特許 7272952 内因性および起源ＤＮＡのワンショットガイドＲＮＡ（ｏｇＲＮＡ）標的化のためのシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-01

(45)【発行日】2023-05-12

(54)【発明の名称】内因性および起源ＤＮＡのワンショットガイドＲＮＡ（ｏｇＲＮＡ）標的化のためのシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20230502BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230502BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230502BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230502BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230502BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20230502BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/09 110

C12N15/86 Z

C12N15/864 100Z

C12N9/22

【請求項の数】 68

(21)【出願番号】P 2019530105

(86)(22)【出願日】2017-12-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-12-19

(86)【国際出願番号】 US2017064720

(87)【国際公開番号】W WO2018106693

(87)【国際公開日】2018-06-14

【審査請求日】2020-12-02

(31)【優先権主張番号】62/503,640

(32)【優先日】2017-05-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/430,154

(32)【優先日】2016-12-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517372508

【氏名又は名称】エディタス・メディシン、インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】フリートラント， アリ イー．

(72)【発明者】

【氏名】ジャヤラム， ハリハラン

(72)【発明者】

【氏名】スタインバーグ， ベレット イーサン

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／０７００８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】MOORE, R., et al.，"CRISPR-based self-cleaving mechanism for cotrollable gene delivery in human cells."，NUCLEIC ACIDS RESEARCH，2014年12月18日，Vol.43, No.2，pp.1297-1303，DOI: 10.1093/nar/gku1326，[Published online]

【文献】LIU, K.I., et al.，"A chemical-inducible CRISPR-Cas9 system for rapid control of genome editing."，NATURE CHEMICAL BIOLOGY，2016年09月12日，Vol.12, No.11，pp.980-987+Online Methods+Supplementary，DOI: 10.1038/nchembio.2179，[Published online]

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

真核生物核酸配列を含んでなるＣａｓ９タンパク質をコードする核酸分子であって、前記真核生物核酸配列が、少なくとも１７ヌクレオチド長であり、前記Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでなるか、またはそれに隣接し、
核酸分子がｃ．８１３＿８１４ｉｎｓＮ_{２４－３６}、ｃ．１１１３＿１１１４ｉｎｓＮ_{２４－３６}、およびｃ．２２１１＿２２１２ｉｎｓＮ_{２４－３６}からなる群から選択される、配列番号６に対する挿入を含む、またはＣａｓ９タンパク質がＥ２７１＿Ｎ２７２ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇ、Ｌ３７１＿Ｎ３７２ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇ、およびＱ７３７＿Ａ７３８ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇからなる群から選択される、配列番号２に対するアミノ酸挿入を含む、
核酸分子。

【請求項2】

前記ＰＡＭに隣接する前記真核生物核酸配列の一部に相補的な標的化ドメインを含んでなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードする、請求項１に記載の核酸分子。

【請求項3】

前記ｇＲＮＡの前記標的化ドメインが１６～２４ヌクレオチド長である、請求項２に記載の核酸分子。

【請求項4】

前記真核生物核酸配列がＣａｓ９コード配列中にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項5】

前記真核生物核酸配列が前記Ｃａｓ９タンパク質の修飾部分をコードする、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項6】

前記真核生物核酸配列が、その３'および５'各末端に、グリシン、アラニン、またはバリンのための少なくとも１つのコドンを含む核酸分子の部分内にある、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項7】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端またはその付近に、配列番号２に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項8】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号３～５および１０からなる群から選択される配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項9】

配列番号７～９および１１からなる群から選択される配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項10】

配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含んでなり、ｃ．１５７ｉｎｓＮ_{１９～３６}の挿入を含んでなる配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＣａｓ９タンパク質を含んでなる、一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項12】

前記システムが、細胞内因性標的遺伝子と前記Ｃａｓ９タンパク質の発現との双方を改変する、請求項１１に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項13】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質の少なくとも８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項１１または１２に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ウイルスベクター。

【請求項15】

前記ウイルスベクターを使用して、細胞内因性標的遺伝子と前記Ｃａｓ９タンパク質の発現との双方が改変される、請求項１４に記載のウイルスベクター。

【請求項16】

前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１４または１５に記載のベクター。

【請求項17】

前記ｇＲＮＡの標的部位が前記ベクター骨格内にある、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項18】

配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる、請求項１６または１７に記載のベクター。

【請求項19】

真核生物核酸配列に相補的な標的化ドメインを含んでなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および
真核生物ヌクレオチド配列とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを含んでなる核酸分子によってコードされる、操作されたＣａｓ９タンパク質
を含んでなり、前記ＰＡＭが、前記Ｃａｓ９タンパク質によって認識され、前記真核生物ヌクレオチド配列中にあるか、またはそれに隣接し、
Ｃａｓ９タンパク質がＥ２７１＿Ｎ２７２ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇ、Ｌ３７１＿Ｎ３７２ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇ、およびＱ７３７＿Ａ７３８ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇからなる群から選択される、配列番号２に対するアミノ酸挿入を含む、または核酸分子がｃ．８１３＿８１４ｉｎｓＮ_{２４－３６}、ｃ．１１１３＿１１１４ｉｎｓＮ_{２４－３６}、およびｃ．２２１１＿２２１２ｉｎｓＮ_{２４－３６}からなる群から選択される、配列番号６に対する挿入を含む、
一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項20】

前記操作されたＣａｓ９タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項１９に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項21】

前記Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が前記核酸分子を切断するように適合されている、請求項２０に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項22】

前記操作されたＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質の少なくとも８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項23】

配列番号２に対する前記アミノ酸挿入が、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端またはその付近にある、請求項１９に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項24】

前記操作されたＣａｓ９タンパク質が、配列番号３～５および１０からなる群から選択される配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項25】

前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸分子が、Ｃａｓ９タンパク質コード配列のＮ末端またはその付近にある、配列番号６に対する挿入を含んでなる、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項26】

前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸分子が、配列番号７～９および１１からなる群から選択される配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含んでなる、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項27】

前記操作されたＣａｓ９タンパク質が、操作されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項28】

細胞内因性標的遺伝子とＣａｓ９タンパク質の発現との双方の改変に使用するための請求項１９～２７のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項29】

前記操作されたＣａｓ９タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項２８に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項30】

前記Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする前記核酸分子と前記細胞内因性標的遺伝子をコードする核酸分子との双方を切断するように適合されている、請求項２９に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項31】

少なくとも１７ヌクレオチド長の真核生物核酸配列によって少なくとも部分的にコードされるアミノ酸挿入または置換を含んでなる、Ｃａｓ９タンパク質であって、挿入が、配列番号２に対する、かつＥ２７１＿Ｎ２７２ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇ、Ｌ３７１＿Ｎ３７２ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇ、およびＱ７３７＿Ａ７３８ｉｎｓＧＸ_６－１０Ｇからなる群から選択される挿入である、Ｃａｓ９タンパク質。

【請求項32】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質の少なくとも８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項３１に記載のＣａｓ９タンパク質。

【請求項33】

前記真核生物核酸配列が哺乳類配列である、請求項３１または３２に記載のＣａｓ９タンパク質。

【請求項34】

前記真核生物核酸配列が、前記操作されたＣａｓ９タンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでなるか、またはそれに隣接する、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質。

【請求項35】

前記真核生物核酸配列が、前記ＰＡＭに隣接する少なくとも１７ヌクレオチドを含んでなる、請求項３４に記載のＣａｓ９タンパク質。

【請求項36】

挿入が、前記Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端またはその付近にある、請求項３１～３５のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質。

【請求項37】

配列番号３～５および１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項３１～３６のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質。

【請求項38】

請求項３１～３７のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質をコードする、核酸分子。

【請求項39】

細胞内の標的部位の改変に使用するための請求項１９～２７のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項40】

前記操作されたＣａｓ９タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項３９に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項41】

前記Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする前記核酸分子と前記細胞内の前記標的部位との双方を切断するように適合されている、請求項４０に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項42】

真核生物核酸配列を含んでなるＣｐｆ１タンパク質をコードする核酸分子であって、前記真核生物核酸配列が少なくとも１７ヌクレオチド長であり、前記Ｃｐｆ１タンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでなるか、またはそれに隣接し、
Ｃｐｆ１タンパク質が、
アミノ酸位置１４７と１４８の間、
アミノ酸位置４８４と４９２の間の任意の箇所、
アミノ酸位置５６８と５９０の間の任意の箇所、
アミノ酸位置７９５と８５５の間の任意の箇所、
アミノ酸位置１１３１と１１４０の間の任意の箇所、および
アミノ酸位置１１６０と１１７３の間の任意の箇所
からなる群から選択される位置に、配列番号１３に対するアミノ酸挿入を含む、または
核酸分子が、
核酸位置４４１と４４２の間、
核酸位置１４５２と１４７４の間の任意の箇所、
核酸位置１７０４と１７６８の間の任意の箇所、
核酸位置２３８５と２５６３の間の任意の箇所、
核酸位置３３９３と３４１８の間の任意の箇所、および
核酸位置３４８０と３５１７の間の任意の箇所
からなる群から選択される位置に、配列番号１４に対する挿入を含み、挿入が核酸分子の読み枠を改変しない、
核酸分子。

【請求項43】

前記ＰＡＭに隣接する前記核酸配列の部分と相補的な標的化ドメインを含んでなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードする、請求項４２に記載の核酸分子。

【請求項44】

前記ｇＲＮＡの標的化ドメインが１６～２４ヌクレオチド長である、請求項４３に記載の核酸分子。

【請求項45】

前記真核生物核酸配列がＣｐｆ１コード配列中にある、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項46】

前記真核生物核酸配列が前記Ｃｐｆ１タンパク質の修飾部分をコードする、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項47】

前記真核生物核酸配列が、その３'および５'各末端に、グリシンのための少なくとも１つのコドンを含む核酸分子の部分内にある、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項48】

前記Ｃｐｆ１タンパク質が、前記Ｃｐｆ１タンパク質のＮ末端またはその付近に、配列番号１３に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項４２～４７のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項49】

前記Ｃｐｆ１タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項４２～４８のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項50】

Ｃｐｆ１タンパク質コード配列のＮ末端またはその付近に、配列番号１４に対する挿入を含んでなる、請求項４２～４９のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項51】

配列番号１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる、請求項４２～５０のいずれか一項に記載の核酸分子。

【請求項52】

請求項４２～５１のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＣｐｆ１タンパク質を含んでなる、一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項53】

前記システムが、細胞内因性標的遺伝子と前記Ｃｐｆ１タンパク質との双方を改変する、請求項５２に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項54】

前記Ｃｐｆ１タンパク質が、野生型Ｃｐｆ１タンパク質の少なくとも８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項５２または５３に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項55】

請求項４２～５１のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ウイルスベクター。

【請求項56】

一過性活性ゲノム編集システムであって、前記一過性活性ゲノム編集システムが、
真核生物核酸配列に相補的な標的化ドメインを含んでなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および
真核生物ヌクレオチド配列とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを含んでなる核酸分子によってコードされる、操作されたＣｐｆ１タンパク質
を含んでなり、前記ＰＡＭが、前記Ｃｐｆ１タンパク質によって認識され、前記真核生物ヌクレオチド配列中にあるか、またはそれに隣接し、
Ｃｐｆ１タンパク質が、
アミノ酸位置１４７と１４８の間、
アミノ酸位置４８４と４９２の間の任意の箇所、
アミノ酸位置５６８と５９０の間の任意の箇所、
アミノ酸位置７９５と８５５の間の任意の箇所、
アミノ酸位置１１３１と１１４０の間の任意の箇所、および
アミノ酸位置１１６０と１１７３の間の任意の箇所
からなる群から選択される位置に、配列番号１３に対するアミノ酸挿入を含む、または
核酸分子が、
核酸位置４４１と４４２の間、
核酸位置１４５２と１４７４の間の任意の箇所、
核酸位置１７０４と１７６８の間の任意の箇所、
核酸位置２３８５と２５６３の間の任意の箇所、
核酸位置３３９３と３４１８の間の任意の箇所、および
核酸位置３４８０と３５１７の間の任意の箇所
からなる群から選択される位置に、配列番号１４に対する挿入を含み、挿入が核酸分子の読み枠を改変しない、
一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項57】

前記操作されたＣｐｆ１タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項５６に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項58】

前記Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣｐｆ１タンパク質をコードする前記核酸分子を切断するように適合されている、請求項５７に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項59】

前記Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣｐｆ１タンパク質をコードする前記核酸分子と細胞内の標的部位との双方を切断するように適合されている、請求項５７に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項60】

前記操作されたＣｐｆ１タンパク質が、前記真核生物ヌクレオチド配列によって少なくとも部分的にコードされるアミノ酸挿入または置換を含んでなる、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項61】

前記操作されたＣｐｆ１タンパク質が、野生型Ｃｐｆ１タンパク質の少なくとも８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項62】

前記Ｃｐｆ１タンパク質が、前記Ｃｐｆ１タンパク質のＮ末端またはその付近に、配列番号１３に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項63】

前記Ｃｐｆ１タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項64】

Ｃｐｆ１タンパク質コード配列のＮ末端またはその付近に、配列番号１４に対する挿入を含んでなる、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項65】

配列番号１４と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項66】

細胞内の標的部位の改変に使用するための請求項５６～６５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項67】

前記操作されたＣｐｆ１タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項６６に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【請求項68】

前記Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣｐｆ１タンパク質をコードする前記核酸分子と前記細胞内の前記標的部位との双方を切断するように適合されている、請求項６７に記載の一過性活性ゲノム編集システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により援用され、それに対して優先権が主張される、２０１６年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／４３０，１５４号明細書および２０１７年５月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５０３，６４０号明細書の優先権を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じてＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その内容全体を本明細書に参照により援用する。２０１７年１２月４日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、０８４１７７０１６３ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴと命名され、サイズは９２，９６９バイトである。

【0003】

本開示は、ゲノム編集システム、ならびに標的核酸配列を編集するための、または標的核酸配列の発現を調節するための、関連する方法および組成物、ならびにそれらの適用に関する。より特には、本開示は、操作された自己調節ゲノム編集システムに関する。

【背景技術】

【0004】

ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ：規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）は細菌および古細菌において発達し、ウイルスの攻撃から防御するための適応性免疫系である。ウイルスへの曝露に際して、ウイルスＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部から、ＲＮＡが転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含有するＲＮＡは、ウイルスゲノム中の標的配列へのＣａｓ９タンパク質の標的化を媒介する。次に、Ｃａｓ９タンパク質はウイルス標的を切断し、それによってウイルス標的を発現停止する。

【0005】

最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、真核細胞内のゲノム編集のために応用されている。部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同指向修復（ＨＤＲ）などの内因性ＤＮＡ修復機構を通じた、標的配列改変を可能にする。

【0006】

遺伝性疾患の治療のためのツールとしてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのゲノム編集システムの使用は、広く認識されている。例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、２０１６年１１月１５日に科学委員会会議を開催し、このようなシステムの使用とそれらが提起し得る規制上の問題に対処した。その会議において、ＦＤＡは、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体をカスタマイズして、関心のある遺伝子座で正確な編集をし得る一方で、複合体がまた、その他の「オフターゲット」遺伝子座と相互作用し、それを切断し得ることに注目した。オフターゲット切断（「オフターゲット」）の可能性は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ治療薬の承認に関して、少なくとも規制上のリスクを引き起こす。

【0007】

オフターゲットリスクを低減するための１つのストラテジーは、Ｃａｓ９をコードするベクター中に、Ｃａｓ９コード配列を標的化するガイドＲＮＡである「支配ガイドＲＮＡ」（ｇｇＲＮＡ）を含めることである。このベクターが対象に送達されると、さもなければウイルス形質導入細胞によって構成的におよび／または安定的に発現され得るＣａｓ９が、一過性にのみ発現される。時間経過と共に、ベクター内のＣａｓ９をコードするドメインは、支配ガイドＲＮＡによって媒介される切断によって破壊される。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、従来のｇｇＲＮＡとは異なる方法で、これらのシステムのゲノム編集活性を時間的に制限するために、特定の遺伝子座を標的化するｇＲＮＡを適応させる、ゲノム編集システムおよび関連方法を提供する。これらの適合化ｇＲＮＡは、「ワンショットガイドＲＮＡ」または「ｏｇＲＮＡ」と称される。明確さのために、本明細書に記載されるｏｇＲＮＡは、以下でより詳細に考察されるように、単分子またはモジュールであり得る。ｇＲＮＡのｏｇＲＮＡへの適応は、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼまたはベクター骨格などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸配列に、このようなｇＲＮＡによって認識される細胞ＤＮＡ配列を組み込むことによって達成される。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣａｓ９である。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣｐｆ１である。

