(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-02
(45)【発行日】2023-05-15
(54)【発明の名称】脂肪由来幹細胞を含む生体材料およびその作製方法
(51)【国際特許分類】
A61L 27/12 20060101AFI20230508BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20230508BHJP
A61L 27/38 20060101ALI20230508BHJP
A61L 27/54 20060101ALI20230508BHJP
A61L 27/36 20060101ALI20230508BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20230508BHJP
A61L 27/44 20060101ALI20230508BHJP
A61L 27/10 20060101ALI20230508BHJP
A61K 35/32 20150101ALI20230508BHJP
A61K 35/28 20150101ALN20230508BHJP
【ＦＩ】
A61L27/12
A61L27/22
A61L27/38 111
A61L27/38 112
A61L27/54
A61L27/36 110
A61L27/38
A61P19/00
A61L27/36 311
A61L27/36 312
A61L27/44
A61L27/36 130
A61L27/10
A61K35/32
A61K35/28
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020537864
(86)(22)【出願日】2018-09-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-11-26
(86)【国際出願番号】 EP2018075545
(87)【国際公開番号】W WO2019057862
(87)【国際公開日】2019-03-28
【審査請求日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】62/561,046
(32)【優先日】2017-09-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】18165933.5
(32)【優先日】2018-04-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】520097216
【氏名又は名称】ノヴァディップ バイオサイエンシズ
(74)【代理人】
【識別番号】110002516
【氏名又は名称】弁理士法人白坂
(72)【発明者】
【氏名】ダフレーン，デニス
【審査官】長谷川 茜
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５２８６４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１７０１１７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Medicine，2015年，Vol.94, No.50, e2220，pp.1-11
【文献】Stem Cells International，2016年，Vol.2016, Article ID 1934270，pp.1-12
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｌ １５／００ －３３／１８
Ａ６１Ｋ ３５／００ －３５／７６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）から分化させた骨原性細胞とセラミック材料と細胞外基質とを含む多次元構造を有し、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）を分泌し、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１）と間質細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ－１α）とを含む、生体材料であり、前記セラミック材料が粒子の形態であり、
前記生体材料の前記多次元構造が、前記骨原性細胞による前記細胞外基質の合成に起因し、かつ、
前記骨原性細胞および前記セラミック材料が前記細胞外基質に包埋されている、生体材料。
【請求項2】
ＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり５ｎｇ分泌する、請求項１に記載の生体材料。
【請求項3】
ＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり１０ｎｇ分泌する、請求項１に記載の生体材料。
【請求項4】
ＩＧＦ１を生体材料１ｇ当たり少なくとも５０ｎｇ含む、請求項１に記載の生体材料。
【請求項5】
ＩＧＦ１を生体材料１ｇ当たり少なくとも７５ｎｇ含む、請求項１に記載の生体材料。
【請求項6】
ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり最大１００ｎｇ含む、請求項１に記載の生体材料。
【請求項7】
ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり最大７５ｎｇ含む、請求項１に記載の生体材料。
【請求項8】
前記セラミック材料がリン酸カルシウムの粒子である、請求項１に記載の生体材料。
【請求項9】
前記リン酸カルシウムの粒子が、５０μｍ～１５００μｍの範囲の平均サイズを有する、請求項８に記載の生体材料。
【請求項10】
前記リン酸カルシウムの粒子が、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）および／またはβリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）の粒子である、請求項８に記載の生体材料。
【請求項11】
前記リン酸カルシウムの粒子が、１０／９０～９０／１０の範囲の比のＨＡ／β－ＴＣＰの粒子である、請求項８に記載の生体材料。
【請求項12】
前記リン酸カルシウムの粒子が、２０／８０～８０／２０の範囲の比のＨＡ／β－ＴＣＰの粒子である、請求項８に記載の生体材料。
【請求項13】
ＶＥＧＦを少なくとも生体材料１ｇ当たり１０ｎｇ含む、請求項１に記載の生体材料。
【請求項14】
三次元のものである、請求項１に記載の生体材料。
【請求項15】
請求項１に記載の多次元生体材料を含む、医療装置。
【請求項16】
請求項１に記載の多次元生体材料を作製する方法であって、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖の段階と、
第４継代のＡＳＣを骨原性細胞に分化させる段階と、
前記骨原性細胞にセラミック材料を加え、多次元誘導させる段階と
を含む、方法。
【請求項17】
前記多次元誘導が３Ｄ誘導である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
骨欠損および／または軟骨欠損の治療に使用するための、請求項１に記載の生体材料を含む医薬組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、幹細胞および多次元生体材料の作製へのその使用の分野に関する。具体的には、本発明は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）を含む生体材料、そのような生体材料を治療用に調製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
骨欠損とは、通常であれば骨であるべき身体領域に骨組織がないことである。骨欠損は様々な外科的方法によって治療することができる。しかし、多くの場合、糖尿病、免疫抑制療法、運動状態の不良および処置を計画する際に考慮に入れる必要のあるその他の因子など、骨治癒の障害となる因子が存在する。
【0003】
骨欠損を再建する外科的方法としては、特に皮質剥離、切除および固定、海綿骨移植ならびにイリザロフの介在骨輸送法が挙げられる。ただし、患者の歩行障害の期間が長くなり、機能面および審美面からみた結果も最適ものとならないことが多い。
【0004】
組織工学では、生細胞の使用によって組織の構造または機能を回復させる。一般的工程は、細胞の単離および増殖と、それに続く足場材料を使用する再移植処置とからなる。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、成熟組織の細胞の優れた代替物となり、骨および軟骨の組織再生の細胞供給源として多数の利点がある。
【0005】
定義によれば、幹細胞は、自己再生することが可能であり、多系列に分化し、最終的に分化細胞を形成することが可能であることを特徴とするものである。理想的には、再生医療に適用する幹細胞は、以下の基準を満たすべきである：（ｉ）大量に（数百万～数十億個の細胞が）存在するべきである；（ｉｉ）低侵襲性の方法によって収集および回収することができる；（ｉｉｉ）再現可能に複数の細胞系列経路に沿って分化することができる；（ｉｖ）自家宿主または同種宿主に安全かつ効率的に移植することができる。
【0006】
複数の研究で、幹細胞には中胚葉、内胚葉および外胚葉起源の細胞に分化する能力があることが明らかにされている。ＭＳＣの可塑性はほとんどの場合、幹細胞内に保持している、系列の境界を越え、他の組織に固有の細胞の表現型の特性、生化学的特性および機能的特性を取り入れる先天的能力を指す。成体間葉系幹細胞は、例えば骨髄および脂肪組織から単離することができる。
【0007】
脂肪由来幹細胞は多能性であり、著明な再生能がある。この同じ脂肪組織細胞集団を識別するのに以下の用語：脂肪由来幹細胞／間質細胞（ＡＳＣ）；脂肪由来成体幹（ＡＤＡＳ）細胞、脂肪由来成体間質細胞、脂肪由来間質細胞（ＡＤＳＣ）、脂肪間質細胞（ＡＳＣ）、脂肪間葉系幹細胞（ＡｄＭＳＣ）、脂肪芽細胞、周皮細胞、脂肪前駆細胞、処理吸引脂肪組織（Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ Ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ）（ＰＬＡ）細胞が用いられている。文献にこのように多様な命名法が用いられることにより、大きな混乱を招いた。この問題に対処するため、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆａｔ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｃｉｅｔｙは、単離されており、可塑性のある付着性の多能性細胞集団を識別するのに「脂肪由来幹細胞」（ＡＳＣ）という用語を採用することで意見が一致した。
【0008】
骨原性分化ＡＳＣは様々な前臨床モデルで、様々な足場、例えばβリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、Ｉ型コラーゲン、ポリ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）およびアルギン酸などに播種すると大きな治癒能を示すことが明らかにされている。国際特許出願第２０１３／０５９０８９号は、幹細胞と、リン酸三カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムセメントの混合物とを含む、骨ペーストに関するものである。米国特許出願公開第２０１１／１０４２３０号には、合成セラミック材料と間葉系幹細胞とシグナル伝達分子とを含む足場材料を含む、骨パッチが開示されている。
【0009】
しかし、小動物モデルでは有望な結果が得られているものの、足場に搭載したＡＳＣを用いる臨界サイズの骨再建は未だ、骨欠損のサイズが大きいことによる、したがって、設計する移植片の大きさによる制約を受けている。播種細胞の細胞生着についても、酸素および栄養素の拡散不良による制約を受けている。さらに、足場内での細胞の位置が、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの生存率に対する大きな制約となっている。細胞をより均一に分布させる移植片内での細胞遊走、移植片の中心部に酸素および栄養素を送達することによる細胞生存ならびに、（流体せん断力による）骨原性細胞分化が改善されるように、足場のフロー灌流を備えたバイオリアクターが設計されている。これらの技術は有望なものではあるが、大型動物モデルでの関連する前臨床および臨床データが少ない。
【0010】
このように、当該技術分野では依然として、完全に生体に適合し、指定された用途に適した機械的特徴をもたらす、骨組織再生のための組織設計材料が必要とされている。したがって、本発明は、セラミック材料を有する多次元骨原性構造物に分化したＡＳＣから作製される、移植片に関するものである。
【発明の概要】
【0011】
本発明は、骨原性分化脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）とセラミック材料と細胞外基質とを含む多次元構造を有し、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）を分泌し、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１）と間質細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ－１α）とを含む、生体材料に関する。
【0012】
一実施形態では、生体材料は、ＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり約５ｎｇ、好ましくは少なくとも約１０ｎｇ／ｇ分泌する。
【0013】
一実施形態では、生体材料は、ＩＧＦ１を少なくとも生体材料１ｇ当たり約５０ｎｇ、好ましくは少なくとも７５ｎｇ含む。
【0014】
一実施形態では、生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大で生体材料１ｇ当たり約１００ｎｇ、好ましくは最大で７５ｎｇ含む。
【0015】
一実施形態では、セラミック材料は粒子の形態である。一実施形態では、セラミック材料はリン酸カルシウムの粒子である。
【0016】
一実施形態では、リン酸カルシウムの粒子は、約５０μｍ～約１５００μｍの範囲の平均サイズを有する。一実施形態では、リン酸カルシウムの粒子は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）および／またはβ－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）の粒子である。
【0017】
一実施形態では、リン酸カルシウムの粒子は、約１０／９０～約９０／１０の範囲の比のＨＡ／β－ＴＣＰの粒子である。別の実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰの粒子は、約２０／８０～約８０／２０の比である。別の実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰの粒子は、約３０／７０～約７０／３０の比である。別の実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰの粒子は、約４０／６０～約６０／４０の比である。別の実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰの粒子は約５０／５０の比である。別の実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰの粒子は６５／３５の比である。
【0018】
一実施形態では、生体材料は、ＶＥＧＦを少なくとも生体材料１ｇ当たり約１０ｎｇ含む。
【0019】
一実施形態では、生体材料は三次元のものである。
【0020】
ある特定の実施形態では、生体材料は成形可能または形成可能なものである。
【0021】
本発明は、本発明の多次元生体材料を含む、医療装置または医薬組成物にも関する。
【0022】
本発明のまた別の目的は、本発明の多次元生体材料を作製する方法であって、
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖の段階と、
第４継代でのＡＳＣ骨原性分化の段階と、
多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階と
を含む、方法である。
脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）増殖の段階と、
第４継代でのＡＳＣ骨原性分化の段階と、
多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階と
を含む、方法である。
【0023】
本発明はさらに、本発明の方法によって得られる多次元生体材料に関する。
【0024】
本発明のまた別の目的は、骨欠損または軟骨欠損の治療に使用する、本明細書に記載される生体材料である。
【0025】
定義
本発明では、以下の用語は以下のような意味を有する：
本発明では、以下の用語は以下のような意味を有する：
【0026】
値の前に記載される「約」という用語は、前記値±１０％の値を意味する。
【0027】
「脂肪組織」という用語は、任意の脂肪組織を指す。脂肪組織は、皮下、大網／内臓、乳房、性腺またはその他の脂肪組織部位に由来する、褐色脂肪組織または白色脂肪組織であり得る。好ましくは、脂肪組織は皮下白色脂肪組織である。このような細胞は、初代細胞培養物または不死化細胞系列を含み得る。脂肪組織は、脂肪組織を有し、生存している、または死亡した任意の生物に由来するものであり得る。好ましくは、脂肪組織は動物、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくは、脂肪組織はヒトである。脂肪組織の便利な供給源として脂肪吸引術由来のものがあるが、脂肪組織の供給源も脂肪組織単離の方法も本発明にとって重要なものではない。
【0028】
本明細書で使用される「脂肪由来幹細胞」（「脂肪組織由来幹細胞」とも呼ばれる）という用語は、脂肪組織の「非脂肪細胞」分画を指す。細胞は、新鮮なものであっても、培養したものであってもよい。「脂肪由来幹細胞」（ＡＳＣ）は、脂肪組織に由来し、様々な異なる細胞型、例えば、特に限定されないが、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などへの前駆体としての役割を果たし得る、間質細胞を指す。
【0029】
本明細書で使用される「セラミック材料」という用語は、無機非金属固体材料を指す。セラミック材料は、リン酸カルシウム（ＣａＰ）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、硫酸カルシウム、水酸化カルシウム（Ｃａ［ＯＨ］２）またはその組合せであり得る。セラミック材料は粒子の形態であり得る。セラミック材料は、粉末、ビーズまたは顆粒の形態であり得る。セラミック材料は多孔性であり得る。
【0030】
「再生」または「組織再生」という用語は、特に限定されないが、本開示のＡＳＣからの新たな細胞型または組織の成長、発生または再建を含む。一実施形態では、細胞型または組織としては、特に限定されないが、骨原性細胞（例えば、骨芽細胞）、軟骨細胞、内皮細胞、心筋細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神経細胞および筋管が挙げられる。特定の実施形態では、「再生」または「組織再生」という用語は、本開示のＡＳＣからの骨原性細胞（例えば、骨芽細胞）の発生または再建を指す。
【0031】
本明細書で使用される「成長因子」という用語は、組織成長、細胞増殖、血管新生などを促進する分子のことである。特定の実施形態では、「成長因子」という用語は、骨組織形成を促進する分子を含む。
【0032】
本明細書で使用される「培養された」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの環境で細胞分裂の過程にある、または細胞分裂の過程にない１つまたは複数の細胞を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するのに適した当該技術分野で公知の任意の培地、例えば、適切な液体培地または寒天などであり得る。細胞培養に適したｉｎ ｖｉｔｒｏの環境の具体例が、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），１９９４，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｃｅｌｌｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（ｖｏｌ．１），１９９８，Ｄ．Ｌ．Ｓｐｅｃｔｏｒ，Ｒ．Ｄ．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｌ．Ａ．Ｌｅｉｎｗａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａ，１９９４，Ｄ．Ｃ．Ｄａｒｌｉｎｇ，Ｓ．Ｊ．Ｍｏｒｇａｎ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．に記載されている。
【0033】
「コンフルエンシー」という用語は、細胞培養表面（培養皿またはフラスコなど）の付着細胞の数、すなわち、細胞によって覆われている表面の割合を指す。１００％のコンフルエンシーは、表面が細胞によって完全に覆われていることを意味する。一実施形態では、「細胞がコンフルエンスに達する」または「細胞がコンフルエントである」という表現は、細胞が表面の８０～１００％を覆っていることを意味する。一実施形態では、「細胞がサブコンフルエントである」という表現は、細胞が表面の６０～８０％を覆っていることを意味する。一実施形態では、「細胞がオーバーコンフルエントである」という表現は、細胞が少なくとも表面の１００％を覆っている、かつ／または数時間または数日以来、１００％のコンフルエントであることを意味する。
【0034】
「冷蔵すること」または「冷蔵」という用語は、対象の正常な生理的温度未満の温度にする処理を指す。例えば、長期間にわたって、例えば、少なくとも約１時間、少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約４週間、少なくとも約６か月などにわたって、約－１９６℃～約＋３２℃の範囲内で選択される１つまたは複数の温度で。一実施形態では、「冷蔵すること」または「冷蔵」は、０℃未満の温度にする処理を指す。冷蔵することは、手作業で実施しても、好ましくは、冷蔵プログラムを実行することが可能な特別の装置を用いて実施してもよい。一実施形態では、「冷蔵」という用語は、当該技術分野で「凍結すること」および「凍結保存」として知られる方法を含む。当業者には、冷蔵方法が、冷蔵目的で試薬を添加することを含めた他の段階を含み得ることが理解されよう。
【0035】
本明細書で使用される「非胚細胞」という用語は、胚から単離されるものではない細胞を指す。非胚細胞は、分化したものであっても未分化のものであってもよい。非胚細胞は、ほぼあらゆる体細胞、例えば子宮外の動物から単離した細胞などを指し得る。一実施形態では、非胚細胞は生殖細胞を含む。これらの例は、限定することを意図するものではない。
【0036】
本明細書で使用される「分化細胞」という用語は、特殊化していない表現型から特殊化した表現型に発生した前駆細胞を指す。例えば、脂肪由来幹細胞は骨原性細胞に分化し得る。
【0037】
本明細書で使用される「分化培地」という用語は、分化細胞を作製するのに本発明の培養系で使用する化合物の集合物の１つを指す。化合物の作用機序に関しては、いかなる限定も意図されない。例えば、薬剤は、表現型の変化を誘導または補助する、特定の表現型を有する細胞の増殖を促進する、または他の細胞の増殖を遅らせることによって、分化過程を補助するものであり得る。薬剤は、培地中に存在するか、細胞集団によって合成され、望ましくない細胞型への経路に沿って分化を指令する可能性のある他の因子に対して、阻害剤として作用し得るものであってもよい。
【0038】
「治療」、「治療すること」または「軽減」という用語は、骨欠損を予防すること、または速度を低下させる（減少させる）ことを目的とする、治療的処置を指す。治療を必要とする者には、既に障害を有する者および障害を発症しやすい者または骨欠損を予防するべき者が含まれる。治療量の本発明の方法による生体材料を入れた後、患者に、骨欠損の軽減および／または骨欠損による１つもしくは複数の症状のある程度の緩和；罹病率および死亡率の低下ならびに生活の質の改善のうち１つまたは複数のものについて観察可能かつ／または測定可能な軽減または不在がみられる場合、対象の骨欠損が良好に「治療された」ことになる。疾患の良好な治療および改善を評価するための上記パラメータは、医師がよく知るルーチンの方法によって容易に測定可能なものである。
【0039】
