅｖｉｅｗｓ；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：２０７９９９Ｏｒｉｇ１ｓ０００）。また、ｗｅｓｔｅｒｎ ｄｉｅｔ ＮＡＳＨマウスモデルにおける効能試験時に、４０ｍｇ／ｋｇ以上の容量ではむしろ非アルコール性脂肪肝疾患の経過を悪化（肝線維化の深刻化、ＡＬＴ数値の上昇）させることが報告されたことがある（Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１８ Ｍａｙ１；９：４１０）。したがって、多くのマウス非アルコール性脂肪肝研究論文で用いられた２０～３０ｍｇ／ｋｇ容量範囲のうち、最高の容量である３０ｍｇ／ｋｇに試験容量を設定した。
【0059】
ピオグリタゾンの場合、マウス１３週反復毒性試験時に、３２０ｍｇ／ｋｇ以上の容量で個体死亡が発生し、１００ｍｇ／ｋｇの以上で心臓副作用が発生することが報告されている（ＦＤＡ Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（ＡＣＴＯＳ）ＮＤＡ ｐａｃｋａｇｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｒｅｖｉｅｗｓ：０２１０７３）。また、マウスに非アルコール性脂肪肝に対する効能容量範囲として１０～３０ｍｇ／ｋｇが研究論文に報告されているが、ピオグリタゾン２５ｍｇ／ｋｇの容量でむしろ脂肪肝を悪化させると報告された研究結果（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１５，１６，１２２１３－１２２２９，ＰＰＡＲ Ｒｅｓ．２０１４：３８１８３）も参考して、一般的に最も多く報告された容量である１０ｍｇ／ｋｇを試験容量として設定した。
【0060】
２）ＭＣＤ食餌１２週給餌試験
【0061】
ＭＣＤ食餌の給餌期間を総１２週に延長して非アルコール性脂肪肝炎の誘発レベルを高めた。そのために、７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにメチオニン－コリン欠乏食餌を８週間給餌して非アルコール性脂肪肝を誘発した後、表２と同じ試験群を同一投与容量で４週間反復経口投与した。
【0062】
（２）組織病理学的及び臨床病理学的評価結果
【0063】
１）ＭＣＤ食餌８週給餌試験
【0064】
試験例１の組織病理学的検査方法と同様に、ＭＣＤ食餌８週給餌試験したマウスから肝組織を分離してＨ＆Ｅ染色スライドを作製した後、表１の基準に基づいて、１）脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、２）肝小葉内炎症などの病変（ｌｏｂｕｌａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、３）肝組織の風船様変性（ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）の変化を分析し評価点数を合算して非アルコール性脂肪肝疾患活性指数を算出し、これを用いて非アルコール性脂肪肝炎の治療効果を評価した。
【0065】
【0066】
図４に示す肝小葉の炎症細胞浸潤指数は、非アルコール性脂肪肝炎の組織病理学的評価において最も重要な指数の一つである。また、非アルコール性脂肪肝炎の薬物的治療の最大の目的が、脂肪肝から脂肪肝炎への進行又は脂肪肝炎から肝硬変のような次の段階への進行が起きないようにすることにある点からも、病理組織学的肝小葉炎症の改善は、非常に重要な効能改善指標である。
【0067】
本発明の化合物１投与群の場合、陰性対照群（ＭＣＤ ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて肝小葉炎症性細胞浸潤の改善効果が顕著であった（図４）。特に、現在臨床で非アルコール性脂肪肝炎１次治療剤として用いられているインスリン抵抗性改善薬物であるピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ，ＰＧＺ）に比べても優れた抗炎症効能を示し、また、現在臨床３床開発中であるオベチコール酸（Ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＯＣＡ）に比べても優れた抗炎症効能を示した。
【0068】
また、本発明の化合物１は、非アルコール性脂肪肝疾患活性指数が低くなることが確認され（図５）、臨床病理学的肝機能指標であるＡＬＴ数値が、陰性対照群及び比較対照群に比べて化合物１の２００ｍｇ／ｋｇ投与群において顕著に減少することが観察された（図６）。
【0069】
一方、抗酸化、抗炎症の効果があると知られたレスベラトロール（ＲＳＶ）及びＤＤＢ系列肝機能保護剤（ＤＤＢ ｃｏｍｐｌｅｘ）の場合、陰性対照群に比べて非アルコール性脂肪肝炎の改善効果を示していないが、これは、一般の抗酸化、抗炎効果だけでは、複雑な病理機転を持つ非アルコール性脂肪肝炎に対する抑制効果が得られないということを意味する。これに基づいて、本発明の化合物１は、非アルコール性脂肪肝炎を適応症として開発される既存の様々な作用機転の薬物群に比べて優れた非アルコール性脂肪肝炎抑制効能を示すことが確認された。
