特許 7273118 藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-01

(45)【発行日】2023-05-12

(54)【発明の名称】藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/748 20150101AFI20230502BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230502BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230502BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230502BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20230502BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230502BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20230502BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20230502BHJP

【ＦＩ】

A61K35/748

A61P29/00

A61P35/00

A61K9/08

A61K9/10

A61K9/14

A61K9/20

A61K9/48

【請求項の数】 9

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021145982

(22)【出願日】2021-09-08

(62)【分割の表示】P 2018557183の分割

【原出願日】2017-01-20

(65)【公開番号】P2022003035

(43)【公開日】2022-01-11

【審査請求日】2021-10-08

(31)【優先権主張番号】201610037244.6

(32)【優先日】2016-01-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】518258386

【氏名又は名称】チ， チィン

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チ， チィン

(72)【発明者】

【氏名】ジアン， ディン

【審査官】柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】特表２００３－５０４４１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】Cardiovasc. Ther., (2010), 28, [4], p.e33-e45

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／７４８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

藻類プロテオグリカン抽出物又は藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物の、対象の炎症若しくは炎症性因子によって媒介される疾患を治療又は予防するための医薬の製造における使用であって、前記藻類プロテオグリカン抽出物が、
（ａ）藍藻粉末を５～２０倍量の水に溶解して、細胞壁を破壊するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物を６０～１００℃で加熱して、冷却させた後、固液分離するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた液体のｐＨ値を７未満に調整して、再度固液分離するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で得られた液体を中性ｐＨに調整して濃縮させ、必要に応じて乾燥させるステップと、を含む方法によって得られる、使用。

【請求項2】

前記炎症が、腫瘍関連炎症である、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記腫瘍が、原発性腫瘍又は転移性腫瘍である、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記腫瘍が、肉腫、リンパ腫、食道癌、膵臓癌、黒色腫、白血病、肺癌、肝癌、胃癌、乳癌、皮膚扁平上皮癌、結腸癌、又はそれらの転移性癌から選択される、請求項２又は３に記載の使用。

【請求項5】

前記炎症性因子が、ヒスタミン受容体Ｈ３、カリクレイン関連ペプチダーゼ３、カリクレイン関連ペプチダーゼ１３、インスリン様成長因子２、腫瘍壊死因子、ロイコトリエンＢ４受容体２、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド４、コロニー刺激因子３（顆粒球）、ドーパミン受容体４、血小板由来成長因子βポリペプチド、カリクレイン関連ペプチダーゼ１１、カリクレイン関連ペプチダーゼ１５、ロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＣ４シンターゼ、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、インターフェロン－α受容体２、血小板由来成長因子Ａ、血小板由来成長因子Ｃ、血小板由来成長因子Ｄ、Ｃ反応性タンパク質、カリクレイン関連ペプチダーゼ１４、ブラジキニン受容体Ｂ２、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド３、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２０、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド２、インターフェロン（α、β及びΩ）受容体１、インターロイキン３、インターロイキン９、インターロイキン１７Ｂ、インターロイキン２０、増殖分化因子２、増殖分化因子３、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻止因子）、増殖分化因子１１、骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質４、トロンボポエチン、カリクレイン関連ペプチダーゼ４、カリクレイン関連ペプチダーゼ５、ブラジキニン受容体Ｂ１及びインターフェロン－α６から選択される１種以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項6】

前記藻類プロテオグリカン抽出物が、及び／又は前記藻類プロテオグリカン抽出物が薬学的に許容される担体とともに、薬学的に許容される剤形、好ましくは経口液剤、カプセル、粉剤、錠剤、顆粒剤、丸剤、シロップ、注射剤等に調製される、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用。

【請求項7】

前記藻類プロテオグリカン抽出物が、経口、皮下、筋肉内又は腹腔内投与され、好ましくは、経口投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用。

【請求項8】

前記藻類プロテオグリカン抽出物が、１日に５～５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２０～１５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは３０～１２０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項9】

前記藻類プロテオグリカン抽出物におけるプロテオグリカンの含有量が、約５０重量％、約６０重量％、約６５重量％、約７０重量％、若しくは約７５重量％よりも多い、請求項１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、藻類抽出物含有組成物及びその使用に関し、具体的には、藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物、及びその腫瘍、疼痛、炎症若しくは炎症性因子によって媒介される疾患の治療又は予防における使用に関する。

【背景技術】

【0002】

膵臓癌は、予後が極めて不良である高悪性度胃腸癌である。膵臓癌の診断と治療とのいずれも困難である。膵臓癌のほぼ９０％は腺上皮由来の導管腺癌である。近年、膵臓癌の罹患率及び死亡率は著しく増加しており、５年生存率が１％未満で、最悪の予後を有する悪性腫瘍の１つである。膵臓癌は早期診断率が低く、手術死亡率が高く、治癒率が低い。近年、他の癌の罹患率及び死亡率でも継続的に増加している。

【0003】

癌、特に膵臓癌の治療の鍵としては、最近の研究の焦点にもなっている有効な抗腫瘍薬が求められている。

【0004】

１９７０年代以来、藻類、特に藍藻についての研究は注目されてきた。最初は、研究者は藻類の栄養価と毒性に焦点を当てている。１９７４年の国際連合食糧農業機関の会議では、スピルリナが将来の人間にとって優れた食糧資源と考えられていた。藻類生物の製薬学的用途は１９８０年代から認められて、研究は主に様々な藻類抽出物の性能に焦点を当てていた。このような研究の中、藍藻抽出物、特にスピルリナ抽出物の研究は特に顕著である。本発明の発明者らは、藻類から藻類プロテオグリカン抽出物を抽出した（中国特許ＣＮ１０９８７０７Ｃ参照）。本発明において、本発明者らは、癌、特に膵臓癌ならびに疼痛（腫瘍関連疼痛など）及び炎症（腫瘍関連炎症など）に対する藻類プロテオグリカン抽出物の治療効果を研究した。

【発明の概要】

【0005】

一態様によれば、本発明は、藻類プロテオグリカン抽出物又は藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物の、対象（個体）の膵臓癌を治療又は予防する薬物の製造における使用を提供する。前記膵臓癌は原発性癌又は転移性癌である。

【0006】

さらに、本発明は藻類プロテオグリカン抽出物又は藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物の、炎症又は疼痛を治療又は予防する薬物の製造における使用を提供する。ある特定の実施形態において、上記炎症は腫瘍関連炎症で、上記疼痛は腫瘍関連疼痛である。

【0007】

別の態様によれば、本発明は、前記対象に藻類プロテオグリカン抽出物又は前記藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物を治療又は予防に有効な量で投与するステップを含む、対象の膵臓癌を治療又は予防する方法を提供する。さらに、本発明は前記対象に藻類プロテオグリカン抽出物又は前記藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物を治療又は予防に有効な量で提供するステップを含む、対象の炎症又は疼痛を治療又は予防する方法を提供する。

