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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-28
(45)【発行日】2023-05-11
(54)【発明の名称】ユビキチンおよびユビキチン様酵素活性を同定するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/573 20060101AFI20230501BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230501BHJP
C12Q 1/00 20060101ALI20230501BHJP
C07K 17/00 20060101ALN20230501BHJP
【ＦＩ】
G01N33/573 A
G01N33/68 ZNA
C12Q1/00 Z
C07K17/00
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021570461
(86)(22)【出願日】2020-05-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-28
(86)【国際出願番号】 EP2020064911
(87)【国際公開番号】W WO2020239949
(87)【国際公開日】2020-12-03
【審査請求日】2021-11-26
(31)【優先権主張番号】19305690.0
(32)【優先日】2019-05-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】511119776
【氏名又は名称】セントレ ナショナル デ ラ レセルシュ シャンティフィク
(73)【特許権者】
【識別番号】515011944
【氏名又は名称】ウニヴェルシテ・ドゥ・モンペリエ
(74)【代理人】
【識別番号】100091487
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 行孝
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】ギョーム、ボシス
(72)【発明者】
【氏名】ピエール、ゲイテル
(72)【発明者】
【氏名】マルク、ピチャツェイク
【審査官】白形 優依
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／０３４８９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００４／０２０４５８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０２０９４１４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】WIDAGDO, J. et al.，SUMOylation of GTF2IRD1 Regulates Protein Partner Interactions and Ubiquitin-Mediated Degradation，PLOS ONE，2012年11月08日，Vol.7, No.11, e49283，pp.1-10
【文献】RISTIC, M. et al.，Detection of Protein-Protein Interactions and Posttranslational Modifications Using the Proximity Ligation Assay: Application to the Study of the SUMO Pathway，Proteostasis，2016年09月10日，Vol.1449，pp.279-290
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
医中誌ＷＥＢ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物学的サンプルの細胞におけるＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質のコンジュゲーションに関与するタンパク質または酵素の活性を定量化するための方法であって、ａ）細胞の細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループから選択される少なくとも３個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、前記１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
前記少なくとも３個のタンパク質が、担体に固定化されており、
前記少なくとも３個のタンパク質は、それらが前記細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質とコンジュゲートしておらず、
前記少なくとも３個のタンパク質が、配列番号１～３の配列からなるタンパク質に対応し、前記１０個のタンパク質が、配列番号１～１０の配列からなるタンパク質に対応し、前記４６個のタンパク質のグループが、配列番号１～４６の配列からなるタンパク質に対応し、
配列番号１は、ＺＭＹＭ５タンパク質に対応し、配列番号２は、ＢＥＡＮタンパク質に対応し、配列番号３は、ＯＴＵＤ６Ｂに対応する、ステップと、
ｂ）前記少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、を含む、方法。
【請求項2】
前記方法が、細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループの各タンパク質と接触させるステップを含み、前記１０個のタンパク質のグループは、前記４６個のタンパク質のセットに属する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法が、細胞抽出物を、４６個のタンパク質のセットの各タンパク質と接触させるステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも３個のタンパク質が、ビーズによって担持されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ビーズが、蛍光ビーズである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記少なくとも３個のタンパク質のそれぞれが、他のビーズの蛍光特性とは異なる蛍光特性を有するビーズによって担持されており、同じ蛍光特性を有するすべてのビーズが、同じタンパク質を担持する、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
生物学的サンプルの細胞におけるＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に対する薬物の効果を同定するための方法であって、ａ）前記薬物で処理された細胞の細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループから選択された少なくとも３個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、前記１０個のタンパク質のグループが、４６個のタンパク質のセットに属し、
前記少なくとも３個のタンパク質が、担体に固定化されており、
前記少なくとも３個のタンパク質は、それらが前記細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質とコンジュゲートしておらず、
前記少なくとも３個のタンパク質が、配列番号１～３の配列からなるタンパク質に対応し、前記１０個のタンパク質が、配列番号１～１０の配列からなるタンパク質に対応し、前記４６個のタンパク質のグループが、配列番号１～４６の配列からなるタンパク質に対応し、
配列番号１は、ＺＭＹＭ５タンパク質に対応し、配列番号２は、ＢＥＡＮタンパク質に対応し、配列番号３は、ＯＴＵＤ６Ｂに対応する、ステップと、
ｂ）前記少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで取得された前記第１の値を、前記少なくともタンパク質が、前記薬物で処理されていない細胞の前記細胞抽出物と接触したときに取得された前記少なくとも３個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、前記第１の値と前記第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ａ．前記少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の前記比率が１である場合、前記薬物は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｂ．そうでない場合、前記薬物は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む、方法。
【請求項8】
前記方法が、前記薬物で処理された細胞の細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループの各タンパク質と接触させるステップを含み、前記１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属する、請求項７に記載の薬物の効果を同定するための方法。
【請求項9】
前記方法が、前記薬物で処理された細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質のセットの各タンパク質と接触させるステップを含む、請求項８に記載の薬物の効果を同定するための方法。
【請求項10】
前記少なくとも３個のタンパク質が蛍光ビーズによって担持される、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記少なくとも３個のタンパク質のそれぞれが、他のビーズの蛍光特性とは異なる蛍光特性を有するビーズによって担持されており、同じ蛍光特性を有するすべてのビーズが、同じタンパク質を担持する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
１０個のタンパク質のグループから選択される少なくとも３個のタンパク質を含む組成物であって、前記１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、前記少なくとも３個のタンパク質が、配列番号１～３の配列からなるタンパク質に対応し、前記１０個のタンパク質が、配列番号１～１０の配列からなるタンパク質に対応し、前記４６個のタンパク質のグループが、配列番号１～４６の配列からなるタンパク質に対応し、
前記少なくとも３個のタンパク質が、蛍光ビーズ上に担持され、
前記少なくとも３個のタンパク質のそれぞれが蛍光特性を有するビーズによって担持され、
前記少なくとも３個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズが、少なくとも２個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズが、同じタンパク質を担持する、組成物。
【請求項13】
１０個のタンパク質の少なくとも１０個のタンパク質グループを含み、前記グループが、４６個のタンパク質のセットに属し、前記少なくとも１０個のタンパク質が、蛍光ビーズ上に担持され、
前記少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれが蛍光特性を有するビーズによって担持され、
前記少なくとも１０個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズが、少なくとも９個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズが、同じタンパク質を担持する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
