特許 7274264 核酸を増幅するための組成物、方法およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-08

(45)【発行日】2023-05-16

(54)【発明の名称】核酸を増幅するための組成物、方法およびキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/12 20060101AFI20230509BHJP

   C12N 9/99 20060101ALI20230509BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20230509BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20230509BHJP

【ＦＩ】

C12N9/12 ZNA

C12N9/99

C12N15/11 Z

C12Q1/686 Z

【請求項の数】 22

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2018083860

(22)【出願日】2018-04-25

(62)【分割の表示】P 2016162389の分割

【原出願日】2006-09-29

(65)【公開番号】P2018134099

(43)【公開日】2018-08-30

【審査請求日】2018-04-25

【審判番号】

【審判請求日】2021-03-16

(31)【優先権主張番号】60/723,383

(32)【優先日】2005-10-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】310009775

【氏名又は名称】アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ドン シュリアン

(72)【発明者】

【氏名】ジュンコ スティーブンス

(72)【発明者】

【氏名】ダニー エイチ． リー

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】高堀 栄二

【審判官】宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００４／０９０１５３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N15/00-15/11

C12Q1/68-1/686

ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

グリセロールならびにＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む複合体を含む組成物であって、該ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがヌクレオチド配列、少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログおよび少なくとも２つのクエンチャーを含み、該ヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成するように該第１の領域が該第３の領域に相補的であり、該第１の領域および／または該第３の領域が該少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログを含み、該第１の領域が第１のクエンチャーを含み、該第２の領域が第２のクエンチャーを含む、組成物。

【請求項2】

前記少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログがジデオキシヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ジデオキシヌクレオチドがｄｄＣである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記少なくとも２つのクエンチャーが同一である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記第１および／または第２のクエンチャーがＤＡＢＣＹＬである、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが５’オーバーハングを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがステム－ループ高次構造を形成する、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

非特異的蛍光を減少させるための方法であって、
グリセロール、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む複合体、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、標的核酸、プライマー、ならびに核酸色素を含む反応組成物を第１の温度で形成する工程であって、該ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがヌクレオチド配列、少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログおよび少なくとも２つのクエンチャーを含み、該ヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成するように該第１の領域が該第３の領域に相補的であり、該第１の領域および／または該第３の領域が該少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログを含み、該第１の領域が第１のクエンチャーを含み、該第２の領域が第２のクエンチャーを含み、該少なくとも２つのクエンチャーが該ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第２の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物を少なくとも１つの増幅サイクルに供して複数のアンプリコンを生成する工程と、
該反応組成物中の複数のアンプリコンに会合した該核酸色素の蛍光を検出する工程と
を含む、方法。

【請求項9】

標的核酸を増幅するための方法であって、
グリセロール、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む複合体、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、標的核酸、プライマー、ならびに核酸色素を含む反応組成物を第１の温度で形成する工程であって、該ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがヌクレオチド配列、少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログおよび少なくとも２つのクエンチャーを含み、該ヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成するように該第１の領域が該第３の領域に相補的であり、該第１の領域および／または該第３の領域が該少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログを含み、該第１の領域が第１のクエンチャーを含み、該第２の領域が第２のクエンチャーを含み、該少なくとも２つのクエンチャーが該ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに関連した蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第２の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物を少なくとも１つの増幅サイクルに供して複数のアンプリコンを生成する工程と、
を含む、方法。

【請求項10】

前記少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログがジデオキシヌクレオチドである、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

前記ジデオキシヌクレオチドがｄｄＣである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも２つのクエンチャーが同一である、請求項８または９に記載の方法。

【請求項13】

前記第１および／または第２のクエンチャーがＤＡＢＣＹＬである、請求項８または９に記載の方法。

【請求項14】

前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが５’オーバーハングを含む、請求項８または９に記載の方法。

【請求項15】

前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがステム－ループ高次構造を形成する、請求項８または９に記載の方法。

【請求項16】

グリセロールならびに、ヌクレオチド配列、少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログおよび少なくとも２つのクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含むキットであって、該ヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成するように該第１の領域が該第３の領域に相補的であり、該第１の領域および／または該第３の領域が該少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログを含み、該第１の領域が第１のクエンチャーを含み、該第２の領域が第２のクエンチャーを含む、キット。

【請求項17】

前記少なくとも１つの合成ヌクレオチドアナログがジデオキシヌクレオチドである、請求項１６に記載のキット。

【請求項18】

前記ジデオキシヌクレオチドがｄｄＣである、請求項１７に記載のキット。

【請求項19】

前記少なくとも２つのクエンチャーが同一である、請求項１６に記載のキット。

【請求項20】

前記第１および／または第２のクエンチャーがＤＡＢＣＹＬである、請求項１６に記載のキット。

【請求項21】

前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが５’オーバーハングを含む、請求項１６に記載のキット。

【請求項22】

前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがステム－ループ高次構造を形成する、請求項１６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（分野）
本教示は、一般に、非特異的蛍光および望ましくない増幅産物を減少させながら核酸を増幅するための組成物、方法、およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

（導入）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連技術は種々の適用に非常に有用である一方で、深刻な問題として望ましくない副反応に起因する非標的核酸の増幅が生じ得る。かかる副反応は、非標的核酸の誤プライミングおよび／またはプライマーオリゴマー化（時折、プライマー二量体形成と呼ばれる）、およびその後のこれらのプライミング人工物の増幅の結果として起こり得る。これは、特に、有意なバックグラウンド核酸を有する一方で、標的核酸のコピー数が少ない核酸混合物を使用してＰＣＲを行う適用で当てはまる（例えば、非特許文献１を参照のこと）。非特異的に増幅した産物の生成は、少なくともその一部が、非特異的にアニーリングしたプライマーを伸長する周囲温度でのＤＮＡポリメラーゼ活性に起因していた（例えば、非特許文献１、非特許文献２を参照のこと）。したがって、周囲温度でのＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害は、二次アンプリコンの生成の調節で有益である。

