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特許7271794サイトメガロウイルスのｇＢとペンタマーとの融合タンパク質及び該融合タンパク質を含むワクチン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-04-28
(45)【発行日】2023-05-11
(54)【発明の名称】サイトメガロウイルスのｇＢとペンタマーとの融合タンパク質及び該融合タンパク質を含むワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230501BHJP
A61K 39/245 20060101ALI20230501BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20230501BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230501BHJP
C07K 14/045 20060101ALI20230501BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230501BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230501BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230501BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230501BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230501BHJP
C12N 15/38 20060101ALI20230501BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
A61K39/245
A61P31/22
A61P37/04
C07K14/045
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/38
C12N15/63 Z
【請求項の数】
32
(21)【出願番号】P 2022530580
(86)(22)【出願日】2021-06-08
(86)【国際出願番号】 JP2021021752
(87)【国際公開番号】W WO2021251384
(87)【国際公開日】2021-12-16
【審査請求日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】P 2020100100
(32)【優先日】2020-06-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】318010328
【氏名又は名称】ＫＭバイオロジクス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100140888
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 欣乃
(72)【発明者】
【氏名】鳥飼 正治
(72)【発明者】
【氏名】森 泰亮
(72)【発明者】
【氏名】枦山 紘輔
(72)【発明者】
【氏名】松本 みゆき
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１５３９５４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】CHIUPPESI, Flavia et al.，Vaccine-Derived Neutralizing Antibodies to the Human Cytomegalovirus gH/gL Pentamer Potently Block Primary Cytotrophoblast Infection，Journal of Virology，2015年，Vol.89, No.23，P.11884-11898
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）とペンタマーとの融合タンパク質であり、前記ｇＢタンパク質が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３又は配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと９０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインを含み、
前記ペンタマーが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるｇＨと９０％以上の配列同一性を有するｇＨ、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるｇＬと９０％以上の配列同一性を有するｇＬ、配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１２８と９０％以上の配列同一性を有するＵＬ１２８、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３０と９０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３０、及び配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３１と９０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３１を含む、融合タンパク質。
【請求項2】
３つのｇＢタンパク質構成分子からなるｇＢタンパク質のホモ三量体と、５つのペンタマー構成分子からなるペンタマーのヘテロ五量体とが、少なくとも１つのｇＢタンパク質構成分子と少なくとも１つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによって、タンパク質複合体を形成している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
少なくとも２つのｇＢタンパク質構成分子と、少なくとも２つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
３つのｇＢタンパク質構成分子と、５つのペンタマー構成分子のうちのいずれか３つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、請求項２又は３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
３つのｇＢタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるｇＬ、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、請求項２～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
３つのｇＢタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、請求項２～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
遺伝子工学的な融合のうち少なくとも１つの融合が、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、請求項２～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
遺伝子工学的な融合のうち少なくとも２つの融合が、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、請求項３～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
３つの遺伝子工学的な融合がすべて、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、請求項４～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
ｇＢタンパク質構成分子とペンタマー構成分子との間にリンカー及び／又はタグを有する、請求項２～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
リンカーが配列番号２２記載のアミノ酸配列単位を１～３回繰り返したアミノ酸配列からなるリンカーである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
ｇＢタンパク質がＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
ｇＢタンパク質が配列番号１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
ｇＢタンパク質が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと９０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項１２又は１３に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
ｇＢタンパク質がドメインＩＶを欠失したｇＢタンパク質改変体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
ｇＢタンパク質が配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
ｇＢタンパク質が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと９０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項１５又は１６に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
ｇＢタンパク質が、野生型ｇＢタンパク質に比べて、凝集体の形成を低減させ、ホモ三量体構造の割合を増加させる改変が導入されたｇＢタンパク質改変体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項19】
ｇＢタンパク質が配列番号３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
ｇＢタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと９０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項１８又は１９に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
ｇＢタンパク質が、野生型ｇＢタンパク質に比べて、ヘッド領域の免疫原性を低減させる改変が導入されたｇＢタンパク質改変体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
ｇＢタンパク質が配列番号３１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項23】
ｇＢタンパク質が、配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと９０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項２１又は２２に記載の融合タンパク質。
【請求項24】
ペンタマーが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
ｇＨがｇＨタンパク質のエクトドメインである、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項26】
ペンタマーが、配列番号４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３１
を含むヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のペンタマータンパク質である、請求項２４又は２５に記載の融合タンパク質。
【請求項27】
ペンタマーが、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるｇＨと９０％以上の配列同一性を有するｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるｇＬと９０％以上の配列同一性を有するｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１２８と９０％以上の配列同一性を有するＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３０と９０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３１と９０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３１
からなるＨＣＭＶのペンタマータンパク質である、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸断片。
【請求項29】
請求項２８に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
【請求項30】
請求項２８に記載の核酸断片又は請求項２９に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項31】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む、ＣＭＶの感染を予防又は治療するためのワクチン。
【請求項32】
ＣＭＶの感染がＣＭＶの先天性感染である、請求項３１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サイトメガロウイルスのｇＢとペンタマーとの融合タンパク質、及び該融合タンパク質を含む、サイトメガロウイルスの感染を予防又は治療するためのワクチンに関する。
【背景技術】
【0002】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症には、大きく移植、ＡＩＤＳ、先天性免疫不全などの免疫抑制状態の患者において発症するＣＭＶ肺炎、腸炎、網膜炎などの臓器障害と、妊婦が初感染した場合に胎児が発症する先天性ＣＭＶ感染症との２つがある。このうち、先天性ＣＭＶ感染症は、ＴＯＲＣＨ症候群の１つであり、胎児に奇形又は重篤な臨床症状を引き起こす重要な先天性感染症である。妊婦がＣＭＶに初感染した場合、およそ４０％で胎盤を通して胎児の先天性感染が発生する（本明細書においては、「先天性感染」という用語と「経胎盤感染」という用語を同じ意味で用いている）。また、死産の約１５％が先天性ＣＭＶ感染によるという報告もある。先天性感染児の年間発生件数は、日本で３０００人以上、米国で約４万人であり、症候性は日本で約１０００人、米国で約８０００人とも言われ、このうち約９割に中枢神経障害や難聴などの後障害が残る。
【0003】
日本におけるＣＭＶ抗体保有率は欧米諸国に比して高く、日本人成人の８０％～９０％はＣＭＶ抗体陽性であり、ほとんどの人が乳幼児期に感染を受けている。しかし、最近の傾向として、若年者のＣＭＶ抗体保有率は９０％台から６０％台に低下傾向を示しており、先天性ＣＭＶ感染症の予防対策の必要性はさらに高まっている（非特許文献１）。
【0004】
米国医学研究所（ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）は、先天性ＣＭＶ感染症が先進国における先天性の中枢神経障害の原因としてダウン症候群を凌ぐインパクトを持っており、障害が残った先天性感染児の生涯に及ぶＱＯＬの低下と社会経済的損失をＱＡＬＹｓ（ｑｕａｌｉｔｙ－ａｄｊｕｓｔｅｄ ｌｉｆｅ ｙｅａｒｓ）として算出すると、ＣＭＶワクチンは、最も医療経済効果が高いカテゴリーに分類されると分析している（非特許文献２）。
【0005】
感染症を引き起こす病原体は、従来型ワクチンで十分な効果を得ることができるＣｌａｓｓ Ｉ群病原体と、従来型ワクチン又は病原体感染歴では十分な防御免疫を獲得できないＣｌａｓｓ ＩＩ群病原体とに大別されるが、ＣＭＶは後者に分類される。Ｃｌａｓｓ ＩＩ群病原体の克服が難しい理由として、それらが有する巧妙な免疫逃避機構が指摘されている。人類はこれまでにＣｌａｓｓ Ｉ群病原体に対する数多くの有効なワクチンを開発し、それらの引き起こす感染症の脅威に打ち勝ってきた。そして今後のワクチン開発の焦点は、Ｃｌａｓｓ ＩＩ群病原体へと移りつつある。
【0006】
先天性ＣＭＶ感染症の被害を最小限に留めるために、妊婦スクリーニングで未感染妊婦を同定し、生活上の注意を啓発することも行われているが、十分ではない。さらに初感染妊婦を同定して、ＣＭＶ抗体高力価免疫グロブリンを妊婦に投与することで胎児への感染予防や重症化の軽減に有効であったとする報告もあるが、現在のところ有効性に疑問が出てきている（非特許文献３）。一方、低分子薬としてガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）も上市されているが、その効果は限定的であり、副作用の問題もある。現時点においてワクチンは存在せず、また前述の通り十分に有効な治療法も無いことから、そのアンメットニーズは高いと考えられる。
【0007】
ＣＭＶワクチン開発に関しては、これまで複数の製薬企業やアカデミアにおいて弱毒生ワクチンやサブユニットワクチン、ＤＮＡワクチンなどを用いた検討が試みられてきたが、いずれもＴ細胞免疫、Ｂ細胞免疫共に応答が不十分であり、結果としてワクチンとして実用に耐え得る効果は得られていない。
【0008】
その中でＳａｎｏｆｉ社のワクチンは、ＣＭＶ糖タンパク質のｇＢを抗原とした遺伝子組換えサブユニットワクチンであるが、未感染成人女性を対象とした臨床試験において約５０％程度の感染予防効果を示した。効果が限定的だったため、開発は事実上中断しているが、「ｇＢ抗原のみで一定の効果を示しうる（だが十分ではない）」という意義のある知見が得られた（非特許文献４）。
【0009】
ＣＭＶのワクチン候補品の効果の実験的証明については、ＣＭＶの種特異性についての考慮が必要となる。ＣＭＶには種特異性があるため、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を用いた動物実験は基本的に不可能である。動物実験はマウス、ラット、モルモット、サルなどを用いて行われるが、各種動物種に固有のＣＭＶを用いて実施される。経胎盤感染については、モルモットのみが、母体へのウイルス感染を起こさせることで、特殊な処置をせずとも胎仔への感染が確認できる動物モデル系であり、モルモットの経胎盤感染試験系は広く利用されている（非特許文献５）。
【0010】
ｇＢワクチンの経胎盤感染に対する効果に関しては、組換えモルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）のｇＢタンパク質＋アジュバントの雌モルモットへの投与により、雌モルモットの初感染が抑制され、また、胎仔への経胎盤感染も抑制されたことが報告されている（非特許文献６）。
【0011】
非特許文献７では、ＧＰＣＭＶのｇＢタンパク質を組み込んだアデノウイルスベクターワクチンを用いて、モルモットの経胎盤感染モデルにおいて胎仔への経胎盤感染をｇＢが抑制することが示されている。
【0012】
一方、ＣＭＶの主要抗原としてここ数年で大きな注目を集めているのがペンタマー（Ｐｅｎｔａｍｅｒ）抗原である。ペンタマーはＣＭＶの細胞指向性決定因子であり、ヒトＣＭＶではｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１）の５つのサブユニットから構成される分子である（非特許文献１５）。
【0013】
ペンタマーの経胎盤感染における寄与に関しては、ペンタマー遺伝子を欠失したＧＰＣＭＶは上皮・内皮細胞への感染性と経胎盤感染能を失っており、欠失した遺伝子を異所性に発現させることによりそれらが復活することが報告されている（非特許文献８）。
【0014】
また、ペンタマーワクチンの効果に関しては、ペンタマーを発現させたベクターワクチンＭＶＡ－ＰＣをマウスに投与し誘導されたモノクローナル抗体について詳細に解析した結果、抗ｇＨ抗体に比べて抗ペンタマー抗体の上皮及び内皮細胞系での中和能が明らかに高く、経胎盤感染において重要と考えられる栄養膜細胞での中和能についても同様であったことが報告されている（非特許文献９）。
【0015】
その一方で、相反する報告もある。非特許文献１０では、ヒトの胎盤における栄養芽前駆細胞はＣＭＶのターゲットであり、当細胞へのＣＭＶの感染にはペンタマーの寄与はほぼ認められず、ｇＢの寄与は明確に認められたとしている。
【0016】
また、非特許文献１１では、ｅｘ ｖｉｖｏの胎盤感染試験系を用いて、ＧＰＣＭＶの胎盤組織への感染及び増殖にはペンタマーの寄与がほとんど認められないとしている。
【0017】
このように、ペンタマーのワクチン抗原としての有用性を示唆する報告は散見されるものの、経胎盤感染におけるペンタマーの役割が明白ではなく、ペンタマーワクチンの経胎盤感染に対する抑制効果については未だ結論が出ているとは言えない状況にある。
【0018】
ペンタマーとｇＢの併用の効果については、特許文献１において、サルを対象とした感染防御試験において、組換えペンタマーと組換えｇＢの併用が有効であったとする報告がなされているものの、経胎盤感染への影響については何らの示唆も与えていない。また、ペンタマー単独群及び非免疫群と比較して、ペンタマー＋ｇＢの併用群が優れていることは示されているが、ｇＢ単独群が設定されていないため、正確には併用の効果を示していることにならない。
【0019】
また、非特許文献１２では、抗ｇＢモノクローナル抗体と抗ペンタマーモノクローナル抗体との併用効果についてｉｎ ｖｉｔｒｏで検証し、中和能と耐性株出現抑制に関して併用の利点があるとしているが、生体における感染防御能について併用の効果を証明してはいない。
【0020】
さらに、特許文献２では、ｇＢ＋ペンタマーの２価ワクチンで免疫することで、いくつかのサイトカインの産生が単独群より高いというデータがあるが、中和能では併用群は優位ではなく、また、感染実験もされていない。また、特許文献４には、改変ＣＭＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＣＭＶワクチンが開示されている。
【0021】
非特許文献１５ではペンタマーのＸ線結晶構造が明らかにされている。これによれば、ペンタマーはらせん状構造をとる長径約１８ｎｍの分子であり、その末端にｇＨが存在し、ｇＨの一部がｇＬと絡み合う形でｇＨ／ｇＬドメインを形成している。ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１は緩やかに湾曲した形をとりながら、ｇＬのＮ末端と相互作用している。ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１のうち、ＵＬ１３１は３者の中心に存在している。ＵＬ１３０はそのＣ末端側で、ＵＬ１３１のβストランドとともにシート構造を形成しており、その片面をＵＬ１３１のヘリックス構造により覆われている。ＵＬ１２８とＵＬ１３０は、ともにＮ末端側でそれぞれ球状構造を形成しており、これらはコア構造を挟んで正反対に位置している。ＵＬ１２８のＣ末端側は５ｎｍに達する柔軟性に富んだリンカーでｇＬと相互作用しており、ｇＬの溝にはまり込む形で小さなヘリックス構造を形成している。このように、ペンタマーは内部分子間で多数の相互作用をしている。しかし、その界面が小さいために、非常に柔軟性に富んだ構造を取っているが、Ｆａｂとの結合によりペンタマーを安定化できることが示されている。そのため、適切な部位特異的変異を導入することで安定性を向上させられる可能性がある。
【0022】
非特許文献１３では部位特異的変異により凝集性を改善したｇＢの細胞外ドメイン（エクトドメイン）のＸ線結晶構造が明らかにされている。これによれば、ｇＢはホモ三量体がスパイクのような構造を取っており、そのプロトマーは５つのドメインから構成されている。ドメインＩ及びドメインＩＩは細胞膜に近い側に隣接して位置しており、ドメインＩＩＩは非常に長いヘリックス構造によりコイルドコイル構造を形成している。ドメインＩＶは細胞膜と正反対側に位置し、ドメインＶはドメインＩからドメインＩＩＩにかけて、ｇＢ全長に沿う形で存在している。Ｎ末端はドメインＩＶ近傍に位置し、Ｃ末端はドメインＶに存在している。
【0023】
ＣＭＶ ｇＢタンパク質の立体構造は解析されており（非特許文献１３）、例えば、ＡＤ１６９株由来のｇＢタンパク質（配列番号１）において、配列番号１における１０９－３１９番目のアミノ酸残基からなるドメインＩ、９７－１０８番目のアミノ酸残基と３２０－４１４番目のアミノ酸残基とからなるドメインＩＩ、７１－８７番目のアミノ酸残基と４５３－５２５番目のアミノ酸残基と６１４－６４３番目のアミノ酸残基とからなるドメインＩＩＩ、６５－７０番目のアミノ酸残基と５２６－６１３番目のアミノ酸残基とからなるドメインＩＶ、及び、６４４－６７５番目のアミノ酸残基からなるドメインＶを有することが知られている。