【0009】

一態様では、本開示は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする単離核酸に関し、上記単離された核酸は、真核生物核酸配列などの、外因性、置換、挿入または操作された核酸配列を含む。真核生物またはその他の外因性の配列は、一般的に１７ヌクレオチド以上の長さであり、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでなるか、またはそれに隣接する。単離核酸の特定の実施形態はまた、ＰＡＭに隣接する外因性または真核生物核酸配列の一部に相補的な標的化ドメインを有するｇＲＮＡ（例えばｏｇＲＮＡ）をコードし、上記標的化ドメインは、任意選択的に長さが１６ヌクレオチドより長く、または１６～２４ヌクレオチドである。特定の実施形態では、外因性または真核生物核酸配列の一部に対する標的化ドメインの相補性は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸配列の修飾を可能にするのに十分である。特定の実施形態では、標的化ドメインは、外因性または真核生物核酸配列の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％に相補的である。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、真核生物核酸配列は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列中にあり、そこでタンパク質の修飾部分の少なくとも一部をコードし得る。外因性配列がＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの修飾部分の全部または一部をコードする場合、その配列は、その３’および５’各末端がグリシン、アラニンまたはバリンのためのコドンで挟まれた領域内に位置し得る。場合によっては、外因性核酸配列を含んでなるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列の領域は、Ｇ－（Ｘ）_６～１０－Ｇの配列を有するアミノ酸をコードする。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがＣａｓ９であるいくつかの実施形態では、これらの配列によってコードされるタンパク質は、Ｅ２７１＿Ｎ２７２ｉｎｓＧＸ_６～１０Ｇ、Ｌ３７１＿Ｎ３７２ｉｎｓＧＸ_６～１０Ｇ、および／またはＱ７３７＿Ａ７３８ｉｎｓＧＸ_６～１０Ｇなどの（配列番号２に対する）挿入、および／またはＣａｓ９ペプチドＮ末端またはその付近における挿入、および／または配列番号３～５および１０と少なくとも９５％の同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）の配列を含んでなり得る。

【0010】

本開示のこの態様を続けると、単離核酸は、ｃ．８１３＿８１４ｉｎｓＮ２７～３６、ｃ．１１１３＿１１１４ｉｎｓＮ２７～３６、および／またはｃ．２２１１＿２２１２ｉｎｓＮ２７～３６の（配列番号６に対する）挿入、および／またはＣａｓ９ペプチドＮ末端のコード配列またはその付近における挿入を含み得て、および／または配列番号７～９および１１と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を有し得る。代案としてはまたはそれに加えて、単離核酸は、ｃ．１５７ｉｎｓＮ_{１９～３６}の挿入を含み得て、および／または配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を共有し得る。本開示のこの態様による単離核酸は、プラスミド、ウイルスベクター、裸のＤＮＡベクターなどのベクターに任意選択的に組み込まれる。場合によっては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、本開示のこの態様による単離された核酸を組み込む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡの標的部位はベクター骨格内にある。ベクターを使用して、細胞内因性標的遺伝子とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ発現との双方が改変され得る。

【0011】

特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣｐｆ１である。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３で記載される。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＧＸ_６～１０Ｇ挿入などの挿入を含んでなり得る。特定の実施形態では、（配列番号１３に対する）挿入は、アミノ酸位置１４７と１４８の間、アミノ酸位置４８４と４９２の間の任意の箇所、アミノ酸位置５６８と５９０の間の任意の箇所、アミノ酸位置７９５と８５５の間の任意の箇所、アミノ酸位置１１３１と１１４０の間の任意の箇所、またはアミノ酸位置１１６０と１１７３の間の任意の箇所に位置する。特定の実施形態では、挿入はＣｐｆ１ペプチドのＮ末端またはその付近に位置する。特定の実施形態では、挿入を含んでなるＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を有する。

【0012】

特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする単離核酸配列は、配列番号１４で記載される。特定の実施形態では、単離されたＣｐｆ１核酸は、Ｎ２４～３６挿入などの挿入を含んでなり得る。特定の実施形態では、（配列番号１４に対する）挿入は、核酸位置４４１と４４２の間、核酸位置１４５２と１４７４の間の任意の箇所、核酸位置１７０４と１７６８の間の任意の箇所、核酸位置２３８５と２５６３の間の任意の箇所、核酸位置３３９３と３４１８の間の任意の箇所、または核酸位置３４８０と３５１７の間の任意の箇所に位置する。特定の実施形態では、挿入は単離されたＣｐｆ１核酸の読み枠を改変しない。特定の実施形態では、挿入はＣｐｆ１ペプチドのＮ末端またはその付近に位置する。特定の実施形態では、挿入を含んでなるＣｐｆ１タンパク質の核酸配列は、配列番号１４と少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の同一性を有する。本開示のこの態様による単離核酸は、プラスミド、ウイルスベクター、裸のＤＮＡベクターなどのベクターに任意選択的に組み込まれる。場合によっては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、本開示のこの態様による単離された核酸を組み込む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡの標的部位はベクター骨格内にある。ベクターを使用して、細胞内因性標的遺伝子とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ発現との双方が改変され得る。

【0013】

別の態様では、本開示は、真核生物ヌクレオチド配列に相補的な標的化ドメインを有するガイドＲＮＡと、上述したような真核生物核酸配列を含んでなる核酸によってコードされる操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとを含む、一過性活性ゲノム編集システムに関する。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質である。ｇＲＮＡおよび操作されたＣａｓ９はＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成し得て、上記複合体は次に、操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を切断し、または別の様式で改変または不活性化してもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内因性標的遺伝子をコードする核酸を切断し得る。一過性活性ゲノム編集システムを使用して、細胞内因性標的とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ発現との双方が改変され得る。上で考察されるように、真核生物核酸配列はＣａｓ９の修飾部分（例えば、アミノ酸挿入または置換）を少なくとも部分的にコードし得て、上記修飾部分は上述したような配列を有する。特定の実施形態では、操作されたＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質の少なくとも約８０％のヌクレアーゼ活性を有する。

【0014】

特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣｐｆ１タンパク質である。ｇＲＮＡおよび操作されたＣｐｆ１は、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体を形成し得て、上記複合体は次に、操作されたＣｐｆ１タンパク質をコードする核酸を切断し、または別の様式で改変または不活性化してもよい。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体は、細胞内因性標的遺伝子をコードする核酸を切断し得る。一過性活性ゲノム編集システムを使用して、細胞内因性標的とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ発現との双方が改変され得る。上で考察されるように、真核生物核酸配列はＣｐｆ１の修飾部分（例えば、アミノ酸挿入または置換）を少なくとも部分的にコードし得て、上記修飾部分は上述したような配列を有する。特定の実施形態では、操作されたＣｐｆ１タンパク質は、野生型Ｃｐｆ１タンパク質の少なくとも約８０％のヌクレアーゼ活性を有する。

【0015】

さらに別の態様では、本開示は、少なくとも１７ヌクレオチド長の真核生物核酸配列によって少なくともある程度コードされるアミノ酸挿入または置換を含んでなる、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに関する。特定の実施形態では、アミノ酸挿入または置換を有するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの少なくとも約８０％のヌクレアーゼ活性を有する。真核生物配列は、哺乳類配列および／またはヒトまたは動物対象の配列であり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質であり得て、本開示のこの態様によるＣａｓ９タンパク質をコードする核酸は実質的に上述した通りである。

【0016】

別の態様では、本開示は、上述したような一過性発現ゲノム編集システムを送達すること（例えば、接触、投与、導入、形質移入、形質導入するなど）を伴う細胞を改変する方法に関する。特定の実施形態では、方法を使用して、細胞の標的部位が改変され得る。特定の実施形態では、方法を使用して、細胞内因性標的遺伝子とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ発現との双方が改変され得る。

【0017】

なおも別の態様では、本開示は、上に提示した本開示の様々な態様による、一過性活性ゲノム編集システム、核酸および／またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの１つまたは複数の構成要素を含んでなる、キットに関する。

【0018】

添付の図面は、本開示の特定の態様および実施形態の包括的ではなく、むしろ例示的で概略的な例を提供することを意図している。図面は、任意の特定の理論またはモデルを制限することもまたはそれに拘束されることも意図されず、必ずしも縮尺通りではない。上記を限定することなく、核酸およびポリペプチドは線状配列として、または概略的な二次元もしくは三次元構造として描写されてもよく；これらの描写は、それらの構造に関する任意の特定のモデルまたは理論を制限することもまたはそれに拘束されることもなく、むしろ例示的であることを意図している。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1A-1B】Ａは、内因性細胞標的とウイルスベクター中のＳａＣａｓ９をコードする核酸との双方を標的化する、ＳａＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体を示す概略図である。Ｂは、その中で操作されたＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡが別々のウイルスゲノム上でコードされている、２ベクター系を描写するカートゥーン図である。その中に異種細胞配列を組み込み得る、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム中の２種類の例示的部位が矢印で示される。

【図2】Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質を示すリボン図である。操作された異種配列によってコードされ得る例示的な領域は、矢印によって同定される。

【図3A-3C】異種細胞配列を組み込んだ例示的なペプチドをコードするインサートを示す概略図である。

【図4A】ＳａＣａｓ９コード配列中の４つの異なる位置に標的部位を有する例示的コンストラクト、ならびにｇＲＮＡ発現プラスミドを描写するカートゥーン図である。

【図4B】野生型Ｃａｓ９コンストラクトおよび自己不活性化Ｃａｓ９コンストラクトの転写レベルおよび翻訳レベルの比較を示す。

【図4C】野生型および自己不活性化ＳａＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性レベルを描写する。

【図4D】野生型および自己不活性化ＳａＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性レベルを描写する。

【図4E】野生型および自己不活性化ＳａＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性レベルを描写する。

【図5A】実施例３における実験デザインを示す。

【図5B】自己不活性化ＡＡＶが、ＨＥＫ２９３細胞において自己不活性化する一方で、標的ＧＦＰプラスミドでは有効性を維持することを示す。左上パネルは、自己不活性化Ｃａｓ９コンストラクトに挿入された標的部位の位置を示す。左下のパネルは、野生型または自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトを含むまたは含まないＨＥＫ２９３細胞における、ＧＦＰ発現レベルを示す。右下パネルは、野生型または自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞における、Ｃａｓ９タンパク質レベルを示す。

【図6A-6B】Ａは、マウス網膜外植片における、野生型または自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトによる内因性標的遺伝子座（ｍＣＥＰ２９０）の編集レベルを示すグラフである。Ｂは、野生型または自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトによる、マウス網膜外植片における％野生型ＳａＣａｓ９配列レベルを示すグラフである。

【図7A】生体内における、野生型または自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトを有する内因性標的遺伝子座の編集レベルを示す。

【図7B】野生型ＳａＣａｓ９コンストラクトと比較した、自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトを介して発現された特定の転写物の倍数変化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

定義および略語
別段の指定がない限り、以下の各用語は、このセクションでそれに関連した意味を有する。

【0021】

不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、関連した名詞の少なくとも１つを指し、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」という用語と互換的に使用される。例えば、「１つのモジュール（ａ ｍｏｄｕｌｅ）」は少なくとも１つのモジュール、または１つまたは複数のモジュールを意味する。

【0022】

接続詞「または」および「および／または」は、非排他的選言肢として同義的に使用される。

【0023】

「ドメイン」は、タンパク質または核酸のセグメントを表すために使用される。特に断りのない限り、ドメインは、いかなる特定の機能特性も有する必要はない。

【0024】

「インデル」は、核酸配列中の挿入および／または欠失である。インデルは、本開示のゲノム編集システムによって形成された二本鎖切断などのＤＮＡ二本鎖切断の修復の産物であってもよい。インデルは、最も一般的には、下述したＮＨＥＪ経路などの「誤りがちな」修復経路によって中断が修復された場合に形成される。

【0025】

「遺伝子変換」とは、内因性相同配列（例えば、遺伝子アレイ内の相同配列）の組み込みによるＤＮＡ配列の改変を指す。「遺伝子修正」とは、外因性一本鎖または二本鎖ドナー鋳型ＤＮＡなどの外因性相同配列の組み込みによるＤＮＡ配列の改変を指す。遺伝子変換および遺伝子修正は、下述したものなどのＨＤＲ経路によるＤＮＡ二本鎖切断の修復の産物である。

【0026】

インデル、遺伝子変換、遺伝子修正、およびその他のゲノム編集結果は、典型的には配列決定によって（最も一般的には「次世代」または「合成による配列決定」法によって、ただしサンガー配列決定も依然として使用されてもよい）評価され、全ての配列決定読み取りにおける数値変化の相対頻度（例えば、±１、±２またはそれ以上の塩基）によって定量化される。配列決定のためのＤＮＡサンプルは、当該技術分野で公知の多様な方法によって調製されてもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による目的部位の増幅、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（５）：４８３（２０１６）、参照により本明細書に援用される）に記載されるＧＵＩＤＥｓｅｑプロセスにおけるような二本鎖切断によって生じるＤＮＡ末端の捕捉を伴ってもよく、または当該技術分野で周知の別の手段によって調製されてもよい。ゲノム編集結果はまた、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｖｉｓｉｏｎ（Ｂａｇｎｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）によって製品化されているＦｉｂｅｒＣｏｍｂ（商標）システムなどの原位置ハイブリダイゼーション法によって、および当該技術分野で公知任意のその他の適切な方法によって評価されてもよい。

【0027】

「Ａｌｔ－ＨＤＲ」、「代替相同指向修復」、または「代替ＨＤＲ」は同義的に使用されて、相同核酸（例えば姉妹染色分体などの内因性相同配列、または例えば鋳型核酸などの外因性核酸）を使用して、ＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。Ａｌｔ－ＨＤＲは、プロセスが、標準ＨＤＲとは異なる経路を利用し、標準ＨＤＲ媒介物であるＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２によって阻害され得るという点で、標準ＨＤＲと異なる。Ａｌｔ－ＨＤＲは一本鎖またはニックの入った相同核酸鋳型の関与によっても区別されるのに対し、標準ＨＤＲは一般に二本鎖相同鋳型を伴う。

【0028】

「標準ＨＤＲ」、「標準相同指向修復」または「ｃＨＤＲ」は、相同核酸（例えば姉妹染色分体などの内因性相同配列、または例えば鋳型核酸などの外因性核酸）を使用したＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。標準ＨＤＲは、二本鎖切断で顕著な切除があって、少なくとも１つのＤＮＡの一本鎖部分が形成する場合に、典型的に機能する。正常細胞では、ｃＨＤＲは、典型的に、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分解、およびライゲーションなどの一連の工程を伴う。プロセスはＲＡＤ５１およびＢＲＣＡ２を必要とし、相同核酸は典型的に二本鎖である。

【0029】

特に断りのない限り、「ＨＤＲ」という用語は、本明細書の用法では標準ＨＤＲおよびａｌｔ－ＨＤＲの双方を包含する。

【0030】

「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、標準ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）および代替ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）などのライゲーション媒介修復および／または非鋳型媒介修復を指し、これは次に、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存性マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ－ＭＭＥＪ）を含む。

【0031】

「置換」または「置換された」は、分子（例えば、核酸またはタンパク質）の修飾に関して使用される場合、プロセス制限を必要とせず、単に置換実体が存在することを示す。

【0032】

「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味する。ヒト対象は、任意の年齢（例えば、乳児、子供、若年成人、または成人）であり得て、疾患に罹患していてもよく、または遺伝子の改変を必要としていてもよい。代案としては、対象は、動物であってもよく、上記用語には、哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類、両生類、およびより特に非ヒト霊長類、齧歯類（マウス、ラット、ハムスターなど）、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコなどが含まれるが、これに限定されるものではない。本開示の特定の実施形態では、対象は、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、またはヤギなどの家畜である。特定の実施形態では、対象は家禽である。

【0033】

「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、疾病を抑制すること、すなわち、その発症または進行を阻止または防止すること；疾病を緩和し、すなわち、疾病状態の退縮を引き起こすこと；疾病の１つまたは複数の症状を緩和すること；疾病を治癒させることの１つまたは複数をはじめとする、対象（例えば、ヒト対象）における疾病の治療を意味する。

【0034】

「予防する」、「予防すること」、および「予防」は、（ａ）疾病を回避または排除すること；（ｂ）疾病に対する素因に影響を及ぼすこと；または（ｃ）疾病の少なくとも１つの症状の発症を予防または遅延させることをはじめとする、例えばヒトなどの哺乳類における疾病の予防を指す。

【0035】

「キット」とは、特定の目的のために使用され得る機能単位を一緒に構成する、２つまたはそれ以上の構成要素の任意の集合を指す。例証として（そして限定ではなく）、本開示による１つのキットは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと複合体化したまたは複合体化できるガイドＲＮＡを含み得て、（例えば、その中に懸濁されたまたは懸濁可能な）薬学的に許容可能な担体を伴う。例えば、細胞または対象において所望のゲノムの改変を引き起こす目的で、キットを使用して、このような細胞または対象に複合体を導入し得る。キットの構成要素は一緒に包装され得て、またはそれらは別々に包装されてもよい。本開示によるキットはまた、例えば本開示の方法によるキットの使用を説明する使用説明書（ＤＦＵ）も任意選択的に含む。ＤＦＵは、キットと共に物理的に包装され得て、またはそれは例えば電子的手段によって、キット使用者に提供され得る。