【0003】

望ましくない二次増幅産物の形成を減少させるとされるいくつかの技術が記載されている。一定の「マニュアルホットスタート（ｍａｎｕａｌ ｈｏｔ ｓｔａｒｔ）」技術によれば、ＤＮＡポリメラーゼ活性に極めて重要な成分（例えば、２価イオンおよび／またはＤＮＡポリメラーゼ自体）を、混合物の温度が非特異的プライマーアニーリングを防止するのに十分に高くなるまで、反応混合物に添加しない（例えば、非特許文献１；および非特許文献３を参照のこと）。労働集約性の低い技術は、少なくとも１つの増幅反応成分の物理的分離または可逆的不活化を使用する。例えば、マグネシウムおよびＤＮＡポリメラーゼを、ワックスビーズ中で配列決定する。このワックスビーズは反応温度の上昇につれて融解し、それによって高温でのみ配列決定した成分が放出される。他の技術によれば、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの可逆的化学修飾または抗体の結合によって可逆的に不活化されるか修飾される（例えば、Ｂｉｒｃｈらの特許文献１を参照のこと）。高い反応温度では、化学修飾が逆行するか、抗体分子が変性し、機能的ＤＮＡポリメラーゼが放出される。しかし、これらの技術のいくつかは、いくつかのＤＮＡポリメラーゼ活性がより低い反応温度で検出可能であるという点で漏出性があるようであるか、ＤＮＡポリメラーゼを完全に活性化させるために高温で反応混合物を長期間曝露する必要がある。

【0004】

現在使用されている一定の核酸増幅技術は、核酸色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が含まれるが、これに限定されない）を含む増幅産物の検出および／または定量工程（一定の実時間および／または終点検出技術が含まれる）を含む（例えば、非特許文献４を参照のこと）。典型的には、核酸色素は、増幅産物の二本鎖セグメントおよび／またはプライマー－テンプレート二重鎖と会合し、特定の核酸色素に特徴的な波長の検出可能な蛍光シグナルを放射する。一定の増幅方法は、核酸産物を含む複数の増幅産物を評価するための検出工程（例えば、融解曲線分析としても公知のＰＣＲ後解離曲線分析が含まれるが、これらに限定されない）を含む。アンプリコンの融解曲線は特にその長さおよび配列に依存するので、アンプリコンを、一般に、その融解曲線によって識別することができる（例えば、非特許文献５を参照のこと）。解離曲線または融解曲線を、反応温度がアンプリコンの融点を通過する時の核酸色素の蛍光のモニタリングによって一定の増幅反応中に得ることができる。二本酸アンプリコンの解離は、核酸色素に特徴的な放射波長の蛍光の突然の減少として認められる。一定の解離曲線分析技術によれば、融解曲線が単一の一貫した融点を示し、時折、蛍光強度の負の微分値対温度（－ｄＦ／ｄｔ対Ｔ）のプロットのピークとしてグラフで示される場合、増幅産物を「純粋」と分類する。例えば、単回（ｓｉｎｇｌｅ ｐｌｅｘ）シングルプレックス増幅由来のかかる解離曲線中の複数のピークの外観は、典型的には、望ましくない副反応産物の存在を示す。かかる核酸色素ベースの増幅産物の検出技術を使用する場合、しばしば、以下であることが望ましい：１）望ましくない副反応産物の形成を少なくとも減少させ、好ましくは排除すること、２）他の核酸の二本鎖セグメント（すなわち、非増幅産物）の変性に起因する蛍光ピークを少なくとも減少させ、好ましくは排除すること。

【0005】

一定の他の増幅技術でも、特に、プライマー、ライゲーションプローブ、切断プローブ、プロモーター－プライマーなどの非特異的アニーリング、および最適以下の温度でのその後の酵素活性によって望ましくない増幅産物を生じ得る。例えば、反応成分がしばしば室温で組み合わされるか、反応組成物が所望の反応温度に加熱される。これらの技術の少なくともいくつかは、バックグラウンド蛍光の減少から恩恵を受け得る。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】米国特許第５，６７７，１５２号明細書

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｃｈｏｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９２）２０：１７１７－１７２３

【文献】Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９０）８７：４５８０

【文献】Ｄ’Ａｑｕｉｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９：３７４９

【文献】Ｒｉｒｉｅら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４５：１５４－６０

【文献】Ｚｈａｎｇら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００２）３６：７２３－２８

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

（要旨）
本教示は、非特異的蛍光および望ましくない増幅産物（時折、当該分野で二次アンプリコンまたは偽副産物と呼ばれる）を減少させながら標的核酸を増幅するための組成物、方法、およびキットに関する。

【0009】

ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビターを開示する。開示のインヒビターを、酵素の少なくとも１つの酵素活性を阻害するようにデザインする。一部の実施形態では、酵素インヒビターのヌクレオチド配列は、アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターは、少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成することができるアプタマーを含む（例えば、Ｙａｋｉｍｏｖｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｍｏｓｃ．）６８（２）：２２８－３５（２００３）；Ｎｉｃｋｅｎｓら、ＲＮＡ ９：１０２９－３３（２００３）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １４：１１４－２９（２００４）；およびＵｍｅｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３３９－７４（２００５）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターは、複数の異なるクエンチャーを含む。一部の実施形態では、酵素インヒビターは、第１の温度での少なくとも１つの二本鎖セグメントを含む高次構造を想定することができるが、第２の温度に加熱した場合、一本鎖または実質的に一本鎖である。一部の実施形態によれば、少なくとも１つの二本鎖セグメントを含む酵素インヒビターは、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素が含まれるが、これに限定されない）、ＲＮＡポリメラーゼ、切断酵素（構造特異的ヌクレアーゼが含まれるが、これに限定されない）、ヘリカーゼ、およびリガーゼと複合体を形成することができる。一部の実施形態では、酵素インヒビターが遮断基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）、ヌクレオチドアナログ、非切断性ヌクレオチド間結合、またはこれらの組み合わせを含むので、酵素インヒビターは対応する酵素の無効な基質である。