【0024】
ｇＢには抗原ドメイン（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｏｍａｉｎ、ＡＤ）が５つ存在しており（ＡＤ－１～ＡＤ－５）、ＡＤ－１が最も抗原性が高いとされる。ＡＤ－１はドメインＩＶに位置しており、ドメインＩＶにはＮ型糖鎖が比較的少なく抗原が露出しているため、抗体がアクセスしやすいと考えられる。さらに、特許文献４では、ドメインＩＶを含む領域（ヘッド領域）に非中和抗体が集中していることが報告されており、ヘッド領域を除いたｇＢのワクチンとしての可能性について報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0025】
【文献】国際公開第２０１７１５３９５４号
【文献】特表２０１７－５１５５０３号公報
【文献】国際公開第２００３００４６４７号
【文献】国際公開２０２００８５４５７号
【非特許文献】
【0026】
【文献】Azuma H et al., “Cytomegalovirus seropositivity in pregnant women in Japan during 1996-2009” J Jpn Soc Perin Neon Med 46 (2010) 1273-1279
【文献】Kathleen R.Stratton et al., “Vaccines for the 21st centrury : a tool for decision making” The National Academies Press, 2000
【文献】Revello MG et al., “Randomized trial of hyperimmune globulin to prevent congenital cytomegalovirus” N Engl J Med 370 (2014) 1316-1326
【文献】Rieder F et al., “Cytomegalovirus vaccine: phase II clinical trial results” Clin Microbiol Infect 20 Suppl 5 (2014) 95-102
【文献】Yamada S et al., “Characterization of the guinea pig cytomegalovirus genome locus that encodes homologs of human cytomegalovirus major immediate-early genes, UL128, and UL130” Virology 391 (2009) 99-106
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【文献】Hashimoto K et al., “Effects of immunization of pregnant guinea pigs with guinea pig cytomegalovirus glycoprotein B on viral spread in the placenta” Vaccine 31 (2013) 3199-3205
【文献】Coleman S et al., “A Homolog Pentameric Complex Dictates Viral Epithelial Tropism, Pathogenicity and Congenital Infection Rate in Guinea Pig Cytomegalovirus” PLoS Pathog 12 (2016) e1005755
【文献】Flavia Chiuppesi et al., “Vaccine-Derived Neutralizing Antibodies to the Human Cytomegalovirus gH/gL Pentamer Potently Block Primary Cytotrophoblast Infection” J Virol 89 (2015) 11884-11898
【文献】Martin Zydek et al., “HCMV Infection of Human Trophoblast Progenitor Cells of the Placenta Is Neutralized by a Human Monoclonal Antibody to Glycoprotein B and Not by Antibodies to the Pentamer Complex” Viruses 6 (2014) 1346-1364
【文献】Yamada S et al., “An Ex vivo culture model for placental cytomegalovirus infection using slices of Guinea pig placental tissue” Placenta 37 (2016) 85-88
【文献】Hetalkumar D et al., “In Vitro Characterization of Human Cytomegalovirus-Targeting Therapeutic Monoclonal Antibodies LJP538 and LJP539” Antimicrob Agents Chemother 60 (2016) 4961-4971
【文献】Burke HG et al., “Crystal Structure of the Human Cytomegalovirus Glycoprotein B” PLoS Pathog 11 (2015) e1005227
【文献】Ciferri C et al., “Structural and biochemical studies of HCMV gH/gL/gO and Pentamer reveal mutually exclusive cell entry complexes” Proc Natl Acad Sci USA 112 (2015) 1767-1772
【文献】Chandramouli S et al., “Structural basis for potent antibody-mediated neutralization of human cytomegalovirus.” Sci Immunol 2(2017) eaan1457
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0027】
上述したように、ＣＭＶの感染予防において、特にＣＭＶの先天性感染を抑制し得る有効なＣＭＶワクチンが存在しない。したがって、本発明は、ＣＭＶの感染を予防及び治療できる有効なワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0028】
本発明者らは、以前の研究（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４７９６６号、２０２０年６月１８日付けＷＯ２０２０／１２１９８３として公開）では、ＣＭＶ ｇＢ抗原とペンタマー抗原とを含む、ＣＭＶの先天性感染を予防又は治療するためのワクチンを提案した。本発明者らはさらなる有効なワクチンを提供すべく鋭意研究の結果、ＣＭＶの主要な抗原であるｇＢとペンタマーとを遺伝子工学的に融合させたタンパク質複合体を作出し、１種類のタンパク質からなるサブユニットワクチンとすることで、モルモットにおける先天性ＣＭＶ感染を強く抑制しうること、並びに当該融合タンパク質の形態においてペンタマー分子の安定性が向上することを見出し、本発明の完成に至った。
【0029】
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
［１］ サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）とペンタマーとの融合タンパク質。
［２］ ３つのｇＢタンパク質構成分子からなるｇＢタンパク質のホモ三量体と、５つのペンタマー構成分子からなるペンタマーのヘテロ五量体とが、少なくとも１つのｇＢタンパク質構成分子と少なくとも１つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによって、タンパク質複合体を形成している、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］ 少なくとも２つのｇＢタンパク質構成分子と、少なくとも２つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、［２］に記載の融合タンパク質。
［４］ ３つのｇＢタンパク質構成分子と、５つのペンタマー構成分子のうちのいずれか３つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、［２］又は［３］に記載の融合タンパク質。
［５］ ３つのｇＢタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるｇＬ、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、［２］～［４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［６］ ３つのｇＢタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、［２］～［４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［７］ 遺伝子工学的な融合のうち少なくとも１つの融合は、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、［２］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［８］ 遺伝子工学的な融合のうち少なくとも２つの融合は、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、［３］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［９］ ３つの遺伝子工学的な融合がすべて、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、［４］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１０］ ｇＢタンパク質構成分子とペンタマー構成分子との間にリンカー及び／又はタグを有する、［２］～［９］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１１］ リンカーが配列番号２２記載のアミノ酸配列単位を１～３回繰り返したアミノ酸配列からなるリンカーである、［１０］に記載の融合タンパク質。
［１２］ ｇＢタンパク質がＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１］～［１１］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１３］ ｇＢタンパク質が配列番号１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１２］に記載の融合タンパク質。
［１４］ ｇＢタンパク質が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１２］又は［１３］に記載の融合タンパク質。
［１５］ ｇＢタンパク質がドメインＩＶを欠失したｇＢタンパク質改変体である、［１］～［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１６］ ｇＢタンパク質が配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１５］に記載の融合タンパク質。
［１７］ ｇＢタンパク質が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１５］又は［１６］に記載の融合タンパク質。
［１８］ ｇＢタンパク質が、野生型ｇＢタンパク質に比べて、凝集体の形成を低減させ、ホモ三量体構造の割合を増加させる改変が導入されたｇＢタンパク質改変体である、［１］～［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１９］ ｇＢタンパク質が配列番号３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１８］に記載の融合タンパク質。
［２０］ ｇＢタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１８］又は［１９］に記載の融合タンパク質。
［２１］ ｇＢタンパク質が、野生型ｇＢタンパク質に比べて、ヘッド領域の免疫原性を低減させる改変が導入されたｇＢタンパク質改変体である、［１］～［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［２２］ ｇＢタンパク質が配列番号３１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［２１］に記載の融合タンパク質。
［２３］ ｇＢタンパク質が、配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、［２１］又は［２２］に記載の融合タンパク質。
［２４］ ペンタマーが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなる、［１］～［２３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［２５］ ｇＨがｇＨタンパク質のエクトドメインである、［２４］に記載の融合タンパク質。
［２６］ ペンタマーが、
配列番号４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３１
を含むヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のペンタマータンパク質である、［２４］又は［２５］に記載の融合タンパク質。
［２７］ ペンタマーが、
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるｇＨと８０％以上の配列同一性を有するｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるｇＬと８０％以上の配列同一性を有するｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１２８と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３０と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３１と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３１
を含むＨＣＭＶのペンタマータンパク質である、［２４］～［２６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［２８］ ［１］～［２７］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸断片。
［２９］ ［２８］に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
［３０］ ［２８］に記載の核酸断片又は［２９］に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
［３１］ ［１］～［２７］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、ＣＭＶの感染を予防又は治療するためのワクチン。
［３２］ ＣＭＶの感染がＣＭＶの先天性感染である、［３１］に記載のワクチン。
［１］ サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）とペンタマーとの融合タンパク質。
［２］ ３つのｇＢタンパク質構成分子からなるｇＢタンパク質のホモ三量体と、５つのペンタマー構成分子からなるペンタマーのヘテロ五量体とが、少なくとも１つのｇＢタンパク質構成分子と少なくとも１つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによって、タンパク質複合体を形成している、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］ 少なくとも２つのｇＢタンパク質構成分子と、少なくとも２つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、［２］に記載の融合タンパク質。
［４］ ３つのｇＢタンパク質構成分子と、５つのペンタマー構成分子のうちのいずれか３つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、［２］又は［３］に記載の融合タンパク質。
［５］ ３つのｇＢタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるｇＬ、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、［２］～［４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［６］ ３つのｇＢタンパク質構成分子と、ペンタマー構成分子であるＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１とがそれぞれ遺伝子工学的に融合している、［２］～［４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［７］ 遺伝子工学的な融合のうち少なくとも１つの融合は、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、［２］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［８］ 遺伝子工学的な融合のうち少なくとも２つの融合は、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、［３］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［９］ ３つの遺伝子工学的な融合がすべて、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合である、［４］～［６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１０］ ｇＢタンパク質構成分子とペンタマー構成分子との間にリンカー及び／又はタグを有する、［２］～［９］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１１］ リンカーが配列番号２２記載のアミノ酸配列単位を１～３回繰り返したアミノ酸配列からなるリンカーである、［１０］に記載の融合タンパク質。
［１２］ ｇＢタンパク質がＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１］～［１１］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１３］ ｇＢタンパク質が配列番号１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１２］に記載の融合タンパク質。
［１４］ ｇＢタンパク質が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１２］又は［１３］に記載の融合タンパク質。
［１５］ ｇＢタンパク質がドメインＩＶを欠失したｇＢタンパク質改変体である、［１］～［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１６］ ｇＢタンパク質が配列番号１６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１５］に記載の融合タンパク質。
［１７］ ｇＢタンパク質が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１５］又は［１６］に記載の融合タンパク質。
［１８］ ｇＢタンパク質が、野生型ｇＢタンパク質に比べて、凝集体の形成を低減させ、ホモ三量体構造の割合を増加させる改変が導入されたｇＢタンパク質改変体である、［１］～［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１９］ ｇＢタンパク質が配列番号３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１８］に記載の融合タンパク質。
［２０］ ｇＢタンパク質が、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１８］又は［１９］に記載の融合タンパク質。
［２１］ ｇＢタンパク質が、野生型ｇＢタンパク質に比べて、ヘッド領域の免疫原性を低減させる改変が導入されたｇＢタンパク質改変体である、［１］～［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［２２］ ｇＢタンパク質が配列番号３１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［２１］に記載の融合タンパク質。
［２３］ ｇＢタンパク質が、配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインである、［２１］又は［２２］に記載の融合タンパク質。
［２４］ ペンタマーが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなる、［１］～［２３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［２５］ ｇＨがｇＨタンパク質のエクトドメインである、［２４］に記載の融合タンパク質。
［２６］ ペンタマーが、
配列番号４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３１
を含むヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のペンタマータンパク質である、［２４］又は［２５］に記載の融合タンパク質。
［２７］ ペンタマーが、
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるｇＨと８０％以上の配列同一性を有するｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるｇＬと８０％以上の配列同一性を有するｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１２８と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３０と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３１と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３１
を含むＨＣＭＶのペンタマータンパク質である、［２４］～［２６］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［２８］ ［１］～［２７］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸断片。
［２９］ ［２８］に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
［３０］ ［２８］に記載の核酸断片又は［２９］に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
［３１］ ［１］～［２７］のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、ＣＭＶの感染を予防又は治療するためのワクチン。
［３２］ ＣＭＶの感染がＣＭＶの先天性感染である、［３１］に記載のワクチン。
【発明の効果】
【0030】