【0008】

一態様によれば、本発明は、対象（個体）の膵臓癌、疼痛又は炎症を治療又は予防する藻類プロテオグリカン抽出物又は藻類プロテオグリカン抽出物含有医薬組成物を提供する。

【0009】

ある特定の実施形態において、前記藻類プロテオグリカン抽出物を単独及び／又は１種以上の薬学的に許容される担体とともに薬学的に許容される剤形、好ましくは経口液剤、錠剤、顆粒剤、カプセル、粉剤、丸剤、シロップ、注射剤等に調製する。

【0010】

ある特定の実施形態において、前記藻類プロテオグリカン抽出物は経口、皮下、筋肉内又は腹腔内投与される。好ましい実施形態において、前記藻類プロテオグリカン抽出物は経口投与される。

【0011】

ある特定の実施形態において、前記藻類プロテオグリカン抽出物の投与量は、１日に５～５００ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましい実施形態において、上記投与量は１日に１０～１５０ｍｇ／ｋｇ体重である。より好ましい実施形態において、上記投与量は１日に２０～１２０ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0012】

さらなる態様によれば、本発明は、藻類プロテオグリカン抽出物又は前記藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物の、炎症性因子によって媒介される関連疾患を治療又は予防する薬物の製造における使用を提供する。

【0013】

さらなる態様によれば、本発明は、藻類プロテオグリカン抽出物と１種以上のほかの抗腫瘍薬とを含む医薬組成物を提供する。

【0014】

いくつかの実施形態において、上記藻類プロテオグリカン抽出物と１種以上のほかの抗腫瘍薬とを含む医薬組成物は、対象（個体）の腫瘍の治療又は予防に用いられ、前記腫瘍は好ましくは膵臓癌、黒色腫又は肉腫である。前記藻類プロテオグリカン抽出物及び他の抗腫瘍薬は、腫瘍の治療に相乗効果を有し、腫瘍に対する治療効果を有意に改善する。

【0015】

さらなる態様によれば、さらに、本発明は藻類プロテオグリカン抽出物と１種以上のほかの抗腫瘍薬とを含む医薬組成物の、対象の腫瘍を治療又は予防する薬物の製造における使用を提供する。

【0016】

さらなる態様によれば、さらに、本発明は対象に藻類プロテオグリカン抽出物又は前記藻類プロテオグリカン抽出物と１種以上のほかの抗腫瘍薬とを含む医薬組成物を治療又は予防に有効な量で投与するステップを含む、対象の腫瘍を治療又は予防する方法を提供する。

【0017】

ある特定の実施形態において、前記腫瘍は原発性癌又は転移性腫瘍である。好ましい実施形態において、前記腫瘍は膵臓癌、黒色腫、肉腫、白血病、肺癌、食道癌、リンパ腫、胃癌、肝癌、乳癌、結腸癌、皮膚扁平上皮癌、又は上記腫瘍の転移性腫瘍から選ばれる。

【0018】

さらに、本発明は、藻類プロテオグリカン抽出物含有抗腫瘍組成物の抗腫瘍免疫における作用を提供する。

【0019】

上記藻類プロテオグリカン抽出物は、中国特許ＣＮ１０９８７０７Ｃに記載された方法に従って調製され、前記特許の全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、藻類プロテオグリカン抽出物の製造方法は、
藍藻粉末を５～２０倍量の水に溶解して、細胞壁を破壊するステップａと、
得られた混合物を６０～１００℃で加熱して、冷却させた後、固液分離するステップｂと、
得られた液体のｐＨ値を７未満に調整して、再度固液分離するステップｃと、
得られた液体を中性ｐＨに調整して濃縮させ、必要に応じて乾燥させるステップｄとを含む。

【0020】

製造された藻類プロテオグリカン抽出物におけるプロテオグリカンの含有量は約５０重量％であり、例えば約６０重量％、約６５重量％、約７０重量％、約７５重量％より大きい。ある特定の実施形態において、藻類プロテオグリカン抽出物におけるプロテオグリカンの含有量は約７０重量％～７５重量％である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】ＰＡＮＣ－１細胞系増殖をテストするＭＴＳアッセイプロトコルを示す。

【図2】１日目（Ｄ１）、２日目（Ｄ２）、３日目（Ｄ３）、４日目（Ｄ４）及び６日目（Ｄ６）に異なる濃度の藻類プロテオグリカン抽出物で処理した後の、対照に対するＰＡＮＣ－１細胞の増殖百分率を示す。

【図3】藻類プロテオグリカン抽出物を３ヶ月服用した進行性膵臓癌患者の膵臓のＣＴ画像変化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、藻類プロテオグリカン抽出物又は藻類プロテオグリカン抽出物含有医薬組成物の、対象の腫瘍例えば膵臓癌、炎症、疼痛又は炎症性因子によって媒介される関連疾患を治療又は予防する薬物の製造における使用を提供する。

【0023】

本発明の前記「薬学的に許容される担体」とは、医薬分野で一般に使用されるものを含む活性成分の生物活性を妨害しない担体を指す。本発明の薬学的に許容される担体は固体であっても、液体であってもよく、薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、乳化剤、安定剤、防腐剤、希釈剤、封入剤、充填剤などを含む。例えば、薬学的に許容される緩衝剤は、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩及び炭酸塩などをさらに含む。

【0024】

本発明に係る医薬組成物は、単位用量の形態で提供することができ、医薬分野で周知の任意の方法によって調製することができる。このような方法は、すべて本発明の活性成分と１種以上の薬学的に許容される担体とを組み合わせるステップを含む。一般には、活性成分と、液体担体、固体担体又はこの両方の組み合わせとの組成物を調製し、次に必要に応じて得られた生成物を成形する。

【0025】

ある特定の実施形態において、本発明の前記藻類プロテオグリカン抽出物を、単独及び／又は薬学的に許容される担体とともに、例えば経口液剤、カプセル、粉剤、錠剤、顆粒剤、丸剤、シロップ、注射剤、座剤等の薬学的に許容される剤形に調製する。

【0026】

本発明の前記藻類プロテオグリカン抽出物は、中国特許ＣＮ１０９８７０７Ｃに記載の方法に従って調製され、前記特許の全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0027】

ある特定の実施形態において、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物の投与量は、１日に５～５００ｍｇ／ｋｇ体重で、好ましくは１日に２０～１５０ｍｇ／ｋｇ体重で、より好ましくは１日に２０～１２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば１日に２０ｍｇ／ｋｇ体重、３０ｍｇ／ｋｇ体重、６０ｍｇ／ｋｇ体重、１２０ｍｇ／ｋｇ体重等である。

【0028】

別の態様によれば、対象に藻類プロテオグリカン抽出物又は前記藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物を治療又は予防に有効な量で投与するステップを含む、対象の腫瘍、例えば膵臓癌、炎症、疼痛又は炎症性因子によって媒介される関連疾患を治療又は予防する方法を提供する。

【0029】

さらなる態様によれば、治療又は予防上有効量の藻類プロテオグリカン抽出物又は前記藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物の、対象の癌、炎症又は疼痛又は炎症性因子によって媒介される関連疾患の治療又は予防における使用を提供する。

