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特許7274222非ヒト大型類人猿アデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-08
(45)【発行日】2023-05-16
(54)【発明の名称】非ヒト大型類人猿アデノウイルスの核酸配列及びアミノ酸配列、それを含有するベクター、並びにその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/34 20060101AFI20230509BHJP
C07K 14/075 20060101ALI20230509BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20230509BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20230509BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230509BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230509BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230509BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230509BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230509BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20230509BHJP
A61K 39/235 20060101ALI20230509BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230509BHJP
【ＦＩ】
C12N15/34 ZNA
C07K14/075
C12N7/01
C12N15/861 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K31/7088
A61K35/761
A61K39/235
A61P37/04
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020500165
(86)(22)【出願日】2018-07-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-10-29
(86)【国際出願番号】 EP2018068291
(87)【国際公開番号】W WO2019008111
(87)【国際公開日】2019-01-10
【審査請求日】2021-05-12
(31)【優先権主張番号】17179825.9
(32)【優先日】2017-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】518435943
【氏名又は名称】ノイスコム アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】100088904
【弁理士】
【氏名又は名称】庄司 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100124453
【弁理士】
【氏名又は名称】資延 由利子
(74)【代理人】
【識別番号】100135208
【弁理士】
【氏名又は名称】大杉 卓也
(74)【代理人】
【識別番号】100163544
【弁理士】
【氏名又は名称】平田 緑
(72)【発明者】
【氏名】ニコシア，アルフレド
(72)【発明者】
【氏名】コロカ，ステファノ
(72)【発明者】
【氏名】ラーム，アルミン
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５０７２９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５３０６０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５２３００７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Yan J et al.，Interaction between hexon and L4-100K determines virus rescue and growth of hexon-chimeric recombinant Ad5 vectors，Sci Rep.，2016年，Vol. 6: 22464，pp. 1-13
【文献】McVey D et al.，Adenoviruses isolated from wild gorillas are closely related to human species C viruses，Virology，2013年，Vol. 444(1-2)，pp. 119-123
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドであって、A）（i）配列番号11に示されるアミノ酸配列を含むHVR1、
（ii）配列番号12に示されるアミノ酸配列を含むHVR2、
（iii）配列番号13に示されるアミノ酸配列を含むHVR3、
（iv）配列番号14に示されるアミノ酸配列を含むHVR4、
（v）配列番号15に示されるアミノ酸配列を含むHVR5、
（vi）配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むHVR6、及び、
（vii）配列番号17に示されるアミノ酸配列を含むHVR7；又は、
E）（i）配列番号39に示されるアミノ酸配列を含むHVR1、
（ii）配列番号40に示されるアミノ酸配列を含むHVR2、
（iii）配列番号41に示されるアミノ酸配列を含むHVR3、
（iv）配列番号42に示されるアミノ酸配列を含むHVR4、
（v）配列番号43に示されるアミノ酸配列を含むHVR5、
（vi）配列番号44に示されるアミノ酸配列を含むHVR6、及び、
（vii）配列番号45に示されるアミノ酸配列を含むHVR7、
を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記ヘキソンタンパク質が、A）配列番号46に示されるアミノ酸配列、又は、
E）配列番号50に示されるアミノ酸配列、
を含む、請求項1に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項3】
配列番号51に示されるアミノ酸配列を含むアデノウイルスペントンタンパク質を更にコードする、請求項1又は2に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項4】
配列番号53に示されるアミノ酸配列を含むアデノウイルスファイバータンパク質を更にコードする、請求項1～3のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項5】
配列番号57に示されるヌクレオチド配列を含むVA RNAIIノンコーディングRNA、及び／又は配列番号55に示されるヌクレオチド配列を含むVA RNA IノンコーディングRNAを更にコードする、請求項1～4のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項1～5のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、アデノウイルス若しくは複製不全アデノウイルスのタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記アデノウイルスが、キメラアデノウイルス、及び／又は非アデノウイルス遺伝子、タンパク質又はそのフラグメントを有するキメラアデノウイルスである、請求項6に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項8】
請求項1～4のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド。
【請求項9】
請求項1～7のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド及び／又は請求項8に記載の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む、単離アデノウイルス若しくは複製不全アデノウイルス。
【請求項10】
請求項1～7のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドによってコードされるウイルス様粒子。
【請求項11】
請求項1～7のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項12】
（i）アジュバント、及び（ii）請求項1～7のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項8に記載の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、請求項9に記載のアデノウイルス、請求項10に記載のウイルス様粒子、又は請求項11に記載のベクター、及び
（iii）薬学的に許容可能な賦形剤、
を含む組成物。
【請求項13】
請求項1～7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項8に記載の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、請求項9に記載のアデノウイルス、請求項10に記載のウイルス様粒子又は請求項11に記載のベクターを含む細胞。
【請求項14】
疾患の治療又は予防に使用される、請求項1～7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項8に記載の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、請求項9に記載のアデノウイルス、請求項10に記載のウイルス様粒子、又は請求項11に記載のベクター又は請求項12に記載の組成物。
【請求項15】
アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子を作製するin vitro方法であって、（i）請求項1～7のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを、アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子が細胞中で組み立てられるように細胞において発現させる工程と、
（ii）アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子を細胞又は細胞周辺の培地から単離する工程と、
を含む、in vitro方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高い免疫原性を有し、ヒト一般集団における既存の免疫を有しない新規のアデノウイルス株に関する。既存の免疫の欠如は、アデノウイルスカプシドタンパク質ヘキソン中の新規の超可変領域によって生じる。この新規のアデノウイルス株は、改善された増殖能力も有する。本発明は、これらの新規のアデノウイルス株のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにこれらの株をベースとした組み換えウイルス、ウイルス様粒子及びベクターを提供する。疾患の治療法又は予防法における医薬組成物及び医学的用途、並びに新規の配列、組み換えウイルス、ウイルス様粒子及びベクターを用いてアデノウイルス又はウイルス様粒子を作製する方法も更に提供する。
【背景技術】
【0002】
アデノウイルス（Ad）は、無エンベロープ正二十面体カプシド構造を有する、両生類、鳥類及び哺乳動物に見られる二本鎖DNAウイルスの大きなファミリーを構成する（非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3、非特許文献4）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスは、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を含む幾つかの哺乳動物種の多数の細胞型に形質導入することができる。
【0003】
一般的に言うと、アデノウイルスDNAは通例、非常に安定しており、形質転換又は腫瘍形成（tumorigenesis）が起こらない限り、エピソーム性（例えば、染色体外）のままである。加えて、アデノウイルスベクターは、臨床グレードの組成物の医薬品規模の生産に容易に従うことができる明確に定義された生産システムにおいて高収率に増殖させることができる。これらの特性及びそれらのよく特徴付けられた分子遺伝学から、組み換えアデノウイルスベクターは、ワクチン担体としての使用に良好な候補となる。組み換えアデノウイルスベクターの作製は、欠失した又は非機能的となるように設計されたアデノウイルス遺伝子産物の機能を補完することが可能なパッケージング細胞株の使用に依存し得る。
【0004】
現在、2つのよく特徴付けられたヒトサブグループCアデノウイルス血清型（すなわち、hAd2及びhAd5）が、遺伝子療法に用いられるアデノウイルスベクターの大半についてウイルス骨格の供給源として広く使用されている。複製欠損ヒトアデノウイルスベクターも様々な感染因子に由来する様々な免疫原の送達のためのワクチン担体として試験されている。実験動物（例えば齧歯類、イヌ及び非ヒト霊長類）において行われた研究から、免疫原及び他の抗原をコードする導入遺伝子を有する組み換え複製欠損ヒトアデノウイルスベクターが導入遺伝子産物に対して液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方を引き起こすことが示される。一般的に言うと、免疫応答を引き起こすことが予測される高用量の組み換えアデノウイルスベクターを利用する免疫化プロトコルを用いるか、又は異なる血清型に由来するが、同じ導入遺伝子産物を有するアデノウイルスベクターの連続投与をブースティング免疫化（boosting immunizations：追加免疫）として用いる免疫化プロトコルを用いることによって、非ヒト実験系においてヒトアデノウイルスベクターをワクチン担体として使用した成功が研究者により報告されている（非特許文献5）。
【0005】
種Cアデノウイルス（例えばAd5、Ad6及びChAd63）に由来するベクターは、最も免疫原性が高い（非特許文献6）。特に、ヒトアデノウイルス5型（Ad5）をベースとするウイルスベクターが遺伝子療法及びワクチン用途のために開発されている。Ad5ベースのベクターは動物モデルにおいて極めて効率的であるが、Ad5野生型ウイルスに対するヒトにおける既存の免疫の存在が遺伝子導入の効率を低下させることが臨床試験において実証されている（非特許文献7）。このため、一般集団における免疫は、Ad5をベースとするAdベクターワクチンの広い用途を制限する。一方、稀なヒトアデノウイルスはAd5よりも免疫原性が低い（非特許文献8）。非ヒトアデノウイルスをベースとするベクターは、ヒト一般集団において既存の免疫を有しない（非特許文献9）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Straus, Adenovirus infections in humans; The Adenoviruses, 451-498, 1984
【文献】Hierholzer et al.,J. Infect.Dis.,158: 804-813,1988
【文献】Schnurr and Dondero, Intervirology., 36: 79-83,1993
【文献】Jong et al., J. Clin. Microbiol., 37: 3940-3945: 1999
【文献】Mastrangeli, et. al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996)
【文献】Colloca et al., Sci. Transl. Med. 4 (115), 2012
【文献】Moore JP et al. Science. 2008 May 9; 320(5877):753-5
【文献】Colloca et al., Sci. Transl. Med. 4 (115), 2012
【文献】Farina et al., J. Virol. 75 (23), 11603-11613, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
このため、免疫原性が高く、ヒトにおける既存の免疫が低いか又は存在しないアデノウイルスベクターが必要とされている。これらのアデノウイルスベクターは、それらの複製の点で高い生産性を有するのが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【0008】
第1の態様では、本発明は、アデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
A）（i）配列番号11に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号11に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、27位にAを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号12に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号12に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、1位にLを有さず、好ましくはIを有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号13に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号13に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、7位にVを有さず、好ましくはAを有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号14に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号14に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号15に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号15に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号16に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号16に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号17に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号17に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、1位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7；又は、
B）（i）配列番号18に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号18に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、8位にVを有さず、好ましくはEを有し、12位にDを有さず、好ましくはEを有し、13位にEを有さず、好ましくはDを有し、及び／又は14位にLを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号19に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号19に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、10位にDを有さず、好ましくはEを有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号20に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号20に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、6位にTを有さず、好ましくはAを有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号21に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号21に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、9位にLを有さず、好ましくはMを有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号22に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号22に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、3位にTを有さず、好ましくはSを有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号23に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号23に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、9位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号24に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号24に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、8位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7；又は、
