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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-02
(45)【発行日】2023-05-15
(54)【発明の名称】変異体ライブラリプール作製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20230508BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20230508BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230508BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C40B40/06
C12Q1/02
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021189096
(22)【出願日】2021-11-22
【審査請求日】2023-03-17
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】日置 貴大
(72)【発明者】
【氏名】寺井 三佳
(72)【発明者】
【氏名】川原 彰人
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】特開２００８－２７８８０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１１３９４３７９（ＣＮ，Ａ）
【文献】JAIN PC. et al.，Analytical Biochemistry，2014年，Vol.449，pp.90-98
【文献】ZHANG K. et al.，Scientific Reports，2021年05月，Vol.11，Article No.10454，https://doi.org/10.1038/s41598-021-89884-z
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｃ４０Ｂ ４０／０６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
【請求項2】
１０種類以上の変異導入用プライマー対を用いる、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記鋳型ＤＮＡが、塩基配列の一部が異なる複数種のＤＮＡの混合物である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
前記工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片を混合する工程、前記工程（ｂ）で得られたＤＮＡを混合する工程、又は前記工程（ｃ）で得られた形質転換体を混合する工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、請求項１～４のいずれか１項記載の方法で作製された変異ライブラリプールであり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
【請求項6】
以下の工程（ａ’）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：（ａ’）鋳型ＤＮＡと変異導入用プライマー対とを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、塩基配列の一部が異なる複数種のＤＮＡの混合物であり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ’）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
【請求項7】
前記鋳型ＤＮＡが、塩基配列の一部が異なる５０種類以上のＤＮＡの混合物である、請求項６記載の方法。
【請求項8】
前記鋳型ＤＮＡが、請求項１～５のいずれか１項記載の方法で作製された変異ライブラリプールである、請求項６又は７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、変異体ライブラリプール作製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質コード配列やプロモーター配列など、ＤＮＡ配列の有する機能を解析又は向上させるために、鋳型ＤＮＡに対して多様な変異が導入されたＤＮＡの変異ライブラリが用いられる。変異ライブラリとしては、個々の変異ＤＮＡを独立して用いる方法と、多様な変異ＤＮＡの混合物である変異ライブラリプールを用いる方法がある。近年では、実験の自動化や、スループット性の高いアッセイシステム開発の進歩から、多様性の大きい変異ライブラリプールを用いた配列の機能解析や機能向上スクリーニングが可能となっている。そのため、多様性が大きく、目的変異を幅広く含む変異ライブラリプールを、安価かつ簡便に作製する方法が求められている。
【0003】
大規模な変異ライブラリプールの作製方法としては、エラープローンＰＣＲ（非特許文献１）が最も広く用いられている。高性能なエラープローンＰＣＲの試薬が各社から販売されており、安価かつ簡便に変異ライブラリプールを作製することができる。しかし、エラープローンＰＣＲでは、隣接した塩基に同時に変異が導入されることは非常に稀であり、アクセスできない変異配列が非常に多く存在するという課題が存在する（非特許文献２）。この課題の解決にあたり、近年では、超並列オリゴヌクレオチド合成法（非特許文献２）が有効な手段とされている。超並列オリゴヌクレオチド合成法では、目的の変異を幅広く含む変異ライブラリプールの合成が可能である。しかし、大規模な変異ライブラリプールの作製において、超並列オリゴヌクレオチド合成法は、エラープローンＰＣＲと比較して依然高価であり、また１０6を越えるような規模の変異ライブラリプールの合成は特に高価かつ困難である。一方で、目的変異を幅広く含む変異ライブラリプールを安価に作製する手法として、一本鎖環状ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによる手法（非特許文献３）やＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ｃｌｏｎｉｎｇを用いた手法（例えば、非特許文献４）などが報告されている。しかし、一本鎖環状ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによる手法では、鋳型の配列に制限があり、また、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ｃｌｏｎｉｎｇを用いた手法では、用いるオリゴＤＮＡの設計が複雑であるなど、簡便性には依然として改良の余地がある。また、これらの手法では適用可能な改変配列の長さの制限は明らかにされておらず、大領域への変異導入において効率が低下する懸念がある。
【0004】
一方、単一の変異を導入する方法として、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる簡便な部位特異的導入方法が知られているが（非特許文献５、６、及び特許文献１）、相補的プライマー対を用いたＰＣＲを利用する大規模な変異ライブラリプールの作製方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特許第５３９００７６号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Cirino, Patrick C., Kimberly M. Mayer, and Daisuke Umeno. Directed Evolution Library Creation. Humana Press, 2003. 3-9.
【文献】Oeling, David, et al. ACS Synthetic Biology 7.9 (2018): 2317-2321.
【文献】Wrenbeck, Emily E., et al. Nature Methods 13.11 (2016): 928-930.
【文献】Nedrud, David, Willow Coyote‐Maestas, and Daniel Schmidt. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics (2021).
【文献】Braman, Jeffrey, Carol Papworth, and Alan Greener. In Vitro Mutagenesis Protocols (1996): 31-44.
【文献】Zheng, Lei, Ulrich Baumann, and Jean-Louis Reymond. Nucleic Acids Research 32.14 (2004): e115-e115.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、多様性が高くかつ目的変異を幅広く含む変異ライブラリプールを、安価かつ簡便に作製する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、変異ライブラリプールの作製方法について種々検討した結果、鋳型ＤＮＡと、異なる変異を導入するための複数種の相補的プライマー対とを用い、該相補的プライマー対毎にＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を混合して宿主細胞を形質転換することで、変異ライブラリプールを作製できることを見出した。一方で、相補的プライマー対を用いたＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片の形質転換効率が、多様性を要する変異ライブラリプールの構築には不十分であるとの課題が判明した。本発明者らは、該課題の解決のためさらに検討を重ねた結果、相補的プライマー対を用いたＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片をライゲーション反応に供することにより、形質転換効率を大幅に向上できることを見出した。さらに、鋳型ＤＮＡとして予め作製した変異ライブラリプールを用いることで、多様性が飛躍的に向上した変異ライブラリプールを作製できることを見出した。
【0009】
一態様において、本発明は、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程、
を提供する。
別の一態様において、本発明は、以下の工程（ａ’）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：
（ａ’）鋳型ＤＮＡと変異導入用プライマー対とを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、塩基配列の一部が異なる複数種のＤＮＡの混合物であり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ’）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程、
を提供する。
別の一態様において、本発明は、上記の変異ライブラリプールの作製方法で作製された変異ライブラリプールを提供する。
別の一態様において、本発明は、所望の性質を有するＤＮＡのスクリーニング方法であって、上記の変異ライブラリプールの作製方法で作製された変異ライブラリプールから、所望の性質を指標として、該所望の性質を有するＤＮＡを選抜する工程を含む、方法を提供する。
（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程、
を提供する。
別の一態様において、本発明は、以下の工程（ａ’）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：