４６個のタンパク質を含み、前記４６個のタンパク質が、蛍光ビーズ上に担持され、
前記４６個のタンパク質のそれぞれが蛍光特性を有するビーズによって担持され、
前記４６個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズが、少なくとも４５個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズが、同じタンパク質を担持する、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項15】
生物学的サンプルの細胞において、ＵＢＬ経路活性を定量化するため、またはＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質による修飾に対する薬物の効果をインビトロで同定するための、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ユビキチンおよびユビキチン様酵素活性、特に薬物処理に加えて酵素活性を同定するための方法に関する。
【0002】
前駆体タンパク質は活性がなく、そのため、機能的な成熟タンパク質になるにはさらに処理が必要である。翻訳後タンパク質修飾は、タンパク質生合成の前または後のタンパク質の化学修飾であり、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、アセチル化、およびユビキチン様修飾因子（ＵＢＬ）による修飾が含まれる。
【0003】
ユビキチンは、最もよく理解されている翻訳後修飾因子だが、ユビキチンプロテアソーム経路と並行しているが異なる経路で細胞標的を修飾するユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）のファミリーが増えている。これらの代替修飾因子には、ＳＵＭＯ（Ｓｅｎｔｒｉｎ、酵母のＳｍｔ３）、ＮＥＤＤ８（酵母のＲｕｂ１）、ＩＳＧ１５（ＵＣＲＰ）、ＡＰＧ８、ＡＰＧ１２、ＦＡＴ１０、Ｕｆｍ１、ＵＲＭ１およびＨｕｂ１が含まれる。
【0004】
これらの関連分子は、新規な機能を有し、多様な生物学的プロセスに影響を与える。一部のタンパク質は、複数のＵＢＬによって、場合によっては同じリジン残基でさえも修飾される可能性があるため、様々なコンジュゲーション経路間にも相互調節がある。例えば、ＳＵＭＯ修飾は、ユビキチン化の修飾に対して拮抗的に作用することができ、タンパク質基質を安定化させる働きをする。ＵＢＬにコンジュゲートしたタンパク質は、通常、プロテアソームによる分解の標的にはならないが、様々な調節活性で機能する。ＵＢＬの付着は、基質のコンフォメーションを変化させ、リガンドまたは他の相互作用する分子への親和性に影響を与え、基質の局在を変化させ、タンパク質の安定性に影響を与える可能性がある。
【0005】
ＵＢＬは、構造的にユビキチンに類似しており、ユビキチンの対応するメカニズムに類似した酵素ステップによって処理され、活性化され、コンジュゲートし、コンジュゲートから放出される。ＵＢＬは、不変のＣ末端ＧＧモチーフを露出するように処理されるＣ末端伸長で翻訳される。これらの修飾因子には、ＵＢＬを細胞内標的にコンジュゲートさせる独自の特異的なＥ１（活性化）、Ｅ２（コンジュゲート）、およびＥ３（連結）酵素がある。これらのコンジュゲートは、脱ユビキチン化酵素と同様のメカニズムを有するＵＢＬ特異的イソペプチダーゼによって逆転させることができる。
【0006】
したがって、ＵＢＬは、多くの細胞プロセスにおいて中心的な機能を果たしており、したがって調節解除が可能であり、そのような調節解除は、多くの疾患および症候群に関与している。
【0007】
したがって、ユビキチンおよびＵＢＬの修飾を制御し、異常な変動を評価する必要がある。
【0008】
しかしながら、今日まで、疾患の結果として、またはさらに阻害剤による処理の結果として、ユビキチンおよびＵＢＬの修飾の包括的な評価を実行することは、容易ではない。実際、既存の技術は、酵素の活性を直接定量化するのではなく、個々のタンパク質の修飾のレベルを定量化する。
【0009】
したがって、ユビキチンおよびＵＢＬの修飾に関与する酵素の活性を監視することを可能にする方法を提供する必要がある。
【0010】
本発明の１つの目的は、そのような方法およびそのような方法を実行しやすいキットを提案することである。
【0011】
本発明は、生物学的サンプルの細胞におけるＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質のコンジュゲーションに関与するタンパク質または酵素の活性を定量化するための方法に関し、当該方法は、
ａ）少なくとも細胞の細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループから選択される少なくとも３個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも３個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該少なくとも３個のタンパク質が、配列番号１～３の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該１０個のタンパク質が、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、
配列番号１は、ＺＭＹＭ５タンパク質に対応し、配列番号２は、ＢＥＡＮタンパク質に対応し、配列番号３は、ＯＴＵＤ６Ｂに対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、を含む。
ａ）少なくとも細胞の細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループから選択される少なくとも３個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも３個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該少なくとも３個のタンパク質が、配列番号１～３の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該１０個のタンパク質が、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、
配列番号１は、ＺＭＹＭ５タンパク質に対応し、配列番号２は、ＢＥＡＮタンパク質に対応し、配列番号３は、ＯＴＵＤ６Ｂに対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、を含む。
【0012】
本発明は、４６個のタンパク質のグループに属する少なくとも３個の特定のタンパク質のユビキチン、ＳＵＭＯ、およびＮＥＤＤ８による修飾の評価が、当該経路の活性を測定し、これらの経路を標的とする薬物の効果を監視するために非常に重要である、という本発明者らが行った予想外の観察に基づいている。
【0013】
実際、本発明者らは、当該３個のタンパク質へのユビキチンおよび／またはＳＵＭＯおよび／またはＮＥＤＤ８の添加によって誘導される修飾を評価することにより、それらのコンジュゲーションに関与する特定の酵素の活性、およびＵｂｌ経路を修飾する化合物の能力に関する良好な情報を提供することを観察した。
【0014】
ユビキチン、ＳＵＭＯ、ＮＥＤＤ８のいずれによっても修飾されていない精製された決定されたタンパク質（当該少なくとも３個のタンパク質）を使用することにより、本発明者らは、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８経路の活性を容易に定量化することができる。
【0015】
さらに、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質のコンジュゲーションに関与するタンパク質／酵素の活性を決定するために使用される細胞抽出物が、そのような活性を修飾する傾向がある決定された状態にある場合（例えば、薬物または化合物で処理され、特定の環境に置かれ、決定された温度および／または圧力に置かれる）、次に、修飾のレベルを、この決定された状態に置かれない細胞、すなわち対照細胞の修飾のレベルと比較することが適切である。
【0016】
ユビキチン（Ｕｂ）は、７６個のアミノ酸残基からなる球状タンパク質であり、ＵＰＳ（ユビキチン－プロテアソームシステム）は、細胞内タンパク質の８０～９０％を分解する役割を果たす。Ｕｂは、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチンがコンジュゲートする酵素Ｅ２、およびユビキチンＥ３リガーゼなどの一連の酵素によって、標的タンパク質のリジン残基に結合する。その後、これらのユビキチン化されたタンパク質は、一般に２６Ｓプロテアソームによって認識および分解される。
【0017】
３つすべてのＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、およびＳＵＭＯ３パラログの構造は、球状でコンパクトなＵｂのような折り目に似ている。ＳＵＭＯ１とＳＵＭＯ２の違いは、主に両方のタンパク質の２番目のβストランドおよびαヘリックスに見られる。細胞内では、異なるＳＵＭＯパラログは、共通の特性を共有しているように見えるが、いくつかの異なる機能も有している。例えば、前骨髄球性白血病タンパク質は、３つすべてのＳＵＭＯパラログにコンジュゲートするが、ＲａｎＧＡＰ１は、ＳＵＭＯ１で優先的に修飾され、トポイソメラーゼＩＩは、ＳＵＭＯ２／３で有糸分裂中に優先的に修飾される。さらに、ＳＵＭＯ１およびＳＵＭＯ２／３は、どちらも核質に多く見られるが、ＳＵＭＯ１は核小体、核膜、および細胞質病巣に独自に見られ、ＳＵＭＯ２／３は核再形成プロセスの初期の時点で染色体に発生する。興味深いことに、ＳＵＭＯ１よりも遊離した非コンジュゲートＳＵＭＯ２／３のプールが大きくなっている。
【0018】
ＮＥＤＤ８は、相対分子量が９ｋＤａの８１アミノ酸のタンパク質で、ユビキチンと６０％同一で、８０％相同である。ＮＥＤＤ８には、専用のＥ１活性化酵素（ＡｐｐＢｐ１／ＵＢＡ３、またはＮＡＥ）およびＥ２がコンジュゲートする酵素（ＵＢＣ１２、ＵＢＥ２Ｆ）があり、カリン足場へのコンジュゲーションを通じて、Ｅ３リガーゼのＣＲＬファミリーの酵素活性に不可欠である。ＮＥＤＤ化経路の他の構成要素には、ＮＥＤＤ８を、成熟した７６アミノ酸の形態に処理するＤＥＮ１、およびカリンタンパク質からＮＥＤＤ８を除去する役割を担うＣＯＰ９シグナロソーム複合体が含まれる。ＣＡＮＤ１（カリン結合およびＮＥＤＤ化解離）は、ＮＥＤＤ８の活性化がない場合にカリンに結合することにより、ＣＲＬ複合体の集合を調節する追加の構成要素である。
【0019】
本発明では、４６個のタンパク質のセット（すなわち、４６個のタンパク質からなるセット）は、以下のタンパク質によって構成される。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【0020】
上記の方法において、配列番号１～３に記載の少なくとも３個のタンパク質は、担体上に沈着され、次いで、比較される細胞の細胞抽出物（例えば、ＵＢＬ経路を阻害しやすい化合物で処理された細胞または処理されなかった細胞）と接触される。
【0021】
この方法を用いて、本発明者らは、細胞抽出物に含有されるすべてのタンパク質ではなく、配列番号１～３のタンパク質のユビキチン／ＳＵＭＯ／ＮＥＤＤ８による修飾を具体的に評価する。
【0022】
接触期間中、抽出物に含有されるユビキチン／ＳＵＭＯ／ＮＥＤＤ８の添加に関与する酵素は、タンパク質の配列番号１～３を修飾するであろう。したがって、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、およびＮＥＤＤ化の量は、酵素の活性に依存し、分析する条件（細胞型、阻害剤など）の影響と直接相関する。
【0023】
タンパク質と細胞抽出物との接触に加えて、ユビキチン／ＳＵＭＯ／ＮＥＤＤ８による修飾は、ユビキチン、またはＳＵＭＯ、またはＮＥＤＤ８のいずれかに対して向けられた特異的抗体を使用した免疫学的手法によって測定される。