C）（i）配列番号25に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号25に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号26に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号26に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号27に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号27に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、7位にVを有さず、好ましくはAを有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号28に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号28に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、10位にEを有さず、好ましくはQを有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号29に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号29に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、3位にTを有さず、好ましくはSを有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号30に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号30に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、9位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号31に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号31に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、8位にIを有さず、好ましくはVを有し、及び／又は11位にTを有さず、好ましくはSを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7；又は、
D）（i）配列番号32に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号32に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号33に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号33に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号34に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号34に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、6位にTを有さず、好ましくはAを有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号35に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号35に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、6位にQを有さず、好ましくはKを有し、及び／又は10位にEを有さず、好ましくはQを有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号36に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号36に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、3位にTを有さず、好ましくはSを有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号37に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号37に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、1位にKを有さず、好ましくはTを有し、及び／又は9位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号38に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号38に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、8位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7；又は、
E）（i）配列番号39に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号39に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、27位にAを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号40に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号40に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号41に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号41に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号42に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号42に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号43に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号43に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号44に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号44に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号45に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号45に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、1位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7、
を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。
A）（i）配列番号11に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号11に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、27位にAを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号12に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号12に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、1位にLを有さず、好ましくはIを有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号13に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号13に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、7位にVを有さず、好ましくはAを有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号14に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号14に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号15に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号15に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号16に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号16に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号17に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号17に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、1位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7；又は、
B）（i）配列番号18に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号18に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、8位にVを有さず、好ましくはEを有し、12位にDを有さず、好ましくはEを有し、13位にEを有さず、好ましくはDを有し、及び／又は14位にLを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号19に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号19に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、10位にDを有さず、好ましくはEを有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号20に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号20に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、6位にTを有さず、好ましくはAを有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号21に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号21に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、9位にLを有さず、好ましくはMを有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号22に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号22に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、3位にTを有さず、好ましくはSを有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号23に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号23に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、9位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号24に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号24に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、8位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7；又は、
C）（i）配列番号25に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号25に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号26に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号26に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号27に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号27に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、7位にVを有さず、好ましくはAを有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号28に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号28に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、10位にEを有さず、好ましくはQを有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号29に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号29に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、3位にTを有さず、好ましくはSを有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号30に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号30に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、9位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号31に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号31に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、8位にIを有さず、好ましくはVを有し、及び／又は11位にTを有さず、好ましくはSを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7；又は、
D）（i）配列番号32に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号32に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号33に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号33に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号34に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号34に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、6位にTを有さず、好ましくはAを有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号35に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号35に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、6位にQを有さず、好ましくはKを有し、及び／又は10位にEを有さず、好ましくはQを有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号36に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号36に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、3位にTを有さず、好ましくはSを有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号37に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号37に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、1位にKを有さず、好ましくはTを有し、及び／又は9位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号38に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号38に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、8位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7；又は、
E）（i）配列番号39に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号39に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、27位にAを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第1の超可変領域HVR1、
（ii）配列番号40に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号40に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第2の超可変領域HVR2、
（iii）配列番号41に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号41に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第3の超可変領域HVR3、
（iv）配列番号42に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号42に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第4の超可変領域HVR4、
（v）配列番号43に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号43に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第5の超可変領域HVR5、
（vi）配列番号44に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号44に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む第6の超可変領域HVR6、及び、
（vii）配列番号45に従うアミノ酸配列、若しくは配列番号45に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、1位にIを有さず、好ましくはVを有するその変異体を含む第7の超可変領域HVR7、
を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0009】
第2の態様では、本発明は、第1の態様のポリヌクレオチドを含むアデノウイルス、好ましくは複製不全アデノウイルスをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0010】
第3の態様では、本発明は、第1の態様の単離ポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを提供する。
【0011】
第4の態様では、本発明は、第1の態様の単離ポリヌクレオチドによってコードされるアデノウイルス、又は第1の態様による単離ポリヌクレオチド及び／又は第3の態様による少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む単離アデノウイルス、好ましくは複製不全アデノウイルスを提供する。
【0012】
第5の態様では、本発明は、第1の態様の単離ポリヌクレオチドによってコードされるウイルス様粒子を提供する。
【0013】
第6の態様では、本発明は、第1の態様の単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0014】
第7の態様では、本発明は、（i）アジュバント、（ii）第1若しくは第2の態様の単離ポリヌクレオチド、第3の態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子、又は第6の態様のベクター、及び任意に（iii）薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物を提供する。
【0015】
第8の態様では、本発明は、第1若しくは第2の態様の単離ポリヌクレオチド、第3の態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子、又は第6の態様のベクターを含む細胞を提供する。
【0016】
第9の態様では、本発明は、疾患の治療又は予防に使用される、第1若しくは第2の態様の単離ポリヌクレオチド、第3の態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子、又は第6の態様のベクター及び／又は第7の態様の組成物を提供する。
【0017】
第10の態様では、本発明は、アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子を作製するin vitro方法であって、
（i）第1又は第2の態様の単離ポリヌクレオチドを、アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子が細胞中で組み立てられるように細胞において発現させる工程と、
（ii）アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子を細胞又は細胞周辺の培地から単離する工程と、
を含む、in vitro方法に関する。
（i）第1又は第2の態様の単離ポリヌクレオチドを、アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子が細胞中で組み立てられるように細胞において発現させる工程と、
（ii）アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子を細胞又は細胞周辺の培地から単離する工程と、
を含む、in vitro方法に関する。
【0018】
本発明を以下で詳細に記載する前に、本明細書中に記載する特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得るので、本発明はこれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語が、特定の実施形態を記載するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0019】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されるように、並びにAxel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999による"Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications"、"Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", Susan Budavari et al.編, CRC Press, 1996、及びUnited States Pharmacopeia-25/National Formulary-20（the United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville Md., 2001により出版）に記載されるように定義される。