本発明によれば、ＣＭＶの先天性感染防御において、ｇＢとペンタマーとの融合タンパク質を抗原とすることで、それぞれの単独投与による効果を上回る感染抑制効果を有するワクチンを提供することができる。これにより、ＣＭＶワクチンの実用化が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】実施例１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図2】実施例１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図3】実施例１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図4】実施例２の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の、ＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清及びペンタマー免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図5】実施例２の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図6】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の、ＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清及びペンタマー免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図7】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の、ＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清及びペンタマー免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図8】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の、ＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清及びペンタマー免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図9】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の、ＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清及びペンタマー免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図10】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図11】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図12】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図13】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図14】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体免疫血清の抗体価測定の結果を示す図である。
【図15】実施例３－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体免疫血清の中和活性の結果を示す図である。
【図16】実施例３－２－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の、Δｄ４免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図17】実施例３－２－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の、ペンタマー（ＰＣ）免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図18】実施例３－２－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１（Δｄ４／ＰＣ）免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図19】実施例３－２－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の、ｓａｌｉｎｅ免疫血清を用いた反応性解析の結果を示す図である。
【図20】実施例３－２－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図21】実施例３－２－１の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の粒子径評価の結果を示す図である。
【図22】実施例４の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の粒子径分布の結果を示す図である。
【図23】実施例４の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の粒子径分布の結果を示す図である。
【図24】実施例５の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のスコアを示す図である。
【図25】実施例６の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図26】実施例６の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の経胎盤感染防御試験の結果を示す図である。
【図27】実施例７の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の経胎盤感染防御試験の結果を示す図である。
【図28】実施例３－２－２の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図29】実施例３－２－２の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品の粒子径評価の結果を示す図である。
【図30】実施例３－２－３の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体免疫血清の抗体価測定の結果を示す図である。
【図31】実施例３－２－３の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体免疫血清の中和活性の結果を示す図である。
【図32】実施例４のｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１の精製品の粒子径分布の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【0033】
〔融合タンパク質〕
本発明の融合タンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）とペンタマーとの融合タンパク質である。当該融合タンパク質は、３つのｇＢタンパク質構成分子からなるｇＢタンパク質のホモ三量体と、５つのペンタマー構成分子からなるペンタマーのヘテロ五量体とが、少なくとも１つのｇＢタンパク質構成分子と少なくとも１つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによってタンパク質複合体を形成したものである。ここで、構成分子とは、ｇＢタンパク質のホモ三量体又はペンタマーのヘテロ五量体を構成するタンパク質をいい、サブユニットともいう。当該融合タンパク質は抗原としてＣＭＶの予防及び治療に有用なワクチンの作製に用いられる。
本発明の融合タンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）とペンタマーとの融合タンパク質である。当該融合タンパク質は、３つのｇＢタンパク質構成分子からなるｇＢタンパク質のホモ三量体と、５つのペンタマー構成分子からなるペンタマーのヘテロ五量体とが、少なくとも１つのｇＢタンパク質構成分子と少なくとも１つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによってタンパク質複合体を形成したものである。ここで、構成分子とは、ｇＢタンパク質のホモ三量体又はペンタマーのヘテロ五量体を構成するタンパク質をいい、サブユニットともいう。当該融合タンパク質は抗原としてＣＭＶの予防及び治療に有用なワクチンの作製に用いられる。
【0034】
融合タンパク質は、好ましくは少なくとも２つのｇＢタンパク質構成分子と、少なくとも２つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによって形成されたタンパク質複合体であり、より好ましくは、３つのｇＢタンパク質構成分子と、５つのペンタマー構成分子のうちのいずれか３つのペンタマー構成分子とがそれぞれ遺伝子工学的に融合することによって形成されたタンパク質複合体である。
【0035】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、任意のＣＭＶ株を含み、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、モルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、ラットサイトメガロウイルス（ＲＣＭＶ）及びアカゲザルサイトメガロウイルス（ＲｈＣＭＶ）などが挙げられる。ＨＣＭＶであることが好ましい。
【0036】
本実施形態におけるＣＭＶのｇＢタンパク質は、野生型ＣＭＶ ｇＢタンパク質であっても、改変型ＣＭＶ ｇＢタンパク質であってもよい。
【0037】
野生型ＣＭＶ ｇＢタンパク質とは、任意のＣＭＶ株に由来するｇＢタンパク質を意味し、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＭＶ ＡＤ１６９株由来のｇＢタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：Ｘ１７４０３．１）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＧＰＣＭＶ ２２１２２株に由来するｇＢタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＢ５９２９２８．１）などが挙げられる。
【0038】
改変型ＣＭＶ ｇＢタンパク質（「ｇＢタンパク質改変体」、「ｇＢ改変体」又は「改変体」ともいう。）とは、野生型ＣＭＶ ｇＢタンパク質に対して、少なくとも一つのアミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基領域が、置換、欠損（欠失）又は付加されたタンパク質をいい、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されたタンパク質などの野生型に存在しないタンパク質修飾がされたタンパク質も含む。
【0039】
ｇＢ改変体は、野生型ＣＭＶ ｇＢタンパク質のアミノ酸配列において、１以上、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有してもよく、置換、欠損（欠失）又は付加は同時に生じてもよい。ここで、アミノ酸の付加とは、元のアミノ酸配列の中に挿入すること、及び、元のアミノ酸配列の末端に追加することの両方を含む。なお、本明細書において、アミノ酸残基は、アミノ酸残基であることが明確な場合、単にアミノ酸という場合がある。
【0040】
ｇＢ改変体としては、元のｇＢタンパク質の立体構造及び機能に影響を与えない改変を有する改変体であってもよく、性状が改善されたものであってもよい。性状が改善されたｇＢ改変体としては、例えば、凝集体が形成しない又は低減し、ホモ三量体構造の割合を増加させるための改変が導入された改変体、或いは、抗体誘導能又は中和抗体誘導能を向上させるための改変、例えば特許文献４に記載されているようなｇＢタンパク質のヘッド領域の免疫原性を低減させる改変が導入された改変体などが挙げられる。「中和抗体誘導能」とは、抗原タンパク質に対する中和抗体を誘導できる能力をいい、抗原タンパク質を被検動物に接種することで得られる免疫血清中の中和抗体価（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ）で評価され得る。「中和抗体」とは、ウイルス粒子の感染性を失わせることができる抗体をいい、例えば被検ウイルスのプラーク数を５０％減少させるのに必要な抗体の濃度（ＮＴ５０）にてその抗体の中和活性の高さを評価することができる。
【0041】
また、本実施形態におけるＣＭＶのｇＢタンパク質は、ＣＭＶ ｇＢタンパク質の全長であっても、ＣＭＶ ｇＢタンパク質の抗原性断片であってもよい。
【0042】
ｇＢタンパク質の全長としては、例えば、上記の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＣＭＶ ｇＢタンパク質が挙げられる（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：Ｘ１７４０３．１）。但し、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１番目から２４番目のアミノ酸配列（配列番号１９）はシグナル配列である。したがって、ＣＭＶ ｇＢタンパク質の全長としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列から上記シグナル配列（配列番号１９）を除いたＨＣＭＶ ｇＢタンパク質であってもよい。
【0043】
本発明の融合タンパク質は抗原として、ＣＭＶの予防及び治療に有用なワクチンの作製に用いられるため、ｇＢタンパク質の抗原性断片としては、抗原性があり、かつ、ホモ三量体を形成できる断片であればよく、例えばＣＭＶのｇＢタンパク質の細胞外ドメイン（エクトドメイン）又はエクトドメインの断片若しくは改変体が挙げられる。エクトドメインとしては、例えば、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株由来のＨＣＭＶ（配列番号１）に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目から７０６番目のアミノ酸配列からなるＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の断片が挙げられ、この断片を野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメイン（配列番号１５）として定義する。また、他のＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメインの場合、上記ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株由来のＨＣＭＶのエクトドメイン（配列番号１５）との配列アライメントに基づく相当位置で定義される。本実施形態におけるｇＢタンパク質のエクトドメインは、野生型ＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメインであっても、改変型ＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメイン（ｇＢタンパク質のエクトドメイン改変体）であってもよい。
【0044】
ｇＢタンパク質のエクトドメイン又はその改変体としては、配列番号１５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＣＭＶのｇＢタンパク質のエクトドメインであってよい。
【0045】
ｇＢタンパク質のエクトドメイン又はその改変体としては、また、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９８％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインであってよい。ここで、配列同一性とは、複数の配列をアライメントした際の、（配列間で一致しているアミノ酸残基数）／（アミノ酸配列全長）の百分率を指す。例えば、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにて対象配列をアライメントし、ギャップを計算から除外して作成した％Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｍａｔｒｉｘが配列同一性にあたる。
【0046】
また、ｇＢタンパク質のエクトドメインの改変体としては、例えば、ドメインＩＶを欠失した改変体であってよい。例えば、配列番号１５に記載のアミノ酸配列の９７－４６８アミノ酸と６３１－６８２アミノ酸とを直接又は適切なペプチドリンカーを介してつないだものであってよい。また、該ドメインＩＶを欠失した改変体に対して、さらにＹ１３１Ａ、Ｉ１３２Ａ、Ｙ１３３Ａ、Ｗ２１６Ａ、Ｒ４３２Ｔ及びＲ４３４Ｑにアミノ酸置換を導入したものであってよく、例えば、配列番号１５の９７－４６８アミノ酸と６３１－６８２アミノ酸との間をＧＧＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号２０）の９アミノ酸でつなぎ、さらにＹ１３１Ａ、Ｉ１３２Ａ、Ｙ１３３Ａ、Ｗ２１６Ａ、Ｒ４３２Ｔ及びＲ４３４Ｑにアミノ酸置換を導入した改変体（「ｇＢΔｄ４」）（配列番号１６）が挙げられる。
【0047】
ドメインＩＶを欠失した改変体としては、また、配列番号１６に記載のアミノ酸配列において１以上、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインであってもよい。
【0048】
ドメインＩＶを欠失した改変体としては、また、ｇＢタンパク質が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９８％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインであってよい。
【0049】
凝集体の形成を低減させ、ホモ三量体構造の割合を増加させる改変が導入されたｇＢタンパク質改変体としては、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメインを基として、非特許文献１３を参考に、１３２番目のアミノ酸残基をヒスチジン残基（Ｈｉｓ）に、１３３番目のアミノ酸残基をアルギニン残基（Ａｒｇ）に、２１５番目のアミノ酸残基をグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）に、２１６番目のアミノ酸残基をアラニン残基（Ａｌａ）に、４３２番目のアミノ酸残基をトレオニン残基（Ｔｈｒ）に、４３４番目のアミノ酸残基をグルタミン残基（Ｇｌｎ）に置換したＨＣＭＶ ｇＢタンパク質エクトドメイン改変体（配列番号３）が挙げられる。
【0050】
上記ｇＢタンパク質改変体としては、また、配列番号３に記載のアミノ酸配列において１以上、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインであってもよい。
【0051】
上記ｇＢタンパク質改変体としては、また、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９８％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインであってよい。
【0052】
抗体誘導能又は中和抗体誘導能を向上させるための改変が導入されたｇＢタンパク質改変体としては、例えばｇＢタンパク質のヘッド領域の免疫原性を低減させる改変が導入されたｇＢタンパク質改変体が挙げられ、例えば、配列番号１５に記載のアミノ酸配列において、配列番号３と同じ変異を導入したうえ、さらにＳ１２８－Ｌ１３８を欠損させ、末端のＲ１２７とＧ１３９をグリシンリンカーＧＧＧでつなぎ、Ｗ２１６－Ｙ２１８を欠損させ、Ｎ型糖鎖を４か所導入（Ｄ７７Ｎ、Ｉ７９Ｔ／Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ／Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ／Ｋ６０９Ｎ、Ｒ６１０Ｔ、Ｍ６１１Ｔ）したもの（ｇＢＶＣ３７、配列番号３１）が挙げられる（特許文献４）。
【0053】
上記ｇＢタンパク質改変体としては、また、配列番号３１に記載のアミノ酸配列において１以上、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインであってもよい。
【0054】
上記ｇＢタンパク質改変体としては、また、配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるｇＢタンパク質のエクトドメインと８０％以上、例えば８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９８％以上の配列同一性を有するｇＢタンパク質のエクトドメインであってよい。
【0055】
ＣＭＶのｇＢタンパク質抗原は、ＣＭＶを用いてタンパク質精製によって作製してもよく、遺伝子工学の手法によって作製することができる。作製方法は特に限定されないが、たとえば、野生型ｇＢタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、プライマーを設計して、ＰＣＲによって核酸を得て、発現プロモーターと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させることによって得ることができる。作製されたＣＭＶ ｇＢタンパク質抗原は、必要に応じて精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーカラムなどによる精製が挙げられる。
【0056】
改変型ｇＢタンパク質抗原が変異導入による改変体の場合、目的の変異を導入するためのプライマーを設計して、ＰＣＲによって変異が導入された核酸を得て、発現プロモーターと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させることによって得ることができる。
【0057】
また、改変型ｇＢタンパク質抗原が糖鎖導入（糖鎖修飾）による改変体の場合は、通常の方法であればよく、特に限定されないが、たとえば、Ｎ型糖鎖を導入する場合、野生型ｇＢタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、Ｎ型糖鎖を導入する目的部位の３つの連続したアミノ酸配列が、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）となるように、プライマーを設計し、ＰＣＲによって変異を導入する。目的の改変型ｇＢタンパク質の核酸配列、さらに必要あれば６×Ｈｉｓなどのタグを連結した核酸配列を適切なベクターにクローニングし、発現させることによって改変型ＣＭＶ ｇＢタンパク質を得ることができる。そして、ｇＢ改変体の目的部位のアスパラギンに通常の方法によってＮ型糖鎖を付加する。
【0058】
ＣＭＶのペンタマーは、５つの異なる構成分子（サブユニット）からなる五量体複合体、又はヘテロ五量体若しくは単に五量体ともいう。野生型ＣＭＶペンタマーであっても、改変型ＣＭＶペンタマーであってもよい。
【0059】
野生型ＣＭＶペンタマーとは、任意のＣＭＶ株に由来するペンタマーを意味し、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなる五量体、モルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）のＧＰ７５（ｇＨ）、ＧＰ１１５（ｇＬ）、ＧＰ１２９（ＵＬ１２８）、ＧＰ１３１（ＵＬ１３０）及びＧＰ１３３（ＵＬ１３１）からなる五量体などが挙げられる。
【0060】
ＨＣＭＶペンタマーは、例えば配列番号４（ｇＨ）、配列番号５（ｇＬ）、配列番号６（ＵＬ１２８）、配列番号７（ＵＬ１３０）及び配列番号８（ＵＬ１３１）に記載のアミノ酸配列からなるＨＣＭＶ Ｍｅｒｌｉｎ株由来のペンタマータンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＹ４４６８９４．２）（但し、ＵＬ１２８の塩基配列には変異を含んでいるため、他のＣＭＶ株の配列情報を基に修正を加えている）などが挙げられる。
【0061】
ＧＰＣＭＶペンタマーは、例えば配列番号１０（ＧＰ７５）、配列番号１１（ＧＰ１１５）、配列番号１２（ＧＰ１２９）、配列番号１３（ＧＰ１３１）及び配列番号１４（ＧＰ１３３）に記載のアミノ酸配列からなるＧＰＣＭＶ ２２１２２株由来のペンタマータンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＢ５９２９２８．１）（但し、ＧＰ１３３の塩基配列には変異を含んでいるため、他のＣＭＶ株の配列情報を基に修正を加えている）などが挙げられる。
【0062】