【0030】

本明細書に使用される用語「治療」は、癌、疼痛（腫瘍関連疼痛など）又は炎症（腫瘍関連炎症など）又は炎症性因子によって媒介される疾患を抑制、治癒、軽減又は緩和させることと、ならびに原発癌の転移を予防又は遅延させることとを含む。

【0031】

ある特定の実施形態において、前記癌は原発性癌であってもよく、転移性癌であってもよい。いくつかの実施形態において、前記癌は膵臓癌、肝癌、結腸癌、胃癌、黒色腫、肉腫、白血病、肺癌、乳癌、皮膚扁平上皮癌、食道癌、リンパ腫等であってもよい。

【0032】

いくつかの実施形態において、上記炎症性因子は、ヒスタミン受容体Ｈ３、カリクレイン関連ペプチダーゼ３、カリクレイン関連ペプチダーゼ１３、インスリン様成長因子２、腫瘍壊死因子、ロイコトリエンＢ４受容体２、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド４、コロニー刺激因子３（顆粒球）、ドーパミン受容体４、血小板由来成長因子βポリペプチド、カリクレイン関連ペプチダーゼ１１、カリクレイン関連ペプチダーゼ１５、ロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＣ４シンターゼ、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２、インターロイキン－６、インターロイキン－１０、インターフェロン－α受容体２、血小板由来成長因子Ａ、血小板由来成長因子Ｃ、血小板由来成長因子Ｄ、Ｃ反応性タンパク質、カリクレイン関連ペプチダーゼ１４、ブラジキニン受容体Ｂ２、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリーメンバー１１、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド３、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド７、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２０、ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド２、血小板由来成長因子βポリペプチド、インターフェロン（α、β及びΩ）受容体１、インターロイキン３、インターロイキン９、インターロイキン１７Ｂ、インターロイキン２０、増殖分化因子２、増殖分化因子３、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻止因子）、増殖分化因子１１、骨形成タンパク質２、骨形成タンパク質４、トロンボポエチン、カリクレイン関連ペプチダーゼ４、カリクレイン関連ペプチダーゼ５、ブラジキニン受容体Ｂ１及びインターフェロン－α６などを含むが、それらに制限されない。

【0033】

いくつかの実施形態において、前記炎症性因子によって媒介される疾患又は障害は、慢性膀胱炎症、尿道炎、前庭眩暈、アナフィラキシー、喘息（気管支喘息、小児喘息）、肝癌（ヒト肝細胞癌、原発性肝癌等）、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、精巣癌、結腸直腸癌、変形性関節症、原発性高血圧、心筋梗塞、心筋梗塞を伴うパーキンソン病、アルツハイマー病、遺伝性血管浮腫、血管腫（幼児）、心血管疾患、大腸癌、化膿性髄膜炎、子宮内膜癌、自然流産、膀胱癌、神経膠腫、肝線維症、脳出血、非小細胞肺癌、急性骨髄性白血病、脳梗塞、咽頭扁桃肥大、Ｃ型肝炎、多発性骨髄腫、全身性紅斑性狼瘡、肺炎（気管支肺炎、小児肺炎、地域性肺炎）、潰瘍性大腸炎、慢性閉塞性肺疾患、肺結核、パーキンソン病、非アルコール性脂肪肝疾患、高血圧（肥満関連高血圧、原発性高血圧）、自己免疫性肝炎、硬化性胆管炎、正常体重肥満症候群、糖尿病性網膜症、炎症性腸疾患、過眠症、ベーチェット病、巨細胞性動脈炎、扁平上皮癌、基底細胞癌、皮膚粘膜リンパ節症候群、結腸炎、アレルギー疾患、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、中風（脳卒中、虚血性脳卒中）、薬剤誘発性急性肝障害、慢性好中球性白血病、統合失調症、乳頭状甲状腺癌、髄膜腫、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、肺血栓塞栓症、甲状腺炎、多発性骨髄腫骨疾患、慢性リンパ球性白血病、軟骨肉腫、口腔白板症及び扁平上皮癌、アレルギー性鼻炎、慢性鼻副鼻腔炎、リステリア菌感染症、心筋炎、多発性硬化症、多発性骨髄腫、喉頭癌、ＩｇＡ腎症、ウイルス性心筋炎、結腸直腸癌、乾癬、椎間板形成腰痛、Ｂ型肝炎、肺癌、歯髄炎、ハシモト甲状腺炎、乳頭状甲状腺癌、肺結核、白血病、川崎病、再生不良性貧血、多発性筋炎、ホジキン病、骨髄性白血病、強直性脊椎炎、鼻ポリープを伴う慢性鼻副鼻腔炎、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、アトピー性皮膚炎、高所肺高血圧症、関節炎（変形性関節症、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、脊椎関節炎）、非小細胞肺癌、アレルギー性鼻炎、扁平苔癬、不安定狭心症、急性冠動脈症候群、歯周炎、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、奇形癌、胎児性癌、アトピー性皮膚炎、子宮内膜癌、急性膵炎、子宮頸部扁平上皮癌、口腔扁平上皮癌、鼻咽頭癌、食道扁平上皮癌、骨髄異形成症候群、脳神経膠腫、原発性シェーグレン症候群、貧血（小児再生不良性貧血、再生不良性貧血）、脳性麻痺、新生児低酸素性虚血性脳症、気道炎症、閉塞性睡眠時無呼吸症候群、痛風、扁桃腺炎、急性呼吸窮迫症候群、強迫性障害、非アルコール性脂肪肝疾患、代謝症候群、新生児敗血症、手足口病、皮膚筋炎、敗血症、脳炎、子癇、胆道癌（肺門胆管癌、糖尿病性大血管合併症胆道癌）、全身性硬化症、大腸癌、多嚢胞性卵巣症候群、Ｎｅｔｈｅｒｔｏｎ症候群、セリアック病、糖尿病性腎症等を含むが、それらに制限されない。

【0034】

本明細書に使用される「治療上有効量」又は「予防上有効量」は、具体的な状況、例えば患者の体重、年齢及び状態に応じて決定することができ、実際に必要とされる投薬量に応じて当業者が容易に把握できる。抽出物に含まれる成分の全てが無毒であるので、抽出物自体は、組成物に薬学的に許容される担体を含まない場合には、必要に応じて直接投与できる。組成物が薬学的に許容される担体を含む場合、抽出物及び担体は、医薬分野における従来の方法によって混合されて所望の薬剤を製造できる。

【0035】

ある特定の実施形態において、藻類プロテオグリカン抽出物又は前記藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物は経口、皮下、筋肉内又は腹腔内投与される。好ましい実施形態において、藻類プロテオグリカン抽出物又は前記藻類プロテオグリカン抽出物含有組成物は経口投与される。

【0036】

さらに、本発明は藻類プロテオグリカン抽出物と１種以上のほかの抗腫瘍薬とを含む医薬組成物を提供する。

【0037】

上記抗腫瘍薬は、腫瘍を治療するために臨床的に使用される薬物を含み、例えば、ヌクレオチド合成阻害剤（例えば５－フルオロウラシル（５－ＦＵ））、抗腫瘍抗生物質（例えばアドリアマイシン（ＡＤＭ））、白金化合物（例えばカルボプラチン）、アルキル化剤（例えばシクロホスファミド及びニトロソウレア、例えばカルムスチン）、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤（例えばゲムシタビン）、タンパク質合成を妨害する薬物（例えばエトポシド（ＶＰ－１６））などを含む。