【0020】
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他に必要な場合以外は、「を含む（comprise）」という単語、並びに「を含む（comprises）」及び「を含む（comprising）」等の変化形は、記載された特徴、整数若しくは工程、又は特徴、整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の特徴、整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。以下の節では本発明の種々の態様をより詳細に規定する。そのようにして規定した各態様は、反対の内容が明示されない限り、任意の他の態様（単数又は複数）と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であるとして示した任意の特徴を、好ましい又は有利であるとして示した任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わせることができる。
【0021】
複数の文書が、本明細書の文章全体を通じて引用される。本明細書中で引用される文書（全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の仕様書、取扱説明書等を含む）の各々が、上記のものであるか又は下記のものであるかに関わらず、その全体において引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書のどの記載も、本発明が従来の発明に基づくかかる開示に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】BAC GAd-GAG A/L/Sシャトルベクターの概略図である。
【図2】E1及びE3が欠失したGAdNou19 GAG(DE1E3) BACプラスミドの概略図である。
【図3】E1及びE3が欠失したGAdNou20 GAG(DE1E3) BACプラスミドの概略図である。
【図4】同じ発現カセットを有するベンチマークAd5ベクターと比較した、Hek293におけるGADNOU19及びGADNOU20の生産性を示す図である。
【図5】GAG抗原をコードするGADNOU19及びGADNOU20ベクター免疫原性を示す図である。GADNOU19 GAG(DE1DE3)及びGADNOU20 GAG(DE1DE3)ベクターの免疫学的効力をIFN-γ ELISpotによって決定した。T細胞応答を3×107 vp及び3×106 vpの各ベクターによる免疫化の3週間後に測定する。CD8+エピトープをコードする免疫優性gagペプチドによる刺激に応答してIFNγを産生するT細胞の脾細胞100万個当たりの数を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
以下の表1に本明細書で言及される配列の概要を提示する（GADNOU＋番号：単離アデノウイルス株；*：アミノ酸配列をコードするGADNOUゲノムの対応するヌクレオチド配列、配列の対応は記載の順序に従う、例えば配列番号11については、HVR1 GADNOU 20は配列番号1のx-xに対応し、HVR1 GADNOU 21は配列番号2のx-xに対応し、HVR1 GADNOU 25は配列番号3のx-xに対応する）。GADNOUは本発明者らの株の呼称である。本開示において座標を用いてヘキソン、ペントン又はファイバーをコードするポリヌクレオチドに言及する場合、下記のヘキソン、ペントン、ファイバーについてのゲノム座標の範囲（GADNOUゲノム中の配列番号46～54）は、任意に含まれる／付加される最終終止コドンを含まない。
以下の表1に本明細書で言及される配列の概要を提示する（GADNOU＋番号：単離アデノウイルス株；*：アミノ酸配列をコードするGADNOUゲノムの対応するヌクレオチド配列、配列の対応は記載の順序に従う、例えば配列番号11については、HVR1 GADNOU 20は配列番号1のx-xに対応し、HVR1 GADNOU 21は配列番号2のx-xに対応し、HVR1 GADNOU 25は配列番号3のx-xに対応する）。GADNOUは本発明者らの株の呼称である。本開示において座標を用いてヘキソン、ペントン又はファイバーをコードするポリヌクレオチドに言及する場合、下記のヘキソン、ペントン、ファイバーについてのゲノム座標の範囲（GADNOUゲノム中の配列番号46～54）は、任意に含まれる／付加される最終終止コドンを含まない。
【0024】
表1：本願で言及される配列番号
配列番号
ポリペプチド
ポリヌクレオチド
ヘキソン
ペントン
ファイバー
ゲノム
配列番号10、1、2、5、7、9の10724～10897及び配列番号3、4、6、8の10721～10894
*配列番号1、2、3の19386～19472
FWプライマーGAd-GAG左末端
RVプライマーGAd-GAG左末端
FWプライマーGAd右末端
RVプライマーGAd右末端
FWプライマーpIX
RVプライマーpIX
FWプライマーAmp-LacZ-SacB Ex.2
RVプライマーAmp-LacZ-SacB Ex.2
FWプライマーAmp-LacZ-SacB Ex.4
RVプライマーAmp-LacZ-SacB Ex.4
SSオリゴAmp-LacZ-SacB
CMVFAM-TAMRAプローブ
【表1-1】
【表1-2】
ポリペプチド
ポリヌクレオチド
ヘキソン
ペントン
ファイバー
ゲノム
配列番号10、1、2、5、7、9の10724～10897及び配列番号3、4、6、8の10721～10894
*配列番号1、2、3の19386～19472
FWプライマーGAd-GAG左末端
RVプライマーGAd-GAG左末端
FWプライマーGAd右末端
RVプライマーGAd右末端
FWプライマーpIX
RVプライマーpIX
FWプライマーAmp-LacZ-SacB Ex.2
RVプライマーAmp-LacZ-SacB Ex.2
FWプライマーAmp-LacZ-SacB Ex.4
RVプライマーAmp-LacZ-SacB Ex.4
SSオリゴAmp-LacZ-SacB
CMVFAM-TAMRAプローブ
【0025】
以下の表2a及び表2bにGADNOUゲノム中のCDS、RNA及びITRのゲノム境界／座標を提示する。これらは、これらの表に挙げられ、それぞれの実施形態に好ましいものとして組み込まれる本明細書のゲノム要素への任意の言及に当てはまる。
【0026】
表2a：GADNOU19、GADNOU20、GANOU21、GADNOU29、GADNOU30、GADNOU31についてのCDS、RNA及びITRのゲノム境界。E3_Orf2*は、GTGを開始コドンとして有する推定オープンリーディングフレームを表す。rcは逆相補鎖（reverse complement）を表す。スプライシングによって生成する産物は、複数の座標対によって示す。
E1B_スモールT_19K
E1B_ラージT_55K
E2B_ポリメラーゼ
L2_ペントン
L3_ヘキソン
L3_エンドプロテアーゼ
L5_ファイバー
5プライムITR
3プライムITR
【表2a-1】
【表2a-2】
E1B_スモールT_19K
E1B_ラージT_55K
E2B_ポリメラーゼ
L2_ペントン
L3_ヘキソン
L3_エンドプロテアーゼ
L5_ファイバー
5プライムITR
3プライムITR
【0027】
表2b：GADNOU25、GADNOU26、GANOU27、GADNOU28についてのCDS、RNA及びITRのゲノム境界。E3_Orf2*は、GTGを開始コドンとして有する推定オープンリーディングフレームを表す。rcは逆相補鎖を表す。スプライシングによって生成する産物は、複数の座標対によって示す。
E1B_スモールT_19K
E1B_ラージT_55K
E2B_ポリメラーゼ
L2_ペントン
L3_ヘキソン
L3_エンドプロテアーゼ
L5_ファイバー
5プライムITR
3プライムITR
【表2b-1】
【表2b-2】
E1B_スモールT_19K
E1B_ラージT_55K
E2B_ポリメラーゼ
L2_ペントン
L3_ヘキソン
L3_エンドプロテアーゼ
L5_ファイバー
5プライムITR
3プライムITR
【0028】
本発明の態様及びその特定の実施形態
本発明は、上の発明の概要に提示される幾つかの態様に関する。これらの態様は、下記の代替的な実施形態及び好ましい実施形態を含む。
本発明は、上の発明の概要に提示される幾つかの態様に関する。これらの態様は、下記の代替的な実施形態及び好ましい実施形態を含む。
【0029】
第1の態様では、本発明は、上の発明の概要で定義されるアデノウイルスヘキソンタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0030】
好ましい実施形態では、HVR変異体は、それぞれの配列番号に対して少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する。配列同一性のパーセンテージレベルによる定義の代替として、HVR変異体は、それぞれの配列番号内に一定数のアミノ酸突然変異を有すると定義することができる。この場合、突然変異の数は以下の通りである：少なくとも85%の配列同一性の代わりに、任意のHVR1中に最大4個の突然変異、任意のHVR2中に最大2個の突然変異、任意のHVR3中に最大1個の突然変異、任意のHVR4中に最大1個の突然変異、任意のHVR5中に最大2個の突然変異、任意のHVR6中に最大1個の突然変異、及び任意のHVR7中に最大3個の突然変異；少なくとも90%の配列同一性の代わりに、任意のHVR1中に最大2個の突然変異、任意のHVR2中に最大1個の突然変異、任意のHVR3中に最大1個の突然変異、好ましくは突然変異なし、任意のHVR4中に最大1個の突然変異、任意のHVR5中に最大1個の突然変異、任意のHVR6中に最大1個の突然変異、好ましくは突然変異なし、及び任意のHVR7中に最大2個の突然変異；少なくとも95%の配列同一性の代わりに、任意のHVR1中に最大1個の突然変異、任意のHVR2中に最大1個の突然変異、好ましくは突然変異なし、任意のHVR3中に最大1個の突然変異、好ましくは突然変異なし、任意のHVR4中に最大1個の突然変異、好ましくは突然変異なし、任意のHVR5中に最大1個の突然変異、好ましくは突然変異なし、任意のHVR6中に最大1個の突然変異、好ましくは突然変異なし、及び任意のHVR7中に最大1個の突然変異。
【0031】
当該技術分野で、例えばBradley et al. (J Virol., 2012 Jan；86(2):1267-72)から既知のように、アデノウイルス中和抗体はヘキソン超可変領域を標的とし、血清陽性率（serumprevalence）を有するアデノウイルスのHVR領域を置き換えることによって、このアデノウイルスは、免疫宿主における免疫系を回避することができる。このため、上記のHVRは、下で定義されるそれぞれのヘキソンタンパク質と共に使用することができるが、これらのヘキソンタンパク質、更には下記のペントン及びファイバータンパク質とは独立した有用性を有する。すなわち他のヘキソン、ペントン及び／又はファイバータンパク質を有する異なるアデノウイルス中のヘキソンHVRを置き換えることにより有用性を有する。
【0032】
好ましい実施形態では、ヘキソンタンパク質は、
A）配列番号46に従うアミノ酸配列、又は配列番号46に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、
B）配列番号47に従うアミノ酸配列、又は配列番号47に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、
C）配列番号48に従うアミノ酸配列、又は配列番号48に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、
D）配列番号49に従うアミノ酸配列、又は配列番号49に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、及び／又は、
E）配列番号50に従うアミノ酸配列、又は配列番号50に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む。
A）配列番号46に従うアミノ酸配列、又は配列番号46に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、
B）配列番号47に従うアミノ酸配列、又は配列番号47に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、
C）配列番号48に従うアミノ酸配列、又は配列番号48に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、
D）配列番号49に従うアミノ酸配列、又は配列番号49に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、及び／又は、
E）配列番号50に従うアミノ酸配列、又は配列番号50に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む。
【0033】
好ましい実施形態では、ヘキソン変異体は、それぞれの配列番号に対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する。配列同一性のパーセンテージレベルによる定義の代替として、ヘキソン変異体は、それぞれの配列番号内に一定数のアミノ酸突然変異を有すると定義することができる。この場合、突然変異の数は以下の通りである：少なくとも85%の配列同一性の代わりに、任意のヘキソン中に最大143個の突然変異；少なくとも90%の配列同一性の代わりに、任意のヘキソン中に最大95個の突然変異；少なくとも95%の配列同一性の代わりに、任意のヘキソン中に最大47個の突然変異；少なくとも96%の配列同一性の代わりに、任意のヘキソン中に最大38個の突然変異；少なくとも97%の配列同一性の代わりに、任意のヘキソン中に最大28個の突然変異；少なくとも98%の配列同一性の代わりに、任意のヘキソン中に最大19個の突然変異；少なくとも99%の配列同一性の代わりに、任意のヘキソン中に最大9個の突然変異。ヘキソン変異体が上記のそれぞれのHVRについて定義されるよりも低い配列同一性又はより多い突然変異をHVR中に有しないことを理解されたい。
【0034】
一実施形態では、第1の態様の単離ポリヌクレオチドは、配列番号51若しくは52に従うアミノ酸配列、又は配列番号51若しくは52に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含むアデノウイルスペントンタンパク質を更にコードする。好ましい実施形態では、ペントン変異体は、それぞれの配列番号に対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する。配列同一性のパーセンテージレベルによる定義の代替として、ペントン変異体は、それぞれの配列番号内に一定数のアミノ酸突然変異を有すると定義することができる。この場合、突然変異の数は以下の通りである：少なくとも85%の配列同一性の代わりに、任意のペントン中に最大97個の突然変異；少なくとも90%の配列同一性の代わりに、任意のペントン中に最大65個の突然変異；少なくとも95%の配列同一性の代わりに、任意のペントン中に最大32個の突然変異；少なくとも96%の配列同一性の代わりに、任意のペントン中に最大26個の突然変異；少なくとも97%の配列同一性の代わりに、任意のペントン中に最大19個の突然変異；少なくとも98%の配列同一性の代わりに、任意のペントン中に最大13個の突然変異；少なくとも99%の配列同一性の代わりに、任意のペントン中に最大6個の突然変異。
【0035】
配列番号51及び52のペントン変異体は各々、289位にDを有さず、好ましくはGを有し、341位にDを有さず、好ましくはNを有するのが好ましい。また、配列番号52の変異体は、442位にAを有さず、より好ましくはTを有するのがより好ましい。
【0036】
別の実施形態では、第1の態様の単離ポリヌクレオチドは、配列番号53若しくは54に従うアミノ酸配列、又は配列番号53若しくは54に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含むアデノウイルスファイバータンパク質を更に（すなわちヘキソン、場合によってはペントンタンパク質の隣に）コードする。好ましい実施形態では、ファイバー変異体は、それぞれの配列番号に対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する。配列同一性のパーセンテージレベルによる定義の代替として、ファイバー変異体は、それぞれの配列番号内に一定数のアミノ酸突然変異を有すると定義することができる。この場合、突然変異の数は以下の通りである：少なくとも85%の配列同一性の代わりに、任意のファイバー中に最大89個の突然変異；少なくとも90%の配列同一性の代わりに、任意のファイバー中に最大59個の突然変異；少なくとも95%の配列同一性の代わりに、任意のファイバー中に最大29個の突然変異；少なくとも96%の配列同一性の代わりに、任意のファイバー中に最大23個の突然変異；少なくとも97%の配列同一性の代わりに、任意のファイバー中に最大17個の突然変異；少なくとも98%の配列同一性の代わりに、任意のファイバー中に最大11個の突然変異；少なくとも99%の配列同一性の代わりに、任意のファイバー中に最大5個の突然変異。
【0037】
配列番号53のファイバー変異体は、181位にAを有さず、好ましくはPを有し、474位にVを有さず、好ましくはIを有し、及び／又は4位と5位との間にSの挿入、好ましくはアミノ酸挿入を有しないのが好ましい。好ましくは、配列番号54のファイバー変異体は、90位にTを有さず、好ましくはIを有し、及び／又は7位にS（好ましくは、4位～7位の各々にS）を有するのが好ましい。
【0038】
別の実施形態では、第1の態様の単離ポリヌクレオチドは、配列番号57に従うヌクレオチド配列、又は配列番号57に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含むVA RNA IIノンコーディングRNAを更に（すなわちヘキソン、場合によってはペントン及び／又はファイバータンパク質の隣に）コードする。代替的には又は加えて、第1の態様の単離ポリヌクレオチドは、配列番号55若しくは56に従うヌクレオチド配列、又は配列番号55若しくは56に対してそれぞれ少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含むVA RNA IノンコーディングRNAをコードしてもよい。好ましい実施形態では、VA RNA変異体は、それぞれの配列番号に対して少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有する。配列同一性のパーセンテージレベルによる定義の代替として、VA RNA変異体は、それぞれの配列番号内に一定数のヌクレオチド突然変異を有すると定義することができる。この場合、突然変異の数は以下の通りである：少なくとも85%の配列同一性の代わりに、VA RNA I中に最大25個の突然変異及びVA RNA II中に最大26個の突然変異；少なくとも90%の配列同一性の代わりに、VA RNA I中に最大16個の突然変異及びVA RNA II中に最大17個の突然変異；少なくとも95%の配列同一性の代わりに、任意のVA RNA中に最大8個の突然変異；少なくとも96%の配列同一性の代わりに、任意のVA RNA中に最大6個の突然変異；少なくとも97%の配列同一性の代わりに、任意のVA RNA中に最大5個の突然変異；少なくとも98%の配列同一性の代わりに、任意のVA RNA中に最大3個の突然変異；少なくとも99%の配列同一性の代わりに、任意のVA RNA中に最大1個の突然変異。
【0039】
配列番号57のVA RNA II変異体は、（a）79位にCを有さず、及び／又は80位にAを有さず、好ましくは79位にTを有し、及び／又は80位にGを有し、（b）81位にAを有さず、好ましくは81位にGを有するのが好ましい。配列番号55のVA RNA I変異体は、好ましくは80位にGを有さず、好ましくは80位にAを有する。
【0040】
本発明によるVA RNAは、実施例5に示されるように、アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子の産生の改善をもたらす。
【0041】
第1の態様のポリヌクレオチドが、配列番号1～10を参照として用いて、アデノウイルスゲノム中でヘキソン、ペントン及び／又はファイバーの遺伝子に隣接した他のアデノウイルス遺伝子及びヌクレオチドセグメントを更に含むことが好ましい。また、ポリヌクレオチドがアデノウイルス粒子へのポリヌクレオチドのパッケージングに必要とされる配列を含むことが特に好ましい。
【0042】
概して、第1の態様の単離ポリヌクレオチドが以下の少なくとも1つを含むことが好ましい：
（a）アデノウイルス5'末端、好ましくはアデノウイルス5'逆方向末端反復；
（b）アデノウイルスEla領域、又は13S領域、12S領域及び9S領域の中から選択されるそのフラグメント；
（c）アデノウイルスElb領域、又はスモールT領域、ラージT領域及びIX領域からなる群の中から選択されるそのフラグメント；
（d）アデノウイルスVA RNA領域、又はVA RNA I領域及びVA RNA II領域からなる群の中から選択されるそのフラグメント；
（e）アデノウイルスE2b領域、又はスモールpTP領域、ポリメラーゼ領域及びIVa2領域からなる群の中から選択されるそのフラグメント；
（f）アデノウイルスL1領域、又は28.1 kDタンパク質、ポリメラーゼ、アグノプロテイン、52/55 kDaタンパク質及びIIIaタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（g）アデノウイルスL2領域、又は上で定義されるペントンタンパク質、VIIタンパク質、Vタンパク質及びXタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（h）アデノウイルスL3領域、又はVIタンパク質、上で定義されるヘキソンタンパク質、及びエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（i）アデノウイルスE2a領域、又はDBPタンパク質からなるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（j）アデノウイルスL4領域、又は100 kDタンパク質、22 kDホモログ、33 kDホモログ及びタンパク質VIIIからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（k）アデノウイルスE3領域、又はE3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8及びE3 ORF9からなる群から選択されるそのフラグメント；
（l）アデノウイルスL5領域、又は上で定義されるファイバータンパク質をコードするそのフラグメント；
（m）アデノウイルスE4領域、又はE4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2及びE4 ORF1からなる群から選択されるそのフラグメント；及び／又は、
（n）アデノウイルス3'末端、好ましくはアデノウイルス3'逆方向末端反復。
（a）アデノウイルス5'末端、好ましくはアデノウイルス5'逆方向末端反復；
（b）アデノウイルスEla領域、又は13S領域、12S領域及び9S領域の中から選択されるそのフラグメント；