【0010】

ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビターを開示する。いくつかのＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、同一のクエンチャーまたは異なるクエンチャーであり得る２つまたはそれを超えるクエンチャーを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは副溝結合剤（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）をさらに含み、いくつかの実施形態では、クエンチャーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列の３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できず、これは、典型的には、遮断基または非伸長ヌクレオチドの存在に起因する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成することができるアプタマーを含む（例えば、Ｙａｋｉｍｏｖｉｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｍｏｓｃ．）６８（２）：２２８－３５（２００３）を参照のこと）。

【0011】

酵素および酵素インヒビターを含む複合体を提供する。一定の複合体は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビター、リガーゼおよびリガーゼインヒビター、ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼインヒビター、切断酵素および切断酵素インヒビター、またはヘリカーゼおよびヘリカーゼインヒビターを含む。一定の複合体は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、アクセサリータンパク質（例えば、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）または増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない）、またはこれらの組み合わせをさらに含む。典型的には、酵素－酵素インヒビター複合体は第１の温度で形成することができ、複合体中のインヒビターと会合する間に、酵素の少なくとも１つの酵素活性が阻害される。複合体が第２の温度に加熱される場合、複合体は解離し、酵素を放出する。

【0012】

一部の実施形態では、酵素－酵素インヒビター複合体は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ－ＤＮＡポリメラーゼインヒビター複合体は、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）および／またはヌクレオチドアナログをさらに含む。一定の複合体は、ＤＮＡポリメラーゼ、および、任意選択的に、ＤＮＡポリメラーゼ、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログに会合したステム－ループ高次構造でＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。一定の複合体の実施形態は、アニーリングして少なくとも１つの二本鎖セグメント、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを含む二重鎖を形成する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビターに会合したＤＮＡポリメラーゼを含む。典型的には、本教示のＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログと複合体化する場合に、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性は阻害される。

【0013】

本教示の酵素インヒビターを含む非特異的蛍光を減少する方法を開示する。一定の方法によれば、酵素を、酵素－酵素インヒビター複合体の形成に適切な条件下で酵素インヒビターと接触させる。酵素の少なくとも１つの酵素活性が粗害される一方で、酵素は複合体で存在する。酵素－酵素インヒビター複合体を適切な第２の温度に加熱する場合、複合体は解離し、酵素を遊離する。

【0014】

いくつかの非特異的蛍光の減少方法は、本教示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。一定のかかる方法によれば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログ、標的核酸、プライマー、および核酸色素を含む反応組成物を、第１の温度で形成する。一部の実施形態では、プライマーはプライマー対を含む。第１の温度で、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、少なくとも１つの二本鎖セグメントを含み、ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成することができる。ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのクエンチャーは、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの二本鎖セグメントと会合した核酸色素の少なくともいくつかの蛍光シグナルを吸収することができる。反応組成物を、典型的には、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの融点付近、融点、または融点以上である第２の温度に加熱し、それにより、少なくともいくつかのＤＮＡポリメラーゼインヒビター－ＤＮＡポリメラーゼ複合体が解離する。反応組成物を、少なくとも１サイクルの増幅に供し、複数のアンプリコンを生成する。二本鎖アンプリコンを、アンプリコンに会合した核酸色素の蛍光によって「実時間」または増幅反応が完了した後のいずれかで検出することができる一方で、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素の蛍光は、クエンチャーによって少なくとも減少する。

【0015】

本教示の酵素インヒビターを使用した標的核酸の増幅方法を開示する。一定のかかる方法によれば、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ＮＴＰ、標的核酸、プライマー、および核酸色素を含む反応組成物を、第１の温度で形成する。一部の実施形態では、プライマーはプライマー対を含む。第１の温度で、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、少なくとも１つの二本鎖セグメントを含み、ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成することができる。ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのクエンチャーは、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの二本鎖セグメントと会合した核酸色素によって少なくともいくつかの蛍光シグナルを吸収することができる。反応組成物を、典型的には、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの融点付近、融点、または融点以上である第２の温度に加熱し、それにより、少なくともいくつかのＤＮＡポリメラーゼインヒビター－ＤＮＡポリメラーゼ複合体が解離する。反応組成物を、少なくとも１サイクルの増幅に供し、複数のアンプリコンを生成する。一部の実施形態では、アンプリコンの生成量は、反応組成物中のＤＮＡポリメラーゼインヒビターの存在によって増加する。

【0016】

一定の方法によれば、反応組成物は、標的核酸、酵素、酵素インヒビター、核酸色素、ならびにＮＴＰ、ヌクレオチドアナログ、プライマー、ライゲーションプローブ対、切断プローブ対、プロモーター－プライマー、補因子（例えば、ＮＡＤ＋を含む物質が含まれるが、これに限定されない）、およびアクセサリータンパク質（ＰＣＮＡおよび／またはＳＳＢが含まれるが、これらに限定されない）のうちの少なくとも１つを含む。

【0017】

一定の方法によれば、リガーゼを適切な条件下でリガーゼインヒビターに接触させ、リガーゼ－リガーゼインヒビター複合体を形成する。一定の方法によれば、切断酵素を、適切な条件下で切断酵素インヒビターと接触させ、切断酵素－切断酵素インヒビター複合体を形成する。一定の方法によれば、ヘリカーゼを適切な条件下でヘリカーゼインヒビターと接触させ、ヘリカーゼ－ヘリカーゼインヒビター複合体を形成する。いくつかの方法によれば、ＲＮＡポリメラーゼを適切な条件下でＲＮＡポリメラーゼインヒビターと接触させ、ＲＮＡポリメラーゼ－ＲＮＡポリメラーゼインヒビター複合体を形成する。