改変型ＣＭＶペンタマーのサブユニット（構成分子）としては、元のサブユニットの立体構造及び機能に影響を与えない改変を有する改変体であってもよく、性状が改善されたものであってもよい。性状が改善されたサブユニットの改変体としては、例えば、凝集体が形成しない又は低減し、それによって五量体の含有量が増加するようにするための改変が導入された改変体、抗体誘導能又は中和抗体誘導能を向上させるための改変が導入された改変体などが挙げられる。改変型ＣＭＶペンタマーは、野生型ＣＭＶペンタマーを構成する５つのサブユニットのうち少なくとも１つが改変タンパク質（サブユニットの改変体）であるペンタマーをいう。サブユニットの改変体は、対応する野生型のサブユニットに対して、１以上のアミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基領域が、置換、欠損（欠失）又は付加されたタンパク質をいい、アミノ酸残基の置換、欠損（欠失）又は付加によって糖鎖導入されたタンパク質などの野生型に存在しないタンパク質修飾がされたタンパク質も含む。ここで、アミノ酸の付加とは、元のアミノ酸配列の中に挿入すること、及び、元のアミノ酸配列の末端に追加することの両方を含む。
【0063】
一実施形態のＨＣＭＶペンタマーが、
配列番号４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３１
を含むＨＣＭＶのペンタマータンパク質であってよい。ここで、１以上のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加は、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加であってよい。
配列番号４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＵＬ１３１
を含むＨＣＭＶのペンタマータンパク質であってよい。ここで、１以上のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加は、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加であってよい。
【0064】
一実施形態のＨＣＭＶペンタマーが、
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるｇＨと８０％以上の配列同一性を有するｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるｇＬと８０％以上の配列同一性を有するｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１２８と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３０と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３１と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３１
を含むＨＣＭＶのペンタマータンパク質であってよい。ここで、８０％以上の配列同一性は、例えば８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９８％以上の配列同一性であってよい。
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるｇＨと８０％以上の配列同一性を有するｇＨ、
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるｇＬと８０％以上の配列同一性を有するｇＬ、
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１２８と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１２８、
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３０と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３０、及び
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＵＬ１３１と８０％以上の配列同一性を有するＵＬ１３１
を含むＨＣＭＶのペンタマータンパク質であってよい。ここで、８０％以上の配列同一性は、例えば８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９８％以上の配列同一性であってよい。
【0065】
一実施形態のＧＰＣＭＶペンタマーが、
配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ７５、
配列番号１１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ１１５、
配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ１２９、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ１３１、及び
配列番号１４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ１３３
を含むＧＰＣＭＶのペンタマータンパク質であってよい。ここで、１以上のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加は、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加であってよい。
配列番号１０に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ７５、
配列番号１１に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ１１５、
配列番号１２に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ１２９、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ１３１、及び
配列番号１４に記載のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＧＰ１３３
を含むＧＰＣＭＶのペンタマータンパク質であってよい。ここで、１以上のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加は、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個、１～３個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加であってよい。
【0066】
一実施形態のＧＰＣＭＶペンタマーが、
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ７５と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ７５、
配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ１１５と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ１１５、
配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ１２９と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ１２９、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ１３１と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ１３１、及び
配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ１３３と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ１３３
を含むＧＰＣＭＶのペンタマータンパク質であってよい。ここで、８０％以上の配列同一性は、例えば８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９８％以上の配列同一性であってよい。
配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ７５と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ７５、
配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ１１５と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ１１５、
配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ１２９と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ１２９、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ１３１と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ１３１、及び
配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＧＰ１３３と８０％以上の配列同一性を有するＧＰ１３３
を含むＧＰＣＭＶのペンタマータンパク質であってよい。ここで、８０％以上の配列同一性は、例えば８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９８％以上の配列同一性であってよい。
【0067】
各サブユニットが全長であってもよく、例えばエクトドメインのみであってもよい。ｇＨがｇＨタンパク質のエクトドメインであることが好ましい。
【0068】
ＣＭＶペンタマー抗原は、ＣＭＶを用いてタンパク質精製によって作製してもよく、遺伝子工学の手法によって作製することができる。作製方法は特に限定されないが、たとえば、野生型ＣＭＶペンタマーを構成する５つのタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、プライマーを設計して、ＰＣＲによって核酸を得て、発現プロモーターと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させ、フォールディングさせ五量体構造を形成させることによって得ることができる。ＣＭＶペンタマー抗原は、必要に応じて分泌型蛋白として発現させることもできる。例えば、ｇＨを全長（配列番号９）ではなく、エクトドメイン（配列番号４）の断片として発現させることで、分泌型蛋白としての発現が可能となる。作製されたＣＭＶペンタマー抗原は、必要に応じて精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーカラムなどによる精製が挙げられる。
【0069】
改変型ＣＭＶペンタマー抗原が変異導入による改変体、又は糖鎖導入（糖鎖修飾）による改変体の場合は、上述のように作製することができる。
【0070】
本発明の融合タンパク質はｇＢとペンタマーの立体構造を部分的に併せ持つ。ｇＢとペンタマー構成分子は一分子以上連結していればよく、その組み合わせも適宜選択できる。また、ｇＢとペンタマー構成分子が一分子以上連結し、他の分子は融合せず発現する場合であっても、これらは連結した分子とともに複合体を形成しうるため、ｇＢ－ペンタマー融合タンパク質といえる。ｇＢ－ペンタマー融合タンパク質は、どのような組み合わせで連結してもよい。
【0071】
一実施形態の融合タンパク質においては、ｇＢタンパク質構成分子と遺伝子工学的に融合するペンタマーのサブユニットは特に限定されず、１つのｇＢタンパク質構成分子とペンタマーのサブユニットのうち任意の１つと遺伝子工学的に融合すればよく、２つまたは３つのｇＢタンパク質構成分子のそれぞれと遺伝子工学的に融合するペンタマーのサブユニットの組み合わせも特に限定されず、例えば、ホモ三量体の３つのｇＢタンパク質構成分子のそれぞれと融合するペンタマーの構成サブユニットが、ｇＬ、ＵＬ１２８及びＵＬ１３０であってもよく、ｇＢタンパク質と融合するペンタマーの構成サブユニットが、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１であってもよい。
【0072】
一実施形態の融合タンパク質においては、遺伝子工学的な融合は、Ｎ末端側からｇＢタンパク質、ペンタマーの順で結合された融合（すなわち、ｇＢタンパク質構成分子のＣ末端と、ペンタマーの構成分子のＮ末端とが連結された融合）であってもよく、Ｎ末端側からペンタマー、ｇＢタンパク質の順で結合された融合であってもよい。Ｎ末端側からペンタマー、ｇＢタンパク質の順で結合された融合タンパク質、すなわち、ｇＢタンパク質のＮ末端側にペンタマーが結合したものが凝集体を形成しにくい傾向があるため、好ましい。すなわち、遺伝子工学的な融合のうち少なくとも１つの融合は、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合であることが好ましく、遺伝子工学的な融合のうち少なくとも２つの融合は、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合であることがより好ましく、３つの遺伝子工学的な融合がすべて、ｇＢタンパク質構成分子のＮ末端側にペンタマー構成分子が結合している融合であることが特に好ましい。
【0073】
融合タンパク質において、ｇＢタンパク質とペンタマーとが直接結合してもよいが、好ましくは適切なリンカー及び／又はタグを介して結合されていることが好ましい。融合タンパク質は、ｇＢタンパク質とペンタマーとの間に適切な長さのリンカーを有することで、互いに立体障害を及ぼさず、各々が適切な構造を形成できると考えられる。また、融合タンパク質は、ｇＢタンパク質とペンタマーとの間にタグを有することで、アフィニティ精製による精製が可能となる。また、融合タンパク質は、ｇＢタンパク質とペンタマーとの間に限らず、融合タンパク質のＮ末端側又はＣ末端側にリンカー及び／又はタグを有してもよい。
【0074】
リンカーとしては特に限定されず、当業者が適宜に設計できるものである。例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒを単位とする５アミノ酸のリンカー（配列番号２２）などが挙げられ、例えば、配列番号２２記載のアミノ酸配列単位を１～３回繰り返したアミノ酸配列からなるリンカーが挙げられる。
【0075】
タグとしては特に限定されず、当業者が適宜に選択できるものである。例えば、複数のヒスチジン残基が連なったＨｉｓタグ（例えば、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するＨｉｓタグ）などが挙げられる。
【0076】
さらに、ＣＭＶのｇＢとペンタマーの融合タンパク質は、実施例に記載するように、ｇＢとペンタマーを遺伝子工学的に融合させることで作出できる。
【0077】
〔核酸断片、組換え発現ベクター、形質転換体〕
本発明の核酸断片は、本発明のＣＭＶのｇＢとペンタマーとの融合タンパク質をコードする核酸断片であり、本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸断片を含む組換え発現ベクターであり、本発明の形質転換体は、本発明の核酸断片又は本発明の組換え発現ベクターが導入された形質転換体である。
本発明の核酸断片は、本発明のＣＭＶのｇＢとペンタマーとの融合タンパク質をコードする核酸断片であり、本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸断片を含む組換え発現ベクターであり、本発明の形質転換体は、本発明の核酸断片又は本発明の組換え発現ベクターが導入された形質転換体である。
【0078】
融合タンパク質をコードする核酸断片としては、当該核酸断片を宿主において転写、発現させる際に、最終的にｇＢ及びペンタマーが結合した融合タンパク質として発現できるものであれば、特に限定されない。例えば、ｇＢタンパク質をコードする核酸断片、及び、ペンタマーのそれぞれのサブユニットをコードする核酸断片を機能的連結することによって得ることができる。これらの核酸断片の間には、終止コドン等の転写を途中で止めるコドンを含まないほうが好ましい。
【0079】
野生型のｇＢタンパク質をコードする核酸断片は、例えば、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する野生型ｇＢをコードする遺伝子に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、各種ＣＭＶのＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該遺伝子に基づき設計することができるプライマーセットを用いた、各種ＣＭＶのＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
【0080】
ｇＢタンパク質の改変体をコードする核酸断片は、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。または、部位特異的変異を導入することによっても得ることができる。
【0081】
ｇＢタンパク質をコードする核酸断片は、配列番号１～３、１５、１６、３１等のアミノ酸配列に基づき設計したアミノ酸配列をコードする核酸断片を人工合成によって得ることができる。
【0082】
野生型又は改変型のペンタマーの各サブユニット、例えば、配列番号４～８、又は配列番号１０～１４の各サブユニットをコードする核酸断片も同様に取得することができる。
【0083】
取得した上記の核酸断片は、そのまま、又は適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該核酸断片の塩基配列を決定することができる。
【0084】
組換え発現ベクターに利用できるベクターは特に限定されないが、例えば、ＣＡＧプロモーターを用いたｐＣＡＧＧＳベクター、ＣＭＶプロモーターを用いたｐＣＭＶベクターなどを挙げることができる。
【0085】
形質転換体は、上記核酸断片又は組換え発現ベクターを宿主細胞に導入することによって得ることができる。導入は常法によって行えばよい。宿主細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞やＨＥＫ２９３細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞などを挙げることができる。
【0086】
形質転換体を適切な培地にて培養し、必要に応じて発現誘導することによって、本発明の融合タンパク質を発現させ、それを回収し、必要に応じて精製することで、本発明の融合タンパク質を得ることができる。
【0087】
〔ワクチン〕
本発明のワクチンは、本発明の融合タンパク質を含む。一実施形態のワクチンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）とペンタマーとの融合タンパク質を抗原として含むＣＭＶの先天性感染を予防又は治療するためのワクチンである。すなわち、本実施形態のワクチンは２種類の抗原タンパク質の機能を併せ持つ融合タンパク質からなるサブユニットワクチンである。
本発明のワクチンは、本発明の融合タンパク質を含む。一実施形態のワクチンは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）とペンタマーとの融合タンパク質を抗原として含むＣＭＶの先天性感染を予防又は治療するためのワクチンである。すなわち、本実施形態のワクチンは２種類の抗原タンパク質の機能を併せ持つ融合タンパク質からなるサブユニットワクチンである。
【0088】
本実施形態のワクチンにおけるタンパク質抗原の含有量は、ＣＭＶのｇＢタンパク質抗原及びＣＭＶペンタマー抗原について、それぞれ０．１～１０００μｇであればよく、１～１００μｇであることが好ましい。
【0089】
本実施形態のワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。
【0090】
本実施形態のＣＭＶワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）などが、更に適宜配合されてもよい。
【0091】
本実施形態のワクチンの免疫原性をさらに高めるために、アジュバントを更に含むことも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント又はスクアレンを含む水中油型乳濁アジュバント（ＡＳ０３、ＭＦ５９など）、ＣｐＧ及び３－Ｏ－脱アシル化－４’－モノホスホリル ｌｉｐｉｄ Ａ（ＭＰＬ）などのＴｏｌｌ様受容体のリガンド、サポニン系アジュバント、ポリγ－グルタミン酸などのポリマー系アジュバント、キトサン及びイヌリンなどの多糖類が挙げられる。
【0092】
本実施形態のワクチンは、ＣＭＶのｇＢとペンタマーの融合タンパク質である抗原と、必要に応じて、担体、アジュバントなどと混合することにより得ることができる。アジュバントは、用時に混合するものであってもよい。
【0093】
本実施形態のワクチンの投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。
【0094】
本実施形態のワクチンの投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、スプレーによって投与する方法であってもよい。
【0095】
本実施形態のワクチンによれば、ＣＭＶの経胎盤感染を予防又は治療することができる。経胎盤感染の予防とは、母体にワクチンを投与することにより、胎児へのＣＭＶの垂直感染を抑制すること、或いは、先天性感染により生じる各種症状の発現を抑制することである。これらは、胎児の羊水や新生児の体液を用いた核酸増幅法による検査や、新生児の頭部超音波検査、頭部ＣＴ検査、頭部ＭＲＩ検査、又は聴覚スクリーニングなどによって評価することができる。経胎盤感染の治療とは、先天性感染児にワクチンを投与することにより、先天性感染により生じる各種症状の発現や進展を抑制することである。これらは、先天性感染児の聴力検査、視力検査、その他の身体学的検査や精神発達検査などによって評価することができる。本実施形態のワクチンは、妊娠可能年齢の女性或いは女子児童を対象に投与することが好ましい。集団免疫の観点から、男性や男子児童、高齢者までを対象とすることも考えられる。また、投与回数は１回から３回、但し、２ヶ月から数年の間隔を置いて複数回接種することが望ましい。血中の抗体価を測定し、抗体が陰性或いは抗体価が低い人を接種対象とすることもできる。
【実施例】
【0096】
以下、実施例等に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0097】
実施例１
＜抗原調製＞
ＡＤ１６９株に由来するＨＣＭＶ ｇＢのエクトドメイン（配列番号１５）をコードする遺伝子を人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏ（特許文献３）にクローニングした。Ｃ末端には９アミノ酸のＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）が付加されるように設計した。これをベースに、Ｉ１３２Ｈ、Ｙ１３３Ｒ、Ｔ２１５Ｅ、Ｗ２１６Ａ、Ｒ４３２Ｔ及びＲ４３４Ｑのアミノ酸置換を行ったもの（配列番号３）をｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍｖ９（以下、「ｇＢｖ９」と呼ぶ）とした（特許文献４）。ｇＢｖ９を発現する際は、Ｎ末端にＨＣＭＶ－ｇＢのシグナル配列（ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳ）（配列番号１９）を挿入した。
＜抗原調製＞
ＡＤ１６９株に由来するＨＣＭＶ ｇＢのエクトドメイン（配列番号１５）をコードする遺伝子を人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏ（特許文献３）にクローニングした。Ｃ末端には９アミノ酸のＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）が付加されるように設計した。これをベースに、Ｉ１３２Ｈ、Ｙ１３３Ｒ、Ｔ２１５Ｅ、Ｗ２１６Ａ、Ｒ４３２Ｔ及びＲ４３４Ｑのアミノ酸置換を行ったもの（配列番号３）をｇＢ１－６８２－ｆｍ３Ｍｖ９（以下、「ｇＢｖ９」と呼ぶ）とした（特許文献４）。ｇＢｖ９を発現する際は、Ｎ末端にＨＣＭＶ－ｇＢのシグナル配列（ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳ）（配列番号１９）を挿入した。
【0098】
発現には、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクノロジーズ社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。ｇＢｖ９を含む培養上清から、Ｎｉ ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ＰＢＳ＋０．５Ｍ Ａｒｇｉｎｉｎｅに対して透析を行い、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメインの精製品を得た。