（c）アデノウイルスElb領域、又はスモールT領域、ラージT領域及びIX領域からなる群の中から選択されるそのフラグメント；
（d）アデノウイルスVA RNA領域、又はVA RNA I領域及びVA RNA II領域からなる群の中から選択されるそのフラグメント；
（e）アデノウイルスE2b領域、又はスモールpTP領域、ポリメラーゼ領域及びIVa2領域からなる群の中から選択されるそのフラグメント；
（f）アデノウイルスL1領域、又は28.1 kDタンパク質、ポリメラーゼ、アグノプロテイン、52/55 kDaタンパク質及びIIIaタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（g）アデノウイルスL2領域、又は上で定義されるペントンタンパク質、VIIタンパク質、Vタンパク質及びXタンパク質からなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（h）アデノウイルスL3領域、又はVIタンパク質、上で定義されるヘキソンタンパク質、及びエンドプロテアーゼからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（i）アデノウイルスE2a領域、又はDBPタンパク質からなるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（j）アデノウイルスL4領域、又は100 kDタンパク質、22 kDホモログ、33 kDホモログ及びタンパク質VIIIからなる群から選択されるアデノウイルスタンパク質をコードするそのフラグメント；
（k）アデノウイルスE3領域、又はE3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8及びE3 ORF9からなる群から選択されるそのフラグメント；
（l）アデノウイルスL5領域、又は上で定義されるファイバータンパク質をコードするそのフラグメント；
（m）アデノウイルスE4領域、又はE4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2及びE4 ORF1からなる群から選択されるそのフラグメント；及び／又は、
（n）アデノウイルス3'末端、好ましくはアデノウイルス3'逆方向末端反復。
【0043】
これらの要素は、表1による第1の態様のポリヌクレオチドのHVR及び／又はヘキソンと同じアデノウイルス（すなわち、同じGADNOU）に由来するものであっても、又はキメラアデノウイルスを形成するように異なるアデノウイルス、特に異なる種のアデノウイルス、例えばヒトアデノウイルスに由来するものであってもよい。
【0044】
上述のポリヌクレオチドの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドが上に概説されるような（例えば領域E3及び／又はE4等の（a）～（m）のような）1つ以上のゲノム領域を含まず、及び／又は少なくとも1つの遺伝子を非機能的なものにする欠失及び／又は突然変異を含むアデノウイルス遺伝子を含むことが望ましい場合もある。これらの好ましい実施形態では、好適なアデノウイルス領域は、上述の領域（複数の場合もある）／遺伝子（複数の場合もある）を含まない又は選択領域（複数の場合もある）／遺伝子（複数の場合もある）が非機能的なものとなるように改変される。これらを非機能的なものにする可能性の1つは、1つ以上の人工終止コドン（例えばTAA）をこれらの遺伝子のオープンリーディングフレームに導入することである。ウイルスを複製欠損にする方法が当該技術分野で既知である（例えば、Brody et al, 1994 Ann NY Acad Sci., 716: 90-101を参照されたい）。欠失により導入遺伝子を、好ましくは本明細書に記載されるミニ遺伝子カセット等の発現カセット内にて挿入するスペースを作ることができる。さらに、当該技術分野で既知であるように、欠失を用いて、パッケージング細胞株又はヘルパーウイルスを使用しなければ複製することができないアデノウイルスベクターを生成することができる。このため、指定の遺伝子／領域の欠失又は機能喪失型突然変異の1つ以上を含む、上に概説されるポリヌクレオチドを含む最終組み換えアデノウイルスは、例えば遺伝子療法又はワクチン接種のためのより安全な組み換えアデノウイルスを提供することができる。
【0045】
ポリヌクレオチドは、本明細書で概説される少なくとも1つのゲノム領域／遺伝子（例えば、領域E3及び／又はE4等）、具体的にはE1A、E1B、E2A、E2B、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2及び／又はE4 ORF1、好ましくはE1A、E1B、E2A、E2B、E3及び／又はE4を含まなくてもよく、及び／又は少なくとも1つの遺伝子を非機能的なものにする欠失及び／又は突然変異を含むアデノウイルス遺伝子を含むが、無傷のEla及び／又はElb領域を保持することが望ましい。かかる無傷のEl領域は、アデノウイルスゲノム中のその天然（native）位置に位置していても、又は天然アデノウイルスゲノム中の欠失の部位（例えば、E3領域中）に配置されてもよい。
【0046】
好ましい実施形態では、第1の態様の単離ポリヌクレオチドは、以下のアデノウイルスタンパク質：タンパク質VI、タンパク質VIII、タンパク質IX、タンパク質IIIa及びタンパク質IVa2の1つ以上、好ましくは全てを更にコードする。
【0047】
アデノウイルスの技術分野の平均的な当業者は、上で指定したアデノウイルスタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを決定する方法を十分に認識している。当業者は、アデノウイルスゲノムの構造も認識しており、不当な負担なしに、本明細書で概説される個々のアデノウイルス領域及びORFを任意のアデノウイルスゲノムにマッピングすることができる。
【0048】
別の実施形態では、第1の態様の単離ポリヌクレオチドは、1つ以上の異種タンパク質又はそのフラグメントを更にコードする。1つ以上の異種タンパク質又はそのフラグメントは、非アデノウイルスタンパク質又はそのフラグメントであるのが好ましい。好ましい実施形態では、1つ以上の非アデノウイルスタンパク質又はそのフラグメントは、1つ以上の抗原タンパク質又はそのフラグメントである。1つ以上の異種タンパク質又はそのフラグメントは、1つ以上の発現カセットの一部であるのが好ましい。異種タンパク質をコードする配列、好ましくは異種タンパク質をコードするかかる配列（複数の場合もある）を含む発現カセットを、例えば本明細書で定義されるアデノウイルスゲノムの欠失領域に挿入することができる。例示的な異種タンパク質は、配列番号74に従うポリペプチド、又は配列番号74に対して少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体である。
【0049】
第2の態様では、本発明は、好ましくは配列番号1～10のいずれか1つに従うアデノウイルスゲノム、又は配列番号1～10に対してそれぞれ少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む、第1の態様のポリヌクレオチドを含む、アデノウイルスをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0050】
好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、好ましくはゲノム領域／遺伝子E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4の1つ以上を欠く配列番号1～10のいずれか1つに従うアデノウイルスゲノムを含む、複製不全アデノウイルスをコードする。
【0051】
単離ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号1～10のいずれか1つに従うアデノウイルスゲノム、又は配列番号1～10に対してそれぞれ少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含み、好ましくは1つ以上の異種タンパク質又はそのフラグメントが挿入される、組み換えアデノウイルス（担体アデノウイルス）をコードするのが最も好ましい。好ましくは、1つ以上の異種タンパク質又はそのフラグメントは、ゲノム領域／遺伝子E1A、E1B、E2A、E2B、E3 ORF1、E3 ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF6/7、E4 ORF6、E4 ORF5、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2及びE4 ORF1、より好ましくはE1、E3及び／又はE4の1つ以上を置き換えることによって挿入される。異種タンパク質又はそのフラグメントは、発現カセットの一部として挿入されるのが好ましい。任意に、担体アデノウイルスは、本明細書に記載されるように複製不全でもある、すなわちゲノム領域／遺伝子E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4の1つ以上を欠く。
【0052】
例示的な実施形態では、本発明は、配列番号72若しくは73に従うポリヌクレオチド、又は配列番号72若しくは73に対してそれぞれ少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含む、アデノウイルスをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【0053】
好ましい実施形態では、アデノウイルスゲノム変異体は、それぞれの配列番号1に対する少なくとも85%、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5又は99.9%の配列同一性の代わりに、配列番号2に対する少なくとも（at least）90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性、配列番号3に対する少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性、それぞれの配列番号4に対する少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性、それぞれの配列番号5に対する少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性、それぞれの配列番号6に対する少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性、それぞれの配列番号7に対する少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性、それぞれの配列番号8に対する少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性、それぞれの配列番号9に対する少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性、又はそれぞれの配列番号10に対する少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、99.5若しくは99.9%の配列同一性を有する（いずれの場合にも、上で定義される欠失を考慮に入れる）。
【0054】
一実施形態では、第2の態様の単離ポリヌクレオチドは、組み換えアデノウイルスの少なくとも1つのアデノウイルスゲノム領域が、上で定義されるヘキソンHVR又はヘキソンタンパク質を含まないアデノウイルスに由来する組み換えアデノウイルス（キメラアデノウイルス）をコードする。キメラアデノウイルスは、主に又は好ましくはヘキソンHVR又はヘキソンタンパク質、任意に更には本明細書で定義されるペントン及び／又はファイバータンパク質についてのみキメラであるのが好ましい。言い換えると、ポリヌクレオチドは、上で定義されるヘキソンHVR又はヘキソンタンパク質、任意に更には上で定義されるペントン及び／又はファイバータンパク質をコードするが、他のゲノム領域の1つ以上、好ましくは全てが、異なるアデノウイルス、特に配列番号1～10に従うアデノウイルスとは異なるアデノウイルスに由来する。異なるアデノウイルスは、異なる宿主に自然に見られるアデノウイルス、より好ましくはヒトアデノウイルスであるのが好ましい。このポリヌクレオチドは、上で定義される1つ以上の異種非アデノウイルスタンパク質又はそのフラグメントを更にコードするのが好ましい。このため、1つ以上の異種非アデノウイルス遺伝子がキメラアデノウイルスのアデノウイルスゲノムに挿入される。したがって、キメラアデノウイルスのアデノウイルスゲノムは、上で定義されるヘキソンHVR又はヘキソンタンパク質をコードするDNA、及び任意に上で定義されるペントン及び／又はファイバータンパク質をコードするDNAを除いて、非サルアデノウイルス、例えばヒトアデノウイルス、好ましくは担体非サル、例えばヒトアデノウイルスに由来する。
【0055】
アデノウイルスが複製不全であることが一般に好ましい。この目的で、アデノウイルスがゲノム領域E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4の1つ以上を欠くか、又はゲノム領域若しくはそれによってコードされる発現産物を非機能的なものにする欠失及び／又は突然変異を中に含むことが好ましい。
【0056】
特に好ましい一実施形態では、第1又は第2の態様の単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるその全ての変異体で、機能的に損なわれたIVa2遺伝子、好ましくはその欠失又はヌル突然変異を有し得る。この遺伝子はウイルスDNAパッキング（packing）に関与し、その障害はウイルス様粒子の産生につながる。この実施形態では、第1又は第2の態様の単離ポリヌクレオチドは、1つ以上の非アデノウイルスB細胞エピトープ及び／又はT細胞エピトープをコードするのが好ましい。
【0057】
第3の態様では、本発明は、第1又は第2の態様のポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを提供する。少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチドは、少なくとも上で定義されるHVRを有するヘキソン、好ましくは上で定義されるヘキソンタンパク質、任意に更には上で定義されるペントン及び／又はファイバータンパク質を含む。
【0058】
少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチドは、細胞における発現によって得ることができる。発現されたポリペプチド（複数の場合もある）は、任意に標準的な技法を用いて精製することができる。例えば、細胞を機械的に又は浸透圧衝撃によって溶解させた後、沈殿及びクロマトグラフィー工程に供することができ、その性質及び配列は、回収される特定の組み換え材料によって決まる。代替的には、発現されたポリペプチド（複数の場合もある）を、タンパク質発現の技術分野で既知のように分泌させ、組み換え細胞を培養した培養培地から回収することができる。
【0059】
第4の態様では、本発明は、第1又は第2の態様の単離ポリヌクレオチド及び／又は第3の態様のアデノウイルスカプシドポリペプチドを含むアデノウイルス（本明細書でアデノウイルスベクター（adenovirus vector or adenoviral vector）とも称する）を提供する。したがって、アデノウイルスは、例えば配列番号1～10のいずれか1つによってコードされるアデノウイルス、又は上で定義される担体アデノウイルス若しくはキメラアデノウイルス等の組み換えアデノウイルスであり得る。アデノウイルスは、単離アデノウイルスであるのが好ましい。
【0060】
例示的な実施形態では、本発明は、配列番号72若しくは73に従うポリヌクレオチド、又は配列番号72若しくは73に対してそれぞれ少なくとも85%の配列同一性を有するその変異体を含むアデノウイルスを提供する。
【0061】
アデノウイルスは、第1又は第2の態様のポリヌクレオチドを含んでも又は含まなくてもよい。このポリヌクレオチドがアデノウイルスに含まれない場合、ポリヌクレオチドがトランスで（in trans）（すなわち、アデノウイルスに組み込まれるアデノウイルスゲノムではない遺伝要素によって）提供されることが好ましい。ポリヌクレオチドは通常、ヘルパー構築物（例えば、プラスミド又はウイルス）によって、又はパッケージング宿主細胞（本明細書に記載される補完（complementing）細胞）のゲノム若しくはその中のヘルパー構築物によって提供される。トランスで提供されるポリヌクレオチドが、これらのポリヌクレオチドのホモログ又は他の配列変異体を含むアデノウイルス中に組み込まれるゲノムに含まれないことが更に好ましい。例えば、トランスで提供されるポリヌクレオチドがヘキソン、ペントン及び／又はファイバー遺伝子を含む場合、アデノウイルス中に組み込まれるゲノムは、ヘキソン、ペントン及び／又はファイバータンパク質をそれぞれコードする任意のポリヌクレオチドを含まない。トランスで提供されるポリヌクレオチドが、第3の態様において定義される少なくとも1つのアデノウイルスカプシドポリペプチド、すなわち第1又は第2の態様において定義されるHVRを有するヘキソン、好ましくは第1又は第2の態様において定義されるヘキソンタンパク質、任意に更には第1又は第2の態様において定義されるペントン及び／又はファイバータンパク質をコードするのが最も好ましい。
【0062】
宿主、例えばヒト又は他の哺乳動物の細胞への遺伝子の送達のためのアデノウイルスベクターの構築においては、様々なアデノウイルス核酸配列を用いることができる。例えば、アデノウイルス後初期（delayed early）遺伝子E3の全て又は一部分を、組み換えウイルスの一部を形成するアデノウイルス配列から除去することができる。サルE3の機能は、組み換えウイルス粒子の機能及び産生とは無関係であると考えられている。一部の実施形態では、少なくともE4遺伝子のORF6領域、より望ましくはこの領域の機能の重複のためにE4領域全体の欠失を有するアデノウイルスベクターを構築することもできる。本発明のまた別のベクターは、後初期遺伝子E2a中に欠失を有する。欠失は、サルアデノウイルスゲノムの後期遺伝子L1～L5のいずれかに作り出すこともできる。同様に、中期（intermediate）遺伝子IX及びIVa2中の欠失が幾つかの目的で有用であり得る。他の欠失を他の構造性又は非構造性アデノウイルス遺伝子中に作り出してもよい。上で論考される欠失は、個別に用いることができ、すなわち、本発明において使用されるアデノウイルス配列は、単一領域にのみ欠失を有することができる。代替的には、遺伝子全体、又はそれらの生物活性を消失させるのに効果的なその一部分の欠失を任意の組合せで用いることができる。例えば、アデノウイルス配列は、El及びE4領域、又はEl、E2a及びE3領域、又はE1及びE3領域、又はE3の欠失を伴って若しくは伴わずにEl、E2a及びE4領域の欠失等を有し得る。かかる欠失は、所望の結果を達成するために温度感受性突然変異等の他のアデノウイルス遺伝子突然変異と組み合わせて用いることができる。
【0063】
任意の必須のアデノウイルス配列（例えば、Ela、Elb、E2a、E2b、E4 ORF6、L1又はL4から選択される領域）を欠くアデノウイルスベクターは、ウイルス感染性及びアデノウイルス粒子の増殖に必要とされる、欠けているアデノウイルス遺伝子産物の存在下で培養することができる。これらのヘルパー機能は、1つ以上のヘルパー構築物（例えば、プラスミド又はウイルス）又はパッケージング宿主細胞（本明細書に記載される補完細胞）の存在下でアデノウイルスベクターを培養することによってもたらすことができる。例えば、国際公開第96/13597号に「最小」ヒトアデノウイルスベクターの調製について記載されている技法を参照されたい）。
【0064】
有用なヘルパー構築物は、欠失した、及び／又はベクター及びベクターをトランスフェクトした細胞によって発現されないそれぞれの遺伝子を補完する、選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含有する。一実施形態では、ヘルパー構築物は複製欠損であり、必須の、任意に更なるアデノウイルス遺伝子を含有する。
【0065】
ヘルパー構築物は、Wu et al, J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989)、K. J. Fisher and J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (April 1, 1994)に記載されるように、ポリカチオンコンジュゲートに形成することもできる。ヘルパー構築物は、任意にレポーター遺伝子を含有してもよい。多数のかかるレポーター遺伝子が当該技術分野で既知である。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子とは異なるヘルパー構築物上のレポーター遺伝子の存在は、アデノウイルス及びヘルパー構築物の両方を独立してモニタリングすることを可能にする。この第2のレポーターは、精製時の得られる組み換えアデノウイルスとヘルパー構築物との分離を容易にするために使用することができる。好ましいヘルパー構築物は、ヘルパーウイルスである。
【0066】
本明細書の好ましい実施形態との関連で記載される遺伝子のいずれかにおいて欠失した組み換えアデノウイルス（Ad）を生成するために、欠失遺伝子領域の機能を、ウイルスの複製及び感染性に必須の場合に、ヘルパー構築物又は細胞、すなわち補完細胞又はパッケージング細胞によって組み換えウイルスに与えることが好ましい。多くの場合、ヒトE1を発現する構築物／細胞を使用して、組み換えアデノウイルスを生成するために使用されるベクターをトランス補完する（transcomplement）ことができる。このことは、本発明のポリヌクレオチド配列と、現在利用可能なパッケージング構築物／細胞中に見られるヒトアデノウイルスE1配列との間の多様性のために、現在のヒトE1含有構築物／細胞の使用により複製及び産生プロセス中の複製可能な（replication-competent）アデノウイルスの生成が妨げられることから特に有利である。しかしながら、或る特定の状況では、E1欠失組み換えアデノウイルスの産生のためにE1遺伝子産物を発現する構築物／細胞を利用することが望ましい。
【0067】
必要に応じて、最低でも配列番号1～10のいずれか1つに従うアデノウイルスに由来するアデノウイルスE1遺伝子を、例えばHeLa細胞等の選択された親細胞株における発現のためのプロモーターの転写制御下で発現するヘルパー構築物／細胞又は細胞株を生成するために、本明細書で提供される配列を利用することができる。誘導性又は構成的プロモーターをこの目的で用いることができる。プロモーターの例は、例えば本明細書に記載される実施例に提示される。かかるE1発現細胞は、組み換えアデノウイルスE1欠失ベクターの生成に有用である。付加的又は代替的には、本発明は、組み換えアデノウイルスベクターの生成に用いられるのと基本的に同じ手順を用いて構築することができる、1つ以上のアデノウイルス遺伝子産物、例えばEla、Elb、E2a及び／又はE4 ORF6、好ましくはAd5 E4 ORF6を発現する構築物／細胞を提供する。かかる構築物／細胞は、それらの産物をコードする必須遺伝子中で欠失したアデノウイルスベクターをトランス補完するか、又はヘルパー依存ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）のパッケージングに必要なヘルパー機能をもたらすために利用することができる。
【0068】