（ａ’）鋳型ＤＮＡと変異導入用プライマー対とを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、塩基配列の一部が異なる複数種のＤＮＡの混合物であり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ’）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程、
を提供する。
別の一態様において、本発明は、上記の変異ライブラリプールの作製方法で作製された変異ライブラリプールを提供する。
別の一態様において、本発明は、所望の性質を有するＤＮＡのスクリーニング方法であって、上記の変異ライブラリプールの作製方法で作製された変異ライブラリプールから、所望の性質を指標として、該所望の性質を有するＤＮＡを選抜する工程を含む、方法を提供する。
【発明の効果】
【0010】
本発明の方法によれば、多様性が高く且つ目的変異を幅広く含む網羅的・半網羅的な変異ライブラリプールの作製が可能である。本発明の方法は、基本的に、相補的プライマー対を用いたＤＮＡ合成反応、ライゲーション反応及び形質転換という簡便な手法からなり、安価に変異ライブラリプールを作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】βラクタマーゼの２４残基目のヒスチジンに飽和変異を導入するためのプライマー対の設計の概略図。
【図2】ＹＲ２８８ｄＲＴ（αアミラーゼ変異体）単変異ライブラリプールのＹＲ２８８ｄＲＴの各アミノ酸残基位置におけるＤＮＡトリプレットの出現頻度を示す図。
【図3】ＹＲ２８８ｄＲＴ二重変異ライブラリプールのＹＲ２８８ｄＲＴの各アミノ酸残基位置におけるＤＮＡトリプレットの出現頻度を示す図。
【図4】ＹＲ２８８ｄＲＴの各アミノ酸残基位置において、エラープローンＰＣＲによる１塩基置換で導入され得る変異のマッピング図。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書において、「変異ライブラリプール」とは、異なる変異に起因する異なる塩基配列を含むＤＮＡの混合物、又は該ＤＮＡを有する菌体の混合物を指す。本発明の方法で作製される変異ライブラリプールは、好適には、異なる変異に起因する異なる塩基配列を含むプラスミドＤＮＡの混合物、又は該プラスミドＤＮＡを有する菌体の混合物である。例えば、あるタンパク質に関しての「変異ライブラリプール」とは、該タンパク質をコードするＤＮＡであって異なる変異に起因する異なる塩基配列からなるＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡの混合物、又は該プラスミドＤＮＡを有する菌体の混合物であり得る。あるタンパク質に関しての「単変異ライブラリプール」とは、上記変異ライブラリプールのうち、変異ライブラリプールを構成する個々のメンバーが、該タンパク質をコードするＤＮＡに単一のアミノ酸残基の置換に相当する変異を有する変異ライブラリプールをいう。また、あるタンパク質に関しての「二重変異ライブラリプール」とは、上記変異ライブラリプールのうち、変異ライブラリプールを構成する個々のメンバーが、該タンパク質をコードするＤＮＡにいずれか２箇所のアミノ酸残基の置換に相当する変異を有する変異ライブラリプールをいう。
【0013】
本明細書において、「飽和変異導入」とは、ＤＮＡの特定の位置の塩基配列に生じ得る様々な変異を導入することを指し、該ＤＮＡがタンパク質をコードしている場合、結果として、該タンパク質の特定の位置のアミノ酸残基に生じ得る様々な変異が導入される。
【0014】
本明細書において、塩基及びアミノ酸残基の略記は、公認されているＩＵＰＡＣ表記に従う。本明細書において、「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。
【0015】
本明細書において、ある塩基配列と「相補的」とは、該ある塩基配列の完全な相補配列である場合に限られず、該ある塩基配列の相補配列と好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の塩基配列の同一性を有すればよい。塩基配列の同一性は、前記ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
【0016】
ここで採用され得る各種操作、例えばＤＮＡの合成、同切断、削除、付加乃至結合を目的とする酵素処理、同単離、精製、選択など、組換えＤＮＡの作製などはいずれも常法に従うことができる（例えば「分子遺伝学実験法」、共立出版株式会社1993年発行；「PCRテクノロジー」、宝酒造株式会社1990年発行、Science, 224, 1431 (1984)；Biochem.Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80,5990 (1983); Moplecular Cloning, by T.Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982)など参照）。
【0017】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0018】
本発明は、変異ライブラリプールの作製方法を提供する。該方法は、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む。
（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
【0019】
本発明の方法の工程（ａ）は、鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程である。斯かる工程により、特定の部位に変異が導入されたＤＮＡ断片が得られる。
【0020】
本発明の方法で用いられる「鋳型ＤＮＡ」は、変異を導入したい目的のＤＮＡを含んでいればよい。目的のＤＮＡの種類や由来は特に限定されない。目的のＤＮＡとしては、プロモーターをコードするＤＮＡ、タンパク質をコードするＤＮＡ等が挙げられ、好ましくは、タンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。目的のＤＮＡは任意の長さであってよいが、その長さは、例えば、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは６０塩基以上、さらに好ましくは１５０塩基以上、なお好ましくは３００塩基以上、さらになお好ましくは４５０塩基以上、さらになお好ましくは６００塩基以上、さらになお好ましくは９００塩基以上であり、且つ好ましくは目的のＤＮＡの全長以下である。これは、アミノ酸配列長に換算すると、好ましくは５アミノ酸残基以上、より好ましくは２０アミノ酸残基以上、さらに好ましくは５０アミノ酸残基以上、なお好ましくは１００アミノ酸残基以上、さらになお好ましくは１５０アミノ酸残基以上、さらになお好ましくは２００アミノ酸残基以上、さらになお好ましくは３００アミノ酸残基以上であり、且つ好ましくは目的のＤＮＡがコードするアミノ酸配列の全長以下である。目的のＤＮＡは、該目的のＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアゲノムＤＮＡ、葉緑体ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなどから通常の遺伝子工学的手法により取得することができる。
【0021】
鋳型ＤＮＡは、環状ＤＮＡであればよく、好ましくは二本鎖環状ＤＮＡである。二本鎖環状ＤＮＡには、環状構造をとることができる限りにおいて、一方又は両方の鎖にニック又はギャップを有するＤＮＡ、及び鎖の一部が一本鎖のＤＮＡも包含される。環状ＤＮＡの具体例としては、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ等が挙げられ、本発明の方法においてはプラスミドＤＮＡが好適に用いられる。好ましいプラスミドＤＮＡの例としては、限定するものではないが、ｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）、ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等が挙げられる。該プラスミドには、後述する工程（ｃ）で形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）が組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子がマーカー遺伝子として組み込まれていてもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子がマーカー遺伝子として組み込まれていてもよい。
【0022】
鋳型ＤＮＡは、１種類の鋳型ＤＮＡを用いてもよいが、塩基配列の一部、具体的には目的のＤＮＡの塩基配列の一部、が異なる複数種のＤＮＡの混合物を用いてもよい。ここで、複数種とは、少なくとも２種類、好ましくは５０種類以上、より好ましくは１００種類以上、さらに好ましくは３００種類以上、なお好ましくは５００種類以上、さらになお好ましくは１０００種類以上、さらになお好ましくは２０００種類以上、さらになお好ましくは３０００種類以上、さらになお好ましくは５０００種類以上、さらになお好ましくは１００００種類以上であり、且つ好ましくは目的のＤＮＡの塩基配列について理論上生じ得る全ての変異体の種類数以下である。鋳型ＤＮＡの種類数が増えるのに応じて、得られる変異ライブラリプールの多様性が高まる。また、塩基配列の一部が異なるとは、塩基配列中の少なくとも１塩基が相違することを意味する。
あるいは、鋳型ＤＮＡとして、本発明の方法で作製された変異ライブラリプール又は公知の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ）で作製された変異ライブラリプールを用いることもでき、これにより、より多様性の高い変異ライブラリプールを作製することが可能となる。
あるいは、鋳型ＤＮＡとして、本発明の方法で作製された変異ライブラリプール又は公知の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ）で作製された変異ライブラリプールを用いることもでき、これにより、より多様性の高い変異ライブラリプールを作製することが可能となる。
【0023】
本発明の方法で用いられる「変異導入用プライマー対」は、鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む。ここで、「互いに相補的な領域を有する」とは、プライマー対を構成する第一のプライマーと第二のプライマーの配列の一部又は全部が互いに相補配列となっていることを意味する。本明細書では、互いに相補的な領域を有するプライマー対を相補的プライマー対と称することがある。尚、プライマー対の互いに相補的な領域は、好ましくは鋳型ＤＮＡとも相補的である。第一のプライマーと第二のプライマーの配列は、プライマーダイマーの軽減の点から、各プライマーの一部のみが互いに相補配列となっていることが好ましく、各プライマーの５’末端側の少なくとも一部が互いに相補配列となっていることがより好ましく、各プライマーの５’末端側の５’末端を含む領域が互いに相補配列となっていることがさらに好ましい。相補配列の長さは、特に限定されないが、好ましくは９～３０塩基、より好ましくは１２～２４塩基、さらに好ましくは１５～１８塩基である。
【0024】
「変異導入部位」は、鋳型ＤＮＡ、具体的には鋳型ＤＮＡ中の目的のＤＮＡ、に変異を導入するための部位であり、導入する変異に相当する塩基配列からなる。変異としては、置換、挿入、欠失のいずれであってもよく、いずれか１種であっても、いずれか２種以上の組み合わせであってもよい。導入する変異が置換であれば、変異に相当する塩基配列は、目的のＤＮＡに置換する塩基配列又はこれと相補的な塩基配列とすればよい。あるいは、導入する変異が挿入であれば、変異に相当する塩基配列は、目的のＤＮＡに挿入する塩基配列又はこれと相補的な塩基配列とすればよい。置換又は挿入を導入するにあたっては、変異に相当する塩基配列を構成する塩基としてＲ、Ｍ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｋ、Ｈ、Ｂ、Ｄ、Ｖ及びＮから選択される少なくとも１種の混合塩基を使用し、複数種の変異を一度に導入することもできる。あるいは、導入する変異が欠失であれば、目的のＤＮＡから欠失される塩基配列の５’側に隣接する塩基配列と３’側に隣接する塩基配列とを連結した塩基配列又はこれと相補的な塩基配列を変異に相当する塩基配列とすればよい。変異導入部位の長さは、特に限定されないが、導入する変異が置換又は挿入である場合には、好ましくは１～２１塩基、より好ましくは１～１８塩基、さらに好ましくは３～９塩基である。導入する変異が欠失である場合には、変異導入部位の長さは特に限定されない。