【0036】

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオチド」とも称される）を指し、２つまたはそれ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。これらの用語は、一本鎖または二本鎖のキメラ混合物またはそれらの誘導体または修飾型であり得る組成物を指す。これらの用語はまた、例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾され、分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータなどを改善し得る組成物も指す。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質および酵素を製造するために細胞機構によって使用される情報をはじめとするが、これに限定されるものではない、遺伝情報を保有する。これらの用語は、二本鎖または一本鎖のゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝子操作ポリヌクレオチド、ならびにセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの双方を含む。これらの用語はまた、修飾塩基を含有する核酸も含む。

【0037】

下記の表１に示されるように、慣用的なＩＵＰＡＣ表記法が、本明細書で提示されるヌクレオチド配列において使用される（参照により本明細書に援用されるＣｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ Ａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８５ Ｍａｙ １０；１３（９）：３０２１－３０もまた参照されたい）。しかし、配列がＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかによって、例えばｇＲＮＡ標的化ドメインにおいてコードされてもよい場合、「Ｔ」は「チミンまたはウラシル」を示すことに留意すべきである。

【0038】

【0039】

「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は同義的に使用され、ペプチド結合を介して共に連結するアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、個々のタンパク質、共に結合するタンパク質の群または複合体、ならびにそのようなタンパク質の断片または部分、変異型、誘導体、および類似体を含む。ペプチド配列は、左側のアミノまたはＮ末端から開始して、右側のカルボキシルまたはＣ末端に進む、慣用的な表記法を用いて本明細書に提示される。標準的な一文字または三文字略語が使用され得る。

【0040】

概要
概括的には、本開示は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと、特定の通常は細胞のＤＮＡ配列を標的化するｇＲＮＡとを含んでなる一過性活性ゲノム編集システムをはじめとするが、これに限定されるものではない、ゲノム編集システムに関与する。これらのゲノム編集システムで使用されるｇＲＮＡは、本開示を通して「ワンショットガイドＲＮＡ」またはｏｇＲＮＡと称され、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸配列を特異的に標的化する支配ガイドＲＮＡと区別される。本開示の様々な実施形態において、ゲノム編集システムをコードする核酸は修飾されて、ｏｇＲＮＡによって認識される部位が導入され、それらが標的化するように設計されている特定の細胞配列を認識するそれらの能力を変えることなく、それらがｇｇＲＮＡとして機能できるようにする。したがって、特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、内因性標的遺伝子座、ならびにＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸を編集し得る。図１Ａは、内因性細胞遺伝子座を標的化するＳａＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体、ならびにウイルスベクター内のｏｇＲＮＡ標的配列を含んでなる操作されたＣａｓ９配列を示す概略図である。

【0041】

提示の経済性のために、そして図１Ｂに示されるように、ゲノム編集システムをコードする核酸に導入される部位は、（ａ）例えばウイルスゲノム骨格などの核酸ベクター骨格に導入された部位、および／または（ｂ）例えばＣａｓ９ヌクレアーゼをコードする配列などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列に導入された部位に分類される。この分類は、任意の特定の理論またはモデルを制限することもまたはそれに拘束されることも意図されず、および（ａ）および（ｂ）は相互に排他的ではない。ゲノム編集システムをコードする配列またはこのような配列を含むベクターへのｏｇＲＮＡ標的部位の導入は、その他の自己不活性化ストラテジーに優るいくつかの利点を有する。一例を挙げると、このような核酸へのｏｇＲＮＡ標的部位の導入は、別個のｇｇＲＮＡを必要とすることなく、自己不活性化ゲノム編集システムを設計および実装できるようにする。次にこれにより、自己不活性化ゲノム編集システムを比較的小さなスペースにパッケージングすることが可能になり、例えば、パッケージング限界が約４．７ｋｂのＡＡＶベクターなどの単一ベクター（「ワンショット」構成）にパッケージングされる、複数のｇＲＮＡを含んでなる自己不活性化システムに役立つ。別の利点は、例えば、ゲノム標的化ｇＲＮＡとｇｇＲＮＡの間の発現の差または切断効率に起因する変動の排除による、ｇｇＲＮＡシステムに対するｏｇＲＮＡの挙動の予測可能性における潜在的な改善である。本開示の実施形態のさらなる利点は、当業者には明らかであろう。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに導入された部位は、野生型タンパク質と比較してＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を改変しない。特定の実施形態では、操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型タンパク質の少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のヌクレアーゼ活性を有する。

【0042】

まず、操作された配列のベクター骨格への導入に最初に注目すると、プラスミド、人工染色体、および／または組換えウイルスベクターゲノムなどの多数のベクター核酸は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードしない「骨格」配列を含んでなることが、当業者によって理解されるであろう。１つまたは複数のｏｇＲＮＡ標的部位をこれらの骨格に組み入れることによって、ｏｇＲＮＡを組み込んだゲノム編集システムは、例えば、一本鎖または二本鎖の切断、点変異、または以下でより詳細に記載されるその他の修飾を形成することによって、ベクターを認識し改変し得る。この改変は、次に、ゲノム編集システムの１つまたは複数の構成要素の転写を低減または排除し得て、それによってゲノム編集システムの活性を制限し得る。

【0043】

ｏｇＲＮＡ標的部位は、それがベクター骨格またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列のどちらに組み込まれているかを問わず、一般に、ｏｇＲＮＡの標的化ドメイン配列（または「スペーサー」、１６～２４ヌクレオチド長）に相補的な１６～２４ヌクレオチド配列（「プロトスペーサー」配列）を含んでなり；プロトスペーサーは、使用されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ種に応じて一般に３～６ヌクレオチド長である、プロトスペーサー隣接モチーフ（または「ＰＡＭ」）に隣接する。本開示の特定の実施例は、「上部」または「相補的」鎖上で視覚化されるプロトスペーサー配列の３’に隣接するＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ ＰＡＭを認識する、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９と共に使用するための標的部位に重点を置く。上記を限定することなく、例示的なＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｏｇＲＮＡ標的部位は２２～３０ヌクレオチド長であり得て、真核生物遺伝子中の１６～２４個の核酸配列およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９によって認識される６個のヌクレオチドＰＡＭを含んでなる。

【0044】

ワンショットガイドＲＮＡ標的部位は、任意の適切な位置でベクター骨格に組み入れ得るが、場合によっては、ｏｇＲＮＡ標的部位を（ａ）生体内のベクターの安定性に必要である；（ｂ）例えばインデルによって中断されると、機能を獲得するのではなくむしろ機能を失う；および／または（ｃ）機能的ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの発現に必要である部位または要素の近くに配置させることが有利であってもよい。これらの部位または要素としては、限定されるものではないが、ｇＲＮＡおよび／またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのためのプロモーター配列；逆方向末端反復、ｇＲＮＡコード配列などが挙げられる。

【0045】

ｏｇＲＮＡ標的部位が核酸ベクター骨格に導入される特定の実施形態では、標的部位は、ｇＲＮＡおよび／またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのプロモーター配列中にまたはそれに隣接して位置する。特定の実施形態では、標的部位は、例えば、転写開始部位の上流の０ｂｐ、約１ｂｐ、約１０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、または任意の中間距離またはその範囲などのプロモーター配列の転写開始部位の上流に位置する。特定の実施形態では、標的部位は、例えば、転写開始部位の下流の０ｂｐ、約１ｂｐ、約１０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、または任意の中間距離またはその範囲などのプロモーター配列の転写開始部位の下流に位置する。特定の実施形態では、標的部位は、転写開始部位を含んでなる。

【0046】

ｏｇＲＮＡ標的部位が核酸ベクター骨格に導入される特定の実施形態では、標的部位はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内にまたはそれに隣接して位置する。特定の実施形態では、標的部位は、例えば、翻訳開始部位の上流の０ｂｐ、約１ｂｐ、約１０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、または任意の中間距離またはその範囲などのプロモーター配列の翻訳開始部位の上流に位置する。特定の実施形態では、標的部位は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内にまたはそれに隣接して位置する。特定の実施形態では、標的部位は、例えば、０ｂｐ、約１ｂｐ、約１０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、または任意の中間距離またはその範囲などの翻訳停止コドン（例えば、ＴＧＡ、ＴＡＡおよび標識）の下流に位置する。

【0047】

下の表２は、その中に標的部位（Ｎで示される）が５’末端付近（ｃ．１５７ｉｎｓＮ_{１９～３０}）に組み入れられる、１つの例示的なＡＡＶ骨格を含む。

【0048】

【0049】

【0050】

【0051】

表２の例示的な骨格配列は単一の標的部位を含むが、本開示はまた、２、３、４、５個またはそれ以上の同一または非同一の標的配列がベクター中に組み入れられた骨格も包含する。さらに、ベクター骨格内の特定の配列が標的部位の一部と類似していてもよく、これらの部位は、標的部位を生成するために容易に修飾されてもよいことが、当業者によって理解されるであろう。例えば、ベクター骨格内には複数のＰＡＭが存在し得て、（相補鎖または上部鎖上で視覚化されるように）５’に隣接する配列は、認識されるプロトスペーサー配列から０、１、２、３個またはそれ以上のヌクレオチドだけ異なるように改変され得る。代案としては、ＰＡＭ配列は、例えば、標的化ドメインの３’に隣接するｇＲＮＡの残基を修飾することによって、ｇＲＮＡ標的化ドメインをコードする配列に導入されてもよい。特定の実施形態では、真核生物配列を有するＣａｓ９タンパク質をコードする単離核酸は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を共有し得る。特定の実施形態では、真核生物配列を有するＣｐｆ１タンパク質をコードする単離核酸は、配列番号１４と少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を共有し得る。

【0052】

次に、標的部位がＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする配列に導入されるシステムに注目すると、本開示は、上述したような標的部位を含んでなるＤＮＡ配列によってコードされる、特定の操作されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質を提供する。このような標的部位を含んでなる短い（例えば２４～４２塩基対または８～１３アミノ酸）配列は、Ｃａｓ９コード配列および／または操作されたＣａｓ９タンパク質に実装される場合に、それらが配列中に挿入されたかまたは配列の一部を置換しているかにかかわらず、「インサート」と称される。図３Ａ～図３は、異種細胞配列を組み込んだ例示的なペプチドをコードするインサートを示す概略図である。

【0053】

当業者は、インサートの設計基準が、ＤＮＡベクターの「骨格」配列中の標的部位に必ずしも適用可能ではない特定の条件を含むことを理解するであろう。一例を挙げると、特定の実施形態におけるインサートの長さは３で整除でき、操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの機能に影響を及ぼすこともあるフレームシフト変異の導入が回避される。ゲノムの標的部位が３で整除できない長さを有する場合、必要に応じて１または２個の追加的なヌクレオチドがインサートに付加されて、インサートを含んでなるコード配列の読み枠が保存される。

【0054】

本開示の特定の実施形態によって満たされる別の設計基準は、インサートを含んでなる操作されたタンパク質の構造の最小限の破壊である。この要件は、場合によっては、（ａ）アミノ酸の付加が良好に耐容されるヌクレアーゼタンパク質の領域に、インサートを配置すること、および／または（ｂ）周囲のタンパク質の構造を乱さない傾向があるインサートを選択することによって満たされる。これら２つの設計要素は、順番に対処される。

【0055】

インサートの位置に関して、図１Ｂおよび２は、本開示の様々な実施形態においてその中にインサートが付加される、例えば、Ｅ２７１＿Ｎ２７２ｉｎｓＧＸ_６～１０Ｇ、Ｌ３７１＿Ｎ３７２ｉｎｓＧＸ_６～１０Ｇ、Ｑ７３７＿Ａ７３８ｉｎｓＧＸ_６～１０Ｇおよび／またはＮ末端（ＮＴ）またはその付近などのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質中の４つの例示的な部位（ＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３、ＮＴ）を描写する。これらの位置のそれぞれに対応するペプチド配列が、下の表３に提示される。表中、インサート内の残基はＸで示される。提示された配列は、明確さのために１０～１２アミノ酸のインサートを含むが、インサートは任意の適切な長さを有し得る。

【0056】

特定の実施形態では、「Ｎ末端またはその付近の」インサートは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）ペプチドの第１のアミノ酸残基から約２０アミノ酸残基内に位置する。特定の実施形態では、Ｎ末端またはその付近のインサートは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）ペプチドの第１のアミノ酸残基から、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０アミノ酸残基に位置する。特定の実施形態では、Ｎ末端またはその付近のインサートは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）ペプチドの第１のアミノ酸残基の上流に位置する。特定の実施形態では、Ｎ末端またはその付近のインサートは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）ペプチドの第１のアミノ酸残基の下流に位置する。特定の実施形態では、Ｎ末端またはその付近のインサートは、核局在配列（ＮＬＳ）とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼペプチドコード配列との間に位置する。特定の実施形態では、ＮＬＳは配列番号１２ＧＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ［配列番号１２］に記載のペプチド配列を含んでなる。

【0057】

特定の実施形態では、Ｎ末端またはその付近のインサートは、Ｃａｓ９ペプチドの第１のアミノ酸残基から約９アミノ酸残基内に位置する。特定の実施形態では、Ｎ末端またはその付近のインサートは、Ｃａｓ９ペプチドの第１のアミノ酸残基から、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９アミノ酸残基に位置する。特定の実施形態では、Ｎ末端またはその付近のインサートは、Ｃｐｆ１ペプチドの第１のアミノ酸残基から約２０アミノ酸残基内に位置する。特定の実施形態では、Ｎ末端またはその付近のインサートは、Ｃｐｆ１ペプチドの第１のアミノ酸残基から、約０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０アミノ酸残基に位置する。

【0058】

特定の実施形態では、インサートは、翻訳開始コドン（すなわちＡＴＧ）を含んでなり得る。特定の実施形態では、翻訳開始コドン（すなわちＡＴＧ）は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列とインフレームである。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列のＮ末端またはその付近のインサートは、翻訳開始コドン（すなわちＡＴＧ）とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列の間に位置する。

【0059】

さらに、当業者は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ配列（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１タンパク質配列）がｏｇＲＮＡの動作を妨害しない様式で修飾されてもよいこと、そしてこれらの配列が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸変化を有するように修飾されてもよいことを理解するであろう。言い換えると、特定の実施形態では、配列は、対応する天然のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼに対して９５％を超える配列同一性を有するであろう。特定の実施形態では、これらの３つの例示的部位に付加されるインサートは、野生型ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと比較して、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質のヌクレアーゼ活性を改変しない。特定の実施形態では、例示的部位にインサートが付加されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、野生型ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のヌクレアーゼ活性を有するであろう。

【0060】

【0061】

【0062】

表３に提示される操作されたＣａｓ９タンパク質は、表４に列挙される例示的な核酸配列によってコードされる。表中、インサート内のヌクレオチドはＮで示され、アミノ酸位置１～３に対応するインサート位置は、それぞれｃ．８１３＿８１４ｉｎｓＮ_{２７～３６}、ｃ．１１１３＿１１１４ｉｎｓＮ_{２７～３６}、およびｃ．２２１１＿２２１２ｉｎｓＮ_{２７～３６}である。

【0063】

【0064】

【0065】

【0066】

【0067】

【0068】

特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣｐｆ１である。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３で記載される。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ＧＸ_６～１０Ｇ挿入などの挿入を含んでなり得る。特定の実施形態では、（配列番号１３に対する）挿入は、アミノ酸位置１４７と１４８の間、アミノ酸位置４８４と４９２の間の任意の箇所、アミノ酸位置５６８と５９０の間の任意の箇所、アミノ酸位置７９５と８５５の間の任意の箇所、アミノ酸位置１１３１と１１４０の間の任意の箇所、またはアミノ酸位置１１６０と１１７３の間の任意の箇所に位置する。特定の実施形態では、挿入は、Ｃｐｆ１ペプチドのＮ末端またはその付近に位置する。特定の実施形態では、挿入を含んでなるＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）を有する。

【0069】

特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質をコードする単離核酸配列は、配列番号１４で記載される。特定の実施形態では、単離されたＣｐｆ１核酸は、Ｎ２４～３６挿入などの挿入を含んでなり得る。特定の実施形態では、（配列番号１４に対する）挿入は、核酸位置４４１と４４２の間、核酸位置１４５２と１４７４の間の任意の箇所、核酸位置１７０４と１７６８の間の任意の箇所、核酸位置２３８５と２５６３の間の任意の箇所、核酸位置３３９３と３４１８の間の任意の箇所、または核酸位置３４８０と３５１７の間の任意の箇所に位置する。特定の実施形態では、挿入は単離されたＣｐｆ１核酸の読み枠を改変しない。特定の実施形態では、挿入は、Ｃｐｆ１ペプチドのＮ末端またはその付近に位置する。特定の実施形態では、挿入を含んでなるＣｐｆ１タンパク質の核酸配列は、配列番号１４と少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の同一性を有する。本開示のこの態様による単離核酸は、プラスミド、ウイルスベクター、裸のＤＮＡベクターなどのベクターに任意選択的に組み込まれる。場合によっては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、本開示のこの態様による単離された核酸を組み込む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡの標的部位はベクター骨格内にある。ベクターを使用して、細胞内因性標的遺伝子とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ発現との双方が改変され得る。