概して、アデノウイルスベクターをトランスフェクションによって送達する場合、ベクターを約0.1 μg～約100 μgのDNA、好ましくは約10 μg～約50 μgのDNAの量で約1×104個の細胞～約1×103個の細胞、好ましくは約105個の細胞へと送達する。しかしながら、宿主細胞に対するベクターDNAの相対量は、選択されたベクター、送達方法及び選択される宿主細胞等の要因を考慮して調整することができる。宿主細胞へのベクターの導入は、トランスフェクション及び感染を含む当該技術分野で既知の又は本明細書で開示される任意の手段によって、例えばCaPO4トランスフェクション又はエレクトロポレーションを用いて達成することができる。
【0069】
所望の組み換えアデノウイルスの構築及び組立てのためには、当該技術分野で既知であるように、アデノウイルスベクターを一例ではin vitroにてヘルパー構築物の存在下でパッケージング細胞株にトランスフェクトし、ヘルパーとアデノウイルスベクター配列との間で相同組換えを生じさせることができ、これによりベクター中のアデノウイルス導入遺伝子配列を複製し、ビリオンカプシドにパッケージングして、組み換えウイルスベクター粒子を得ることが可能となる。本発明の組み換えアデノウイルスは、例えば選択された宿主細胞への選択された導入遺伝子の導入に有用である。
【0070】
好ましい実施形態では、第4の態様のアデノウイルスは、ヒト被験体の5%未満で血清陽性率（seroprevalence）を有し、好ましくはヒト被験体において血清陽性率を有さず、最も好ましくは以前に非ヒト大型類人猿アデノウイルス、より好ましくは配列番号1～10に従うアデノウイルスの1つ以上、特に全てと接触していないヒト被験体において血清陽性率を有しない。これに関連して、ヒト被験体がヨーロッパ人、アフリカの先住民、アジア人、アメリカの先住民及びオセアニアの先住民から選択される民族集団に属することが好ましい。ヒト被験体の民族起源を特定する方法は、当該技術分野に含まれる（例えば、国際公開第2003/102236号を参照されたい）。
【0071】
組み換えアデノウイルスの更なる好ましい実施形態では、アデノウイルスDNAは、哺乳動物標的細胞内に入ることが可能であり、すなわち感染性である。本発明の感染性組み換えアデノウイルスは、本明細書にも記載されるようにワクチンとして、また遺伝子療法に使用することができる。このため、別の実施形態では、組み換えアデノウイルスが標的細胞への送達のための分子を含むことが好ましい。標的細胞は哺乳動物細胞、例えば非ヒト大型類人猿細胞、齧歯類細胞又はヒト細胞であるのが好ましい。例えば、標的細胞への送達のための分子は、好ましくは発現カセット内の本明細書で定義される異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド（すなわち、異種遺伝子）であり得る。発現カセットをアデノウイルスのゲノムに導入する方法は、当該技術分野で既知である。一例では、例えば異種遺伝子をコードする発現カセットを含む本発明の組み換えアデノウイルスは、E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4から選択されるアデノウイルスのゲノム領域を上記発現カセットで置き換えることによって生成することができる。本発明のアデノウイルスのゲノム領域E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4は、ヒトAd5に由来するような既知の注釈付きのアデノウイルスゲノムとのアラインメントによって容易に特定することができる（Birgitt Taeuber and Thomas Dobner, Oncogene (2001) 20, p. 7847-7854、またAndrew J. Davison, et al., "Genetic content and evolution of adenoviruses", Journal of General Virology (2003), 84, p. 2895-2908を参照されたい）。
【0072】
標的細胞への送達のための分子は、好ましくは異種ポリヌクレオチドであるが、好ましくは治療活性又は診断活性を有する、ポリペプチド又は小化学化合物であってもよい。特に好ましい一実施形態では、標的細胞への送達のための分子は、アデノウイルス5'逆方向末端反復配列（ITR）及び3' ITRを含む異種ポリヌクレオチドである。組み換えアデノウイルスを、例えばパッケージング細胞において産生する場合に、分子の分子サイズをカプシドが分子の周りに形成され、分子をパッケージングすることができるように選ぶ必要があることが当業者に明らかである。このため、異種遺伝子は、例えば7000個まで、最大8000個までの塩基対を有することができるミニ遺伝子であるのが好ましい。
【0073】
第5の態様では、本発明は、第1又は第2の態様のポリヌクレオチドによってコードされるウイルス様粒子（VLP）を提供する。したがって、VLPは、第3の態様による少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチドを含む。一実施形態では、VLPをコードするポリヌクレオチドは、Iva2遺伝子が欠失しているか、又はIva2遺伝子中にヌル突然変異を有する。
【0074】
下のVLPの定義によると、第5の態様のVLPは、実質的にウイルスゲノムDNAを含まない。アデノウイルスVLPを含むVLPは、ワクチン接種、遺伝子療法、又は例えば抗癌剤の直接薬物送達に使用されている（Chroboczek et al., ACTA ABP BIOCHIMICA POLONICA, Vol. 61, No. 3/2014）。したがって、第5の（fifth）態様のVLPは、1つ以上の非アデノウイルスB細胞エピトープ及び／又は非アデノウイルスT細胞エピトープ、遺伝子療法のための1つ以上の非アデノウイルス遺伝子、及び／又は1つ以上の薬剤（pharmaceutical agents）、例えば抗癌剤を含み得る。一実施形態では、VLPは、1つ以上の非アデノウイルスB細胞エピトープを組み込み、好ましくは提示し、及び／又は1つ以上の非アデノウイルスT細胞エピトープを組み込む。
【0075】
第6の態様では、本発明は、第1又は第2の態様のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。好ましい実施形態では、ベクターはプラスミドベクター、例えば発現ベクターである。プラスミドベクターは、本明細書に記載される組み換えアデノウイルスを生成するために有利に使用することができる。新規のヘキソン、ペントン及びファイバータンパク質並びに本発明のVA RNAの配列情報が提供されることから、上記組み換えアデノウイルスは、例えば第1又は第2の態様のポリヌクレオチド及び任意の他のアデノウイルスゲノム領域によってコードされる組み換えアデノウイルスを構築することによって得ることができる。組み換えアデノウイルスを構築する方法は、当該技術分野で既知である。組み換えアデノウイルスの作製に有用な技法は、例えばGraham & Prevec, 1991 In Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. Murray, EJ.), p. 109、及びHitt et al., 1997 "Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer into Mammalian Cells" Advances in Pharmacology 40:137-206に概説されている。更なる方法が国際公開第2006/086284号に記載されている。
【0076】
第1又は第2の態様のポリヌクレオチドを発現させるために、転写を導く強力なプロモーターを、好ましくは発現カセットと共に含有する発現ベクターに上記ポリヌクレオチドをサブクローニングすることができる。好適な細菌プロモーター、例えば大腸菌（E. coli）、バシラス属の一種及びサルモネラが当該技術分野で既知であり、かかる発現系のためのキットが市販されている。同様に、哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞用の真核細胞発現系が当該技術分野で既知であり、同じく市販されている。発現カセットの更なる詳細については下記を参照されたい。
【0077】
細胞への遺伝情報の輸送に有用な特定の発現ベクターは、特に重要でない。真核細胞又は原核細胞での発現に使用される従来のベクターのいずれかを使用することができる。標準的な細菌発現ベクターとしては、pBR322系プラスミド等のプラスミド、pSKF、pET23D、並びにGST及びLacZ等の融合発現系が挙げられるが、有益に用いることができる、当該技術分野で当業者により知られている多くのベクターがある。真核生物ウイルスに由来する調節要素を含有する発現ベクターが通例、真核細胞発現ベクター、例えばSV40ベクター、パピローマウイルスベクター、及びエプスタインバーウイルスに由来するベクターにおいて用いられる。他の例示的な真核細胞ベクターとしては、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、pcDNA3.1、pIRES、及び例えばHCMV前初期プロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現に効果的であることが示される他のプロモーターの指導下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。一部の発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ及びジヒドロ葉酸還元酵素等の遺伝子増幅をもたらすマーカーを有する。代替的には、遺伝子増幅を伴わない高収率発現系も好適である。発現ベクター中に更に含まれ得る要素としては、大腸菌中で機能するレプリコン、組み換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする薬物耐性をコードする遺伝子、及び真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の固有の制限部位が挙げられる。選ばれる特定の薬物耐性遺伝子は重要ではなく、当該技術分野で既知の多くの薬物耐性遺伝子のいずれかが好適である。原核生物配列が、必要に応じて真核細胞におけるDNAの複製を妨げないように任意に選ばれる。
【0078】
第7の態様では、本発明は、（i）アジュバント、（ii）第1若しくは第2の態様の単離ポリヌクレオチド、第3の態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子、又は第6の態様のベクター、及び任意に（iii）薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物を提供する。アジュバントは、I型サイトカイン受容体、II型サイトカイン受容体、TNF受容体、転写因子として作用するビタミンD受容体、並びにToll様受容体1（TLR1）、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7及びTLR9からなる群から選択される受容体のアゴニストであるのが好ましい。
【0079】
アジュバントを含む組成物を、例えばヒト被験体用のワクチンとして使用することができる。例えば、特定の受容体の活性化により免疫応答を刺激することができる。かかる受容体は当業者に既知であり、例えばサイトカイン受容体、特にI型サイトカイン受容体、II型サイトカイン受容体、TNF受容体、並びに転写因子として作用するビタミンD受容体、並びにToll様受容体1（TLR1）、TLR-2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR-6、TLR7及びTLR9を含む。かかる受容体のアゴニストはアジュバント活性を有し、すなわち免疫賦活性である。好ましい実施形態では、組成物のアジュバントは、1つ以上のToll様受容体アゴニストであり得る。より好ましい実施形態では、アジュバントはToll様受容体4アゴニストである。特定の好ましい実施形態では、アジュバントはToll様受容体9アゴニストである。アジュバントの例については、下記を参照されたい。また、好ましい薬学的に許容可能な賦形剤を下に言及する。
【0080】
第8の態様では、本発明は、第1若しくは第2の態様のポリヌクレオチド、第3の態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子又は第6の態様のベクターを含む細胞を提供する。
【0081】
細胞は、アデノウイルスを複製不全とするために上で説明されるように欠失した又は非機能的なものとした少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子、又は好ましくは全てのアデノウイルス遺伝子を発現する宿主細胞であるのが好ましい。この少なくとも1つの遺伝子の発現により、宿主細胞は、そうでなければ複製不全のアデノウイルスの複製を可能にするのが好ましい。一実施形態では、宿主細胞はE1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4からなる群から選択される少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子を発現する。特に、この少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子は、アデノウイルスゲノム中で欠失する又は非機能的なものとされる。かかる補完細胞は、例えば上述の遺伝子産物の1つを欠くことから複製不全であるアデノウイルスの増殖及び救済（rescue）に使用することができる。
【0082】
細胞は大腸菌細胞等の細菌細胞、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）又はピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母細胞、植物細胞、SF9若しくはHi5細胞等の昆虫細胞、又は哺乳動物細胞から選択することができる。哺乳動物細胞の好ましい例は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胎児腎臓（HEK 293）細胞、HELA細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えばHuh7.5）、Hep G2ヒト肝細胞癌細胞、Hep 3Bヒト肝細胞癌細胞等である。
【0083】
細胞が第1又は第2の態様によるポリヌクレオチド（polynucleotide）を含む場合、このポリヌクレオチドは、（i）それ自体が自由に分散して、又は（ii）細胞ゲノム若しくはミトコンドリアDNA中に組み込まれて細胞内に存在することができる。
【0084】
更なる好ましい実施形態では、細胞はE1a、E1b、E2a、E2b、E4、L1、L2、L3、L4及びL5からなる群から選択される少なくとも1つのアデノウイルス遺伝子を発現する宿主細胞、好ましくは293細胞又はPER.C6（商標）細胞である。
【0085】
標準的なトランスフェクション方法を用いて細菌、哺乳動物、酵母又は昆虫の細胞株を作製することができる。外来ポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する既知の手順のいずれかを用いることができる。例えば、Lipofectamine（商標）（Invitrogen）等の市販のリポソームベースのトランスフェクションキット、Fugene（Roche Diagnostics）等の市販の脂質ベースのトランスフェクションキット、ポリエチレングリコールベースのトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃（バイオリスティック）、エレクトロポレーション又はウイルス感染、及びクローン化ゲノムDNA、cDNA、合成DNA又は他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入する他の既知の方法のいずれかを用いることができる。用いられる特定の遺伝子工学手順が、受容体を発現することが可能な宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を首尾よく導入することが可能であることのみが必要である。
【0086】
細胞の更なる実施形態は、上記の本発明の第4の態様に関して記載される。
【0087】
第9の態様では、本発明は、疾患の治療又は予防に使用される、第1若しくは第2の態様のポリヌクレオチド、第3の態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子、又は第6の態様のベクター及び／又は第7の態様の組成物を提供する。一実施形態では、治療又は予防はワクチン接種によるものである。別の実施形態では、治療は遺伝子療法によるものである。ワクチン接種に関しては、疾患は、好ましくは本明細書に記載される病原体に起因する感染性疾患、又は好ましくは健常細胞によって発現されない抗原を発現する罹患細胞（腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞等）を特徴とする非感染性疾患である。遺伝子療法に関しては、疾患は、遺伝子又はタンパク質の機能の喪失又は獲得をもたらす1つ以上の体細胞突然変異に起因する遺伝性疾患である。
【0088】
アデノウイルスが遺伝子療法において、またワクチンとして有用であることがよく知られている。前臨床研究及び臨床研究により、この系を用いたベクター設計、ロバストな抗原発現及び防御免疫の実現可能性が実証されている。このため、使用の好ましい実施形態は、例えばヒト被験体に対するワクチン接種におけるものである。アデノウイルスをワクチン接種のために使用し、作製する方法の詳細な指示は、当該技術分野に含まれ、当業者に既知の多数の文献として与えられる。例えば非ヒト大型類人猿アデノウイルスをベースとするウイルスベクターは、遺伝子ワクチンの開発のためのヒト由来Adベクターの使用の代替となる（非特許文献9、Fattori E, Gene Ther. 2006 Jul;13(14):1088-96）。非ヒト大型類人猿から単離されたアデノウイルスは、ヒトから単離されたアデノウイルスと、ヒト起源の細胞におけるそれらの効率的な増殖によって実証されるように密接に関連している。しかしながら、ヒトアデノウイルス及び非ヒト類人猿アデノウイルスが関連していることから、2つのウイルス種の間に血清学的交差反応性が或る程度見られる又は全く見られない可能性がある。この仮説は、チンパンジーアデノウイルスを単離し、特性評価することで確認された。このため、本発明による非ヒト大型類人猿アデノウイルスは、ヒトアデノウイルスの一般的な血清型に対するヒトにおける既存の免疫に伴う有害作用を低減する基礎を提供し、それにより例えば免疫化及び／又は遺伝子療法に用いることができる有益な医療ツールを提供する。
【0089】
これは、ヘキソン、ペントン及びファイバータンパク質を含むアデノウイルスカプシドタンパク質の新規の配列、特に最も表面に露出したアデノウイルスエピトープである新規のヘキソンHVR配列によるものである。したがって、ヒト血清中に存在することが予想される、カプシドタンパク質、特に本発明によるヘキソンHVRに特異的な中和抗体は全くない又は非常に少ない。このため、新規の配列の利点の1つは、例えば医療目的で設計された従来技術のアデノウイルスを改良するために使用することができることである。例えば、配列を用いて、例えば主要構造カプシドタンパク質の1つ以上、又は特に異なるアデノウイルス、例えば従来技術のアデノウイルスのヘキソンHVRのみを置き換え／置換し、ヒトにおける血清陽性率が低減した、改善された組み換えアデノウイルス（キメラアデノウイルス）を得ることができる。新規の配列、したがって記載のように再設計されたアデノウイルスは、投与の際にヒトにおける任意の顕著な阻害性免疫応答を生じないことから、それらの全体的な形質導入効率及び感染性が向上する。このため、このような改善されたアデノウイルスは、宿主細胞への侵入及び抗原の発現が任意の顕著な力価の中和抗体によって妨げられないため、より効果的なワクチンとなることが予想される。
【0090】
ワクチンがアジュバントを含むことが好ましい。好ましい免疫アジュバントは、本明細書で言及され、かかるワクチンに使用することができる。
【0091】
用途がワクチン接種である場合、本発明の組み換えアデノウイルスは、好ましくは1×108個～1×1011個のウイルス粒子（すなわち、1×108個、5×108個、1×109個、5×109個、1×1010個、2.5×1010個又は5×1010個の粒子）である免疫学的及び／又は予防的に効果的な用量で投与することができる。
【0092】
さらに、ブースティングを必要とするワクチン接種については、「異種プライム－ブースト（heterologous prime-boost）」方法論を適用するのが好ましい。ワクチン接種においては、第1若しくは第2の態様のポリヌクレオチド、第3の（third）態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子、又は第6の態様のベクター及び／又は第7の態様の組成物をプライミング（priming：初回刺激）又はブースティング、特に異種プライム－ブーストワクチン接種に使用することができる。異種プライム－ブーストの好ましい実施形態では、2つの異なるワクチン、例えばアデノウイルスを使用することができ、ここで第1若しくは第2の態様のポリヌクレオチド、第3の態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子、又は第6の態様のベクター及び／又は第7の態様の組成物を、例えばヒトにおける中和抗体の欠如のためにブーストワクチンとして使用することが特に有利である。
【0093】
本発明によるポリヌクレオチド若しくは組み換えアデノウイルスタンパク質、又はそのフラグメントを用いて作製される組み換えアデノウイルスは、宿主細胞にポリヌクレオチド、例えばDNAを形質導入するために使用することができる。このため、感染性（すなわち、宿主細胞内に入ることが可能）ではあるが、好ましくは複製欠損（replication deficient）のアデノウイルスを、宿主細胞において任意の独自のタンパク質又はポリペプチドを発現させるために作製することができる。このため、好ましい実施形態では、本発明による使用において挙げられる治療法は、遺伝子療法である。遺伝子療法はin vivo、ex vivo又はin vitro遺伝子療法であり得る。遺伝子療法は、体細胞遺伝子療法であるのが好ましい。本発明による単離ポリヌクレオチド、単離タンパク質、ベクター、組み換えアデノウイルス及び／又は医薬組成物を遺伝子療法に使用し、治療対象の被験体に投与する場合、治療により患者の1つ以上の細胞がトランスフェクトされる、すなわち形質導入されるように十分に多い用量で投与することが好ましい。本発明による組み換えアデノウイルス及び／又は医薬組成物を本明細書で開示される好ましい投与手段のいずれかによって投与する場合、好ましくは1×108個～5×1011個のウイルス粒子（すなわち、1×108個、5×108個、1×109個、5×109個、1×1010個、2.5×1010個、5×1010個、1×1011個、又は最も好ましくは5×1011個の粒子）である効果的な用量を投与することが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の組み換えアデノウイルスに含まれる、好ましくは異種のポリヌクレオチドは、被験体の宿主細胞においてタンパク質又はポリペプチドを発現することが可能であり、ここでタンパク質又はポリペプチドは、上記宿主細胞からのタンパク質又はポリペプチドの分泌をもたらすシグナルペプチドを含む。例えば、或る特定のタンパク質を必要とする患者は、そのタンパク質の分泌型をコードするcDNAを含む本発明のアデノウイルスを用いて治療することができる。
【0094】