【0025】
変異導入部位は、変異導入用プライマー対を構成する第一のプライマー及び第二のプライマーの少なくとも一方に含まれていればよく、両方に含まれていてもよい。一方のプライマーのみが変異導入部位を含む場合、変異導入部位は、一方のプライマーの他方のプライマーと相補的でない領域に含まれ、好ましくは、一方のプライマーの他方のプライマーと相補的な領域より３’側の領域に含まれる。一方、両方のプライマーが変異導入部位を含む場合、変異導入部位は、両方のプライマーの互いに相補的な領域に含まれ、互いに相補的な配列からなる。費用の点から、変異導入部位は、変異導入用プライマー対のいずれか一方のプライマーに含まれていることが好ましい。変異導入部位を含むプライマーにおいて、変異導入部位の３’末端側には、鋳型ＤＮＡとアニールするための塩基配列を含むことが好ましく、その長さは、特に限定されてないが、好ましくは５～３０塩基、より好ましくは１０～２５塩基、さらに好ましくは１５～２０塩基である。
好ましい変異導入用プライマー対の例としては、これに限定されるものではないが、鋳型ＤＮＡにアニールし、５’末端に互いに相補的な１５塩基程度の塩基配列を有し、一方のプライマーが、他方のプライマーと相補的な領域の３’末端側に変異導入部位を含み、さらにその３’末端側に１７塩基程度の塩基配列を含み、該他方のプライマーが該一方のプライマーと相補的な領域の３’末端側に９塩基の程度の塩基配列を含むプライマー対が挙げられる。
好ましい変異導入用プライマー対の例としては、これに限定されるものではないが、鋳型ＤＮＡにアニールし、５’末端に互いに相補的な１５塩基程度の塩基配列を有し、一方のプライマーが、他方のプライマーと相補的な領域の３’末端側に変異導入部位を含み、さらにその３’末端側に１７塩基程度の塩基配列を含み、該他方のプライマーが該一方のプライマーと相補的な領域の３’末端側に９塩基の程度の塩基配列を含むプライマー対が挙げられる。
【0026】
本発明の方法では、複数種の変異導入用プライマー対が用いられる。ここで、複数種とは、少なくとも２種類であり、好ましくは１０種類以上、より好ましくは２０種類以上、さらに好ましくは３０種類以上、なお好ましくは５０種類以上、さらになお好ましくは７０種類以上、さらになお好ましくは１００種類以上、さらになお好ましくは１５０種類以上、さらになお好ましくは２００種類以上、さらになお好ましくは３００種類以上であり、且つ好ましくは目的のＤＮＡの塩基配列において理論上導入できる変異の種類数以下である。複数種の変異導入用プライマー対は、それぞれ、目的のＤＮＡに異なる変異を導入するためのものであり、好ましくは目的のＤＮＡの異なる位置に変異を導入するためのものである。よって、複数種の変異導入用プライマー対は、目的のＤＮＡに対し、少なくとも２種類、好ましくは１０種類以上、より好ましくは２０種類以上、さらに好ましくは３０種類以上、なお好ましくは５０種類以上、さらになお好ましくは７０種類以上、さらになお好ましくは１００種類以上、さらになお好ましくは１５０種類以上、さらになお好ましくは２００種類以上、さらになお好ましくは３００種類以上、且つ好ましくは目的のＤＮＡの塩基配列において理論上導入できる変異の種類数以下の変異を導入する。また、複数種の変異導入用プライマー対は、目的のＤＮＡに対し、少なくとも２箇所、好ましくは１０箇所以上、より好ましくは２０箇所以上、さらに好ましくは３０箇所以上、なお好ましくは５０箇所以上、さらになお好ましくは７０箇所以上、さらになお好ましくは１００箇所以上、さらになお好ましくは１５０箇所以上、さらになお好ましくは２００箇所以上、さらになお好ましくは３００箇所以上、且つ好ましくは目的のＤＮＡの塩基配列において理論上変異を導入できる箇所数以下の変異を導入する。
【0027】
変異導入用プライマー対は、目的のＤＮＡの塩基配列及び導入する変異に相当する塩基配列に基づいて適宜設計することができる。プライマーの長さは、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができる長さであればよく、好ましくは１０～１００塩基、より好ましくは１５～５０塩基、さらに好ましくは２０～４０塩基の鎖長を有するものが挙げられる。プライマーは、特異的なアニーリング及び鎖伸長ができる限りにおいて、鋳型ＤＮＡとのミスマッチを含んでいてもよい。尚、プライマーは、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。
【0028】
本発明の方法において、「ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応」とは、各種ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅反応又は各種ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの複製反応であり得る。該反応は、当業者に周知の任意の方法を用いて行うことができる。本発明の方法で使用可能なＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型としてそれに相補的な塩基配列を有するＤＮＡ鎖を合成できる限り、いずれであってもよいが、目的外の変異導入の低減の点から、校正活性を有し、フィデリティの高いＤＮＡポリメラーゼが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼは市販されており、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）、ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） ＳｕｐｅｒＦｉ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）等を用いることができる。
【0029】
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応は、好適にはＰＣＲにより行うことができる。ＰＣＲは、市販のＰＣＲ用試薬や機器を用いて、常法に従って行うことができる。ＰＣＲの条件は、特に限定されず、ＰＣＲ毎に最適条件を定めればよいが、例えば、以下の条件が挙げられる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：通常９３～９５℃程度で、通常３秒間～１分間程度加熱する。
２）アニーリング：通常５０～６０℃程度で、通常１０秒間～１分間程度加熱する。
３）ＤＮＡ伸長反応：通常６０～７４℃程度で、通常１０秒間～５分間程度加熱する。
上記１）～３）の反応を１サイクルとして、これを通常３０サイクル以上、好ましくは３５サイクル以上、また、通常５０サイクル以下、好ましくは４５サイクル以下で行えばよい。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：通常９３～９５℃程度で、通常３秒間～１分間程度加熱する。
２）アニーリング：通常５０～６０℃程度で、通常１０秒間～１分間程度加熱する。
３）ＤＮＡ伸長反応：通常６０～７４℃程度で、通常１０秒間～５分間程度加熱する。
上記１）～３）の反応を１サイクルとして、これを通常３０サイクル以上、好ましくは３５サイクル以上、また、通常５０サイクル以下、好ましくは４５サイクル以下で行えばよい。
【0030】
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応は、複数種の変異導入用プライマー対を用いて、変異導入用プライマー対毎に行う。その結果、ＤＮＡ合成反応毎に、異なる変異が導入されたＤＮＡ断片が得られる。これらのＤＮＡ断片は、別個に工程（ｂ）に供してもよいし、混合して工程（ｂ）に供してもよいが、作業効率の点から、ＤＮＡ断片を混合して工程（ｂ）に供するのが好ましい。よって、本発明の方法は、工程（ａ）の後に続けて、得られたＤＮＡ断片を混合する工程を含み得る。
【0031】
ＤＮＡ合成反応後、必要に応じて、ＤｐｎＩ等のメチル化ＤＮＡのみを消化する制限酵素で処理し、鋳型ＤＮＡを除去してもよい。あるいは、ＤＮＡ合成反応に供する鋳型ＤＮＡの濃度を十分に低くすることで、ＤｐｎＩ処理を行わずに次の工程に進むことも可能である。また、ＤＮＡ合成反応後、必要に応じて、エタノール沈殿、電気泳動、カラム精製、ビーズ精製、アフィニティー精製などの通常の手段を用いてＤＮＡ断片を精製してもよい。
【0032】
斯くして得られたＤＮＡ断片は、典型的には、変異導入用プライマー対を構成する第一のプライマーに由来する伸長鎖と第二のプライマーに由来する伸長鎖からなる二本鎖の環状ＤＮＡを形成する、５’突出末端を有するＤＮＡ断片であって、該変異導入用プライマー対に含まれる変異導入部位に由来する変異を含む。
【0033】
あるいは、工程（ａ）として、以下の工程（ａ’）を行ってもよい。
（ａ’）鋳型ＤＮＡと変異導入用プライマー対とを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、塩基配列の一部が異なる複数種のＤＮＡの混合物であり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む。
（ａ’）鋳型ＤＮＡと変異導入用プライマー対とを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、塩基配列の一部が異なる複数種のＤＮＡの混合物であり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む。
【0034】
工程（ａ’）は、鋳型ＤＮＡと変異導入用プライマー対とを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程である。斯かる工程により、特定の部位に変異が導入されたＤＮＡ断片が得られる。
【0035】
「鋳型ＤＮＡ」は、塩基配列の一部、具体的には目的のＤＮＡの塩基配列の一部、が異なる複数種のＤＮＡの混合物であり、各鋳型ＤＮＡの具体的内容については前述のとおりである。ここで、複数種とは、少なくとも２種類、好ましくは５０種類以上、より好ましくは１００種類以上、さらに好ましくは３００種類以上、なお好ましくは５００種類以上、さらになお好ましくは１０００種類以上、さらになお好ましくは２０００種類以上、さらになお好ましくは３０００種類以上、さらになお好ましくは５０００種類以上、さらになお好ましくは１００００種類以上であり、且つ好ましくは目的のＤＮＡの塩基配列について理論上生じ得る全ての変異体の種類数以下である。鋳型ＤＮＡの種類数が増えるのに応じて、得られる変異ライブラリプールの多様性が高まる。
あるいは、鋳型ＤＮＡとして、本発明の方法で作製された変異ライブラリプール又は公知の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ）で作製された変異ライブラリプールを用いることもでき、これにより、より多様性の高い変異ライブラリプールを作製することが可能となる。
あるいは、鋳型ＤＮＡとして、本発明の方法で作製された変異ライブラリプール又は公知の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ）で作製された変異ライブラリプールを用いることもでき、これにより、より多様性の高い変異ライブラリプールを作製することが可能となる。
【0036】