本開示の生体材料の治療的使用に関連して、「同種」療法では、ドナーとレシピエントが同じ種に属する異なる個体であるのに対して、「自家」療法では、ドナーとレシピエントが同じ個体であり、「異種」療法では、ドナーは、レシピエントと異なる種に属する動物に由来するものである。
【0040】
「有効量」という用語は、臨床結果を含めた有益な結果または所望の結果を得るのに十分な量を指す。有効量を１回または複数回の投与で投与することができる。
【0041】
「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。対象の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウマ、ウシおよびそのトランスジェニック種が挙げられる。一実施形態では、対象は「患者」、すなわち、医療を受けるのを待っているか受けている、または医療処置の対象であった／である／となる、または疾患の発症を監視している温血動物、より好ましくはヒトであり得る。一実施形態では、対象は成体（例えば、１８歳超のヒト対象）である。別の実施形態では、対象は子供（例えば、１８歳未満のヒト対象）である。一実施形態では、対象は雄である。別の実施形態では、対象は雌である。
【0042】
「生体適合性」という用語は、細胞、細胞培養物、組織または生物体などの生体系に適合する、無毒性材料を指す。
【0043】
「多次元」という用語は、２以上の次元、例えば二次元（２Ｄ）または三次元（３Ｄ）を指す。一実施形態では、多次元構造を有する生体材料は、２Ｄまたは３Ｄ構造を有する生体材料を指す。
【発明を実施するための形態】
【0044】
本発明は、脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）とセラミック材料と細胞外基質とを含む多次元構造を有し、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）を含み、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１）と間質細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ－１α）とを含む、生体材料に関する。
【0045】
本明細書で使用される「多次元構造を有する生体材料」という用語は、本発明全体を通して「多次元生体材料」という用語に置き換えられ得る。
【0046】
一実施形態では、細胞は、脂肪組織から単離されるものであり、以降、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）と呼ぶ。
【0047】
一実施形態では、ＡＳＣ組織は動物起源、好ましくは哺乳動物起源、より好ましくはヒト起源のものである。したがって、一実施形態では、ＡＳＣは動物ＡＳＣ、好ましくは哺乳動物ＡＳＣ、より好ましくはヒトＡＳＣである。好ましい実施形態では、ＡＳＣはヒトＡＳＣである。
【0048】
脂肪組織から幹細胞を単離する方法は当該技術分野で公知であり、例えばＺｕｋら（Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２００１，７：２１１－２２８）に開示されている。一実施形態では、脂肪吸引術によって脂肪組織からＡＳＣを単離する。
【0049】
例として、針生検または脂肪吸引術による吸引によって脂肪組織を収集し得る。最初に、任意選択で抗生物質、例えば１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で組織試料を徹底的に洗浄することによって、脂肪組織からＡＳＣを単離し得る。次いで、試料を組織消化用のコラゲナーゼ（例えば、２％Ｐ／Ｓを含有するＰＢＳで調製したＩ型コラゲナーゼ）とともに無菌組織培養プレートに入れ、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートし得る。培地（例えば、１０％血清を含有するＤＭＥＭ）を添加することによってコラゲナーゼ活性を中和し得る。崩壊後、試料をチューブに移し得る。試料を（例えば、２０００ｒｐｍで５分間）遠心分離することによって、ＡＳＣが含まれる間質血管細胞群（ＳＶＦ）が得られる。間質細胞と初代脂肪細胞との分離を完了させるため、試料を激しく振盪して、ペレットを徹底的に破壊し、細胞をかき混ぜ得る。遠心分離段階を反復し得る。遠心分離しコラゲナーゼ溶液を吸引した後、ペレットを溶解緩衝液に再懸濁させ、氷上で（例えば１０分間）インキュベートし、（例えばＰＢＳ／２％Ｐ／Ｓで）洗浄し、（例えば、２０００ｒｐｍで５分間）遠心分離し得る。次いで、上清を吸引し、細胞ペレットを培地（例えば、間質培地、すなわち、２０％ＦＢＳ、１％Ｌ－グルタミンおよび１％Ｐ／Ｓを添加したα－ＭＥＭ）に再懸濁させ、細胞懸濁液を（例えば７０μｍのセルストレーナーで）ろ過し得る。最後に、細胞が含まれる試料を培養プレートに播き、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし得る。
【0050】
一実施形態では、脂肪組織の間質血管細胞群から本発明のＡＳＣを単離する。一実施形態では、吸引脂肪組織を使用前に室温で数時間もしくは＋４℃で２４時間、または長期保存に０℃未満、例えば－１８℃で保持し得る。
【0051】
一実施形態では、ＡＳＣは、新鮮なＡＳＣまたは冷蔵したＡＳＣであり得る。新鮮なＡＳＣとは、冷蔵処理を実施していない単離ＡＳＣのことである。冷蔵ＡＳＣとは、冷蔵処理を実施した単離ＡＳＣのことである。一実施形態では、冷蔵処理は、０℃未満の任意の処理を意味する。一実施形態では、冷蔵処理を約－１８℃、－８０℃または－１８０℃で実施し得る。特定の実施形態では、冷蔵処理は凍結保存であり得る。
【0052】
冷蔵処理の例として、ＡＳＣを８０～９０％のコンフルエンスで回収し得る。洗浄および皿からの剥離の段階の後、細胞を冷蔵保存培地とともに室温でペレット化し、バイアルに入れ得る。一実施形態では、冷蔵保存培地は、８０％ウシ胎児血清またはヒト血清、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および１０％ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２を含む。次いで、バイアルを－８０℃で一晩保管し得る。例えば、バイアルを－８０℃に達するまで毎分約１℃で徐々に冷却するアルコール凍結容器に入れ得る。最後に、凍結したバイアルを長期保存用の液体窒素容器に移し得る。
【0053】
一実施形態では、ＡＳＣは分化ＡＳＣである。好ましい実施形態では、ＡＳＣは骨原性分化ＡＣＳである。換言すれば、好ましい実施形態では、ＡＳＣを骨原性細胞に分化させる。特定の実施形態では、ＡＳＣを骨芽細胞に分化させる。
【0054】
骨原性分化を制御および評価する方法は当該技術分野で公知である。例えば、オステオカルシンおよび／または（例えばフォン・コッサで）リン酸塩を染色することによって；（例えばアリザリンレッドで）リン酸カルシウムを染色することによって；磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって；ミネラル化基質形成の測定によって；あるいはアルカリホスファターゼ活性の測定によって、本発明の細胞または組織の骨分化を評価し得る。
【0055】
一実施形態では、ＡＳＣを骨原性分化培地（ＭＤ）で培養することによって、ＡＳＣの骨原性分化を実施する。
【0056】
一実施形態では、骨原性分化培地はヒト血清を含む。特定の実施形態では、骨原性分化培地はヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含む。一実施形態では、骨原性分化培地は他のいかなる動物血清も含まず、好ましくは、骨原性分化培地はヒト血清以外の血清を含まない。
【0057】
一実施形態では、骨原性分化培地は、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびリン酸ナトリウムを添加した増殖培地を含むか、これよりなるものである。一実施形態では、骨原性分化培地は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよび／またはアンホテリシンＢなどの抗生物質をさらに含む。一実施形態では、いずれの培地も動物タンパク質を含まない。
【0058】
一実施形態では、増殖培地は、細胞の成長を補助するよう考案された当業者に公知の任意の培地であり得る。本明細書で使用される増殖培地は、「成長培地」とも呼ぶ。成長培地の例としては、特に限定されないが、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＦＧＭもしくはＦＧＭ－２、１９９／１０９培地、ＨａｍＦ１０／ＨａｍＦ１２またはＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａが挙げられる。好ましい実施形態では、増殖培地はＤＭＥＭである。
【0059】
一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ａｌａ－Ｇｌｎ、「Ｇｌｕｔａｍａｘ（登録商標）」または「Ｕｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅ（登録商標）」とも呼ばれる）、ｈＰＬ、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびリン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ、デキサメタゾン、アスコルビン酸およびリン酸ナトリウムならびに抗生物質、好ましくはペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよび／またはアンホテリシンＢを添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。
【0060】
一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ（約５％、ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（約１μＭ）、アスコルビン酸（約０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（約２．９３ｍＭ）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ（約５％、ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（約１μＭ）、アスコルビン酸（約０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（約２．９３ｍＭ）、ペニシリン（約１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（約１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、骨原性分化培地はアンホテリシンＢ（約０．１％）をさらに含む。
【0061】
一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ（約５％、ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（約１μＭ）、アスコルビン酸（約０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（約２．９３ｍＭ）を添加したＤＭＥＭよりなる。一実施形態では、骨原性分化培地は、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ｈＰＬ（約５％、ｖ／ｖ）、デキサメタゾン（約１μＭ）、アスコルビン酸（約０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（約２．９３ｍＭ）、ペニシリン（約１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（約１００μｇ／ｍＬ）およびアンホテリシンＢ（約０．１％）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。
【0062】
一実施形態では、ＡＳＣは後期継代脂肪由来幹細胞である。本明細書で使用される「後期継代」という用語は、少なくとも継代４以降に分化した脂肪由来幹細胞を意味する。本明細書で使用される継代４は第４継代、すなわち、細胞を培養容器の表面から剥離することによって分けた後、新鮮培地に再懸濁させる４回目の行為を指す。一実施形態では、後期継代脂肪由来幹細胞を継代４、継代５、継代６またはそれ以降に分化させる。好ましい実施形態では、ＡＳＣを継代４以降に分化させる。
【0063】
本明細書で使用される「容器」という用語は、任意の細胞培養表面、例えばフラスコまたはウェルプレートなどを意味する。
【0064】
初代細胞の初期継代は継代０（Ｐ０）と呼ばれた。本発明では、継代Ｐ０は、ペレット化した間質血管細胞群（ＳＶＦ）の細胞懸濁液を培養容器に播種することを指す。したがって、継代Ｐ４は、細胞を培養容器の表面から（例えば、トリプシンでの消化によって）４回（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４に）剥離し、新鮮培地に再懸濁させたことを意味する。
【0065】
一実施形態では、本発明のＡＳＣを第４継代まで増殖培地で培養する。一実施形態では、本発明のＡＳＣを第４継代以降、分化培地で培養する。したがって、一実施形態では、継代Ｐ１、Ｐ２およびＰ３で、ＡＳＣを培養容器の表面から剥離し、次いで、増殖培地で適切な細胞密度まで希釈する。さらにこの実施形態では、継代Ｐ４でＡＳＣを培養容器の表面から剥離し、次いで、分化培地で適切な細胞密度まで希釈する。したがって、この実施形態では、Ｐ４で、本発明のＡＳＣを分化させる（すなわち、分化培地で培養する）前に、これを増殖培地に再懸濁させ、コンフルエンスに達するまで培養するのではなく、分化培地に直接再懸濁させ、培養する。
【0066】
一実施形態では、細胞を少なくともコンフルエンス、好ましくは７０％～１００％のコンフルエンス、より好ましくは８０％～９５％のコンフルエンスに達するまで骨原性分化培地で維持する。一実施形態では、細胞を少なくとも５日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１５日間、骨原性分化培地で維持する。一実施形態では、細胞を５～３０日間、好ましくは１０～２５日間、より好ましくは１５～２０日間、骨原性分化培地で維持する。一実施形態では、分化培地を２日毎に交換する。ただし、当該技術分野で公知のように、細胞成長速度はドナーによってわずかに異なる可能性がある。したがって、骨原性分化の継続期間および培地交換の回数は、ドナーによって異なるものとなり得る。
【0067】
一実施形態では、細胞を少なくとも類骨、すなわち、骨組織成熟の前に形成される骨基質の非ミネラル化有機部分の形成まで、骨原性分化培地で維持する。
【0068】
一実施形態では、本発明のセラミック材料は、本明細書でセラミック粒子と呼ぶ粒子の形態である。一実施形態では、粒子は、ビーズ、粉末、球状物、マイクロスフェアなどであり得る。
【0069】
一実施形態では、本発明のセラミック材料は、リン酸カルシウム（ＣａＰ）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、硫酸カルシウムもしくは水酸化カルシウム（Ｃａ［ＯＨ］２）またはその組合せの粒子である。
【0070】
リン酸カルシウム粒子の例としては、特に限定されないが、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ、Ｃａ３［ＰＯ４］２）、αリン酸三カルシウム（α－ＴＣＰ、（α－Ｃａ３（ＰＯ４）２）、βリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ、β－Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ、Ｃａ４（ＰＯ４）２Ｏ）、リン酸八カルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６．５Ｈ２Ｏ）、非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、ヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト／リン酸四カルシウム（ＨＡ／ＴＴＣＰ）などが挙げられる。
【0071】
一実施形態では、本発明のセラミック材料は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）、硫酸カルシウムまたはその組合せを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、本発明のセラミック材料は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、βリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）、ヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）、αリン酸三カルシウム（α－ＴＣＰ）、硫酸カルシウムまたはその組合せを含むか、これよりなるものである。
【0072】
一実施形態では、本発明のセラミック粒子はヒドロキシアパタイト（ＨＡ）の粒子である。別の実施形態では、本発明のセラミック粒子はβリン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）の粒子である。別の実施形態では、本発明のセラミック粒子はヒドロキシアパタイト／βリン酸三カルシウム（ＨＡ／β－ＴＣＰ）の粒子である。換言すれば、一実施形態では、本発明のセラミック粒子は、ヒドロキシアパタイト粒子とβリン酸三カルシウム粒子の混合物（ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子と呼ぶ）である。一実施形態では、本発明のセラミック粒子は、ヒドロキシアパタイト粒子とβリン酸三カルシウム粒子（ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子と呼ぶ）よりなる。
【0073】
一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、顆粒、粉末またはビーズの形態である。一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、多孔性の顆粒、粉末またはビーズの形態である。一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、多孔性セラミック材料である。一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、粉末粒子である。特定の実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、多孔性顆粒の形態である。別の特定の実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、粉末の形態である。一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、予め定められた３Ｄの形状または足場、例えば立方体などを形成するよう構築されていない。一実施形態では、本発明のセラミック材料は、３Ｄ足場ではない。一実施形態では、セラミック材料は予め定められた形状でも足場でもない。一実施形態では、本発明のセラミック材料は立方体の形状ではない。一実施形態では、本発明の生体材料は足場がない。
【0074】
一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約５０μｍより大きく、好ましくは約１００μｍより大きい。一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約５０μｍより大きい、好ましくは約１００μｍより大きい平均径を有する。
【0075】
一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、少なくとも約５０μｍ、好ましくは少なくとも約１００μｍ、より好ましくは少なくとも約１５０μｍの平均径を有する。別の実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、少なくとも約２００μｍ、好ましくは少なくとも約２５０μｍ、より好ましくは少なくとも約３００μｍの平均径を有する。
【0076】
別の実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、最大約２５００μｍ、好ましくは最大約２０００μｍ、より好ましくは最大約１５００μｍの平均径を有する。一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、最大約１０００μｍ、９００μｍ、８００μｍ、７００μｍまたは６００μｍの平均径を有する。
【0077】
一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約５０μｍ～約１５００μｍ、好ましくは約５０μｍ～約１２５０μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約１０００μｍの範囲の平均径を有する。一実施形態では、本発明のセラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約１００μｍ～約８００μｍ、好ましくは約１５０μｍ～約７００μｍ、より好ましくは約２００μｍ～約６００μｍの範囲の平均径を有する。
【0078】
一実施形態では、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子は、約５０μｍ～約１５００μｍ、好ましくは約５０μｍ～約１２５０μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約１０００μｍの範囲の平均径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子およびβ－ＴＣＰ粒子は、約１００μｍ～約８００μｍ、好ましくは約１５０μｍ～約７００μｍ、より好ましくは約２００μｍ～約６００μｍの範囲の平均径を有する。
【0079】
一実施形態では、粒子中のＨＡとβ－ＴＣＰの比（ＨＡ／β－ＴＣＰ比）は、約０／１００～約１００／０、好ましくは約１０／９０～約９０／１０、より好ましくは約２０／８０～約８０／２０の範囲内にある。一実施形態では、粒子中の比ＨＡ／β－ＴＣＰは、約３０／７０～約７０／３０、約３５／６５～約６５／３５または約４０／６０～約６０／４０の範囲内にある。
【0080】
一実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は０／１００である、すなわち、粒子はβリン酸三カルシウムの粒子である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は１００／０である、すなわち、粒子はヒドロキシアパタイトの粒子である。一実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約１０／９０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約９０／１０である。一実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約２０／８０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約８０／２０である。一実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約３０／７０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約７０／３０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約３５／６５である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約６５／３５である。一実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約４０／６０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約６０／４０である。別の実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は約５０／５０である。
【0081】