【0024】
例えば、ユビキチンおよび／またはＳＵＭＯおよび／またはＮＥＤＤ８タンパク質によって修飾されるタンパク質は、したがって、ユビキチンおよび／またはＳＵＭＯおよび／またはＮＥＥＤ８タンパク質に対して向けられた抗体と相互作用して、分子複合体を形成する。複合体は、ユビキチンおよび／またはＳＵＭＯおよび／またはＮＥＤＤ８タンパク質に対して向けられた当該抗体の一定部分のＦＣ鎖を認識する（および相互作用する）二次抗体によって検出され得る。
【0025】
当該複合体は、二次抗体が蛍光タンパク質、ペルオキシダーゼ、蛍光色素などのレポーター分子で標識されている場合に同定され得る。
【0026】
当業者は、特にフローサイトメーターを使用することにより、複合体タンパク質／抗ユビキチン、抗ＳＵＭＯまたは抗ＮＥＤＤ８抗体を定量化する方法を知っている。
【0027】
次に、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮＥＤＤ８のそれぞれについて、配列番号１～３の各タンパク質について、修飾の値が取得される。
【0028】
タンパク質配列番号１は、ＳＵＭＯ１およびＳＵＭＯ２によって修飾され得るが、タンパク質配列番号２は、好ましくはユビキチンによって修飾され、タンパク質配列番号３は、ＮＥＤＤ８によって修飾され得ることに留意されたい。
【0029】
したがって、当該少なくともタンパク質を評価する場合、干渉なしにＵＢＬ経路活性を決定し、細胞内のＵＢＬ経路の定量的活性を得ることが可能である。
【0030】
図９は、これらのタンパク質の特異性を示している。
【0031】
有利には、本発明は、上記の方法に関する。当該方法は、細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループの各タンパク質と接触させるステップを含み、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属する。
【0032】
言い換えれば、本発明は、有利には、上記の方法に関する。当該方法は、
ａ）細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質のセットから選択された少なくとも１０個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、
当該少なくとも３個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のセットは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、を含む。
ａ）細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質のセットから選択された少なくとも１０個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、
当該少なくとも３個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のセットは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、を含む。
【0033】
より有利には、本発明は、上記で定義された方法に関し、当該方法は、細胞抽出物を当該４６個のタンパク質のセットの各タンパク質と接触させるステップを含む。
【0034】
言い換えれば、本発明は、有利には、上記の方法に関する。当該方法は、
ａ）細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質の各タンパク質と接触させるステップであって、
当該４６個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該４６個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該４６個のタンパク質のセットは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応する、ステップと、
ｂ）当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、を含む。
ａ）細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質の各タンパク質と接触させるステップであって、
当該４６個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該４６個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該４６個のタンパク質のセットは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応する、ステップと、
ｂ）当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、を含む。
【0035】
より有利には、本発明は、上記で定義された方法に関し、当該少なくとも３個のタンパク質が、ビーズによって担持されている。
【0036】
有利には、本発明は、上記で定義された方法に関し、当該ビーズが、蛍光ビーズである。
【0037】
有利には、本発明は、上記で定義された方法に関する。当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれは、他のビーズの蛍光特性とは異なる蛍光特性を有する決定されたビーズによって担持されており、
同じ蛍光特性を有するすべてのビーズが、同じタンパク質を担持する。
同じ蛍光特性を有するすべてのビーズが、同じタンパク質を担持する。
【0038】
例えば、この方法は、Ｌｕｍｉｎｅｘによって開発されたＸＭａｐテクノロジーを使用して実施できる。これは、独自の色のＭａｇ－Ｐｌｅｘ金属ベースのミクロスフェア（２つの異なる染料のレベルが変化する５００の異なる色）で構成されている。それらは、カルボイイミドカップリング技術を使用して特定のタンパク質とカップリングすることができる。タンパク質とカップリングしたビーズは、その後の例で説明するように、多重化して細胞抽出物とともに使用することができる。専用のアナライザーまたはフローサイトメーターを使用して、様々なビーズを区別することができる。
【0039】
本発明によるタンパク質は、当技術分野で周知の任意の手段によって蛍光ビーズ上に共有結合的にグラフトされる。
【0040】
一態様では、本発明は、生物学的サンプルの細胞におけるＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質のコンジュゲーションによるタンパク質修飾に対する薬物の効果を同定することに関するタンパク質／酵素の活性を定量化するための方法に関する。例えば、ＵＢＬタンパク質修飾に対する薬物の効果を同定するために、当該方法は、
ａ）試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された細胞の）を、１０個のタンパク質のグループから選択された少なくとも３個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも３個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該少なくとも３個のタンパク質は、配列番号１～３の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、
配列番号１は、ＺＭＹＭ５タンパク質に対応し、配列番号２は、ＢＥＡＮタンパク質に対応し、配列番号３は、ＯＴＵＤ６Ｂに対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該制御細胞抽出物と接触したときに取得された当該少なくとも３個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ｉ－当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された薬物条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｉｉ－当該少なくとも３個のタンパク質の少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された薬物条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
ａ）試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された細胞の）を、１０個のタンパク質のグループから選択された少なくとも３個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも３個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該少なくとも３個のタンパク質は、配列番号１～３の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、
配列番号１は、ＺＭＹＭ５タンパク質に対応し、配列番号２は、ＢＥＡＮタンパク質に対応し、配列番号３は、ＯＴＵＤ６Ｂに対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該制御細胞抽出物と接触したときに取得された当該少なくとも３個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ｉ－当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された薬物条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｉｉ－当該少なくとも３個のタンパク質の少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された薬物条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
【0041】
有利には、本発明は、有利には、上記の方法に関する。当該方法は、
ａ）試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された細胞の）を、グループの少なくとも１０個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該制御細胞抽出物と接触したときに取得された当該少なくとも１０個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値の比率を取得するステップと、
ｄ）
ｉ．当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）薬物は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｉｉ．当該少なくとも１０個のタンパク質の少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された薬物条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
ａ）試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された細胞の）を、グループの少なくとも１０個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該制御細胞抽出物と接触したときに取得された当該少なくとも１０個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値の比率を取得するステップと、
ｄ）