「変異導入用プライマー対」は、鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む。変異導入用プライマー対の具体的内容については前述のとおりである。変異導入用プライマー対は、１種類のみを用いてもよいし、複数種を用いてもよい。ここで、複数種とは、少なくとも２種類であり、好ましくは１０種類以上、より好ましくは２０種類以上、さらに好ましくは３０種類以上、なお好ましくは５０種類以上、さらになお好ましくは７０種類以上、さらになお好ましくは１００種類以上、さらになお好ましくは１５０種類以上、さらになお好ましくは２００種類以上、さらになお好ましくは３００種類以上であり、且つ好ましくは目的のＤＮＡの塩基配列において理論上導入できる変異の種類数以下である。複数種の変異導入プライマー対を用いる場合は、変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行うことが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の具体的内容については前述のとおりである。
【0037】
本発明の方法において、工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程である。上述のとおり、工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片は、５’突出末端を有するＤＮＡ断片であり、各鎖の５’末端と３’末端は連結されていない。工程（ｂ）は、ＤＮＡ断片の各鎖の５’末端及び３’末端をそれぞれ連結させる工程であり、斯かる工程によりその後の形質転換効率を大幅に向上することができる。
【0038】
ＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程は、公知の方法に従い実施することができる。本発明の方法で使用可能なＤＮＡリガーゼとしては、特に限定されず、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ等が挙げられる。これらのＤＮＡリガーゼは市販されており、ＴＯＹＯＢＯ、タカラバイオ等から購入することができる。ＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応は、通常の手順で、例えば、酵素添付のプロトコルに従って実施することができる。反応条件は、酵素の至適条件や、基質であるＤＮＡ断片の量に従って適宜決定することができる。例えば、ライゲーション反応は、温度を４～２５℃、好ましくは１６℃に調製し、反応時間を５～６０分、好ましくは５～３０分間として実施することができる。あるいは、ライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ）等の市販のキットを利用して、キット添付のプロトコルに従い実施してもよい。
【0039】
ＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを効率よく作用させる手法としては、例えば、５’末端が予めリン酸化された変異導入用プライマー対を用いて工程（ａ）を行い、得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる手法が挙げられる。このとき、工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片の各鎖の５’末端にはリン酸基が存在するので、該ＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させることで、該ＤＮＡ断片の各鎖の５’末端と３’末端が効率よく連結される。また、５’末端がリン酸化されていない変異導入用プライマー対を用いて工程（ａ）を行い、得られたＤＮＡ断片にポリヌクレオチドキナーゼを作用させ、次いでＤＮＡリガーゼを作用させる手法が挙げられる。このとき、工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片の各鎖の５’末端にはリン酸基が存在しないが、ポリヌクレオチドキナーゼを作用させて該ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化してからＤＮＡリガーゼを作用させることで、該ＤＮＡ断片の各鎖の５’末端と３’末端が効率よく連結される。これらの手法は、ＤＮＡ断片をベクターにライゲーションする際等にＤＮＡリガーゼを効率よく作用させる手法としては知られていたが、本発明のように相補的プライマー対を用いて得られたＤＮＡ断片で宿主細胞を形質転換する際の形質転換効率を飛躍的に向上させることは知られておらず、全く意外であった。
【0040】
さらに、ＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを効率よく作用させる手法として、工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片に、ＤＮＡリガーゼに加え、５’エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて作用させる手法も挙げられ、５’末端がリン酸化されていない変異導入用プライマー対を用いて工程（ａ）を行った場合であっても、得られたＤＮＡ断片の各鎖の５’末端と３’末端が効率よく連結される。上記３種の酵素を含む試薬ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）が市販されている。該試薬は、様々なＤＮＡ断片のアセンブルを可能にすることは知られているが、本発明のように相補的プライマー対を用いて得られたＤＮＡ断片で宿主細胞を形質転換する際の形質転換効率を飛躍的に向上させることは知られておらず、全く意外であった。
【0041】
工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片毎に別個に工程（ｂ）を実施した場合、得られたＤＮＡは、別個のまま工程（ｃ）に供してもよいし、混合して工程（ｃ）に供してもよいが、作業効率の点から、ＤＮＡを混合して工程（ｃ）に供するのが好ましい。よって、本発明の方法は、工程（ｂ）の後に続けて、得られたＤＮＡを混合する工程を含み得る。
【0042】
工程（ｂ）で得られたＤＮＡは、必要に応じて、エタノール沈殿、電気泳動、カラム精製、ビーズ精製、アフィニティー精製などの通常の手段を用いて精製してもよい。
【0043】
本発明の方法において、工程（ｃ）は、工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程である。該工程により、変異が導入された目的のＤＮＡを含む形質転換体を得ることができる。
【0044】
宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。
【0045】
形質転換方法としては、エレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等の当該分野で通常使用される方法を用いることができる。形質転換が適切に行われた形質転換体（形質転換細胞）は、マーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標として選抜することができる。
【0046】
工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片毎に別個に工程（ｂ）及び（ｃ）を実施した場合、選抜された形質転換体は混合すればよい。よって、本発明の方法は、工程（ｃ）の後に続けて、得られた形質転換体を混合する工程を含み得る。
【0047】
選抜された各形質転換体は、それぞれ、異なる変異に起因する異なる塩基配列を含む目的のＤＮＡを含む菌体である。よって、選抜された形質転換体の混合物は、変異ライブラリプールを構成する。また、選抜された形質転換体の混合物から抽出したＤＮＡ、あるいは選抜された形質転換体から抽出したＤＮＡの混合物も、変異ライブラリプールを構成する。該ＤＮＡは、形質転換体又は形質転換体の混合物から当該分野における通常の方法を用いてＤＮＡを抽出又は単離することによって取得することができる。該抽出又は単離には、例えば、市販のＤＮＡ抽出キットなどを用いることができる。
【0048】
本発明の方法で作製される変異ライブラリプールを鋳型として、本発明の変異ライブラリプールの作製方法又は公知の変異ライブラリプール作製方法（例えば、エラープローンＰＣＲ）を行うことで、さらに多様性を高めた変異ライブラリプールを作製することができる。
【0049】
本発明の方法の好ましい一実施形態において、鋳型ＤＮＡは、変異を導入したいタンパク質をコードするＤＮＡを含む。変異導入用プライマー対の少なくとも一方に含まれる変異導入部位は、該タンパク質の特定の位置のアミノ酸残基を置換変異させる塩基配列からなるように構成することが好ましく、該塩基配列としてＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＢ、ＮＮＮ、ＮＤＴ、ＤＢＫ等を用いることがより好ましい。変異導入部位の塩基配列をＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＢ、ＮＮＮ、ＮＤＴ又はＤＢＫとすることにより、複数種類のアミノ酸残基を指定するコドンを導入することができ、特に、変異導入部位の塩基配列をＮＮＫ、ＮＮＳ又はＮＮＢとすることにより、２０種類のアミノ酸残基を指定するコドン及び終止コドンを網羅的に導入し、且つ終止コドンの発生確率を下げることができる。鋳型ＤＮＡと上記の変異導入部位の塩基配列をＮＮＫ、ＮＮＳ又はＮＮＢとした変異導入用プライマー対とを用いてＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行って得られるＤＮＡ断片は、該タンパク質の特定の位置のアミノ酸残基をコードするコドンが、本来のアミノ酸残基をコードするコドンか、本来のアミノ酸残基以外のいずれかのアミノ酸残基をコードするコドンか、終止コドンであるＤＮＡ断片の混合物であり、該タンパク質の特定の位置のアミノ酸残基に関して飽和変異が導入されたことになる。よって、上記の変異導入部位の塩基配列をＮＮＫ、ＮＮＳ又はＮＮＢとした変異導入用プライマー対の種類数を増やせば、該タンパク質のアミノ酸配列において飽和変異が導入されたアミノ酸残基を増やすことにつながる、ここで、上記の変異導入用プライマー対の種類数としては、好ましくは少なくとも２種類、より好ましくは１０種類以上、さらに好ましくは２０種類以上、なお好ましくは３０種類以上、さらになお好ましくは５０種類以上、さらになお好ましくは７０種類以上、さらになお好ましくは１００種類以上、さらになお好ましくは１５０種類以上、さらになお好ましくは２００種類以上、さらになお好ましくは３００種類以上であり、且つ好ましくは該タンパク質のアミノ酸残基数分の種類以下である。該タンパク質の各位置のアミノ酸残基のそれぞれについて上記の変異導入部位の塩基配列をＮＮＫ、ＮＮＳ又はＮＮＢとした変異導入用プライマー対（すなわち、該タンパク質のアミノ酸残基数分の変異導入用プライマー対）を用いれば、該タンパク質の単変異ライブラリプールを作製することができる。また、該単変異ライブラリプールを鋳型ＤＮＡとすることで、該タンパク質の二重変異ライブラリプールも作製することができる。
【0050】
本発明の方法で作製される変異ライブラリプールは、好ましくは１０4以上、より好ましくは１０5以上、さらに好ましくは１０6以上、なお好ましくは１０7以上のＤＮＡ配列多様性を有する。尚、ＤＮＡ配列多様性は、例えば、変異ライブラリプールを構成する各メンバーの塩基配列をシーケンスし、得られたシーケンスデータに基づいて確認することができる。また、ＤＮＡ配列多様性は、鋳型ＤＮＡの種類数、変異導入用プライマー対の種類数、該変異導入用プライマー対で導入される変異の種類数等に基づいて概算される理論上のＤＮＡ配列多様性として表し得る。一例において、全長５００アミノ酸のタンパク質をコードするＤＮＡに対して、単一の全アミノ酸残基にそれぞれ変異導入部位の塩基配列をＮＮＫとした変異導入用プライマー対を用いて飽和変異導入を行う場合、ＮＮＫで表される配列は４×４×２＝３２通りの配列を含むため、得られる単変異ライブラリプールの理論上のＤＮＡ配列多様性は、５００×３２＝１．６×１０4と概算できる。別の一例において、全長５００アミノ酸をコードするＤＮＡに対して、全組み合わせの２アミノ酸残基にそれぞれ変異導入部位の塩基配列をＮＮＫとした変異導入用プライマー対を用いて飽和変異導入を行う場合、得られる二重変異ライブラリプールの理論上のＤＮＡ配列多様性は、500Ｃ2×３２2＝約１．３×１０8と概算できる。
【0051】