【0018】

一定の本方法を実施するためのキットも開示する。いくつかの実施形態では、キットは、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビターを含む。一部の実施形態では、キットは、２つまたはそれを超える酵素インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ、切断酵素、またはリガーゼと複合体を形成することができる。一定のキット実施形態は、切断プローブ組、ライゲーションプローブ組、プライマー、プロモーター－プライマー、またはこれらの組み合わせをさらに含む。

【0019】

一定のキット実施形態は、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、キットは、２つまたはそれを超えるＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、副溝結合剤を含む。一定のキット実施形態は、プライマー、プライマー対、核酸色素、ＤＮＡポリメラーゼ、およびレポータープローブの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む。

【0020】

本教示のこれらおよび他の特徴を、本明細書中に記載する。

【0021】

例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む複合体であって、該ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む、複合体。
（項目２）
ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ヌクレオチドアナログ、またはＮＴＰおよびヌクレオチドアナログをさらに含む、項目１に記載の複合体。
（項目３）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に、第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的である、項目１に記載の複合体。
（項目４）
ＮＴＰ、ヌクレオチドアナログ、またはＮＴＰおよびヌクレオチドアナログをさらに含む、項目３に記載の複合体。
（項目５）
前記ヌクレオチド配列がＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目３に記載の複合体。
（項目６）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが副溝結合剤をさらに含む、項目３に記載の複合体。
（項目７）
前記ヌクレオチド配列が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、該第１のオリゴヌクレオチドが第１の領域を含み、該第２のオリゴヌクレオチドが第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドの第１の領域が該第２のオリゴヌクレオチドの第３の領域に相補的である、項目１に記載の複合体。
（項目８）
ＮＴＰ、ヌクレオチドアナログ、またはＮＴＰおよびヌクレオチドアナログをさらに含む、項目７に記載の複合体。
（項目９）
前記第１のオリゴヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、前記第２のオリゴヌクレオチドが該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドが該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目７に記載の複合体。
（項目１０）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目１に記載の複合体。
（項目１１）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが少なくとも２つの異なるクエンチャーを含む、項目１に記載の複合体。
（項目１２）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がヌクレオチドアナログを含む、項目１に記載の複合体。
（項目１３）
前記ヌクレオチドアナログが、７－デアザ－２’－デオキシアデノシン（デアザ－ｄＡ）、７－デアザ－２’－デオキシグアノシン（デアザ－ｄＧ）、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮ）、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはこれらの組み合わせを含む、項目１２に記載の複合体。
（項目１４）
ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰ、ヌクレオチドアナログ、またはＮＴＰおよびヌクレオチドアナログを含む複合体であって、該ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがヌクレオチド配列およびクエンチャーを含み、該ヌクレオチド配列が第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的であり、該第１の領域、該第３の領域、または該第１の領域および該第３の領域が少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含み、該第１の領域が第１のクエンチャーを含み、該第２の領域が第２のクエンチャーを含む、複合体。
（項目１５）
前記第３の領域が前記ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、前記第４の領域が該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目１４に記載の複合体。
（項目１６）
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ－ｄＡ、デアザ－ｄＧ、ｄｄＮ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む、項目１４に記載の複合体。
（項目１７）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが副溝結合剤をさらに含む、項目１４に記載の複合体。
（項目１８）
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目１９）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に、第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的である、項目１８に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２０）
前記ヌクレオチド配列がＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目１９に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２１）
副溝結合剤をさらに含む、項目１９に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２２）
前記ヌクレオチド配列が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、該第１のオリゴヌクレオチドが第１の領域を含み、該第２のオリゴヌクレオチドが第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドの第１の領域が該第２のオリゴヌクレオチドの第３の領域に相補的である、項目１８に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２３）
前記第１のオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、前記第２のオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目２２に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２４）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目１８に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２５）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが少なくとも２つの異なるクエンチャーを含む、項目１８に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２６）
ヌクレオチドアナログをさらに含む、項目１８に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２７）
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ－ｄＡ、デアザ－ｄＧ、ｄｄＮ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む、項目２６に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２８）
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビターであって、該ヌクレオチド配列が第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的であり、該第１の領域がヌクレオチドアナログを含むか、該第３の領域がヌクレオチドアナログを含むか、該第１の領域および該第３の領域がヌクレオチドアナログを含み、該第１の領域が第１のクエンチャーを含み、該第２の領域が第２のクエンチャーを含む、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目２９）
前記ヌクレオチド配列がＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目２８に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目３０）
副溝結合剤をさらに含む、項目２８に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目３１）
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ－ｄＡ、デアザ－ｄＧ、ｄｄＮ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む、項目２８に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目３２）
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビターであって、該ヌクレオチド配列が、５’－ＴＣＴＧＧＧＡＴＡ（デアザ－ｄＡ）ＴＴ（デアザ－ｄＡ）ＴＧＧＴＡ（デアザ－ｄＡ）ＡＴＡＴＧ（Ｔｎ）Ｃ（デアザ－ｄＡ）ＴＡＴＴＴＡＴＴ（デアザ－ｄＡ）ＴＡ（デアザ－ｄＡ）ＴＴＡＴＣ－３’を含み、ＴｎがＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴ、またはＴＴＴＴＴＴを含む、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター。（項目３３）