本発明の使用の更なる実施形態では、第1若しくは第2の態様のポリヌクレオチド、第3の態様の少なくとも1つの単離アデノウイルスカプシドポリペプチド、第4の態様のアデノウイルス、第5の態様のウイルス様粒子、又は第6の態様のベクター及び／又は第7の態様の組成物（以下で本発明による医薬品と称される）は、1つ以上の薬学的に許容可能な希釈剤；担体；充填剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、崩壊剤及び吸着剤を含む賦形剤；及び／又は保存料を更に含むように配合される。
【0095】
本発明による医薬品は、経口、直腸、胃内及び非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内、皮下及び同様の投与経路を含む様々な既知の経路によって投与することができる。非経口投与、筋肉内投与及び静脈内投与が好ましい。本発明による医薬品は、シロップ、注入若しくは注射溶液、錠剤、カプセル、カプレット（caplet）、トローチ剤、リポソーム、坐剤、硬膏、バンドエイド、徐放性（retard）カプセル、粉末、又は持続放出配合物として配合するのが好ましい。希釈剤は水、緩衝液、緩衝塩溶液又は塩溶液であるのが好ましく、担体は、ココアバター及びビテベソール（vitebesole）からなる群から選択されるのが好ましい。
【0096】
本発明の使用における本発明による医薬品の投与のための特定の好ましい医薬品形態は、注射用途に好適な形態であり、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。通例、かかる溶液又は分散液は、例えば水で緩衝化した（water-buffered）水溶液、例えば生体適合性緩衝液、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリオール、それらの好適な混合物、界面活性剤又は植物油を含有する溶媒又は分散媒を含む。
【0097】
注入又は注射溶液は、抗菌剤又は抗真菌剤、例えばパラベン（parabene）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸又はチメロサール（thimerosal）のような保存料の添加を含むが、これに限定されない様々な当該技術分野において認識されている技法によって達成することができる。さらに、糖又は塩、特に塩化ナトリウム等の等張剤を注入又は注射溶液に組み込むことができる。
【0098】
本発明の好ましい希釈剤は水、生理学的に許容可能な（physiological acceptable）緩衝液、生理学的に許容可能な緩衝塩溶液又は塩溶液である。好ましい担体は、ココアバター及びビテベソールである。本発明による医薬品の様々な医薬品形態と共に使用することができる賦形剤は、以下の非限定的なリストから選ぶことができる：
a）ラクトース、マンニトール、結晶ソルビトール、二塩基性リン酸塩、リン酸カルシウム、糖、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；
b）ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、水添植物油、ロイシン、グリセリド（glycerides）及びステアリルフマル酸ナトリウム等の滑沢剤、
c）デンプン、クロスカルメロース（croscarmellose）ナトリウム、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の崩壊剤。
a）ラクトース、マンニトール、結晶ソルビトール、二塩基性リン酸塩、リン酸カルシウム、糖、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；
b）ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、水添植物油、ロイシン、グリセリド（glycerides）及びステアリルフマル酸ナトリウム等の滑沢剤、
c）デンプン、クロスカルメロース（croscarmellose）ナトリウム、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の崩壊剤。
【0099】
他の好適な賦形剤は、American Pharmaceutical Associationにより出版されたHandbook of Pharmaceutical Excipientsに見ることができる。
【0100】
一定量の本発明による医薬品が疾患の治療法又は予防法に好ましい。しかしながら、疾患の重症度、疾患のタイプ、及び治療対象のそれぞれの患者、例えば患者の全身健康状態等に応じて、異なる用量の本発明による医薬品が治療効果又は予防効果を引き出すために必要とされることが理解される。適切な用量の決定は、主治医の裁量の範囲内にある。本発明による医薬品を予防的に使用すべき場合、ワクチンとして配合することができる。この場合、本発明による医薬品は、上で概説される好ましい用量及び特定の好ましい用量で投与するのが好ましい。ワクチンの投与は、ワクチン接種を受けた被験体が本発明による医薬品に対して十分な抗体を生成し、それぞれの疾患を発症するリスクが低下するまで、規定の期間にわたって少なくとも2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回又は少なくとも10回繰り返すのが好ましい。この場合の期間は通常、ワクチンの抗原性に応じて様々である。期間が4週間、3ヶ月、6ヶ月又は3年間を超えないのが好ましい。一実施形態では、本発明によるアデノウイルスをワクチン接種目的で使用する場合、ヘキソンタンパク質の超可変ドメインの少なくとも1つを、ワクチン接種が対象とするそれぞれの病因物質の免疫原性エピトープに置き換えることができる。ワクチンは通例、上に概説される1つ以上のアジュバントを含有する。ワクチン接種へのアデノウイルスの使用の詳細な概要及びそれに関連する方法は、Bangari DS and Mittal SK (2006) Vaccine, 24(7), p. 849-862に提示されている。Zhou D, et al., Expert Opin Biol Ther. 2006 Jan;6(1):63-72及びFolgori A, et al., Nat Med. 2006 Feb;12(2):190-7も参照されたい。Draper SJ, et al., Nat Med. 2008 Aug;14(8):819-21. Epub 2008 Jul 27も参照されたい。
【0101】
第10の態様では、本発明は、アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子を作製するin vitro方法であって、
（i）第1又は第2の態様の単離ポリヌクレオチドを、アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子が細胞中で組み立てられるように細胞において発現させる工程と、
（ii）アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子を細胞又は細胞周辺の培地から単離する工程と、
を含む、in vitro方法に関する。
（i）第1又は第2の態様の単離ポリヌクレオチドを、アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子が細胞中で組み立てられるように細胞において発現させる工程と、
（ii）アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子を細胞又は細胞周辺の培地から単離する工程と、
を含む、in vitro方法に関する。
【0102】
上記方法は、工程（i）前に、第1若しくは第2の態様の単離ポリヌクレオチド又は第6の態様のベクターを、例えば上記のような細胞に導入する更なる工程を任意に含む。
【0103】
単離ポリヌクレオチドが第4の態様のアデノウイルス又は第5の態様のウイルス様粒子をコードすることが一般に好ましい。アデノウイルスは、複製不全であるのが好ましい。細胞は、第7の態様の細胞であるのが好ましい。単離ポリヌクレオチドが複製不全アデノウイルスをコードする場合、細胞がヘルパー細胞であるか、又は本明細書に記載されるヘルパー構築物（例えば、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルス、例えば工程（i）の前又は工程（i）中にヘルパー構築物を形質導入する、好ましくはヘルパーウイルスを感染させるように）を含み、ヘルパー細胞又はヘルパー構築物がそれぞれ、アデノウイルスを複製不全にする遺伝子／ゲノム領域を発現することが好ましい。
【0104】
「アデノウイルス又はアデノウイルス様粒子が細胞内で組み立てられるように」は、工程（i）において、本明細書に記載されるアデノウイルス又はアデノウイルス様粒子の組立てに必要な全ての遺伝子が細胞内で発現されることを意味する。これには、アデノウイルスが組み立てられる場合にアデノウイルスのパッケージング（すなわち、ウイルスカプシドへのゲノムのパッケージング）に必要な全ての遺伝子が含まれる。
【0105】
好ましい実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、上で定義されるVA RNA IIノンコーディングRNA及び／又はVA RNA IノンコーディングRNAをコードする。本発明によるVA RNAは、実施例1に示される方法のアデノウイルス又はアデノウイルス様粒子の収率の改善をもたらす。
【0106】
定義及び本発明の更なる実施形態
以下では、本明細書においてよく使用される用語の一部の定義を提示する。これらの用語は、その使用のいずれの場合も、本明細書の残りの部分において、それぞれ定義される意味及び好ましい意味を有する。
以下では、本明細書においてよく使用される用語の一部の定義を提示する。これらの用語は、その使用のいずれの場合も、本明細書の残りの部分において、それぞれ定義される意味及び好ましい意味を有する。
【0107】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、それが自然状態で会合する他の分子を実質的に含まない分子を指す。特に、単離されたとは、分子が動物の身体又は動物の身体サンプル中にないことを意味する。このため、単離分子は、動物内で他の分子とは会合又は接触することがない。単離されたとは、本明細書に記載されるような関連する他の構成要素から単離されること、例えば分子が含まれる組成物の他の構成要素から単離されること、又はそれが含まれるベクター若しくは細胞から単離されることを意味するものではない。
【0108】
「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸、すなわち複数のヌクレオチドから構成される生体分子を指すことを意図したものである。これにはDNA、RNA及び合成類縁体、例えばPNAが含まれる。DNAが好ましい。
【0109】
「オープンリーディングフレーム」（ORF）という用語は、アミノ酸に翻訳することができるヌクレオチドの配列を指す。通例、ORFは開始コドン、通常は3ヌクレオチドの倍数である長さを有する後続の領域を含有するが、所与のリーディングフレーム内の終止コドン（TAG、TAA、TGA、UAG、UAA又はUGA）を含有しない。ORFは、それが翻訳され得るアミノ酸がペプチド連結鎖を形成するタンパク質をコードする。
【0110】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」（"peptide", "polypeptide", "peptides" and "polypeptides"）という用語は、全体を通して区別なく使用される。これらの用語は自然発生ペプチド、例えば自然発生タンパク質、及び自然発生又は非自然発生アミノ酸を含み得る合成ペプチドの両方を指す。ペプチドは、天然又は非自然発生アミノ酸の側鎖又は遊離アミノ末端若しくはカルボキシ末端を修飾することによって化学修飾されていてもよい。この化学修飾は、更なる化学部分の付加、及びグリコシル化等のアミノ酸の側鎖中の官能基の修飾を含む。ペプチドは、好ましくは少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個又は少なくとも100個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも8個又は少なくとも30個のアミノ酸を含む重合体である。本明細書で開示されるポリペプチド及びタンパク質はアデノウイルスに由来するため、本明細書で使用される単離ポリペプチド又はタンパク質の分子質量が200 kDaを超えないことが好ましい。
【0111】
アデノウイルス（Ad）は、幾つかの鳥類及び哺乳動物宿主において同定されている無エンベロープ正二十面体ウイルスである。ヒトアデノウイルス（hAd）は、既知の全てのヒトAd及び動物（例えばウシ、ブタ、イヌ、ネズミ、ウマ、サル及びヒツジ）起源の多くのAdを含むマストアデノウイルス属に属する。ヒトアデノウイルスは概して、ラット及びアカゲザル赤血球の血球凝集特性、DNA相同性、制限酵素切断パターン、G+C含量のパーセンテージ、並びに発癌性を含む多数の生物学的、化学的、免疫学的及び構造的基準に基づいて6つのサブグループ（A～F）に分けられる（非特許文献1及びHorwitz, 1990; in Virology, eds. B. N. Fields and D. M. Knipe, pps. 1679-1721）。
【0112】
アデノウイルスビリオンは、正二十面体対称を有し、血清型に応じて60 nm～90 nmの直径を有する。正二十面体カプシドは、3つの主要タンパク質であるヘキソン（II）、ペントンベース（III）及びノブのある（knobbed）ファイバー（IV）タンパク質を含む（W. C. Russel, J. Gen.Virol., 81: 2573-2604 (2000)）。より具体的には、アデノウイルスカプシドは、252個のカプソメアを含み、そのうち240個がヘキソンであり、12個がペントンである。ヘキソン及びペントンは、3つの異なるウイルスポリペプチドに由来する。ヘキソンは、3つの同一のポリペプチド、すなわちポリペプチドIIを含む。ペントンは、カプシドへの付着点をもたらすペントンベース、及びペントンベースに非共有的に結合し、突出した三量体ファイバータンパク質を含む。他のタンパク質、すなわちタンパク質IX、VI及びIIIaも通常アデノウイルスカプシド中に存在する。これらのタンパク質は、ウイルスカプシドを安定化すると考えられている。
【0113】
ヒトにおいて観察される既存の免疫の一態様は、アデノウイルスタンパク質に特異的な抗体の産生及び持続をもたらし得る液性免疫である。アデノウイルスによって引き起こされる液性応答は、主に構造タンパク質ヘキソンの超可変領域に対するものである。非ヒト大型類人猿から単離されたアデノウイルスは、ヒトから単離されたアデノウイルスと、ヒト起源の細胞におけるそれらの効率的な増殖によって実証されるように密接に関連している。
【0114】
カプシドは、T細胞エピトープ及び／又はB細胞エピトープ等の非アデノウイルスポリペプチドを組み込むことによって本明細書に記載されるように修飾することができる。
【0115】
「ヘキソンタンパク質」という用語は、アデノウイルスに含まれるヘキソン（II）タンパク質を指す。本発明によるヘキソンタンパク質又はその変異体は、感染性アデノウイルスビリオン中のヘキソンタンパク質又はそのフラグメントと同じ機能を有する。このため、好ましくはカプシドタンパク質として上記ヘキソン又はその変異体を含むアデノウイルスは、宿主細胞内に入ることが可能である。ヘキソンタンパク質の変異体を生成する好適な方法は、米国特許第5,922,315号に記載されている。この方法では、アデノウイルスヘキソンの少なくとも1つのループ領域を別のアデノウイルス血清型の少なくとも1つのループ領域と交換する。組み換えアデノウイルスが宿主細胞内に入ることができるかを容易に決定することができる。例えば、宿主細胞をアデノウイルスと接触させた後、組み換え宿主細胞を洗浄し、溶解させることができ、アデノウイルスRNA及び／又はDNAが宿主細胞中に見られるかを、例えばアデノウイルスRNA及び／又はDNAに特異的な適切なハイブリダイゼーションプローブを用いて決定することができる。代替的又は付加的には、組み換えアデノウイルスと接触させた後の宿主細胞を洗浄し、溶解させ、例えばウエスタンブロットを用いてアデノウイルス特異抗体でプローブすることができる。また別の代替案では、宿主細胞における遺伝子産物の発現に好適な発現カセットを含む組み換えアデノウイルスによる感染後に宿主細胞が遺伝子産物、例えば蛍光タンパク質を発現するかを、例えばin vivoで観察する。
【0116】
「超可変領域」という用語は、株間で高い配列変異を有し、ヘキソンタンパク質の溶媒露出面に位置するため、ウイルスカプシドの外側に露出するドメインを指す。これらは中和抗体の主要決定基である。HVRは、例えば他のヘキソンタンパク質との配列アラインメントによって特定することができる。
【0117】
「アデノウイルスペントンタンパク質」とは、アデノウイルスに含まれるペントンベース（III）タンパク質を意味する。アデノウイルスペントンタンパク質は、カプシドの正二十面体対称の角に局在化することを特徴とする。本発明によるペントンタンパク質又はその変異体は、感染性アデノウイルスビリオン中のペントンタンパク質と同じ機能を有する。このため、好ましくはカプシドタンパク質として上記ペントン又はその変異体を含むアデノウイルスは、宿主細胞内に入ることが可能であり、これを上記のように試験することができる。さらに、機能性ペントンは、アデノウイルスファイバータンパク質に対して親和性を有する。平均的な当業者は、タンパク質間の親和性を試験する方法を十分に認識している。第1のタンパク質が第2のタンパク質に結合することが可能であるかを決定するために、例えば遺伝学的酵母ツーハイブリッドアッセイ、又はプルダウン、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、蛍光活性化セルソーティング（FACS）ベースのアッセイ若しくはプラズモン共鳴アッセイ等の生化学アッセイを用いることができる。プルダウン又はプラズモン共鳴アッセイを用いる場合、生化学の技術分野で既知であるように、タンパク質の少なくとも1つをHISタグ、GSTタグ又は他のタグ等のアフィニティタグに融合することが有用である。
【0118】
「ファイバータンパク質」という用語は、アデノウイルスに含まれるノブのあるファイバー（IV）タンパク質を指す。本発明によるファイバータンパク質又はその変異体は、感染性アデノウイルスビリオン中のファイバータンパク質又はそのフラグメントと同じ機能を有する。このため、好ましくはカプシドタンパク質として上記ファイバー又はファイバー変異体を含むアデノウイルスは、宿主細胞内に入ることが可能であり、これを上記のように試験することができる。さらに、機能性ファイバータンパク質は、アデノウイルスペントンタンパク質に対して親和性を有する。また、グリコシル化形態の機能性アデノウイルスファイバータンパク質は、三量化することが可能である。このため、変異体がグリコシル化され、及び／又は三量体を形成することが可能であることも好ましい。三量化を含む親和性は、上記のように試験することができ、グリコシル化アッセイも当該技術分野で既知である。
【0119】
「VA（ウイルス関連）RNA」は、アデノウイルス中に見られる一種のノンコーディングRNAである。これは翻訳の調節において役割を果たす。VAI又はVA RNA I及びVAII又はVA RNA IIと呼ばれる、このRNAの2つのコピーが存在する。2つのVA RNA遺伝子は、アデノウイルスゲノム中で別個の遺伝子である。VA RNA Iが主要な種であり、VA RNA IIは、より低レベルで発現される。どちらの転写産物もポリアデニル化されず、どちらもPolIIIによって転写される。
【0120】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はタンパク質の配列との関連での「同一性」又は「同一の」という用語は、最大の一致についてアラインメントされた場合に同一である2つの配列中の残基の数を指す。具体的には、2つの配列の配列同一性パーセントは、核酸配列又はアミノ酸配列に関わらず、2つのアラインメントされた配列間の完全な一致の数を短い方の配列の長さで除算し、100を乗算したものである。2つの配列をアラインメントするために用いることができるアラインメントツールは当業者に既知であり、例えばワールドワイドウェブ上、例えばポリペプチドアラインメントのためのClustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）、又はポリヌクレオチドアラインメントのためのMUSCLE（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）若しくはMAFFT（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）、又はポリヌクレオチド及びポリペプチドのアラインメントのためのWATER（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/）で得ることができる。2つの配列間のアラインメントは、デフォルトのパラメーター設定、例えばMAFFTについては、好ましくはMatrix：Blosum62、Gap Open 1.53、Gap Extend 0.123、WATERのポリヌクレオチドについては、好ましくはMATRIX：DNAFULL、Gap Open：10.0、Gap Extend 0.5、WATERのポリペプチドについては、好ましくはMATRIX：BLOSUM62、Gap Open：10.0、Gap Extend：0.5を用いて行うことができる。十分なアラインメントをもたらすためにいずれかの配列中にギャップを導入する必要があり得ることが当業者には理解される。「最良の配列アラインメント」は、最小数のギャップを有した上で最大数の同一の残基のアラインメントをもたらすアラインメントとして定義される。これは、アラインメントにあらゆる配列中のあらゆる残基を含むグローバルアラインメントであるのが好ましい。
【0121】
「変異体」という用語は、ポリペプチドに関して、概してポリペプチドの修飾バージョン、例えば突然変異を指し、ポリペプチドの1つ以上のアミノ酸が欠失、挿入、修飾及び／又は置換されている可能性がある。概して、変異体は機能性であり、機能性変異体を含むアデノウイルスが宿主細胞に感染することが可能であることを意味する。より具体的な機能は本明細書で定義され、一般的定義に優先する。「突然変異」又は「アミノ酸突然変異」は、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入であり得る（「及び」は、2つ以上の突然変異が存在する場合に適用することができる）。これは置換（すなわち、保存的又は非保存的アミノ酸置換）、より好ましくは保存的アミノ酸置換であるのが好ましい。一部の実施形態では、置換は、非自然発生アミノ酸との自然発生アミノ酸の交換も含む。保存的置換は、置換されるアミノ酸と同様の化学的特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む。保存的置換は、以下のものからなる群から選択される置換であるのが好ましい：
（i）別の異なる塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換；
（ii）別の異なる酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換；
（iii）別の異なる芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換；
（iv）別の異なる非極性脂肪族アミノ酸による非極性脂肪族アミノ酸の置換；及び、
（v）別の異なる極性非荷電アミノ酸による極性非荷電アミノ酸の置換。
（i）別の異なる塩基性アミノ酸による塩基性アミノ酸の置換；
（ii）別の異なる酸性アミノ酸による酸性アミノ酸の置換；