【0038】

藻類プロテオグリカン抽出物と１種以上の他の抗腫瘍剤とを組み合わせて投与する場合、抗腫瘍効果が著しく増強され、相乗効果が示される。併用療法（例えば、藻類プロテオグリカン抽出物と１種又は複数種の他の抗腫瘍剤との組み合わせ）の相乗効果は、特定の障害（例えば、癌又はその関連症状）に罹患している対象に単剤療法よりも低用量で投与し、及び／又は前記治療法の投与頻度を減少させることを可能にする。

【0039】

本明細書に記載の用語「対象（個体）」は、霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、及び齧歯類（ラットやマウスなど）を含むが、これらに限定されない哺乳類を意味する。

【0040】

本明細書及び特許請求の範囲では、「含む」、「含んでいる」、「含有する」、「挙げられる」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ／ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）用語は、「…含む/挙げられるがこれに限定されない」を意味し、ほかの部分、添加剤、成分又はステップ（工程）を排除することを意図しない。

【0041】

なお、特に断らない限り、本発明の特定の態様、実施形態又は実施例に説明される特徴、特性、組成又はステップは、本明細書に記載された他のいずれかの態様、実施形態又は実施例に適用できる。

【0042】

上記開示は一般的に本発明を説明し、以下の実施例ではさらに本発明を説明する。これらの記載された実施例は説明するためのものに過ぎず、本発明を制限するものではない。特定の用語及び値が本明細書で使用されるが、また、これらの用語及び値も例示的なものと解釈されるべきであり、本発明の範囲を限定するものではない。別に断らない限り、本明細書の実験方法及び技術は、当業者に周知の方法及び技術である。

【0043】

実施例
実施例１ 藻類プロテオグリカン抽出物による膵臓癌への阻害作用
実施例１．１ 藻類プロテオグリカン抽出物によるＰＡＮＣ－１膵臓癌細胞の増殖抑制

【0044】

細胞系及び細胞培養
本研究では、膵臓癌細胞系ＰＡＮＣ－１を使用した。該細胞系はＡｎｙＧｅｎｅｓ（登録商標）社で培養したものである。細胞の活力を確保するために、異なる試験（ＭＴＳテストとＳｉｇｎＡｒｒａｙｓ（登録商標）分析）を行うのに必要な細胞量に達するまで複数回継代した。次表に本発明に使用されているＰＡＮＣ－１の関連情報は示されている。

【表1】

【0045】

ＰＡＮＣ－１細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^ＴＭ製）、１％Ｌ－グルタミン（２００ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^ＴＭ製）、１％ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^ＴＭ製）、及び１％ストレプトマイシン－ペニシリン（ペニシリン１０，０００Ｕ／ｍＬ、及びストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ。Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^ＴＭ製）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^ＴＭ製））で培養して、３７℃、５％ ＣＯ_２でインキュベートした。トリパンブルー排除アッセイにより細胞活力を測定した。

【0046】

藻類プロテオグリカン抽出物の製造
スピルリナ粉末３ｋｇを水３Ｌで洗浄して、吸引濾過を行い、濾滓に水３０Ｌを加えて撹拌し、８８℃で１時間加熱して、冷却後、減圧下で濾過して分離し、濾液を塩酸でｐＨ３．８に調整して、一晩放置し、遠心分離を行って、上澄み液をＮａ_２ＣＯ_３溶液でｐＨ７に調整した後、噴霧乾燥させて、藻類プロテオグリカン抽出物０．５９９ｋｇを得て、測定したところ、抽出物におけるプロテオグリカンの含有量は７２．３％であった。

【0047】

藻類プロテオグリカン抽出物を無菌条件下で秤重して５０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳに溶解してストック溶液を得た。次に２５００ｇを３０分間遠心分離した後、上澄み液を０．２μｍフィルタで濾過した。ＭＴＳアッセイにおいて、該溶液を培地に希釈して細胞を処理した。以下、藻類プロテオグリカン抽出物は「抽出物Ｋ」とも呼ばれる。
ＭＴＳアッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイキット（ＭＴＳ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞増殖試験を行い、比色法により生存した増殖細胞の数を決定した。

【0048】

該アッセイキットは、テトラゾリウム塩（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウム）、ＭＴＳ）及びＭＴＳ化学的安定性を向上させる電子結合剤（フェナジンメトサルフェート、ＰＭＳ）から構成される。ＭＴＳは、代謝活性を有する細胞におけるデヒドロゲナーゼで還元して培地に可溶な有色生成物ホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）としてされた。３７℃で２時間インキュベートした後、ホルマザン生成物の量を測定し、４９０ｎｍでの吸光度で示し、該数値は培地における活細胞数に比例する。最後、実験モデルＰＡＮＣ－１細胞において藻類プロテオグリカン抽出物の半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を測定した。すべての細胞培養条件は３回繰り返した。

【0049】

１日目に、細胞を９６ウェル培養板（Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ９６(R)、Ｆａｌｃｏｎ）に接種して、１ウェルの１００μＬ培地に１５００個の細胞とし、次に所定濃度範囲に基づいて細胞を処理した。具体的に、藻類プロテオグリカン抽出物について１０個の異なる濃度を設置して、濃度ごとに３つのウェルを設置した。藻類プロテオグリカン抽出物を添加しない無細胞ウェルを対照ウェルとした。

【0050】

ＭＴＳ溶液を添加する直前に、ＭＴＳアッセイの藻類プロテオグリカン抽出物に対する干渉を避けるために、処理の有無にかかわらず細胞培養培地を取り除いた。各ウェルに１００μＬの培地を添加し、次に、各ウェルに２０μＬのＭＴＳ溶液を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした後、４９０ｎｍでの吸光度を測定した。藻類プロテオグリカン抽出物を含む又は含まない細胞培地を２日目及び４日目に交換した。図１に示すように、６×９６ウェルプレートの全体分析（１日に１回）に対応した結果、０日目、１日目（Ｄ１）、２日目（Ｄ２）、３日目（Ｄ３）、４日目（Ｄ４）及び６日目（Ｄ６）に、４９０ｎｍでのＯＤ値（吸光度値）を測定した。

【0051】

ＰＡＮＣ－１細胞系に対する細胞増殖測定の結果
Ｄ０でのＭＴＳ結果
前日の細胞播種が適切な方式で行われたか否か、かつ適用したプロトコールが該細胞系に対して機能するか否かをテストするために、Ｄ０でのＯＤ値を測定した。以下の表２は、Ｄ０でのＯＤ値を示した。各群のＯＤ値の間に有意な統計的差異がないことを観察でき、細胞播種が適切であること、及び結果が再現可能であることを示した。