【0070】
２）ＭＣＤ食餌１２週給餌試験
【0071】
【0072】
図７及び図８に示すように、化合物１投与群の場合、陰性対照群（ＭＣＤ ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて肝小葉炎症性細胞浸潤に対する改善効果を示し、非アルコール性脂肪肝疾患活性指数が低くなったが、このような効果は化合物１の濃度依存的に増加することが観察された。特に、現在臨床で非アルコール性脂肪肝炎１次治療剤として用いられているインスリン抵抗性改善薬物であるピオグリタゾン（ＰＧＺ）に比べても優れた炎症抑制効能を示し、現在臨床３床開発中であるオベチコール酸（ＯＣＡ）に比べても優れた効能を示した。
【0073】
本試験例でも、抗酸化、抗炎症効果があると知られたレスベラトロール（ＲＳＶ）及びＤＤＢ系列肝機能保護剤（ＤＤＢ ｃｏｍｐｌｅｘ）の場合、陰性対照群に比べて改善効果が見られなかったが、これは、一般の抗酸化、抗炎効果だけでは、複雑な病理機転を持つ非アルコール性脂肪肝炎に対する抑制効果が十分でないことを意味する。
【0074】
［試験例３］高脂肪食餌（Ｈｉｇｈ－ｆａｔ ｄｉｅｔ，ＨＦＤ）給餌肥満及び非アルコール性脂肪肝炎モデルにおける効能評価
【0075】
（１）試験方法
【0076】
６０ｋｃａｌ％高脂肪食餌（ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＩＥＴＳ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ：Ｄ１２４９２）を７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１６週間食餌して非アルコール性脂肪肝を誘発し、高脂肪食餌１７週目から２５週目まで試験物質を９週間反復経口投与し、非アルコール性脂肪肝炎に対する改善効能を臨床病理学的検査及び組織病理学的検査によって評価した。
【0077】
試験群として、ＨＦＤ食餌ではなく正常食餌（１０ｋｃａｌ％脂肪食餌、ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＩＥＴＳ，Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｎｏ：Ｄ１２４５０Ｂ）を給餌した正常対照群と、ＨＦＤ食餌を給餌した後、賦形剤である０．５％ ＭＣ（Ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）水溶液だけを投与した陰性対照群、及び化合物１（２，３，５－トリメチルハイドロキノン－１－ヘキシルエーテル）投与群（３０、１００、２００ｍｇ／ｋｇ）、比較対照群（オベチコール酸３０ｍｇ／ｋｇ、ピオグリタゾン１０ｍｇ／ｋｇ、ＤＤＢ系列肝機能保護剤２００ｍｇ／ｋｇ）を設定した。
【0078】
（２）体重及び内臓脂肪蓄積抑制効果の確認
【0079】
前記（１）の試験方法と同様に、９週間試験物質を反復経口投与しながら９週間の体重増加量、飼料摂取量及び一般症状を観察、記録した。
【0080】
図９から確認されるように、化合物１投与群の場合、陰性対照群（ＨＦＤ ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて高脂肪食餌給餌による体重増加率が顕著に減少した。特に、化合物１投与群の場合、飼料摂取量は他の投与群と差異がなかったところ（図１０）、化合物１投与群における体重減少効能は飼料摂取量減少に起因するものでないことが分かる。
【0081】
また、図１１に示すように、マウスの解剖検査時に副睾丸脂肪の重さを測定した結果、化合物１は、副睾丸脂肪のような内臓脂肪の蓄積を抑制する効果に優れていた。このような副睾丸脂肪のような内臓脂肪の場合、皮下脂肪よりは速く動かされ、肝門脈を通して肝に直接流入して肝損傷を誘発することがあるため、非アルコール性脂肪肝炎の進行及び予後とも密接な関連を有することが知られている。
【0082】
このように、化合物１は、非常に優れた体重及び内臓脂肪量減少効果があり、肥満の予防、改善又は治療に効果があることが確認された。
【0083】
さらに、化合物１投与群の場合、正常動物においても副作用を示し得る代謝経路をターゲットとする他の薬物とは違い、ラット単回経口投与毒性試験時に、２０００ｍｇ／ｋｇの高容量投与にも死亡個体が発生しなかった。また、１３週経口反復投与毒性試験時に、５００ｍｇ／ｋｇの高い濃度にも死亡、臓器不全などの深刻な副作用を示しておらず、また、体重（図１２）及び飼料摂取量、尿検査及び血液学的検査においても化合物１投与に起因する変化がないことが観察された。
【0084】
（３）インスリン抵抗性改善効果確認
【0085】
化合物１の化合物投与７週目にインスリン耐性検査を行って、化合物１が高脂肪食餌によるインスリン抵抗性増加に及ぼす影響を観察した。
【0086】