（iii）別の異なる芳香族アミノ酸による芳香族アミノ酸の置換；
（iv）別の異なる非極性脂肪族アミノ酸による非極性脂肪族アミノ酸の置換；及び、
（v）別の異なる極性非荷電アミノ酸による極性非荷電アミノ酸の置換。
【0122】
塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群から選択されるのが好ましい。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であるのが好ましい。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択されるのが好ましい。非極性脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群から選択されるのが好ましい。極性非荷電アミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるのが好ましい。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は、上で概説される保存的置換（i）～（v）に該当しない、任意のアミノ酸との或るアミノ酸の交換である。
【0123】
配列同一性を決定する手段は上に説明している。
【0124】
タンパク質のアミノ酸は、修飾、例えば化学修飾することもできる。例えば、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸の側鎖又は遊離アミノ若しくはカルボキシ末端を、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化等によって修飾することができる。化学修飾は、当該技術分野で既知であるようにin vivoで、例えば宿主細胞内で行うこともできる。例えば、タンパク質のアミノ酸配列中に存在する好適な化学修飾モチーフ、例えばグリコシル化配列モチーフによりタンパク質がグリコシル化される。修飾により修飾アミノ酸の同一性の変化（例えば、置換又は欠失）がもたらされない限り、修飾ポリペプチドは、或る特定の配列番号に関して言及されるポリペプチドの範囲内であり、すなわち本明細書で定義される変異体ではない。
【0125】
「変異体」という用語は、ポリヌクレオチドに関して、概してポリヌクレオチドの修飾バージョン、例えば突然変異を指し、ポリヌクレオチドの1つ以上のヌクレオチドが欠失、挿入、修飾及び／又は置換されている可能性がある。概して、変異体は機能性であり、機能性変異体を含むアデノウイルスが宿主細胞に感染することが可能であることを意味する。より具体的な機能は本明細書で定義され、一般的定義に優先する。「突然変異」は、ヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入であり得る（「及び」は、2つ以上の突然変異が存在する場合に適用することができる）。これは置換であるのが好ましく、より好ましくはアミノ酸置換、最も好ましくは保存的アミノ酸置換を引き起こす。
【0126】
「抗原タンパク質又はそのフラグメント」（フラグメントも抗原性である）は、哺乳動物において免疫応答を引き起こすことが可能である。これは腫瘍抗原又は病原体に由来する抗原であるのが好ましい。「病原体」という用語は、被験体において疾患を引き起こす可能性がある任意の生物を指す。これには細菌、原生動物、真菌、線虫、ウイロイド、ウイルス及び寄生生物が含まれるが、これらに限定されず、各病原体は、単独で又は別の病原体と協調して、哺乳動物を含むが、これに限定されず、ヒトを含むが、これに限定されない脊椎動物において疾患を引き起こす場合がある。本明細書で使用される場合、「病原体」という用語は、通常は非免疫不全宿主において病原性でない場合があり、免疫不全宿主において病原性である生物も包含する。
【0127】
一般的に言うと、アデノウイルスゲノムは、よく特徴付けられている。同様に位置付けられる特定のオープンリーディングフレームに関するアデノウイルスゲノムの組織全体、例えば各ウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、LI、L2、L3、L4及びL5遺伝子の位置に全般的保存が見られる。アデノウイルスゲノムの両端がウイルス複製に必要な逆方向末端反復（ITR）として知られる配列を含む。ウイルスは、感染性ビリオンの産生に必要とされる一部の構造タンパク質のプロセシングに必要なウイルスコードプロテアーゼも含む。アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞の形質導入後にウイルス遺伝子が発現される順序に基づいて説明される。より具体的には、ウイルス遺伝子は、転写がDNA複製の開始前又は開始後に生じるかにより初期（E）又は後期（L）遺伝子と称される。形質導入の初期では、アデノウイルスのE1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4遺伝子が発現され、ウイルス複製のために宿主細胞を準備する。感染の後期において、ウイルス粒子の構造要素をコードする後期遺伝子L1～L5の発現が活性化される。
【0128】
「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、プラスミドベクター、コスミドベクター、ラムダファージ等のファージベクター、アデノウイルス（Ad）ベクター（例えば、非複製Ad5、Ad11、Ad26、Ad35、Ad49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63及びChAd82ベクター、又は従来技術、例えば国際公開第2005/071093号から既知の複製可能なAd4及びAd7ベクター）、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター（例えばAAV 5型）、アルファウイルスベクター（例えばベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEE）、シンドビスウイルス（SIN）、セムリキ森林ウイルス（SFV）及びVEE-SINキメラ）、ヘルペスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（MVA）、NYVAC（ワクシニアのコペンハーゲン株に由来する）、及びアビポックスベクター：カナリア痘（ALVAC）及び鶏痘（FPV）ベクター）、及び水疱性口内炎ウイルスベクター等のウイルスベクター、ウイルス様粒子、又は細菌芽胞を含む当業者に既知の任意のベクターを含む。ベクターには発現ベクター、クローニングベクター、及び宿主細胞における組み換えアデノウイルスの生成に有用なベクターも含まれる。
【0129】
上述のように、「異種タンパク質又はそのフラグメント」は、非アデノウイルスタンパク質又はそのフラグメント、特に抗原タンパク質又はそのフラグメントであり得る。この目的で、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標的細胞に送達される分子、例えば抗原タンパク質又はそのフラグメント、好ましくは病原性ウイルス、細菌、真菌、原生動物若しくは寄生生物等の病原体の抗原タンパク質若しくはフラグメント、又は腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドであり得る。「抗原」は、哺乳動物において免疫応答を引き起こすことが可能な任意のタンパク質又はペプチドを指す。抗原は、好ましくは少なくとも8個のアミノ酸を含み、最も好ましくは8個～12個のアミノ酸を含む。
【0130】
「発現カセット」という用語は、発現すべき少なくとも1つの核酸配列を、その転写及び翻訳制御配列と共に含む核酸分子を指す。発現カセットを変更することで、それが組み込まれるベクターが、異なる配列又は配列の組合せの発現を導く。好ましくは5'末端及び3'末端に存在するように設計される制限部位のために、カセットを容易に挿入し、除去し、又は別のカセットと交換することができる。発現カセットは、所与の遺伝子の効率的な発現のためにプロモーター、開始部位及び／又はポリアデニル化部位等のシス調節要素を含むのが好ましい。本発明に関してより具体的には、発現カセットは、宿主細胞における第1又は第2の態様のポリヌクレオチドの発現に必要とされる付加的な要素を全て含有する。このため、典型的な発現カセットは、第1又は第2の態様のポリヌクレオチドに操作可能に連結したプロモーター、及び転写産物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、並びに翻訳終結を含有する。カセットの付加的な要素には、例えばエンハンサーが含まれ得る。発現カセットは、効率的な終結をもたらすために構造遺伝子の下流の転写終結領域も含有するものとする。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ても、又は異なる遺伝子から得てもよい。
【0131】
本明細書で使用される場合、「ミニ遺伝子」という用語は、自然発生遺伝子に対して遺伝子の1つ以上の機能的に必須でないセグメントが欠失した異種遺伝子構築物を指す。「ミニ遺伝子カセット」は、発現のためのミニ遺伝子を含む発現カセットである。
【0132】
「複製可能な」組み換えアデノウイルス（AdV）という用語は、細胞に含まれる任意の組み換えヘルパータンパク質の非存在下で宿主細胞において複製することができるアデノウイルスを指す。「複製可能な」アデノウイルスは、以下の無傷又は機能的な必須の初期遺伝子：E1A、E1B、E2A、E2B、E3及びE4を含むのが好ましい。特定の動物から単離された野生型アデノウイルスは、その動物において複製可能である。
【0133】
「複製欠損」又は「複製不全」組み換えAdVという用語は、少なくとも機能的欠失、すなわち遺伝子の機能を、それを完全に除去することなく損なう欠失、例えば人工終止コドンの導入、活性部位若しくは相互作用ドメインの欠失若しくは突然変異、遺伝子の調節配列等の突然変異若しくは欠失、又はE1、E2、E3及びE4から選択される1つ以上のアデノウイルス遺伝子等のウイルス複製に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子の完全な除去を含むように設計されていることにより、複製することができなくなったアデノウイルスを指す。本発明の組み換えアデノウイルス（adenoviral viruses）は、複製欠損であるのが好ましい。
【0134】
「組み換えアデノウイルス」という用語は特に、異種ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド配列を含むように改変されたアデノウイルスを指す。「異種」は、別のアデノウイルス株、特に異なる宿主（例えばヒト宿主、このためAd3又はAd5等のヒトアデノウイルス）、又は本明細書に記載される病原体に由来する抗原のような非アデノウイルス生物、又はヒト腫瘍抗原等のヒトからのものであることを意味し得る。そのため、この用語は、キメラアデノウイルス及び担体アデノウイルスをそれぞれ含む。組み換えアデノウイルスは、他のアデノウイルス又は非アデノウイルス生物の両方に由来する異種ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド配列を含み、すなわちキメラアデノウイルス及び担体アデノウイルスの両方であり得る。
【0135】
本明細書で使用される場合、「ウイルス様粒子」すなわち「VLP」という用語は、この場合アデノウイルスに由来する、複製しない空のウイルスシェルを指す。VLPは概して、限定されるものではないが、カプシド、コート、シェル、表面及び／又はエンベロープタンパク質と称されるタンパク質等の1つ以上のウイルスタンパク質から構成される。VLPは、効率的な細胞侵入を確実にする、ウイルスによる細胞透過に関与する機能性ウイルスタンパク質を含有する。VLPは、適切な発現系におけるタンパク質の組み換え発現後に自然に形成され得る。特定のVLPを作製する方法は、当該技術分野で既知である。アデノウイルスVLPは、特にウイルスDNAパッキングに関与するアデノウイルスのIva2遺伝子を機能的に損なう、例えば欠失させる、又はヌル突然変異をIva2遺伝子に導入することによって作製することができる（Ostapchuk et al. J Virol. 2011 Jun; 85(11): 5524-5531）。VLPの存在は、当該技術分野で既知の従来の技法を用いて、例えば電子顕微鏡法、X線結晶構造解析等によって検出することができる。例えば、Baker et al., Biophys. J. (1991) 60:1445-1456、Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68:4503-4505を参照されたい。例えば、低温電子顕微鏡法は、問題のVLP調製物のガラス化水性サンプルに対して行うことができ、画像を適切な露出条件下で記録する。
【0136】
VLP中に「ウイルスゲノムDNAが実質的に含まれない」とは、ウイルスゲノムDNAがVLP中に存在しないか、又はVLPに感染した、ウイルス複製を行うことができるようにVLP中のDNAを補完するDNAを発現しない細胞におけるウイルス複製を可能にするのに十分なウイルスDNAがVLP中に存在しないことを意味する。
【0137】
上記の点に加えて、抗原決定基としても知られる「エピトープ」は、免疫系、具体的には抗体、B細胞又はT細胞によって認識される巨大分子のセグメントである。本発明の文脈においては、「エピトープ」という用語が免疫系によって認識されるタンパク質又はポリプロテインのセグメントを指すことが好ましい。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖等の化学的に活性な分子の表面集団（surface groupings）からなり、通常は特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープ及び非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で立体配座エピトープへの結合が失われ、非立体配座エピトープへの結合が失われないという点で区別される。
【0138】
「非アデノウイルスT細胞エピトープ」は、MHC分子に結合して抗原提示細胞の表面に提示され得るエピトープである。ヒトでは、プロフェッショナル抗原提示細胞がMHCクラスIIペプチドの提示に特殊化し、殆どの有核体細胞がMHCクラスIペプチドを提示する。MHCクラスI分子によって提示されるT細胞エピトープは通例、8アミノ酸長～11アミノ酸長のペプチドであり、MHCクラスII分子は、より長い、13アミノ酸長～17アミノ酸長のペプチドを提示する。
【0139】
「非アデノウイルスB細胞エピトープ」は、B細胞によって天然抗原の表面上で三次元構造として認識されるエピトープである。
【0140】
B細胞エピトープ及びT細胞エピトープは、コンピューターによるツール、例えばIEDB Analysis ResourceのオンラインのB細胞又はT細胞予測ツールを用いて予測することができる。
【0141】
「1つ以上の非アデノウイルスB細胞エピトープを提示する」という用語は、1つ以上のエピトープがB細胞によって認識されるようにカプシド中に組み込まれることを意味する。「1つ以上の非アデノウイルスB細胞／T細胞エピトープを組み込む」という用語は、エピトープがカプシド中に組み込まれることなくVLP中に含有されるか、又はカプシド中に組み込まれることを意味する。エピトープがカプシド中に組み込まれる場合、エピトープは、免疫細胞によって認識され得るように外側に提示されていても、又は外側に提示されていなくてもよい。
【0142】
「免疫アジュバント」又は単に「アジュバント」は、抗原／免疫原に対する免疫応答の品質及び／又は強度を、抗原単独の投与と比較して加速、延長及び／又は増強し、したがって任意の所与のワクチンに必要な抗原／免疫原の量、及び／又は関心の抗原／免疫原に対して適切な免疫応答を生じさせるために必要な注射の頻度を低減する物質である。本発明による組成物との関連で使用することができるアジュバントの例は、水酸化アルミニウム（アラム）のゲル状沈殿物；AlPO4；alhydrogel；グラム陰性細菌の外膜に由来する細菌産物、特にモノホスホリルリピドA（MPLA）、リポ多糖（LPS）、ムラミルジペプチド及びそれらの誘導体；フロイント不完全アジュバント；リポソーム、特に中性リポソーム、組成物及び任意にサイトカインを含有するリポソーム；非イオン性ブロック共重合体；ISCOMATRIXアジュバント（Drane et al., 2007）；CpGジヌクレオチド（CpGモチーフ）を含む非メチル化DNA、特にホスホロチオエート（PTO）骨格（CpG PTO ODN）又はホスホジエステル（PO）骨格（CpG PO ODN）を有するCpG ODN；合成リポペプチド誘導体、特にPam3Cys；リポアラビノマンナン；ペプチドグリカン；ザイモサン；熱ショックタンパク質（HSP）、特にHSP 70；dsRNA及びその合成誘導体、特にポリI：ポリC；ポリカチオン性ペプチド、特にポリ-L-アルギニン；タキソール；フィブロネクチン；フラジェリン；イミダゾキノリン；アジュバント活性を有するサイトカイン、特にGM-CSF、インターロイキン-（IL-）2、IL-6、IL-7、IL-18、I型及びII型インターフェロン、特にインターフェロン-γ、TNF-α；25-ジヒドロキシビタミンD3（カルシトリオール）；並びに合成オリゴペプチド、特にMHCII提示ペプチドである。POE-POP-POEブロック共重合体等のポリオキシエチレン（POE）及びポリオキシプロピレン（POP）を含有する非イオン性ブロック重合体をアジュバントとして使用することができる（Newman et al., 1998）。このタイプのアジュバントは、活性成分として核酸を含む組成物に特に有用である。
【0143】
本発明の文脈における「ワクチン接種」という用語は、好適な免疫原性配合物中の抗原（ワクチン接種を受けた個体の免疫系により外来の、ひいては免疫原性と認識される物質）を（例えば皮下、皮内、筋肉内、経口、経鼻）投与することによる特異的免疫応答の誘導である能動免疫化である。このため、抗原は、抗原に対する特異的免疫応答を構築するための免疫系のトリガーとして使用される。本発明の範囲内のワクチン接種は、原則として治療的な意味だけでなく、予防的な意味でも行うことができる。ワクチン接種は、感染性疾患を治療若しくは予防するための本明細書に記載される病原体に対するワクチン接種、又は癌等の非感染性疾患を治療若しくは予防するためのワクチン接種を含む。非感染性疾患の場合、抗原は細胞膜抗原、特に罹患細胞によってのみ発現され、非罹患細胞によって発現されない抗原であるのが好ましい。一例は腫瘍関連抗原である。これに関連して、「腫瘍関連抗原」という用語は、主として腫瘍細胞によって提示されるため、非悪性組織との区別を可能にする構造を意味する。かかる腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞膜上又は細胞膜内に位置するのが好ましい。腫瘍関連抗原の例は、例えばDeVita et al. (Eds., "Biological Therapy of Cancer", 2. Edition, Chapter 3: Biology of Tumor Antigens, Lippincott Company, ISBN 0-397-51416-6 (1995))に記載されている。
【0144】
本明細書で使用される場合、「プライミング」は、哺乳動物において免疫応答を誘導する／生じさせるためのワクチンの投与を指し、「ブースティング」は、哺乳動物における免疫応答を増強するためのワクチンの投与を指す。「異種プライム－ブースト」という表現は、哺乳動物において免疫応答を誘導する／生じさせるためのワクチン（プライミング）と、哺乳動物において免疫応答を増強するためのワクチン（ブースティング）とが異なることを意味する。異種プライム－ブーストは、被験体、例えば患者により第1のベクターに対する抗体が作られ、ブースティングが必要とされる場合に有用である。これに関連して、第1の（プライム）及び第2の（ブースト）ワクチン、例えばアデノウイルスは、ブースティングのために投与される第2のワクチン粒子の70%超又は好ましくは80%超がプライミング及びブースティングに供された動物の細胞の核内に入ることを第1のワクチンによるプライミング中に誘導される抗体応答が妨げない場合に十分に異なる。
【0145】
「遺伝子療法」という用語は、患者の臨床状態を改善することを目的とした欠陥遺伝子の修正のための細胞、組織又は器官への外来遺伝物質の指向性誘導の概念として広く定義することができる。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、世代から世代へと伝えられる遺伝的変化を誘導する「生殖細胞系療法」ではなく、「体細胞療法」を指すのが好ましく、体細胞療法では、治療効果は治療される個体に制限される。遺伝子療法、好ましくは、体細胞療法は、生物への迅速かつ実行が容易な直接遺伝子導入（「in vivo」）、又は治療後に再移植される外植細胞若しくは組織への高度であるが、より特異的かつ制御可能な遺伝子導入（「ex vivo」又は「in vitro」）によって更に区別することができる。
【0146】
「中和抗体」という用語は、アデノウイルスのエピトープに結合し、宿主細胞において増殖感染を生じることを妨げるか、又は導入遺伝子、例えば細胞、特に宿主細胞内に入ることが可能なアデノウイルスDNAを発現する複製不全（incompetent）ベクターによる標的細胞の形質導入を妨げる抗体を指す。
【0147】
本発明の様々な変更形態及び変形形態が、本発明の範囲を逸脱することなく当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明がかかる特定の実施形態に不当に限定されるものではないことを理解されたい。実際に、関連分野の当業者に明白な本発明を実施するための記載の形態の様々な変更形態が本発明に包含されることが意図される。
【0148】
本発明を、単に例示であり、本発明の範囲を限定するものではないと解釈すべき以下の実施例によって説明する。
【実施例】
【0149】
実施例1：新たなアデノウイルスベクターの単離
pGADNOU19及びpGADNOU20ベクターの構築は、下に提示した工程を経て進めた。pGADNOU19及びpGADNOU20ベクターは、標準手順を用いて健常な非ヒト大型類人猿から得られた糞便サンプルから単離された野生型アデノウイルス株から得た。野生型ウイルスは、HEK 293及びA549細胞の単層に糞便抽出物を接種することによって単離した。細胞単層を細胞変性効果の出現について毎日観察した。顕微鏡下での観察により陽性にスコアリングされたサンプルを採取した後、細胞を凍結融解（-700℃/37℃）によって溶解させた。次いで、清澄化細胞溶解物を新鮮細胞の単層に感染させることによるウイルス増殖に用いた。ウイルス増幅の2回の継代後に、標準手順を用いてアデノウイルスを精製した。ウイルスゲノムをSDS／プロテイナーゼK消化に続くフェノール－クロロホルム抽出によって精製ウイルスから抽出した。精製アデノウイルスDNAを、ウイルスゲノムの以下の欠失を有することで改変されるシャトルプラスミドベクターにクローニングした：
1）ウイルスゲノムのE1領域（bp 461～bp 3402）の欠失
2）ウイルスゲノムのE3領域（bp 28472～bp 31996）の欠失
pGADNOU19及びpGADNOU20ベクターの構築は、下に提示した工程を経て進めた。pGADNOU19及びpGADNOU20ベクターは、標準手順を用いて健常な非ヒト大型類人猿から得られた糞便サンプルから単離された野生型アデノウイルス株から得た。野生型ウイルスは、HEK 293及びA549細胞の単層に糞便抽出物を接種することによって単離した。細胞単層を細胞変性効果の出現について毎日観察した。顕微鏡下での観察により陽性にスコアリングされたサンプルを採取した後、細胞を凍結融解（-700℃/37℃）によって溶解させた。次いで、清澄化細胞溶解物を新鮮細胞の単層に感染させることによるウイルス増殖に用いた。ウイルス増幅の2回の継代後に、標準手順を用いてアデノウイルスを精製した。ウイルスゲノムをSDS／プロテイナーゼK消化に続くフェノール－クロロホルム抽出によって精製ウイルスから抽出した。精製アデノウイルスDNAを、ウイルスゲノムの以下の欠失を有することで改変されるシャトルプラスミドベクターにクローニングした：