【0070】

当業者は、本明細書に提示される例示的な配列が、それらが具現するゲノム編集システムの動作原理に影響を及ぼさない様式で、修飾されてもよいことを認識するであろう。したがって、修飾ヌクレオチド、または本明細書で提示される配列に対して、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞８５％、＞９０％、＞９１％、＞９２％、＞９３％、＞９４％、＞９５％、＞９６％、＞９７％、＞９８％または＞９９％の配列同一性を有する、トランケートされているか、他の配列と融合しているか、さもなければ修飾されているアミノ酸配列は、本開示の範囲内である。本明細書で提示される配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれ以上の残基が異なるアミノ酸配列または核酸配列についてもまた、本開示の範囲内である。

【0071】

次に、ヌクレアーゼ構造の破壊を最小化するインサートの選択に注目すると、本開示の範囲内のインサートの多くは、以下の要件の１つまたは複数を満たすように設計されている：（ｉ）インサートは、その３’および５’末端に、グリシンまたは別の小型で可撓性の残基（例えば、アラニンまたはバリン）のための３ヌクレオチドコドンを含み、Ｇ－［Ｘ］_６～１０－Ｇなどのアミノ酸配列をコードする（式中、「Ｘ」は、本明細書中に記載の制約を条件として、任意のアミノ酸を示す）；（ｉｉ）インサートは、コード配列中に停止コドン、スプライス供与体もしくは受容体、またはその他の望ましくないドメインを導入しない；（ｉｉｉ）Ｘは、人工タンパク質またはその最終構造（例えばフェニルアラニン）の折り畳みを乱さない親水性または疎水性によって特徴付けられる；（ｉｖ）Ｘは嵩高くなく（例えばトリプトファン）、屈曲を導入しまたは周囲のタンパク質との立体障害を引き起こし硫黄架橋を形成することなどによってＣａｓ９の構造を破壊し得る、システイン、プロリンまたはその他のアミノ酸ではない。

【0072】

場合によっては、本開示によるインサートは、以下の発見的方法に従って生成され得る：
１．目的の細胞遺伝子標的内の標的部位（プロトスペーサーおよびＰＡＭ）について、全ての６つの可能な読み枠中で標的部位配列によってコードされてもよい、全ての可能なアミノ酸配列を同定する；
２．上記の設計基準を満たさないヌクレオチド配列読み枠（例えば、停止コドンをコードする、または疎水性や嵩高さなどのために周囲のタンパク質の構造を破壊する可能性が高いペプチドをコードするなど）を棄却する；
３．ステップ２で棄却されなかった各ヌクレオチド配列に対して、
ａ．標的部位の３’および５’末端にグリシンのためのコドンを付加し；
ｂ．必要に応じて、グリシンコドンと標的部位との間の配列の５’末端に１つまたは２つのヌクレオチドを挿入し、標的部位配列を所望の読み枠にシフトさせ；
ｃ．必要に応じて、標的部位とグリシンコドンとの間の配列の３’末端に、１つまたは２つのヌクレオチドを挿入し、３’グリシンコドンおよび引き続くペプチド配列をインフレームに保つ。

【0073】

本開示のインサートは、限定されるものではないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、およびその他のクラス２ヌクレアーゼをはじめとする、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼおよびその様々なオルソログと、そしてそれらをコードする核酸と、広く適合性であることに留意すべきである。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣａｓ９である。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはＣｐｆ１である。本開示の特定の例は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の発現を調節するためのインサートの使用に重点を置いている一方で、当業者は、本開示のインサートが、その他のヌクレアーゼまたはオルソログとの使用のために適合されてもよいことを認識するであろう。一例として、インサートは、（ｉ）ヌクレアーゼまたはオルソログによって認識されるＰＡＭ配列を含んでなる、適切な標的部位を選択すること、および（ｉｉ）（ａ）ヌクレアーゼタンパク質の表面上に位置し、および／または（ｂ）折り畳みまたは構造の改変なしにインサートの挿入に耐えると予測される、ペプチドループ内にある挿入部位を選択することによって、別のヌクレアーゼまたはオルソログにおいて使用するために適合されてもよい。

【0074】

使用に際して、本開示による操作された核酸は、ゲノム編集システム構成要素の転写および発現のための鋳型と、発現されたゲノム編集システムによる切断または他の編集のための基質とを同時に提供する。（必ずしも全てはないが）数多くの実施形態では、操作された核酸の切断は、操作された核酸によってコードされる１つまたは複数のゲノム編集システム構成要素の発現を減少させまたは排除する。代案としては、またはそれに加えて、操作された核酸の切断は、ゲノム編集システム構成要素の機能を低下させるインデル変異の形成をもたらし得る。これらの結果は、次に、類似構成要素をコードする操作されていないヌクレオチドと比較して、操作された核酸の送達によって引き起こされるゲノム編集活性に、時間的制限を提供し得る。例えば、構成的プロモーターの制御下にあるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸ベクターが、進行中の構成的ゲノム編集活性を推進すると予想される場合、同一ベクター内にｏｇＲＮＡ標的部位を（骨格またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列を問わず）包含することは、限られた期間のシステム構成要素の高発現とゲノム編集活性の一過性ピークをもたらし、これは、数時間、数日間、または数週間の期間にわたって、各細胞内のベクターのコピーが切断され不活性化されるにつれて減少する。本明細書に記載の一過性活性ゲノム編集システムを使用したゲノム編集活性の時間的制限が、例えばオフターゲット切断の可能性を制限する、またはゲノム編集システム構成要素に対する任意の可能な細胞性応答を制限するなどの特定の状況で有利であり得ることは、当業者には明らかであろう。

【0075】

特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの活性は、ベクター骨格またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼコード配列のどちらかに挿入されたｏｇＲＮＡ標的配列の性質によって調節され得る。例えば、ｏｇＲＮＡ標的配列がコンセンサスＰＡＭ配列を含んでなる場合、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、最適以下のＰＡＭを含む標的配列よりも高い効率で、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸を編集するであろう。したがって、コンセンサスＰＡＭ配列が使用される場合、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの発現はバースト用量を反映する一方で、最適以下のＰＡＭ配列が使用される場合、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの発現は拡張用量を反映するであろう。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９の例示的なコンセンサス配列および最適以下のＰＡＭ配列は、表５に列挙される。

【0076】

【0077】

この概要は、特定の操作された核酸ベクターおよび操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの原理を例証する、少数の例示的実施形態に焦点を合わせている。しかし、明確さのために、本開示は当業者に明らかであろう修正および変動を包含する。例えば、本明細書に記載されるように、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸および細胞内因性標的遺伝子をコードする核酸の編集は、同時または随伴性であり得るが、必ずしもこのような編集の時間的制限はない。これを念頭に置いて、以下の開示は、ゲノム編集システムの動作原理をより一般的に例証することを意図している。以下は制限的なものではなく、むしろゲノム編集システムの特定の原理を例証するものとして理解されるべきであり、それは本開示との組み合わせで、当業者に、本開示の範囲内にある追加的な実装および修正について情報を提供するであろう。

【0078】

ゲノム編集システム
「ゲノム編集システム」という用語は、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ編集活性を有する任意のシステムを指す。本開示のゲノム編集システムは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムから適合された、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの少なくとも２つの構成要素を含む。これらの２つの構成要素は、特定の核酸配列と結合して、例えば、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢまたはニック）、二重鎖切断および／または点変異を生成することによって、核酸配列中またはその周囲のＤＮＡを編集できる複合体を形成する。特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、一過性活性ゲノム編集システムである。特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、細胞内因性標的遺伝子とＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ発現との双方を改変し得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ／ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ複合体は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸と細胞内因性標的遺伝子をコードする核酸との双方を切断し得る。

【0079】

天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムは、進化的に２つのクラスと５つの型に組織化され（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｊｕｎ；９（６）：４６７－４７７（Ｍａｋａｒｏｖａ）、参照により本明細書に援用される）、本開示のゲノム編集システムは、任意の型またはクラスの天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を適合させてもよい一方で、本明細書に提示される実施形態は、一般にクラス２、およびＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲシステムから適合される。ＩＩ型およびＶ型を包含するクラス２システムは、相対的に大型の多ドメインＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）と、１つまたは複数のガイドＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡ、任意選択的にｔｒａｃｒＲＮＡ）とによって特徴付けられ、それは、ｃｒＲＮＡの標的（またはスペーサー）配列に相補的な特定の遺伝子座と会合（標的化）して切断する、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。本開示によるゲノム編集システムは、細胞ＤＮＡ配列を同様に標的化して編集するが、天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステムとは著しく異なる。例えば、本明細書に記載の単分子ガイドＲＮＡは自然界に存在せず、そして本開示によるガイドＲＮＡおよびＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはどちらも、天然に存在しない任意の数の修飾を組み込んでもよい。

【0080】

ゲノム編集システムは、様々な方法で実装され得て（例えば、細胞または対象に投与または送達され得る）、異なる実装が異なる用途に適してもよい。例えば、ゲノム編集システムは、特定の実施形態では、タンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質、またはＲＮＰ）として実装され、それは、脂質またはポリマーの微粒子またはナノ粒子、ミセル、リポソームなどの薬学的に許容可能な担体および／または封入剤を任意選択的に含む医薬組成物に含まれ得る。特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、上述したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ構成要素をコードする１つまたは複数の核酸として（任意選択的に、１つまたは複数の追加的な構成要素と共に）実装され；特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、このような核酸を含んでなる１つまたは複数のベクター、例えばアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターとして実装され；特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、前述のいずれかの組み合わせとして実装される。本明細書に記載の原理に従って動作する追加的なまたは修正された実装は、当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。

【0081】

本開示のゲノム編集システムは、単一の特定のヌクレオチド配列を標的化し得て、または標的化してもよく、２つ以上のガイドＲＮＡの使用によって、２つ以上の特定のヌクレオチド配列を並行して編集できることに留意すべきである。複数のｇＲＮＡの使用は、本開示を通して「多重化」と称され、関心のある複数の無関係の標的配列を標的化するため、または単一の標的ドメイン内に複数のＳＳＢもしくはＤＳＢを形成するため、場合によってはこのような標的ドメイン内で特定の編集をするために用いられ得る。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍａｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｅｄｅｒ）による国際公開第２０１５／１３８５１０号パンフレットは、潜在的なスプライス部位の生成をもたらし、その結果として遺伝子の機能を低下させまたは排除する、ヒトＣＥＰ２９０遺伝子における点変異を修正する（Ｃ．２９９１＋１６５５ＡからＧへ）ためのゲノム編集システムを記載する。Ｍａｅｄｅｒのゲノム編集システムは、点変異の両側の（すなわちそれを挟む）配列を標的化する２つのガイドＲＮＡを利用して、変異側面に位置するＤＳＢを形成する。これは次に、変異を含む介在配列の欠失を促進し、それによって潜在的スプライス部位を除去し正常な遺伝子機能を回復させる。

【0082】

別の例とし、参照により本明細書に援用される、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏら（「Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏ」）による国際公開第２０１６／０７３９９０号パンフレットは、「二重ニッカーゼシステム」と称される配置である、Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｄ１０Ａなどの一本鎖ニックを生じるＣａｓ９）と組み合わせて、２つのｏｇＲＮＡを利用するゲノム編集システムを記載する。Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏの二重ニッカーゼシステムは、１つまたは複数のヌクレオチドでオフセットされている目的の配列の逆ストランドに、２つのニックを生じるように構成され、上記ニックが組み合わされて、オーバーハングを有する二本鎖切断を作り出す（Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏの場合には５’であるが３’オーバーハングもまた可能である）。オーバーハングは、次に、いくつかの状況において相同指向修復事象を促進し得る。そして別の例として、Ｐａｌｅｓｔｒａｎｔらによる国際公開第２０１５／０７００８３号パンフレット（「Ｐａｌｅｓｔｒａｎｔ」、参照により本明細書に援用される）は、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド配列を標的化するｇＲＮＡ（「支配ＲＮＡ」と称される）を記載し、それは、例えば、いくつかのウイルス形質導入細胞において、さもなければ構成的に発現され得るＣａｓ９の一過性発現を可能にするために、１つまたは複数の追加的なｇＲＮＡを含んでなるゲノム編集システムに含まれ得る。これらの多重化用途は限定的ではなく、むしろ例示的であること意図しており、当業者は、その他の多重化用途が一般に、本明細書に記載のゲノム編集システムと適合性があることを理解するであろう。

【0083】

ゲノム編集システムは、場合によっては、ＮＨＥＪまたはＨＤＲなどの細胞ＤＮＡ二本鎖切機序断によって修復される二本鎖切断を形成し得る。これらの機序は、例えば、Ｄａｖｉｓ ＆ Ｍａｉｚｅｌｓ，ＰＮＡＳ，１１１（１０）：Ｅ９２４－９３２，Ｍａｒｃｈ １１，２０１４（Ｄａｖｉｓ）（Ａｌｔ－ＨＤＲについて記載する）；Ｆｒｉｔ ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ １７（２０１４）８１－９７（Ｆｒｉｔ）（Ａｌｔ－ＮＨＥＪについて記載する）；およびＩｙａｍａ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ ＩＩＩ，ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ．）２０１３－Ａｕｇ；１２（８）：６２０－６３６（Ｉｙａｍａ）（標準ＨＤＲおよびＮＨＥＪ経路について一般的に記載する）などの文献にわたり記載されている。

【0084】

ゲノム編集システムがＤＳＢを形成することによって機能する場合、このようなシステムは任意選択的に、特定の様式の二本鎖切断修復または特定の修復結果を促進しまたは容易にする、１つまたは複数の構成要素を含む。例えば、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏは、その中に一本鎖オリゴヌクレオチド「ドナー鋳型」が付加されているゲノム編集システムも記載しており；ドナー鋳型は、ゲノム編集システムによって切断される細胞ＤＮＡの標的領域に組み込まれ、標的配列の変化をもたらし得る。

【0085】

特定の実施形態では、ゲノム編集システムは、一本鎖または二本鎖の切断を引き起こすことなく、標的配列を改変し、または標的配列中またはその付近の遺伝子の発現を改変する。例えば、ゲノム編集システムは、ＤＮＡに作用する機能ドメインに融合したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含んでもよく、それによって標的配列またはその発現を改変する。一例として、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、シチジンデアミナーゼ機能ドメインに結合（例えば融合）し得て、標的化されたＣからＡへの置換を生成することによって機能してもよい。例示的なヌクレアーゼ／デアミナーゼ融合体は、参照により援用される、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，４２０－４２４（１９ Ｍａｙ ２０１６）（「Ｋｏｍｏｒ」）に記載される。代案としては、ゲノム編集システムは、デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）などの切断不活性化（すなわち「デッド」）ヌクレアーゼを利用してもよく、細胞ＤＮＡの１つまたは複数の標的化領域上に安定な複合体を形成し、それによって、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ転写、クロマチンリモデリングなどをはじめとする、標的領域が関与する機能を妨害することによって、機能してもよい。

【0086】

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」という用語は、細胞内のゲノムまたはエピソーム配列などの標的配列に対する、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの特定の結合（または「標的化」）を促進する、任意の核酸を指す。ｇＲＮＡは、単分子（単一のＲＮＡ分子を含んでなり、あるいはキメラとも称される）、またはモジュール型（例えば二重化によって通常互いに結合する、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡなどの２つ以上、典型的には２つの別々のＲＮＡ分子を含んでなる）であり得る。ｇＲＮＡおよびそれらの構成部分は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ５６（２），３３３－３３９，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２３，２０１４（Ｂｒｉｎｅｒ）、参照により援用される）、およびＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏなどの文献にわたり記載される。

【0087】

細菌および古細菌では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは一般に、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質；外来配列に相補的な５’領域を含むＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；およびｃｒＲＮＡの３’領域に相補的でありそれと二重鎖を形成する、５’領域を含むトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含んでなる。いかなる理論にも拘束されることは意図されないが、この二重鎖はＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を促進し、その活性に必要であると考えられる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを遺伝子編集における使用に適合させる間に、例えば、限定されるものではないが、ｃｒＲＮＡ（その３’末端）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（その５’末端）の相補的領域を架橋する、４ヌクレオチド（例えばＧＡＡＡ）「テトラループ」または「リンカー」配列によって、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが単一の単分子またはキメラガイドＲＮＡに連結され得ることが発見された。（それらの全てが参照により本明細書に援用される、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３－８２６（「Ｍａｌｉ」）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２３３－２３９（「Ｊｉａｎｇ」）；およびＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－８２１（「Ｊｉｎｅｋ」））。

【0088】

ガイドＲＮＡは、単分またはモジュラー型を問わず、編集が望まれる細胞のゲノム中のＤＮＡ配列などの標的配列中の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的な「標的化ドメイン」を含む。標的化ドメインは、限定されるものではないが、「ガイド配列」（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｓｅｐ；３１（９）：８２７－８３２，（「Ｈｓｕ」）、参照により本明細書に援用される）、「相補的領域」（Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏ）、「スペーサー」（Ｂｒｉｎｅｒ）および包括的に「ｃｒＲＮＡ」（Ｊｉａｎｇ）をはじめとする文献において、様々な名称で呼ばれている。それらに与えられた名称とはかかわりなく、標的化ドメインは、典型的には１０～３０ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では１６～２４ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長）であり、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡの場合には５’末端またはその付近にあり、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡの場合には３’末端またはその付近にある。