前記クエンチャーが少なくとも２つの異なるクエンチャーを含む、項目３２に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目３４）
副溝結合剤をさらに含む、項目３２に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目３５）
前記ヌクレオチド配列が、５’－ＴＣＴＧＧＧＡＴＡ（デアザ－ｄＡ）ＴＴ（デアザ－ｄＡ）ＴＧＧＴＡ（デアザ－ｄＡ）ＡＴＡＴＧＴＴＴＴＣ（デアザ－ｄＡ）ＴＡＴＴＴＡＴＴ（デアザ－ｄＡ）ＴＡ（デアザ－ｄＡ）ＴＴＡＴＣ－３’を含み、前記クエンチャーが少なくとも２つの異なるクエンチャーを含む、項目３２に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目３６）
副溝結合剤をさらに含む、項目３５に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目３７）
前記第１のクエンチャーが、少なくとも１つのＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、およびＲＯＸを含み、前記副溝結合剤が前記第２のクエンチャーをさらに含む、項目３６に記載のＤＮＡポリメラーゼインヒビター。
（項目３８）
非特異的蛍光を減少させるための方法であって、
ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、標的核酸、プライマー、核酸色素、および、任意選択的に、ヌクレオチドアナログを含む反応組成物を第１の温度で形成する工程であって、該ヌクレオチド配列が少なくとも１つの二本鎖セグメントを含み、該ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターが会合して複合体を形成し、該クエンチャーが該ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第２の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物を少なくとも１つの増幅サイクルに供して複数のアンプリコンを生成する工程と、
該反応組成物中の複数のアンプリコンに会合した該核酸色素の蛍光を検出する工程であって、該クエンチャーが該ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と
を含む、方法。
（項目３９）
前記検出する工程が実時間検出を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記検出する工程が終点検出を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
前記終点検出が融解曲線分析を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ＤＮＡポリメラーゼ、前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを共にインキュベートして複合体を形成し、その後に前記第１の温度で前記反応組成物を形成する、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的である、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
前記ヌクレオチド配列が前記ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが、副溝結合剤をさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４６）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、該第１のオリゴヌクレオチドが第１の領域を含み、該第２のオリゴヌクレオチドが第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドの第１の領域が該第２のオリゴヌクレオチドの第３の領域に相補的である、項目３８に記載の方法。
（項目４７）
前記第１のオリゴヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、前記第２のオリゴヌクレオチドが該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドが該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４９）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが少なくとも２つの異なるクエンチャーを含む、項目３８に記載の方法。
（項目５０）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがヌクレオチドアナログを含む、項目３８に記載の方法。
（項目５１）
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ－ｄＡ、デアザ－ｄＧ、ｄｄＮ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記標的核酸が複数の異なる標的核酸を含み、前記プライマーが複数の異なるプライマーを含み、前記複数のアンプリコンが複数の異なるアンプリコンを含む、項目３８に記載の方法。
（項目５３）
前記検出する工程が検出プローブをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目５４）
前記標的核酸がＲＮＡを含む、項目３８に記載の方法。
（項目５５）
前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ＲＮＡが小ＲＮＡ分子を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
前記小ＲＮＡ分子がミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記第１の温度が約２２℃～約４０℃である、項目３８に記載の方法。
（項目５９）
前記第２の温度が約４８℃～約７３℃である、項目３８に記載の方法。
（項目６０）
前記第２の温度が約５３℃～約６７℃である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記第２の温度が６４℃～６７℃である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記標的核酸がＤＮＡを含む、項目３８に記載の方法。
（項目６３）
前記プライマーがプライマー対を含み、前記少なくとも１つの増幅サイクルがＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、項目３８に記載の方法。
（項目６４）
標的核酸を増幅するための方法であって、
ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ＮＴＰ、標的核酸、プライマー、核酸色素、および、任意選択的に、ヌクレオチドアナログを含む反応組成物を第１の温度で形成する工程であって、該ヌクレオチド配列が少なくとも１つの二本鎖セグメントを含み、該ＤＮＡポリメラーゼおよび該ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが会合して複合体を形成し、該クエンチャーが該ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに関連した蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第２の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物を少なくとも１つの増幅サイクルに供して複数のアンプリコンを生成する工程と、
を含む、方法。
（項目６５）
前記標的核酸がＲＮＡを含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記ＲＮＡがｍＲＮＡを含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ＲＮＡが小ＲＮＡ分子を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６８）
前記小ＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡを含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記標的核酸がＤＮＡを含む、項目６４に記載の方法。
（項目７０）
前記プライマーがプライマー対を含み、前記少なくとも１つの増幅サイクルがＰＣＲを含む、項目６４に記載の方法。
（項目７１）
前記ＤＮＡポリメラーゼ、前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを共にインキュベートして複合体を形成し、その後に前記第１の温度で前記反応組成物を形成する、項目６４に記載の方法。
（項目７２）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的である、項目６４に記載の方法。
（項目７３）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が前記ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが、副溝結合剤をさらに含む、項目６４に記載の方法。
（項目７５）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列が第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、該第１のオリゴヌクレオチドが第１の領域を含み、該第２のオリゴヌクレオチドが第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドの第１の領域が該第２のオリゴヌクレオチドの第３の領域に相補的である、項目６４に記載の方法。
（項目７６）
前記第１のオリゴヌクレオチドが前記ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、前記第２のオリゴヌクレオチドが該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できないか、該第１のオリゴヌクレオチドおよび該第２のオリゴヌクレオチドが該ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目６４に記載の方法。
（項目７８）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが少なくとも２つの異なるクエンチャーを含む、項目６４に記載の方法。
（項目７９）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがヌクレオチドアナログを含む、項目６４に記載の方法。
（項目８０）