【表2】

【0052】

藻類プロテオグリカン抽出物によるＰＡＮＣ－１細胞系への抗増殖作用
異なる濃度の藻類プロテオグリカン抽出物に対応したＯＤ値を表３に示す。

【表3】

【0053】

対照（藻類プロテオグリカン抽出物を含まない）に対する増殖細胞の百分率を計算した。毎日異なる濃度の藻類プロテオグリカン抽出物で処理した後、対照に対するＰＡＮＣ－１細胞の増殖百分率を表４及び図２に示した。表５は藻類プロテオグリカン抽出物によるＰＡＮＣ－１細胞増殖への阻害百分率を示す。抽出物Ｋで処理した細胞の生存量と、処理していない場合の細胞生存量とを比較して抑制率を計算した。

【表4】

【表5】

【0054】

表５から明らかなように、１．７５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬの抽出物Ｋで処理した場合、１日目、２日目、３日目、４日目及び６日目のいずれにも、ＰＡＮＣ－１細胞への有意的な抗増殖効果が観察された。例えば、１日目には、２．５ｍｇ／ｍＬの抽出物Ｋは３８．１５％の抑制率、５ｍｇ／ｍＬの抽出物Ｋは３７．０６％の抑制率、２日目には、２．５ｍｇ／ｍＬの抽出物Ｋは７５．６４％の抑制率、５ｍｇ／ｍＬの抽出物Ｋは８８．２９％の抑制率であり、４日目には、１．７５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬの抽出物ＫはいずれもＰＡＮＣ－１細胞に対する増殖抑制率が９０％を上回った。

【0055】

藻類プロテオグリカン抽出物は、１日目のＩＣ５０が５ｍｇ／ｍＬより大きく、２日目のＩＣ５０が１ｍｇ／ｍＬと１．７５ｍｇ／ｍＬの間にあった。
以上の結果から明らかなように、本発明に係る藻類プロテオグリカン抽出物は、ＰＡＮＣ－１膵臓癌細胞に対して顕著な阻害作用を有する。

【0056】

実施例１．２ 藻類プロテオグリカン抽出物で進行膵臓癌患者を治療する臨床例
患者の状況：１９２７年に生まれた男性、急性心筋梗塞の治療のために１９９６年に冠状動脈ステント留置術を受けた。徐脈の治療のために２００３年に心臓ペースメーカ移植術を受け、発熱症状のために、超音波検査によって２０１３年１２月３日に膵頭部腫瘤が発見された。２０１３年１２月２６日に膵頭部腫瘤に対する超音波ガイド下コア針生検により低分化型進行膵臓癌と診断された。２０１４年１月１４日に、ＰＴＣＤ＋胆管ステント留置術を行った。実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を、２０１３年１２月１５日に１，３５０ｍｇ／ｄで２０日間投与した後、２０日間後に２０２５ｍｇ／ｄに増加した。それ以外、患者は他の治療を受けなかった。

【0057】

臨床的有効性の観察：部分寛解（ＰＲ）後に患者の状態が安定し、全生存期間は２０ヶ月であった。
図３は、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物を３ヶ月間投与した後の患者の膵臓におけるＣＴ画像変化を示した。動脈相画像は、３ヶ月後に腫瘍が４６×５１ｍｍから３５×４６ｍｍに縮小したことを示した。静脈相画像は、腫瘍の中心壊死部の密度が有意に減少したことを示した。これは、さらに本発明に係る藻類プロテオグリカン抽出物が膵臓癌の治療に使用することができ、進行膵臓癌に対しても有意な抑制効果を有することがさらに確認された。

【0058】

膵臓癌は高悪性度の消化管癌であり、膵臓癌の患者の生存期は、任意の処置を受けない場合、約４ヶ月、切除手術を受けた場合、１６ヶ月であったが、早期膵臓癌は、その診断率が低いため、ほとんどの場合、発見された時にずでに外科的治療に適していない段階まで発展してきた。既存の薬物療法は、効果的に患者の生存期間を延長することはできない。本発明者らにより従来の文献で報告されている薬物療法の効果（表６）の要約から分かるように、複数種の薬物を用いた併用療法でも、全生存期間は９ヶ月だけである。驚くべきことに、該実施例では、進行膵臓癌患者は、藻類プロテオグリカン抽出物を服用することで、２０ヶ月の全生存期間を実現した。このことから、本発明における藻類プロテオグリカン抽出物は、膵臓患者に対する治療効果が既存の薬物療法よりも著しく優れていることを証明し、この効果は予想外であった。

【表6】

【0059】

実施例２ 藻類プロテオグリカン抽出物による肝癌への治療効果
本実施例では、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物による１１例の肝細胞癌患者の生存期間中央値への影響を研究した。

【0060】

１１例の肝細胞癌患者は、本発明の実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物（１，０８０ｍｇ／ｄ）を、死亡又は経口投与の実行不可能になるまで服用した。すべての症例の生存期間は２～４３ヶ月であり、１１例の肝細胞癌患者の生存期間中央値は１５．２ヶ月であった。追跡調査された患者のうち、最も長い生存期間は４３ヶ月、４名の患者の生存期間は２０ヶ月以上、８名の患者の生存期間は１１ヶ月以上、９名の患者の生存期間は６ヶ月以上、１名の患者の生存期間は３ヶ月未満であった。これらの症例のうち、中国・安徽省慈善総会により推薦した安徽病院からの特別な患者ＺＢＦＵは、２００５年８月２日にＴ２Ｎ０Ｍ０ ＩＩ期の原発性肝癌と診断され、肝臓の右葉に３．０×３．７ｃｍの占拠性病変があった。脾腫、肝硬変、出血を伴った左腎結石のために、他の治療は行われなかった。この患者は、２００５年９月２４日に試験に入り、実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を服用し始めた。ＺＢＦＵは２００９年４月６日に死亡した。該患者は藻類プロテオグリカン抽出物を連続的に服用して、４３ヶ月間生存した。

【0061】

肝癌患者の生存期間は、肝癌の治療において最も困難な問題であった。手術不可能な患者の場合、様々な化学療法は、生存期間中央値を１～２ヶ月だけ延長できる。現在、肝がんの標準治療薬はソラフェニブ（Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、商品名：ＮＥＸＡＶＡＲ（ネクサバール））であり、治療群及びプラセボ対照群では、それぞれ１０．７ヶ月及び７．９ヶ月の中央生存期間を実現した。本実施例では、藻類プロテオグリカン抽出物を服用したところ、肝癌患者の生存期間中央値は１５．２ヶ月になった。このことから、本発明に開示される藻類プロテオグリカン抽出物は、肝癌に対する治療効果が既存の薬剤よりも著しく優れていることが確認された。

【0062】

実施例３ 藻類プロテオグリカン抽出物による結腸癌への治療効果
本実施例では、本発明に係る藻類プロテオグリカン抽出物による８例の結腸癌患者への治療效果を研究した。
８例の結腸癌患者のうち、男性２名、女性６名、年齢範囲：３８～６８歳、年齢中央値：６０．５歳、全身状態評価：７０～９０であった。臨床病期ＩＩＩ期の結腸癌患者は２例、臨床病期ＩＶ期の結腸癌患者は６例あり、すなわち、全ての症例は、臨床病期ＩＩＩ期又はＩＶ期の腫瘍であり、８例は病理学的に診断された（８例は手術を受けた）。