【0099】
また、ｇＢエクトドメイン（配列番号１５）の９７－４６８アミノ酸と６３１－６８２アミノ酸の間をＧＧＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号２０）の９アミノ酸でつなぎ、さらにＹ１３１Ａ、Ｉ１３２Ａ、Ｙ１３３Ａ、Ｗ２１６Ａ、Ｒ４３２Ｔ及びＲ４３４Ｑにアミノ酸置換を導入したものを「ｇＢΔｄ４」（配列番号１６）とし、人工合成遺伝子をもとに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｇＢΔｄ４をコードするＤＮＡ断片を作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした（特許文献４のＤ１Ｄ２と同一分子）。ｇＢΔｄ４を発現する際は、Ｎ末端にＨＣＭＶ－ｇＢのシグナル配列（ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳ）（配列番号１９）を挿入し、Ｃ末端には９アミノ酸のＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）を挿入した。発現及び精製はｇＢｖ９と同様の方法で行った。
【0100】
ＵＬ１２８（配列番号６）をコードする遺伝子、ＵＬ１３０（配列番号７）をコードする遺伝子、及びＵＬ１３１（配列番号８）をコードする遺伝子をそれぞれ人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。
【0101】
次に、ＵＬ１２８（配列番号６）のシグナル配列（１－２７アミノ酸）を除き、同じ位置にヒトイムノグロブリン軽鎖シグナルペプチド配列（ＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＭＬＷＶＰＧＳＳＧ）（配列番号２１）を挿入した「シグナルペプチド置換ＵＬ１２８」、又は、
ＵＬ１３０（配列番号７）のシグナル配列（１－２５アミノ酸）を除き、同じ位置にＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＭＬＷＶＰＧＳＳＧ（配列番号２１）のアミノ酸配列を挿入した「シグナルペプチド置換ＵＬ１３０」、又は、
ＵＬ１３１（配列番号８）のシグナル配列（１－１８アミノ酸）を除き同じ位置にＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＭＬＷＶＰＧＳＳＧ（配列番号２１）のアミノ酸配列を挿入した「シグナルペプチド置換ＵＬ１３１」
のＣ末端側に５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介してｇＢｖ９を付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。このうち、シグナルペプチド置換ＵＬ１２８とｇＢｖ９を連結したものをＮ－ＵＬ１２８－ｇＢ、シグナルペプチド置換ＵＬ１３０とｇＢｖ９を連結したものをＮ－ＵＬ１３０－ｇＢ、シグナルペプチド置換ＵＬ１３１とｇＢｖ９を連結したものをＮ－ＵＬ１３１－ｇＢとした。
ＵＬ１３０（配列番号７）のシグナル配列（１－２５アミノ酸）を除き、同じ位置にＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＭＬＷＶＰＧＳＳＧ（配列番号２１）のアミノ酸配列を挿入した「シグナルペプチド置換ＵＬ１３０」、又は、
ＵＬ１３１（配列番号８）のシグナル配列（１－１８アミノ酸）を除き同じ位置にＭＲＬＰＡＱＬＬＧＬＬＭＬＷＶＰＧＳＳＧ（配列番号２１）のアミノ酸配列を挿入した「シグナルペプチド置換ＵＬ１３１」
のＣ末端側に５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介してｇＢｖ９を付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。このうち、シグナルペプチド置換ＵＬ１２８とｇＢｖ９を連結したものをＮ－ＵＬ１２８－ｇＢ、シグナルペプチド置換ＵＬ１３０とｇＢｖ９を連結したものをＮ－ＵＬ１３０－ｇＢ、シグナルペプチド置換ＵＬ１３１とｇＢｖ９を連結したものをＮ－ＵＬ１３１－ｇＢとした。
【0102】
また、ｇＢｖ９のＮ末端にＨＣＭＶ－ｇＢのシグナル配列（ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳ）（配列番号１９）を挿入し、ｇＢｖ９のＣ末端側からＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）を除き、５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介して、
ＵＬ１２８（配列番号６）のシグナル配列（１－２７アミノ酸）を除いたシグナル除去ＵＬ１２８、又は、
ＵＬ１３０（配列番号７）のシグナル配列（１－２５アミノ酸）を除いたシグナル除去ＵＬ１３０、又は、
ＵＬ１３１（配列番号８）シグナル配列（１－１８アミノ酸）を除いたシグナル除去ＵＬ１３１
を連結し、さらにそのＣ末端側に９アミノ酸のＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）を付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。このうち、シグナル除去ＵＬ１２８とｇＢｖ９を連結したものをＣ－ＵＬ１２８－ｇＢ、シグナル除去ＵＬ１３０とｇＢｖ９を連結したものをＣ－ＵＬ１３０－ｇＢ、シグナル除去ＵＬ１３１とｇＢｖ９を連結したものをＣ－ＵＬ１３１－ｇＢとした。
ＵＬ１２８（配列番号６）のシグナル配列（１－２７アミノ酸）を除いたシグナル除去ＵＬ１２８、又は、
ＵＬ１３０（配列番号７）のシグナル配列（１－２５アミノ酸）を除いたシグナル除去ＵＬ１３０、又は、
ＵＬ１３１（配列番号８）シグナル配列（１－１８アミノ酸）を除いたシグナル除去ＵＬ１３１
を連結し、さらにそのＣ末端側に９アミノ酸のＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）を付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。このうち、シグナル除去ＵＬ１２８とｇＢｖ９を連結したものをＣ－ＵＬ１２８－ｇＢ、シグナル除去ＵＬ１３０とｇＢｖ９を連結したものをＣ－ＵＬ１３０－ｇＢ、シグナル除去ＵＬ１３１とｇＢｖ９を連結したものをＣ－ＵＬ１３１－ｇＢとした。
【0103】
次に、ｇＢΔｄ４(配列番号１６）の３７３ａａ－３８１ａａを除き、同じ位置にシグナル除去ＵＬ１２８、又はシグナル除去ＵＬ１３０、又はシグナル除去ＵＬ１３１を挿入した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。なお、いずれについても、Ｎ末端にＨＣＭＶ－ｇＢのシグナル配列（ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳ）（配列番号１９）を挿入した。このうちシグナル除去ＵＬ１２８を挿入したものをΔｄ４－ＵＬ１２８－ｇＢ、シグナル除去ＵＬ１３０を挿入したものをΔｄ４－ＵＬ１３０－ｇＢ、シグナル除去ＵＬ１３１を挿入したものをΔｄ４－ＵＬ１３１－ｇＢとした。
【0104】
発現及び精製はＨＣＭＶのｇＢタンパク質と同様の方法で行い、Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ、Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ、及びＮ－ＵＬ１３１－ｇＢをそれぞれ単独で発現させた場合と、Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ、Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ、及びＮ－ＵＬ１３１－ｇＢの３種を共発現させた場合（Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ）、Ｃ－ＵＬ１２８－ｇＢ、Ｃ－ＵＬ１３０－ｇＢ、及びＣ－ＵＬ１３１－ｇＢをそれぞれ単独で発現させた場合と、Ｃ－ＵＬ１２８－ｇＢ、Ｃ－ＵＬ１３０－ｇＢ、及びＣ－ＵＬ１３１－ｇＢの３種を共発現させた場合（Ｃ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｃ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｃ－ＵＬ１３１－ｇＢ）、Δｄ４－ＵＬ１２８－ｇＢ、Δｄ４－ＵＬ１３０－ｇＢ、及びΔｄ４－ＵＬ１３１－ｇＢをそれぞれ単独で発現させた場合と、Δｄ４－ＵＬ１２８－ｇＢ、Δｄ４－ＵＬ１３０－ｇＢ、及びΔｄ４－ＵＬ１３１－ｇＢの３種を共発現させた場合（Δｄ４－ＵＬ１２８－ｇＢ／Δｄ４－ＵＬ１３０－ｇＢ／Δｄ４－ＵＬ１３１－ｇＢ）、計１２種類のｇＢとペンタマー構成タンパク質との融合タンパク質の精製品を得た。ここで本明細書において、混同しない限り、ｇＢ又はその一部とペンタマー構成タンパク質又はその一部との融合タンパク質、及びこれら融合タンパク質を細胞において発現させて得られた単量体又は多量体、並びにこれらの融合タンパク質をコードする遺伝子又はそのＤＮＡ断片を、総じて「ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体」と呼ぶ場合がある。
【0105】
＜タンパク精製品のゲル濾過クロマトグラフィー＞
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品をアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで移動相はＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品をアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで移動相はＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
【0106】
＜結果＞
ゲル濾過クロマトグラフィーの結果を図１～３に示す。全ての発現物において、凝集体が確認された。しかし、Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ、Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ、Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ及びＮ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢを発現した場合に比べ、Ｃ－ＵＬ１２８－ｇＢ、Ｃ－ＵＬ１３０－ｇＢ、Ｃ－ＵＬ１３１－ｇＢ及びＣ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｃ－ＵＬ１３０－ｇＢ／及びＣ－ＵＬ１３１－ｇＢを発現した場合、並びに、Δｄ４－ＵＬ１２８－ｇＢ、Δｄ４－ＵＬ１３０－ｇＢ、Δｄ４－ＵＬ１３１－ｇＢ及びΔｄ４－ＵＬ１２８－ｇＢ／Δｄ４－ＵＬ１３０－ｇＢ／Δｄ４－ＵＬ１３１－ｇＢを発現した場合は、凝集体含量が増加していることが確認された。このことからＵＬ１２８、ＵＬ１３０又はＵＬ１３１をＨＣＭＶｇＢタンパク質と融合する場合、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のＮ末端側に融合した方が凝集体を形成しにくく、凝集体以外の含量が増加すると示唆された。
ゲル濾過クロマトグラフィーの結果を図１～３に示す。全ての発現物において、凝集体が確認された。しかし、Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ、Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ、Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ及びＮ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢを発現した場合に比べ、Ｃ－ＵＬ１２８－ｇＢ、Ｃ－ＵＬ１３０－ｇＢ、Ｃ－ＵＬ１３１－ｇＢ及びＣ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｃ－ＵＬ１３０－ｇＢ／及びＣ－ＵＬ１３１－ｇＢを発現した場合、並びに、Δｄ４－ＵＬ１２８－ｇＢ、Δｄ４－ＵＬ１３０－ｇＢ、Δｄ４－ＵＬ１３１－ｇＢ及びΔｄ４－ＵＬ１２８－ｇＢ／Δｄ４－ＵＬ１３０－ｇＢ／Δｄ４－ＵＬ１３１－ｇＢを発現した場合は、凝集体含量が増加していることが確認された。このことからＵＬ１２８、ＵＬ１３０又はＵＬ１３１をＨＣＭＶｇＢタンパク質と融合する場合、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のＮ末端側に融合した方が凝集体を形成しにくく、凝集体以外の含量が増加すると示唆された。
【0107】
実施例２
＜抗原調製＞
実施例１の検討によりＵＬ１２８、ＵＬ１３０、又はＵＬ１３１をｇＢのＮ末端側に融合すると凝集体含量の低下が認められたため、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、又はＵＬ１３１をｇＢのＮ末端側に融合させた次のような各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体をデザインした。
ＵＬ１２８（配列番号６）にＣ１６２Ｓアミノ酸置換を加え、更にＣ末端側に５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介してｇＢｖ９を付加したものをＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ｇＢとした。
ＵＬ１２８（配列番号６）にＣ１６２Ｓアミノ酸置換を加え、更にＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してｇＢΔｄ４を付加したものをＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４とした。
ＵＬ１２８（配列番号６）、ＵＬ１３０（配列番号７）又はＵＬ１３１（配列番号８）遺伝子のＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してｇＢΔｄ４を付加し、このうち、Ｎ末端側がＵＬ１２８のものをＵＬ１２８－Δｄ４、Ｎ末端側がＵＬ１３０のものをＵＬ１３０－Δｄ４、Ｎ末端側がＵＬ１３１のものをＵＬ１３１－Δｄ４とした。
ｇＢｖ９のＳ１２８ａａ－Ｌ１３８ａａを欠損させ、末端のＲ１２７とＧ１３９をグリシンリンカーＧＧＧでつなぎ、Ｗ２１６ａａ－Ｙ２１８ａａを欠損させ、Ｎ型糖鎖を４か所導入（Ｄ７７Ｎ、Ｉ７９Ｔ／Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ／Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ／Ｋ６０９Ｎ、Ｒ６１０Ｔ、Ｍ６１１Ｔ）したものをｇＢＶＣ３７（配列番号３１）とした（特許文献４）。ｇＢＶＣ３７を発現する際はＮ末端に ＨＣＭＶ－ｇＢのシグナル配列（ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳ）（配列番号１９）を挿入した。
ＵＬ１２８（配列番号６）にＣ１６２Ｓアミノ酸置換を加え、Ｃ末端側に５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介してｇＢＶＣ３７を付加したものをＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７とした。
ＵＬ１２８（配列番号６）、ＵＬ１３０（配列番号７）又はＵＬ１３１（配列番号８）遺伝子のＣ末端側に５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介してｇＢＶＣ３７を付加し、このうち、Ｎ末端側がＵＬ１２８のものをＵＬ１２８－ＶＣ３７、Ｎ末端側がＵＬ１３０のものをＵＬ１３０－ＶＣ３７、Ｎ末端側がＵＬ１３１のものをＵＬ１３１－ＶＣ３７とした。
＜抗原調製＞
実施例１の検討によりＵＬ１２８、ＵＬ１３０、又はＵＬ１３１をｇＢのＮ末端側に融合すると凝集体含量の低下が認められたため、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０、又はＵＬ１３１をｇＢのＮ末端側に融合させた次のような各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体をデザインした。
ＵＬ１２８（配列番号６）にＣ１６２Ｓアミノ酸置換を加え、更にＣ末端側に５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介してｇＢｖ９を付加したものをＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ｇＢとした。
ＵＬ１２８（配列番号６）にＣ１６２Ｓアミノ酸置換を加え、更にＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してｇＢΔｄ４を付加したものをＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４とした。
ＵＬ１２８（配列番号６）、ＵＬ１３０（配列番号７）又はＵＬ１３１（配列番号８）遺伝子のＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してｇＢΔｄ４を付加し、このうち、Ｎ末端側がＵＬ１２８のものをＵＬ１２８－Δｄ４、Ｎ末端側がＵＬ１３０のものをＵＬ１３０－Δｄ４、Ｎ末端側がＵＬ１３１のものをＵＬ１３１－Δｄ４とした。
ｇＢｖ９のＳ１２８ａａ－Ｌ１３８ａａを欠損させ、末端のＲ１２７とＧ１３９をグリシンリンカーＧＧＧでつなぎ、Ｗ２１６ａａ－Ｙ２１８ａａを欠損させ、Ｎ型糖鎖を４か所導入（Ｄ７７Ｎ、Ｉ７９Ｔ／Ｅ５４４Ｎ、Ｐ５４６Ｔ／Ｌ５８８Ｎ、Ｐ５８９Ｇ／Ｋ６０９Ｎ、Ｒ６１０Ｔ、Ｍ６１１Ｔ）したものをｇＢＶＣ３７（配列番号３１）とした（特許文献４）。ｇＢＶＣ３７を発現する際はＮ末端に ＨＣＭＶ－ｇＢのシグナル配列（ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳ）（配列番号１９）を挿入した。
ＵＬ１２８（配列番号６）にＣ１６２Ｓアミノ酸置換を加え、Ｃ末端側に５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介してｇＢＶＣ３７を付加したものをＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７とした。
ＵＬ１２８（配列番号６）、ＵＬ１３０（配列番号７）又はＵＬ１３１（配列番号８）遺伝子のＣ末端側に５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２２）を介してｇＢＶＣ３７を付加し、このうち、Ｎ末端側がＵＬ１２８のものをＵＬ１２８－ＶＣ３７、Ｎ末端側がＵＬ１３０のものをＵＬ１３０－ＶＣ３７、Ｎ末端側がＵＬ１３１のものをＵＬ１３１－ＶＣ３７とした。
【0108】
各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングし、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドとした。
【0109】
また、ＨＣＭＶ Ｍｅｒｌｉｎ株に由来するペンタマーのエクトドメインのうち、ｇＨ（１－７１５ａａ、配列番号４）をコードする遺伝子、ｇＬ（１－２７８ａａ、配列番号５）をコードする遺伝子をそれぞれ人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。ここで、ｇＨのＣ末端には９アミノ酸のＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）が付加されるように設計した（以下、ｇＨと呼ぶときはこのＨｉｓ－ｔａｇを付加した配列を指す）。
【0110】
発現時には各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、
Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ、
ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ、
ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７／ＵＬ１３０－ＶＣ３７／ＵＬ１３１－ＶＣ３７、
ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、
ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、
ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１（ペンタマー）、
ｇＢｖ９
の計７種類であった。ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１はＨＣＭＶペンタマーのエクトドメインに相当し、以下「ペンタマー」と呼ぶ。発現はＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と同様の方法で行い、各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清を得た。また、ペンタマーの精製はＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と同様の方法で行った。
Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ、
ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ、
ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７／ＵＬ１３０－ＶＣ３７／ＵＬ１３１－ＶＣ３７、
ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、
ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、
ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１（ペンタマー）、
ｇＢｖ９
の計７種類であった。ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１はＨＣＭＶペンタマーのエクトドメインに相当し、以下「ペンタマー」と呼ぶ。発現はＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と同様の方法で行い、各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清を得た。また、ペンタマーの精製はＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と同様の方法で行った。
【0111】
＜免疫＞
ｇＢｖ９、ペンタマーを抗原として、モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ）に免疫を行った。各抗原は５μｇ／匹になるように、生理食塩水(大塚製薬)で調製し、アジュバントとして１０ｖ／ｖ％のＡｌｕｍ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ｖａｃ－ａｌｕ２５０）及び５０μｇ／匹のＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（ユーロフィン）を使用した。調製した抗原液を２週間間隔で３回、モルモット（雌 ３匹／群）に筋肉内接種（１００μＬ／片足、両足投与）し、最終免疫の２週間後にイソフルラン吸入麻酔下での心臓採血により全採血した。得られた血液は凝固促進剤入り分離管で血清分離した。血清分離後、３匹分の血清をプールし、ｇＢｖ９免疫血清とペンタマー免疫血清を得た。これを用いて、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の、ｇＢｖ９免疫血清及びペンタマー免疫血清に対する反応性評価を行った。
ｇＢｖ９、ペンタマーを抗原として、モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ）に免疫を行った。各抗原は５μｇ／匹になるように、生理食塩水(大塚製薬)で調製し、アジュバントとして１０ｖ／ｖ％のＡｌｕｍ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ｖａｃ－ａｌｕ２５０）及び５０μｇ／匹のＣｐＧ ＯＤＮ１８２６（ユーロフィン）を使用した。調製した抗原液を２週間間隔で３回、モルモット（雌 ３匹／群）に筋肉内接種（１００μＬ／片足、両足投与）し、最終免疫の２週間後にイソフルラン吸入麻酔下での心臓採血により全採血した。得られた血液は凝固促進剤入り分離管で血清分離した。血清分離後、３匹分の血清をプールし、ｇＢｖ９免疫血清とペンタマー免疫血清を得た。これを用いて、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の、ｇＢｖ９免疫血清及びペンタマー免疫血清に対する反応性評価を行った。