【0089】

標的化ドメインに加えて、ｇＲＮＡは、典型的には（以下で考察されるように必ずしもそうとは限らないが）、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の形成または活性に影響を及ぼしてもよい複数のドメインを含む。例えば、上記のように、ｇＲＮＡの第１および第２の相補的ドメイン（リピート：アンチリピート二重鎖とも称される）によって形成される二重鎖構造は、Ｃａｓ９の認識（ＲＥＣ）ローブと相互作用して、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介し得る。（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６，９３５－９４９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２７、２０１４（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４）およびＮｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６２，１１１３－１１２６，Ａｕｇｕｓｔ ２７，２０１５（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１５）、どちらも参照により本明細書に援用される）。第１および／または第２の相補的ドメインは、ＲＮＡポリメラーゼによって終結シグナルとして認識され得る、１つまたは複数のポリＡ鎖を含有してもよいことに留意すべきである。そのため、第１および第２の相補的ドメインの配列は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒに記載されるようなＡ－Ｇスワップの使用、あるいはＡ－Ｕスワップの使用を通じて任意選択的に修飾され、これらの区域が除去されてＲＮＡの完全な生体外転写が促進される。第１および第２の相補的ドメインに対するこれらのおよびその他の類似の改変は、本開示の範囲内である。

【0090】

第１および第２の相補的ドメインと共に、Ｃａｓ９ｇ ＲＮＡは典型的には、生体内でヌクレアーゼ活性に関与するが、生体外では必ずしも関与しない、２つ以上の追加的な二重鎖領域を含む。（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１５）。第二の相補的ドメインの３’部分の付近にある第１のステムループ１は、「近位ドメイン」（Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏ）、「ステムループ１」（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４および２０１５）、および「ｎｅｘｕｓ」（Ｂｒｉｎｅｒ）など様々に呼ばれる。１つまたは複数の追加的なステムループ構造は、一般に、ｇＲＮＡの３’末端の付近に存在し、数は種によって異なり、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡが典型的に２つの３’ステムループ（リピート：アンチリピート二重鎖を含む合計４つのステムループ構造：アンチリピート二重鎖）を含む一方で、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびその他の種は、単に１つのみ有する（合計３つのステムループ構造）。種毎にまとめられた、保存的ステムループ構造（およびより一般的にはｇＲＮＡ構造）の説明は、Ｂｒｉｎｅｒに提供されている。

【0091】

前述の説明は、Ｃａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡに焦点を当ててきたが、ここまでに記載されたものといくつかの点で異なるｇＲＮＡを利用する、その他のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼが発見されまたは発明されている（または将来的に発見される可能性がある）ことを理解されたい。例えば、Ｃｐｆ１（「Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ １」由来のＣＲＩＳＰＲ）は最近発見されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼであり、機能するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７７１ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２２，２０１５（Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｉ）、参照により本明細書に援用される）。Ｃｐｆ１ゲノム編集システムにおいて使用するためのｇＲＮＡは、一般に、標的化ドメインおよび相補的ドメイン（交互に「ハンドル」と称される）を含む。Ｃｐｆ１と共に使用するためのｇＲＮＡにおいて、標的化ドメインは通常、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡに関して上述したように、５’末端ではなくむしろ３’末端またはその付近に存在する（ハンドルはＣｐｆ１ ｇＲＮＡの５’末端またはその付近にある）ことにも留意すべきである。

【0092】

しかし、当業者は、異なる原核生物種由来のｇＲＮＡ間に、またはＣｐｆ１とＣａｓ９のｇＲＮＡ間に構造上の相違が存在してもよいが、ｇＲＮＡが作用する原理は概して一貫していることを理解するであろう。この動作の一貫性のために、ｇＲＮＡは、広い意味で、それらの標的化ドメイン配列によって定義され得て、当業者は、所与の標的化ドメイン配列が、単分子またはモジュール型ｇＲＮＡや、１つまたは複数の化学修飾および／または配列修飾（置換、追加のヌクレオチド、切断など）を含むｇＲＮＡをはじめとする、任意の適切なｇＲＮＡに組み込まれ得ることを理解するであろう。したがって、本開示における提示の経済性のために、ｇＲＮＡはそれらの標的化ドメイン配列の観点のみから記載されてもよい。

【0093】

より一般的には、当業者は、本開示のいくつかの態様が、複数のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用して実装され得るシステム、方法、および組成物に関することを理解するであろう。この理由から、別段の指定がない限り、ｇＲＮＡという用語は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の特定の種と適合性のｇＲＮＡだけでなく、任意のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に使用され得る任意の適切なｇＲＮＡを包含するものと理解されるべきである。例として、ｇＲＮＡという用語は、特定の実施形態では、ＩＩ型またはＶ型などのクラス２ ＣＲＩＳＰＲシステムまたはＣＲＩＳＰＲシステムに存在する任意のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に、またはそれに由来するか、またはそれから適合化されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼと共に、使用するためのｇＲＮＡを含み得る。

【0094】

ｇＲＮＡ設計
標的配列の選択および検証、ならびにオフターゲット分析の方法は、例えば、Ｍａｌｉ；Ｈｓｕ；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４ Ｎａｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２（３）：２７９－８４，Ｈｅｉｇｗｅｒ ｅｔａｌ．，２０１４ Ｎａｔ ｍｅｔｈｏｄｓ １１（２）：１２２－３；Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０（１０）：１４７３－５；およびＸｉａｏ Ａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０（８）：１１８０－１１８２に以前記載されている。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。非限定的例として、ｇＲＮＡ設計は、例えば、ゲノム全体にわたる総オフターゲット活性を最小化するために、使用者の標的配列に対応する潜在的な標的配列の選択を最適化するためのソフトウェアツールの使用を伴い得る。オフターゲット活性は切断に限定されないものの、各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に導出された重み付けスキームを用いて予測され得る。これらのおよびその他のガイド選択方法は、ＭａｅｄｅｒおよびＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに詳細に記載されている。

【0095】

ｇＲＮＡ修飾
ｇＲＮＡの活性、安定性、またはその他の特徴は、特定の修飾を組み込むことによって改変され得る。一例として、一過性に発現または送達された核酸は、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を起こし易くあり得る。したがって、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対して安定性を導入する、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。理論による拘束は望まないが、本明細書に記載の特定の修飾ｇＲＮＡは、細胞に導入された際に、先天性免疫応答の低下を示し得るとも考えられている。当業者は、外因性核酸、特にウイルスまたは細菌起源のものに応答して、例えば哺乳類細胞などの細胞において一般的に観察される特定の細胞応答を承知している。サイトカインの発現および放出の誘導ならびに細胞死を含み得るそのような応答は、本明細書に提示される修飾によって低下しまたは完全に排除されてもよい。

【0096】

このセクションで論じられる特定の例示的な修飾は、限定されるものではないが、５’末端またはその付近（例えば、５’末端の１～１０、１～５、または１～２ヌクレオチド以内）および／または３’末端またはその付近（例えば、３’末端の１～１０、１～５、または１～２ヌクレオチド以内）などのｇＲＮＡ配列中の任意の位置に含まれ得る。場合によっては、修飾は、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二重鎖、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１ ｇＲＮＡのステムループ構造、および／またはｇＲＮＡの標的化ドメインなどの機能的モチーフ内に位置する。

【0097】

一例として、ｇＲＮＡの５’末端は、以下で示されるような、真核生物のｍＲＮＡキャップ構造またはＧキャップ類似体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、または３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ抗キャップ類似体（ＡＲＣＡ））を含み得る：

【0098】

キャップまたはキャップ類似体は、ｇＲＮＡの化学合成または生体外転写中に含まれ得る。

【0099】

似たような路線で、ｇＲＮＡの５’末端には５’三リン酸基が欠如し得る。例えば、生体外転写ｇＲＮＡを（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを使用することで）ホスファターゼ処理して、５’三リン酸基が除去され得る。

【0100】

別の一般的な修飾は、ｇＲＮＡの３’末端に、ポリＡトラクトと称される複数の（例えば、１～１０、１０～２０、または２５～２００個の）アデニン（Ａ）残基を付加することを伴う。ポリＡ配列は、ポリアデノシンポリメラーゼ（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を使用した生体外転写に続く化学合成中に、またはＭａｅｄｅｒに記載されるように生体内でポリアデニル化配列によって、ｇＲＮＡに付加され得る。

【0101】

本明細書に記載の修飾は任意の適切な方法で組み合わされ得て、例えば、生体内でＤＮＡベクターから転写されるか、または生体外で転写されたｇＲＮＡは、５’キャップ構造またはキャップ類似体のどちらかまたは双方と、３’ポリＡ配列とを含み得ることに留意すべきである。

【0102】

ガイドＲＮＡは、３’末端Ｕリボースで修飾され得る。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基が、アルデヒド基に酸化され得て、同時のリボース環の開環が、下に示される修飾ヌクレオシドをもたらし：

式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。

【0103】

３’末端Ｕリボースは、以下で示されるように２’３’環状リン酸エステルで修飾され得て：

式中、「Ｕ」は、未修飾または修飾ウリジンであり得る。

【0104】

ガイドＲＮＡは、例えば、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドの１つまたは複数を組み込むことによって分解に対して安定化され得る、３’ヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態では、ウリジンは、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、および５－ブロモウリジン、または本明細書に記載されるいずれかの修飾ウリジンなどの修飾ウリジンで置換され得て；アデノシンおよびグアノシンは、例えば８－ブロモグアノシンなどの例えば８位が修飾された修飾アデノシンおよびグアノシンによって、または本明細書に記載されるいずれかの修飾アデノシンまたはグアノシンによって、置換され得る。

【0105】

特定の実施形態では、糖修飾リボヌクレオチドがｇＲＮＡに組み込まれ得て、例えば２’ＯＨ基が、Ｈ、－ＯＲ、－Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、ハロ、－ＳＨ、－ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であり得る）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）；またはシアノ（－ＣＮ）から選択される基によって置換される。特定の実施形態では、リン酸骨格は、例えばホスホロチオエート（ＰｈＴｘ）基で、本明細書に記載されるように修飾され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡのヌクレオチドの１つまたは複数は、それぞれ独立して、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチルなどの２’－糖修飾、または例えば２’－Ｆもしくは２’－Ｏ－メチル、アデノシン（Ａ）、２’－Ｆもしくは２’－Ｏ－メチル、シチジン（Ｃ）、２’－Ｆもしくは２’－Ｏ－メチル、ウリジン（Ｕ）、２’－Ｆもしくは２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）１，２’－Ｆもしくは２’－Ｏ－メチル、グアノシン（Ｇ）をはじめとする２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅ０）、およびそれらの任意の組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、修飾または未修飾ヌクレオチドであり得る。

【0106】

ガイドｇＲＮＡは、「ロックド」核酸（ＬＮＡ）もまた含み得て、その中で、２’ＯＨ基は、例えば、同一リボース糖の４’炭素へのＣ１～６アルキレンまたはＣ１～６ヘテロアルキレン架橋によって結合され得る。このような架橋を提供するために、限定されるものではないが、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ－アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）、およびアミノアルコキシまたはＯ（ＣＨ_２）_ｎ－アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る）をはじめとする任意の適切な部分が使用され得る。

【0107】

特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、多環である修飾ヌクレオチド（例えば、トリシクロ；およびグリコール核酸（ＧＮＡ）などの「アンロックド」形態（例えば、その中でリボースがリン酸ジエステル結合に付着するグリコール単位で置換される、Ｒ－ＧＮＡまたはＳ－ＧＮＡ）、またはトレオース核酸（その中でリボースがα－Ｌ－トレオフラノシル－（３’→２’）で置換される、ＴＮＡ）を含み得る。

【0108】

一般に、ｇＲＮＡは、酸素を有する５員環の糖類であるリボースを含む。代表的な修飾ｇＲＮＡとしては、限定されるものではないが、リボース中の酸素の置換（例えば、イオウ（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えば、メチレンまたはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボース環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボース環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホロアミダート骨格もまた有するモルホリノなどの追加的な炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環を形成する）が挙げられる。糖類似体改変の大部分は２’位に局在するが、４’位をはじめとするその他の部位も修飾を受け入れやすい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、４’－Ｓ、４’－Ｓｅまたは４’－Ｃ－アミノメチル－２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含んでなる。

【0109】

特定の実施形態では、例えば７－デアザ－アデノシンなどのデアザヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。特定の実施形態では、例えばＮ６－メチルアデノシンなどのＯ－およびＮ－アルキル化ヌクレオチドが、ｇＲＮＡに組み込まれ得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中の１つまたは複数のまたは全てのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである。

【0110】

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ
本開示によるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１などの天然クラス２ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ならびにそれに由来するか、またはそれから得られるその他のヌクレアーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。機能的には、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、（ａ）ｇＲＮＡと相互作し（例えば複合体形成し）；（ｂ）ｇＲＮＡと共に、（ｉ）ｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的な配列と、任意選択的に（ｉｉ）以下でより詳細に説明される「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」と称される追加的な配列とを含む、ＤＮＡの標的領域と結合し、任意選択的にそれを切断または修飾するヌクレアーゼとして定義される。以下の実施例が例証するように、たとえ同一ＰＡＭ特異性または切断活性を共有する個々のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ間に変動が存在し得るとしても、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、広い意味で、それらのＰＡＭ特異性および切断活性によって定義され得る。当業者は、本開示のいくつかの態様が、特定のＰＡＭ特異性および／または切断活性を有する任意の適切なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用して実装され得るシステム、方法、および組成物に関することを理解するであろう。この理由から、別段の指定がない限り、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼという用語は総称として理解されるべきであり、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのいかなる特定の型（例えば、Ｃａｓ９と対比したＣｐｆ１）、種（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）と対比したＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、またはバリエーション（例えば、完全長と対比した短縮型または分割；天然ＰＡＭ特異性と対比した操作されたＰＡＭ特異性など）にも限定されない。

【0111】

ＰＡＭ配列は、ｇＲＮＡ標的化ドメイン（または「スペーサー」）に相補的な「プロトスペーサー」配列とのその配列関係からその名称を取っている。プロトスペーサー配列と共に、ＰＡＭ配列は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡの組み合わせのための標的領域または配列を規定する。

【0112】

様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、ＰＡＭとプロトスペーサーとの間の異なる配列関係を必要とし得る。一般に、Ｃａｓ９は、下部鎖または非相補鎖上に視覚化されたプロトスペーサーの３’にあるＰＡＭ配列を認識する：

【0113】

他方、Ｃｐｆ１は一般に、下部鎖または非相補鎖上に視覚化されたプロトスペーサーの５’にあるＰＡＭ配列を認識する：

【0114】

ＰＡＭおよびプロトスペーサーの特定の配列の向きを認識することに加えて、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはまた、特定のＰＡＭ配列を認識し得る。例えばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９は、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶのＰＡＭ配列を認識し、その中ではＮ残基が、ｇＲＮＡ標的化ドメインによって認識される領域の３’に隣接する。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識する。そしてＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆ１は、ＴＴＮ ＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は様々なＲＮＡ誘導ヌクレアーゼについて同定されており、新規ＰＡＭ配列を同定するためのストラテジーは、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０，３８５－３９７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ５，２０１５によって記載されている。操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、参照分子のＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有し得ることにも留意すべきである（例えば、操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの場合、参照分子はＲＮＡ誘導ヌクレアーゼがそれに由来する天然に存在する変異型であってもよく、または操作されたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼとの最大アミノ酸配列相同性を有する天然に存在する変異型であってもよい）。

【0115】

それらのＰＡＭ特異性に加えて、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、それらのＤＮＡ切断活性によって特徴付けられ得て：天然ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、典型的には標的核酸中でＤＳＢを形成するが、ＳＳＢのみを生じ、または全く切断しない、操作された変異型が生成されている（上で論じた）Ｒａｎ ＆ Ｈｓｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４（６），１３８０－１３８９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １２，２０１３（Ｒａｎ）、参照により本明細書に援用される）。

【0116】

Ｃａｓ９
結晶構造は、単分子ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと複合体形成した、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（Ｊｉｎｅｋ２０１４）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９について決定されている（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ ２０１４；およびＮｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１５）。

【0117】

天然に存在するＣａｓ９タンパク質は、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブの２つのローブを含んでなり、そのそれぞれは特定の構造ドメインおよび／または機能ドメインを含んでなる。ＲＥＣローブは、アルギニンに富む架橋らせん（ＢＨ）ドメイン、および少なくとも１つのＲＥＣドメイン（例えば、ＲＥＣ１ドメイン、任意選択的にＲＥＣ２ドメイン）を含んでなる。ＲＥＣローブは、その他の既知のタンパク質と構造的類似性を共有せず、独特の機能ドメインであることが示唆される。いかなる理論による拘束も望まない一方で、変異解析は、ＢＨおよびＲＥＣドメインの特定の機能的役割を示唆し：ＢＨドメインがｇＲＮＡ：ＤＮＡ認識において役割を果たすようようである一方で、ＲＥＣドメインはｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二重鎖と相互作用し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介すると考えられている。