【0063】

【0064】

８例の結腸癌患者のうち、実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を１０８０ｍｇ／ｄで５６日間服用したところ、１例は部分寛解（ＰＲ）、３例は病勢安定化（ＳＤ）、４例は病勢進行（ＰＤ）を示した。８例の結腸癌患者の治療に対する有効率（ＣＲ＋ＰＲ／症例総数）は１２．５％であり、疾患制御率（ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤ／症例総数）は５０％であった。

【0065】

実施例４ 藻類プロテオグリカン抽出物による胃癌への治療効果
本発明の藻類プロテオグリカン抽出物による胃癌患者への治療効果は、さらに研究された。
３例の胃癌患者はすべて５７歳から６７歳の男性で年齢中央値が６５歳であった。３例はすべて進行期にあり、そのうちの２例は臨床病期ＩＩＩ期腫瘍、１例は臨床病期ＩＶ期腫瘍であり、すべての症例の組織型は腺癌であった。３例は病理学的に診断された（そのうちの１例は生検、２例は手術を受けた）。

【0066】

３例の胃癌患者が実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を１０８０ｍｇ／ｄで５６日間服用したところ、２例は病勢安定化（ＳＤ）、１例は病勢進行（ＰＤ）を示し、疾患制御率は６６．７％であった。

【0067】

実施例５ 藻類プロテオグリカン抽出物によるリンパ腫への治療効果
本実施例では、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物によるリンパ腫患者への治療效果を研究した。
患者の状況：非ホジキンリンパ腫ＮＨＬ（びまん性大Ｂ）、ＩＶＢ期（末期腫瘍患者）と診断された６２歳の女性。ＣＨＯＰ化学療法６コース、ＩＭＶＰ－１６化学療法８コース、ＨＤＡｒａ－ｃ＋ＶＰ－１６化学療法２コースを受けたことがある。上記処置後、左顎下部に３×２ｃｍの塊が見られた。

【0068】

２００３年３月２日以降、化学療法で複数回実施した後に再発した当該非ホジキンびまん性大型Ｂリンパ腫の患者は、実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を、２，７００ｍｇ／ｄで１日に３回分けて経口投与し始めた。２００３年３月３１日に、病変サイズは従来より小さくなり１．５×１．８ｃｍまで縮小された。臨床的有効性は、部分寛解（ＰＲ）と評価された。

【0069】

化学療法で複数回実施した後に再発した上記非ホジキンびまん性大型Ｂリンパ腫の患者については、藻類プロテオグリカン抽出物を２８日間投与したところ、部分寛解効果を達成したことから、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物がリンパ腫に対して有意な治療効果を有することが明らかにされた。

【0070】

実施例６ 藻類プロテオグリカン抽出物による食道癌への治療効果
本実施例では、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物による食道癌患者への治療效果を研究した。
試験に参加した２例の食道癌患者は、全身状態評価が８０点で、２例とも遠隔転移を伴う進行期（ＩＩＩ期及びＩＶ期）であった。上記患者が実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を服用したところ、そのうちの１例は部分寛解（ＰＲ）、１例は病勢安定化（ＳＤ）を示した。次の表に示される。

【0071】

【0072】

次に、２例の患者の具体的な病状を説明した。
患者ＳＸＦＡ、男性、１９４１年３月１９日生まれ、彼の病状及び治療は以下の通りであった。
患者は２００５年１１月１０日に組織生検で食道のＩＶ期低分化型腺癌と診断された。
２００５年１１月８日のＣＴの結果、切歯列（ｉｎｃｉｓｏｒｓ ｌｉｎｅ）より４０ｍｍの位置における粘膜に６ｃｍ長さの出血性びらんを伴う結節性隆起を示した。

【0073】

２００６年８月１３日から２００６年１１月１５日まで、該患者は、実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を連続的に１，０８０ｍｇ／ｄで服用し、藻類プロテオグリカン抽出物の投与前及び投与中に他の治療を受けることがなかった。
２００６年１０月１３日のＣＴの結果、下部食道の５ｃｍ不規則な陰影欠損が認められ、病変高さは５ｍｍであった。治療有効性は、病勢安定化（ＳＤ）と評価された。
患者ＺＳＣＡ、男性、１９５７年７月１７日生まれ、彼の病状及び治療は以下の通りであった。
２００６年５月１５日に穿刺及びスメアによりＩＶ期食道扁平上皮癌と診断された。
２００６年５月１７日のＣＴの結果、右鎖骨に５．５×５ｃｍのリンパ節を示した。
２００６年５月１７日から２００６年１１月１日まで、患者は、実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を連続的に１，０８０ｍｇ／ｄで服用し、藻類プロテオグリカン抽出物の投与前及び投与中に他の治療を受けることがなかった。
２００６年１１月１日のＣＴの結果、右鎖骨に２．５×２ｃｍのリンパ節を示した。治療有効性は、部分寛解（ＰＲ）と評価された。
上記データでは、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物は食道癌に対しても治療効果を有することが明らかにされた。

【0074】

実施例７ 藻類プロテオグリカン抽出物による腫瘍関連疼痛の緩和
実施例７．１ 藻類プロテオグリカン抽出物による肝癌疼痛への治療効果
疼痛は進行肝癌の一般的な臨床症状であり、患者の生活の質に重大な影響を及ぼし、疼痛を抑制するために、強力な鎮痛薬が慣習的に使用されなければならない。本実施例では、１８例の肝細胞癌患者について、藻類プロテオグリカン抽出物の疼痛に対する抑制又は予防効果を研究した。

【0075】

１８例の肝細胞癌患者は、実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を１０８０ｍｇ／ｄで、死亡又は経口投与の実行不可能になるまで服用した。研究中に他の鎮痛薬を服用させず、その中でも、１４例の患者の疼痛が疼痛スケールで測定された。これらの１４例のうち、２例は始終疼痛を示さなかった他、７例は疼痛緩和を示し、５例は１～２度の軽度の疼痛を変わらずに維持していた。典型的な症例は以下の患者を含む。

【0076】

１例の患者は研究に入る際に強力なモルヒネ鎮痛薬を服用する必要があり、藻類プロテオグリカン抽出物の投与後、短時間内に鎮痛薬は必要とされていなかった。他の患者は画像検査で検出された巨大腫瘍（８×８．５ｃｍ）を有していたが、藻類プロテオグリカン抽出物の投与後、患者に疼痛症状は現れなかった。

【0077】

上記のデータでは、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物は、疼痛に対して有意な抑制効果及び改善効果を有することが示された。
本明細書に記載の疼痛評価スケールは以下の通りである。

【0078】

【0079】

実施例７．２ 藻類プロテオグリカン抽出物による膵臓癌疼痛への治療効果
膵臓癌及び疼痛症状を有する２４例の患者の疼痛症状について、藻類プロテオグリカン抽出物による疼痛抑制効果も研究された。試験に登録された膵臓癌患者２４例は、実施例１．１で調製された藻類プロテオグリカン抽出物を、患者が死亡又は経口投与の実行不可能になるまで、２，０２５ｍｇ／ｄで服用した。疼痛評価スケールで測定したところ、２４例の患者の疼痛症状はいずれも有意に緩和された。