ｉ．当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）薬物は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｉｉ．当該少なくとも１０個のタンパク質の少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された薬物条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
【0042】
より有利には、本発明は、上記の方法に関する。当該方法は、
ａ）試験される（例えば、当該薬物で処理される）細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質の各タンパク質セットと接触させるステップであって、
当該４６個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該４６個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該４６個は、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなる、ステップと、
ｂ）当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該対照細胞抽出物と接触したときに取得された当該４６個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ｉ．当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｉｉ．当該４６個のタンパク質のうちの少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
ａ）試験される（例えば、当該薬物で処理される）細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質の各タンパク質セットと接触させるステップであって、
当該４６個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該４６個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該４６個は、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなる、ステップと、
ｂ）当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該対照細胞抽出物と接触したときに取得された当該４６個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ｉ．当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｉｉ．当該４６個のタンパク質のうちの少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
【0043】
本発明は、生物学的サンプルの細胞におけるＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に対する薬物の効果を同定するための方法に関し、当該方法は、
ａ）当該薬物で処理された細胞の細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループから選択された少なくとも３個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも３個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該少なくとも３個のタンパク質は、配列番号１～３の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、
配列番号１は、ＺＭＹＭ５タンパク質に対応し、配列番号２は、ＢＥＡＮタンパク質に対応し、配列番号３は、ＯＴＵＤ６Ｂに対応する、ステップと、
ａ）当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｂ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、当該薬物で処理されていない細胞の当該細胞抽出物と接触したときに取得された当該少なくとも３個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｃ）
ｉ－当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該薬物は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｉｉ－当該少なくとも３個のタンパク質のうちの少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該薬物は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
上記のステップａ）およびｂ）の上記条件は、必要な変更を加えてここに適用される。
ａ）当該薬物で処理された細胞の細胞抽出物を、１０個のタンパク質のグループから選択された少なくとも３個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも３個のタンパク質は、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該少なくとも３個のタンパク質は、配列番号１～３の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、
配列番号１は、ＺＭＹＭ５タンパク質に対応し、配列番号２は、ＢＥＡＮタンパク質に対応し、配列番号３は、ＯＴＵＤ６Ｂに対応する、ステップと、
ａ）当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｂ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、当該薬物で処理されていない細胞の当該細胞抽出物と接触したときに取得された当該少なくとも３個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｃ）
ｉ－当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該薬物は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｉｉ－当該少なくとも３個のタンパク質のうちの少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該薬物は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
上記のステップａ）およびｂ）の上記条件は、必要な変更を加えてここに適用される。
【0044】
試験された条件（例えば、薬物処理）が、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化のプロセスに影響を及ぼさない場合、配列番号１～３のタンパク質は、同じ性質の対照細胞抽出物で得られる修飾と同様のレベルで修飾される（例えば、阻害剤で処理されなかった細胞）。
【0045】
逆に、試験された条件（例えば、薬物処理）が、ＵＢＬ経路に影響を与える場合、ユビキチン／ＳＵＭＯ／ＮＥＤＤ８による配列番号１～３のタンパク質の修飾量は、対照条件（例えば、非処理細胞）において観察された修飾量と比較して増加または減少する。
【0046】
タンパク質と細胞抽出物との接触に加えて、ユビキチン／ＳＵＭＯ／ＮＥＤＤ８による修飾は、ユビキチン、またはＳＵＭＯ、またはＮＥＤＤ８のいずれかに対して向けられた特異的抗体を使用した免疫学的手法によって測定される。
【0047】
例えば、ユビキチンおよび／またはＳＵＭＯおよび／またはＮＥＤＤ８タンパク質によって修飾されるタンパク質は、したがって、ユビキチンおよび／またはＳＵＭＯおよび／またはＮＥＥＤ８タンパク質に対して向けられた抗体と相互作用して、分子複合体を形成する。複合体は、ユビキチンおよび／またはＳＵＭＯおよび／またはＮＥＤＤ８タンパク質に対して向けられた当該抗体の一定部分のＦＣ鎖を認識する（および相互作用する）二次抗体によって検出され得る。
【0048】
当該複合体は、二次抗体が蛍光タンパク質、ペルオキシダーゼ、蛍光色素などのレポーター分子で標識されている場合に同定され得る。
【0049】
当業者は、特にフローサイトメーターを使用することにより、複合体タンパク質／抗ユビキチン、抗ＳＵＭＯまたは抗ＮＥＤＤ８抗体を定量化する方法を知っている。
【0050】
次に、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮＥＤＤ８のそれぞれについて、配列番号１～３の各タンパク質について、修飾の値が得られる。
【0051】
次に、この値を、対照細胞抽出物と接触させた同じタンパク質（例えば、阻害剤で処理したものと同じ性質の細胞であるが、当該阻害剤で処理しなかった細胞）について得られた参照値と比較する。
【0052】
第１の値、すなわち試験される細胞抽出物で得られた値（例えば、阻害剤で処理された）と第２の値、すなわち対照細胞抽出物で得られた値（例えば、阻害剤で処理されていない）との間に比率が確立される。
【0053】
次に、１つのタンパク質について、３つの異なる比率が得られる。１つはユビキチン、１つはＳＵＭＯ、もう１つはＮＥＤＤ８である。
【0054】
Ｒユビキチン（ｉ）＝試験される細胞（例えば、阻害剤で処理された）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのユビキチンの値／対照細胞（例えば、阻害剤で処理されていない）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのユビキチンの値、
ＲＳＵＭＯ（ｉ）＝試験される細胞（例えば、阻害剤で処理された）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのＳＵＭＯの値／対照細胞（例えば、阻害剤で処理されていない）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのＳＵＭＯの値、および
ＲＮＥＤＤ８（ｉ）＝試験される細胞（例えば、阻害剤で処理された）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのＮＥＤＤ８の値／対照細胞（例えば、阻害剤で処理されていない）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのＮＥＤＤ８の値。
ＲＳＵＭＯ（ｉ）＝試験される細胞（例えば、阻害剤で処理された）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのＳＵＭＯの値／対照細胞（例えば、阻害剤で処理されていない）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのＳＵＭＯの値、および
ＲＮＥＤＤ８（ｉ）＝試験される細胞（例えば、阻害剤で処理された）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのＮＥＤＤ８の値／対照細胞（例えば、阻害剤で処理されていない）の細胞抽出物を含むタンパク質配列番号ｉのＮＥＤＤ８の値。
【0055】
上記の例では、ｉは１、２、または３のいずれかである。
【0056】
比率が確立されると、各ユビキチン、ＳＵＭＯ、およびＮＥＤＤ８の各タンパク質について計算されたすべての比率が、約１に等しい場合、試験された条件（例えば、薬物処理）が、ＵＢＬ経路に影響を与えないと結論付けられる。これは、配列番号１～３のタンパク質で起こる修飾が、試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された）と対照（例えば、処理されない）との間で類似していることを意味する。
【0057】
逆に、上記の比率のうちの少なくとも１つが、１と著しく異なる場合は、試験された条件（例えば、薬物処理）が、ＵＢＬ経路に影響を与えると結論付けることができる。