一実施形態では、粒子中のＨＡ／β－ＴＣＰ比は、１００：０、９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９４：６、９３：７、９２：８、９１：９、９０：１０、８９：１１、８８：１２、８７：１３、８６：１４、８５：１５、８４：１６、８３：１７、８２：１８、８１：１９、８０：２０、７９：２１、７８：２２、７７：２３、７６：２４、７５：２５、７４：２６、７３：２７、７２：２８、７１：２９、７０：３０、６９：３１、６８：３２、６７：３３、６６：３４、６５：３５、６４：３６、６３：３７、６２：３８、６１：３９、６０：４０、５９：４１、５８：４２、５７：４３、５６：４４、５５：４５、５４：４６、５３：４７、５２：４８、５１：４９、５０：５０、４９：５１、４８：５２、４７：５３、４６：５４、４５：５５、４４：５６、４３：５７、４２：５８、４１：５９、４０：６０、３９：６１、３８：６２、３７：６３、３６：６４、３５：６５、３４：６６、３３：６７、３２：６８、３１：６９、３０：７０、２９：７１、２８：７２、２７：７３、２６：７４、２５：７５、２４：７６、２３：７７、２２：７８、２１：７９、２０：８０、１９：８１、１８：８２、１７：８３、１６：８４、１５：８５、１４：８６、１３：８７、１２：８８、１１：８９、１０：９０、９：９１、８：９２、７：９３、６：９４、５：９５、４：９６、３：９７、２：９８、１：９９または０：１００である。
【0082】
一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ、β－ＴＣＰおよび／またはＨＡ／β－ＴＣＰの量は、生体材料に３Ｄ構造を与えるのに最適なものである。一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子を１５０ｃｍ２の容器に対して約０．１ｃｍ３～約５ｃｍ３、好ましくは約０．５ｃｍ３～約３ｃｍ３、より好ましくは約１ｃｍ３～約２ｃｍ３の範囲の濃度で加える。好ましい実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子を１５０ｃｍ２の容器に対して約１．５ｃｍ３の濃度で加える。
【0083】
一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子を培地１ｍＬ当たり約７×１０－３～７×１０－２ｃｍ３の範囲の濃度で加える。一実施形態では、セラミック粒子、好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子を容器１ｃｍ２当たり約３．３×１０３～３．３×１０－２ｃｍ３の範囲の濃度で加える。
【0084】
一実施形態では、細胞の分化後に本発明のセラミック材料を培地に加える。一実施形態では、細胞がサブコンフルエントであるときに本発明のセラミック材料を加える。一実施形態では、細胞がオーバーコンフルエントであるときに本発明のセラミック材料を加える。一実施形態では、細胞が分化後にコンフルエンスに達したとき、本発明のセラミック材料を加える。換言すれば、一実施形態では、細胞が分化培地中でコンフルエンスに達したとき、本発明のセラミック材料を加える。一実施形態では、Ｐ４の少なくとも５日後、好ましくは１０日後、より好ましくは１５日後に本発明のセラミック材料を加える。一実施形態では、Ｐ４の５～３０日後、好ましくは１０～２５日後、より好ましくは１５～２０日後に本発明のセラミック材料を加える。
【0085】
一実施形態では、本発明による生体材料は二次元のものである。この実施形態では、本発明の生体材料は、１ｍｍ未満の薄膜を形成し得る。
【0086】
別の実施形態では、本発明による生体材料は三次元のものである。この実施形態では、本発明の生体材料は、厚さが少なくとも１ｍｍの厚膜を形成し得る。生体材料の大きさを使用に適合させ得る。
【0087】
一実施形態では、本発明の生体材料は足場を含まない。本明細書で使用される「足場」という用語は、ヒトおよび動物の組織を含めた天然の哺乳動物組織、例えば天然の哺乳動物の骨または細胞外基質などの多孔性、孔径および／または機能を模倣する構造を意味する。このような足場の例としては、特に限定されないが、人工骨、コラーゲンスポンジ、ヒドロゲル、例えばタンパク質ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、ポリマーヒドロゲルおよび木材系ナノセルロースヒドロゲルなどが挙げられる。一実施形態では、本発明の生体材料は人工骨を含まない。一実施形態では、本発明のセラミック材料は人工骨ではない。
【0088】
一実施形態では、本発明の生体材料の多次元性は、天然の細胞外基質構造を模倣する足場によるものではない。一実施形態では、本発明の生体材料は、天然の細胞外基質構造を模倣する足場を含まない。
【0089】
一実施形態では、本発明の生体材料の多次元性は、本発明の脂肪組織由来幹細胞による細胞外基質の合成によるものである。
【0090】
一実施形態では、本発明の生体材料は細胞外基質を含む。一実施形態では、本発明の細胞外基質は、ＡＳＣに由来するものである。一実施形態では、本発明の細胞外基質は、ＡＳＣによって産生されるものである。
【0091】
本明細書で使用される「細胞外基質」（ＥＣＭ）という用語は、非細胞三次元高分子ネットワークを意味する。ＥＣＭの基質成分が互いに結合するとともに細胞接着受容体とも結合し、それにより複合体ネットワークを形成し、その中で細胞が組織または本発明の生体材料中に存在する。
【0092】
一実施形態では、本発明の細胞外基質は、コラーゲン、プロテオグリカン／グリコサミノグリカン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンおよび／またはその他の糖タンパク質を含む。特定の実施形態では、本発明の細胞外基質はコラーゲンを含む。別の特定の実施形態では、本発明の細胞外基質はプロテオグリカンを含む。別の特定の実施形態では、本発明の細胞外基質は、コラーゲンとプロテオグリカンとを含む。一実施形態では、本発明の細胞外基質は、成長因子、プロテオグリカン、分泌因子、細胞外基質調節因子および糖タンパク質を含む。
【0093】
一実施形態では、本発明の生体材料の中にあるＡＳＣが、本明細書でＡＳＣ組織と呼ぶ組織を形成する。一実施形態では、本発明の生体材料の中にあるＡＳＣならびにセラミック材料、好ましくはセラミック粒子、より好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子が細胞外基質中の包埋されている。一実施形態では、好ましくは骨細胞に分化したＡＳＣが、セラミック材料、好ましくはセラミック粒子、より好ましくはＨＡ粒子、β－ＴＣＰ粒子および／またはＨＡ／β－ＴＣＰ粒子とともに、細胞外基質を有する３Ｄ構造を形成する。一実施形態では、ＡＳＣ組織は血管新生した組織である。一実施形態では、本発明の生体材料は血管新生したものである。
【0094】
一実施形態では、ＡＳＣ組織は細胞化された相互結合組織である。一実施形態では、細胞化された相互結合組織にセラミック粒子が組み込まれている。一実施形態では、ＡＳＣ組織内にセラミック粒子が分散している。
【0095】
一実施形態では、本発明の生体材料は、セラミック粒子の間で形成される、相互結合組織を特徴とする。一実施形態では、本発明の生体材料は、セラミック粒子周囲でのミネラル化を特徴とする。一実施形態では、形成された生体材料の組織としての性質を組織退縮が起きることによって確認し得る。
【0096】
一実施形態では、本発明の生体材料は、オステオカルシン発現およびミネラル化特性に関して実骨と同じ特性を有する。一実施形態では、本発明の生体材料は骨細胞を含む。一実施形態では、本発明の生体材料は骨細胞と細胞外基質とを含む。一実施形態では、本発明の生体材料は骨細胞とコラーゲンとを含む。特定の実施形態では、コラーゲンは、石灰化しミネラル化したコラーゲンである。一実施形態では、本発明の生体材料は骨基質を含む。
【0097】
一実施形態では、本発明の生体材料は、生体材料の細胞の分化が終点に達したものであり、生体材料の表現型は、移植しても変化しないままである。
【0098】
一実施形態では、本発明の生体材料は成長因子を含む。一実施形態では、生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料による成長因子の含有量または分泌を評価する。
【0099】
破骨細胞形成阻害因子（ＯＣＩＦ）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）としても知られるオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）は、サイトカイン受容体の１つである。マウスでは、ＯＰＧの過剰発現または投与によって破骨細胞形成が鈍化することがわかっている。同様に、ＯＰＧが欠如した動物では破骨細胞形成が促進され、重度の骨粗鬆症が発症することが確認されている。ＯＰＧは現在、ＲＡＮＫＬ（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１１（ＴＮＦＳＦ１１）、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、オステオプロテジェリンリガンド（ＯＰＧＬ）または破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）としても知られる核因子カッパＢリガンドの受容体活性化因子）に関してＲＡＮＫと競合する可溶性デコイ受容体であることが知られている。ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧシグナル伝達経路は、破骨細胞の分化および活性化を調節することが明らかにされている。したがって、破骨細胞形成の刺激因子であるＲＡＮＫＬの発現と阻害剤であるＯＰＧの発現のバランスが、再吸収される骨の量を決定する。
【0100】
一実施形態では、好ましくは生体適合材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＯＰＧの含有量および／または分泌を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。
【0101】
一実施形態では、本発明の生体材料はＯＰＧを含む。一実施形態では、本発明の生体材料はＯＰＧを分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料のＡＳＣはＯＰＧを分泌する。一実施形態では、本発明の細胞設計生体材料はＯＰＧを分泌する。
【0102】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり少なくとも約１０００ｐｇ、１２５０ｐｇ、１５００ｐｇ、１７５０ｐｇまたは２０００ｐｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり少なくとも約２１００ｐｇ、２２００ｐｇ、２３００ｐｇ、２４００ｐｇまたは２５００ｐｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり少なくとも約２５５０ｐｇ、２６００ｐｇ、２６５０ｐｇまたは２７００ｐｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり少なくとも約２７５０ｐｇ、２８００ｐｇ、２８５０ｐｇ、２９００ｐｇまたは２９５０ｐｇ分泌する。
【0103】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり少なくとも約２７５０ｐｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり約２５００ｐｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり約３０００ｐｇ分泌する。
【0104】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり約１０００～約１００００ｐｇ、好ましくは約１２５０～約７５００ｐｇ／１０６個、より好ましくは約１５００～約５０００ｐｇ／１０６個分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを細胞１０６個当たり約１０００～約５０００ｐｇ、好ましくは約１２５０～約４５００ｐｇ／１０６個、より好ましくは約１５００～約４０００ｐｇ／１０６個分泌する。好ましい実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約２０００～約３５００ｐｇ／１０６個の範囲の濃度で分泌する。特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約３０００または３５００ｐｇ／１０６個の濃度で分泌する。
【0105】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約５ｎｇ、好ましくは少なくとも約１０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約１５ｎｇ／ｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約２０ｎｇ、好ましくは少なくとも約２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約３０ｎｇ／ｇ分泌する。
【0106】
別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約５０ｎｇ、好ましくは少なくとも約６０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約７０ｎｇ／ｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約７５ｎｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり少なくとも約８０ｎｇ分泌する。
【0107】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約５～約２００ｎｇ、好ましくは約１０～約１７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約１５～約１５０ｎｇ／ｇ分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを生体材料１ｇ当たり約１０～約２００ｎｇ、好ましくは約１５～約１７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約２０～約１５０ｎｇ／ｇ、さらにより好ましくは約２５～約１２５ｎｇ／ｇ分泌する。一実施形態では、本発明の生体材料は、約２０～約１００ｎｇ／ｇ生体材料、分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、約２５～約１００ｎｇ／ｇ生体材料、分泌する。別の実施形態では、本発明の生体材料は、約３０～約１００ｎｇ／ｇ生体材料、約３０～約９０ｎｇ／ｇ生体材料または約３０～約８５ｎｇ／ｇ生体材料、分泌する。
【0108】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約３０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で分泌する。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約７５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で分泌する。別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを約８５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で分泌する。
【0109】
一実施形態では、本発明の生体材料は、セラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＯＰＧを本明細書で上に記載した濃度で分泌する。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＯＰＧを本明細書で上に記載した濃度で分泌する。
【0110】
一実施形態では、好ましくはセラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＲＡＮＫＬの含有量および／または分泌を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。
【0111】
一実施形態では、培地中での本発明の生体材料中または生体材料の上清中のＲＡＮＫＬのレベルは検出不可能なものである。一実施形態では、ＲＡＮＫＬのレベルを上清１ｍＬ当たりのｐｇ数で表す。一実施形態では、本発明の生体材料が１ｍＬ当たり２００ｐｇ未満、好ましくは１５６ｐｇ／ｍＬ未満、好ましくは１００ｐｇ／ｍＬ未満、より好ましくは７８ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは５０ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは１０ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは７．８ｐｇ／ｍＬ未満のＲＡＮＫＬを含むか、生体材料のＡＳＣがこれを分泌する。
【0112】
一実施形態では、本発明の生体材料は実質的にＲＡＮＫＬを含まない。一実施形態では、本発明の生体材料のＡＳＣは実質的にＲＡＮＫＬを分泌しない。
【0113】
一実施形態では、本発明の生体材料は、セラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＲＡＮＫＬを本明細書で上に記載した濃度で分泌する。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＲＡＮＫＬを本明細書で上に記載した濃度で分泌する。
【0114】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを分泌し、かつＲＡＮＫＬを分泌しないか、検出可能なレベルのＲＡＮＫＬを分泌しない。
【0115】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを少なくとも本明細書で上に記載した濃度で分泌し、かつＲＡＮＫＬを最大でも本明細書で上に記載した濃度で分泌する。
【0116】
一実施形態では、本発明の生体材料は骨吸収阻害活性を示す。一実施形態では、骨吸収阻害活性はオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）の分泌を含む。一実施形態では、骨吸収阻害活性は、ＯＰＧの分泌およびＲＡＮＫＬの低分泌または無分泌を含む。
【0117】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）は、骨ミネラル密度の維持およびのちの骨折リスクを低下させる高いピーク骨量の獲得と正の相関がある。
【0118】
一実施形態では、好ましくはセラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＩＧＦ－１含有量を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。
【0119】
一実施形態では、本発明の生体材料はＩＧＦ－１を含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は高レベルのＩＧＦ－１を含む。
【0120】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を少なくとも約５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは少なくとも約６０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約７０ｎｇ／ｇ、さらにより好ましくは少なくとも約８０ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を少なくとも約９０ｎｇ／ｇ生体材料、９１ｎｇ／ｇ生体材料、９２ｎｇ／ｇ生体材料、９３ｎｇ／ｇ生体材料、９４ｎｇ／ｇ生体材料、９５ｎｇ／ｇ生体材料、９６ｎｇ／ｇ生体材料、９７ｎｇ／ｇ生体材料、９８ｎｇ／ｇ生体材料、９９ｎｇ／ｇ生体材料または１００ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。
【0121】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約１０ｎｇ／ｇ～約５００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約２０ｎｇ／ｇ～約４００ｎｇ／ｇ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｇ～約３００ｎｇ／ｇ、さらにより好ましくは約４０ｎｇ／ｇ～約２５０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。
【0122】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約５０ｎｇ／ｇ～約２００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約６０ｎｇ／ｇ～約１７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約７０ｎｇ／ｇ～約１５０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約８０ｎｇ／ｇ～約１５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約８５ｎｇ／ｇ～約１２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約９０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。
【0123】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約９０ｎｇ／ｇ～約５００ｎｇ／ｇ生体材料、約９０ｎｇ／ｇ～約４００ｎｇ／ｇ、約９０ｎｇ／ｇ～約３００ｎｇ／ｇ、約９０ｎｇ／ｇ～約２００ｎｇ／ｇ、約９０ｎｇ／ｇ～約１５０ｎｇ／ｇ、約９０ｎｇ／ｇ～約１２５ｎｇ／ｇまたは約９０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。
【0124】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を約９０ｎｇ／ｇ生体材料、９１ｎｇ／ｇ生体材料、９２ｎｇ／ｇ生体材料、９３ｎｇ／ｇ生体材料、９４ｎｇ／ｇ生体材料、９５ｎｇ／ｇ生体材料、９６ｎｇ／ｇ生体材料、９７ｎｇ／ｇ生体材料、９８ｎｇ／ｇ生体材料、９９ｎｇ／ｇ生体材料または１００ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を生体材料１ｇ当たり約９０ｎｇ含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を生体材料１ｇ当たり約９５ｎｇ含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＩＧＦ－１を生体材料１ｇ当たり約１００ｎｇ含む。
【0125】
一実施形態では、本発明の生体材料は、セラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＩＧＦ－１を本明細書で上に記載した濃度で含む。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＩＧＦ－１を本明細書で上に記載した濃度で含む。
【0126】
間質細胞由来因子１アルファまたはＣＸＣＬ１２とも呼ばれるＳＤＦ－１αは、破骨細胞の分化および活性化を刺激する役割を果たす。破骨細胞、特に破骨細胞前駆体は、ＳＤＦ－１αに対する固有の受容体であるＣＸＣＲ４に対して強い陽性を示す。ＳＤＦ－１αは破骨細胞形成を直接誘導するが、最近、ＳＤＦ－１αがＲＡＮＫＬ発現のアップレギュレーションを介して間接的に破骨細胞形成に影響を及ぼし得ることがわかった。破骨細胞およびその前駆体上にＲＡＮＫが存在することから、間質細胞上に存在する破骨細胞分化因子がＲＡＮＫＬである可能性が示唆された。
【0127】
一実施形態では、好ましくはセラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＳＤＦ－１α含有量を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。
【0128】
一実施形態では、本発明の生体材料はＳＤＦ－１αを含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は低レベルのＳＤＦ－１αを含む。