【0080】

実施例８ 藻類プロテオグリカン抽出物による炎症への抑制作用
腫瘍促進性炎症は、癌の特徴の１つであると考えられている。慢性炎症性疾患は、特定の癌に罹患するリスクを向上させる可能性があり、多くの疫学的証拠から、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、特にアスピリンが強力な化学予防剤であることが示唆される。腫瘍微小環境には多くの異なる炎症細胞が存在し、遺伝性、可移植性及び誘導性のマウス癌モデルにおいてこれらの因子を標的とすることは、腫瘍疾患の発症、進展及び広がりを有意に減少できる。したがって、この複雑な炎症ネットワークは、悪性疾患の予防及び治療の標的を提供する。本実施例は、藻類プロテオグリカン抽出物による癌細胞における炎症性メディエーターの発現に及ぼす影響を調べた。

【0081】

８．１ 膵臓癌モデルにおける炎症性メディエーター発現に対する藻類プロテオグリカン抽出物の調節効果
実施例１に記載のプロトコルに従って、藻類プロテオグリカン抽出物を調製し、ＰＡＮＣ－１膵臓癌細胞系を培養した。
１日目に、１００ｍｍの培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））（各培養皿の培地１６ｍＬに２５０，０００個の細胞を含有させる）に細胞を接種して、２日目に、ＰＡＮＣ－１細胞を５ｍｇ／ｍＬ藻類プロテオグリカン抽出物又はＰＢＳ含有培地（対照）で処理した。細胞を３群（対照群、３時間処理群、及び１８時間処理群）に分けて、群毎に２回繰り返した。

【0082】

ＡｎｙＧｅｎｅｓ（登録商標）社製のＳｉｇｎＡｒｒａｙｓ（登録商標）システムを用いて、血管新生、炎症、インターフェロン・免疫系、サイトカイン、酸化ストレス及びＨＬＡ系を含む６種類のｑＰＣＲシグナル伝達経路（ＳｉｇｎＡｒｒａｙｓ（登録商標））に関連する因子の発現を研究した。次表７には、測定された７６種類の炎症性メディエーターのうち、対照サンプルに比べて発現が有意に下方制御された（少なくとも１倍以上）因子の数を示した。表８には、対照に比べて一部の例示的な因子が下方制御された倍数を示す。

【表7】

【表8】

【0083】

上記結果から明らかなように、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物はＰＡＮＣ－１膵臓癌細胞における複数種の炎症性メディエーターとサイトカインの発現を調節でき、複数種の炎症性因子の発現に対して顕著な抑制作用を有する。

【0084】

８．２ 肝癌及び肺癌モデルにおける炎症メディエーター発現に対する藻類プロテオグリカン抽出物の調節効果
本研究では、ＨｕＨ７肝癌細胞系とＡ５４９肺腺癌細胞系を使用した。この２種の細胞系はＡｎｙＧｅｎｅｓ（登録商標）社で培養されたものである。
ＨｕＨ７細胞をＤＭＥＭ培地で培養して、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM製）、１％のＬ－グルタミン（２００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM製）、１％ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM製）、及び１％のストレプトマイシン－ペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０，０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM製）を添加して、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。トリパンブルー排除アッセイにより細胞活力を測定した。

【0085】

Ａ５４９細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM製）、１％のＬ－グルタミン（２００ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM製）、１％のピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM製）、及び１％のストレプトマイシン－ペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１０，０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ^TM製）を添加したＲＰＭＩ培地で培養して、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。トリパンブルー排除アッセイにより細胞活力を測定した。

【0086】

藻類プロテオグリカン抽出物を実施例１に記載のプロトコルに従って調製した。関連因子の発現を実施例３．１に記載の方法に従って検出した。表９には、Ａ５４９細胞及びＨｕＨ７細胞において検出された炎症性メディエーター、サイトカインの数、並びに６時間又は１２時間後に対照サンプルに比べて発現が有意に下方制御された（少なくとも２倍以上）因子の数を示した。表１０には、対照に比べて下方制御されたいくつかの例示的因子の倍率をも示した。

【表9】

【表10】

【0087】

実施例８．１及び８．２の結果から明らかなように、本発明における藻類プロテオグリカン抽出物は、種々の癌モデルにおける炎症性メディエーター及びサイトカインの発現を調節するための主要なモジュレータであり、種々の炎症性サイトカインの発現を有意に抑制し得、このことは、本発明における藻類プロテオグリカン抽出物は、炎症、特に腫瘍関連炎症の発生及び進行を抑制できることを示した。

【0088】

さらに、次表１１は、炎症性因子とその因子によって媒介される疾患との対応関係を示し、表１１から、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物によって調節される炎症性メディエーター及びサイトカインは様々な疾患の発症及び進展を媒介し得ることがわかる。したがって、これらの炎症性因子を下方制御できる藻類プロテオグリカン抽出物は、表１１に記載の疾患又は障害を含むがこれらに限定されない炎症性因子に関連する種々の疾患及び障害を治療又は予防するために用いることができる。

【表11】

【0089】

実施例９ 藻類プロテオグリカン抽出物と化学療法剤との併用による癌治療における相乗効果
本研究に使用された実験動物は、中国科学院上海実験動物センターによって提供された雌Ｃ５７マウス（１８～２２ｇ）又は雌ＫＭマウス（１８～２２ｇ）であった（証明書番号：００５）。
Ｂ－１６黒色腫及びＳ－１８０肉腫を含む腫瘍は、中国科学院上海薬物研究所より提供された。

【0090】

カルボプラチンは山東斉魯製薬廠、アドリアマイシンは中国浙江海門製薬廠、エトポシドは上海医薬工業研究院亜東薬業公司浦東製薬廠、５－フルオロウラシルは上海旭東海普薬業有限公司、シクロホスファミドは上海華聨製薬有限公司、残りの化学療法剤は北京可瑞生物工程有限責任公司から購入された。

【0091】

実施例９．１ 藻類プロテオグリカン抽出物と化学療法剤との併用による黒色腫における治療効果
実験スキーム
１８～２２ｇの雌Ｃ５７マウス及びよく成長した７～１１日のＢ－１６黒色腫を用いた。腫瘍組織を細胞懸濁液に調製して、マウスの右腋窩皮下に、約４．５～５×１０^６細胞／匹で接種した。接種２４時間後、マウスをランダムに群分けして異なるケージ（ｎ＝６）に入れた。藻類プロテオグリカンを経口（ｐ．ｏ．）投与、カルボプラチン、アドリアマイシン又はＣＴＸを１日に１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、異なる投与量（用量）で２日目から連続的に７日間投与した。空白対照群に生理食塩水（ＮＳ）を投与した。休薬２４時間後、動物を屠殺して体重を秤量した。腫瘍を摘出し、腫瘍重量を測定した。各群について平均腫瘍重量を計算した。下式により腫瘍抑制率を算出して、Ｔ検定を行った。
腫瘍抑制率＝［（Ａ－Ｂ）／Ａ］×１００％
Ａは空白対照群の平均腫瘍重量（ｇ）であり、Ｂは治療群の平均腫瘍重量（ｇ）である。