【0058】
タンパク質配列番号１は、ＳＵＭＯ１およびＳＵＭＯ２によって修飾され得るが、タンパク質配列番号２は、好ましくはユビキチンによって修飾され、タンパク質配列番号３は、ＮＥＤＤ８によって修飾され得ることに留意されたい。
【0059】
したがって、当該少なくともタンパク質を評価する場合、どのＵＢＬ経路が、試験された条件（例えば、阻害剤処理）によって影響を受けるかを決定することが可能である。
【0060】
図９は、これらのタンパク質の特異性を示している。
【0061】
有利には、本発明は、上記の方法に関する。当該方法は、試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された細胞の）を、１０個のタンパク質のグループの各タンパク質と接触させるステップを含み、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属する。
【0062】
言い換えれば、本発明は、有利には、上記の方法に関する。当該方法は、
ａ）試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された細胞の）を、グループの少なくとも１０個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも１０個のタンパク質が、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該制御細胞抽出物と接触したときに取得された当該少なくとも１０個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ａ．当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｂ．当該少なくとも１０個のタンパク質の少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
ａ）試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された細胞の）を、グループの少なくとも１０個のタンパク質のサブグループの各タンパク質と接触させるステップであって、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該少なくとも１０個のタンパク質が、それらが当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応する、ステップと、
ｂ）当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該制御細胞抽出物と接触したときに取得された当該少なくとも１０個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ａ．当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｂ．当該少なくとも１０個のタンパク質の少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
【0063】
より有利には、本発明は、上記で定義された方法に関する。当該方法は、試験される細胞抽出物（例えば、当該薬物で処理された細胞の）を、４６個のタンパク質のセットの各タンパク質と接触させるステップを含む。
【0064】
言い換えれば、本発明は、有利には、上記の方法に関する。当該方法は、
ａ）試験される（例えば、当該薬物で処理される）細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質の各タンパク質セットと接触させるステップであって、
当該４６個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該４６個のタンパク質は、当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該４６個は、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなる、ステップと、
ｂ）当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該対照細胞抽出物と接触したときに取得された当該４６個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ａ．当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｂ．当該４６個のタンパク質のうちの少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
ａ）試験される（例えば、当該薬物で処理される）細胞の細胞抽出物を、４６個のタンパク質の各タンパク質セットと接触させるステップであって、
当該４６個のタンパク質は、担体に固定化されており、
当該４６個のタンパク質は、当該細胞抽出物と接触する前に、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質と実質的にコンジュゲートしておらず、
当該４６個は、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなる、ステップと、
ｂ）当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化レベルを同時に測定して、ユビキチン、ＳＵＭＯおよびＮｅｄｄ８の第１の値を取得するステップと、
ｃ）前のステップで得られた第１の値を、当該少なくともタンパク質が、（例えば、当該薬物で処理されていない細胞の）当該対照細胞抽出物と接触したときに取得された当該４６個のタンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の第２の値と比較して、第１の値と第２の値との比率を取得するステップと、
ｄ）
ａ．当該４６個のタンパク質のそれぞれのユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１と著しく異ならない場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を及ぼさないこと、および
ｂ．当該４６個のタンパク質のうちの少なくとも１個のユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＮＥＤＤ化の比率が、１よりも著しく低いまたは高い場合、当該試験された条件（例えば、薬物処理）は、ＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質によるタンパク質修飾に影響を与えること、を決定するステップと、を含む。
【0065】
より有利には、本発明は、上記で定義された方法に関し、当該少なくとも３個のタンパク質がビーズによって担持され、当該ビーズが有利には蛍光ビーズである。
【0066】
有利には、本発明は、上記で定義された方法に関する。当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれは、他のビーズの蛍光特性とは異なる蛍光特性を有する決定されたビーズによって担持されており、
すべてのビーズは、同じタンパク質を担持する同じ蛍光特性を有する。
すべてのビーズは、同じタンパク質を担持する同じ蛍光特性を有する。
【0067】
本発明はまた、組成物であって、１０個のタンパク質のグループから選択される少なくとも３個のタンパク質を含み、当該１０個のタンパク質のグループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、配列番号１～３の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、蛍光ビーズ上に担持され、
当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれは、決定された蛍光特性を有するビーズによって担持されて、少なくとも３個の別個のタンパク質担持ビーズを取得し、
当該少なくとも３個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズは、少なくとも２個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる決定された蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズは、同じタンパク質を担持する、組成物に関する。
当該少なくとも３個のタンパク質は、配列番号１～３の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該１０個のタンパク質は、配列番号１～１０の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、当該４６個のタンパク質のグループは、配列番号１～４６の配列から本質的になるか、またはそれらからなるタンパク質に対応し、
当該少なくとも３個のタンパク質は、蛍光ビーズ上に担持され、
当該少なくとも３個のタンパク質のそれぞれは、決定された蛍光特性を有するビーズによって担持されて、少なくとも３個の別個のタンパク質担持ビーズを取得し、
当該少なくとも３個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズは、少なくとも２個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる決定された蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズは、同じタンパク質を担持する、組成物に関する。
【0068】
したがって、上記の組成物は、少なくとも上記のタンパク質配列番号１～３、または上記のセットの４６個のタンパク質までのタンパク質を担持するビーズを含み、当該タンパク質のユビキチン化、ＳＵＭＯ化またはＮＥＤＤ化を評価するために使用することができる。
【0069】
有利には、本発明は、上記の組成物であって、１０個のタンパク質の少なくとも１０個のタンパク質グループを含み、当該グループは、４６個のタンパク質のセットに属し、
当該少なくとも１０個のタンパク質は、蛍光ビーズ上に担持され、
当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれは、決定された蛍光特性を有するビーズによって担持されて、少なくとも１０個の別個のタンパク質担持ビーズを取得し、
当該少なくとも１０個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズは、少なくとも９個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる決定された蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズは、同じタンパク質を担持する、組成物に関する。
当該少なくとも１０個のタンパク質は、蛍光ビーズ上に担持され、
当該少なくとも１０個のタンパク質のそれぞれは、決定された蛍光特性を有するビーズによって担持されて、少なくとも１０個の別個のタンパク質担持ビーズを取得し、
当該少なくとも１０個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズは、少なくとも９個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる決定された蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズは、同じタンパク質を担持する、組成物に関する。
【0070】
言い換えれば、本発明は、上記の組成物に有利に関連し、配列番号１～１０に記載の少なくとも１０個のタンパク質を、上記のセットの４６個のタンパク質まで担持するビーズを含む。
【0071】
ＲＥＶ１４
有利には、本発明は、上記の組成物であって、４６個のタンパク質を含み、
当該４６個のタンパク質は、蛍光ビーズ上に担持され、