【0129】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約３００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは最大約２５０ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約２００ｎｇ／ｇ、さらにより好ましくは最大約１５０ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約１００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは最大約９０ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約８０ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約７５ｎｇ／ｇ生体材料、約７０ｎｇ／ｇ、約６５ｎｇ／ｇ、約６０ｎｇ／ｇまたは約５５ｎｇ／ｇの濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約５９ｎｇ／ｇ生体材料、５８ｎｇ／ｇ生体材料、５７ｎｇ／ｇ生体材料、５６ｎｇ／ｇ生体材料、５５ｎｇ／ｇ生体材料、５４ｎｇ／ｇ生体材料、５３ｎｇ／ｇ生体材料、５２ｎｇ／ｇ生体材料または５１ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。
【0130】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約５０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約４９ｎｇ／ｇ生体材料、４８ｎｇ／ｇ生体材料、４７ｎｇ／ｇ生体材料、４６ｎｇ／ｇ生体材料、４５ｎｇ／ｇ生体材料、４４ｎｇ／ｇ生体材料、４３ｎｇ／ｇ生体材料、４２ｎｇ／ｇ生体材料または４１ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約４０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約３９ｎｇ／ｇ生体材料、３８ｎｇ／ｇ生体材料、３７ｎｇ／ｇ生体材料、３６ｎｇ／ｇ生体材料、３５ｎｇ／ｇ生体材料、３４ｎｇ／ｇ生体材料、３３ｎｇ／ｇ生体材料、３２ｎｇ／ｇ生体材料または３１ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを最大約３０ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。
【0131】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約５ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約１０ｎｇ／ｇ～約９０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約１５ｎｇ／ｇ～約９０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約２０ｎｇ／ｇ～約８０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約２５ｎｇ／ｇ～約７０ｎｇ／ｇ、より好ましくは約２５ｎｇ／ｇ～約６０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約２５ｎｇ／ｇ～約５５ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを約３０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇ生体材料、約３０ｎｇ／ｇ～約９０ｎｇ／ｇ、約３０ｎｇ／ｇ～約８０ｎｇ／ｇ、約３０ｎｇ／ｇ～約７０ｎｇ／ｇ、約３０ｎｇ／ｇ～約６０ｎｇ／ｇ、約３０ｎｇ／ｇ～約５５ｎｇ／ｇまたは約３０ｎｇ／ｇ～約５０ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。
【0132】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり約３０ｎｇ含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり約４０ｎｇ含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＳＤＦ－１αを生体材料１ｇ当たり約５０ｎｇ含む。
【0133】
一実施形態では、本発明の生体材料は、セラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＳＤＦ－１αを本明細書で上に記載した濃度で含む。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＳＤＦ－１αを本明細書で上に記載した濃度で含む。
【0134】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＯＰＧを本明細書で上に記載した濃度で分泌し、ＩＧＦ１を本明細書で上に記載した濃度で含み、ＳＤＦ－１αを本明細書で上に記載した濃度で含む。
【0135】
特定の実施形態では、本発明の生体材料は、
－ＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり約５ｎｇ、好ましくは少なくとも約１０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約１５ｎｇ／ｇ分泌し、
－ＩＧＦ１を少なくとも生体材料１ｇ当たり約１０ｎｇ、好ましくは少なくとも約２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約５０ｎｇ／ｇ含み、
－ＳＤＦ－１αを最大で生体材料１ｇ当たり約２００ｎｇ、好ましくは最大約１５０ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約１００ｎｇ／ｇ含む。
－ＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり約５ｎｇ、好ましくは少なくとも約１０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約１５ｎｇ／ｇ分泌し、
－ＩＧＦ１を少なくとも生体材料１ｇ当たり約１０ｎｇ、好ましくは少なくとも約２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約５０ｎｇ／ｇ含み、
－ＳＤＦ－１αを最大で生体材料１ｇ当たり約２００ｎｇ、好ましくは最大約１５０ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約１００ｎｇ／ｇ含む。
【0136】
別の特定の実施形態では、本発明の生体材料は、
－ＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり約１０ｎｇ、好ましくは少なくとも約２０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約３０ｎｇ／ｇ分泌し、
－ＩＧＦ１を少なくとも生体材料１ｇ当たり約５０ｎｇ、好ましくは少なくとも約７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約９０ｎｇ／ｇ含み、
－ＳＤＦ－１αを最大で生体材料１ｇ当たり約１００ｎｇ、好ましくは最大約７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約５０ｎｇ／ｇ含む。
－ＯＰＧを少なくとも生体材料１ｇ当たり約１０ｎｇ、好ましくは少なくとも約２０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約３０ｎｇ／ｇ分泌し、
－ＩＧＦ１を少なくとも生体材料１ｇ当たり約５０ｎｇ、好ましくは少なくとも約７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約９０ｎｇ／ｇ含み、
－ＳＤＦ－１αを最大で生体材料１ｇ当たり約１００ｎｇ、好ましくは最大約７５ｎｇ／ｇ、より好ましくは最大約５０ｎｇ／ｇ含む。
【0137】
一実施形態では、本発明の生体材料は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含む。特定の実施形態では、本発明の生体材料は高レベルのＶＥＧＦを含む。
【0138】
一実施形態では、好ましくはセラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＶＥＧＦ含有量を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。
【0139】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを少なくとも約１０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは少なくとも約２０ｎｇ／ｇ、より好ましくは少なくとも約３０ｎｇ／ｇの濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを少なくとも約５０ｎｇ／ｇ生体材料、約６０ｎｇ／ｇ、約７０ｎｇ／ｇまたは約７５ｎｇ／ｇの濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを少なくとも約９５または１００ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。
【0140】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約１０ｎｇ／ｇ～約１５０ｎｇ／ｇ生体材料、好ましくは約２０ｎｇ／ｇ～約１２５ｎｇ／ｇ、より好ましくは約２５ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇの範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約２０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約３０ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約３５ｎｇ／ｇ～約１００ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約３５ｎｇ／ｇ～約９５ｎｇ／ｇ生体材料の範囲の濃度で含む。
【0141】
一実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約３５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約７５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約９５ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。別の実施形態では、本発明の生体材料は、ＶＥＧＦを約１００ｎｇ／ｇ生体材料の濃度で含む。
【0142】
一実施形態では、本発明の生体材料は、セラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＶＥＧＦを本明細書で上に記載した濃度で含む。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＶＥＧＦを本明細書で上に記載した濃度で含む。
【0143】
骨形成タンパク質２またはＢＭＰ２は、骨の発達の刺激に重要な役割を果たす。例えば、ＢＭＰ２は骨芽細胞分化を強力に誘導することが示されている。
【0144】
骨形成タンパク質７またはＢＭＰ７は、具体的には、次に多数の骨原性遺伝子の転写を誘導するＳＭＡＤ１およびＳＭＡＤ５のリン酸化を誘導することによって、間葉細胞の骨へ転換に鍵となる役割を果たす。
【0145】
一実施形態では、好ましくはセラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後、本発明の生体材料のＢＭＰ２およびＢＭＰ７の含有量を当該技術分野で公知の任意の方法により、例えばＥＬＩＳＡなどにより定量化し得る。
【0146】
一実施形態では、培地中での本発明の生体材料中または生体材料の上清中のＢＭＰ２のレベルは検出不可能なものである。一実施形態では、本発明の生体材料は実質的にＢＭＰ２を含まない。一実施形態では、本発明の生体材料のＡＳＣは実質的にＢＭＰ２を分泌しない。
【0147】
一実施形態では、ＢＭＰ２のレベルを上清１ｍＬ当たりのｐｇ数で表す。一実施形態では、本発明の生体材料が１ｍＬ当たり１００ｐｇ未満、好ましくは８５ｐｇ／ｍＬ未満、より好ましくは７５ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは６２．５ｐｇ／ｍＬ未満のＢＭＰ２を含むか、生体材料のＡＳＣがこれを分泌する。
【0148】
一実施形態では、培地中の本発明の生体材料中または生体材料の上清中のＢＭＰ７のレベルは検出不可能なものである。一実施形態では、本発明の生体材料は実質的にＢＭＰ７を含まない。一実施形態では、本発明の生体材料のＡＳＣは実質的にＢＭＰ７を分泌しない。
【0149】
一実施形態では、ＢＭＰ７のレベルを上清１ｍＬ当たりのｐｇ数で表す。一実施形態では、本発明の生体材料が１ｍＬ当たり５０ｐｇ未満、好ましくは４０ｐｇ／ｍＬ未満、より好ましくは３５ｐｇ／ｍＬ未満、さらにより好ましくは３１．２ｐｇ／ｍＬ未満のＢＭＰ７を含むか、生体材料のＡＳＣがこれを分泌する。
【0150】
一実施形態では、本発明の生体材料は、セラミック材料を加えてから４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ７を本明細書で上に記載した濃度で含む。換言すれば、一実施形態では、本発明の生体材料は、多次元誘導の開始から４週間後、５週間後、６週間後、７週間後または８週間後に、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ７を本明細書で上に記載した濃度で含む。
【0151】
一実施形態では、本発明による生体材料はミネラル化されている。本明細書で使用される「ミネラル化」または「骨組織ミネラル密度」という用語は、生体材料によって形成された骨または「骨様」組織の１平方センチメートル当たりのミネラル物質の量を指し、百分率で表されることもある。したがって、本明細書で使用される「ミネラル化」または「骨組織ミネラル密度」という用語は、生体材料の１平方センチメートル当たりのミネラル物質の量を指し、百分率で表されることもある。
【0152】
生体材料のミネラル化度を評価する方法は当該技術分野で公知である。このような方法の例としては、特に限定されないが、マイクロコンピュータ断層撮影法（マイクロＣＴ）解析、イメージング質量分析、カルセインブルー染色、骨ミネラル密度分布（ＢＭＤＤ）解析などが挙げられる。
【0153】
一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は約１％以上である。一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は約１％超である。
【0154】
別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％である。別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらにより好ましくは少なくとも約３５％である。一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％または３８％である。
【0155】
一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約５％～約５０％、好ましくは約１０％～約４５％、より好ましくは約１５％～約４０％の範囲内にある。別の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約２０％～約５０％、好ましくは約２５％～約４５％、より好ましくは約３０％～約４０％の範囲内にある。一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は、約３５％～約４０％の範囲内にある。１つの特定の実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度は約３８％である。
【0156】
一実施形態では、本発明の生体材料のミネラル化度はＯＰＧ分泌に比例する。一実施形態では、生体材料がＯＰＧを多く含むほど、生体材料がミネラル化されている。
【0157】
本発明は、骨原性細胞に分化した脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）と、セラミック材料と、細胞外基質とを含み、生体材料がオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）を含む、多次元生体材料を作製する方法にも関する。
【0158】
一実施形態では、本発明による生体材料を作製する方法は、
細胞増殖の段階と、
細胞分化の段階と、
多次元誘導、例えば３Ｄ誘導の段階と
を含む。
細胞増殖の段階と、
細胞分化の段階と、
多次元誘導、例えば３Ｄ誘導の段階と
を含む。
【0159】
一実施形態では、本発明による生体材料を作製する方法は、
ＡＳＣ増殖の段階と、
ＡＳＣの骨原性分化の段階と、
多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導と
を含む。
ＡＳＣ増殖の段階と、
ＡＳＣの骨原性分化の段階と、
多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導と
を含む。
【0160】
一実施形態では、本発明による生体材料を作製する方法は、
－細胞、好ましくはＡＳＣを増殖させる段階と、
－増殖した細胞、好ましくはＡＳＣを分化させる段階と、
－分化した細胞、好ましくはＡＳＣをセラミック材料の存在下で培養する段階と
を含む。
－細胞、好ましくはＡＳＣを増殖させる段階と、
－増殖した細胞、好ましくはＡＳＣを分化させる段階と、
－分化した細胞、好ましくはＡＳＣをセラミック材料の存在下で培養する段階と
を含む。
【0161】
一実施形態では、本発明による生体材料を作製する方法は、
対象から細胞、好ましくはＡＳＣを単離する段階と、
細胞、好ましくはＡＳＣを増殖させる段階と、
増殖した細胞、好ましくはＡＳＣを分化させる段階と、
分化した細胞、好ましくはＡＳＣをセラミック材料の存在下で培養する段階と
を含む。
対象から細胞、好ましくはＡＳＣを単離する段階と、
細胞、好ましくはＡＳＣを増殖させる段階と、
増殖した細胞、好ましくはＡＳＣを分化させる段階と、
分化した細胞、好ましくはＡＳＣをセラミック材料の存在下で培養する段階と
を含む。
【0162】
一実施形態では、本発明の生体材料を作製する方法は、細胞増殖の段階の前に実施する、細胞、好ましくはＡＳＣ、より好ましくは自家ＡＳＣの単離の段階をさらに含む。一実施形態では、本発明の生体材料を作製する方法は、細胞増殖の段階の前に実施する、細胞、好ましくはＡＳＣを単離する段階をさらに含む。
【0163】
一実施形態では、増殖の段階を増殖培地で実施する。特定の実施形態では、増殖培地はＤＭＥＭである。一実施形態では、増殖培地にＡｌａ－Ｇｌｎおよび／またはヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を添加する。一実施形態では、増殖培地は、ペニシリンおよび／またはストレプトマイシンなどの抗生物質をさらに含む。
【0164】
一実施形態では、増殖培地は、Ａｌａ－ＧｌｎおよびｈＰＬ（５％）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。一実施形態では、増殖培地は、Ａｌａ－Ｇｌｎ、ｈＰＬ（５％、ｖ／ｖ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭを含むか、これよりなるものである。
【0165】
一実施形態では、増殖の段階を本明細書で上に記載される通りに実施する。一実施形態では、増殖の段階をＰ８まで実施する。一実施形態では、増殖の段階がＰ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８まで継続する。したがって、一実施形態では、細胞増殖の段階は少なくとも３継代を含む。一実施形態では、細胞増殖の段階は最大７継代を含む。一実施形態では、細胞増殖の段階は３～７継代を含む。１つの特定の実施形態では、増殖の段階をＰ４まで実施する。したがって、一実施形態では、細胞増殖の段階は、継代Ｐ１、Ｐ２およびＰ３で、培養容器の表面から細胞を剥離し、次いで、それを増殖培地で希釈することを含む。Ｐ６までの増殖の一実施形態では、細胞増殖の段階は、継代Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５で、培養容器の表面から細胞を剥離し、次いで、それを増殖培地で希釈することを含む。
【0166】
一実施形態では、増殖の段階は、細胞を３回、４回、５回、６回または７回継代するのに必要な長さだけ継続する。特定の実施形態では、増殖の段階は、細胞を３回継代するのに必要な長さだけ継続する。一実施形態では、増殖の段階は、最後の継代後に細胞がコンフルエンス、好ましくは７０％～１００％のコンフルエンス、より好ましくは８０％～９５％のコンフルエンスに達するまで継続する。一実施形態では、増殖の段階は、第３継代、第４継代、第５継代、第６継代または第７継代後に細胞がコンフルエンスに達するまで継続する。
【0167】
有利な実施形態では、生体適合性粒子を加える前に、細胞、好ましくはＡＳＣを分化培地で培養することが、本発明の方法の鍵となる段階である。このような段階は、ＡＳＣを骨原性細胞に分化させるのに必要なものである。さらに、この段階は、多次元構造を得るのに必要なものである。
【0168】
一実施形態では、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８の後に分化の段階を実施する。一実施形態では、細胞がコンフルエンスでないときに分化の段階を実施する。特定の実施形態では、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８の後、細胞をコンフルエンスまで培養せずに分化の段階を実施する。
【0169】
一実施形態では、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８で分化の段階を実施する。一実施形態では、細胞がコンフルエンスでないときに分化の段階を実施する。特定の実施形態では、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７またはＰ８で、細胞をコンフルエンスまで培養せずに分化の段階を実施する。
【0170】
一実施形態では、細胞を分化培地、好ましくは骨原性分化培地でインキュベートすることによって、分化の段階を実施する。一実施形態では、培養容器の表面から剥離した細胞を分化培地、好ましくは骨原性分化培地に再懸濁させることによって、分化の段階を実施する。
【0171】
一実施形態では、骨原性分化培地でのＡＳＣのインキュベーションを少なくとも５日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１５日間実施する。一実施形態では、骨原性分化培地でのＡＳＣのインキュベーションを５～３０日間、好ましくは１０～２５日間、より好ましくは１５～２０日間実施する。一実施形態では、分化培地を２日毎に交換する。
【0172】
一実施形態では、本明細書で上に明記したセラミック材料を分化培地に加えることによって、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。一実施形態では、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階において、細胞を分化培地で維持する。
【0173】
一実施形態では、細胞が分化培地でコンフルエンス、好ましくは７０％～１００％のコンフルエンス、より好ましくは８０％～９５％のコンフルエンスに達したとき、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。
【0174】
別の実施形態では、形態学的変化、例えば小結節の前形成などがみられたとき、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。一実施形態では、類骨小結節が少なくとも１つ形成されたとき、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。本明細書で使用される「類骨」という用語は、骨組織成熟の前に形成される骨基質の非ミネラル化有機部分を意味する。
【0175】
別の実施形態では、細胞がコンフルエンスに達したとき、形態学的変化がみられたとき、および類骨小結節が少なくとも１つ形成されたとき、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階を実施する。
【0176】
一実施形態では、本発明の細胞およびセラミック材料を少なくとも５日間、好ましくは少なくとも１０日間、より好ましくは少なくとも１５日間インキュベートする。一実施形態では、本発明の細胞およびセラミック材料を１０日間～３０日間、好ましくは１５～２５日間、より好ましくは２０日間インキュベートする。一実施形態では、多次元誘導、好ましくは３Ｄ誘導の段階において、培地を２日毎に交換する。