後記実施例に示すように、本発明の方法で得られた全長４８３アミノ酸のタンパク質に関する単変異ライブラリプールは、その理論上のＤＮＡ配列多様性が約１．５×１０4、アミノ酸配列多様性が約９．２×１０3であるところ、形質転換効率から求めたライブラリサイズは２．７×１０8であり、全ての単変異からなる多様性を十分に網羅できる高い多様性を有していた。この多様性は、変異ライブラリプール作製に従来利用されているエラープローンＰＣＲで作製可能な単変異ライブラリプールの多様性の理論値と比較して３倍以上も高い。また、該単変異ライブラリプールの平均変異導入数は、０．９１であり、理論値の１に近い良好な値であった。さらに、該単変異ライブラリプールは、理論上のＤＮＡ配列多様性の８０％という高いカバレッジを有していた。一方、同タンパク質に関する二重変異ライブラリプールは、その理論上のＤＮＡ配列多様性が約１．１×１０8、アミノ酸配列多様性が約４．２×１０7であるところ、形質転換効率から求めたライブラリサイズは９．５×１０7であり、全ての二重変異からなる多様性の大部分を網羅できる高い多様性を有していた。また、該二重変異ライブラリプールの平均変異導入数は、１．７３であり、理論値の２に近い良好な値であった。さらに、該二重変異ライブラリプールは、理論上のＤＮＡ配列多様性の８０％という高いカバレッジを有していた。斯様に、本発明の方法で得られる変異ライブラリプールは、多様性が高く且つ目的変異を幅広く含む。
【0052】
斯かる変異ライブラリプールを用いることで、ＤＮＡ配列の有する機能解析や機能向上のためのスクリーニングが可能となる。例えば、本発明の方法で作製される変異ライブラリプールから、所望の性質を指標として、該所望の性質を有するＤＮＡを選抜することができる。ここで、ＤＮＡの「性質」は、コードするポリペプチド（例えば、酵素）の活性、コードするポリペプチドの安定性、コードするポリペプチドの発現量、コードするプロモーターの活性、該ＤＮＡが含まれるプラスミドのコピー数、該ＤＮＡが含まれるプラスミド上の該ＤＮＡとは異なる領域のＤＮＡがコードするポリペプチドの発現量等で表され得る。よって、例えば、コードするポリペプチドの活性が高い若しくは低い、コードするポリペプチドの安定性が高い若しくは低い、コードするポリペプチドの発現量が多い若しくは少ない、コードするプロモーターの活性が高い若しくは低い、該ＤＮＡが含まれるプラスミドのコピー数が多い若しくは少ない、又は該ＤＮＡが含まれるプラスミド上の該ＤＮＡとは異なる領域のＤＮＡがコードするポリペプチドの発現量が多い若しくは少ないＤＮＡの選抜が可能である。変異ライブラリプールからの所望の性質を有するＤＮＡの選抜は、該所望の性質に応じて適宜常法に従って実施することができる。
【0053】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【0054】
〔１〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
〔２〕好ましくは少なくとも２種、より好ましくは１０種類以上、さらに好ましくは２０種類以上、なお好ましくは３０種類以上、さらになお好ましくは５０種類以上、さらになお好ましくは７０種類以上、さらになお好ましくは１００種類以上、さらになお好ましくは１５０種類以上、さらになお好ましくは２００種類以上、さらになお好ましくは３００種類以上の前記変異導入用プライマー対を用いる、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記鋳型ＤＮＡが、好ましくは塩基配列の一部が異なる複数種、すなわち少なくとも２種類、より好ましくは５０種類以上、さらに好ましくは１００種類以上、なお好ましくは３００種類以上、さらになお好ましくは５００種類以上、さらになお好ましくは１０００種類以上、さらになお好ましくは２０００種類以上、さらになお好ましくは３０００種類以上、さらになお好ましくは５０００種類以上、さらになお好ましくは１００００種類以上のＤＮＡの混合物である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片を混合する工程、前記工程（ｂ）で得られたＤＮＡを混合する工程、又は前記工程（ｃ）で得られた形質転換体を混合する工程をさらに含む、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記鋳型ＤＮＡが、好ましくは変異を導入したいタンパク質をコードするＤＮＡを含む、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記変異導入部位の塩基配列が、好ましくはＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＢ、ＮＮＮ、ＮＤＴ又はＤＢＫであり、より好ましくはＮＮＫ、ＮＮＳ又はＮＮＢである、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕好ましくは前記タンパク質のアミノ酸残基数分の種類の前記変異導入用プライマー対を用いる、〔５〕又は〔６〕記載の方法。
〔８〕前記変異ライブラリプールのＤＮＡ配列多様性が、好ましくは１０4以上、より好ましくは１０5以上、さらに好ましくは１０6以上、なお好ましくは１０7以上である、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法で作製された変異ライブラリプールであり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
〔２〕好ましくは少なくとも２種、より好ましくは１０種類以上、さらに好ましくは２０種類以上、なお好ましくは３０種類以上、さらになお好ましくは５０種類以上、さらになお好ましくは７０種類以上、さらになお好ましくは１００種類以上、さらになお好ましくは１５０種類以上、さらになお好ましくは２００種類以上、さらになお好ましくは３００種類以上の前記変異導入用プライマー対を用いる、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記鋳型ＤＮＡが、好ましくは塩基配列の一部が異なる複数種、すなわち少なくとも２種類、より好ましくは５０種類以上、さらに好ましくは１００種類以上、なお好ましくは３００種類以上、さらになお好ましくは５００種類以上、さらになお好ましくは１０００種類以上、さらになお好ましくは２０００種類以上、さらになお好ましくは３０００種類以上、さらになお好ましくは５０００種類以上、さらになお好ましくは１００００種類以上のＤＮＡの混合物である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片を混合する工程、前記工程（ｂ）で得られたＤＮＡを混合する工程、又は前記工程（ｃ）で得られた形質転換体を混合する工程をさらに含む、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記鋳型ＤＮＡが、好ましくは変異を導入したいタンパク質をコードするＤＮＡを含む、〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記変異導入部位の塩基配列が、好ましくはＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＢ、ＮＮＮ、ＮＤＴ又はＤＢＫであり、より好ましくはＮＮＫ、ＮＮＳ又はＮＮＢである、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕好ましくは前記タンパク質のアミノ酸残基数分の種類の前記変異導入用プライマー対を用いる、〔５〕又は〔６〕記載の方法。
〔８〕前記変異ライブラリプールのＤＮＡ配列多様性が、好ましくは１０4以上、より好ましくは１０5以上、さらに好ましくは１０6以上、なお好ましくは１０7以上である、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法で作製された変異ライブラリプールであり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
【0055】
〔１０〕以下の工程（ａ’）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：
（ａ’）鋳型ＤＮＡと変異導入用プライマー対とを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、塩基配列の一部が異なる複数種のＤＮＡの混合物であり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ’）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
〔１１〕前記鋳型ＤＮＡが、好ましくは塩基配列の一部が異なる少なくとも２種類、より好ましくは５０種類以上、さらに好ましくは１００種類以上、なお好ましくは３００種類以上、さらになお好ましくは５００種類以上、さらになお好ましくは１０００種類以上、さらになお好ましくは２０００種類以上、さらになお好ましくは３０００種類以上、さらになお好ましくは５０００種類以上、さらになお好ましくは１００００種類以上のＤＮＡの混合物である、〔１０〕記載の方法。
〔１２〕前記鋳型ＤＮＡが〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法で作製された変異ライブラリプールである、〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは少なくとも２種、より好ましくは１０種類以上、さらに好ましくは２０種類以上、なお好ましくは３０種類以上、さらになお好ましくは５０種類以上、さらになお好ましくは７０種類以上、さらになお好ましくは１００種類以上、さらになお好ましくは１５０種類以上、さらになお好ましくは２００種類以上、さらになお好ましくは３００種類以上の前記変異導入用プライマー対を用い、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行う、〔１０〕～〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
〔１４〕前記工程（ａ’）で得られたＤＮＡ断片を混合する工程、前記工程（ｂ）で得られたＤＮＡを混合する工程、又は前記工程（ｃ）で得られた形質転換体を混合する工程をさらに含む、〔１３〕記載の方法。
〔１５〕前記鋳型ＤＮＡが、好ましくは変異を導入したいタンパク質をコードするＤＮＡを含む、〔１０〕～〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕前記変異導入部位の塩基配列が、好ましくはＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＢ、ＮＮＮ、ＮＤＴ又はＤＢＫであり、より好ましくはＮＮＫ、ＮＮＳ又はＮＮＢである、〔１０〕～〔１５〕のいずれか１項記載の方法。
〔１７〕好ましくは前記タンパク質のアミノ酸残基数分の種類の前記変異導入用プライマー対を用いる、〔１５〕又は〔１６〕記載の方法。
〔１８〕作製される前記変異ライブラリプールのＤＮＡ配列多様性が、好ましくは１０4以上、より好ましくは１０5以上、さらに好ましくは１０6以上、なお好ましくは１０7以上である、〔１０〕～〔１７〕のいずれか１項記載の方法。
（ａ’）鋳型ＤＮＡと変異導入用プライマー対とを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該鋳型ＤＮＡは、塩基配列の一部が異なる複数種のＤＮＡの混合物であり、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；
（ｂ）工程（ａ’）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
〔１１〕前記鋳型ＤＮＡが、好ましくは塩基配列の一部が異なる少なくとも２種類、より好ましくは５０種類以上、さらに好ましくは１００種類以上、なお好ましくは３００種類以上、さらになお好ましくは５００種類以上、さらになお好ましくは１０００種類以上、さらになお好ましくは２０００種類以上、さらになお好ましくは３０００種類以上、さらになお好ましくは５０００種類以上、さらになお好ましくは１００００種類以上のＤＮＡの混合物である、〔１０〕記載の方法。