当該４６個のタンパク質のそれぞれは、決定された蛍光特性を有するビーズによって担持されて、４６個の別個のタンパク質担持ビーズを取得し、
当該４６個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズは、少なくとも４５個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる決定された蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズは、同じタンパク質を担持する、組成物に関する。
有利には、本発明は、上記の組成物であって、４６個のタンパク質を含み、
当該４６個のタンパク質は、蛍光ビーズ上に担持され、
当該４６個のタンパク質のそれぞれは、決定された蛍光特性を有するビーズによって担持されて、４６個の別個のタンパク質担持ビーズを取得し、
当該４６個のタンパク質のうちの１個を担持するビーズは、少なくとも４５個の他のタンパク質担持ビーズの蛍光特性とは異なる決定された蛍光特性を有し、
同じ蛍光特性を有するすべての蛍光ビーズは、同じタンパク質を担持する、組成物に関する。
【0072】
他の１つの態様では、本発明は、ＵＢＬ経路活性を定量化するため、または生物学的サンプルの細胞におけるＳＵＭＯ／ユビキチン／Ｎｅｄｄ８タンパク質による修飾に対する薬物の効果をインビトロで同定するための、上記で定義された組成物の使用に関する。
【0073】
本発明による組成物は、例えば、上記で定義された方法を実行するために使用することができる。
【0074】
本発明は、以下の図および例を考慮して、よりよく説明および図示されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0075】
【図1】ＵＢＣ９ ｓｈＲＮＡで処理した細胞（Ｂ、ＣおよびＤ）と対照ｓｈＲＮＡで処理した細胞（Ａ）におけるＳＵＭＯ化活性の修飾を示すグラフを表す。Ｙ軸は、対照量に対するＵＢＣ９ ｍＲＮＡの量を表す。Ｎ．Ｓ．：有意でない。＊＊：ｐ＜０．０１
【図2】ＵＢＣ９ ｓｈＲＮＡ（Ｂ、Ｃ、Ｄ）で処理した細胞と対照ｓｈＲＮＡ（Ａ）で処理した細胞におけるＺＭＹＭ５タンパク質のＳＵＭＯ化活性を示すグラフを表す。細胞抽出物もＮＥＭ（Ｎ－エチルマレイミド）で処理して、すべてのＳＵＭＯコンジュゲーションを阻害した（陰性対照）（Ｎ）。Ｙ軸は、ＺＭＹＭ５上のＳＵＭＯの量を表す。Ｎ．Ｓ．：有意でない。＊：ｐ＜０．０５ ＊＊：ｐ＜０．０１
【図3】ＵＢＣ９ ｓｈＲＮＡで処理した細胞（Ｂ、ＣおよびＤ）と対照ｓｈＲＮＡで処理した細胞（Ａ）におけるＢＩＲＣ７タンパク質のユビキチン化活性を示すグラフを表す。細胞抽出物もＮＥＭ（Ｎ－エチルマレイミド）で処理して、すべてのＳＵＭＯコンジュゲーションを阻害した（陰性対照）（Ｎ）。Ｙ軸はＢＩＲＣ７上のユビキチンの量を表す。Ｎ．Ｓ．：有意でない。＊：ｐ＜０．０５ ＊＊：ｐ＜０．０１
【図4】ＵＢＣ９ ｓｈＲＮＡで処理した細胞抽出物（Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、Ｄ’）と対照細胞抽出物（Ａ、Ａ’）のウエスタンブロットの結果を表す。ブロットは、抗ＳＵＭＯ１（Ａ）および抗ＳＵＭＯ２（Ｂ）抗体で標識された。
【図5】アナカルド酸で処理した細胞（Ｃ）または２Ｄ０８で処理した細胞（Ｄ）のＨＬ６０細胞抽出物対ジメチルスルホキシドで処理した細胞（ＤＭＳＯ－Ｂ）またはＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）処理細胞（陰性対照）（Ａ）の細胞の抽出物における、ＺＭＹＭ５タンパク質のＳＵＭＯ化活性調節を示すグラフを表す。Ｙ軸は、ＺＭＹＭ５のＳＵＭＯの量を表す。Ｎ．Ｓ．：有意でない。＊：ｐ＜０．０５
【図6】抗ＳＵＭＯ１抗体で標識された、ＤＭＳＯ（Ａ）、アナカルド酸（Ｂ）阻害剤、または２Ｄ０８（Ｃ）阻害剤で処理した細胞に対応する細胞抽出物の免疫ブロットを表す。１．はＳＵＭＯ化タンパク質を表し、２．は、遊離ＳＵＭＯを表す。
【図7】ＭＬＮ４９２４阻害剤で処理したＨＬ６０の細胞抽出物（Ｃ）とＤＭＳＯで処理した細胞の細胞抽出物（Ｂ）またはＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）処理細胞の細胞抽出物（Ａ）のＮＥＤＤ化活性調節を示すグラフを表す。
【図8】ＴＭＥＭ９２（１）、ＢＥＡＮ１（２）、ＷＢＰ２（３）タンパク質でコーティングされたビーズへのユビキチン添加、ＺＭＹＭ５（４）でコーティングされたビーズへのＳＵＭＯ１添加、またはＯＴＵＤ６Ｂ（５）でコーティングされたビーズへのＮＥＤＤ８添加を評価するグラフを表す。ＨＬ６０細胞を、０（Ｂ）、５（Ｃ）、１０（Ｄ）、５０（Ｅ）、１００（Ｆ）、および５００ｎＭ（Ｇ）のＭＬＮ７２４３で、６時間処理した。対照として、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）で処理した細胞抽出物を使用する（Ａ）。
【図9】蛍光ビーズにコーティングされて、ＳＵＭＯ１（Ａ）、ＳＵＭＯ２（Ｂ）、ユビキチン（Ｃ）、ＮＥＤＤ８（Ｄ）とインキュベートし、細胞抽出物と接触させた１０個のタンパク質の蛍光レベルを示すグラフを表す。１．は、ＺＭＹＭ５タンパク質（配列番号１）を表す。２．は、ＢＥＡＮタンパク質（配列番号２）を表す。３．は、ＯＴＵＤ６Ｂタンパク質（配列番号３）を表す。Ｙ軸は、細胞数を表し、Ｘ軸は、蛍光強度（任意単位）を表す。Ｔは、対照ビーズ（細胞抽出物で処理なし）を表す。
【実施例】
【0076】
タンパク質は、以下のプロトコルに従って、ビーズにコーティング／グラフトされる。
【0077】
１．製造元の指示に従って、ストックのカップリングしていないビーズの懸濁液を再懸濁する。
【0078】
２．５．０ｘ１０６個のストックビーズを、推奨されるマイクロ遠心チューブに移す。
【0079】
３．チューブを磁気分離器に入れ、３０～６０秒間分離させる。
【0080】
４．チューブを磁気分離器に置いたまま、上澄みを除去する。ビーズを乱さないように注意する。
【0081】
５．磁気分離器からチューブを取り外し、約２０秒間ボルテックスおよび超音波処理することにより、ビーズを１００μＬのｄＨ２Ｏに再懸濁する。
【0082】
６．チューブを磁気分離器に入れ、３０～６０秒間分離させる。
【0083】
７．チューブを磁気分離器に置いたまま、上澄みを除去する。ビーズを乱さないように注意する。
【0084】
８．磁気分離器からチューブを取り外し、洗浄したビーズを８０μＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム（一塩基性）、ｐＨ６．２でボルテックスし、約２０秒間超音波処理して再懸濁する。注：ビーズは、この手順全体を通して、長時間光にさらされないように保護する必要がある。
【0085】
９．１０μＬの５０ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ（ｄＨ２０で希釈）をビーズに加え、ボルテックスで穏やかに混合する。
【0086】
１０．１０μＬの５０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（ｄＨ２０で希釈）をビーズに加え、ボルテックスで穏やかに混合する。
【0087】
１１．１０分間隔でボルテックスにより穏やかに混合しながら、室温で２０分間インキュベートする。
【0088】
１２．チューブを磁気分離器に入れ、３０～６０秒間分離させる。
【0089】
１３．チューブを磁気分離器に置いたまま、上澄みを除去する。ビーズを乱さないように注意する。
【0090】
１４．磁気分離器からチューブを取り外し、約２０秒間ボルテックスおよび超音波処理することにより、ビーズを２５０μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０に再懸濁する。
【0091】
１５．ステップ１２および１３を繰り返し、５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０で合計２回洗浄する。
【0092】
１６．磁気分離器からチューブを取り外し、約２０秒間ボルテックスおよび超音波処理することにより、活性化および洗浄したビーズを１００μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ ５．０に再懸濁する。
【0093】
１７．再懸濁したビーズ（すなわち、５μｇ／１００万ビーズ）に、２５μｇのタンパク質を添加する。（注：１００万ビーズ当たり５μｇのタンパク質が、通常は良好に機能する。最適なアッセイ性能を達成するために、必要に応じて、上および／または下に用量を設定することを推奨する。）
【0094】
１８．５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ５．０で総量を５００μＬにする。
【0095】
１９．ボルテックスによりカップリング反応物を混合する。
【0096】
２０．室温で混合（回転による）しながら２時間インキュベートする。
【0097】
２１．チューブを磁気分離器に入れ、３０～６０秒間分離させる。
【0098】
２２．チューブを磁気分離器に置いたまま、上澄みを除去する。ビーズを乱さないように注意する。
【0099】
２３．磁気分離器からチューブを取り外し、約２０秒間ボルテックスおよび超音波処理により、カップリングしたビーズを５００μＬのＰＢＳ－ＴＢＮに再懸濁する。
【0100】
２４．任意のブロッキングステップ－室温で混合（回転による）しながら３０分間インキュベートする。（注：同じ日にビーズを使用する場合は、このステップを実行すること。）
【0101】
２５．チューブを磁気分離器に入れ、３０～６０秒間分離させる。
【0102】
２６．チューブを磁気分離器に置いたまま、上澄みを除去する。ビーズを乱さないように注意する。
【0103】
２７．磁気分離器からチューブを取り外し、約２０秒間ボルテックスおよび超音波処理することにより、ビーズを１ｍＬのＰＢＳ－ＴＢＮに再懸濁する。
【0104】
２８．ステップ２５および２６を繰り返する。これは、１ｍＬのＰＢＳ－ＴＢＮで合計２回洗浄する。
【0105】
２９．磁気分離器からチューブを取り外し、カップリングさせて洗浄したビーズを２５０～１０００μＬのＰＢＳ－ＴＢＮに再懸濁する。
【0106】
３０．セルカウンターまたは血球計算盤を使用して、カップリング反応後に回収されたビーズの数を数える。
【0107】
３１．２～８℃で冷蔵されたカップリングしたビーズを暗所で保存する
【0108】
実施例１：ユビキチン様システムの活性の測定
本発明者らは、ＭａｇＰｌｅｘ Ｘｍａｐビーズを使用して方法を最適化し、細胞抽出物中のユビキチン化、ＳＵＭＯ化、およびＮＥＤＤ化活性の定量的測定を可能にした。
本発明者らは、ＭａｇＰｌｅｘ Ｘｍａｐビーズを使用して方法を最適化し、細胞抽出物中のユビキチン化、ＳＵＭＯ化、およびＮＥＤＤ化活性の定量的測定を可能にした。
【0109】
したがって、本発明者らは、ユビキチン様システムの酵素を標的とする化合物の阻害活性を評価するために、この方法を使用することを意図していた。
【0110】
この方法を実行するために、本発明者らは、蛍光ビーズにグラフトされた、ユビキチン／ＳＵＭＯ／ＮＥＤＤ８によって高度に修飾された１０個のタンパク質を使用した。選択された１０個のタンパク質は、ユビキチン、ＳＵＭＯ１および２、ＮＥＤＤ８の４つの異なる経路を表す。選択されたタンパク質のいくつかは、異なる酵素によって同時に修飾され得る。
【表2】
【0111】
この表は、ＵｂＬシステムの阻害活性の測定のために選択されたタンパク質を表す。
【0112】
最初のステップは、発明者の方法に従って、タンパク質を修飾できるかどうかを確認することであった。次に、タンパク質を細菌内で産生し、次に、異なる蛍光特性を有するビーズとカップリングさせ、薬物への感応性があるＨＬ６０細胞抽出物を使用した。
【0113】
ＺＭＹＭ５は、ＳＵＭＯ化のマーカーとして、ＯＴＵＤ６Ｂは、ＮＥＤＤ化のマーカーとして、ＴＭＥＭ９２、ＢＥＡＮ、ＷＢＰ２は、ユビキチン化のマーカーとして、使用された。
【0114】
実施例２：ＳＵＭＯ経路の阻害