【0112】
＜血清を用いた反応性解析＞
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清の、各種免疫血清に対する反応性（結合活性）をＥＬＩＳＡによって評価した。Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ６ Ｈｉｓ Ａｂ（ＢＥＴＨＹＬ Ａ１９０－１１４）をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、４℃でオーバーナイトインキュベートすることによって固相化した。固相化後、ｐｌａｔｅをＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１時間以上静置してブロッキングを行った。ブロッキング後に１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液を捨て、取得した培養上清を１０倍希釈し、ｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、各種免疫血清をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ＨＲＰ－Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ６１４６２０）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ Ｔ－４４４４）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清の、各種免疫血清に対する反応性（結合活性）をＥＬＩＳＡによって評価した。Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ ６ Ｈｉｓ Ａｂ（ＢＥＴＨＹＬ Ａ１９０－１１４）をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、４℃でオーバーナイトインキュベートすることによって固相化した。固相化後、ｐｌａｔｅをＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１時間以上静置してブロッキングを行った。ブロッキング後に１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液を捨て、取得した培養上清を１０倍希釈し、ｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、各種免疫血清をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ＨＲＰ－Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ６１４６２０）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ Ｔ－４４４４）をｐｌａｔｅのｗｅｌｌに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ 硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。
【0113】
＜タンパク精製品のゲル濾過クロマトグラフィー＞
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品を５０μＬアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品を５０μＬアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
【0114】
＜結果＞
ＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清（ｇＢｖ９免疫血清）及びペンタマー免疫血清を用いた反応性解析の結果を図４に示す。図４によれば、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７／ＵＬ１３０－ＶＣ３７／ＵＬ１３１－ＶＣ３７、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢのいずれの組み合わせのｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体もＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清及びペンタマー免疫血清両方に対する反応性を有していた。また、ＵＬ１２８に対してＣ１６２Ｓの点変異を導入した場合、ペンタマー免疫血清に対する反応性の向上が認められた。さらに、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体のｇＢ部分がｇＢｖ９のものに比べ、ｇＢ部分をｇＢＶＣ３７若しくはｇＢΔｄ４としたｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の方がペンタマー免疫血清との反応が大きかった。
ＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清（ｇＢｖ９免疫血清）及びペンタマー免疫血清を用いた反応性解析の結果を図４に示す。図４によれば、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢ、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７／ＵＬ１３０－ＶＣ３７／ＵＬ１３１－ＶＣ３７、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、Ｎ－ＵＬ１２８－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３０－ｇＢ／Ｎ－ＵＬ１３１－ｇＢのいずれの組み合わせのｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体もＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清及びペンタマー免疫血清両方に対する反応性を有していた。また、ＵＬ１２８に対してＣ１６２Ｓの点変異を導入した場合、ペンタマー免疫血清に対する反応性の向上が認められた。さらに、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体のｇＢ部分がｇＢｖ９のものに比べ、ｇＢ部分をｇＢＶＣ３７若しくはｇＢΔｄ４としたｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の方がペンタマー免疫血清との反応が大きかった。
【0115】
また、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４及びＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４の精製品をゲルろ過クロマトグラフィーにて評価した結果を、図５に示す。各ピークの位置から推定される、それぞれのピークの主な成分を図示した。図５によれば、これらの精製品の三量体含量の増加が認められた。このことから、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体では、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質及びペンタマーが野生型配列でもＨＣＭＶ－ｇＢ免疫血清とペンタマー免疫血清に対する反応性を有し、さらにＨＣＭＶ ｇＢタンパク質又はペンタマーに適切な変異を導入することで、特にペンタマー部分をより本来の構造を維持した形でｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体として発現できることが示された。
【0116】
実施例３－１
＜抗原調製＞
実施例２の検討により、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質若しくはペンタマーに相当する領域に変異を導入したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを３種組み合わせて共発現することで、ｇＢ及びペンタマーとしての構造を保ったｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を発現できていることが示された。よってＨＣＭＶ ｇＢタンパク質又はペンタマーの構成タンパク質又はｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体のうち３種以上のタンパク質を組み合わせて共発現させることを目的として、さらに次の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドをデザインした。
＜抗原調製＞
実施例２の検討により、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質若しくはペンタマーに相当する領域に変異を導入したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを３種組み合わせて共発現することで、ｇＢ及びペンタマーとしての構造を保ったｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を発現できていることが示された。よってＨＣＭＶ ｇＢタンパク質又はペンタマーの構成タンパク質又はｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体のうち３種以上のタンパク質を組み合わせて共発現させることを目的として、さらに次の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドをデザインした。
【0117】
ｇＨ（配列番号４）をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものをｇＨ（Ｈｉｓ－）とした。また、ｇＬ（配列番号５）にＣ１４４Ｓアミノ酸置換を加えたものをコードするＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものをｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）とした。
【0118】
また、ｇＬ（配列番号５）のＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してｇＢＶＣ３７若しくはｇＢΔｄ４を付加した。このうち、Ｃ末端側がｇＢＶＣ３７のものをｇＬ－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ、Ｃ末端側がΔｄ４のものをｇＬ－Δｄ４とし、各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。
【0119】
また、ＵＬ１２８（配列番号６）又はＵＬ１３０（配列番号７）又はＵＬ１３１（配列番号８）のＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してｇＢＶＣ３７を連結した。このうち、Ｎ末端側がＵＬ１２８のものをＵＬ１２８－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ、Ｎ末端側がＵＬ１３０のものをＵＬ１３０－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ、Ｎ末端側がＵＬ１３１のものをＵＬ１３１－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａとし、各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体をコードするＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。
【0120】
これら各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、表１に示す計３１種類であった。発現はＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と同様の方法で行い、各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清を得た。また、精製はＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と同様の方法で行い、各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品を得た。
【表1】
【0121】
＜血清を用いた反応性解析＞
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清若しくは精製品の、各種免疫血清に対する反応性（結合活性）を実施例２と同様の方法により評価した。ただし、培養上清は１００倍に希釈したものを使用している点、また培養上清の代わりに精製品を用いて試験を行う場合は１μｇ／ｍＬで固相抗体と反応させている点が実施例２と異なる。
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の培養上清若しくは精製品の、各種免疫血清に対する反応性（結合活性）を実施例２と同様の方法により評価した。ただし、培養上清は１００倍に希釈したものを使用している点、また培養上清の代わりに精製品を用いて試験を行う場合は１μｇ／ｍＬで固相抗体と反応させている点が実施例２と異なる。
【0122】
評価の結果を図６～９に示す。図６～９の結果から、まずＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７／ＵＬ１３０－ＶＣ３７／ＵＬ１３１－ＶＣ３７に比べ、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７／ＵＬ１３０－ＶＣ３７／ＵＬ１３１－ＶＣ３７ではペンタマー免疫血清に対する反応性が向上しており、またＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４に比べ、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４ではペンタマー免疫血清に対する反応性が向上していることが確認された。このことから、ｇＨ及びｇＬが含まれることでｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体は本来のペンタマーの構造を取りやすいと考えられる。
【0123】
また、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７／ＵＬ１３０－ＶＣ３７／ＵＬ１３１－ ＶＣ３７に比べ、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－ＶＣ３７／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１ではペンタマー血清に対する反応性が低く、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４に比べ、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１ではペンタマー血清に対する反応性が低いこと、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４に比べ、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１ではペンタマー血清に対する反応性が低いことが観察された。このことから、ペンタマー構成分子のうち３分子はｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体として発現させた方が良いと考えられた。
【0124】
また、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４に比べ、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１／Δｄ４、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１／Δｄ４、ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１－Δｄ４／Δｄ４では反応性が低いことが観察された。このことから、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体においてペンタマー部分に天然構造を形成させるために、ペンタマー構成タンパク質と融合させていないｇＢを共発現させることは有効ではないと考えられる。
【0125】
また、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１２８－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１３０－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１２８－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１３１－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａと比べ、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４の方が、ｇＢｖ９免疫血清、ペンタマー免疫血清との反応性が高く、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１は、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４に比べ、ｇＢｖ９免疫血清及びペンタマー免疫血清との反応性が高いことが観察された。このことから、ＵＬ１２８とＵＬ１３０とＵＬ１３１のいずれかをｇＢと融合していない分子としてｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を発現させた場合、ｇＢ部分をΔｄ４型とすることでｇＢ、ペンタマーが天然に近い構造として発現され、特にＵＬ１３１をｇＢと融合していない分子とした場合に、ペンタマーの構造に関して、その傾向が顕著となると考えられる。
【0126】
＜タンパク精製品のゲル濾過クロマトグラフィー＞
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品を５０μＬアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を検出した。
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品を５０μＬアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を検出した。
【0127】
評価の結果を図１０～１３に示す。ペンタマー構成タンパク質のうちの１つのペンタマー構成分子とｇＢとしてのＶＣ３７又はΔｄ４とを融合させたｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体、他の４つのペンタマー構成タンパク質、及びペンタマー構成タンパク質と融合させていないＶＣ３７又はΔｄ４を共発現させたものでは凝集体以外の含量が高いことが確認された（図１０）が、ペンタマー構成タンパク質のうちの１つのペンタマー構成分子とｇＢとしてのＶＣ３７又はΔｄ４とを融合させたｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体、及び他の４つのペンタマー構成タンパク質を共発現させたものでは（ペンタマー構成タンパク質と融合させていないＶＣ３７又はΔｄ４を共発現させていない）、凝集体がメインピークであった（図１１（ｂ））。ペンタマー構成タンパク質の中で３つのペンタマー構成分子とｇＢを融合させた場合には、凝集体以外の含量が高い傾向が認められた（図１１～１３）が、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４（図１３（ｂ））の場合は、凝集体がメインピークであった。
【0128】
＜抗体価測定＞
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を実施例２と同様の方法により免疫し、免疫血清を取得した。この血清を用いて、ＨＣＭＶのｇＢタンパク質、ペンタマーに対する結合抗体価及び中和抗体価を評価した。
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を実施例２と同様の方法により免疫し、免疫血清を取得した。この血清を用いて、ＨＣＭＶのｇＢタンパク質、ペンタマーに対する結合抗体価及び中和抗体価を評価した。
【0129】
結合抗体価を評価するために、まずｇＢｖ９又はペンタマーをＰＢＳ（Ｗａｋｏ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ ｐｌａｔｅ （Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、４℃で一晩静置し抗原を固相化した。固相化後、ｐｌａｔｅをＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１時間以上静置してブロッキングを行った。ブロッキング後に１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液を捨て、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液で段階希釈した血清を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間静置後、ＰＢＳＴで洗浄した。これに１％ＢＳＡ／ＰＢＳ液で５０００倍に希釈したＨＲＰ－Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：６１４６２０）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間静置後、ＰＢＳＴで洗浄した。これにＴＭＢ（ｓｉｇｍａ：Ｔ４４４４）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３０分静置後、１Ｎ硫酸を添加することで反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。
【0130】
結果を図１４に示す。図１４の結果から、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１２８－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１３０－ＶＣ３７－Ｌ１５ａａ／ＵＬ１３１及びｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１を免疫したモルモット血清中にｇＢ結合抗体（図１４の（ａ））及びペンタマー結合抗体（図１４の（ｂ））が確認されたため、両ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体はワクチン抗原として免疫することでｇＢ抗体及びペンタマー抗体を誘導しうると考えられた。
【0131】
続いて、中和抗体価を評価するために、ＭＲＣ－５細胞を用いて線維芽細胞中和試験を、またＡＲＰＥ－１９細胞を用いて上皮細胞中和試験を行った。線維芽細胞中和試験では、試験用のウイルスとしてＨＣＭＶ ＡＤ－１６９株をＭＲＣ－５細胞にて継代したもの、上皮細胞中和試験では、ＨＣＭＶ ＡＤ－１６９株をＡＲＰＥ－１９細胞にて継代したものを使用した。
【0132】