〔１２〕前記鋳型ＤＮＡが〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法で作製された変異ライブラリプールである、〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。
〔１３〕好ましくは少なくとも２種、より好ましくは１０種類以上、さらに好ましくは２０種類以上、なお好ましくは３０種類以上、さらになお好ましくは５０種類以上、さらになお好ましくは７０種類以上、さらになお好ましくは１００種類以上、さらになお好ましくは１５０種類以上、さらになお好ましくは２００種類以上、さらになお好ましくは３００種類以上の前記変異導入用プライマー対を用い、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行う、〔１０〕～〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
〔１４〕前記工程（ａ’）で得られたＤＮＡ断片を混合する工程、前記工程（ｂ）で得られたＤＮＡを混合する工程、又は前記工程（ｃ）で得られた形質転換体を混合する工程をさらに含む、〔１３〕記載の方法。
〔１５〕前記鋳型ＤＮＡが、好ましくは変異を導入したいタンパク質をコードするＤＮＡを含む、〔１０〕～〔１４〕のいずれか１項記載の方法。
〔１６〕前記変異導入部位の塩基配列が、好ましくはＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＢ、ＮＮＮ、ＮＤＴ又はＤＢＫであり、より好ましくはＮＮＫ、ＮＮＳ又はＮＮＢである、〔１０〕～〔１５〕のいずれか１項記載の方法。
〔１７〕好ましくは前記タンパク質のアミノ酸残基数分の種類の前記変異導入用プライマー対を用いる、〔１５〕又は〔１６〕記載の方法。
〔１８〕作製される前記変異ライブラリプールのＤＮＡ配列多様性が、好ましくは１０4以上、より好ましくは１０5以上、さらに好ましくは１０6以上、なお好ましくは１０7以上である、〔１０〕～〔１７〕のいずれか１項記載の方法。
【0056】
〔１９〕〔１〕～〔１８〕のいずれか１項記載の方法で作製された変異ライブラリプール。
〔２０〕ＤＮＡ配列多様性が、好ましくは１０4以上、より好ましくは１０5以上、さらに好ましくは１０6以上、なお好ましくは１０7以上である、〔１９〕記載の変異ライブラリプール。
〔２０〕ＤＮＡ配列多様性が、好ましくは１０4以上、より好ましくは１０5以上、さらに好ましくは１０6以上、なお好ましくは１０7以上である、〔１９〕記載の変異ライブラリプール。
【0057】
〔２１〕所望の性質を有するＤＮＡのスクリーニング方法であって、〔１〕～〔１８〕のいずれか１項記載の方法で作製された変異ライブラリプールから、所望の性質を指標として、該所望の性質を有するＤＮＡを選抜する工程を含む、方法。
〔２２〕前記ＤＮＡの性質が、コードするポリペプチドの活性、コードするポリペプチドの安定性、コードするポリペプチドの発現量、コードするプロモーターの活性、該ＤＮＡが含まれるプラスミドのコピー数、又は該ＤＮＡが含まれるプラスミド上の該ＤＮＡとは異なる領域のＤＮＡがコードするポリペプチドの発現量で表される性質である、〔２１〕記載の方法。
〔２２〕前記ＤＮＡの性質が、コードするポリペプチドの活性、コードするポリペプチドの安定性、コードするポリペプチドの発現量、コードするプロモーターの活性、該ＤＮＡが含まれるプラスミドのコピー数、又は該ＤＮＡが含まれるプラスミド上の該ＤＮＡとは異なる領域のＤＮＡがコードするポリペプチドの発現量で表される性質である、〔２１〕記載の方法。
【実施例】
【0058】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0059】
実施例１ 飽和変異導入用プライマー対の設計
変異導入アミノ酸のコドンに、その上流１５塩基、下流１７塩基を加えた計３５塩基において、変異導入アミノ酸のコドンをＮＮＫに変更した配列をフォワードプライマーとした。変異導入アミノ酸のコドンの上流２４塩基の相補配列をリバースプライマーとした。よって、プライマー対は、変異導入アミノ酸のコドンの上流１５塩基の部分で互いに相補的になっている。一例として、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）においてアンピシリン耐性遺伝子としてコードされるβラクタマーゼの２４残基目のヒスチジンに飽和変異を導入するためのプライマー設計の概略を図１に示す。βラクタマーゼのアミノ酸配列を配列番号１に、βラクタマーゼをコードする塩基配列を配列番号２に、βラクタマーゼの２４残基目のヒスチジンに飽和変異を導入するためのフォワードプライマー（CTTCCTGTTTTTGCTNNKCCAGAAACGCTGGTGAA）及びリバースプライマー（AGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGC）の塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
変異導入アミノ酸のコドンに、その上流１５塩基、下流１７塩基を加えた計３５塩基において、変異導入アミノ酸のコドンをＮＮＫに変更した配列をフォワードプライマーとした。変異導入アミノ酸のコドンの上流２４塩基の相補配列をリバースプライマーとした。よって、プライマー対は、変異導入アミノ酸のコドンの上流１５塩基の部分で互いに相補的になっている。一例として、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）においてアンピシリン耐性遺伝子としてコードされるβラクタマーゼの２４残基目のヒスチジンに飽和変異を導入するためのプライマー設計の概略を図１に示す。βラクタマーゼのアミノ酸配列を配列番号１に、βラクタマーゼをコードする塩基配列を配列番号２に、βラクタマーゼの２４残基目のヒスチジンに飽和変異を導入するためのフォワードプライマー（CTTCCTGTTTTTGCTNNKCCAGAAACGCTGGTGAA）及びリバースプライマー（AGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGC）の塩基配列をそれぞれ配列番号３及び４に示す。
【0060】
実施例２ 相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的変異導入
プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫにおいてアンピシリン耐性遺伝子としてコードされるβラクタマーゼの２４残基目、２５残基目、２６残基目に飽和変異を導入するためのプライマー合計６配列をそれぞれ実施例１と同様に設計し、オリゴＤＮＡを合成した。ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）の推奨プロトコルに従って、鋳型ＤＮＡであるプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫと各プライマー対を用いてＰＣＲ反応を行った。電気泳動により目的断片の増幅を確認後、すべてのＰＣＲ反応液を混合してＤｐｎＩで鋳型を消化した後にハイピュアＰＣＲプロダクトピュアリフィケイションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲ断片を精製した。このＤＮＡ １００ｎｇを用いて、ライブラリ構築用の高効率大腸菌コンピテントセルであるＥ． ｃｌｏｎｉ（Ｒ） １０Ｇ ＳＵＰＲＥＭＥ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（ＳＯＬＯｓ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）への形質転換をキット推奨プロトコルに従って行った。鋳型としたプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫはアンピシリン耐性遺伝子とは別にテトラサイクリン耐性遺伝子を含むため、アンピシリン耐性が失われた場合にもテトラサイクリン含有培地にて増殖が可能である。形質転換後の菌液を適宣希釈してテトラサイクリン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした後に形成されたコロニーをカウントすることで形質転換効率（ＣＦＵ）を求めた。形質転換効率は８．２×１０4ＣＦＵであった。これは１０5以上の多様性を有する変異ライブラリプールの構築には不十分な形質転換効率である。
プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫにおいてアンピシリン耐性遺伝子としてコードされるβラクタマーゼの２４残基目、２５残基目、２６残基目に飽和変異を導入するためのプライマー合計６配列をそれぞれ実施例１と同様に設計し、オリゴＤＮＡを合成した。ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）の推奨プロトコルに従って、鋳型ＤＮＡであるプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫと各プライマー対を用いてＰＣＲ反応を行った。電気泳動により目的断片の増幅を確認後、すべてのＰＣＲ反応液を混合してＤｐｎＩで鋳型を消化した後にハイピュアＰＣＲプロダクトピュアリフィケイションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲ断片を精製した。このＤＮＡ １００ｎｇを用いて、ライブラリ構築用の高効率大腸菌コンピテントセルであるＥ． ｃｌｏｎｉ（Ｒ） １０Ｇ ＳＵＰＲＥＭＥ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（ＳＯＬＯｓ）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）への形質転換をキット推奨プロトコルに従って行った。鋳型としたプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫはアンピシリン耐性遺伝子とは別にテトラサイクリン耐性遺伝子を含むため、アンピシリン耐性が失われた場合にもテトラサイクリン含有培地にて増殖が可能である。形質転換後の菌液を適宣希釈してテトラサイクリン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした後に形成されたコロニーをカウントすることで形質転換効率（ＣＦＵ）を求めた。形質転換効率は８．２×１０4ＣＦＵであった。これは１０5以上の多様性を有する変異ライブラリプールの構築には不十分な形質転換効率である。
【0061】
実施例３ 形質転換効率の向上１
実施例２におけるプライマーの５’末端を事前にリン酸化修飾して、同様にＰＣＲ断片を調製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）の推奨プロトコルに従ってＰＣＲ断片のライゲーション反応を行い、エタノール沈殿により精製した。このＤＮＡ １００ｎｇを用いて、実施例２と同様に形質転換を行い、形質転換効率を求めた。形質転換効率は３．８×１０6ＣＦＵであった。複数のコロニーについてプラスミドの配列を確認したところ、βラクタマーゼの２４残基目、２５残基目、２６残基目のいずれかに変異が導入されていた。
以上の結果から、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的変異導入法において、ライゲーション反応を組み合わせることで形質転換効率が飛躍的に向上し、大規模な変異ライブラリプールの調製が可能であることが示された。
実施例２におけるプライマーの５’末端を事前にリン酸化修飾して、同様にＰＣＲ断片を調製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）の推奨プロトコルに従ってＰＣＲ断片のライゲーション反応を行い、エタノール沈殿により精製した。このＤＮＡ １００ｎｇを用いて、実施例２と同様に形質転換を行い、形質転換効率を求めた。形質転換効率は３．８×１０6ＣＦＵであった。複数のコロニーについてプラスミドの配列を確認したところ、βラクタマーゼの２４残基目、２５残基目、２６残基目のいずれかに変異が導入されていた。