本発明者らは、ＳＵＭＯ化阻害を評価することによって彼らの方法を検証したかった。
本発明者らは、ＳＵＭＯ化阻害を評価することによって彼らの方法を検証したかった。
【0115】
最初のアプローチでは、本発明者らは、ＳＵＭＯのＥ２酵素であるＵＢＣ９の発現を阻害するｓｈＲＮＡを発現するＨＬ６０細胞株を使用した。３つの異なる細胞株を、異なるｓｈＲＮＡとともに使用し、対照細胞株を対照として使用した。ＵＢＣ９発現阻害は、ＵＢＣ９ ＲＮＡの相対量を定量化することにより、ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価された。
【0116】
ｓｈＲＮＡ１は、限定的な減少（有意でない）を誘発し、ｓｈＲＮＡ２は、約２０％の減少を誘発し、ｓｈＲＮＡ３は、Ｕｂｃ９発現の５０％の減少を誘発する。
【0117】
したがって、本発明者らは、それらの方法を、上記のｓｈＲＮＡで処理された細胞抽出物に適用する。同じ反応において、本発明者らは、ユビキチン化を測定し、ＳＵＭＯ１およびＳＵＭＯ２によるウエスタンブロットＳＵＭＯ化によって測定した。（図１～図４）
【0118】
驚くべきことに、ウエスタンブロットによって測定されたＳＵＭＯ化レベルは、Ｕｂｃ９ ＲＮＡが５０％減少した細胞を含め、著しく修飾されてはいない。
【0119】
これは、イムノブロットで検出されたタンパク質が、ＳＵＭＯ化によって著しく修飾されたタンパク質であり、Ｕｂｃ９の量の減少に対する感受性が低いタンパク質に対応している、という事実によって説明できる。
【0120】
しかしながら、本発明による方法は、実験でテキスト化された細胞における包括的なＳＵＭＯ化の検出を可能にする。実際、本発明による方法によって測定されたＳＵＭＯ化活性は、ｑＰＣＲによって評価されたＵＢＣ９発現と直接相関する。
【0121】
２回目に、本発明者らは、本発明の方法が、ＵｂＬ経路の阻害剤の効果を測定するために使用され得るかどうかを評価した。この目的のために、本発明者らは、２つの既知のＳＵＭＯ化阻害剤、すなわち、ＳＵＭＯのＥ１酵素を阻害するアナカルド酸、およびＳＵＭＯのＥ２酵素を阻害する２Ｄ０８を使用することによって方法を評価した。
【0122】
ＨＬ６０細胞を、５０μＭのこれらの化合物で６時間処理した後、細胞抽出物を調製し、本発明による方法を実行するために使用した。
【0123】
次に細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で溶解し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離のために、サンプルをアクリルアミド－ビスアクリルアミドゲルにロードした。次にタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、抗ＳＵＭＯ１抗体で標識した。
【0124】
結果を図５および６に示す。
【0125】
本発明による方法を使用することにより、細胞抽出物において５０％のＳＵＭＯ化の減少を検出することが可能であるが、イムノブロットはそのような減少を示さない。これは、ウエスタンブロットでは、ＳＵＭＯによって修飾されやすいすべてのタンパク質、特に大幅に修飾されたタンパク質が検出される、という事実によって説明できる。
【0126】
薬物で処理されたサンプルでは、ＳＵＭＯ化の減少の特徴である遊離ＳＵＭＯ１を検出することが可能である。したがって、本発明による方法は、ウエスタンブロットベースの方法よりも効率的である。
【0127】
実施例３：医薬阻害剤を使用したユビキチン様経路の阻害
この実施例では、発明者らは、ユビキチンおよびＮｅｄｄ８経路、すなわちＭＬＮ７２４３（ユビキチン）およびＭＬＮ４９２４（ＮＥＤＤ８）で、治療的に有効であることが証明されている市販の阻害剤で処置された患者からのサンプルで方法を検証することを意図した。
この実施例では、発明者らは、ユビキチンおよびＮｅｄｄ８経路、すなわちＭＬＮ７２４３（ユビキチン）およびＭＬＮ４９２４（ＮＥＤＤ８）で、治療的に有効であることが証明されている市販の阻害剤で処置された患者からのサンプルで方法を検証することを意図した。
【0128】
ＭＬＮ７２４３（ＴＡＫ－２４３）は、ユビキチン活性化酵素（ＵＡＥ、Ｅ１酵素としても知られている）を標的とする細胞透過性小分子阻害剤である。正常で健康な細胞よりもがん細胞でより活性が高いことがわかっている酵素は、ユビキチン化反応の最初のステップを触媒し、プロテアソームを介した分解のためにタンパク質を標的にする。標的タンパク質へのユビキチンまたはユビキチン様タンパク質のこの共有結合は、真核生物のタンパク質機能を調節するための主要なメカニズムである。酵素の阻害は、タンパク質のユビキチン化およびそれに続くユビキチンを介したプロテアソーム分解の両方を防ぎ、細胞内のタンパク質の過剰をもたらし、小胞体（ＥＲ）ストレスを介したアポトーシスを引き起こす場合があり、その結果、腫瘍（がん）細胞の増殖および生存を阻害する。ＭＬＮ７２４３は、臨床的に研究されているこのクラスの酵素を特異的に標的とするファースト・イン・クラスの阻害剤である。
【0129】
ＭＬＮ７２４３は、以下の式を有する。
【化1】
【0130】
ＭＬＮ４９２４（ペボネジスタットとも呼ばれる）は、タンパク質恒常性経路の重要な構成要素であるＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）の小分子阻害剤である。これは、このクラスの酵素を特異的に標的とする最初の小分子阻害剤であり、臨床的に研究されており、現在、第Ｉ相臨床試験で検討されている。
【0131】
ＭＬＮ４９２４は、以下の式を有する。
【化2】
【0132】
ＨＬ６０細胞は、最初に１μＭのＭＬＮ４９２４、ＤＭＳＯ、または培地のみで６時間処理された。ＵＢＣ１２を担持するビーズ（ＮＥＤＤ８によって修飾されることが以前に報告されたＮＥＤＤ化 Ｅ２酵素）を当該細胞抽出物と接触させ、ＮＥＤＤ８レベルを評価した。
【0133】
結果を図７に示す。
【0134】
対照サンプルで測定されたＮＥＤＤ化は低かったのに対し、１μＭのＭＬＮ４９２４で処理すると、ＵＢＣ１２タンパク質のＮＥＤＤ化の減少を示す。
【0135】
次に、本発明者らは、ユビキチン経路のＥ１酵素であるＭＬＮ７２４３の異なる量の効果を評価した。
【0136】
次に、細胞を０、５、１０、５０、１００、または５００ｎＭのＭＬＮ７２４３で６時間処理した。細胞抽出物を調製し、ＴＭＥＭ９２、ＢＥＡＮ１、またはＷＢＰ２タンパク質のいずれかでコーティングされたビーズと接触させた。
【0137】
結果を図８に示す。
【0138】
これらの結果は、ユビキチン化活性の５０％以上が、１０ｎＭ以上のＭＬＮ７２４３で阻害されることを示す（インビトロＩＣ５０：１ｎＭ、急性骨髄性白血病細胞株ＩＣ５０に対するインビトロ毒性：２０～４０ｎＭ）
【0139】
５００ｎＭ ＭＬＮ７２４３では、ＴＭＥＭ９２ ＮＥＤＤ化阻害が最大であり、ＷＢＰ２およびＢＥＡＮ１では、残留レベルでユビキチン化されたままである。
【0140】
ＭＬＮ７２４３阻害剤はまた、ＳＵＭＯ化の活性に影響を与えるが、阻害剤を大量にした８５０ｎＭのインビトロＩＣ５０と一致している。
【0141】
ＮＥＤＤ化に関して、ＭＬＮ７２４３ インビトロＩＣ５０は、ＯＴＵＤ６Ｂタンパク質で２８ｎＭだが、データはわずかに異なる減少を示す。
【0142】
材料および方法
細胞培養
ＨＬ－６０（ＤＳＭＺ、ドイツ）は、５％ＣＯ２の存在下で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびストレプトマイシン／ペニシリンを添加したＲＰＭＩ培地で３７℃で培養した。ＨＬ－６０は、Ｓｈｏｒｔ－Ｔａｎｄｅｍ－Ｒｅｐｅａｔ分析を使用してＡＴＣＣによって認証された。すべての細胞は、マイコプラズマ陰性であると定期的に試験された。解凍後、細胞を、３．１０５／ｍｌの密度で２～３日ごとに１０継代未満で継代した。
細胞培養
ＨＬ－６０（ＤＳＭＺ、ドイツ）は、５％ＣＯ２の存在下で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびストレプトマイシン／ペニシリンを添加したＲＰＭＩ培地で３７℃で培養した。ＨＬ－６０は、Ｓｈｏｒｔ－Ｔａｎｄｅｍ－Ｒｅｐｅａｔ分析を使用してＡＴＣＣによって認証された。すべての細胞は、マイコプラズマ陰性であると定期的に試験された。解凍後、細胞を、３．１０５／ｍｌの密度で２～３日ごとに１０継代未満で継代した。
【0143】
細胞抽出物
５～８．１０５／ｍＬ密度で増殖した細胞を、４℃で５分間スピンダウン（３００ｇ）して、ＰＢＳで１回洗浄した。１ｍＬのＰＢＳにペレット再懸濁後、４℃で５分間再度遠心分離（１６，０００ｇ）した。ペレットを再懸濁して、２．１０６細胞当たり２５μＬの容量の低張緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍｇ／Ｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン）中で４℃で３０分間インキュベートした。細胞溶解は、液体窒素を使用した４回の凍結／解凍サイクルによって達成され、ＤＮＡは、２０－１／２Ｇ針を１０回通過したために剪断された。最後に抽出物を４℃で２０分間２回（１６０００ｇ）遠心分離し、上清を分注して急速冷凍し、使用するまで－８０℃で保存した。
５～８．１０５／ｍＬ密度で増殖した細胞を、４℃で５分間スピンダウン（３００ｇ）して、ＰＢＳで１回洗浄した。１ｍＬのＰＢＳにペレット再懸濁後、４℃で５分間再度遠心分離（１６，０００ｇ）した。ペレットを再懸濁して、２．１０６細胞当たり２５μＬの容量の低張緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍｇ／Ｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン）中で４℃で３０分間インキュベートした。細胞溶解は、液体窒素を使用した４回の凍結／解凍サイクルによって達成され、ＤＮＡは、２０－１／２Ｇ針を１０回通過したために剪断された。最後に抽出物を４℃で２０分間２回（１６０００ｇ）遠心分離し、上清を分注して急速冷凍し、使用するまで－８０℃で保存した。
【0144】
組換えタンパク質の産生
目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦライブラリー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）から回収し、メーカーのプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジーを使用して、細菌発現ベクターｐＧＧＷＡベクターにクローニングした。次に、構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株で形質転換した。タンパク質産生は、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して、２５℃で指数関数的に増殖する細菌で６時間誘導された。
目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦライブラリー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）から回収し、メーカーのプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って、Ｇａｔｅｗａｙテクノロジーを使用して、細菌発現ベクターｐＧＧＷＡベクターにクローニングした。次に、構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株で形質転換した。タンパク質産生は、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して、２５℃で指数関数的に増殖する細菌で６時間誘導された。
【0145】