線維芽細胞中和試験では、ＭＲＣ－５を用いて以下の手順にて行った。まず、ＭＲＣ－５懸濁液を準備し、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ－９６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ：６０５５７００）に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、５％ＣＯ２濃度、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。翌日、ウイルス希釈用培地（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．２１％ ＢＳＡ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＭＥＭ培地）にて免疫血清を希釈し、これにＨＣＭＶ ＡＤ－１６９株を終濃度２００ＴＣＩＤ５０／ｍＬとなるよう添加し、３７℃で１時間静置することでウイルス－血清混合液を調製した。このとき、ポジティブコントロールとして、免疫血清を含まないウイルス液も同様にして調製した。培養したＭＲＣ－５細胞をＰＢＳにて洗浄し、ウイルス－血清混合液若しくはウイルス液を３０μＬ／ｗｅｌｌ添加後、室温で４００ｇ、３０分の遠心を行った。その後、ウイルス－血清混合液若しくはウイルス液を除去し、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＭＥＭ培地にて洗浄後、同培地を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加して５％ＣＯ２濃度、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。翌日、細胞を同培地にて洗浄し、５０％アセトン／ＰＢＳ液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２０分静置した。その後５０％アセトン／ＰＢＳ液を除去し、０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ液にて洗浄後、さらに０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０分静置した。その後再び０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ液にて洗浄し、０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ液で１００倍に希釈したＣＭＶ ｐｐ７２／８６抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ：ｓｃ－６９７４８）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間静置した。これを０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ液にて洗浄後、０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ液でＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８）（ａｂｃａｍ：ａｂ１５０１１３）を終濃度１０００倍、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ：３４６－０７９５１）を終濃度５００倍に希釈した染色液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温にて１時間静置した。これを０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ液にて洗浄し、測定サンプルとした。測定はＩｍａｇｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ（モレキュラーデバイス）にて行い、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色により全細胞数を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ染色によりＨＣＭＶ感染細胞数を計数し、（ＨＣＭＶ感染細胞数）／（全細胞数）により感染率を算出した。さらに、１－（被検ウェルの感染率）／（ポジティブコントロールの感染率）とすることで感染阻害率（％）を算出した。この結果を図１５の（ａ）に示す。この結果から、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を投与することにより、ＨＣＭＶの線維芽細胞への侵入に対する中和抗体を誘導できることが示された。
【0133】
上皮細胞中和試験では、ＡＲＰＥ－１９を用いて、線維芽細胞中和試験とほぼ同様の手順にて行った。ただし、ウイルスとしてＡＲＰＥ－１９細胞にて継代馴化したＨＣＭＶ ＡＤ－１６９株を使用した点、またこれを終濃度７～８×１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬ含むものをウイルス血清混合液若しくはウイルス液とした点が線維芽細胞中和試験と異なる。結果を図１５の（ｂ）に示す。ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を投与することにより、ＨＣＭＶの上皮細胞への侵入に対する中和抗体を誘導できることが示された。
【0134】
実施例３－２－１
＜抗原調製＞
実施例３－１の検討により各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを５種組み合わせて共発現してもｇＢ、ペンタマーとしての構造を保っていることが示されたため、さらにｇＬのＣ１４４及びＵＬ１２８のＣ１６２の点変異の影響を精査すべく、次の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドをデザインした。ｇＬ（配列番号５）にＣ１４４Ｓアミノ酸置換を加えＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）、Δｄ４を付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものをｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）－Δｄ４とした。発現時には各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１の計３種類であった。また、精製はＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と同様の方法で行い、各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品を得た。
＜抗原調製＞
実施例３－１の検討により各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを５種組み合わせて共発現してもｇＢ、ペンタマーとしての構造を保っていることが示されたため、さらにｇＬのＣ１４４及びＵＬ１２８のＣ１６２の点変異の影響を精査すべく、次の各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドをデザインした。ｇＬ（配列番号５）にＣ１４４Ｓアミノ酸置換を加えＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）、Δｄ４を付加した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものをｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）－Δｄ４とした。発現時には各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１の計３種類であった。また、精製はＨＣＭＶ ｇＢタンパク質と同様の方法で行い、各ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の精製品を得た。
【0135】
＜免疫＞
実施例２と同様の方法により、ｇＢΔｄ４又はペンタマー又はｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１又はｓａｌｉｎｅをモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ）に免疫し、ｇＢΔｄ４免疫血清及びペンタマー免疫血清及びｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清及びｓａｌｉｎｅ免疫血清を得た。
実施例２と同様の方法により、ｇＢΔｄ４又はペンタマー又はｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１又はｓａｌｉｎｅをモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ）に免疫し、ｇＢΔｄ４免疫血清及びペンタマー免疫血清及びｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清及びｓａｌｉｎｅ免疫血清を得た。
【0136】
＜血清を用いた反応性解析＞
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体について、ｇＢΔｄ４、ペンタマー（ＰＣ）、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１（Δｄ４／ＰＣ）及びｓａｌｉｎｅ免疫血清に対する反応性（結合活性）を実施例２と同様の方法によって評価した。これを図１６～１９に示す。この結果から、ｇＬのＣ１４４及びＵＬ１２８のＣ１６２の点変異は血清との反応性に影響しないことが示唆された。
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体について、ｇＢΔｄ４、ペンタマー（ＰＣ）、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１（Δｄ４／ＰＣ）及びｓａｌｉｎｅ免疫血清に対する反応性（結合活性）を実施例２と同様の方法によって評価した。これを図１６～１９に示す。この結果から、ｇＬのＣ１４４及びＵＬ１２８のＣ１６２の点変異は血清との反応性に影響しないことが示唆された。
【0137】
＜タンパク精製品のゲル濾過クロマトグラフィー＞
取得したｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、及び、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１の精製品の性状をゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品を５０μＬアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を検出した。結果を図２０に示す。この結果及び図１２（ｄ）から、ｇＬのＣ１４４及びＵＬ１２８のＣ１６２の点変異導入は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離パターンに変化を及ぼさないことが示された。
取得したｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、及び、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１の精製品の性状をゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品を５０μＬアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を検出した。結果を図２０に示す。この結果及び図１２（ｄ）から、ｇＬのＣ１４４及びＵＬ１２８のＣ１６２の点変異導入は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離パターンに変化を及ぼさないことが示された。
【0138】
＜タンパク質精製品の粒子径評価＞
取得したｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１融合タンパク質の粒子径分布を動的光散乱によって評価した。各組換えタンパクをＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で０．２又は０．３ｍｇ／ｍＬに希釈し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により粒子径分析を実施した。測定には石英セルを用い、測定条件は温度２５．０℃であった。これを図２１に示す。なお、図２１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のピークは３回の結果を示し、表に示す数字は３回の平均値である。この結果から、ｇＬのＣ１４４及びＵＬ１２８のＣ１６２の点変異導入は、粒子径分布に影響を及ぼさないことが示された。
取得したｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ（Ｃ１４４Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１融合タンパク質の粒子径分布を動的光散乱によって評価した。各組換えタンパクをＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で０．２又は０．３ｍｇ／ｍＬに希釈し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により粒子径分析を実施した。測定には石英セルを用い、測定条件は温度２５．０℃であった。これを図２１に示す。なお、図２１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のピークは３回の結果を示し、表に示す数字は３回の平均値である。この結果から、ｇＬのＣ１４４及びＵＬ１２８のＣ１６２の点変異導入は、粒子径分布に影響を及ぼさないことが示された。
【0139】
実施例３－２－２
＜抗原調製＞
各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４の計２種類であった。また、精製は全てＨＣＭＶのｇＢタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
＜抗原調製＞
各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４の計２種類であった。また、精製は全てＨＣＭＶのｇＢタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
【0140】
＜タンパク精製品のゲル濾過クロマトグラフィー＞
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品を５０μＬアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を検出した。結果を図２８に示す。この結果から、ＵＬ１２８のＣ１６２の点変異導入は、ゲルろ過クロマトグラフィーによるピークの溶出位置には変化を及ぼさないことが示された。
取得した精製品の性状はゲル濾過クロマトグラフィーによって評価した。カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各精製品を５０μＬアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）を使用し、波長２８０ｎｍの吸光度を検出した。結果を図２８に示す。この結果から、ＵＬ１２８のＣ１６２の点変異導入は、ゲルろ過クロマトグラフィーによるピークの溶出位置には変化を及ぼさないことが示された。
【0141】
＜タンパク質精製品の粒子径評価＞
取得したｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４融合タンパク質の粒子径分布を動的光散乱によって評価した。各組換えタンパクをＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で０．２又は０．３ｍｇ／ｍＬに希釈し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により粒子径分析を実施した。測定には石英セルを用い、測定条件は温度２５．０℃であった。これを図２９に示す。なお、図２９のピークは３回の結果を示し、表に示す数字は３回の平均値である。この結果から、ＵＬ１２８のＣ１６２の点変異導入は、粒子径分布に影響を及ぼさないことが示された。
取得したｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４融合タンパク質の粒子径分布を動的光散乱によって評価した。各組換えタンパクをＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で０．２又は０．３ｍｇ／ｍＬに希釈し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により粒子径分析を実施した。測定には石英セルを用い、測定条件は温度２５．０℃であった。これを図２９に示す。なお、図２９のピークは３回の結果を示し、表に示す数字は３回の平均値である。この結果から、ＵＬ１２８のＣ１６２の点変異導入は、粒子径分布に影響を及ぼさないことが示された。
【0142】
実施例３－２－３
＜抗原調製＞
各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ｇＢｖ９、ペンタマー、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１及びｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４の計４種類であった。また、精製は全てＨＣＭＶのｇＢタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
＜抗原調製＞
各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ｇＢｖ９、ペンタマー、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１及びｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４の計４種類であった。また、精製は全てＨＣＭＶのｇＢタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
【0143】
＜免疫＞
実施例２と同様の方法により、ｇＢｖ９、ペンタマー、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、又は、ｓａｌｉｎｅをモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ）に免疫し、ｇＢｖ９免疫血清、ペンタマー免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４免疫血清及びｓａｌｉｎｅ免疫血清を得た。
実施例２と同様の方法により、ｇＢｖ９、ペンタマー、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、又は、ｓａｌｉｎｅをモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ）に免疫し、ｇＢｖ９免疫血清、ペンタマー免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４免疫血清及びｓａｌｉｎｅ免疫血清を得た。
【0144】
＜血清を用いた結合抗体価測定＞
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体について、ｇＢｖ９免疫血清、ペンタマー免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４免疫血清及びｓａｌｉｎｅ免疫血清に対する反応性（結合活性）を実施例２と同様の方法によって評価した。結合抗体価の評価結果を図３０に示す。この結果から、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を投与することにより、ｇＢ抗体及びペンタマー抗体を誘導しうると考えられた。
取得したｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体について、ｇＢｖ９免疫血清、ペンタマー免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４免疫血清及びｓａｌｉｎｅ免疫血清に対する反応性（結合活性）を実施例２と同様の方法によって評価した。結合抗体価の評価結果を図３０に示す。この結果から、ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体を投与することにより、ｇＢ抗体及びペンタマー抗体を誘導しうると考えられた。
【0145】
＜血清を用いた中和抗体価測定＞
取得したｇＢｖ９免疫血清、ペンタマー免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４免疫血清及びｓａｌｉｎｅ免疫血清を用いて、実施例３－１と同様の方法によって、中和抗体価を評価した。ただし、ＭＲＣ－５細胞を用いた線維芽細胞中和試験、ＡＲＰＥ－１９細胞を用いた上皮細胞中和試験のいずれもウイルスとしてＡＲＰＥ－１９細胞にて継代馴化したＨＣＭＶ ＡＤ－１６９株を使用した点が実施例３－１と異なる。中和抗体価の評価結果を図３１に示す。
取得したｇＢｖ９免疫血清、ペンタマー免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４免疫血清及びｓａｌｉｎｅ免疫血清を用いて、実施例３－１と同様の方法によって、中和抗体価を評価した。ただし、ＭＲＣ－５細胞を用いた線維芽細胞中和試験、ＡＲＰＥ－１９細胞を用いた上皮細胞中和試験のいずれもウイルスとしてＡＲＰＥ－１９細胞にて継代馴化したＨＣＭＶ ＡＤ－１６９株を使用した点が実施例３－１と異なる。中和抗体価の評価結果を図３１に示す。
【0146】
図３０から、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１免疫血清、及び、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４免疫血清にｇＢ結合抗体（図３０の（ａ））及びペンタマー結合抗体（図３０の（ｂ））が確認されたため、両ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体はワクチン抗原として免疫することで抗ｇＢ抗体及び抗ペンタマー抗体を誘導しうると考えられた。図３１からｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体のｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、及びｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４を投与することにより、ＨＣＭＶの線維芽細胞及び上皮細胞への侵入に対する中和抗体を誘導できることが示された。
【0147】
実施例４
＜ｇＢ－ペンタマー融合タンパク質の安定性評価＞
各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ｇＢｖ９、ペンタマー、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１の計６種類であった。また、精製は全てＨＣＭＶのｇＢタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
＜ｇＢ－ペンタマー融合タンパク質の安定性評価＞
各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ｇＢｖ９、ペンタマー、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１の計６種類であった。また、精製は全てＨＣＭＶのｇＢタンパク質と同様の方法で行い、タンパク質精製品を得た。
【0148】
取得した組換えｇＢ、組換えペンタマー、組換えｇＢ及び組換えペンタマーの等量混合物、組換えｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体の安定性は、動的光散乱によって評価した。各組換えタンパク質をＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、３７℃で０日、１日、３日、７日静置することによって加速試験を行った。この時、１日以上静置するタンパク質にはプロテアーゼインヒビター（Ｗａｋｏ、１６５－２６０２１）を１／１００量添加し、各試験後のタンパク質は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）により粒子径分析を実施した。測定には石英セルを用い、測定条件は温度２５．０℃であった。得られた粒子径分布のうち、目的物と考えられる粒子径（＜１００ｎｍ）の粒子を「単粒子」、目的物よりも大きく、かつ粒子径１０００ｎｍ未満のものを「凝集（小）」、粒子径が１０００ｎｍを超えるものを「凝集（大）」とした。
【0149】