【0177】
本発明は、本発明による方法によって入手可能な多次元生体材料にも関する。一実施形態では、多次元生体材料を本発明による方法によって得る。一実施形態では、多次元生体材料を本発明による方法によって作製する。一実施形態では、本発明の方法によって入手可能な、または得られる生体材料は、ヒトまたは動物の体内に移植することを意図するものである。一実施形態では、移植する生体材料は、自家起源または同種異系のものであり得る。一実施形態では、本発明の生体材料を骨または軟骨の領域に移植し得る。一実施形態では、この生体材料をヒトまたは動物身体の不規則な形の領域に移植し得る。
【0178】
一実施形態では、本発明の生体材料は均質なものであり、このことは、生体材料の構造および／または構成が組織全体を通じてほぼ同じであることを意味する。一実施形態では、生体材料は、天然の疾患領域への移植に必要な望ましい取扱適性および機械的特性を有する。一実施形態では、本発明の方法によって入手可能な、または得られる生体材料は、裂けることなく手術器具で持つことができるものである。
【0179】
本発明の別の目的は、本発明による生体材料を含む医療装置である。
【0180】
また別の目的は、本発明による生体材料と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。
【0181】
本発明は、薬物として使用する、本発明による生体材料または医薬組成物にも関する。
【0182】
本発明は、本発明の生体材料の医療装置としての、または医療装置もしくは医薬組成物に含める、任意の使用に関する。ある特定の実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、使用前に操作および成形し得るパテ様材料である。
【0183】
本発明はさらに、必要とする対象の骨欠損または軟骨欠損を治療する方法であって、対象に治療有効量の本発明による生体材料、医療装置または医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【0184】
本明細書で使用される「骨欠損」という用語は、通常であれば骨であるべきである身体領域または骨組織の形成が治療上望まれる身体領域に骨組織がないことを意味する。
【0185】
本明細書で使用される「軟骨欠損」という用語は、通常であれば軟骨であるべきである身体領域または軟骨組織の形成が治療上望まれる身体領域に軟骨組織がないことを意味する。
【0186】
本発明の別の目的は、必要とする対象の骨欠損または軟骨欠損の治療に使用する、本発明による生体材料、医療装置または医薬組成物である。本発明のまた別の目的は、必要とする対象の骨欠損の治療への本発明による生体材料、医療装置または医薬組成物の使用である。
【0187】
骨欠損の例としては、特に限定されないが、骨折、骨脆弱、骨ミネラル密度の低下、関節炎、先天性偽関節などの偽関節、骨粗鬆症、脊椎分離症、脊椎すべり症、骨軟化症、骨減少症、骨癌、パジェット病、硬化性病変、骨の浸潤性障害、海綿骨および皮質骨の壊死、二分脊椎症、遷延治癒、骨形成不全症、（例えば、腫瘍切除または出血後の）頭蓋欠損、骨壊死ならびに代謝性骨喪失が挙げられる。
【0188】
軟骨欠損の例としては、特に限定されないが、身体領域内の軟骨損傷または軟骨欠損が挙げられる。軟骨欠損の原因は、外傷、骨壊死、骨軟骨炎およびその他の病態によるものであり得る。軟骨欠損は、膝関節にもっともよくみられ、その場合、外傷を原因とし、前十字靭帯（ＡＣＬ）断裂などの靭帯損傷に付随してみられることが多い。
【0189】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、骨折、骨脆弱、骨ミネラル密度の低下、関節炎、先天性偽関節などの偽関節、骨粗鬆症、脊椎分離症、脊椎すべり症、骨軟化症、骨減少症、骨癌、パジェット病、硬化性病変、骨の浸潤性障害、海綿骨および皮質骨の壊死、二分脊椎症、遷延治癒、骨形成不全症、（例えば、腫瘍切除または出血後の）頭蓋欠損、骨壊死および代謝性骨喪失を含むか、これよりなる群から選択される骨欠損を治療する、またはその治療に使用するものである。
【0190】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、骨折、関節炎、先天性偽関節、骨粗鬆症、脊椎分離症、脊椎すべり症、骨癌、パジェット病、硬化性病変、海綿骨および皮質骨の壊死ならびに代謝性骨喪失を含むか、これよりなる群から選択される骨欠損を治療する、またはその治療に使用するものである。
【0191】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、脊椎分離症および／または脊椎すべり症を治療する、またはその治療に使用するものである。脊椎分離症とは、椎弓の関節突起間部にみられる欠損または疲労骨折のことである。脊椎すべり症またはすべり症は、１つの椎骨が隣接する椎骨に対して並進移動する、または非解剖学的に整列することであり、脊椎分離症のある患者の約３０％に認められる。
【0192】
一実施形態では、脊椎すべり症は、異形成性、分離性、変性、外傷性、病的および／または術後／医原性脊椎すべり症である。一実施形態では、脊椎すべり症は、第５腰椎の上方仙骨椎間関節または下方椎間関節の先天性異常による異形成性脊椎すべり症（１型とも呼ばれる）である。別の実施形態では、脊椎すべり症は、関節突起間部の欠損を原因とする分離性脊椎すべり症（２型とも呼ばれる）であるが、伸長部とともにみられることもある。別の実施形態では、脊椎すべり症は、椎間関節炎および関節再構築によって起こる変性脊椎すべり症（３型とも呼ばれる）である。別の実施形態では、脊椎すべり症は、部以外の神経弓の急性骨折によって起こる外傷性脊椎すべり症（４型とも呼ばれる）である。別の実施形態では、脊椎すべり症は、感染症または悪性腫瘍を原因とする病的脊椎すべり症（５型とも呼ばれる）である。別の実施形態では、脊椎すべり症は、術後合併症を原因とする術後／医原性脊椎すべり症（６型とも呼ばれる）である。
【0193】
一実施形態では、脊椎すべり症は、マイヤーディング分類によるグレードＩ、グレードＩＩ、グレードＩＩＩ、グレードＩＶまたはグレードＶのものである。一実施形態では、脊椎すべり症は、椎体の幅に対する割合として測定されるすべり度０～２５％に対応する、グレードＩのものである。別の実施形態では、脊椎すべり症は、すべり度２５％～５０％に対応するグレードＩＩのものである。別の実施形態では、脊椎すべり症は、すべり度５０％～７５％に対応するグレードＩＩＩのものである。別の実施形態では、脊椎すべり症は、すべり度７５％～１００％に対応するグレードＩＶのものである。別の実施形態では、脊椎すべり症は、すべり度１００％超に対応するグレードＶのものである。
【0194】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、必要とする対象の椎体間隙および／または移植する固定ケージ（１つまたは複数）を充填するものである。
【0195】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、先天性偽関節を治療する、またはその治療に使用するものである。特定の実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、先天性脛骨偽関節症（ＣＰＴ）を治療する、またはその治療に使用するものである。ＣＰＴは、自発的に、または軽度の外傷の後に発症する脛骨骨折による偽関節を指し、脛骨には、骨の前外側湾曲を生じる部分的異形成の領域がみられる。ＣＰＴは通常、神経線維腫症を伴い、未だ小児整形外科が直面する最も厄介で恐ろしい病態である。この疾患は通常、生後１年以内に明らかになるが、１２歳まで発見されないこともある。
【0196】
一実施形態では、ＣＰＴは、クロフォード分類によるＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型またはＩＶ型のものである。一実施形態では、ＣＰＴは、皮質密度の増大および髄質の狭小化を伴う前弯に対応するＩ型のものである。別の実施形態では、ＣＰＴは、髄質が狭小化し硬化した前弯に対応するＩＩ型のものである。別の実施形態では、ＣＰＴは、嚢胞または骨折の前兆を伴う前弯に対応するＩＩＩ型のものである。別の実施形態では、ＣＰＴは、脛骨と腓骨を結ぶことが多い偽関節を伴う前弯および明白な骨折に対応する、ＩＶ型のものである。
【0197】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、小児患者の先天性脛骨偽関節症を治療する、またはその治療に使用するものである。一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物は、小児先天性脛骨偽関節症を治療する、またはその治療に使用するものである。
【0198】
本発明は、整形外科、特に顎顔面外科手術または形成外科手術への本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物の使用にも関する。本発明の生体材料は、リウマチ学でも使用し得る。
【0199】
本発明はさらに、先天性もしくは後天性の関節、頭蓋顔面上顎骨の異常、歯科矯正障害、外科手術後の（例えば、置換を必要とする）骨もしくは関節骨の障害、外傷またはその他の先天性もしくは後天性の異常を治療、是正または軽減するために、ならびに他の筋骨格移植片、具体的には人工移植片および合成移植片を補助するために、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を使用する方法に関する。
【0200】
別の態様では、本発明は、骨再建に使用する、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明の生体材料は、ヒトまたは動物の体内に骨空洞を充填するのに使用するものである。
【0201】
さらに別の態様では、本発明は、再建手術または美容外科手術に使用する、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物に関する。
【0202】
一実施形態では、本発明は、再建手術に使用する、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、美容外科手術に使用する、本発明の生体材料に関する。
【0203】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を同種異系移植片または自家移植片として使用し得る。一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を異種移植片として使用し得る。一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を組織移植に使用し得る。
【0204】
本発明の生体材料はさらに、血管新生を刺激するのに有利である。実際、生体材料のＡＳＣは、新たな血管の成長を刺激する血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を放出する。
【0205】
一実施形態では、対象はヒト対象である。別の実施形態では、対象は動物対象、例えば、ペット、家畜または生産動物などである。一実施形態では、対象は哺乳動物対象である。
【0206】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物をヒトおよび／または動物に使用し得る。一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物をヒト医学および獣医学で使用し得る。
【0207】
一実施形態では、対象は骨欠損および／または軟骨欠損に罹患している。
【0208】
特定の実施形態では、対象は脊椎分離症および／または脊椎すべり症に罹患している。別の特定の実施形態では、対象は先天性脛骨偽関節症（ＣＰＴ）に罹患している。特定の実施形態では、対象は小児先天性脛骨偽関節症（ＣＰＴ）に罹患している。
【0209】
一実施形態では、対象は、既に骨欠損および／または軟骨欠損の治療を受けている。
【0210】
特定の実施形態では、対象は、既に脊椎分離症および／または脊椎すべり症の治療を受けている。脊椎分離症および／または脊椎すべり症の他の治療法の例としては、特に限定されないが、保存的治療、例えば固定具装着、活動制限、伸展運動、屈曲運動および深腹部強化など；ならびに外科手術、例えば脊椎固定および椎弓切除などが挙げられる。
【0211】
別の特定の実施形態では、対象は、既にＣＰＴの治療を受けている。ＣＰＴの他の治療の例としては、特に限定されないが、固定具装着および外科手術、例えば骨移植を伴う髄内釘固定、血管柄付き骨移植、イリザロフ法、誘導膜および海綿自家移植などが挙げられる。
【0212】
一実施形態では、対象は、少なくとも１つの他の骨欠損および／または軟骨欠損治療に不応である。
【0213】
一実施形態では、対象は乳児または小児である。したがって、一実施形態では、対象は小児対象である。一実施形態では、対象は１８歳未満、好ましくは１５歳未満、１２歳未満または１０歳未満である。
【0214】
別の実施形態では、対象は成人である。したがって、一実施形態では、対象は１８歳以上である。
【0215】
一実施形態では、必要とする対象に骨欠損および／または軟骨欠損の処置、例えば脊椎固定処置などの過程で、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を投与する。
【0216】
一実施形態では、本発明の生体材料、医療装置または医薬組成物を創面清掃、１つもしくは２つの椎体間ケージの設置および両側椎弓根スクリュー固定ならびに／あるいはリハビリテーションとともに使用する。
【0217】
本発明は、本発明による生体材料、医薬組成物または医療装置と、適切な固定手段とを含む、キットにも関する。適切な固定手段の例としては、特に限定されないが、外科用接着剤、組織接着剤または外科手術に使用し、生体適合性、無毒性であり、任意選択で生体吸収性である、任意の接着組成物が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0218】
【図1】３種類の異なる濃度（１．５ｃｍ３、２．８５ｃｍ３および５．９１ｃｍ３）のＨＡ／β－ＴＣＰと間接的に接触させたｈＡＳＣの細胞生存率を未処理細胞と比較した百分率で示すヒストグラムである。
【図2】ＨＡ／β－ＴＣＰ（Ａ）、ＨＡ（Ｂ）またはβ－ＴＣＰ（Ｃ）を用いて形成した生体材料を肉眼的に見たものを示す一連の写真である。
【図3】ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料を肉眼的に見たものを示す一連の写真である。
【図4】ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料のヘマトキシリン－エオシン染色（Ａ）、マッソン・トリクロム染色（Ｂ）およびオステオカルシン染色（Ｃ）を示す一連の写真である。
【図5】ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料に関するマイクロＣＴ解析を３種類の異なる縮尺（Ａ、ＢおよびＣ）で示す一連の写真である。
【図6】ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料のＩＧＦ１（暗灰色）、ＶＥＧＦ（明灰色）およびＳＤＦ－１（中灰色）の含有量を示すヒストグラムである。
【図7】ＭＰ培地およびＭＤ培地の２Ｄ培養物中ならびにＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料の培地中でのＡＳＣによるＯＰＧ分泌を細胞１０６個当たりのｐｇ数で示すヒストグラムである。
【図8】２Ｄ培養ＭＤ培地中ならびにＨＡ／β－ＴＣＰ、ＨＡおよびβ－ＴＣＰを用いて形成した生体材料の培養物中でのＡＳＣによるＯＰＧ分泌を材料１ｇ当たりのｎｇ数で示すヒストグラムである。
【図9】ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した本発明の生体材料（生体材料）での遺伝子ＦＧＦＲ１（Ａ）、ＩＧＦＲ１（Ｂ）、ＲＵＮＸ２（Ｃ）、ＴＷＩＳＴ１（Ｄ）、ＴＧＦＢＲ１（Ｅ）、ＳＭＡＤ２（Ｆ）、ＳＭＡＤ４（Ｇ）、ＳＭＡＤ５（Ｈ）の発現をＭＰ（ＭＰ）中およびＭＤ（ＭＤ）中のＡＳＣと比較して示す一連のグラフである。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図10】ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した本発明の生体材料（生体材料）での遺伝子ＡＮＧ（Ａ）、ＥＦＮＡ１（Ｂ）、ＥＦＮＢ２（Ｃ）、ＶＥＧＦＡ（Ｄ）、ＦＧＦ１（Ｅ）、ＬＥＰ（Ｆ）の発現をＭＰ（ＭＰ）中およびＭＤ（ＭＤ）中のＡＳＣと比較して示す一連のグラフである。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図11】ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した本発明の生体材料（生体材料）の低酸素状態（１％）または酸素正常状態（２１％）でのＶＥＧＦ（Ａ）およびＳＤＦ－１α（Ｂ）分泌をＭＰ（ＭＰ）中およびＭＤ（ＭＤ）中のＡＳＣと比較して示す一連のヒストグラムである。
【図12】本発明の生体材料の外植片のフォン・ヴィルブランド因子に対する免疫染色を示す写真である。ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子が記号＊によって示されており、血管が黒矢印によって示されている。
【図13】本発明の生体材料の血管面積の百分率（Ａ）および血管数／ｍｍ２（Ｂ）を示す一連のヒストグラムである。
【図14】ラットに移植後第２８日の本発明の生体材料におけるＨＬＡ／ヒト白血球抗原免疫染色のペルオキシダーゼ顕色によって褐色で示されたヒト細胞の存在（図中、黒矢印によって示されている）を示す写真である。ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子が記号＊によって示されている。
【図15】本発明の生体材料（左上および左下）およびＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独（右上および右下）をラットに移植してから１か月後の大腿骨のマイクロＣＴスキャンを示す一連の写真である。下の写真は上の写真を拡大したものである。点線の四角形は移植部位を示している。
【図16】ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子の移植から１か月後の骨欠損の組織学的検査を示す一連の写真である：ヘマトキシリン－エオシン染色、元の倍率５倍（Ａ）；マッソン・トリクロム染色、元の倍率２０倍（Ｂ）。白矢印は、製品が統合されておらず、重大な線維症があることを示している。黒矢印は、天然の骨とＨＡ／β－ＴＣＰの移植片との間の境界にある欠損に軟骨内骨化がみられないことを示している。
【図17】本発明の生体材料の移植から１か月後の骨欠損の組織学的検査を示す一連の写真である：ヘマトキシリン－エオシン染色、元の倍率５倍（Ａ）；マッソン・トリクロム染色、元の倍率２０倍（Ｂ）；ＨＬＡ－Ｉ免疫染色、元の倍率１０倍（Ｃ）。白矢印は、製品の統合および骨融合を示している。黒矢印は、骨統合過程を示す、天然の骨と生体材料との間に直接接する軟骨内骨化を示している。
【0219】
（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【0220】
実施例１：本発明の生体材料の作製
ｈＡＳＣの単離
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニングの後、コールマン法による腹部領域の脂肪吸引によってヒト皮下脂肪組織を回収した。
ｈＡＳＣの単離
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニングの後、コールマン法による腹部領域の脂肪吸引によってヒト皮下脂肪組織を回収した。
【0221】
入ってくる脂肪組織から迅速にヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）を単離した。吸引脂肪組織は、＋４℃で２４時間、または－８０℃でさらに長期間保管することができる。
【0222】
最初に、品質管理の目的で吸引脂肪組織の一部を単離し、残りの吸引脂肪組織の体積を測定した。次いで、吸引脂肪組織をＨＢＳＳで（最終濃度約８Ｕ／ｍＬに）調製したコラゲナーゼ溶液（ＮＢ１、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ社、ハイデルベルク、ドイツ）により消化した。消化に使用した酵素溶液の体積は、脂肪組織の体積の２倍とした。消化を３７℃±１℃で５０～７０分間にわたって実施した。１５～２５分後、１回目の断続的振盪を実施し、３５～４５分後、２回目の断続的振盪を実施した。ＭＰ培地（増殖培地または成長培地）の添加により消化を停止させた。ＭＰ培地は、５％ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）（ｖ／ｖ）を添加したＤＭＥＭ培地（４．５ｇ／Ｌグルコースおよび４ｍＭ Ａｌａ－Ｇｌｎ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ゲッティンゲン、ドイツ）を含むものとした。ＤＭＥＭは、塩、アミノ酸、ビタミン、ピルビン酸塩およびグルコースを含有し、炭酸塩緩衝剤で緩衝した標準培地であり、生理的ｐＨ（７．２～７．４）を示す。使用したＤＭＥＭは、Ａｌａ－Ｇｌｎを含有するものとした。ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）は、間葉系幹細胞（ｈＡＳＣなど）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成長を刺激するのに用いる成長因子の豊富な供給源となる。
【0223】
消化した脂肪組織を遠心分離（５００ｇ、１０分、室温）し、上清を除去した。ペレット化した間質血管細胞群（ＳＶＦ）をＭＰ培地中に再懸濁させ、２００～５００μｍメッシュのフィルターに通した。ろ過した細胞懸濁液をもう一度遠心分離した（５００ｇ、１０分、２０℃）。ｈＡＳＣを含有するペレットをＭＰ培地中に再懸濁させた。細胞懸濁液のごく一部を細胞カウント用に取っておくことができ、残りの細胞懸濁液を全部用いて１つの７５ｃｍ２Ｔフラスコに播種した（継代Ｐ０と呼ぶ）。播種した細胞の数を推定するため、（情報のみを目的として）細胞カウントを実施した。
【0224】
単離段階の翌日（第１日）、７５ｃｍ２Ｔフラスコから成長培地を除去した。細胞をリン酸塩緩衝液で３回すすぎ、次いで、新たに調製したＭＰ培地をフラスコに加えた。
【0225】
ヒト脂肪由来幹細胞の成長および拡大
工程ののちの諸段階に十分な量の細胞を得るため、増殖期にｈＡＳＣを４回継代した（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４）。
工程ののちの諸段階に十分な量の細胞を得るため、増殖期にｈＡＳＣを４回継代した（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４）。
【0226】
Ｐ０から第４継代（Ｐ４）までの間、細胞をＴフラスコで培養し、新鮮なＭＰ培地を供給した。７０％以上１００％以下のコンフルエンス（目標コンフルエンス：８０～９０％）に達したとき、細胞を継代した。１つのバッチの全細胞培養レシピエントを同時に継代した。継代毎に、細胞を組換え動物無細胞解離酵素であるＴｒｙｐＬＥ（Ｓｅｌｅｃｔ １Ｘ；７５ｃｍ２フラスコに９ｍＬまたは１５０ｃｍ２フラスコに１２ｍＬ）で培養容器から剥離した。ＴｒｙｐＬｅ消化は３７℃±２℃で５～１５分間実施し、ＭＰ培地の添加により停止させた。
【0227】
次いで、細胞を遠心分離（５００ｇ、５分、室温）し、ＭＰ培地に再懸濁させた。均一な細胞懸濁液を確保するため、回収した細胞をプールした。再懸濁後、細胞をカウントした。
【0228】
次いで、継代Ｐ１、Ｐ２およびＰ３で、残りの細胞懸濁液を適切な細胞密度までＭＰ培地で希釈し、さらに大きい組織培養表面に播種した。これらの段階で、７５ｃｍ２フラスコには体積１５ｍＬの細胞懸濁液を播種し、１５０ｃｍ２フラスコには体積３０ｍＬの細胞懸濁液を播種した。各継代で、細胞を０．５×１０４～０．８×１０４細胞／ｃｍ２で播種した。異なる継代間で、培地を３～４日毎、交換した。細胞の挙動および成長速度はドナーによってわずかに異なる可能性がある。このため、２継代間の期間および継代間の培地交換の回数はドナーによって異なってもよい。
【0229】
骨原性分化
継代Ｐ４（すなわち、第４継代）で、細胞をもう一度遠心分離し、ＭＤ培地（分化培地）に再懸濁させた。再懸濁後、細胞をもう一度カウントした後、適切な細胞密度までＭＤ培地で希釈し、１５０ｃｍ２フラスコに体積７０ｍＬの細胞懸濁液を播種し、骨原性ＭＤ培地を供給した。第４継代の後は、この方法に従い、細胞を直接、骨原性ＭＤ培地で培養した。したがって、細胞がコンフルエンスに達していないうちに骨原性ＭＤ培地を加えた。