【0118】

ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、およびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含んでなる。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーとの構造的類似性を共有し、標的核酸の非相補的（すなわち下部）鎖を切断する。それは、２つ以上の分割ＲｕｖＣモチーフ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）中のＲｕｖＣＩ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩなど）から形成されてもよい。その一方で、ＨＮＨドメインは、ＨＮＮエンドヌクレアーゼモチーフと構造的に類似しており、標的核酸の相補的（すなわち上部）鎖を切断する。その名前が示唆するように、ＰＩドメインはＰＡＭ特異性に寄与する。

【0119】

Ｃａｓ９の特定の機能は（それによって必ずしも完全に決定されるわけではないが）上記の特定のドメインにリンクされている一方で、これらのそのおよび他の機能は、その他のＣａｓ９ドメインによって、またはどちらかのローブ上の複数のドメインによって媒介または影響されてもよい。例えば、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４に記載されるように、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９においては、ｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二重鎖がＲＥＣとＮＵＣローブの間の溝に入り、二重鎖中のヌクレオチドが、ＢＨ、ＰＩ、およびＲＥＣドメイン中のアミノ酸と相互作用する。第２のおよび第３のステムループ内のいくつかのヌクレオチド（ＲｕｖＣおよびＰＩドメイン）がそうであるように、第１のステムループ構造内のいくつかのヌクレオチドはまた、複数のドメイン（ＰＩ、ＢＨ、およびＲＥＣ１）内のアミノ酸と相互作用する。

【0120】

Ｃｐｆ１
ｃｒＲＮＡと、そしてＴＴＴＮ ＰＡＭ配列などの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ標的と複合体形成したアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種Ｃｐｆ１の結晶構造が、Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｍａｙ ５；１６５（４）：９４９－９６２（Ｙａｍａｎｏ）、参照により本明細書に援用される）によって解析されている。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１には、ＲＥＣ（認識）ローブとＮＵＣ（ヌクレアーゼ）ローブの２つのローブがある。ＲＥＣローブはＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインを含み、これらはいかなる既知のタンパク質構造とも類似性がない。その一方で、ＮＵＣローブは、３つのＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ、－ＩＩ、および－ＩＩＩ）と１つのＢＨドメインとを含む。しかし、Ｃａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１ ＲＥＣローブはＨＮＨドメインを欠いており、既知のタンパク質構造との類似性を欠くその他のドメイである、構造的にユニークなＰＩドメインと、３つのウェッジ（ＷＥＤ）ドメイン（ＷＥＤ－Ｉ、－ＩＩ、および－ＩＩＩ）と、ヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）ドメインとを含む。

【0121】

Ｃａｓ９およびＣｐｆ１が構造および機能において類似性を共有する一方で、特定のＣｐｆ１活性はいずれのＣａｓ９ドメインにも類似していない、構造ドメインによって媒介されることを理解すべきである。例えば、標的ＤＮＡの相補鎖の切断は、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインとは配列的にかつ空間的に異なる、Ｎｕｃドメインによって媒介されるようである。さらに、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡの非標的化部分（ハンドル）は、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ中のリピート：アンチリピート二重鎖によって形成されるステムループ構造ではなく、むしろ偽結び目構造を取る。

【0122】

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの修飾
上述したＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、様々な用途に有用であり得る活性および特性を有するが、当業者は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼもまた、場合によっては修飾されて、切断活性、ＰＡＭ特異性、またはその他の構造的もしくは機能的特徴が改変され得ることを認識するであろう。

【0123】

まず、切断活性を改変する修飾に目を向けると、ＮＵＣローブ内のドメインの活性を低減または排除する変異が上に記載されている。ＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９ ＨＮＨドメイン、またはＣｐｆ１ Ｎｕｃドメインに生成されてもよい例示的な変異は、Ｒａｎ ａｎｄ Ｙａｍａｎｏ、ならびにＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。一般に、２つのヌクレアーゼドメインの１つの活性を低減または排除する変異は、ニッカーゼ活性を有するＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをもたらすが、ニッカーゼ活性の種類は、いずれのドメインが不活性化されるかによって変化することに留意すべきである。一例として、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインの不活性化は、以下に示されるように相補鎖または上部鎖を切断するニッカーゼをもたらす（ここで、Ｃは切断部位を示す）：

【0124】

他方、Ｃａｓ９ ＨＮＨドメインの不活性化は、下部鎖または非相補鎖を切断するニッカーゼをもたらす：

【0125】

天然に存在するＣａｓ９参照分子と比較したＰＡＭ特異性の修飾は、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらによって、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ Ｉ））、およびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｄｅｃ；３３（１２）：１２９３－１２９８（Ｋｌｉｅｎｓｔｉｖｅｒ ＩＩ））の双方について記載されている。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒらはまた、Ｃａｓ９の標的化忠実度を改善する修飾についても記載している（Ｎａｔｕｒｅ，２０１６ Ｊａｎｕａｒｙ ２８；５２９，４９０－４９５（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＩＩＩ））。これらの参考文献のそれぞれは、参照により本明細書に援用される。

【0126】

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５Ｆｅｂ；３３（２）：１３９－４２（Ｚｅｔｓｃｈｅ ＩＩ）、参照により援用される）、およびＦｉｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１５ Ｊｕｌ１；５：１０７７７（Ｆｉｎｅ）、参照により援用される）によって記載されるように、２つまたはそれ以上の部分に分割される。

【0127】

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、特定の実施形態では、例えば、ｇＲＮＡ結合、標的およびＰＡＭ認識、ならびに切断活性をなおも維持しながら、ヌクレアーゼのサイズを低下させる１つまたは複数の欠失を通じて、サイズ最適化または短縮され得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、任意選択でリンカーによって、別のポリペプチド、ヌクレオチド、またはその他の構造に、共有結合的にまたは非共有結合的に結合する。例示的な結合ヌクレアーゼおよびリンカーは、本明細書におけるあらゆる目的のために参照により援用される、Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，５７７－５８２（２０１４）によって記載される。

【0128】

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはまた、任意選択的に、核局在化シグナルをはじめとするが、これに限定されるものではない標識を含んで、核内へのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質の移動を容易にする。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、Ｃ末端および／またはＮ末端の核局在化シグナルを組み込み得る。核局在化配列は、当該技術分野で公知であり、Ｍａｅｄｅｒおよび他の箇所に記載される。

【0129】

前述の修飾のリストは、本質的に例示的であることを意図しており、当業者は、本開示に鑑みて、その他の修正が特定の用途において可能であり、または望ましくあってもよいことを理解するであろう。したがって、簡潔さのために、本開示の例示的なシステム、方法、および組成物は、特定のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを参照して提示されるが、使用されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼはそれらの動作原理を変えない様式で改変されてもよいものと理解されるべきである。このような改変は、本開示の範囲内である。

【0130】

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸
例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１またはその機能性断片などのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸が、本明細書で提供される。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸が、以前記載されている（例えば、Ｃｏｎｇ ２０１３；Ｗａｎｇ ２０１３；Ｍａｌｉ ２０１３；Ｊｉｎｅｋ ２０１２を参照されたい）。

【0131】

場合によっては、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、合成核酸配列であり得る。例えば、合成核酸分子は化学修飾され得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、以下の特性の１つまたは複数の（例えば全て）を有するであろう：それはキャップされ得て；ポリアデニル化され得て；５－メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換され得る。

【0132】

合成核酸配列もまたコドン最適化され得て、例えば、少なくとも１つの一般的でないコドンまたはそれほど一般的でないコドンが、一般的なコドンによって置き換えられる。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載される哺乳類発現系内での発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導し得る。コドン最適化されたＣａｓ９コード配列の例は、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに提示されている。

【0133】

さらに、または代案としては、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含んでなってもよい。核局在化配列は、当該技術分野で公知である。

【0134】

候補分子の機能解析
候補ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、およびそれらの複合体は、当該技術分野で公知の標準法によって評価され得る。例えば、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏを参照されたい。ＲＮＰ複合体の安定性は、下述される示差走査型蛍光定量法によって評価されてもよい。

【0135】

示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）
ｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを含んでなるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の熱安定性は、ＤＳＦによって測定され得る。ＤＳＦ技術は、例えばｇＲＮＡなどの結合ＲＮＡ分子の添加などの好ましい条件下で増加し得る、タンパク質の熱安定性を測定する。

【0136】

ＤＳＦアッセイは、任意の適切なプロトコルに従って実施され得て、限定されるものではないが、（ａ）異なる条件（例えば、異なる化学量論比のｇＲＮＡ：ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼタンパク質、異なる緩衝液など）を試験して、ＲＮＰ形成のための最適条件を同定すること；および（ｂ）ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡの修飾（例えば、化学修飾、配列改変など）を試験して、ＲＮＰ形成または安定性を改善する修飾を同定することをはじめとする、任意の適切な設定で使用され得る。ＤＳＦアッセイの１つの読み取りは、ＲＮＰ複合体の融解温度の変化であり；比較的高い変化は、ＲＮＰ複合体が、より低い変化によって特徴付けられる標準ＲＮＰ複合体と比較して、より安定している（したがってより大きな活性、またはより好ましい形成動態、分解動態、または別の機能特性を有してもよい）ことを示唆する。ＤＳＦアッセイがスクリーニングツールとして展開される場合、閾値融解温度変化が特定されてもよく、それによって、結果は、閾値以上の融解温度変化を有する１つまたは複数のＲＮＰである。例えば、閾値は、５～１０°Ｃ（例えば、５℃°、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃）またはそれ以上であり得て、結果は、閾値以上の融解温度変化によって特徴付けられる１つまたは複数のＲＮＰであってもよい。

【0137】

ＤＳＦアッセイ条件の２つの非限定的例は、下記の通りである：
ＲＮＰ複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、水中の固定濃度（例えば２μＭ）のＣａｓ９＋１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ－６６５０）を３８４ウェルプレート内に分注する。次に、様々なｐＨおよび塩を有する溶液中に希釈された、等モル量のｇＲＮＡを添加する。室温で１０分間インキュベートし、短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行する。

【0138】

第２のアッセイは、様々な濃度のｇＲＮＡを、上記のアッセイ１からの最適緩衝液中の固定濃度（例えば２μＭ）のＣａｓ９ｉに混合し、３８４ウェルプレート内で（例えば室温で１０分間）インキュベートすることからなる。等容積の最適緩衝液＋１０×ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ－６６５０）を添加し、プレートをＭｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ接着剤（ＭＳＢ－１００１）で密封する。短時間遠心分離してあらゆる気泡を除去した後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸマネージャーソフトウエアと共に、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）リアルタイムシステムＣ１０００ Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラーを使用して、２０℃から９０℃まで、１０秒毎に１℃の増分で勾配を実行する。

【0139】

ゲノム編集ストラテジー
上述したゲノム編集システムを使用して、本開示の様々な実施形態において、細胞内で、または細胞から得られたＤＮＡの標的領域内で編集する（すなわち改変する）。特定の編集をするための様々なストラテジーが本明細書に記載され、これらのストラテジーは、一般に所望の修復結果、個々の編集（例えば、ＳＳＢまたはＤＳＢ）の数と位置、およびこのような編集の標的部位によって記述される。

【0140】

ＳＳＢまたはＤＳＢの形成を伴うゲノム編集ストラテジーは、（ａ）標的領域の全部または一部の欠失；（ｂ）標的領域の全部または一部内への挿入またはその置換；または（ｃ）標的領域の全部または一部の中断をはじめとする修復結果によって特徴付けられる。このグループ分けは、任意の特定の理論またはモデルを制限することもまたはそれに拘束されることも意図されず、提示の経済性のためだけに提供される。当業者は、列挙される結果が相互に排他的でなく、いくつかの修復がその他の結果をもたらしてもよいことを理解するであろう。特定の編集ストラテジーまたは方法の説明は、別段の指定がない限り、特定の修復結果を必要とすると理解されるべきではない。

【0141】

標的領域の置換は、例えば、ＨＤＲ経路によって媒介される２つの修復結果である、遺伝子修正または遺伝子変換を通じた、相同配列による、標的領域内に存在する配列の全部または一部の置換を一般に伴う。ＨＤＲは、以下でより詳細に記載されるように、一本鎖または二本鎖であり得るドナー鋳型の使用によって促進される。一本鎖または二本鎖鋳型は外因性であり得て、その場合、それらは遺伝子修正を促進し、またはそれらは内因性（例えば、細胞ゲノム中の相同配列）であり得て、遺伝子変換を促進する。外因性鋳型は、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，３３９－３４４（２０１６）、（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、参照により援用される）によって記載されるように、非対称オーバーハングを有することができる（すなわち、ＤＳＢの部位に相補的な鋳型の部分は、鋳型内の中心に位置するのではなく、むしろ３’または５’方向にオフセットされていてもよい）。鋳型が一本鎖である場合、それは標的領域の相補的（上部）または非相補的（下部）鎖のどちらかに対応し得る。

【0142】

ＲａｎおよびＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されるように、遺伝子変換および遺伝子修正は、場合によっては、標的領域内またはその周囲に、１つまたは複数のニックを形成することによって促進される。場合によっては、二重ニッカーゼストラテジーを使用して、２つのオフセットＳＳＢが形成され、次に、オーバーハング（例えば５’オーバーハング）を有する単一のＤＳＢが形成される。

【0143】

標的配列の全部または一部の中断および／または欠失は、様々な修復結果によって達成され得る。一例として、ＬＣＡ１０変異についてＭａｅｄｅｒに記載されているように、標的領域を挟む２つ以上のＤＳＢを同時に生成することによって配列を欠失させ得て、次にそれはＤＳＢが修復される際に切除される。別の例として、配列は、一本鎖オーバーハングを有する二本鎖切断の形成と、それに続く修復前のオーバーハングのヌクレオチド末端加水分解プロセシングによって生成される欠失によって、中断され得る。

【0144】

標的配列中断の１つの特定のサブセットは、標的配列中のインデルの形成によって媒介され、その中では修復結果は典型的にはＮＨＥＪ経路（Ａｌｔ－ＮＨＥＪをはじめとする）によって媒介される。ＮＨＥＪは、そのインデル変異との関連のために「誤りがちな」修復経路と称される。しかし、場合によっては、ＤＳＢはその周囲の配列の改変なしにＮＨＥＪによって修復され（いわゆる「完璧」または「無瘢痕」修復）；これは一般に、ＤＳＢの両端が完全にライゲートされることを必要とする。その一方で、インデルは、それらがライゲートされる前の遊離ＤＮＡ末端の酵素的プロセシングから生じると考えられ、それは、片方または両方の遊離末端の片方または両方の鎖にヌクレオチドを付加しおよび／またはそれから除去する。

【0145】

遊離ＤＳＢ末端の酵素的プロセシングは、本質的に確率論的であり得るので、インデル変異は変動する傾向があり、分布に沿って発生し、特定の標的部位、使用される細胞型、使用されるゲノム編集ストラテジーをはじめとする、様々な要因によって影響され得る。インデル形成について限定的に一般化することは可能であり：単一のＤＳＢの修復によって形成される欠失は、最も一般的には１～５０ｂｐの範囲であるが、１００～２００ｂｐを超えることもあり得る。単一のＤＳＢの修復によって形成された挿入はより短くなる傾向があり、しばしば切断部位を直接取り囲む配列の短い重複を含む。しかし、大きな挿入を得ることが可能であり、これらの場合、挿入配列は、しばしば、ゲノムのその他の領域に、または細胞内に存在するプラスミドＤＮＡに由来が突き止められている。

【0146】

インデル変異は、そしてインデルを生成するように構成されたゲノム編集システムは、例えば、特定の最終配列の生成が必要でない場合に、および／またはフレームシフト変異が耐容される場合に、標的配列を中断するのに有用である。それらはまた、所望の特定の配列が所与の部位におけるＳＳＢまたはＤＳＢの修復から優先的に生じる傾向がある限りにおいて、特定の配列が好ましい状況で有用であり得る。インデル変異はまた、特定のゲノム編集システムおよびそれらの構成要素の活性を評価またはスクリーニングするための有用なツールでもある。これらのおよびその他の設定では、インデルは、（ａ）ゲノム編集システムと接触される細胞のゲノムにおけるそれらの相対的および絶対的頻度、および（ｂ）例えば、未編集の配列に対する±１、±２、±３などの数値的な差の分布によって特徴付けられ得る。一例として、リード発見設定では、複数のｇＲＮＡをスクリーニングして、制御された条件下でのインデル読み取りに基づいて、標的部位での切断を最も効率的に推進するｇＲＮＡが同定され得る。閾値頻度以上のインデルを生成するガイド、またはインデルの特定の分布を生成するガイドが、さらなる研究および開発のために選択され得る。インデルの頻度および分布はまた、例えば、ｇＲＮＡを一定に保ち、その他の特定の反応条件または送達方法を変化させることによって、異なるゲノム編集システムの実装または製剤化および送達方法を評価するための読み取りとしても有用であり得る。

【0147】

多重ストラテジー
上記の例示的なストラテジーは、単一のＤＳＢによって媒介される修復結果に焦点を合わせている一方で、本開示によるゲノム編集システムを使用して、同一遺伝子座または異なる遺伝子座のどちらかで２つ以上のＤＳＢが生成されてもよい。複数のＤＳＢ、またはＳＳＢの形成を含む編集ストラテジーは、例えばＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載される。