以上の結果から、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的変異導入法において、ライゲーション反応を組み合わせることで形質転換効率が飛躍的に向上し、大規模な変異ライブラリプールの調製が可能であることが示された。
【0062】
実施例４ 形質転換効率の向上２
実施例２における精製済みＰＣＲ断片を、５’エキソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＤＮＡリガーゼ活性を含むＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と等量で混合し、５０℃で１時間インキュベートした後にエタノール沈殿により精製した。このＤＮＡ １００ｎｇを用いて、実施例２と同様に形質転換を行い、形質転換効率を求めた。形質転換効率は９．３×１０7ＣＦＵであった。複数のコロニーについてプラスミドの配列を確認したところ、βラクタマーゼの２４残基目、２５残基目、２６残基目のいずれかに変異が導入されていた。
以上の結果から、５’エキソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡリガーゼ活性を組み合わせることで、リン酸化修飾の無い相補的プライマー対を用いたＰＣＲ産物においても形質転換効率が飛躍的に向上し、大規模な変異ライブラリプールの調製が可能であることが示された。
実施例２における精製済みＰＣＲ断片を、５’エキソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＤＮＡリガーゼ活性を含むＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と等量で混合し、５０℃で１時間インキュベートした後にエタノール沈殿により精製した。このＤＮＡ １００ｎｇを用いて、実施例２と同様に形質転換を行い、形質転換効率を求めた。形質転換効率は９．３×１０7ＣＦＵであった。複数のコロニーについてプラスミドの配列を確認したところ、βラクタマーゼの２４残基目、２５残基目、２６残基目のいずれかに変異が導入されていた。
以上の結果から、５’エキソヌクレアーゼ活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡリガーゼ活性を組み合わせることで、リン酸化修飾の無い相補的プライマー対を用いたＰＣＲ産物においても形質転換効率が飛躍的に向上し、大規模な変異ライブラリプールの調製が可能であることが示された。
【0063】
実施例５ ＹＲ２８８ｄＲＴ発現プラスミドの構築
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＹＲ２８８株由来のαアミラーゼ（ＷＰ＿１００３４６３６２．１）のＲ１７８位及びＴ１８０位を欠失させた４８３アミノ酸から成る変異体であるＹＲ２８８ｄＲＴのアミノ酸配列を配列番号５に、ＹＲ２８８ｄＲＴをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。ｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を鋳型にプライマーｓｔｏｐ＿ｐＥＴ２２ｂ＿ｆｗ（TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC：配列番号７）及びｐｅｌＢ＿ｒｖ（GGCCATCGCCGGCTGGGC：配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、ＰｅｌＢシグナルとｓｔｏｐコドンを含むベクター断片を増幅した。また、ＹＲ２８８ｄＲＴをコードするＤＮＡを鋳型にプライマーｐｅｌＢ＿ＹＲ２８８＿ｆｗ（CAGCCGGCGATGGCCGCAGCTCAAAACGGTACGATGATGCAG：配列番号９）及びｐＥＴ２２ｂ＿ＹＲ２８８＿ｒｖ（AGCAGCCGGATCTCACTGTTGAACGTACACGGAGACTGAGC：配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、ＹＲ２８８ｄＲＴをコードする断片を増幅した。これらの断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）によってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行い、得られたＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を大腸菌ＥＣＯＳＴＭ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ α（ニッポンジーン）に形質転換してプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴを構築した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＹＲ２８８株由来のαアミラーゼ（ＷＰ＿１００３４６３６２．１）のＲ１７８位及びＴ１８０位を欠失させた４８３アミノ酸から成る変異体であるＹＲ２８８ｄＲＴのアミノ酸配列を配列番号５に、ＹＲ２８８ｄＲＴをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号６に示す。ｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を鋳型にプライマーｓｔｏｐ＿ｐＥＴ２２ｂ＿ｆｗ（TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC：配列番号７）及びｐｅｌＢ＿ｒｖ（GGCCATCGCCGGCTGGGC：配列番号８）を用いてＰＣＲを行い、ＰｅｌＢシグナルとｓｔｏｐコドンを含むベクター断片を増幅した。また、ＹＲ２８８ｄＲＴをコードするＤＮＡを鋳型にプライマーｐｅｌＢ＿ＹＲ２８８＿ｆｗ（CAGCCGGCGATGGCCGCAGCTCAAAACGGTACGATGATGCAG：配列番号９）及びｐＥＴ２２ｂ＿ＹＲ２８８＿ｒｖ（AGCAGCCGGATCTCACTGTTGAACGTACACGGAGACTGAGC：配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、ＹＲ２８８ｄＲＴをコードする断片を増幅した。これらの断片を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）によってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行い、得られたＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を大腸菌ＥＣＯＳＴＭ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５ α（ニッポンジーン）に形質転換してプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴを構築した。
【0064】
実施例６ ＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプールの作製
ｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴを鋳型としてＹＲ２８８ｄＲＴの全長４８３アミノ酸に飽和変異を導入するためのプライマー、１アミノ酸残基あたりフォワードプライマーとリバースプライマーの２配列の合計９６６配列をそれぞれ実施例１と同様に設計し、オリゴＤＮＡを合成した。例として、ＹＲ２８８ｄＲＴの１０残基目のチロシンに飽和変異を導入するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１１（GGTACGATGATGCAGNNKTTTGAATGGTATGTACC）及び１２（CTGCATCATCGTACCGTTTTGAGC）に示す。ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）の推奨プロトコルに従って、鋳型ＤＮＡであるプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴと各プライマー対を用いて合計４８３本のＰＣＲ反応を行った。電気泳動により目的断片の増幅を確認後、すべてのＰＣＲ反応液を混合してＤｐｎＩで鋳型を消化した後にハイピュアＰＣＲプロダクトピュアリフィケイションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲ断片を精製した。精製した断片をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と等量で混合し、５０℃で１時間インキュベートした後にエタノール沈殿により精製した。このＤＮＡ １μｇを用いて、実施例２と同様に形質転換を行った。形質転換後の菌液１μＬを適宣希釈してアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした後に形成されたコロニーをカウントすることで形質転換効率（ＣＦＵ）を求めた。残りの菌液全量（約１ｍＬ）を２０ｍＬの５０ｐｐｍ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ含有ＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養した後にプラスミドを抽出し、ＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプールとした。ＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプールの理論上のＤＮＡ配列多様性は１．５×１０4、アミノ酸配列多様性は９．２×１０3であり、形質転換効率から求めたライブラリサイズは２．７×１０8であった。この結果から、作成した変異ライブラリプールはすべての単変異から成る多様性を十分に網羅できると考えられた。
ｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴを鋳型としてＹＲ２８８ｄＲＴの全長４８３アミノ酸に飽和変異を導入するためのプライマー、１アミノ酸残基あたりフォワードプライマーとリバースプライマーの２配列の合計９６６配列をそれぞれ実施例１と同様に設計し、オリゴＤＮＡを合成した。例として、ＹＲ２８８ｄＲＴの１０残基目のチロシンに飽和変異を導入するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーの塩基配列をそれぞれ配列番号１１（GGTACGATGATGCAGNNKTTTGAATGGTATGTACC）及び１２（CTGCATCATCGTACCGTTTTGAGC）に示す。ＫＯＤ Ｏｎｅ（ＴＯＹＯＢＯ）の推奨プロトコルに従って、鋳型ＤＮＡであるプラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴと各プライマー対を用いて合計４８３本のＰＣＲ反応を行った。電気泳動により目的断片の増幅を確認後、すべてのＰＣＲ反応液を混合してＤｐｎＩで鋳型を消化した後にハイピュアＰＣＲプロダクトピュアリフィケイションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲ断片を精製した。精製した断片をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と等量で混合し、５０℃で１時間インキュベートした後にエタノール沈殿により精製した。このＤＮＡ １μｇを用いて、実施例２と同様に形質転換を行った。形質転換後の菌液１μＬを適宣希釈してアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした後に形成されたコロニーをカウントすることで形質転換効率（ＣＦＵ）を求めた。残りの菌液全量（約１ｍＬ）を２０ｍＬの５０ｐｐｍ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ含有ＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養した後にプラスミドを抽出し、ＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプールとした。ＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプールの理論上のＤＮＡ配列多様性は１．５×１０4、アミノ酸配列多様性は９．２×１０3であり、形質転換効率から求めたライブラリサイズは２．７×１０8であった。この結果から、作成した変異ライブラリプールはすべての単変異から成る多様性を十分に網羅できると考えられた。