継代Ｐ４（すなわち、第４継代）で、細胞をもう一度遠心分離し、ＭＤ培地（分化培地）に再懸濁させた。再懸濁後、細胞をもう一度カウントした後、適切な細胞密度までＭＤ培地で希釈し、１５０ｃｍ２フラスコに体積７０ｍＬの細胞懸濁液を播種し、骨原性ＭＤ培地を供給した。第４継代の後は、この方法に従い、細胞を直接、骨原性ＭＤ培地で培養した。したがって、細胞がコンフルエンスに達していないうちに骨原性ＭＤ培地を加えた。
【0230】
骨原性ＭＤ培地は、デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸（０．２５ｍＭ）およびリン酸ナトリウム（２．９３ｍＭ）を添加した増殖培地（ＤＭＥＭ、Ａｌａ－Ｇｌｎ、ｈＰＬ５％）からなるものとした。
【0231】
細胞の挙動および成長速度がドナーによってわずかに異なる可能性がある。このため、骨原性分化段階の期間および培地交換の回数がドナーによって異なってもよい。
【0232】
細胞の多次元誘導
細胞がコンフルエンスに達したとき、形態学的変化がみられ、フラスコ内に類骨小結節（すなわち、骨組織成熟の前に形成される骨基質の非ミネラル化有機部分）が少なくとも１つ観察された場合にＡＳＣの多次元誘導を開始した。
細胞がコンフルエンスに達したとき、形態学的変化がみられ、フラスコ内に類骨小結節（すなわち、骨組織成熟の前に形成される骨基質の非ミネラル化有機部分）が少なくとも１つ観察された場合にＡＳＣの多次元誘導を開始した。
【0233】
骨原性ＭＤ培地に曝露した後、付着骨原性細胞のコンフルエントな単層が含まれる培養容器に様々なセラミック材料：
ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子：１５０ｃｍ２フラスコに６５／３５の比で１．５ｃｍ３（Ｔｅｋｎｉｍｅｄ社、フランス）、
ＨＡ粒子：１５０ｃｍ２フラスコに１．５ｃｍ３（Ｂｉｏｃｅｔｉｓ社、フランス）または
β－ＴＣＰ粒子：１５０ｃｍ２フラスコに１．５ｃｍ３（Ｂｉｏｃｅｔｉｓ社、フランス）
をゆっくりと均一に撒いた。
ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子：１５０ｃｍ２フラスコに６５／３５の比で１．５ｃｍ３（Ｔｅｋｎｉｍｅｄ社、フランス）、
ＨＡ粒子：１５０ｃｍ２フラスコに１．５ｃｍ３（Ｂｉｏｃｅｔｉｓ社、フランス）または
β－ＴＣＰ粒子：１５０ｃｍ２フラスコに１．５ｃｍ３（Ｂｉｏｃｅｔｉｓ社、フランス）
をゆっくりと均一に撒いた。
【0234】
細胞をＭＤ培地で維持した。多次元誘導の間、３～４日毎に定期的な培地交換を実施した。この培地交換は、セラミック材料粒子および発達中の構造物（１つまたは複数）が除去されないようにして慎重に実施した。
【0235】
実施例２：生体材料の特徴付け
材料および方法
細胞毒性
この方法の目的は、細胞－材料間の間接的な接触（培地中での滲出可能な化学物質の拡散）の毒性を評価することであった。この方法では、ｈＡＳＣを２つの２４ウェルプレートに８０００細胞／ｃｍ２（１ウェル当たり１５２００個）で播種し、３７℃で７２時間インキュベートした。次いで、細胞がコンフルエンスに達したとき、培地を除去し、底部微小孔膜を含むトランスウェルインサートにセラミック材料：
１５０ｃｍ２の容器に３種類の異なる量、すなわち、１．５ｃｍ３、２．８５ｃｍ３および５．９１ｃｍ３のＨＡ／β－ＴＣＰ、
１５０ｃｍ２の容器に１．５ｃｍ３のＨＡ粒子または
１５０ｃｍ２の容器に１．５ｃｍ３のβ－ＴＣＰ粒子
を負荷し、次いで個々のウェルに入れ、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
材料および方法
細胞毒性
この方法の目的は、細胞－材料間の間接的な接触（培地中での滲出可能な化学物質の拡散）の毒性を評価することであった。この方法では、ｈＡＳＣを２つの２４ウェルプレートに８０００細胞／ｃｍ２（１ウェル当たり１５２００個）で播種し、３７℃で７２時間インキュベートした。次いで、細胞がコンフルエンスに達したとき、培地を除去し、底部微小孔膜を含むトランスウェルインサートにセラミック材料：
１５０ｃｍ２の容器に３種類の異なる量、すなわち、１．５ｃｍ３、２．８５ｃｍ３および５．９１ｃｍ３のＨＡ／β－ＴＣＰ、
１５０ｃｍ２の容器に１．５ｃｍ３のＨＡ粒子または
１５０ｃｍ２の容器に１．５ｃｍ３のβ－ＴＣＰ粒子
を負荷し、次いで個々のウェルに入れ、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【0236】
インキュベーション後、増殖および細胞傷害性アッセイで生細胞数を定量化する「ＣＣＫ－８キット」（Ｓｉｇｍａ社）を供給業者の指示通りに用いて、細胞生存率を評価した。簡潔に述べれば、培地を除去し、プレートの各ウェルに体積１００μＬのＣＣＫ－８溶液を加えた。混合物を３７℃／５％ＣＯ２で２～４時間インキュベートした。複雑な細胞機序により、安定なテトラゾリウム塩が可溶性ホルマザン色素に切断される。この生体内還元は、生細胞内での解糖によるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ生成に大きく依存する。したがって、形成されるホルマザン色素の量は、培養物中の代謝活性のある細胞の数と直接相関する。ホルマザン色素の量は、分光光度計プレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を測定することにより評価する。
【0237】
相対細胞生存率（％）を未処理対照細胞に対する百分率で表した。この値は以下のように求めた：
相対細胞生存率＝（ＯＤ－ブランク）処理／（ＯＤ－ブランク）未処理×１００
（ＯＤ－ブランク）未処理：陰性対照（未処理細胞）の（ＯＤ－ブランク）の平均値。
相対細胞生存率＝（ＯＤ－ブランク）処理／（ＯＤ－ブランク）未処理×１００
（ＯＤ－ブランク）未処理：陰性対照（未処理細胞）の（ＯＤ－ブランク）の平均値。
【0238】
セラミック材料を撒いていない細胞を陰性対照（未処理細胞）として用いた。Ｔｒｉｔｏｎ １％溶液で処理した細胞を陽性対照として用いた。
【0239】
組織学的解析
セラミック粒子の添加から４週間後および８週間後、ＭＤ培地中で形成された構造物の生検試料を採取した。
セラミック粒子の添加から４週間後および８週間後、ＭＤ培地中で形成された構造物の生検試料を採取した。
【0240】
構造／細胞充実度／細胞外基質の存在
ヘマトキシリン－エオシン染色およびマッソン・トリクロム染色を実施した後、組織の構造、細胞充実度および細胞外基質の存在を評価した。
ヘマトキシリン－エオシン染色およびマッソン・トリクロム染色を実施した後、組織の構造、細胞充実度および細胞外基質の存在を評価した。
【0241】
骨分化およびミネラル化
組織の骨分化およびミネラル化をそれぞれオステオカルシンおよびマイクロＣＴで評価した。
組織の骨分化およびミネラル化をそれぞれオステオカルシンおよびマイクロＣＴで評価した。
【0242】
Ｓｋｙｓｃａｎ １１７２Ｇ（Ｂｒｕｋｅｒ社）（Ｅｒｗａｎ Ｐｌｏｕｇｏｎｖｅｎ、ＵＬｇ、リエージュ）を用いて取得を実施した。Ｂｒｕｋｅｒ社のマイクロＣＴソフトウェアであるＮＲｅｃｏｎ、ｖ．１．６．１０．１で再構築を実施した。調整後、約１７００×１７００×７００ボクセル（３Ｄピクセル）の３Ｄ画像を再構築した。上記の解像度で、１ボクセルの体積は９８５μｍ３である。減衰領域の体積および厚さの平均測定値を総体積の％で記録した。減衰領域はミネラル化領域と一致した。
【0243】
成長因子含有量
形成された組織の生物活性を評価するため、セラミック粒子の添加から４週間後および８週間後、タンパク質の抽出および定量化に生検試料を採取した。比色分析（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ１α、ＩＧＦ１に関するＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により、供給業者の指示通りに総タンパク質および成長因子含有量を定量化した。
形成された組織の生物活性を評価するため、セラミック粒子の添加から４週間後および８週間後、タンパク質の抽出および定量化に生検試料を採取した。比色分析（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ１α、ＩＧＦ１に関するＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット、ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）により、供給業者の指示通りに総タンパク質および成長因子含有量を定量化した。
【0244】
破骨細胞活性
無ｈＰＬ条件で７２時間培養した後、（ＭＤ培地またはＭＰ培地での）２Ｄ培養物のＡＳＣおよび（ＨＡ／βＴＣＰの添加により約８週間にわたって誘導した）多次元培養物のＡＳＣの上清を回収し、のちの定量化にそのまま－２０℃で保管した。セラミック粒子単独のタンパク質も抽出して、ＯＰＧおよびＲＡＮＫＬのレベルを定量化した。
無ｈＰＬ条件で７２時間培養した後、（ＭＤ培地またはＭＰ培地での）２Ｄ培養物のＡＳＣおよび（ＨＡ／βＴＣＰの添加により約８週間にわたって誘導した）多次元培養物のＡＳＣの上清を回収し、のちの定量化にそのまま－２０℃で保管した。セラミック粒子単独のタンパク質も抽出して、ＯＰＧおよびＲＡＮＫＬのレベルを定量化した。
【0245】
ＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ／ＴＲＡＮＣＥ ＥＬＩＳＡキット；Ｈｕｍａｎ Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ ＥＬＩＳＡキット；ＬＳ Ｂｉｏ社）を供給業者の指示通りに用いてＯＰＧおよびＲＡＮＫＬを定量化した。
【0246】
結果
細胞毒性
低濃度（１０ｍｇ／ｃｍ２）では、ｈＡＳＣとＨＡ／β－ＴＣＰ粒子との間接的な接触によって細胞生存率が改善した（細胞単独と比較して１１１．１％の細胞生存率）。これとは対照的に、１９ｍｇ／ｃｍ２および３９．４ｍｇ／ｃｍ２の濃度では、細胞生存率がそれぞれ１０％および５２．３％に低下した（図１）。
細胞毒性
低濃度（１０ｍｇ／ｃｍ２）では、ｈＡＳＣとＨＡ／β－ＴＣＰ粒子との間接的な接触によって細胞生存率が改善した（細胞単独と比較して１１１．１％の細胞生存率）。これとは対照的に、１９ｍｇ／ｃｍ２および３９．４ｍｇ／ｃｍ２の濃度では、細胞生存率がそれぞれ１０％および５２．３％に低下した（図１）。
【0247】
組織学的解析
生体適合性粒子との４週間または８週間のインキュベーション後、構造物間に有意差は認められなかった。
生体適合性粒子との４週間または８週間のインキュベーション後、構造物間に有意差は認められなかった。
【0248】
構造／細胞充実度／細胞外基質の存在
セラミック材料添加の数日後、骨原性細胞および分散したセラミック材料粒子がミネラル化細胞外基質の中に徐々に閉じ込められていった。
セラミック材料添加の数日後、骨原性細胞および分散したセラミック材料粒子がミネラル化細胞外基質の中に徐々に閉じ込められていった。
【0249】
その後、骨原性細胞およびセラミック材料粒子が、一部ミネラル化した黄褐色の成形可能なパテの大きな三次元パッチ（または少数のこれより小さいパッチ）を形成し、各培養容器から剥離し始める。約１５日後には、多次元生体材料が発達し、フラスコから剥離し得る。
【0250】
ｈＡＳＣと様々な粒子（ＨＡ／β－ＴＣＰ、ＨＡおよびβ－ＴＣＰ）のいずれかとを骨原性分化培地で共培養したところ、多次元構造の形成がみられた。この構造物は鉗子でつまむことができ、機械的強度に耐性を示すものであった（図２）。図３に、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料の肉眼写真を示す。
【0251】
ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料は、細胞充実度が２６２±２０５細胞／ｍｍ２であることがわかった（ｎ＝７）。
【0252】
ヘマトキシリン－エオシンおよびマッソン・トリクロム染色による組織学的解析では、細胞および粒子の間に相互結合組織が存在し、細胞化された相互結合組織に粒子が組み込まれていることが明らかになった（図４Ａ～４Ｂ）。
【0253】
骨分化／ミネラル化
細胞外基質のオステオカルシン染色が陽性であり（図４Ｃ）、ＡＳＣが適切に骨原性細胞に分化したことが示された。
細胞外基質のオステオカルシン染色が陽性であり（図４Ｃ）、ＡＳＣが適切に骨原性細胞に分化したことが示された。
【0254】
マイクロＣＴ解析では、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料のミネラル化度が１．９％であることが明らかになった（図５）。
【0255】
成長因子含有量
生体適合性粒子との４週間または８週間のインキュベーション後、構造物間に有意差は認められなかった。
生体適合性粒子との４週間または８週間のインキュベーション後、構造物間に有意差は認められなかった。
【0256】
結果を下の表１および図６に示す。
【0257】
【表1】
【0258】
本発明のセラミック粒子を用いて形成した生体材料はいずれも、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１およびＳＤＦ－１αを含む。ＳＤＦ－１αにおける含有量はＶＥＧＦおよびＩＧＦ１におけるものよりも少ない。全組織にＢＭＰ２もＢＭＰ７も検出されなかった。
【0259】
破骨細胞活性
ＭＰ／ＭＤ培地、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料、ＨＡを用いて形成した生体材料およびβ－ＴＣＰを用いて形成した生体材料中のｈＡＳＣの上清のＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ分泌を定量化した。
ＭＰ／ＭＤ培地、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料、ＨＡを用いて形成した生体材料およびβ－ＴＣＰを用いて形成した生体材料中のｈＡＳＣの上清のＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ分泌を定量化した。
【0260】
ＲＡＮＫＬは検出されなかった。ＭＰ培地およびＭＤ培地中の細胞の上清にＯＰＧはみられなかった。
【0261】
これとは対照的に、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料は、約３０１０ｐｇ／１０６細胞を分泌する（図７）。組織１ｇ当たりの濃度に関しては、ＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料が約３０ｎｇ／ｇ、ＨＡを用いて形成した生体材料が約７６ｎｇ／ｇ、β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料が約８４ｎｇ／ｇであった（図８）。
【0262】
ＨＡ／β－ＴＣＰ単独によるＯＰＧ分泌も評価し、ほぼ検出不可能なレベルであることがわかった（図８）。
【0263】
実施例３：骨形成能および血管新生能
材料および方法
Ｑｉａｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）およびＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）を用いて、増殖培地（ＭＰ）のＡＳＣ（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）、分化培地のＡＳＣ（ＭＤ、粒子を含まない古典的な骨原性培地で培養した細胞）（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）および１．５ｃｍ３のＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）から全ＲＮＡを抽出した。Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を追加のオンカラムＤＮアーゼ消化とともに製造業者の指示通りに用いて、ＲＮＡを精製した。分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、米国）を用いて、ＲＮＡの性質および量を明らかにした。市販のＰＣＲアレイによる（Ｈｕｍａｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－血管新生；Ｈｕｍａｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－骨形成、Ｑｉａｇｅｎ社）骨原性および血管新生の遺伝子発現プロファイルには、ＲＴ２ＲＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡ０．５μｇからｃＤＮＡを合成した。増幅産物の検出にはＡＢＩ Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ５システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いた。ΔΔＣＴ法に従って定量化を実施した。各試料の最終結果を３種類のハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２ＭおよびＧＡＰＤＨ）の発現レベルの平均値に対して正規化した。
材料および方法
Ｑｉａｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）およびＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）を用いて、増殖培地（ＭＰ）のＡＳＣ（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）、分化培地のＡＳＣ（ＭＤ、粒子を含まない古典的な骨原性培地で培養した細胞）（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）および１．５ｃｍ３のＨＡ／β－ＴＣＰを用いて形成した生体材料（ｎ＝４、４例の異なるヒト脂肪組織ドナー由来）から全ＲＮＡを抽出した。Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を追加のオンカラムＤＮアーゼ消化とともに製造業者の指示通りに用いて、ＲＮＡを精製した。分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、米国）を用いて、ＲＮＡの性質および量を明らかにした。市販のＰＣＲアレイによる（Ｈｕｍａｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－血管新生；Ｈｕｍａｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－骨形成、Ｑｉａｇｅｎ社）骨原性および血管新生の遺伝子発現プロファイルには、ＲＴ２ＲＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡ０．５μｇからｃＤＮＡを合成した。増幅産物の検出にはＡＢＩ Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ５システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いた。ΔΔＣＴ法に従って定量化を実施した。各試料の最終結果を３種類のハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２ＭおよびＧＡＰＤＨ）の発現レベルの平均値に対して正規化した。
【0264】
リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｈｕｍａｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｒｒａｙ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、ｍＲＮＡレベルでの骨原性遺伝子および血管新生遺伝子の発現を実施した。
【0265】
結果
本発明の生体材料では、８４種類の被験骨原性遺伝子のうち骨格発生に関与する１１種類の遺伝子（ＡＣＶＲ１、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＣＳＦ１、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦＲ１、ＲＵＮＸ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＷＩＳＴ１）、３種類の転写因子（ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５）、２種類の成長因子（ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ）および３種類の細胞接着分子（ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ１、ＩＣＡＭ１）がＭＰのＡＳＣまたはＭＤのＡＳＣと比較して調節されることがわかった（図９）。
本発明の生体材料では、８４種類の被験骨原性遺伝子のうち骨格発生に関与する１１種類の遺伝子（ＡＣＶＲ１、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＢＭＰＲ２、ＣＳＦ１、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦＲ１、ＲＵＮＸ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＷＩＳＴ１）、３種類の転写因子（ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５）、２種類の成長因子（ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ）および３種類の細胞接着分子（ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ１、ＩＣＡＭ１）がＭＰのＡＳＣまたはＭＤのＡＳＣと比較して調節されることがわかった（図９）。
【0266】
本発明の生体材料にはＭＰまたはＭＤのＡＳＣと比較して、軟骨細胞および破骨細胞の骨形成関連遺伝子の発現を促進し、細胞周期進行を調節し、骨微小環境を改善し、機能に影響を及ぼす不可欠な骨形成特異的転写因子（Ｂｒｕｄｅｒｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅｒ，２０１４；Ｘｕ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓ Ｒｅｓ，２０１５）であるＲｕｎｔ関連転写因子２（Ｒｕｎｘ２）が有意に高く発現した（図９Ｃ）。
【0267】
本発明の生体材料にはＭＤのＡＳＣと比較して、骨格間葉に発現し、骨格発生の過程で間葉細胞系列の配分の制御に鍵となる役割を果たすＴＷＩＳＴ関連タンパク質１（ＴＷＩＳＴ１）（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｄら Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ．２０００；Ｒｉｃｅ ＤＰ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ．２０００）も有意に高く発現した（ｐ＝０．０９）（図９Ｄ）。
【0268】
骨形成に重要な経路の１つにトランスフォーミング成長因子ベータ／骨形成タンパク質（ＴＧＦ－ｂ／ＢＭＰ）経路がある。ＴＧＦ－ｂは（ＴＧＦＢＲ１活性化を介して）ＳＭＡＤなどの細胞内シグナル伝達タンパク質を活性化する。これらの因子は、ＴＧＦベータ制御遺伝子の転写を調節し、それにより骨原性遺伝子転写を活性化し、骨芽細胞分化を促進する（Ｓｏｎｇ Ｂ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．Ａｕｔｈｏｒ，２０１０）。興味深いことに、本発明の生体材料にはＭＤのＡＳＣと比較して、ＴＧＦＢＲ１およびＳＭＡＤ２／５ ｍＲＮＡが高く発現することがわかった（図９Ｅ～９Ｈ）。
【0269】
ＭＰのＡＳＣ、ＭＤのＡＳＣおよび本発明の生体材料で試験した８４種類の血管新生遺伝子のうち、６種類の遺伝子が成長因子に関連するものであり（ＡＮＧ、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＢ２、ＶＥＧＦＡ、ＦＧＦ１、ＴＧＦＢ１）、２種類のＥＣＭ分子（ＬＥＰ、ＴＩＭＰ１）および２種類の細胞接着分子（ＥＮＧ、ＴＨＢＳ１）が調節された（図１０）。
【0270】
本発明の生体材料にはＭＰのＡＳＣと比較して、アンジオポエチン（ＡＮＧ）ｍＲＮＡが有意に高く発現することがわかった（図１０Ａ）。アンジオポエチンシグナル伝達は、既存の血管から新たな動脈および静脈を形成する過程である血管新生を促進する（Ｆａｇｉａｎｉ Ｅ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２０１３）。
【0271】