各粒子の分布を表したものを図２２、２３及び３２に示す。この結果から、ペンタマーは経時的に凝集（大）の含量が増加していることが観察されたが、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、及びｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、は、ほとんどが単量体のまま存在していた。このことから、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４、及びｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１では、ペンタマーと比べ安定性が向上していることが明らかとなった。
【0150】
実施例５
＜抗原調製＞
刺激抗原として、実施例４と同様の手順でｇＢｖ９、ペンタマー、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４を発現精製した。
＜抗原調製＞
刺激抗原として、実施例４と同様の手順でｇＢｖ９、ペンタマー、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４を発現精製した。
【0151】
＜細胞性免疫評価＞
ヒトＰＢＭＣを用いた細胞性免疫評価は、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳ（ＭＡＢＴＥＣＨ ３４２０－４ＨＳＴ－２）を用いたＥＬＩＳｐｏｔ ａｓｓａｙにより行った。ヒトＰＢＭＣはＣＴＬ社製のうち、ＨＣＭＶ抗原刺激に対するＩＦＮγ誘導が認められるドナー２３名のものを選択した。
ヒトＰＢＭＣを用いた細胞性免疫評価は、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳ（ＭＡＢＴＥＣＨ ３４２０－４ＨＳＴ－２）を用いたＥＬＩＳｐｏｔ ａｓｓａｙにより行った。ヒトＰＢＭＣはＣＴＬ社製のうち、ＨＣＭＶ抗原刺激に対するＩＦＮγ誘導が認められるドナー２３名のものを選択した。
【0152】
ＣＴＬ Ａｎｔｉ－Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ（２０×）（ＣＴＬ）を３７℃に設定したウォーターバスで１０ｍｉｎ温め解凍し、ＲＰＭＩ－１６４０で希釈してＣＴＬ Ａｎｔｉ－Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ（１×）を調製し、使用まで３７℃のＣＯ２インキュベーターで２０ｍｉｎ以上静置した。ＣＴＬ－Ｔｅｓｔ ＭｅｄｉｕｍはＬ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（１００×）を１ｖｏｌ％添加し３７℃のＣＯ２インキュベーターで２０ ｍｉｎ以上静置した。ＰＢＭＣが入ったバイアルを３７℃のウォーターバスで８ｍｉｎ温め、解凍後ＣＴＬ Ａｎｔｉ－Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ（１×）を穏やかに加え、細胞溶液とした。細胞溶液を遠心（３３０ｇ、１０ｍｉｎ、ＲＴ）し上清を除去後、ＣＴＬ Ａｎｔｉ－Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ（１×）を１０ｍＬ添加し再度遠心（３３０ｇ、１０ｍｉｎ、ＲＴ）し上清を除去後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで静置していたＣＴＬ－Ｔｅｓｔ Ｍｅｄｉｕｍで希釈してＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙに用いた。
【0153】
Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳのストリップの必要数を２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで４回洗浄し、ＣＴＬ－Ｔｅｓｔ Ｍｅｄｉｕｍを２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３０ｍｉｎ以上室温に静置した。ＣＴＬ－Ｔｅｓｔ Ｍｅｄｉｕｍをプレートから除き、細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した後、２μｇ／ｍＬに希釈した抗原溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、懸濁した。プレートを遮光し３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内において１２～４８ｈｒ静置培養した。培養後、培地とともに細胞を除去し２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄した。Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳに付属の検出抗体溶液（７－６－１－ｂｉｏｔｉｎ）をＰＢＳ－０．５％ ＦＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、２ｈｒ室温にて静置した。反応後、２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄し、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳに付属の標識抗体溶液（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）をＰＢＳ－０．５％ ＦＢＳで１０００倍希釈し１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、１ｈｒ室温にて静置した。反応後、２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳで５回洗浄し、Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳに付属のＴＭＢ溶液を必要量０．２２μｍフィルターに通し１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、明瞭にスポットが観察されるまで室温に静置した（約５～３０ｍｉｎ）。プレートを２００μＬ／ｗｅｌｌのＤＷで３回洗浄した後乾燥させ、ＥＬＩＳＰＯＴカウンターにてスポット数のカウントを行った。
【0154】
２ウェル分のスポット数の平均値を測定結果とした。なお、ネガティブコントロールのみ４ウェル分のスポット数の平均値を測定結果とした。スポット数の平均値が、０より大きく５未満の場合に「０」、５以上５０未満の場合に「１」、５０以上１００未満の場合に「２」、１００以上の場合に「３」のスコアを付与し、抗原毎に全ドナーのスコアを合計した。これをグラフ化したものを図２４に示す。この結果から、ｇＢｖ９及びペンタマーと比べ、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１、ｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４では、より高いＩＦＮγ産生が起こっていると考えられた。
【0155】
実施例６
＜ＧＰＣＭＶ－ｇＢの調製＞
モルモット経胎盤感染モデル系を用いて評価するため、モルモットに感染性を示すモルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）を用いた。組換えＧＰＣＭＶ ｇＢタンパク質は凝集体を含む場合があるため、凝集体を含まない、性状改善した改変ＧＰＣＭＶ ｇＢタンパク質を作製した。
＜ＧＰＣＭＶ－ｇＢの調製＞
モルモット経胎盤感染モデル系を用いて評価するため、モルモットに感染性を示すモルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）を用いた。組換えＧＰＣＭＶ ｇＢタンパク質は凝集体を含む場合があるため、凝集体を含まない、性状改善した改変ＧＰＣＭＶ ｇＢタンパク質を作製した。
【0156】
ＧＰＣＭＶ ２２１２２株に由来するｇＢのエクトドメイン（１－６５６ａａ）にシグナル配列を付加し、さらに性状改善のためのアミノ酸変異を導入したｇＢ（配列番号１７、１－６９２ａａ；ＧＰＣＭＶ－ｇＢエクトドメイン改変体）をコードする遺伝子を人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。ｇＢのＣ末端には９アミノ酸のＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）が付加されるようにデザインした。発現には、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクノロジーズ社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。ＧＰＣＭＶ ｇＢを含む培養上清から、Ｎｉ ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ＰＢＳ＋０．５Ｍ Ａｒｇｉｎｉｎｅに対して透析を行い、改変ＧＰＣＭＶ ｇＢタンパク質のエクトドメイン（以下、「ＧＰＣＭＶ－ｇＢ」と呼ぶ）の精製品を得た（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４７９６６号）。
【0157】
＜ＧＰＣＭＶペンタマーの調製＞
次に、ＧＰＣＭＶ ２２１２２株に由来するペンタマーのエクトドメインを調製した。ＧＰＣＭＶペンタマーのエクトドメインの可溶性発現に関しては報告例がなかったため、ＨＣＭＶペンタマーのエクトドメインの可溶性発現の報告例（非特許文献１４）を参考に、以下に述べるようにデザインし、発現プラスミドを構築した。
次に、ＧＰＣＭＶ ２２１２２株に由来するペンタマーのエクトドメインを調製した。ＧＰＣＭＶペンタマーのエクトドメインの可溶性発現に関しては報告例がなかったため、ＨＣＭＶペンタマーのエクトドメインの可溶性発現の報告例（非特許文献１４）を参考に、以下に述べるようにデザインし、発現プラスミドを構築した。
【0158】
ＨＣＭＶのｇＨのオルソログであるＧＰＣＭＶのＧＰ７５（配列番号１０）のうちエクトドメインである１－６９８ａａ（配列番号１８）をコードする遺伝子を人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。ＧＰ７５のＣ末端には９アミノ酸のＨｉｓ－ｔａｇ（配列番号３０）が付加されるようにデザインした。さらに、ＨＣＭＶのｇＬのオルソログであるＧＰＣＭＶのＧＰ１１５（１－２５８ａａ、配列番号１１）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１２８のオルソログであるＧＰＣＭＶのＧＰ１２９（１－１７９ａａ、配列番号１２）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１３０のオルソログであるＧＰＣＭＶのＧＰ１３１（１－１９２ａａ、配列番号１３）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１３１のオルソログであるＧＰＣＭＶのＧＰ１３３（１－１２７ａａ、配列番号１４）をコードする遺伝子をそれぞれ人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。以上の５種類のタンパク質を共発現させた。発現及び精製はＧＰＣＭＶ－ｇＢと同様の方法で行い、ＧＰＣＭＶペンタマーのエクトドメイン（以下、「ＧＰＣＭＶペンタマー」と呼ぶ）精製品を得た（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４７９６６号）。
【0159】
＜ＧＰＣＭＶ－ｇＢ－ペンタマー融合タンパク質の調製及び性状解析＞
次に、ＧＰＣＭＶ－ｇＢエクトドメイン改変体（配列番号１７）の１１１－４７５ａａと６４１－６９２ａａとをＧＧＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号２０）の９アミノ酸でつなぎ、さらに、このＣ末端にＨｉｓ－ｔａｇ配列（配列番号３０）を付加したものをＧＰＣＭＶ－Δｄ４（配列番号３２）とし、ＧＰＣＭＶ－Δｄ４をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。また、ＧＰ７５のエクトドメインをコードする遺伝子のＣ末端にＨｉｓ－ｔａｇが付加されないものをデザインし、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものをＧＰ７５（Ｈｉｓ－）とした。
次に、ＧＰＣＭＶ－ｇＢエクトドメイン改変体（配列番号１７）の１１１－４７５ａａと６４１－６９２ａａとをＧＧＧＳＧＳＧＧＧ（配列番号２０）の９アミノ酸でつなぎ、さらに、このＣ末端にＨｉｓ－ｔａｇ配列（配列番号３０）を付加したものをＧＰＣＭＶ－Δｄ４（配列番号３２）とし、ＧＰＣＭＶ－Δｄ４をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。また、ＧＰ７５のエクトドメインをコードする遺伝子のＣ末端にＨｉｓ－ｔａｇが付加されないものをデザインし、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものをＧＰ７５（Ｈｉｓ－）とした。
【0160】
次に、上記遺伝子をもとにＧＰ１１５、ＧＰ１２９、ＧＰ１３１又はＧＰ１３３のＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してＧＰＣＭＶ－Δｄ４を連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものを、それぞれＧＰ１１５－Δｄ４、ＧＰ１２９－Δｄ４、ＧＰ１３１－Δｄ４、又はＧＰ１３３－Δｄ４とした。発現時には各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４であった。発現及び精製はＧＰＣＭＶ－ｇＢと同様の方法で行った。
【0161】
ゲル濾過クロマトグラフィーによる分析（図２５の（ａ）、（ｂ））を実施したところ、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３では、ＨＣＭＶのｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ－Δｄ４／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１（実施例３－２－１、図２０の（ａ））と同様の位置にピークが確認され、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４では、ＨＣＭＶのｇＨ（Ｈｉｓ－）／ｇＬ／ＵＬ１２８－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４（実施例３－２－２、図２８の（ｂ））と同様の位置にピークが確認された。
【0162】
＜ＧＰＣＭＶ－Δｄ４－ＵＬｓの調製及び性状解析＞
次に、上記遺伝子をもとに、ＧＰ１３３のＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してＧＰＣＭＶ－Δｄ４を連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものを、ＧＰ１３３－Δｄ４とした。また、ＧＰ１２９－Δｄ４をベースにＧＰ１１５とＧＰ１２９のジスルフィド結合部位を解離させると考えられるＣ１６７Ｓ改変を加えたものをＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４とした。発現時には各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４であった。発現及び精製はＧＰＣＭＶ－ｇＢと同様の方法で行い、ＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４（ＧＰＣＭＶ－Δｄ４－ＵＬｓ）精製品を得た。
次に、上記遺伝子をもとに、ＧＰ１３３のＣ末端側に１５アミノ酸のリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号２３）を介してＧＰＣＭＶ－Δｄ４を連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって作製し、該ＤＮＡ断片をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングしたものを、ＧＰ１３３－Δｄ４とした。また、ＧＰ１２９－Δｄ４をベースにＧＰ１１５とＧＰ１２９のジスルフィド結合部位を解離させると考えられるＣ１６７Ｓ改変を加えたものをＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４とした。発現時には各種ｇＢ－ペンタマー構成タンパク質融合体発現プラスミドを組み合わせて共発現を行った。組み合わせた発現プラスミドは、ＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４であった。発現及び精製はＧＰＣＭＶ－ｇＢと同様の方法で行い、ＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４（ＧＰＣＭＶ－Δｄ４－ＵＬｓ）精製品を得た。
【0163】
ゲル濾過クロマトグラフィーによる分析（図２５の（ｃ））を実施したところ、ＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４では、ＨＣＭＶのＵＬ１２８（Ｃ１６２Ｓ）－Δｄ４／ＵＬ１３０－Δｄ４／ＵＬ１３１－Δｄ４（実施例３－１、図１１の（ｃ））と同様の位置にピークが観察された。
【0164】
＜胎盤感染防御試験＞
Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（雌、５週齢）に対し、ＧＰＣＭＶ－ｇＢ、ＧＰＣＭＶペンタマー、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３及びＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４（ＧＰＣＭＶ－Δｄ４－ＵＬｓ）を免疫した。各抗原は０．００１６μｇ／匹になるように生理食塩水（大塚製薬）で調製し、アジュバントとして１０ｖ／ｖ％のＡｌｕｍ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ｖａｃ－ａｌｕ２５０）及び５０μｇ／匹のＣｐＧ ＯＤＮ１８２６を使用した。調製した抗原液を２週間間隔で２回、モルモットに筋肉内接種（１００μＬ／片足、後肢両足投与）し、２回免疫の２週後からＨａｒｔｌｅｙモルモット（♂、９週齢以上）と交配を行い、妊娠モルモットを作製した。この時、ＰＢＳ投与群も同様にして交配を行った。免疫群、ＰＢＳ群（ｓａｌｉｎｅ群）ともに、妊娠４週齢時点で野生型ＧＰＣＭＶを１×１０６ｐｆｕ／匹皮下投与し、３週後にペントバルビタールナトリウムにて安楽殺後、胎盤を採取した。採取した胎盤はｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク）により破砕し、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ９６（Ｒｏｃｈｅ）にてＤＮＡ抽出を行った。得られたＤＮＡは７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）を用い、表２に示すプローブ、プライマーセット（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４７９６６号）にてＧＰＣＭＶ ｇｐ８３遺伝子、細胞由来のβａｃｔｉｎ遺伝子の定量を行った。
Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（雌、５週齢）に対し、ＧＰＣＭＶ－ｇＢ、ＧＰＣＭＶペンタマー、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３及びＧＰ１２９（Ｃ１６７Ｓ）－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４（ＧＰＣＭＶ－Δｄ４－ＵＬｓ）を免疫した。各抗原は０．００１６μｇ／匹になるように生理食塩水（大塚製薬）で調製し、アジュバントとして１０ｖ／ｖ％のＡｌｕｍ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ ｖａｃ－ａｌｕ２５０）及び５０μｇ／匹のＣｐＧ ＯＤＮ１８２６を使用した。調製した抗原液を２週間間隔で２回、モルモットに筋肉内接種（１００μＬ／片足、後肢両足投与）し、２回免疫の２週後からＨａｒｔｌｅｙモルモット（♂、９週齢以上）と交配を行い、妊娠モルモットを作製した。この時、ＰＢＳ投与群も同様にして交配を行った。免疫群、ＰＢＳ群（ｓａｌｉｎｅ群）ともに、妊娠４週齢時点で野生型ＧＰＣＭＶを１×１０６ｐｆｕ／匹皮下投与し、３週後にペントバルビタールナトリウムにて安楽殺後、胎盤を採取した。採取した胎盤はｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク）により破砕し、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ９６（Ｒｏｃｈｅ）にてＤＮＡ抽出を行った。得られたＤＮＡは７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ）を用い、表２に示すプローブ、プライマーセット（国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４７９６６号）にてＧＰＣＭＶ ｇｐ８３遺伝子、細胞由来のβａｃｔｉｎ遺伝子の定量を行った。
【表2】
【0165】
細胞１０５個当たりのｇｐ８３遺伝子、すなわちウイルスコピー数を図２６に示す。このとき、定量下限値は細胞１０５個当たり１０コピーとした。図２６の結果から、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３はＧＰＣＭＶ－ｇＢ、ＧＰＣＭＶペンタマー及びＧＰＣＭＶ－Δｄ４－ＵＬｓよりも高い感染防御能を持つことが示された。
【0166】
実施例７
＜経胎盤感染防御試験＞
実施例６と同様の方法により、ＧＰＣＭＶ－ｇＢ、ＧＰＣＭＶペンタマー、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４を発現、調製した。
＜経胎盤感染防御試験＞
実施例６と同様の方法により、ＧＰＣＭＶ－ｇＢ、ＧＰＣＭＶペンタマー、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４を発現、調製した。
【0167】
Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（雌、５週齢）に対し、ＧＰＣＭＶ－ｇＢ、ＧＰＣＭＶペンタマー、ＧＰＣＭＶ－ｇＢ及びＧＰＣＭＶペンタマーの混合、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４を０．２μｇ／匹の用量で実施例６と同様の方法により免疫、交配を行った。ＧＰＣＭＶ－ｇＢ及びＧＰＣＭＶペンタマーの混合については０．１μｇずつを混合し、０．２μｇ／匹とした。またこの時、ＰＢＳ投与群も同様にして交配を行った。免疫群、ＰＢＳ群（ｓａｌｉｎｅ群）ともに、妊娠４週齢時点で野生型ＧＰＣＭＶを１×１０７ｐｆｕ／匹皮下投与し攻撃した。攻撃から３週後にペントバルビタールナトリウムにて安楽殺後、母体、胎仔の解剖を行い、母体から唾液腺と胎盤、胎仔から膵臓の採取を行った。母体の唾液腺と胎盤は適量のＰＢＳとともに、それぞれｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク）により破砕した。胎仔の膵臓は適量のＰＢＳとともにＦａｓｔＰｒｅｐ２４（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）により破砕した。母体の唾液腺、胎盤、胎仔の膵臓は、それぞれのホモジネート液をＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ９６（Ｒｏｃｈｅ）にてＤＮＡ抽出を行った。得られたＤＮＡから、実施例６と同様の方法により、細胞１０５個当たりのウイルスコピー数の定量を行った。このとき、定量下限値は細胞１０５個当たり１コピーとした。
【0168】
この結果を図２７に示す。ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４の免疫群では、胎仔において完全な感染防御が確認された。また、母体、胎盤においても、明確な感染抑制効果が見られた。ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５－Δｄ４／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３、ＧＰ７５（Ｈｉｓ－）／ＧＰ１１５／ＧＰ１２９－Δｄ４／ＧＰ１３１－Δｄ４／ＧＰ１３３－Δｄ４が母体と胎仔の両者に対して効果を示したことから、本発明のワクチン抗原は先天性感染予防に有用であることに加えて、健常者や移植患者、ＡＩＤＳ患者等におけるサイトメガロウイルス感染症の予防にも有効であることが強く示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【配列表】