【0065】
実施例７ ＹＲ２８８ｄＲＴ二重変異ライブラリプールの作製
鋳型ＤＮＡとして実施例６で作製したＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプールを用い、実施例６で用いたものと同じプライマーセットを用いて合計４８３本のＰＣＲ反応を行った。電気泳動により目的断片の増幅を確認後、すべてのＰＣＲ反応液を混合してＤｐｎＩで鋳型を消化した後にハイピュアＰＣＲプロダクトピュアリフィケイションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲ断片を精製した。精製した断片をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と等量で混合し、５０℃で１時間インキュベートした後にエタノール沈殿により精製した。このＤＮＡ １μｇを用いて、実施例２と同様に形質転換を行った。形質転換後の菌液１μＬを適宣希釈してアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした後に形成されたコロニーをカウントすることで形質転換効率（ＣＦＵ）を求めた。残りの菌液全量（約１ｍＬ）を２０ｍＬの５０ｐｐｍ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ含有ＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養した後にプラスミドを抽出し、ＹＲ２８８ｄＲＴ二重変異ライブラリプールとした。ＹＲ２８８ｄＲＴ二重変異ライブラリプールの理論上のＤＮＡ配列多様性は１．２×１０8、アミノ酸配列多様性は４．２×１０7であり、形質転換効率から求めたライブラリサイズは９．５×１０7であった。この結果から、作成した変異ライブラリプールはすべての二重変異から成る多様性の大部分を網羅できると考えられた。
鋳型ＤＮＡとして実施例６で作製したＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプールを用い、実施例６で用いたものと同じプライマーセットを用いて合計４８３本のＰＣＲ反応を行った。電気泳動により目的断片の増幅を確認後、すべてのＰＣＲ反応液を混合してＤｐｎＩで鋳型を消化した後にハイピュアＰＣＲプロダクトピュアリフィケイションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＰＣＲ断片を精製した。精製した断片をＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と等量で混合し、５０℃で１時間インキュベートした後にエタノール沈殿により精製した。このＤＮＡ １μｇを用いて、実施例２と同様に形質転換を行った。形質転換後の菌液１μＬを適宣希釈してアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした後に形成されたコロニーをカウントすることで形質転換効率（ＣＦＵ）を求めた。残りの菌液全量（約１ｍＬ）を２０ｍＬの５０ｐｐｍ Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ含有ＬＢ培地に植菌して３７℃で一晩培養した後にプラスミドを抽出し、ＹＲ２８８ｄＲＴ二重変異ライブラリプールとした。ＹＲ２８８ｄＲＴ二重変異ライブラリプールの理論上のＤＮＡ配列多様性は１．２×１０8、アミノ酸配列多様性は４．２×１０7であり、形質転換効率から求めたライブラリサイズは９．５×１０7であった。この結果から、作成した変異ライブラリプールはすべての二重変異から成る多様性の大部分を網羅できると考えられた。
【0066】
実施例８ ＹＲ２８８ｄＲＴ変異ライブラリプールの品質確認
ｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴ、実施例６で作製したＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプール及び実施例７で作製したＹＲ２８８ｄＲＴ二重変異ライブラリプールを鋳型として、プライマーｐＥＴ２２ｂ＿ＮＧＳ＿ｆｗ（GCGAAATTAATACGACTCACTATAG：配列番号１３）及びｐＥＴ２２ｂ＿ＮＧＳ＿ｒｖ（GCCAATCCGGATATAGTTCC：配列番号１４）を用いてそれぞれＰＣＲを行い、ＹＲ２８８ｄＲＴ（及びその変異体）のコード領域全長を含む断片を増幅した。各ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供した後にゲルの目的バンド部分のみを切り出し、ハイピュアＰＣＲプロダクトピュアリフィケイションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製した。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標） ｄｓＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の推奨プロトコルに従ってそれぞれ断片化を行い、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ（商標） ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の推奨プロトコルに従って次世代シーケンサー用ライブラリを調製した。ＧｅｎＮｅｘｔ ＮＧＳ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）によって濃度を測定した後、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ ｖ２（３００－ｃｙｃｌｅｓ）（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＭｉＳｅｑシステム（ｉｌｌｕｍｉｎａ）にてシークエンスを行った。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ）にてトリミングとリシークエンスを行い、リード情報を出力した。
ｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴ、実施例６で作製したＹＲ２８８ｄＲＴ単変異ライブラリプール及び実施例７で作製したＹＲ２８８ｄＲＴ二重変異ライブラリプールを鋳型として、プライマーｐＥＴ２２ｂ＿ＮＧＳ＿ｆｗ（GCGAAATTAATACGACTCACTATAG：配列番号１３）及びｐＥＴ２２ｂ＿ＮＧＳ＿ｒｖ（GCCAATCCGGATATAGTTCC：配列番号１４）を用いてそれぞれＰＣＲを行い、ＹＲ２８８ｄＲＴ（及びその変異体）のコード領域全長を含む断片を増幅した。各ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供した後にゲルの目的バンド部分のみを切り出し、ハイピュアＰＣＲプロダクトピュアリフィケイションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製した。ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標） ｄｓＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の推奨プロトコルに従ってそれぞれ断片化を行い、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ（商標） ＩＩ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の推奨プロトコルに従って次世代シーケンサー用ライブラリを調製した。ＧｅｎＮｅｘｔ ＮＧＳ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）によって濃度を測定した後、ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ ｖ２（３００－ｃｙｃｌｅｓ）（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＭｉＳｅｑシステム（ｉｌｌｕｍｉｎａ）にてシークエンスを行った。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ）にてトリミングとリシークエンスを行い、リード情報を出力した。
【0067】
各コドンにおいて、そのコドンを含むリードの中で変異が導入されたリード数の割合をＭｕｔａｔｉｏｎ Ｒａｔｅとして算出した。全長のＭｕｔａｔｉｏｎ Ｒａｔｅの総和は、各変異ライブラリプールの平均変異導入数である。各変異ライブラリプールについてＭｕｔａｔｉｏｎ Ｒａｔｅの総和を算出し、ブランクとしてｐＥＴ２２ｂ（＋）－ＹＲ２８８ｄＲＴのＭｕｔａｔｉｏｎ Ｒａｔｅ（ＭｉＳｅｑのエラーによるＭｕｔａｔｉｏｎ Ｒａｔｅ）の総和を引いた値を平均変異導入数とした。単変異ライブラリプールの平均変異導入数は０．９１、二重変異ライブラリプールの平均変異導入数は１．７３であった。
【0068】
各コドンにおいて、６４種類のＤＮＡトリプレットの出現頻度を算出し、ヒートマップを作製した。均等に変異が導入されると仮定した時の理論値（単変異ライブラリプールでは０．００６５％、二重変異ライブラリプールでは０．０１３％）をヒートマップの上限値とし、下限値は０とした。単変異ライブラリプール（図２）、二重変異ライブラリプール（図３）ともに、混合塩基ＮＮＫに含まれる３２種類のＤＮＡトリプレットを高いカバレッジで含んでいた。単変異ライブラリプールについて、理論値０．００６５％の１／１０以上の出現頻度の変異体数は１３４０１であり、理論上のＤＮＡ配列多様性の８０％のカバレッジを示した。一方、エラープローンＰＣＲによってアクセスが可能な変異体として、各コドンについて１塩基のみの置換で導入され得る変異を図４にマッピングした。１塩基のみの置換で導入され得る変異体数は４３４７であったことから、単変異ライブラリプールはエラープローンＰＣＲで作製できる変異ライブラリプールと比較して３倍以上の単変異多様性を有する。
以上の結果から、作製した単変異ライブラリプール及び二重変異ライブラリプールは、高い多様性、高い変異導入率、及び高いカバレッジを有する変異ライブラリプールであることが示された。
以上の結果から、作製した単変異ライブラリプール及び二重変異ライブラリプールは、高い多様性、高い変異導入率、及び高いカバレッジを有する変異ライブラリプールであることが示された。
【要約】
【課題】多様性の高い変異ライブラリプールを安価、簡便に作製する方法の提供。
【解決手段】以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
【選択図】なし
【解決手段】以下の工程（ａ）～（ｃ）を含む、変異ライブラリプールの作製方法：（ａ）鋳型ＤＮＡと複数種の変異導入用プライマー対とを用いて、該変異導入用プライマー対毎にＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を行い、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を取得する工程、ここで、該変異導入用プライマー対は、該鋳型ＤＮＡにアニールし、互いに相補的な領域を有し、且つ少なくとも一方に変異導入部位を含む；（ｂ）工程（ａ）で得られたＤＮＡ断片にＤＮＡリガーゼを作用させる工程；及び（ｃ）工程（ｂ）で得られたＤＮＡで宿主細胞を形質転換する工程。
【選択図】なし
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】