前記ヌクレオチドアナログが、デアザ－ｄＡ、デアザ－ｄＧ、ｄｄＮ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記標的核酸が複数の異なる標的核酸を含み、前記プライマーが複数の異なるプライマー、複数の異なるプライマー対、またはこれらの組み合わせを含み、前記複数のアンプリコンが複数の異なるアンプリコンを含む、項目６４に記載の方法。
（項目８２）
前記第１の温度が約２２℃～約４０℃である、項目６４に記載の方法。
（項目８３）
前記第２の温度が約４８℃～約７３℃である、項目６４に記載の方法。
（項目８４）
前記第２の温度が約５３℃～約６７℃である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記第２の温度が６３℃～６７℃である、項目８３に記載の方法。
（項目８６）
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含むキット。
（項目８７）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目８６に記載のキット。
（項目８８）
前記ヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的である、項目８６に記載のキット。
（項目８９）
前記第１の領域、前記第３の領域、または該第１の領域および該第３の領域がヌクレオチドアナログを含み、ここで該第１の領域が第１のクエンチャーを含むか、前記第２の領域が第２のクエンチャーを含むか、該第１の領域が第１のクエンチャーを含み、且つ該第２の領域が第２のクエンチャーを含む、項目８８に記載のキット。
（項目９０）
前記ヌクレオチド配列が第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、該第１のオリゴヌクレオチドが第１の領域を含み、該第２のオリゴヌクレオチドが第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１のオリゴヌクレオチドの第１の領域が該第２のオリゴヌクレオチドの第３の領域に相補的である、項目８６に記載のキット。
（項目９１）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが、副溝結合剤をさらに含む、項目８６に記載のキット。
（項目９２）
核酸色素をさらに含む、項目８６に記載のキット。
（項目９３）
前記核酸色素が、臭化エチジウム、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、非対称性シアニン色素、またはこれらの組み合わせを含む、項目９２に記載のキット。
（項目９４）
前記非対称性シアニン色素が、［２－Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ－プロピルアミノ］－４－［２，３－ジヒドロ－３－メチル－（ベンゾ－１，３－チアゾール－２－イル）－メチリデン］－１－フェニル－キノリニウム］（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）、［２－Ｎ－ビス－（３－ジメチルアミノプロピル）－アミノ）－アミノ］－４－［２，３－ジヒドロ－３－メチル－（ベンゾ－１，３－チアゾール－２－イル）－メチリデン］－１－フェニル－キノリニウム］（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標））、４－［（３－メチル－６－（ベンゾチアゾール－２－イル）－２，３－ジヒドロ－（ベンゾ－１，３－チアゾール）－２－メチリデン）］－１－メチル－ピリジニウムヨージド（ＢＥＢＯ）、ＢＯＸＴＯ、ＢＥＴＯ、またはこれらの組み合わせを含む、項目９３に記載のキット。
（項目９５）
前記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目８６に記載のキット。
（項目９６）
前記ヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的である、項目８６に記載のキット。
（項目９７）
レポータープローブをさらに含む、項目８６に記載のキット。
（項目９８）
酵素および酵素インヒビターを含む複合体であって、該酵素インヒビターがヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む、複合体。
（項目９９）
前記酵素が、ＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、切断酵素、またはこれらの組み合わせを含む、項目９８に記載の複合体。
（項目１００）
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目９８に記載の複合体。
（項目１０１）
前記インヒビターのヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的である、項目９８に記載の複合体。
（項目１０２）
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列が、１つのオリゴヌクレオチド、２つのオリゴヌクレオチド、または３つのオリゴヌクレオチドを含む、項目９８に記載の複合体。
（項目１０３）
前記酵素インヒビターが少なくとも２つのクエンチャーを含む、項目９８に記載の複合体。
（項目１０４）
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビター。
（項目１０５）
前記ヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目１０３に記載の酵素インヒビター。
（項目１０６）
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列が、１つのオリゴヌクレオチド、２つのオリゴヌクレオチド、または３つのオリゴヌクレオチドを含む、項目１０４に記載の酵素インヒビター。
（項目１０７）
前記ヌクレオチド配列が、第１の領域、第２の領域、第３の領域、第４の領域、第５の領域、および第６の領域を含み、該第１の領域が該第３の領域に相補的であり、該第４の領域が該第６の領域に相補的である、項目１０４に記載の酵素インヒビター。
（項目１０８）
ライゲーション不可能なヌクレオチドをさらに含む、項目１０７に記載の酵素インヒビター。
（項目１０９）
切断不可能なフラップ配列をさらに含む、項目１０７に記載の酵素インヒビター。
（項目１１０）
前記切断不可能なフラップ配列は非切断性ヌクレオチド間結合を含む、項目１０９に記載の酵素インヒビター。
（項目１１１）
非特異的蛍光を減少させるための方法であって、
酵素、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビター、標的核酸、プライマー、および核酸色素を含む反応組成物を第１の温度で形成する工程であって、該ヌクレオチド配列が少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成し、該酵素および酵素インヒビターが会合して複合体を形成し、該クエンチャーが該酵素インヒビターのヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第２の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物中の標的核酸を増幅して複数のアンプリコンを生成する工程と、
該反応組成物中の複数のアンプリコンに会合した該核酸色素の蛍光を検出する工程であって、該クエンチャーが該酵素インヒビターのヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した該核酸色素の蛍光を阻害する、工程と、
を含む、方法。
（項目１１２）
前記酵素が、ＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、切断酵素、またはこれらの組み合わせを含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１４）
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列が、１つのオリゴヌクレオチド、２つのオリゴヌクレオチド、または３つのオリゴヌクレオチドを含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１５）
前記反応組成物が、プライマー、プライマー対、ライゲーションプローブ対、切断プローブ対、またはこれらの組み合わせを含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１６）
標的核酸を増幅するための方法であって、
酵素、酵素インヒビター、標的核酸、および核酸色素を含む反応組成物を第１の温度で形成する工程であって、該酵素インヒビターがヌクレオチド配列および少なくとも１つのクエンチャーを含み、該ヌクレオチド配列が少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成することができ、該酵素および該酵素インヒビターが会合して酵素－酵素インヒビター複合体を形成し、該少なくとも１つのクエンチャーが該ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに関連した蛍光を阻害する、工程と、
該反応組成物を第２の温度に加熱して該複合体を解離する工程と、
該反応組成物中の標的核酸を増幅して複数のアンプリコンを生成する工程と、
を含む、方法。
（項目１１７）
前記酵素が、ＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、切断酵素、またはこれらの組み合わせを含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列がアプタマーを含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１１９）
前記酵素インヒビターのヌクレオチド配列が、１つのオリゴヌクレオチド、２つのオリゴヌクレオチド、または３つのオリゴヌクレオチドを含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１２０）
前記反応組成物が、プライマー、プライマー対、ライゲーションプローブ対、切断プローブ対、またはこれらの組み合わせを含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１２１）
ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビターを含むキット。
（項目１２２）
前記酵素インヒビターが、ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、リガーゼインヒビター、ヘリカーゼインヒビター、切断酵素インヒビター、またはこれらの組み合わせを含む、項目１２１に記載のキット。
（項目１２３）
プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、またはこれらの組み合わせをさらに含む、項目１２２に記載のキット。
当業者は、下記の図面が例示のみを目的とすると理解するであろう。これらの図面は、決して本教示の範囲を制限することを意図しない。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1-1】１つのオリゴヌクレオチドを含む一定の例示的酵素インヒビターの例示的実施形態を概略的に示す。