さらに、本発明の生体材料にはＭＰおよびＭＤのＡＳＣと比較して、胚発生および成体組織での血管新生を調節するエフリンＡ１（ＥＦＮＡ）ｍＲＮＡ（Ｐａｓｑｕａｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００５，６（６）：４６２－４７５）が高く発現することがわかった（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。
【0272】
本発明の生体材料ではＭＰまたはＭＤのＡＳＣと比較して、血管内皮成長因子ＡのｍＲＮＡ（ＶＥＧＦＡ）の発現も有意に改善された（図１０Ｄ）。ＶＥＧＦは、血管発生および血管新生の調節に最も重要な成長因子の１つである。骨は極めて血管が発達した器官である（同時に、血管新生が骨形成の重要な調節因子となっている）ため、ＶＥＧＦも骨格発生および出生後の骨修復に正に影響を及ぼす（Ｈｕ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｏｎｅ ２０１６）。
【0273】
本発明の生体材料にはＭＰのＡＳＣと比較して、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）ｍＲＮＡ（強力な血管新生促進因子、Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２００９）およびレプチン（ＬＥＰ）ｍＲＮＡ（重要な血管新生のエンハンサーおよびＶＥＧＦ発現のインデューサー；Ｂｏｕｌｏｕｍｉｅ Ａ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９９８；Ｓｉｅｒｒａ－Ｈｏｎｉｇｍａｎｎ ＭＲ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）１９９８）の過剰発現もみられた（それぞれ図１０Ｅおよび１０Ｆ）。
【0274】
結論として、本発明の生体材料は、移植後、骨分化能とともに細胞生着のために血管新生を促進する能力を分子レベルで発現する細胞が（３Ｄ構造内に）存在することによって、骨原性であると定義され得る。
【0275】
実施例４：移植後の線維性環境内での血管新生および骨形成の促進
４．１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ
組織傷害に最もよくみられる要素の１つが低酸素状態の存在である。間質が損傷すると多くの場合、凝固カスケードが活性化し、低酸素状態の領域が生じる。このことに関連して、本発明の生体材料が、移植後の血管新生の鍵となる成長因子であるＶＥＧＦ（Ｍａｄｒｉｇａｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４ Ｏｃｔ １１；１２：２６０）を分泌する能力を評価した。様々な組織で酸素圧が低下すると、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生遺伝子の転写を誘導する低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１α）（Ａｈｌｕｗａｌｉａ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１２；１９（１）：９０－９７；Ｈａｗｋｉｎｓ ＫＥ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２０１３；８（６）：７７１－７８２）のほかにもＭＳＣ化学誘引間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１α）（Ｙｏｕｎ ＳＷ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７：４３７６－４３８６．Ｃｅｒａｄｉｎｉ ＤＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４；１０（８）：８５８－８６４）の活性化が起こることが知られている。
４．１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ
組織傷害に最もよくみられる要素の１つが低酸素状態の存在である。間質が損傷すると多くの場合、凝固カスケードが活性化し、低酸素状態の領域が生じる。このことに関連して、本発明の生体材料が、移植後の血管新生の鍵となる成長因子であるＶＥＧＦ（Ｍａｄｒｉｇａｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４ Ｏｃｔ １１；１２：２６０）を分泌する能力を評価した。様々な組織で酸素圧が低下すると、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの血管新生遺伝子の転写を誘導する低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１α）（Ａｈｌｕｗａｌｉａ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１２；１９（１）：９０－９７；Ｈａｗｋｉｎｓ ＫＥ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２０１３；８（６）：７７１－７８２）のほかにもＭＳＣ化学誘引間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１α）（Ｙｏｕｎ ＳＷ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７：４３７６－４３８６．Ｃｅｒａｄｉｎｉ ＤＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４；１０（８）：８５８－８６４）の活性化が起こることが知られている。
【0276】
材料および方法
低酸素濃度が生体材料の血管新生促進特性に及ぼす影響を評価するため、３例のドナー由来のＡＳＣと１．５ｃｍ３ＨＡ／β－ＴＣＰとから形成した生体材料をＰＢＳで２回洗浄し、（培地中に外因性成長因子が存在しないよう）ｈＰＬを含まない骨原性分化培地（ＭＤ）１０ｍＬが入った６ウェルプレートで、二重反復でインキュベートした。プレートを５％ＣＯ２、３７℃で７２時間、低酸素状態（１％Ｏ２）または酸素正常状態（２１％Ｏ２）に置いた。次いで、ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦおよびＳＤＦ－１αの定量化に上清を回収した。
低酸素濃度が生体材料の血管新生促進特性に及ぼす影響を評価するため、３例のドナー由来のＡＳＣと１．５ｃｍ３ＨＡ／β－ＴＣＰとから形成した生体材料をＰＢＳで２回洗浄し、（培地中に外因性成長因子が存在しないよう）ｈＰＬを含まない骨原性分化培地（ＭＤ）１０ｍＬが入った６ウェルプレートで、二重反復でインキュベートした。プレートを５％ＣＯ２、３７℃で７２時間、低酸素状態（１％Ｏ２）または酸素正常状態（２１％Ｏ２）に置いた。次いで、ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦおよびＳＤＦ－１αの定量化に上清を回収した。
【0277】
さらに、６ウェルプレートに二重反復で入っている３例のドナーに由来する継代４のコンフルエントなＡＳＣをＰＢＳで２回洗浄し、ｈＰＬを含まない５ｍＬまたは１０ｍＬの増殖培地（ＭＰ）または骨原性分化培地（ＭＤ）に５％ＣＯ２、３７℃で７２時間、低酸素状態（１％Ｏ２）または酸素正常状態（２１％Ｏ２）で入れた。次いで、ＥＬＩＳＡによるＶＥＧＦおよびＳＤＦ－１αの定量化に上清を回収した。
【0278】
結果
低酸素圧では２Ｄ（ＭＰおよびＭＤ）での細胞によるＶＥＧＦ分泌が増大した（１％Ｏ２対２１％Ｏ２で、ＭＰがそれぞれ２４２±５１ｐｇ／１０５細胞対２９±２７ｐｇ／１０５細胞、ＭＤがそれぞれ５６５±５０７ｐｇ／１０５細胞対１８２±２１６ｐｇ／１０５細胞（ｐ＜０．０５））が、低酸素状態が本発明の生体材料のＶＥＧＦ分泌に及ぼす影響はみられなかった（１％Ｏ２対２１％Ｏ２でそれぞれ、７６０±５９４ｐｇ／１０５細胞対８０６±５３０ｐｇ／１０５細胞）（図１１Ａ）。したがって、低酸素圧が本発明の生体材料の使用に対する限定要因となることはない。
低酸素圧では２Ｄ（ＭＰおよびＭＤ）での細胞によるＶＥＧＦ分泌が増大した（１％Ｏ２対２１％Ｏ２で、ＭＰがそれぞれ２４２±５１ｐｇ／１０５細胞対２９±２７ｐｇ／１０５細胞、ＭＤがそれぞれ５６５±５０７ｐｇ／１０５細胞対１８２±２１６ｐｇ／１０５細胞（ｐ＜０．０５））が、低酸素状態が本発明の生体材料のＶＥＧＦ分泌に及ぼす影響はみられなかった（１％Ｏ２対２１％Ｏ２でそれぞれ、７６０±５９４ｐｇ／１０５細胞対８０６±５３０ｐｇ／１０５細胞）（図１１Ａ）。したがって、低酸素圧が本発明の生体材料の使用に対する限定要因となることはない。
【0279】
さらに、１％Ｏ２条件でも２１％Ｏ２条件下でも、本発明の生体材料にＭＰおよびＭＤのＡＳＣより高いＶＥＧＦ分泌がみられた（図１１Ａ）．
【0280】
低酸素刺激後、ＭＤのＡＳＣにＳＤＦ－１α分泌の刺激が観察され（ｐ＝０．００９）、２１％Ｏ２では、本発明の生体材料よって、ＭＰおよびＭＤのＡＳＣよりも有意に高い量のＳＤＦ－１αが放出された（それぞれ、ｐ＝０．０１３および０．０２５）（図１１Ｂ）。
【0281】
さらに、１％Ｏ２では、ＭＤのＡＳＣの方がＭＰのＡＳＣおよび本発明の生体材料よりも分泌が低いことが明らかになった（それぞれ、ｐ＝０．００９および０．０１３）（図１１Ｂ）．
【0282】
本発明の生体材料を低酸素圧（線維性組織にみられる１％酸素）に曝露することにより、ＡＳＣには脈管形成の鍵となるエフェクターを分泌する能力があることが明らかになった。これらの分泌は、細胞外基質を有する三次元中、すなわち、本発明の生体材料中のＡＳＣの方が、二次元で培養した増殖／骨原性培地のＡＳＣよりも（低酸素状態および酸素正常状態で）優れていた。
【0283】
４．２．ｉｎ ｖｉｖｏ
低酸素条件下での本発明の生体材料の生物活性を明らかにする目的で、筋壊死の前臨床モデルを実施した。Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１１；３２（３４）：８８８０－９１）によって示された異所性モデルは、生体材料の生物活性を検討するゴールドスタンダードであり、腰部領域内の焼灼脊椎傍筋によって形成されたポケットに被験品（生体材料）を移植することにある。
低酸素条件下での本発明の生体材料の生物活性を明らかにする目的で、筋壊死の前臨床モデルを実施した。Ｓｃｈｕｂｅｒｔら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１１；３２（３４）：８８８０－９１）によって示された異所性モデルは、生体材料の生物活性を検討するゴールドスタンダードであり、腰部領域内の焼灼脊椎傍筋によって形成されたポケットに被験品（生体材料）を移植することにある。
【0284】
材料および方法
ヌードラットに、いかなる移植片拒絶反応も起こらないよう本発明の生体材料（ヒト起源）を移植する、２つの実験を実施した。
ヌードラットに、いかなる移植片拒絶反応も起こらないよう本発明の生体材料（ヒト起源）を移植する、２つの実験を実施した。
【0285】
第一の実験は、移植の１か月後に組織リモデリングに本発明の生体材料が果たす役割を評価するようデザインしたものである。第二の実験は、（移植後第２９日に）組織リモデリングを分子レベルで評価するようデザインしたものである。
【0286】
両実験とも、生体材料を１０個体のヌードラットに両側移植した。移植した生体材料の体積は約０．３ｃｍ３（５００ｍｇまたは４．７×１０６細胞に相当する）であった。
【0287】
第一の実験では、移植後第２８日、フォン・ヴィルブランド病に対する免疫染色後に血管新生を組織形態計測によって定量化し、ＨＬＡに対する免疫組織化学によってヒト細胞の存在を評価した。
【0288】
第二の実験では、移植後第２９日、ＨＬＡに対する免疫組織化学によってヒト細胞の存在を評価し、マッソン・トリクロム染色後、組織形態計測解析によって移植片の血管再生を評価した。
【0289】
さらに、Ｑｉａｚｏｌ溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）およびＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）を用いて、外植片から全ＲＮＡを抽出した。Ｒｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を追加のオンカラムＤＮアーゼ消化とともに製造業者の指示通りに用いて、ＲＮＡを精製した。分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ １９０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、カリフォルニア州、米国）を用いて、ＲＮＡの性質および量を求めた。市販のＰＣＲアレイ（Ｈｕｍａｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－血管新生；Ｈｕｍａｎ ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ａｓｓａｙ－骨形成、Ｑｉａｇｅｎ社）による骨原性および血管新生の遺伝子発現プロファイルには、ＲＴ２ ＲＮＡ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いて全ＲＮＡ０．５μｇからｃＤＮＡを合成した。増幅産物の検出にはＡＢＩ Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ５システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＯＸ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、ドイツ）を用いた。ΔΔＣＴ法に従って定量化を実施した。各試料の最終結果を３種類のハウスキーピング遺伝子（ＡＣＴＢ、Ｂ２ＭおよびＧＡＰＤＨ）の発現レベルの平均値に対して正規化した。
【0290】
移植後第２９日、本発明の生体材料から得た外植片の間で骨原性遺伝子の発現を比較した。次いで、外植片について４８種類の骨原性遺伝子を試験した。
【0291】
【0292】
血管表面積および血管数／ｍｍ２の結果を図１３に示す。
【0293】
本発明の生体材料内のヒト細胞の存在により、本発明の生体材料中のヒトＡＳＣが（筋肉領域／移植部位の焼灼の後に）壊死宿主組織内で生き延びることが可能であることが明らかになった（図１４）．
【0294】
第二の実験
移植後第２９日、本発明の生体材料中にヒト細胞が存在することが明らかになった（データ不掲載）。
移植後第２９日、本発明の生体材料中にヒト細胞が存在することが明らかになった（データ不掲載）。
【0295】
既に記載したように、第一の生物活性に関する実験では、移植後第２９日に移植片の血管再生が確認された（データ不掲載）。
【0296】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験から、本発明の生体材料が製品内で血管新生を誘導することが可能であることが明らかになった。
【0297】
実施例５：骨欠損の治療
骨形成における本発明の生体材料の効果を試験するため、ラットモデルの臨界寸法の骨欠損をデザインした。このモデルについては文献（Ｓａｘｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１６－Ｍａｎａｓｓｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ２０１６）に十分に記載されている。
骨形成における本発明の生体材料の効果を試験するため、ラットモデルの臨界寸法の骨欠損をデザインした。このモデルについては文献（Ｓａｘｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１６－Ｍａｎａｓｓｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ２０１６）に十分に記載されている。
【0298】
材料および方法
本発明のヒト生体材料のレシピエントには、いかなるＴ細胞免疫反応も起こらないよう雄ヌードラットを選択した。簡潔に述べれば、ヌードラット１４個体（ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独および生体材料それぞれのレシピエント７個体からなる２つのグループ）にＲａｔＦｉｘ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＲＩＳｙｓｔｅｍ社、スイス）を用いることによって、ラット大腿骨に臨界寸法の骨欠損を実施した。５ｍｍの欠損を生じさせ、スクリューで固定したプレートを用いることにより、大腿骨の２つのセグメントを連結した。
本発明のヒト生体材料のレシピエントには、いかなるＴ細胞免疫反応も起こらないよう雄ヌードラットを選択した。簡潔に述べれば、ヌードラット１４個体（ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独および生体材料それぞれのレシピエント７個体からなる２つのグループ）にＲａｔＦｉｘ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＲＩＳｙｓｔｅｍ社、スイス）を用いることによって、ラット大腿骨に臨界寸法の骨欠損を実施した。５ｍｍの欠損を生じさせ、スクリューで固定したプレートを用いることにより、大腿骨の２つのセグメントを連結した。
【0299】
骨欠損誘導から３週間後、Ｘ線撮影を実施して、骨欠損の不可逆性を評価し、いかなる自発的骨再生も起こらないようにした。
【0300】
（骨欠損が持続し、いかなる固定材料破損もみられない）ヌードラットレシピエントにＨＡ／β－ＴＣＰ粒子（５００ｍｇに相当する総体積０．３４４ｃｍ３）またはＡＳＣと１．５ｃｍ３のＨＡ／β－ＴＣＰ粒子と（５００ｍｇに相当する総体積０．３１３ｃｍ３および４．７×１０６個の細胞）を用いて形成した本発明の生体材料を移植した。
【0301】
移植から１か月後、移植片統合および骨融合のレベルを評価する目的で、各個体にマイクロＣＴスキャンおよび組織学的検査を実施した。
【0302】
結果
移植から１か月後、本発明の生体材料は大腿骨の両セグメントの間に完全に統合されて、二皮質骨融合（２つの大腿皮質構造物の連続性）が起こっていた（図１５、左上および左下）が、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独のものは骨欠損内に位置し、全く統合されていなかった（図１５、右上および右下）。実際、皮質骨とＨＡ／β－ＴＣＰ粒子との間に架橋はみられず、両側皮質融合（図１５右下の記号＊で示される）および大腿骨欠損端の萎縮様相もみられなかった。
移植から１か月後、本発明の生体材料は大腿骨の両セグメントの間に完全に統合されて、二皮質骨融合（２つの大腿皮質構造物の連続性）が起こっていた（図１５、左上および左下）が、ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独のものは骨欠損内に位置し、全く統合されていなかった（図１５、右上および右下）。実際、皮質骨とＨＡ／β－ＴＣＰ粒子との間に架橋はみられず、両側皮質融合（図１５右下の記号＊で示される）および大腿骨欠損端の萎縮様相もみられなかった。
【0303】
以上の結果を組織学的検査により確認した（図１６および１７）。ＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独の移植から１か月後、製品は統合されておらず、重大な線維症が観察された（図１６Ａ、白矢印）。天然の骨とＨＡ／β－ＴＣＰの移植片との間の境界にある欠損には、軟骨内骨化がみられなかった（図１６Ｂ、黒矢印）。本発明の生体材料の移植から１か月後、製品の統合および骨融合が観察された（図１７Ａ、白矢印）。天然の骨と生体材料との間に直接接する形で軟骨内骨化がみられ、骨統合過程が示された（図１７Ｂ、黒矢印）。ＨＬＡ－Ｉ染色では、ヒト細胞が存在することがわかる（図１７Ｃ）。
【0304】
以上のｉｎ ｖｉｖｏの試験から、（ｉ）本発明の生体材料が低酸素環境中で骨形成を改善することが可能であること、および（ｉｉ）臨界寸法の骨欠損において骨融合を起こすことが可能であることが明らかになった。本発明の生体材料は、骨形成および骨再建の点でＨＡ／β－ＴＣＰ粒子単独よりも優れていることが明らかになった。
【0305】
実施例６：脊椎固定ラットモデルを用いた生体材料に関する試験（試験ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群）
試験の目的
ＧＬＰ準拠試験（試験ＣＰ－２０１７０２５）を実施して、（ｉ）治験製品が目的とする臨床使用に関連する条件に従った関連動物モデルでの生体材料の全般的毒性（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５毒性試験群」）および（ｉｉ）治験細胞の生体内分布および異所性組織の継続的発達能（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群」）を評価するという２つの目的を遂行した。
試験の目的
ＧＬＰ準拠試験（試験ＣＰ－２０１７０２５）を実施して、（ｉ）治験製品が目的とする臨床使用に関連する条件に従った関連動物モデルでの生体材料の全般的毒性（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５毒性試験群」）および（ｉｉ）治験細胞の生体内分布および異所性組織の継続的発達能（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群」）を評価するという２つの目的を遂行した。
【0306】
免疫適格動物に予想されるヒト細胞拒絶反応が起こらないよう免疫不全（ヌード）ラットモデルを選択した。脊椎固定手術モデルは、文献（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．２００３，８５：９０５－９１１）に記載されており、同様の組織環境中で大腿骨欠損よりも移植体積を大きくすることができる（Ｂｅｌｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．２０１４，６１（３）：１８６－１９２）ため、同モデルを関連モデルに選択した。さらに、脊椎固定外科処置で生じる移植環境は、大腿骨欠損などの骨非統合モデルで生じる環境と比較して極めて類似していると考えられている。
【0307】
試験デザイン
「生体内分布試験群」の目的には、健常な９週齢ホモ接合ヌード胸腺欠損ラット２０個体（雄１０個体および雌１０個体；Ｈｓｄ：ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ ｒｎｕ／ｒｎｕ）をグループ１および２（１グループ当たり雄５個体および雌５個体）に無作為に割り付けた（表２）。
「生体内分布試験群」の目的には、健常な９週齢ホモ接合ヌード胸腺欠損ラット２０個体（雄１０個体および雌１０個体；Ｈｓｄ：ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ ｒｎｕ／ｒｎｕ）をグループ１および２（１グループ当たり雄５個体および雌５個体）に無作為に割り付けた（表２）。
【0308】
【表2】
【0309】
Ｄ０に、グループ１の個体を下に記載する外科的処置により生体材料（臨床バッチと同じ工程に従って製造した１つのバッチ）で治療した。グループ２の個体には生体材料による治療を実施しなかったが、Ｄ０にグループ１の個体と同じ外科的処置を実施した。
【0310】
Ｗａｎｇらによって記載されている外科手術法に従い、第５または第６腰椎に沿って皮膚および筋肉を切開した。背部の筋肉を分けて離し、腰椎が見えるようにした。Ｌ５腰椎の横突起に円形の骨欠損を生じさせた。直径が一定のドリルビットを使用することにより骨欠損の大きさを統一して、欠損を直径２．０ｍｍ、深さ１ｍｍに制御した。腰椎の両側を欠損させた。グループ１の個体には、腰椎の両側（左および右）に生じさせた穴およびその周囲の領域に生体材料（それぞれ０．５６×１０７個の細胞を含む０．３７５ｃｍ３のものを２片）を移植した。次いで、背部の筋肉および皮膚を縫合した。ラットの体重に基づけば、この生体材料の量は１０（２５０ｇのラット対３０ｋｇの患者）～２３．４（２５０ｇのラット対７０ｋｇの患者）の相対安全域に相当する。
【0311】
Ｄ２９に、ラットを屠殺し、剖検を実施した。ラット組織内の生体材料ヒト細胞の存在を検出および定量化する目的で、投与部位、骨髄、脳、生殖腺、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、骨格筋および脾臓から全ゲノムＤＮＡを抽出した後、ヒトＡｌｕエレメントベースのｑＰＣＲ法を用いて解析した。
【0312】
器官を採取し、重量を測定し、ＤＮＡ抽出まで－８０℃で保管した。次いで、機械的方法を用いることによって組織を抽出緩衝液中で完全にホモジナイズした後、ＤＮＡ抽出を実施した。被験ラット組織試料または対照ラット組織試料のゲノムＤＮＡを１２５ｎｇ用いて、ｑＰＣＲ実験を２０μｌで実施した。各試料を３回反復で試験した。ラットの特定の組織ＤＮＡ基質１２５ｎｇに添加したヒトＤＮＡの２０ｆｇ（全器官の定量化の下限値）または７０ｆｇ（骨格筋の定量化の下限値）～７ｎｇ（定量化の上限値）の範囲の定量化について、ＡｌｕエレメントベースのｑＰＣＲ法の妥当性を検証した。