【0148】

ドナー鋳型設計
ドナー鋳型設計は、例えばＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏなどの文献に詳細に記載される。一本鎖（ｓｓＯＤＮ）または二本鎖（ｄｓＯＤＮ）であり得るＤＮＡオリゴマードナー鋳型（オリゴデオキシヌクレオチドまたはＯＤＮ）が、ＤＳＢのＨＤＲに基づく修復を容易にするために使用され得て、それは標的ＤＮＡ配列に改変を導入し、新しい配列を標的配列に挿入し、または標的配列を完全に置換するのに特に有用である。

【0149】

一本鎖であるかまたは二本鎖であるかにかかわらず、ドナー鋳型は、切断される標的配列中のまたはその付近の（例えば、側方のまたは隣接している）ＤＮＡ領域と相同的な領域を一般に含む。これらの相同領域は、本明細書「相同性アーム」と称され、下に概略的に示される。
［５’相同性アーム］－－［置換配列］－－［３’相同性アーム］

【0150】

相同性アームは任意の適切な長さ（１つの相同性アームのみが使用される場合は皆無のヌクレオチドを含む）を有し得て、３’および５’相同性アームは、同じ長さを有し得るかまたは長さが異なり得る。適切な相同性アーム長の選択は、Ａｌｕ反復配列またはその他の非常に一般的な要素などの特定の配列との相同性またはミクロ相同性を回避したいという願望などの様々な要因によって影響を受け得る。例えば、５’相同性アームが短縮されて配列反復要素が回避され得る。その他の実施形態では、３’相同性アームが短縮されて配列反復要素が回避され得る。いくつかの実施形態では、５’および３’相同性アームの双方が短縮されて、特定の配列反復要素の包含が回避され得る。さらに、いくつかの相同性アームデザインは、編集効率を改善しまたは所望の修復結果の頻度を増加させ得る。例えば、参照により援用されるＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４，３３９－３４４（２０１６）（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）は、一本鎖ドナー鋳型の３’および５’相同性アームの相対的非対称性が、修復率および／または結果に影響を及ぼすことを見いだした。

【0151】

ドナー鋳型中の置換配列は、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏらをはじめとする他の箇所に記載されている。置換配列は、任意の適切な長さ（所望の修復結果が欠失である場合は皆無のヌクレオチドを含む）であり得て、典型的には、編集が所望される細胞内の天然配列に対して１、２、３個またはそれ以上の配列修飾を含む。１つの一般的な配列修飾は、処置が所望される疾患または病状に関連する変異を修復するための天然配列の改変を伴う。別の一般的な配列修飾は、ＳＳＢもしくはＤＳＢを生成するために使用される、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼのＰＡＭ配列またはｇＲＮＡの標的化ドメインに、相補的でありまたはそれをコードする１つまたは複数の配列を改変し、置換配列が標的部位に組み込まれた後に標的部位の反復切断を低減または排除することを伴う。

【0152】

直鎖ｓｓＯＤＮが使用される場合、それは（ｉ）標的核酸のニックの入った鎖にアニールされ、（ｉｉ）無傷の標的核酸鎖にアニールされ、（ｉｉｉ）標的核酸のプラス鎖にアニールされ、および／または（ｉｖ）標的核酸のマイナス鎖にアニールされるように構成され得る。ｓｓＯＤＮは、例えば、約１５０～２００ヌクレオチドまたはそれ以下（例えば、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ヌクレオチド）などの任意の適切な長さを有してもよい。

【0153】

鋳型核酸はまた、例えばウイルスゲノムなどの核酸ベクター、または例えばプラスミドなどの環状二本鎖ＤＮＡであり得ることに留意すべきである。ドナー鋳型を含んでなる核酸ベクターは、その他のコーディングまたは非コード要素を含み得る。例えば、鋳型核酸は、特定のゲノム骨格要素（例えば、ＡＡＶゲノムの場合には逆方向末端反復）を含み、任意選択的に、ｇＲＮＡおよび／またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードする追加の配列を含む、ウイルスゲノムの一部として（例えばＡＡＶまたはレンチウイルスゲノム中で）送達され得る。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、１つまたは複数のｇＲＮＡによって認識される標的部位に隣接しまたはそれで挟まれ、ドナー鋳型の一端または両端における遊離ＤＳＢの形成を容易にし得て、それは、同一ｇＲＮＡを使用して細胞ＤＮＡ中に形成された、対応するＳＳＢまたはＤＳＢの修復に関与し得る。ドナー鋳型として使用するのに適した例示的な核酸ベクターは、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載される。

【0154】

どのような形態が使用されても、鋳型核酸は、望ましくない配列を回避するように設計され得る。特定の実施形態では、片方または両方の相同性アームが短縮され、例えば、Ａｌｕ反復、ＬＩＮＥ要素などの特定の配列反復要素との重複が回避され得る。

【0155】

標的細胞
本開示によるゲノム編集システムを使用して、細胞が操作または改変され、例えば、標的核酸が編集または改変され得る。操作は、様々な実施形態において、生体内または生体外で行い得る。

【0156】

本開示の実施形態に従って様々な細胞型が操作または改変され得て、生体内用途などの場合は、例えば、本開示によるゲノム編集システムを複数の細胞型に送達することによって、複数の細胞型が改変または操作され得る。しかし、その他の場合には、操作または改変を特定の細胞型に限定することが望ましくあってもよい。例えば、いくつかの例では、遺伝子型の修飾が細胞表現型の変化をもたらすと予想される、Ｍａｅｄｅｒの例における光受容細胞などの、限定された分化能を有する細胞または最終分化細胞を編集することが望ましくあり得る。しかし、その他の場合には、低分化型、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、幹細胞または前駆細胞を編集することが望ましいことがある。例として、細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）、または所与の用途または適応症に関連する細胞型に分化するその他の幹細胞または前駆細胞型であってもよい。

【0157】

当然ながら、改変または操作される細胞は、標的化される細胞型および／または所望の編集結果に応じて、様々に、分裂細胞または非分裂細胞である。

【0158】

細胞が生体外で操作または改変される場合、細胞は直ちに使用され得て（例えば、対照に投与され得る）、またはそれらは後で使用するために維持または保存され得る。当業者は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して、細胞が培養物中で維持または保存され得る（例えば、液体窒素中で凍結される）ことを理解するであろう。

【0159】

ゲノム編集システムの実装：送達、配合、および投与経路
上で考察されるように、本開示のゲノム編集システムは、任意の適切な方法で実装され得て、これは、限定されるものではないが、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、任意のドナー鋳型核酸をはじめとするシステムの構成要素が、ゲノム編集システムの形質導入、発現または導入をもたらすような、および／または細胞、組織または対象において所望の修復結果を引き起こすような、任意の適切な形態または形態の組み合わせで、送達、配合、または投与され得ることを意味する。ゲノム編集システム実装のいくつかの非限定的例が、表６および７に記載される。しかし、当業者は、これらの一覧が包括的でなく、その他の実装が可能であることを理解するであろう。特に表６を参照すると、この表は、単一のｇＲＮＡおよび任意のドナー鋳型を含んでなるゲノム編集システムのいくつかの例示的実装を列挙する。しかし、本開示によるゲノム編集システムには、複数のｇＲＮＡ、複数のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、およびタンパク質などのその他の構成要素が組み込まれ得て、当業者には、表に示された原理に基づいて様々な実装が明らかになるであろう。表中、［Ｎ／Ａ］は、ゲノム編集システムが、示された構成要素を含まないことを示す。

【0160】

【0161】

【0162】

表７は、本明細書に記載されるようなゲノム編集システムの構成要素のための様々な送達方法を要約する。この場合も、一覧は限定的ではなくむしろ例示的であることが意図される。

【0163】

【0164】

【0165】

ゲノム編集システムの核酸ベースの送達
本開示によるゲノム編集システムの様々な要素をコードする核酸は、当技術分野で公知の方法によってまたは本明細書に記載されるようにして、対象に投与されまたは細胞内に送達され得る。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードするＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡをコードするＤＮＡ、ならびにドナー鋳型核酸は、例えば、ベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用する）、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。

【0166】

ゲノム編集システムをコードする核酸またはその構成要素は、例えば、形質移入または電気穿孔によって裸のＤＮＡまたはＲＮＡとして細胞に直接送達され得て、あるいは標的細胞（例えば、赤血球、ＨＳＣ）による取り込みを促進する分子（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン）にコンジュゲートされ得る。表７に要約されるベクターなどの核酸ベクターもまた、使用され得る。

【0167】

核酸ベクターは、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡおよび／またはドナー鋳型などのゲノム編集システム構成要素をコードする、１つまたは複数の配列を含んでなり得る。ベクターはまた、タンパク質をコードする配列と結合する（例えば、その中に挿入されまたはそれに融合する）シグナルペプチド（例えば、核局在化、核小体局在化、またはミトコンドリア局在化のための）をコードする配列を含んでなり得る。一例として、核酸ベクターは、１つまたは複数の核局在化配列（例えば、ＳＶ４０由来の核局在化配列）を含むＣａｓ９コード配列を含み得る。

【0168】

核酸ベクターはまた、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、または内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などの任意の適切な数の調節／制御要素も含み得る。これらの要素は当該技術分野で周知であり、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載される。

【0169】

本開示による核酸ベクターは、組換えウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベクターは表７に記載され、追加的な適切なウイルスベクターおよびそれらの使用と製造は、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載される。当該技術分野で公知のその他のウイルスベクターもまた、使用され得る。さらに、ウイルス粒子を使用して、ゲノム編集システムの構成要素が、核酸および／またはペプチドの形態で送達され得る。例えば、「空の」ウイルス粒子が、任意の適切な積荷を含有するように組み立てられ得る。ウイルスベクターおよびウイルス粒子はまた、標的化リガンドを組み込んで、標的組織特異性が改変されるように操作され得る。

【0170】

ウイルスベクターに加えて、非ウイルスベクターが、本開示によるゲノム編集システムをコードする核酸を送達するために使用され得る。非ウイルス核酸ベクターの１つの重要なカテゴリーはナノ粒子であり、これは有機または無機であり得る。ナノ粒子は当該技術分野で周知であり、Ｃｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに要約される。任意の適切なナノ粒子設計を用いて、ゲノム編集システム構成要素を、またはこのような構成要素をコードする核酸を、送達し得る。例えば、有機（例えば、脂質および／またはポリマー）ナノ粒子は、本開示の特定の実施形において送達ビヒクルとして使用するのに適し得る。ナノ粒子製剤および／または遺伝子移入で使用するための例示的な脂質が表８に示され、表９は遺伝子移入および／またはナノ粒子製剤で使用するための例示的ポリマーを列挙する。

【0171】

【0172】

【0173】

【0174】

【0175】

非ウイルスベクターは標的化修飾を任意選択的に含み、取り込みを改善しおよび／または特定の細胞型を選択的に標的化する。これらの標的化修飾としては、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖（例えばＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））、および細胞透過性ペプチドが挙げられる。このようなベクターはまた、任意選択的に、融合誘導性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用し、（例えば、積荷のエンドソーム漏出を促進するための）酸誘発立体構造変化を受け、および／または例えば細胞区画への放出のための刺激切断可能ポリマーを組み込む。例えば、還元性細胞環境内で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーが、使用され得る。

【0176】

特定の実施形態では、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ構成要素および／またはｇＲＮＡ構成要素などの、ゲノム編集システムの構成要素以外の１つまたは複数の核酸分子（例えばＤＮＡ分子）が送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの構成要素の１つまたは複数と同時に送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、ゲノム編集システムの構成要素の１つまたは複数が送達される（例えば、約３０分間、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日間、３日間、１週間、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ構成要素および／またはｇＲＮＡ構成要素などのゲノム編集システムの１つまたは複数の構成要素が送達されるのとは、異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達され得る。例えば、核酸分子は、例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性が低下され得るように、例えば、組み込み欠損レンチウイルスなどのウイルスベクターによって送達され得て、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子構成要素および／またはｇＲＮＡ構成要素は、電気穿孔によって送達され得る。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるタンパク質などの治療用タンパク質をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子をコードする。

【0177】

ＲＮＰおよび／またはＲＮＡをコードするゲノム編集システム構成要素の送達
ＲＮＰ（ｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの複合体、すなわちリボ核タンパク質複合体）および／またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡは、そのいくつかがＣｏｔｔａ－Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載される当技術分野で公知の方法によって、細胞に送達されまたは対象に投与され得る。生体外では、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼをコードしおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡが、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾によって送達され得る（例えばＬｅｅ ２０１２を参照されたい）。脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、ＧａｌＮＡｃまたはその他のコンジュゲート媒介送達、およびそれらの組み合わせもまた、生体外および生体内送達のために使用され得る。

【0178】

生体外では、電気穿孔を通じた送達は、カートリッジ、チャンバーまたはキュベット内において、ドナー鋳型核酸分子の存在下または非存在下で細胞をＲＮＡ誘導ヌクレアーゼおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡと混合するステップと、１回または複数回の規定の長さおよび振幅の電気インパルスを適用するステップとを含んでなる。電気穿孔のシステムおよびプロトコルは、当該技術分野で公知であり、本開示の様々な実施形態に関連して、任意の適切な電気穿孔ツールおよび／またはプロトコルが使用され得る。

【0179】

投与経路
ゲノム編集システム、またはそのようなシステムを用いて改変または操作された細胞は、局所的または全身的を問わず、任意の適切な様式または経路によって対象に投与され得る。全身性の投与法としては、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路としては、例として、静脈内、骨髄内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、および腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成要素は、例えば、ＨＳＣ、造血幹／前駆細胞、または赤血球前駆体もしくは前駆細胞を標的化するように修飾または配合され得る。

【0180】

局所投与様式としては、例として、骨梁への骨髄内注射または骨髄腔への大腿内注射、および門脈への注入が挙げられる。特定の実施形態では、全身投与（例えば静脈内）と比較して、局所的に（例えば骨髄内に直接）投与された場合に、（全身的アプローチと比較して）有意により少量の構成要素が効果を発揮し得る。局所投与法は、治療有効量の構成要素が全身投与された場合に起こることもある、潜在的に毒性の副作用の発生を低減または排除し得る。

【0181】

投与は、周期的ボーラス（例えば、静脈内）として、または内部リザーバーもしくは外部リザーバーからの持続注入（例えば、静注バッグまたは植込み型ポンプから）として提供され得る。構成要素は、例えば、持続放出薬物送達デバイスからの連続放出によって、局所的に投与され得る。

【0182】

加えて、構成要素は、長時間にわたって放出されるように調合され得る。放出系は、生分解性材料、または拡散によって組み込まれた構成要素を放出する材料のマトリックスを含み得る。構成要素は、放出系内で均一にまたは不均一に分布し得る。多様な放出系が有用であり得るが、適切なシステムの選択は、特定の用途によって要求される放出速度に左右される。非分解性および分解性放出系の双方が使用され得る。適切な放出系としては、ポリマーおよびポリマーマトリックス、非ポリマーマトリックス、または炭酸カルシウムおよび糖（例えばトレハロース）などであるが、これに限定されるものではない、無機および有機賦形剤および希釈剤が挙げられる。放出系は、天然または合成であってもよい。しかし、通常、より信頼でき、より再現可であり、より画定された放出プロファイルを生じることから、合成放出系が好ましい。放出系材料は、異なる分子量を有する構成要素が、材料を通じたまたは材料の分解による、拡散によって放出されるように選択され得る。

【0183】

典型的な合成生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（アミノ酸）およびポリ（ペプチド）などのポリアミド；ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）、およびポリ（カプロラクトン）などのポリエステル；ポリ（無水物）；ポリオルトエステル；ポリカーボネート；およびその化学誘導体（例えば、アルキルおよびアルキレンなどの化学基の置換および付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって日常的に行われるその他の修飾）、共重合体およびそれらの混合物が挙げられる。典型的な合成非分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレングリコール）、およびポリ（テトラメチレンオキシド）などのポリエーテル；メチル、エチル、その他のアルキル、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルおよびメタクリル酸、およびポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリ（酢酸ビニル）などのビニルポリマー－ポリアクリレートおよびポリメタクリレート；ポリ（ウレタン）；セルロースと、アルキル、ヒドロキシアルキル、エーテル、エステル、ニトロセルロース、および様々な酢酸セルロースなどのその誘導体；ポリシロキサン；任意のその化学的誘導体（例えば、アルキル、アルキレンなどの化学基の置換や付加、ヒドロキシル化、酸化、および当業者によって慣例的に加えられるその他の修飾）、共重合体、およびそれらの混合物が挙げられる。

【0184】

ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）微小球もまた、使用され得る。典型的に、微小球は、中空球を形成するように構造化された、乳酸およびグリコール酸ポリマーから構成される。球は直径がおよそ１５～３０ミクロンであり得て、本明細書に記載される構成要素が負荷され得る。

【0185】

構成要素の多峰性または差動送達
当業者は、本開示に鑑みて、本明細書で開示されるゲノム編集システムの異なる構成要素が、一緒にまたは別々にそして同時にまたは非同時に送達され得ることを理解するであろう。ゲノム編集システム構成要素の別々のおよび／または非同期の送達は、ゲノム編集システムの機能に対する時間的または空間的制御を提供し、それらの活性によって引き起こされる特定の効果を制限するために、特に望ましくあり得る。