【0092】

投与量
予備実験の結果によれば、藻類プロテオグリカン抽出物（以下、藻類プロテオグリカンと略称する）の投与量を３０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇとし、カルボプラチンの投与量を４ｍｇ／ｋｇ及び８ｍｇ／ｋｇとし、ドキソルビシンの投与量を１ｍｇ／ｋｇとし、ＣＴＸの投与量を７．５ｍｇ／ｋｇとした。

【0093】

実験結果

【表12】

【表13】

【表14】

【0094】

以上の結果から明らかなように、単剤療法に比べて、カルボプラチン又はドキソルビシンと併用した藻類プロテオグリカンの抗腫瘍効果は有意に向上するが、マウスに対する毒性は増加しなかった。例えば、藻類プロテオグリカンを３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与する場合、藻類プロテオグリカンそのものは黒色腫増殖を効果的に阻害しなかったが（Ｐ値＞０．０５）、他の抗腫瘍薬の効果を有意に高めることができる。例えば、藻類プロテオグリカン（３０ｍｇ／ｋｇ）をカルボプラチンと併用した場合場合、カルボプラチンの単剤療法に比べて、腫瘍抑制率は有意に向上させ、３８．９％（Ｐ値＜０．０１）に達した。藻類プロテオグリカン（３０ｍｇ／ｋｇ）をドキソルビシンと併用した場合、ドキソルビシンの腫瘍抑制率も１３．１％と有意に向上させた。カルボプラチンを藻類プロテオグリカン（６０ｍｇ／ｋｇ）と併用した場合、カルボプラチンの単剤療法に比べて、腫瘍抑制率は２６．６％と有意に向上させた。

【0095】

以上の結果から、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物は、カルボプラチンやドキソルビシンなどの化学療法剤のマウスにおけるＢ１６黒色腫移植腫瘍に対する治療効果を高めることができ、このことから、藻類プロテオグリカン抽出物と一般的に使用されている化学療法剤とが黒色腫の治療において相乗効果を有することは明らかにされた。

【0096】

実施例９．２ 藻類プロテオグリカン抽出物と他の化学療法剤との併用によるマウスＳ－１８０肉腫への治療効果
実験スキーム
１８～２２ｇの雌ＫＭマウス及びよく成長した７～１１日のＳ－１８０黒色腫を用いた。腫瘍組織を細胞懸濁液に調製して、マウスの右腋窩皮下に、約４．５～５×１０^６細胞／匹で接種した。接種２４時間後、マウスをランダムに群分けて異なるケージ（ｎ＝６）に入れた。藻類プロテオグリカン抽出物（以下、藻類プロテオグリカンと略称する）を経口（ｐ．ｏ．）投与し、シクロホスファミド、カルボプラチン、５－フルオロウラシル及びエトポシドを、１日に１回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、異なる投与量（用量）で２日目から連続的に７日間投与した。空白対照群に生理食塩水（ＮＳ）を投与した。休薬２４時間後、動物を屠殺して体重（ｇ）を秤量した。腫瘍を摘出し、腫瘍重量（ｇ）を測定した。各群について平均腫瘍重量を計算した。下式により腫瘍抑制率を算出して、Ｔ検定を行った。
腫瘍抑制率＝［（Ａ－Ｂ）／Ａ］×１００％
Ａは空白対照群の平均腫瘍重量（ｇ）であり、Ｂは治療群の平均腫瘍重量（ｇ）である。

【0097】

実験結果

【表15】

【表16】

【0098】

【表17】

【表18】

【0099】

表１５～１８に記載のデータから明らかなように、藻類プロテオグリカンは、２０～３０ｍｇ／ｋｇの用量ではＳ－１８０肉腫（Ｐ値＞０．０５）に対して増殖抑制がなく、６０ｍｇ／ｋｇの用量ではＳ－１８０肉腫に対して３５．４％の増殖抑制率を有し、マウス肉腫の増殖に対して一定の抑制効果を示した。

【0100】

カルボプラチンは、４ｍｇ／ｋｇの用量で単独で使用した場合、マウスＳ－１８０肉腫の移植腫瘍の増殖に対して抑制効果（Ｐ値＞０．０５）がなく、２０ｍｇ／ｋｇの藻類プロテオグリカンと併用した場合、抑制率が３３％であった。藻類プロテオグリカン６０ｍｇ／ｋｇとシクロホスファミド７．５ｍｇ／ｋｇとを併用した場合、Ｓ－１８０肉腫の増殖に対して、シクロホスファミド単独での抑制率よりも１０％高い５２．６％の抑制率が達成された。

【0101】

エトポシドは、３ｍｇ／ｋｇで単独投与した場合、マウスＳ－１８０肉腫の移植腫瘍の増殖に対する抑制効果が２６．９％（Ｐ値＞０．０５）であり、２０及び３０ｍｇ／ｋｇの藻類プロテオグリカンとを併用した場合、抗腫瘍効果がいずれも単独投与した場合より高まり、抑制率がそれぞれ３３．５％（Ｐ値＜０．０５）及び３５．７％（Ｐ値＜０．０１）であった。

【0102】

５－フルオロウラシルは、１５ｍｇ／ｋｇで単独投与した場合、マウスＳ－１８０肉腫の移植腫瘍に対して増殖抑制効果が比較的低く、藻類プロテオグリカンと併用した場合、抗腫瘍効果が有意に増加し、６７．５％の抑制率に達し、それは、２つの薬剤の併用により相乗効果をもたらしたことが明らかにされた。

【0103】

上記のデータから明らかなように、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物と、５－フルオロウラシル、エトポシド、カルボプラチン及びシクロホスファミドなどの化学療法剤との併用は、マウスＳ－１８０肉腫に対するこれらの化学療法剤の治療効果を向上させることができ、その中でも、５－フルオロウラシルと藻類プロテオグリカンとの併用による相乗効果は、最も顕著である。

【0104】

また、本出願人らは、膵臓癌ヌードマウスにおける生体内腫瘍に対する、藻類プロテオグリカン抽出物単独、及び該抽出物とゲムシタビンとの併用の抑制効果、ならびに患者由来異種移植片モデル（ＰＤＸ）において膵臓癌に対する抑制効果についても検討した。その結果、本発明の藻類プロテオグリカン抽出物とゲムシタビンとの併用は、膵臓癌の治療に対しても相乗効果を有することが示された。

【0105】

なお、以上のように、本発明は、上記の具体的な形態により関連発明を説明したが、本発明はこれらの具体的な形態で説明される特定の詳細に限定されていない。本明細書に記載の本発明の精神から逸脱することなく、関連発明に含まれる技術的特徴に対する様々な均等な変更を行うことができ、そのような変更はすべて本発明の範囲内であることは、当業者にとって自明なことである。

【図1】

【図2】

【図3】