【図1-2】１つのオリゴヌクレオチドを含む一定の例示的酵素インヒビターの例示的実施形態を概略的に示す。

【図2】複数のオリゴヌクレオチドを含む一定の例示的酵素インヒビターの例示的実施形態を概略的に示す。

【図3】一定の例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを使用して得た、蛍光の負の微分値（－ｄＦ／ｄｔ）対温度（℃）としてプロットした解離曲線を示す。

【図4】一定の例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを使用して得た、蛍光の負の微分値対温度（℃）としてプロットした解離曲線を示す。

【図5】一定の例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを使用して得た、蛍光の負の微分値対温度（℃）としてプロットした解離曲線を示す。

【図6】一定の例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを使用して得た、蛍光の負の微分値対温度（℃）としてプロットした解離曲線を示す。

【図7】アガロースゲルの写真を示す。実施例２に記載のように、種々の濃度の例示的酵素インヒビター中で生成されたアンプリコンを含む一連のサーモサイクリングした反応組成物のアリコートを、未変性アガロースゲルの個別のレーンで電気泳動し、臭化エチジウムで視覚化した。レーンＡおよびＪ：１２００塩基対、８００塩基対、４００塩基対、２００塩基対、および１００塩基対、のサイズ標準を含むサイズラダー、レーンＢ～Ｇ：５、１０、２５、５０、７５、または１００ｎＭのポリメラーゼインヒビターＥをそれぞれ含むサーモサイクリングした反応組成物のアリコート、レーンＨ：５０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥを含むテンプレートなしのコントロール反応組成物、レーンＩ：ブランク。

【図8】アガロースゲルの写真を示す。実施例３に記載のように、種々の濃度の例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビター中で生成されたアンプリコンを含む一連のサーモサイクリングした反応組成物のアリコートを、未変性アガロースゲルの個別のレーンで電気泳動し、臭化エチジウムで視覚化した。レーンＡおよびＪ：１２００塩基対、８００塩基対、４００塩基対、２００塩基対、および１００塩基対のサイズ標準を含むサイズラダー、レーンＢ～Ｈ：０、５、１０、２５、５０、７５、または１００ｎＭのポリメラーゼインヒビターＥをそれぞれ含むサーモサイクリングした反応組成物のアリコート、レーンＩ：５０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥを含むテンプレートなしのコントロール反応組成物。

【図9】実施例４に記載のように、例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの存在によって二次アンプリコンが減少することを示す、未変性アガロースゲルの写真を示す。

【図10A】実施例５に示すように、本教示の例示的方法にしたがって生成した例示的解離曲線を示す。

【図10B】実施例５に示すように、本教示の例示的方法にしたがって生成した例示的解離曲線を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

（例示的実施形態の説明）
上記の一般的説明および以下の詳細な説明の両方が例示および説明のみを目的とし、本教示の範囲を制限することを意図しないと理解すべきである。本明細書中で使用される、用語「ａ」または「ａｎ」は、別な様に明確に示されない限り、少なくとも１つを意味する。本明細書中では、別なふうに明確に示されない限り、単数形を使用する場合、複数形が含まれる。例えば（制限されない）、「標的核酸」は、１つを超える標的核酸（例えば、特定の標的核酸種の１つまたは複数のコピーおよび標的核酸の２つまたはそれを超える異なる種）が存在することができることを意味する。また、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は、制限することを意図しない。用語「および／または」は、この用語の前後の用語が一緒でも個別でもよいことを意味する。例示を目的として、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」もしくは「Ｙ」または「ＸおよびＹ」を意味し得る。

【0024】

本明細書中で使用される節の見出しは、まとめることのみを目的とし、記載の対象を制限すると決して解釈すべきではない。本明細書中に引用して全ての文献（特許、特許出願、論文、書籍、および専門書が含まれるが、これらに限定されない）は、任意の目的のためにその全体が参照として明確に援用される。任意の援用された文献が本明細書中に定義の任意の用語と矛盾する事象では、本明細書に従う。本教示は種々の実施形態と併せて記載されているが、本教示はかかる実施形態に制限されることを意図しない。一方、当業者に認識されるように、本教示は、種々の変更形態、修正形態、および等価物を含む。

【0025】

２００４年１月１１日出願で、発明の名称が「Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」であるＪｏｈｎ Ｗ．Ｂｒａｎｄｉｓの米国特許出願番号１０／７６２，２２２号は、任意の目的のためにその全体が明確に参照として援用される。

【0026】

定義
用語「～の少なくともいくつかを吸収する」は、核酸色素から放射された蛍光シグナルに関して使用される場合、酵素インヒビターの１つまたは複数のクエンチャーの存在によって検出可能な蛍光の減少をいう。酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素によって放射された少なくともいくつかの蛍光を吸収は、酵素インヒビターがクエンチャーを含まないこと以外は同一の成分を含む反応組成物中の検出可能な蛍光と比較して、核酸色素に特徴的な放射波長の検出可能な蛍光が測定可能に減少することを意味する。いくつかの実施形態では、検出可能な蛍光の測定可能な減少は、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９％を超える蛍光の相対的減少を意味する。少なくとも１つのクエンチャーが蛍光クエンチャーを含む一部の実施形態では、核酸色素に特徴的な波長の検出可能な蛍光が測定可能に減少し、酵素インヒビターの少なくとも１つの蛍光クエンチャーの特徴的な放射波長の検出可能な蛍光が測定可能に増加し得る。