【0186】

異なるまたは差動様式は、本明細書の用法では、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子、ｇＲＮＡ、鋳型核酸、またはペイロードなどの対象構成要素分子に、異なる薬力学的または薬物動態特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択された区画、組織、または臓器に、異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間的分布をもたらし得る。

【0187】

例えば、自律複製または細胞核酸内への挿入によって、細胞内に、または細胞子孫内に残留する核酸ベクターによる送達などのいくつかの送達様式は、構成要素のより持続性の発現および存在をもたらす。例としては、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルス性などのウイルス性送達が挙げられる。

【0188】

例として、例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡなどのゲノム編集システムの構成要素は、その結果生じる、体内、特定の区画、組織または臓器に送達された構成要素の半減期または持続性に関して異なる様式によって、送達され得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡはこのような様式によって送達され得る。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子構成要素は、身体または特定の区画もしくは組織もしくは臓器に対して、より低い持続性またはより少ない曝露をもたらす様式によって送達され得る。

【0189】

より一般的には、特定の実施形態では、第１の送達様式が使用されて第１の構成要素が送達され、および第２の送達様式が使用されて第２の構成要素が送達される。第１の送達様式は、第１の薬力学的または薬物動態学的特性を与える。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、区画、組織または臓器内における、構成要素の、または構成要素をコードする核酸の、分布、持続性、または曝露であり得る。第２の送達様式は、第２の薬力学または薬物動態学的特性を与える。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、区画、組織または臓器内における、構成要素の、または構成要素をコードする核酸の、分布、持続性、または曝露であり得る。

【0190】

特定の実施形態では、例えば、分布、持続性または曝露などの第１の薬力学的または薬物動態学的特性は、第２の薬力学的または薬物動態学的特性よりも限定的である。

【0191】

特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、分布、持続性または曝露などの薬力学的または薬物動態学的特性を最適化するように、例えば最小化するように選択される。

【0192】

特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、分布、持続性または曝露などの薬力学的または薬物動態学的特性を最適化するように、例えば最大化するように選択される。

【0193】

特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、核酸、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスなどの相対的に持続性の要素の使用を含んでなる。このようなベクターは比較的持続性であるので、それらから転写される生成物は、比較的持続性になる。

【0194】

特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質などの比較的一過性の要素を含んでなる。

【0195】

特定の実施形態では、第１の構成要素はｇＲＮＡを含んでなり、送達様式は比較的持続性であり、例えば、ｇＲＮＡは、例えば、ＡＡＶまたはレンチウイルスなどのプラスミドまたはウイルスベクターから転写される。これらの遺伝子はタンパク質生成物をコードせず、ｇＲＮＡは単独で作用できないため、これらの遺伝子の転写は、生理学的に重要でない。第２の構成要素であるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子は、例えば、ｍＲＮＡとしてまたはタンパク質として一過性様式で送達され、完全ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子／ｇＲＮＡ複合体のみが存在し、短期間活性であることを確実にする。

【0196】

さらに、構成要素は、互いに補完して安全性および組織特異性を高める、異なる分子形態で、または異なる送達ベクターで、送達され得る。

【0197】

差動送達様式の使用は、性能、安全性、および／または有効性を高め得て、例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低減し得る。細菌由来Ｃａｓ酵素からのペプチドはＭＨＣ分子によって細胞表面に提示されるので、例えば、Ｃａｓ９分子などの免疫原性構成要素のより低持続性様式による送達は、免疫原性を低下させ得る。二部送達系は、これらの欠点を軽減し得る。

【0198】

差動送達様式を使用して、異なるが重複する標的領域に、構成要素が送達され得る。形成活性複合体は、標的領域の重なりの外で最小化される。したがって、特定の実施形態では、例えば、ｇＲＮＡなどの第１の構成要素は、第１の送達様式によって送達され、例えば、組織分布などの第１の空間的分布がもたらされる。例えば、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子などの第２の構成要素は、第２の送達様式によって送達され、例えば、組織分布などの第２の空間的分布がもたらされる。特定の実施形態では、第１の様式は、リポソーム、例えば、ポリマーナノ粒子などのナノ粒子、および例えば、ウイルスベクターなどの核酸から選択された第１の要素を含んでなる。第２の様式は、群から選択された第２の要素を含んでなる。特定の実施形態では、第１の送達様式は、例えば、細胞特異的受容体または抗体などの第１の標的化要素を含んでなり、第２の送達様式はその要素を含まない。特定の実施形態では、第２の送達様式は、例えば、第２の細胞特異的受容体または第２の抗体などの第２の標的化要素を含んでなる。

【0199】

ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子が、ウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマーナノ粒子中で送達される場合、単一組織のみを標的化することが望ましくあってもよい場合に、複数組織への送達とその中での治療活性の可能性がある。二部送達系はこの難題を解決し、組織特異性を高め得る。ｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ分子が、別個であるが重複する組織向性がある別々の送達ビヒクルにパッケージされれば、完全に機能的な複合体は、双方のベクターによって標的化される組織内のみに形成される。

【実施例】

【0200】

以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲または内容をどのようにも限定することは意図されない。

【0201】

実施例１ 自己不活性化設計はベクターに標的部位を埋め込む
自己不活性化されて普遍的に適用できる、調節可能なモジュールを含むように、ＡＡＶベクター系を操作する。これらのモジュールは、既に標的化されている内因性細胞配列を含み、追加的なｇＲＮＡを不要にする。さらに、これらのモジュールは、ウイルスゲノム中の位置、ｇＲＮＡの選択、またはＰＡＭ配列に基づいて調節し得る。

【0202】

自己不活性化設計は、内因性標的遺伝子座のものと同一またはほぼ同一のＤＮＡ配列を含む。図１Ａは、内因性細胞標的およびウイルスベクター中のＳａＣａｓ９をコードする核酸の双方を標的化する、ＳａＣａｓ９（Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９）－ｇＲＮＡ複合体を示す概略図である。

【0203】

ＡＡＶ内の標的配列は、ウイルス骨格中の部位またはＳａＣａｓ９コード配列中の４つの領域の１つのいずれかに可変的に位置し、標準のまたは最適以下のＰＡＭのどちらかを含有する。図１Ｂは、その中で操作されたＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡが別々のウイルスゲノム上でコードされている、２ベクター系を描写するカートゥーン図である。異種細胞配列を組み入れ得る、ＡＡＶゲノム中の３種類の例示的部位が、矢印で示される。タイプ（ａ）では、細胞配列をＡＡＶ骨格中の部位に挿入し；タイプ（ｂ）では、細胞配列をＳａＣａｓ９コード配列中の４つの領域（ＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３、またはＮ末端（ＮＴ））の１つに挿入する。特定のＡＡＶベクターでは、細胞配列をタイプ（ａ）とタイプ（ｂ）の双方の部位に挿入し得る。ＳａＣａｓ９およびｇＲＮＡは、単一ベクター系にもまた組み入れ得る。

【0204】

実施例２ ＳａＣａｓ９の標的部位はＳａＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を妨害しない
本実施例は、ＳａＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を妨害しない、ＳａＣａｓ９コード配列への標的部位組み入れシステムおよび方法を提供する。ＳａＣａｓ９コード配列中の４つの異なる位置（ＮＴ、ＡＣ１、ＡＣ２、またはＡＣ３）に異なる標的部位を有する、様々なプラスミドを構築した。図４Ａは、ＳａＣａｓ９コード配列中の４つの異なる位置に標的部位を有する例示的コンストラクト、ならびにヒトＶＥＧＦＡ－３ ｇＲＮＡ発現プラスミドを描写するカートゥーン図である。標的部位は、ｍＣＥＰ２９０（ガイド７、９）、ｈＣＥＰ２９０（ガイド６４、３２３、ＫＫＨ）、およびＳＥＲＰＩＮＡ１（ガイド３３３および７７６）に由来した。

【0205】

ＶＥＦＧＡ部位３を標的化するｇＲＮＡ発現プラスミドと共に、自己不活性化または対照Ｃａｓ９プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。ｍＣｈｅｒｒｙは別のプロモーターを通して発現され、プラスミドの形質移入された量を正規化するために使用された。ＧＦＰはＳａＣａｓ９と同じ転写物から発現され、転写速度と翻訳速度との間の潜在的な差を測定するために使用された。図４Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞において、自己不活性化ＳａＣａｓ９変異体が、対照ＳａＣａｓ９（ＷＴ）と比較して同様の発現レベルを示したことを示す。自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトにおけるＧＦＰ発現は、対照ＳａＣａｓ９コンストラクト（ＷＴ）のそれと相関し、自己不活性化ＳａＣａｓ９の妨害されない転写および翻訳を示した。

【0206】

野生型対照および操作された自己不活性化ＳａＣａｓ９タンパク質は、図４Ｃ～４Ｅに示されるのと同様のレベルのヌクレアーゼ活性を示した。特定標的部位に挿入された特定標的配列を有する自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトが、各図に表示される。標的部位ＡＣ１、ＡＣ２、ＡＣ３、およびＮＴは、図１Ｂおよび２に示されるコード配列中にある。標的配列ｍ７、ｍ９、ａ３、ａ７、６４－１、６４－２、３２３－１、３２３－２、ＫＫＨ－１、およびＫＫＨ－２は、下の表１０に示される、遺伝子、マウスＣＥＰ２９０（ガイドｍ７およびｍ９）、ヒトＡ１ＡＴＳＥＲＰＩＮＡ１（ガイドａ３およびａ７）、およびヒトＣＥＰ２９０（ガイド６４－１、６４－２、３２３－１、３２３－２、ＫＫＨ－１、およびＫＫＨ－２）中の配列を指す。対照（「標準」と標識される）および自己不活性化ＳａＣａｓ９ヌクレアーゼ活性をＴ７Ｅ１アッセイによって測定した。ｘ軸は、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入されたプラスミドの量を示し、ｙ軸は、Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定されたＶＥＧＦＡ－３中の％インデルを示す。

【0207】

【0208】

実施例３ 自己不活性化ＡＡＶは標的ＧＦＰプラスミドで有効性を維持する一方でＨＥＫ２９３細胞では自己不活性化する
本実施例は、強固な標的修飾と、その起源におけるＡＡＶ ＤＮＡのプールの自己標的化との双方を達成することの実現可能性を実証する、生体外データを提供する。

【0209】

ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに播種し、ＧＦＰコード配列の５’末端に埋め込まれたｇＲＮＡ標的部位を含有する、５００ｎｇ／ウェルのＧＦＰ発現プラスミドで形質移入した。翌日、ＨＥＫ２９３細胞をｇＲＮＡ ＡＡＶ標的化ＧＦＰと、野生型または自己標的化ＳａＣａｓ９ ＡＡＶのどちらかとの総用量２００，０００ｖｇ／細胞の混合物で（図１Ｂに示されるように）形質導入した。２日後、細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分析し、ＧＦＰ発現のノックダウンを判定した。実験デザインの概略図は、図５Ａに示される。図５Ｂは、野生型または操作されたＳａＣａｓ９タンパク質を含むまたは含まないＨＥＫ２９３細胞における、ＧＦＰ発現レベルを示す。対照：ＳａＣａｓ９タンパク質なし；ＷＴ：野生型ＳａＣａｓ９タンパク質；ＢＢ（ｓｕｂ）：最適以下のＰＡＭ配列ＮＮＧＲＲＡまたはＮＮＧＲＲＶを有するＡＡＶ骨格に挿入された標的部位を有する、操作されたＳａＣａｓ９；ＢＢ：標準ＰＡＭ配列を有するＡＡＶ骨格に挿入された標的部位を有する、操作されたＳａＣａｓ９；ＡＣ１：ＳａＣａｓ９コード配列のＡＣ１部位に挿入された標的部位を有する、操作されたＳａＣａｓ９；ＢＢ／ＡＣ１：ＡＡＶ骨格とＳａＣａｓ９コード配列のＡＣ１部位との双方に挿入された標的部位を有する、操作されたＳａＣａｓ９。２つの異なるｇＲＮＡコンストラクト（ｍＣＥＰ－７およびｍＣＥＰ－９）を、自己不活性化ＳａＣａｓ９タンパク質で個々に試験した。図５Ｂの左下パネルに示されるように、対照ＳａＣａｓ９コンストラクト（ＷＴ）および自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトは、ＧＦＰ発現のノックダウンにおいて同様の能力を示した。

【0210】

タンパク質もまた回収し、ＳａＣａｓ９レベルをアルファＬＩＳＡアッセイによって定量化した。図５Ｂ右下パネルは、野生型または自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトで形質導入されたＨＥＫ２９３細胞における、Ｃａｓ９タンパク質レベルを示す。自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトで形質導入された全ての細胞は、ＳａＣａｓ９タンパク質レベルの低下を示し、ＳａＣａｓ９コード配列のＡＣ１部位に挿入された操作された標的部位を有するＳａＣａｓ９コンストラクトは、ＡＡＶ骨格のみに挿入された標的部位を有するＳａＣａｓ９コンストラクトと比較して、改善された自己不活性化の有効性を示した。さらに、ｇＲＮＡｍＣＥＰ－９は、ｇＲＮＡｍＣＥＰ－７よりも強力な自己不活性化能力を示した。

【0211】

実施例４ 自己不活性化ＡＡＶは標的遺伝子座で有効性を維持する一方で網膜外植片では自己不活性化する
本実施例は、強固な標的修飾と、その起源におけるＡＡＶ ＤＮＡのプールの自己標的化との双方を達成することの実現可能性を実証する、組織外植片データを提供する。

【0212】

網膜外植片をＢＬ６マウスから抽出し、２４ウェルプレートで培養した。外植片は、１Ｅ１１ｖｇ／網膜の総用量で、ｇＲＮＡ ＡＡＶと野生型または自己標的化ＳａＣａｓ９ＡＡＶのどちらかとの混合物で（図１Ｂに示されるように）形質導入した。抽出後１４日目に、外植片からＤＮＡとＲＮＡの両方を採取した。内因性標的遺伝子座（ｍＣＥＰ２９０）を抽出したＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ＴＯＰＯベクターにクローニングして配列決定した。図６Ａに示されるように、対照（ＷＴ）または自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトは、マウス網膜外植片中の内因性標的遺伝子座で同様の遺伝子編集率を示した。

【0213】

さらに、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。ＳａＣａｓ９配列をＰＣＲにより増幅し、ＴＯＰＯベクターにクローニングして配列決定した。ＳａＣａｓ９ ｃＤＮＡ中の％インデル率は、図６Ｂに示される。

【0214】

実施例５ 自己不活性化ＡＡＶは生体内で自己不活性化する一方で標的遺伝子座を成功裏に修飾した
本実施例は、効率的な標的修飾と、その起源におけるＡＡＶ ＤＮＡのプールの自己標的化との双方を達成することの実現可能性を実証する、生体内データを提供する。ＳａＣａｓ９を有するＡＡＶおよびｍＣＥＰ２９０を標的とするｇＲＮＡをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに網膜下注射し、６週間後にＤＮＡおよびｃＤＮＡの配列決定のために網膜を採取した。

【0215】

１つの眼あたり１．１６×１０^１０個のＡＡＶの総用量で、ｇＲＮＡ ＡＡＶと、野生型対照または自己標的化ＳａＣａｓ９ ＡＡＶとの混合物（図１Ｂに示されるように）で形質導入した。形質導入の６週間後、ＤＮＡとＲＮＡの双方を動物組織から採取した。内因性標的遺伝子座をＰＣＲにより抽出ＤＮＡから増幅し、Ｍｉｓｅｑ装置上で次世代配列決定法を用いて配列決定した。図７Ａに示されるように、自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトは、陰性対照と比較して効率的な遺伝子編集率を示したが、Ｃａｓ９コード配列（ＡＣおよびＢＢ／ＡＣ）内に標的部位を有するＳａＣａｓ９コンストラクトの遺伝子編集率は、野生型対照と比較して比較的低かった。

【0216】

さらに、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。ＳａＣａｓ９配列をＰＣＲにより増幅し、ＴＯＰＯベクターにクローニングして配列決定した。野生型ＳａＣａｓ９コンストラクトと比較した、自己不活性化ＳａＣａｓ９コンストラクトの特定の転写物の倍数変化が、図７Ｂに示される。ＳａＣａｓ９コード配列を含む転写物は、ＡＣ－ｍ９－ＷＴ ＰＡＭコンストラクト（ＳａＣａｓ９コード配列のＡＣ１部位に挿入された標的部位を有する、自己不活性化ＳａＣａｓ９）、およびＢＢ－ｍ７－ＡＣ－ｍ９コンストラクト（標的部位がＡＡＶ骨格とＳａＣａｓ９コード配列のＡＣ１部位との双方に挿入された、自己不活性化ＳａＣａｓ９）で形質導入された組織において有意に減少した。

【0217】

参照による援用
全本明細書で言及される全ての文献、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。

【0218】

均等物
当業者は、日常的実験のみを用いて、本明細書に記載される特定の実施形態の多数の均等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【図1A-1B】

【図2】

【図3A-3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図6A-6B】

【図7A】

【図7B】

【配列表】

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