【0313】
結果
グループ１および２の個体の骨髄、脳、生殖腺、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、骨格筋および脾臓ならびにグループ２の個体の投与部位の試料に定量化の限界値以下のヒトＤＮＡが検出されることはなかった。グループ１の個体の全投与部位およびグループ１の１０個体のうち１個体の心臓にヒトＤＮＡが検出された。
グループ１および２の個体の骨髄、脳、生殖腺、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、骨格筋および脾臓ならびにグループ２の個体の投与部位の試料に定量化の限界値以下のヒトＤＮＡが検出されることはなかった。グループ１の個体の全投与部位およびグループ１の１０個体のうち１個体の心臓にヒトＤＮＡが検出された。
【0314】
生体材料治療ラットの全移植部位に加えて、生体内分布を目的に解析した生体材料治療ラット１０個体のうち１個体にヒトＤＮＡが検出された。原因は明らかでないが、この結果は、それが解析した１０個体のうち１個体だけに観察されたものであること、また、検出されたＤＮＡの量が少なかった（心臓中のヒト細胞１６６個に相当する推定数）ことから、試料採取時の汚染によるものであると思われる。さらに、生体材料治療ラット１０個体の心臓に移植してから２９日後に実施した組織病理学的解析では、異所性組織形成を思わせる組織病理学的観察結果は認められなかった。
【0315】
実施例７：脊椎固定ラットモデルを用いた生体材料に関する試験（ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群）
ＧＬＰ準拠試験２件を含めた以下の動物試験３件により、生体材料開発のための非臨床毒性試験を実施した：
－脊椎固定ラットモデルを用いた生体材料に関する単回投与毒性試験（ＧＬＰ試験ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群）；
－ＮＳＧマウスを用いた生体材料に関する腫瘍形成能試験（ＧＬＰ試験ＣＰ－２０１７０２６）；および
－ＮＳＧマウスを用いて腫瘍形成能を検討した生体材料に関する局所耐容性試験（ＣＰ－２０１７０７３）。
ＧＬＰ準拠試験２件を含めた以下の動物試験３件により、生体材料開発のための非臨床毒性試験を実施した：
－脊椎固定ラットモデルを用いた生体材料に関する単回投与毒性試験（ＧＬＰ試験ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群）；
－ＮＳＧマウスを用いた生体材料に関する腫瘍形成能試験（ＧＬＰ試験ＣＰ－２０１７０２６）；および
－ＮＳＧマウスを用いて腫瘍形成能を検討した生体材料に関する局所耐容性試験（ＣＰ－２０１７０７３）。
【0316】
背景および目的
ＧＬＰ準拠試験（試験ＣＰ－２０１７０２５）を実施して、（ｉ）治験製品が目的とする臨床使用に関連する条件に従った関連動物モデルでの生体材料の全般的毒性（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群）および（ｉｉ）治験細胞の生体内分布および異所性組織の継続的発達能（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群」）を評価するという２つの目的を遂行した。
ＧＬＰ準拠試験（試験ＣＰ－２０１７０２５）を実施して、（ｉ）治験製品が目的とする臨床使用に関連する条件に従った関連動物モデルでの生体材料の全般的毒性（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－毒性試験群）および（ｉｉ）治験細胞の生体内分布および異所性組織の継続的発達能（いわゆる「ＣＰ－２０１７０２５－生体内分布群」）を評価するという２つの目的を遂行した。
【0317】
「毒性試験群」の目的は、潜在的毒性、その発現（急性または遅延）および観察された毒性が消失する可能性を確認し、特徴付け、定量化することであった。
【0318】
免疫適格動物に予想されるヒト細胞拒絶反応が起こらないよう免疫不全（ヌード）ラットモデルを選択した。脊椎固定手術モデルは、文献（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３）に記載されており、同様の組織環境中で大腿骨欠損よりも移植体積を大きくすることができる（Ｂｅｌｉｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１４）ため、同モデルを関連モデルに選択した。さらに、脊椎固定外科処置で生じる移植環境は、大腿骨欠損などの骨非統合モデルで生じる環境と比較して極めて類似していると考えられている。
【0319】
試験デザイン
「毒性試験群」の目的には、健常な９週齢ホモ接合ヌード胸腺欠損ラット４０個体（雄２０個体および雌２０個体；Ｈｓｄ：ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ ｒｎｕ／ｒｎｕ）をグループ１および２（１グループ当たり雄１０個体および雌１０個体）に無作為に割り付けた（表３）。
「毒性試験群」の目的には、健常な９週齢ホモ接合ヌード胸腺欠損ラット４０個体（雄２０個体および雌２０個体；Ｈｓｄ：ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ ｒｎｕ／ｒｎｕ）をグループ１および２（１グループ当たり雄１０個体および雌１０個体）に無作為に割り付けた（表３）。
【0320】
【表3】
【0321】
Ｄ０に、グループ１の個体を下に記載する外科的処置により生体材料（臨床バッチと同じ工程に従って製造した１つのバッチ）で治療した。グループ２の個体には生体材料による治療を実施しなかったが、Ｄ０にグループ１の個体と同じ外科的処置を実施した。
【0322】
Ｗａｎｇらによって記載されている外科手術法に従い、第５または第６腰椎に沿って皮膚および筋肉を切開した。背部の筋肉を分けて離し、腰椎が見えるようにした。Ｌ５腰椎の横突起に円形の骨欠損を生じさせた。直径が一定のドリルビットを用い骨欠損の大きさを統一して、欠損を直径２．０ｍｍ、深さ１ｍｍに制御した。腰椎の両側を欠損させた。グループ１の個体には、腰椎の両側（左および右）に生じさせた穴およびその周囲の領域に生体材料（それぞれ０．５６×１０７個の細胞を含む０．３７５ｃｍ３のものを２片）を移植した。次いで、背部の筋肉および皮膚を縫合した。ラットの体重に基づけば、この生体材料の量は１０（２５０ｇのラット対３０ｋｇの患者）～２３．４（２５０ｇのラット対７０ｋｇの患者）の相対安全域に相当する。
【0323】
外科手術後、ラットの麻酔後の回復を観察し、次いで、Ｄ２９まで個体の創傷治癒、運動、罹病率、死亡率および明白な毒性の徴候を毎日モニターした。
【0324】
Ｄ０に、次いで少なくとも週２回、無作為化を目的に体重を測定した。体重変化を評価し、グループ１と２の個体の間で比較した。
【0325】
Ｄ３およびＤ２９に、絶食させたグループ１および２のラットから血液を採取して、血液学的パラメータ、凝固パラメータおよび生化学的パラメータを測定した。Ｄ２９に、ラットを屠殺し、剖検を実施した。
【0326】
毒性検査を目的に、１グループ当たり雌雄それぞれ５個体の器官を肉眼で観察し、採取した。脾臓、肝臓、腎臓および心臓の重量を測定した。採取した器官はいずれも、４％のホルマリンに入れて室温で保存し、パラフィンで包埋し、スライドを作製し（１器官当たり３枚；２０個体）、顕微鏡で解析した。
【0327】
結果
モニタリング期間中、重要な観察結果は報告されなかった。体重に関して、グループ１と２の個体間に体重の統計的有意差は観察されなかった。第３日および第２９日に採取した血液試料に関して実施した解析から、血液学的パラメータ、生化学的パラメータおよび凝固パラメータに関してグループ１と２の個体間に重要な差は報告されなかった。肉眼的には、実施した剖検から重要な事柄は報告されなかった。顕微鏡的には、グループ１の全個体の移植部位に生体材料移植によるものと考えられる異物肉芽腫が観察された。これ以外に生体材料移植に起因すると考えられる組織病理学的な全身変化は観察されなかった。
モニタリング期間中、重要な観察結果は報告されなかった。体重に関して、グループ１と２の個体間に体重の統計的有意差は観察されなかった。第３日および第２９日に採取した血液試料に関して実施した解析から、血液学的パラメータ、生化学的パラメータおよび凝固パラメータに関してグループ１と２の個体間に重要な差は報告されなかった。肉眼的には、実施した剖検から重要な事柄は報告されなかった。顕微鏡的には、グループ１の全個体の移植部位に生体材料移植によるものと考えられる異物肉芽腫が観察された。これ以外に生体材料移植に起因すると考えられる組織病理学的な全身変化は観察されなかった。
【0328】
結論として、ヌードラットの関連するモデルを用いた生体材料移植後に毒性は認められなかった。
【0329】
実施例８：細胞形質転換リスクの評価
ヒトでは、骨肉腫を含めた様々な肉腫が間葉起源であることを裏付ける証拠が相当量得られている。一方、ＭＳＣについては、長期培養で染色体異常が発現するものの、ｉｎ ｖｉｔｒｏで自然形質転換が起こることは示されていない（Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００７，２５（６）：１５８６－１５９４；Ｂｅｒｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７，６７（１９）：９１４２－９１４９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｓａｒｃｏｍａ Ｒｅｓ．２０１３，３（１）：１０）。このような奇形はこれまでに記載されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養条件に対する自然な適応であって、形質転換リスクが高いこととは関係ないことが示唆されている（Ｔａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１０，１１５（８）：１５４９－１５５３）。
ヒトでは、骨肉腫を含めた様々な肉腫が間葉起源であることを裏付ける証拠が相当量得られている。一方、ＭＳＣについては、長期培養で染色体異常が発現するものの、ｉｎ ｖｉｔｒｏで自然形質転換が起こることは示されていない（Ａｇｕｉｌａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００７，２５（６）：１５８６－１５９４；Ｂｅｒｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７，６７（１９）：９１４２－９１４９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｓａｒｃｏｍａ Ｒｅｓ．２０１３，３（１）：１０）。このような奇形はこれまでに記載されており、ｉｎ ｖｉｔｒｏの培養条件に対する自然な適応であって、形質転換リスクが高いこととは関係ないことが示唆されている（Ｔａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１０，１１５（８）：１５４９－１５５３）。
【0330】
臨床バッチに提案される工程で作製した生体材料の開発バッチを４つ以上製造する過程で、生体材料の原薬の細胞遺伝学的安定性を分子核型分析（ａＣＧＨ／ＳＮＰ法）により試験することによって、ＡＳＣの自発的細胞形質転換の可能性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）と高密度一塩基多型（ＳＮＰ）の組合せは、負担となる事前の有糸分裂細胞単離を必要とせずに、ゲノム全域にわたってコピー数変化をスクリーニングし、臨床的に重要な染色体異常および染色体障害を検出する代替手段となるのに十分に確立された分子ジェノタイピング法である（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１，４３（９）：８３８－８４６；Ｓｌａｖｏｔｉｎｅｋ．Ａ．Ｍ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００８，１２４（１）：１－１７）。
【0331】
結果から、製造工程でも生体材料の原薬の放出試験に相当する継代レベルでも、ｈＡＳＣが細胞遺伝学的に安定であるものと思われることがわかる。
【0332】
ＮＳＧマウスを用いた生体材料に関するｉｎ ｖｉｖｏのＧＬＰ腫瘍形成能試験（試験ＣＰ－２０１７０２６）
背景および目的
ＭＳＣ由来細胞療法を実施する場合、これまでにヒト患者に腫瘍形成が観察されたことはないが、こうして得られた結果は、患者に対する腫瘍形成能のリスクを確認するものでも排除するものでもない（Ｂａｒｋｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１３，１５（７）：７５３－７５９）。
背景および目的
ＭＳＣ由来細胞療法を実施する場合、これまでにヒト患者に腫瘍形成が観察されたことはないが、こうして得られた結果は、患者に対する腫瘍形成能のリスクを確認するものでも排除するものでもない（Ｂａｒｋｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１３，１５（７）：７５３－７５９）。
【0333】
研究ＣＰ－２０１７０２６の目的は、ＮＳＧ（ＮＯＤｓｃｉｄガンマ）免疫不全マウスに移植したのち最大６か月にわたって、生体材料に含まれるヒト脂肪由来ＭＳＣの細胞形質転換のリスクを腫瘍形成能の点から評価することであった。腫瘍形成能が確認されていることで選択したＨＴ－２９細胞系を陽性対照に用いた。
【0334】
試験デザイン
この試験には、健常な７週齢のＮＳＧ雌マウス３０個体を含めた。マウスを２つのグループ（グループ１には２０個体、グループ２には１０個体）に無作為に割り付けた。グループ１の個体には、生体材料（１．５×１０７個の細胞を含む１ｇ（±１ｃｍ３））を切開により皮下空隙に移植した（臨床バッチと同じ工程に従って製造し、試験ＣＰ－２０１７０２５に使用したものと同じバッチ）。グループ２の個体には、ＨＴ－２９細胞を皮下注射により接種した（０．９％ＮａＣｌ ２００μｌで１０７個／個体）。
この試験には、健常な７週齢のＮＳＧ雌マウス３０個体を含めた。マウスを２つのグループ（グループ１には２０個体、グループ２には１０個体）に無作為に割り付けた。グループ１の個体には、生体材料（１．５×１０７個の細胞を含む１ｇ（±１ｃｍ３））を切開により皮下空隙に移植した（臨床バッチと同じ工程に従って製造し、試験ＣＰ－２０１７０２５に使用したものと同じバッチ）。グループ２の個体には、ＨＴ－２９細胞を皮下注射により接種した（０．９％ＮａＣｌ ２００μｌで１０７個／個体）。
【0335】
マウスの生存率、行動および体重を実験終了まで週２回記録した。各個体を週２回観察し、投与部位に新たに形成された小結節を触診した。新たに形成された小結節があれば測定した。グループ１のマウス（生体材料で治療）は最大６か月間観察し、グループ２のマウス（ＨＴ－２９細胞で治療）は、腫瘍体積が１０００ｍｍ３に達するか、壊死が観察されるまでモニターした。
【0336】
剖検時、各個体の肉眼観察を実施した。グループ１の個体（試験項目）については、組織病理学的検査用に移植部位、肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓、脳、鼠経リンパ節（目に見える場合）のスライドを作製した。
【0337】
結果
グループ２（ＨＴ－２９、陽性対照）のマウス１０個体に進行性の腫瘍成長がみられ、Ｄ２７（最初の屠殺の日）の平均腫瘍体積（ＭＴＶ）が６１１．６±３３５．４ｍｍ３であった。１個体のマウスを腫瘍の壊死により屠殺し、他の９個体のマウスはＴＶ＞１０００ｍｍ３のため屠殺した。グループ２のマウスの剖検時に実施した器官の肉眼観察で異常はみられなかった。
グループ２（ＨＴ－２９、陽性対照）のマウス１０個体に進行性の腫瘍成長がみられ、Ｄ２７（最初の屠殺の日）の平均腫瘍体積（ＭＴＶ）が６１１．６±３３５．４ｍｍ３であった。１個体のマウスを腫瘍の壊死により屠殺し、他の９個体のマウスはＴＶ＞１０００ｍｍ３のため屠殺した。グループ２のマウスの剖検時に実施した器官の肉眼観察で異常はみられなかった。
【0338】
グループ１のマウスのうち１個体については、投与部位の縫合が開いたことによりＤ０～Ｄ１に試験項目が喪失した。グループ１の個体は、移植後（Ｄ２）の移植部位の平均体積が１１９４．６±３９２．７ｍｍ３（Ｎ＝１９）であった。移植後、一部のマウスに投与部位のレベルで治癒しない重度の創傷がみられた。
【0339】
その結果、グループ１のマウス２０個体のうち１０個体を上記の投与部位における重度の皮膚創傷のため、Ｄ３～Ｄ２７に倫理上の理由で屠殺した。屠殺したグループ１のマウス１０個体のうち、５個体では移植部位に乾燥した黄色の皮膚がみられ、他の２個体では移植部位に壊死が観察された。組織病理学的検査では、移植部位に炎症がみられ、腫瘤が壊死性のものもみられた。上を覆う皮膚および周囲の筋組織には炎症および／または潰瘍が観察された。
【0340】
グループ１の個体では、移植部位の平均体積が試験終了時点（Ｄ１８０）で１０３２．５±２４５．３（ｎ＝９）ｍｍ３であり、Ｄ２の移植部位の平均体積と比較して体積増大はみられなかった。
【0341】
グループ１のマウスの剖検時に実施した器官の肉眼観察で異常はみられなかった。試験終了時（Ｄ１８０）に屠殺したグループ１のマウスについては、顕微鏡観察で移植部位に多房性腫瘤がみられ、壊死はなく、全般的には組織付近に炎症を伴うものではなかった。解析した移植部位およびその他の器官の組織病理学的検査では、グループ１のいずれのマウスにも腫瘍は観察されなかった。
【0342】
グループ２（ＨＴ－２９細胞で治療）の１０個体のうち少なくとも９個体に進行性に成長する腫瘍がみられたことから、この試験は妥当なものである。約１．５×１０７個の細胞が含まれる試験項目（生体材料１ｇ）の単回皮下移植後、グループ１の（雌ＮＳＧ）いずれのマウスにも腫瘍は観察されなかった。
【0343】
組織病理検査報告書には、この実験の条件下で、「ＮＳＧマウスに約１ｇ［生体材料］を皮下移植しても、６か月の観察期間にわたって細胞増殖は一切誘導されなかった。移植部位には、試験項目と直接関係のある多房性腫瘤がみられた。それにより、一部のマウスについては局所炎症性反応を伴う皮膚潰瘍のため早期に屠殺した。このことは、固い材料を大量に皮下移植したことを原因とする機械的外傷と関係があるものと考えられた。」と記載されていた。
【0344】
ＮＳＧマウスを用いた生体材料に関するｉｎ ｖｉｖｏの局所耐容性試験および腫瘍形成能の検討（試験ＣＰ－２０１７０７３）
背景および目的
ＧＬＰ腫瘍形成能試験ＣＰ－２０１７０２６では、生体材料移植片の局所耐容性が低いことが観察され、このことは、ＮＳＧ免疫不全マウスに固い材料を大量に皮下移植したことを原因とする機械的外傷と関係があるものと考えられた。
背景および目的
ＧＬＰ腫瘍形成能試験ＣＰ－２０１７０２６では、生体材料移植片の局所耐容性が低いことが観察され、このことは、ＮＳＧ免疫不全マウスに固い材料を大量に皮下移植したことを原因とする機械的外傷と関係があるものと考えられた。
【0345】
生体材料１ｇ（±１ｃｍ３）の（試験ＣＰ－２０１７０２６で実施した通り）単一部位（ｎ＝８）または２つの部位（１部位当たり０．５ｇ）（ｎ＝８）への移植後の局所耐容性を（元の計画の通り２週間の期間で）さらに検討するため、試験ＣＰ－２０１７０７３を開始した。
【0346】
注目すべきことに、試験ＣＰ－２０１７０７３では、試験ＣＰ－２０１７０２６とは対照的に、病変（例えば、筋レベルで融合していない移植部位の黄色皮膚）が観察された場合でも、生体材料１ｇを移植した個体のうち、投与部位の重度の皮膚創傷により倫理上の理由で屠殺しなければならない個体はみられなかった。次いで、既に試験ＣＰ－２０１７０２６で得た腫瘍形成能に関するデータを補完するため、最初に定めた２週間の追跡期間を超える期間（最大６か月）にわたってグループ１の個体（ｎ＝８）をモニターすることにした。
【0347】
試験デザイン
７週齢の健常なＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）免疫不全雌マウス１６個体を２つのグループ（１グループ当たり８個体）に無作為化した。グループ１の個体には、生体材料（１．５×１０７個の細胞を含む１ｇ）を切開により右側腹部の皮下空隙に移植した。グループ２の個体には、生体材料（各部位に０．７５×１０７個の細胞を含む２×０．５ｇ）を切開により右側腹部および左側腹部の皮下空隙に移植した。マウスの生存率、行動および体重を実験終了まで週２回記録した。各個体について毎日、臨床徴候および局所反応を観察した。グループ１のマウス（１部位を試験項目で治療）は最大６か月間観察した。グループ２のマウス（２部位を試験項目で治療）は１５日間にわたってモニターした。各個体について肉眼剖検を実施した。グループ１の個体（試験項目）については、組織病理学的検査用に移植部位、肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓、脳、鼠経リンパ節（目に見える場合）のスライドを作製した。
７週齢の健常なＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）免疫不全雌マウス１６個体を２つのグループ（１グループ当たり８個体）に無作為化した。グループ１の個体には、生体材料（１．５×１０７個の細胞を含む１ｇ）を切開により右側腹部の皮下空隙に移植した。グループ２の個体には、生体材料（各部位に０．７５×１０７個の細胞を含む２×０．５ｇ）を切開により右側腹部および左側腹部の皮下空隙に移植した。マウスの生存率、行動および体重を実験終了まで週２回記録した。各個体について毎日、臨床徴候および局所反応を観察した。グループ１のマウス（１部位を試験項目で治療）は最大６か月間観察した。グループ２のマウス（２部位を試験項目で治療）は１５日間にわたってモニターした。各個体について肉眼剖検を実施した。グループ１の個体（試験項目）については、組織病理学的検査用に移植部位、肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓、脳、鼠経リンパ節（目に見える場合）のスライドを作製した。
【0348】
結果
グループ１のマウスのうち、Ｄ７９からＤ８５まで体重減少がみられた１個体を除いて、各マウスの体重はＤ０から屠殺まで徐々に増加した。前者のマウスはＤ８９に死亡していた。
グループ１のマウスのうち、Ｄ７９からＤ８５まで体重減少がみられた１個体を除いて、各マウスの体重はＤ０から屠殺まで徐々に増加した。前者のマウスはＤ８９に死亡していた。
【0349】
グループ１の個体は、Ｄ２の移植部位の平均体積が１２２８．３±１９５．３ｍｍ３（ｎ＝８）であった。試験終了時（Ｄ１８０）には、移植部位の平均体積が９４５．５±９２．７ｍｍ３（ｎ＝７）に減少し、試験項目の皮下移植後、いずれの移植部位にも試験期間中に大きさの増大は観察されないことが示された。
【0350】
グループ１（１部位）およびグループ２（２部位）のマウスは全個体とも、モニタリングパラメータ（運動および歩行、身のこなし、行動、呼吸、眼球、皮膚（移植部位以外）、体毛、粘膜、排泄および無麻痺）が正常であった。
【0351】
屠殺時、グループ１のマウス（１部位）またはグループ２（２部位）に実施した肉眼観察で異常な器官はみられなかった。Ｄ１８０に屠殺したグループ１のマウスには、組織病理学的解析で細胞増殖は一切認められなかった。移植部位に多房性のミネラル化が観察されたが、上を覆う皮膚および付近の筋組織に炎症はみられなかった。このミネラル化した材料は、移植した試験項目であると解釈される。
【0352】
この実験条件下では、以下のような結論を導くことができる：
・生体材料を１つまたは２つの部位に投与したところ、両群とも、移植部位に黄色の皮膚が観察される場合でも局所耐容性に何ら有意な影響を及ぼすことはなかった。この観察結果に関して、グループ１の個体には、Ｄ４４に移植部位に最後に黄色の皮膚が観察されて以降、回復がみられた。
・雌ＮＳＧマウスに１．５×１０７個の細胞を含む生体材料を単回皮下移植し、６か月間の追跡後に肉眼および顕微鏡で検討したところ、腫瘍形成の誘導はみられなかった。
・組織病理検査報告書には、１．５×１０７個の細胞を含む生体材料１ｇをＮＳＧマウスに皮下移植しても、６か月間にわたって細胞増殖の誘導はみられないことが記載されていた。移植部位には、試験項目と直接関係のある多房性のミネラル化がみられた。
・生体材料を１つまたは２つの部位に投与したところ、両群とも、移植部位に黄色の皮膚が観察される場合でも局所耐容性に何ら有意な影響を及ぼすことはなかった。この観察結果に関して、グループ１の個体には、Ｄ４４に移植部位に最後に黄色の皮膚が観察されて以降、回復がみられた。
・雌ＮＳＧマウスに１．５×１０７個の細胞を含む生体材料を単回皮下移植し、６か月間の追跡後に肉眼および顕微鏡で検討したところ、腫瘍形成の誘導はみられなかった。
・組織病理検査報告書には、１．５×１０７個の細胞を含む生体材料１ｇをＮＳＧマウスに皮下移植しても、６か月間にわたって細胞増殖の誘導はみられないことが記載されていた。移植部位には、試験項目と直接関係のある多房性のミネラル化がみられた。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A-B】
【図17C】