1）ウイルスゲノムのE1領域（bp 461～bp 3402）の欠失
2）ウイルスゲノムのE3領域（bp 28472～bp 31996）の欠失
【0150】
実施例2：GADNOUシャトルベクターの生成
GADNOUウイルスの精製DNAゲノムを初めにシークエンシングし、次いでDNA配列情報を相同組換えによるGAdのゲノム全体のクローニングのためのシャトルベクターの構築に用いた。シャトルベクターは、E1領域の欠失（ヌクレオチド座標：461～3402）を導入するように設計した。簡潔に述べると、GADNOUウイルスのクローニングに用いたシャトルベクター（本明細書でpGAd-GAGシャトルと称される）は、以下のように構築した：
a. GAd-GAG左末端を、オリゴヌクレオチドFW 5'-GAACTCCgaattcgtttaaaccatcatcaataatataccttattttggattgaggccaatatgataatgaggtgggcggggcgaggcggggcgggtgacgtagg-3'（配列番号58）及びRV 5'-cataatcGGCCGCAGCGGCCCGTCAGATGACGGCGACAATAAA-3'（配列番号59）を用いたPCRによって増幅し、EcoRI及びSfiIで消化した後、EcoRI及びSfiIで消化したpUC19 rc_MCS_Leftend_PIX_Rightend_V1にライゲートし、これによりpUC19 L-ITR GAd-GAGを生成した。
b. 次いで、GAd右末端を、オリゴヌクレオチドFW 5'-Cataatcgacccgagtcgcactctcacagcaccagca-3'（配列番号60）及びRV 5'-GAACTCCggatccgtttaaacCATCATCAATAATATACCTTATTTTG-3'（配列番号61）を用いたPCRによって増幅し、PshA1及びBamHIで消化した後、PshA1及びBamHIで消化したpUC19 L-ITR GAd-GAGにライゲートし、これによりpUC19 L/R-ITR GAd-GAGを生成した。
c. pIXコード領域を含有するDNAフラグメントを、オリゴヌクレオチドFW 5'-Cataatcgcgatcgcgcttaggcctgaccatctgg-3'（配列番号62）及びRV 5'-GAACTCCggcgcgccTTAGGGGGAGGCAAGGCTG-3'（配列番号63）を用いたPCRによって増幅し、AsisI-AscIで消化した後、AsisI-AscIで消化したプラスミドpUC19 L/R-ITR GAd-GAGにクローニングし、pUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAGを生成した。
d. HCMV-GAG-BGHpolyAカセットを、MscI-SfiIで消化したプラスミドphCMV-GAGから得た。カセットを、MscI-SfiIで消化したpUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAGにクローニングした後、平滑化し（blunted）、pGAd-GAGシャトルを生成した。
e. プラスミド領域をBAC領域で置き換えることによるシャトルBACの構築：BAC領域を、PmeIで消化したプラスミドpBELO BAC RDLから得た後、PmeIで消化したプラスミドpGAd-GAGシャトルにクローニングし、これによりBAC GAd-GAGシャトルを生成した。
f. 右末端とpIX領域との間のAmp-LacZ-SacB選択カセットの挿入：Amp-LacZ-SacB選択カセットを、オリゴヌクレオチドFW（5'-GAACTCCGGCGCGCCTAGGGATAACAGGGTAATACCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3'、配列番号64）及びRV（5'-CATAATCGGCGCGCCATTACCCTGTTATCCCTATTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3'、配列番号65）を用いたPCRによってプラスミドpChAdシャトルプラスミドから得て、AscIで消化した。選択カセットをAscIで消化したBAC GAd-GAGシャトルにクローニングし、BAC GAd-GAG A/L/Sシャトルを生成した（図1）。
GADNOUウイルスの精製DNAゲノムを初めにシークエンシングし、次いでDNA配列情報を相同組換えによるGAdのゲノム全体のクローニングのためのシャトルベクターの構築に用いた。シャトルベクターは、E1領域の欠失（ヌクレオチド座標：461～3402）を導入するように設計した。簡潔に述べると、GADNOUウイルスのクローニングに用いたシャトルベクター（本明細書でpGAd-GAGシャトルと称される）は、以下のように構築した：
a. GAd-GAG左末端を、オリゴヌクレオチドFW 5'-GAACTCCgaattcgtttaaaccatcatcaataatataccttattttggattgaggccaatatgataatgaggtgggcggggcgaggcggggcgggtgacgtagg-3'（配列番号58）及びRV 5'-cataatcGGCCGCAGCGGCCCGTCAGATGACGGCGACAATAAA-3'（配列番号59）を用いたPCRによって増幅し、EcoRI及びSfiIで消化した後、EcoRI及びSfiIで消化したpUC19 rc_MCS_Leftend_PIX_Rightend_V1にライゲートし、これによりpUC19 L-ITR GAd-GAGを生成した。
b. 次いで、GAd右末端を、オリゴヌクレオチドFW 5'-Cataatcgacccgagtcgcactctcacagcaccagca-3'（配列番号60）及びRV 5'-GAACTCCggatccgtttaaacCATCATCAATAATATACCTTATTTTG-3'（配列番号61）を用いたPCRによって増幅し、PshA1及びBamHIで消化した後、PshA1及びBamHIで消化したpUC19 L-ITR GAd-GAGにライゲートし、これによりpUC19 L/R-ITR GAd-GAGを生成した。
c. pIXコード領域を含有するDNAフラグメントを、オリゴヌクレオチドFW 5'-Cataatcgcgatcgcgcttaggcctgaccatctgg-3'（配列番号62）及びRV 5'-GAACTCCggcgcgccTTAGGGGGAGGCAAGGCTG-3'（配列番号63）を用いたPCRによって増幅し、AsisI-AscIで消化した後、AsisI-AscIで消化したプラスミドpUC19 L/R-ITR GAd-GAGにクローニングし、pUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAGを生成した。
d. HCMV-GAG-BGHpolyAカセットを、MscI-SfiIで消化したプラスミドphCMV-GAGから得た。カセットを、MscI-SfiIで消化したpUC19 L/R-ITR pIX GAd-GAGにクローニングした後、平滑化し（blunted）、pGAd-GAGシャトルを生成した。
e. プラスミド領域をBAC領域で置き換えることによるシャトルBACの構築：BAC領域を、PmeIで消化したプラスミドpBELO BAC RDLから得た後、PmeIで消化したプラスミドpGAd-GAGシャトルにクローニングし、これによりBAC GAd-GAGシャトルを生成した。
f. 右末端とpIX領域との間のAmp-LacZ-SacB選択カセットの挿入：Amp-LacZ-SacB選択カセットを、オリゴヌクレオチドFW（5'-GAACTCCGGCGCGCCTAGGGATAACAGGGTAATACCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3'、配列番号64）及びRV（5'-CATAATCGGCGCGCCATTACCCTGTTATCCCTATTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3'、配列番号65）を用いたPCRによってプラスミドpChAdシャトルプラスミドから得て、AscIで消化した。選択カセットをAscIで消化したBAC GAd-GAGシャトルにクローニングし、BAC GAd-GAG A/L/Sシャトルを生成した（図1）。
【0151】
シャトルプラスミドは、プラスミドDNAからのウイルスDNAの放出を可能にするために両方のITRの末端にのみ存在する制限酵素部位（PmeI）を含有するように設計した。
【0152】
実施例3：ΔE1ベクターの構築
GADNOU wtゲノムDNAをプロテイナーゼK消化に続くフェノール／クロロホルム抽出によって単離した。pGADNOU19及びpGADNOU20ベクターを、大腸菌株BJ5183における相同組換えによって得た。ウイルスDNAのクローニングは、大腸菌株BJ5183細胞を精製WTウイルスDNA及びBAC GAd-GAG A/L/Sシャトルで同時形質転換することによって得た。pIX遺伝子、シャトルBACの末端に存在する右ITR DNA配列（AscIで消化した）及びウイルスゲノムDNAの間の相同組換えにより、発現カセットによって置換されたE1領域を同時に欠失させることで、BACベクターへのその挿入が可能となり、ΔE1/GAG(BAC)ベクターGADNOU19 GAG BAC及びGADNOU20 GAG BACが生成した。スクリーニングをヘキソン領域に対する制限分析及びPCRシークエンシングによって行った。
GADNOU wtゲノムDNAをプロテイナーゼK消化に続くフェノール／クロロホルム抽出によって単離した。pGADNOU19及びpGADNOU20ベクターを、大腸菌株BJ5183における相同組換えによって得た。ウイルスDNAのクローニングは、大腸菌株BJ5183細胞を精製WTウイルスDNA及びBAC GAd-GAG A/L/Sシャトルで同時形質転換することによって得た。pIX遺伝子、シャトルBACの末端に存在する右ITR DNA配列（AscIで消化した）及びウイルスゲノムDNAの間の相同組換えにより、発現カセットによって置換されたE1領域を同時に欠失させることで、BACベクターへのその挿入が可能となり、ΔE1/GAG(BAC)ベクターGADNOU19 GAG BAC及びGADNOU20 GAG BACが生成した。スクリーニングをヘキソン領域に対する制限分析及びPCRシークエンシングによって行った。
【0153】
実施例4：ΔE3ベクターの構築
構築戦略は、下記の2つの連続工程に基づくものであった：
a）Amp-LacZ-SacB選択カセットによるE3領域の置換：
Amp-LacZ-SacB選択カセットを、オリゴヌクレオチドFW（5'-GGATTACACCAAGATCTTTGCTGTCATTTGTGTGCTGAGTATAATAAAGGCTGAGATCAGAATCTACTCGACCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3'、配列番号66）及びRV（5'-CTTGCTATCAGATTTCAAGTAAGTGATTTTTTATTGATTACAGTTATGATCAATTGAAAGGGATAAGGTCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3'、配列番号67）を用いたPCRによってBAC GAd-GAG A/L/Sシャトルから得た。次いで、PCRによって得られたDNAフラグメントを、リコンビニアリング（recombineering）法によってGAdNou19 GAG BAC及びGAdNou20 GAG BACにクローニングし、GAdNou19 GAG(DE1E3) A/L/S BAC及びGAdNou20 GAG(DE1E3) A/L/S BACを得た。
b）E3領域の欠失のためのAmp-lacZ-SacB選択カセットの欠失：
Amp-LacZ-SacB選択カセットを、一本鎖オリゴヌクレオチド（5'-ctgtcatttgtgtgctgagtataataaaggctgagatcagaatctactcggaccttatccctttcaattgatcataactgtaatcaataaaaaatcactt-3'、配列番号68）を用いて欠失させ、ssオリゴによるAmp-LacZ-SacB選択カセットの置換及びその後のE3領域の欠失を得た。ssオリゴを用いて、リコンビニアリング法により選択カセットをGADNOU19 GAG(DE1E3) A/L/S BAC及びGADNOU20 GAG(DE1E3) A/L/S BACに置き換え、最終プラスミドGADNOU19 GAG(DE1E3) BAC（図2）及びGADNOU20 GAG(DE1E3) BAC（図3）を作り出した。
構築戦略は、下記の2つの連続工程に基づくものであった：
a）Amp-LacZ-SacB選択カセットによるE3領域の置換：
Amp-LacZ-SacB選択カセットを、オリゴヌクレオチドFW（5'-GGATTACACCAAGATCTTTGCTGTCATTTGTGTGCTGAGTATAATAAAGGCTGAGATCAGAATCTACTCGACCCCTATTTGTTTATTTTTCT-3'、配列番号66）及びRV（5'-CTTGCTATCAGATTTCAAGTAAGTGATTTTTTATTGATTACAGTTATGATCAATTGAAAGGGATAAGGTCTTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3'、配列番号67）を用いたPCRによってBAC GAd-GAG A/L/Sシャトルから得た。次いで、PCRによって得られたDNAフラグメントを、リコンビニアリング（recombineering）法によってGAdNou19 GAG BAC及びGAdNou20 GAG BACにクローニングし、GAdNou19 GAG(DE1E3) A/L/S BAC及びGAdNou20 GAG(DE1E3) A/L/S BACを得た。
b）E3領域の欠失のためのAmp-lacZ-SacB選択カセットの欠失：
Amp-LacZ-SacB選択カセットを、一本鎖オリゴヌクレオチド（5'-ctgtcatttgtgtgctgagtataataaaggctgagatcagaatctactcggaccttatccctttcaattgatcataactgtaatcaataaaaaatcactt-3'、配列番号68）を用いて欠失させ、ssオリゴによるAmp-LacZ-SacB選択カセットの置換及びその後のE3領域の欠失を得た。ssオリゴを用いて、リコンビニアリング法により選択カセットをGADNOU19 GAG(DE1E3) A/L/S BAC及びGADNOU20 GAG(DE1E3) A/L/S BACに置き換え、最終プラスミドGADNOU19 GAG(DE1E3) BAC（図2）及びGADNOU20 GAG(DE1E3) BAC（図3）を作り出した。
【0154】
実施例5：新たなアデノウイルスベクターの生産性の改善
E1欠失を有し、GAG抗原を発現する2つの非ヒト大型類人猿アデノウイルスベクターGADNOU19及びGADNOU20の生産性をHek293接着細胞において評価した。生産性を、T25接着細胞にMOI 100 vp／細胞及びMOI 300 vp／細胞の精製ウイルスを感染させることにより、同じ発現カセットを有するベンチマークAd5ベクターと比較して評価した。感染細胞を、十分な細胞変性効果が明らかである感染の3日後に採取した。ウイルスを3回の凍結融解サイクル（-70℃/37℃）によって感染細胞から放出させた後、溶解物を遠心分離によって清澄化した。清澄化溶解物を、プライマー及びCMVプロモーター領域に相補的なプローブを用いた定量的PCRによって定量化した。オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである：CMVfw 5'-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3'（配列番号69）、CMVrv 5'-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3’（配列番号70）、CMVFAM-TAMRAプローブ 5'-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3'（配列番号71）。qPCRは、Applied BiosystemのABI Prism 7900配列検出器で行った。GADNOU19及びGAGを発現するGADNOUの得られる特定の生産性（細胞1つ当たりのウイルス粒子（vp／細胞）で表される）は、同じ発現カセットを有するベンチマークAd5ベクターよりも顕著に高いという結果となった（図1）。
E1欠失を有し、GAG抗原を発現する2つの非ヒト大型類人猿アデノウイルスベクターGADNOU19及びGADNOU20の生産性をHek293接着細胞において評価した。生産性を、T25接着細胞にMOI 100 vp／細胞及びMOI 300 vp／細胞の精製ウイルスを感染させることにより、同じ発現カセットを有するベンチマークAd5ベクターと比較して評価した。感染細胞を、十分な細胞変性効果が明らかである感染の3日後に採取した。ウイルスを3回の凍結融解サイクル（-70℃/37℃）によって感染細胞から放出させた後、溶解物を遠心分離によって清澄化した。清澄化溶解物を、プライマー及びCMVプロモーター領域に相補的なプローブを用いた定量的PCRによって定量化した。オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである：CMVfw 5'-CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA-3'（配列番号69）、CMVrv 5'-GACTTGGAAATCCCCGTGAGT-3’（配列番号70）、CMVFAM-TAMRAプローブ 5'-ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT-3'（配列番号71）。qPCRは、Applied BiosystemのABI Prism 7900配列検出器で行った。GADNOU19及びGAGを発現するGADNOUの得られる特定の生産性（細胞1つ当たりのウイルス粒子（vp／細胞）で表される）は、同じ発現カセットを有するベンチマークAd5ベクターよりも顕著に高いという結果となった（図1）。
【0155】
生産性の改善の理論的根拠：本発明のアデノウイルスゲノムは、高い免疫学的効力を有することが知られるアデノウイルスのC群に属する。同時に、C群ウイルスは比較的低い生産性を特徴とする。本発明者らは、本発明のアデノウイルスゲノムが多くの他のC群アデノウイルスとは異なる特定のゲノム特徴を有することを発見した。この特徴は、各々約170ヌクレオチド長であり、約60ヌクレオチド隔てられた、ゲノム中に存在するノンコーディングRNAの対（いわゆるウイルス関連（VA） RNA I及びII）によって表される。概して、VA RNA I及びIIの両方が存在するが、VA RNA Iのみが存在する場合がある（A群ウイルス及び一部のB群ウイルス）。これらのRNAは、細胞防御機構によるウイルスの干渉に関連することが知られている。加えて、VA RNA I及びIIの両方が、細胞酵素によってマイクロRNAへと更にプロセシングされる。しかしながら、これらのマイクロRNAの正確な機能は分かっていない。
【0156】
既知のアデノウイルスの配列を分析することによって、本発明者らは、本発明のゲノムのVA RNA I及びIIが、他のC群アデノウイルス（例えば、ヒトAd5及びAd2だけでなく、C群に属する多くのチンパンジー分離株）のVA RNA I及びII配列とは似ておらず、代わりにB群及びE群のVA RNA I及びVA RNA IIによりよく似ていることを発見した。群内及び群間のVA RNA I及びII配列の平均配列同一性を算出したが、これを下記表3に示す。
【0157】
表3：C*群、B群、E群、D群、A群、C群内のVA RNA I及びC*群、B群、E群、D群、C群内のVA RNA IIの平均配列同一性パーセント、並びに他の群に対するC*群間の平均配列同一性パーセント。C*群は本発明によるGADNOUウイルスである。
群
群の平均配列同一性%
C*群に対する平均配列同一性%
【表3】
群の平均配列同一性%
C*群に対する平均配列同一性%
【0158】
したがって、これらのRNAがより高いウイルスの複製をもたらすことが考えられる。本発明者らの知る限りでは、VA RNAは今のところアデノウイルスの生産性の改善と関連付けられてはいない。
【0159】
実施例6：Gadベクターの免疫原性
HIV-1 gag（配列番号74）をコードする2つのGADNOUベクター（GADNOU19 GAG(DE1E3)、配列番号72及びGADNOU20 GAG(DE1E3)、配列番号73）の免疫原性をBALB/cマウスにおいて評価した。1群当たり6匹の動物に漸増用量の各GADNOUベクターを筋肉内免疫した。ELISpotを、3週間後に回収した脾細胞に対して、抗原としてHIV gag主要H-2 Kd CD8+エピトープ（AMQMLKETI）をコードする9merペプチドを用いることで行った。データは、3×107 vp（ウイルス粒子）という最高の試験用量で両方のベクターによって誘導される強い免疫原性を示す。また、3×106 vpというより低用量では、2つのベクターは、ワクチン接種を受けたマウスの50%でHIV-1 gag特異的T細胞応答を誘導することが可能であった（図5）。
HIV-1 gag（配列番号74）をコードする2つのGADNOUベクター（GADNOU19 GAG(DE1E3)、配列番号72及びGADNOU20 GAG(DE1E3)、配列番号73）の免疫原性をBALB/cマウスにおいて評価した。1群当たり6匹の動物に漸増用量の各GADNOUベクターを筋肉内免疫した。ELISpotを、3週間後に回収した脾細胞に対して、抗原としてHIV gag主要H-2 Kd CD8+エピトープ（AMQMLKETI）をコードする9merペプチドを用いることで行った。データは、3×107 vp（ウイルス粒子）という最高の試験用量で両方のベクターによって誘導される強い免疫原性を示す。また、3×106 vpというより低用量では、2つのベクターは、ワクチン接種を受けたマウスの50%でHIV-1 gag特異的T細胞応答を誘導することが可能であった（図5）。
【符号の説明】
【0160】
図面訳
図1
shuttle シャトル
Left end 左末端
pIX region pIX領域
Right end 右末端
図2
Left end 左末端
Penton ペントン
Hexon ヘキソン
Fiber ファイバー
Right end 右末端
図3
Left end 左末端
Penton ペントン
Hexon ヘキソン
Fiber ファイバー
Right end 右末端
図4
Vp/cell vp／細胞
図5
splenocytes 脾細胞
positive mice 陽性マウス
Line=geomean 線＝幾何平均
図1
shuttle シャトル
Left end 左末端
pIX region pIX領域
Right end 右末端
図2
Left end 左末端
Penton ペントン
Hexon ヘキソン
Fiber ファイバー
Right end 右末端
図3
Left end 左末端
Penton ペントン
Hexon ヘキソン
Fiber ファイバー
Right end 右末端
図4
Vp/cell vp／細胞
図5
splenocytes 脾細胞
positive mice 陽性マウス
Line=geomean 線＝幾何平均
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】