細菌ペレットを、５００ｍＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ８．６に再懸濁して、液体Ｎ２中で急速冷凍した。解凍後、細菌懸濁液に１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、８ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１ｍｇ／Ｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンを添加し、４℃で１時間インキュベートした。細菌の破片をスピンダウンした（１０００００ｇで１時間）。次に、抽出物を、トリス５０ｍＭ ｐＨ８．６、ＮａＣｌ ５００ｍＭ、ＭｇＳＯ４ ５０ｍＭ、８ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１ｍｇ／Ｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンで平衡化したグルタチオンアガロースビーズ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）に結合させた。次に、カラムを、トリス５０ｍＭ ｐＨ８．６、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＭｇＳＯ４ ５０ｍＭ、８ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１ｍｇ／Ｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンで徹底的に洗浄し、２０ｍＭの還元グルタチオン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して溶出した。
【0146】
ＸＭａｐへのタンパク質カップリング
２．Ｌｕｍｉｎｅｘ製の１０５の磁性ＭａｇＰｌｅｘ ＸＭａｐビーズ（低濃度）を低結合マイクロチューブ（エッペンドルフ）に移し、５００ｍＭ ＮａＣｌを使用して洗浄した。次に、それらを５０μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．１に再懸濁し、５ｍｇ／ｍＬの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Ｐｉｅｒｃｅ）および５ｍｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で、室温で２０分間インキュベートした。次に、ビーズを５００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＰＢＳ中の７μｇのカップリングされる組換えタンパク質とともに、室温で２時間インキュベートした。次に、０．１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０、０．０５％のアジ化ナトリウムおよび５００ｍＭ ＮａＣｌを含むＰＢＳで２回洗浄し、０．１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで４℃で保存した。
２．Ｌｕｍｉｎｅｘ製の１０５の磁性ＭａｇＰｌｅｘ ＸＭａｐビーズ（低濃度）を低結合マイクロチューブ（エッペンドルフ）に移し、５００ｍＭ ＮａＣｌを使用して洗浄した。次に、それらを５０μＬの５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．１に再懸濁し、５ｍｇ／ｍＬの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Ｐｉｅｒｃｅ）および５ｍｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で、室温で２０分間インキュベートした。次に、ビーズを５００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＰＢＳ中の７μｇのカップリングされる組換えタンパク質とともに、室温で２時間インキュベートした。次に、０．１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０、０．０５％のアジ化ナトリウムおよび５００ｍＭ ＮａＣｌを含むＰＢＳで２回洗浄し、０．１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０５％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで４℃で保存した。
【0147】
ＸＭａｐビーズとカップリングしたタンパク質へのＵｂＬコンジュゲーション
ＳＵＭＯ－１－、ＳＵＭＯ－２－、ＮＥＤＤ８、およびユビキチンビニルスルホン（各０．５μＭ）を細胞抽出物（１０μＬ）に添加し、４℃で１５分間インキュベートした。対照抽出物も、５０ｍＭ ＮＥＭとともにインキュベートした。本発明者らはその後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１１０ｍＭ ＫＯＡｃ、２ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２ｍｇ／ｍＬのオバルブミン、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／Ｌのアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチン、１ｍＭ ＡＴＰ、３０μＭ Ｆｌａｇ－ユビキチン、１５μＭ ＮＥＤＤ８、１５μＭ ＳＵＭＯ－１および１５μＭ ＳＵＭＯ－２を含有する反応緩衝液の１０μＬ中に含まれる１０３個のタンパク質とカップリングしたＸＭＡＰビーズを抽出物に添加した。反応は、３０℃で４５分間実施した。ビーズを、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０および０．５％のＳＤＳを含有するＰＢＳで５分間２回洗浄し、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで５分間３回洗浄した。次に、それらを１μｇ／ｍＬの抗ＳＵＭＯ－１（２１Ｃ７）および抗Ｆｌａｇ抗体または抗ＳＵＭＯ－２（８Ａ２）および抗ＮＥＤＤ８とともに、室温で撹拌下１時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳで５分間洗浄した後、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む１００μＬのＰＢＳで、抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体および抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５抗体とともに、室温で３０分間インキュベートした。ビーズを、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳで５分間再度洗浄した。次に、それらを２００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａデバイスを使用して、フローサイトメトリー分析を行った。ＦｌｏｗＪｏｗソフトウェアを使用して、結果を分析した。
ＳＵＭＯ－１－、ＳＵＭＯ－２－、ＮＥＤＤ８、およびユビキチンビニルスルホン（各０．５μＭ）を細胞抽出物（１０μＬ）に添加し、４℃で１５分間インキュベートした。対照抽出物も、５０ｍＭ ＮＥＭとともにインキュベートした。本発明者らはその後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１１０ｍＭ ＫＯＡｃ、２ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２ｍｇ／ｍＬのオバルブミン、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／Ｌのアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチン、１ｍＭ ＡＴＰ、３０μＭ Ｆｌａｇ－ユビキチン、１５μＭ ＮＥＤＤ８、１５μＭ ＳＵＭＯ－１および１５μＭ ＳＵＭＯ－２を含有する反応緩衝液の１０μＬ中に含まれる１０３個のタンパク質とカップリングしたＸＭＡＰビーズを抽出物に添加した。反応は、３０℃で４５分間実施した。ビーズを、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０および０．５％のＳＤＳを含有するＰＢＳで５分間２回洗浄し、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳで５分間３回洗浄した。次に、それらを１μｇ／ｍＬの抗ＳＵＭＯ－１（２１Ｃ７）および抗Ｆｌａｇ抗体または抗ＳＵＭＯ－２（８Ａ２）および抗ＮＥＤＤ８とともに、室温で撹拌下１時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳで５分間洗浄した後、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含む１００μＬのＰＢＳで、抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体および抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５抗体とともに、室温で３０分間インキュベートした。ビーズを、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳで５分間再度洗浄した。次に、それらを２００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａデバイスを使用して、フローサイトメトリー分析を行った。ＦｌｏｗＪｏｗソフトウェアを使用して、結果を分析した。
【0148】
目的のタンパク質の選択
ＨＬ－６０またはＵ９３７からの抽出物に、ＵｂＬ－ビニルスルホンおよび組換えＵｂＬを添加し、Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でインキュベートした。徹底的に洗浄した後、アレイを一次マウス抗ＳＵＭＯ－１およびウサギ抗Ｆｌａｇ（反応に添加された組換えユビキチンに存在するタグ）抗体、続いて蛍光カップリングした二次抗体とともにインキュベートし、蛍光をスキャンした。次に抗体を除去し、アレイを一次マウス抗ＳＵＭＯ－２およびウサギ抗ＮＥＤＤ８抗体、続いて蛍光カップリングした二次抗体とインキュベートし、蛍光をスキャンした。すべてのアレイのすべての修飾因子について得られた正規化された蛍光データを、対照アレイ（ＮＥＭ）の平均シグナルと比較して、頑強に修飾されたタンパク質を同定した。ＷｅｌｃｈとＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの両方を使用し、プロトアレイで平均蛍光強度値が８００を超える、２つのグループ間に有意差を示す４６個のタンパク質を選択した。
ＨＬ－６０またはＵ９３７からの抽出物に、ＵｂＬ－ビニルスルホンおよび組換えＵｂＬを添加し、Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でインキュベートした。徹底的に洗浄した後、アレイを一次マウス抗ＳＵＭＯ－１およびウサギ抗Ｆｌａｇ（反応に添加された組換えユビキチンに存在するタグ）抗体、続いて蛍光カップリングした二次抗体とともにインキュベートし、蛍光をスキャンした。次に抗体を除去し、アレイを一次マウス抗ＳＵＭＯ－２およびウサギ抗ＮＥＤＤ８抗体、続いて蛍光カップリングした二次抗体とインキュベートし、蛍光をスキャンした。すべてのアレイのすべての修飾因子について得られた正規化された蛍光データを、対照アレイ（ＮＥＭ）の平均シグナルと比較して、頑強に修飾されたタンパク質を同定した。ＷｅｌｃｈとＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙの両方を使用し、プロトアレイで平均蛍光強度値が８００を超える、２つのグループ間に有意差を示す４６個のタンパク質を選択した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【配列表】