インスリン耐性検査は、４時間絶食を行ったマウスにインスリンを腹腔投与し（０．７ＩＵ／ｋｇ）、３０分間隔で血糖を測定して行った。また、インスリン抵抗性を数値化するために、インスリン投与前の血糖を基底値（ｂａｓｅｌｉｎｅ）とし、減少した血糖数値曲線の面積をｉＡＵＣ値で数値化してインスリン抵抗性を定量的に比較した（図１４）。ここで、ｉＡＵＣ値が小さいほどインスリン抵抗性が高いことを意味し、ｉＡＵＣ値が大きいほどインスリン感受性が大きいことを意味する。
【0087】
インスリン耐性検査の結果、図１３に示したように、化合物１投与群の場合、インスリン投与時に、陰性対照群及び他の薬物対照群に比べて血糖減少がより速く起きることが確認できた。すなわち、陰性対照群の場合、末梢組織のインスリン抵抗性増加によって血糖減少が徐々に起きるが、化合物１投与時には、インスリンに対する感受性が増加することにより、血糖がより速く減少することを観察した。これを、図１４のように、ｉＡＵＣ値で数値化して比較した場合にも、陰性対照群及び他の薬物対照群に比べて、高脂肪食餌によって発生するインスリン抵抗性に対する抑制効果が大きいことが確認できた。
【0088】
（４）組織病理学的及び臨床病理学的評価結果
【0089】
試験例１の組織病理学的検査方法と同様に、高脂肪食餌給餌試験したマウスから肝組織を分離してＨ＆Ｅ染色スライドを作製した後、表１の基準に基づいて、１）脂肪症（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、２）肝小葉内炎症などの病変（ｌｏｂｕｌａｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、３）肝組織の風船様変性（ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）の変化を分析し、評価点数を合算して非アルコール性脂肪肝疾患活性指数を算出し、これを用いて非アルコール性脂肪肝炎の治療効果を評価した。
【0090】
図１５及び図１６に示すように、組織病理学的な評価においても化合物１は他の薬物に比べて優れた非アルコール性脂肪肝炎の治療効能を示すことが確認された。図１５及び図１６に示すように、化合物１投与群の場合、陰性対照群（ＨＦＤ ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて肝小葉炎症性細胞浸潤及び脂肪肝に対する改善効果を示し、この改善効果は化合物１処理濃度依存的に増加することが観察された。また、化合物１の２００ｍｇ／ｋｇ投与群の場合、他の対照薬物に比べて顕著に高い肝小葉炎症抑制効果を示した。
【0091】
臨床病理学的な評価においても化合物１投与によって肝機能及び肝損傷指標であるＡＬＴ及びＡＳＴ数値が正常レベルに回復したことを確認した。特に、他の薬物対照群に比べてＡＬＴ、ＡＳＴ数値がより多く減少したことを確認した（図１７及び図１８）。
【0092】
さらに、脂肪肝及び脂肪肝炎進行を悪化させる血中コレステロール及び中性脂肪数値が陰性対照群に比べて減少することを確認した（図１９（Ａ）及び（Ｂ））。オベチコール酸の場合、本動物実験では高いコレステロール抑制作用を示したが、臨床試験時には低い濃度（成人１人につき１０～２５ｍｇ）でも正常人と非アルコール性脂肪肝患者において総コレステロール及びＬＤＬコレステロールを上げる副作用を示すことが知られている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｏｂｅｓｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １８：９３６－９４０，２０１６）。これに対し、本発明の化合物１は、臨床１床試験時に、成人１人につき１０００ｍｇの容量を１４日間反復投与した場合にも、異常脂質血症のような異常反応が報告されなかった。
【0093】
（５）総合評価
【0094】
前記高脂肪食餌給餌動物モデル試験から、本発明の化合物１が体重増加及び内臓脂肪量の蓄積を減少させる効果に優れ、肥満の予防、改善又は治療剤として有用に利用可能であることが確認された。
【0095】
また、本発明の化合物１は、既に開発された非アルコール性脂肪肝炎治療剤に比べて、体重及び内臓脂肪蓄積抑制、インスリン感受性増加、及び肝組織炎症抑制効果に優れるので、複雑で様々な因子が作用する非アルコール性脂肪肝炎の治療に極めて効果的であることが確認された。
【0096】
それに加えて、本発明の化合物１は、ラットにおける半数致死量が２０００ｍｇ／ｋｇを上回り、ビーグル犬における最大耐性容量が２０００ｍｇ／ｋｇ以上である非常に安全な化合物として確認されたことがあり、ラットを用いた１３週反復投与毒性試験において５００ｍｇ／ｋｇの高い濃度でも死亡、体重減少、臓器不全のような副作用が見られなかった。また、臨床１床試験からも、単回投与時に成人１人につき２０００ｍｇまで、１４日反復投与時に成人１人につき１０００ｍｇまでも異常反応が報告されなかった、安全性の高い化合物であるので、長期治療が必要な非アルコール性脂肪肝炎治療剤として有用に利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】