【0027】

本明細書中で使用される、用語「アンプリコン」および「増幅産物」は、一般に、増幅反応産物をいう。アンプリコンは、二本鎖または一本鎖であり得、二本鎖増幅産物の変性によって得られた分離成分の鎖が含まれ得る。いくつかの実施形態では、アンプリコンは、ライゲーション産物（例えば、ライゲーションしたプローブが含まれるが、これに限定されない）、ライゲーション産物の少なくとも一部の相補物、またはその両方を含む。一部の実施形態では、１増幅サイクルのアンプリコンを、その後の増幅サイクルにおけるテンプレートとしての役割を果たし得る。

【0028】

用語「アニーリング」および「ハイブリッド形成」（基語の変化形である「ハイブリッド形成する」および「アニーリングする」が含まれるが、これらに限定されない）を交換可能に使用し、これらの用語は、二本鎖、三本鎖、または他の高次構造が形成されるある核酸の別の核酸とのヌクレオチド塩基対合相互作用を意味する。本教示のいくつかの実施形態では、アニーリングまたはハイブリッド形成は、ヘアピン構造またはステム－ループ構造を形成するための同一酵素インヒビターの少なくとも２つの領域中の少なくともいくつかのヌクレオチド間の相互作用をいい、時折、自己アニーリングと呼ばれる。一次相互作用は、典型的には、ヌクレオチド塩基特異的である（例えば、ワトソン－クリック水素結合およびフーグスティーン水素結合によるＡ：Ｔ、Ａ：Ｕ、およびＧ：Ｃ）。一部の実施形態では、塩基スタッキングおよび疎水性相互作用は、二重鎖の安定性にも寄与し得る。プライマーおよびプローブが相補配列にアニーリングする条件は当該分野で周知であり、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）およびＷｅｔｍｕｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９，１９６８に記載されている。一般に、かかるアニーリングが起こるかどうかは、特に、一定の酵素インヒビターの対応する第１および第３の領域および／または第４および第５の領域の相補部分、プライマーならびに標的隣接配列および／またはアンプリコン中のその対応する結合部位の相補部分、切断プローブまたはライゲーションプローブおよび標的核酸またはアンプリコンの対応する結合部分の相補部分、または対応する相補部分もしくはレポータープローブおよびその結合部位の長さ、ｐＨ、温度、１価および２価の陽イオンの存在、ハイブリッド形成領域中のＧおよびＣヌクレオチドの比率、培地の粘度、ならびに変性剤の存在に影響を受ける。かかる変動因子は、ハイブリッド形成に必要な時間に影響を与える。一定の酵素インヒビターの実施形態では、インヒビター、プローブ、および／またはプライマー中の一定のヌクレオチドアナログまたは副溝結合剤の存在もハイブリッド形成条件に影響を与える。したがって、好ましいアニーリング条件は、特定の適用に依存するであろう。しかし、当業者は、かかる条件を過度に実験することなく日常的に決定することができる。好ましくは、アニーリング条件プライマーおよび／またはプローブが対応する標的隣接配列またはアンプリコン中の相補配列と選択的にハイブリッド形成するが、第２の反応温度での反応組成物中の異なる標的核酸または非標的配列にいかなる有意な程度でもハイブリッド形成しないように選択する。

【0029】

用語「選択的にハイブリッド形成する」およびその変形形態は、適切なストリンジェンシー条件下で、所与の配列（例えば、プライマーが含まれるが、これに限定されない）がヌクレオチドの相補鎖を含む第２の配列（例えば、アンプリコンの標的隣接配列またはプライマー結合部位が含まれるが、これらに限定されない）とアニーリングするが、望ましくない配列（非標的核酸、プローブ、または他のプライマーなど）とアニーリングしないことを意味する。典型的には、反応温度が特定の二本鎖配列の融点にむかって上昇するにつれて、選択的ハイブリッド形成の相対量は一般に増加し、誤プライミングは一般に減少する。本明細書では、一方の配列が他方の配列にハイブリッド形成するか選択的にハイブリッド形成するという記述は、両配列の全体が相互にハイブリッド形成するか選択的にハイブリッド形成するという状況および配列の一方または両方の一部のみが他の配列の全体あまたは他の配列の一部にハイブリッド形成するか選択的にハイブリッド形成するという状況を含む。

【0030】

本明細書中で使用される、用語「ストリンジェンシー」を、ハイブリッド形成中に存在する温度および溶媒の組成ならびに２つの相補ヌクレオチド配列から構成されるハイブリッドが形成されるその後の処理工程を定義するために使用する。ストリンジェンシーはまた、相同性、必要条件、および２つのヌクレオチド配列間に形成されたハイブリッドの安定性を定義する。ストリンジェンシー条件が高くなるにつれて、選択的ハイブリッド形成が好まれ、非特異的交差ハイブリッド形成が避けられる。ストリンジェンシー条件の増加は、典型的には、誤プライミング（ライゲーションプローブおよび／または切断プローブの誤アニーリングが含まれるが、これらに限定されない）が起こる可能性がより高いより低いストリンジェンシー条件と比較してより高いインキュベーション温度、より低い塩濃度、および／またはより高いｐＨに相当する。当業者は、プライマーまたはプライマー対、ライゲーションプローブ対、および／または切断プローブ対が対応する標的隣接配列および／またはアンプリコンに選択的にハイブリッド形成することができる適切なストリンジェンシー条件を、周知の技術を使用して、過度の実験を行うことなく日常的に決定することができると理解している（例えば、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ ｆｒｏｍ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅｎｃｈ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（２０００；以下“ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ”）を参照のこと）。

【0031】

本明細書では、一方の核酸配列が他方のヌクレオチド配列と同一であるか実質的に同一であるという記述は、両ヌクレオチド配列が他方の配列と同一であるか実質的に同一であるという状況および一方の配列の一部のみが他方の配列全体の一部と同一であるか実質的に同一であるという状況を含む。同様に、一方の核酸配列が他方のヌクレオチド配列と相補的であるか実質的に相補的であるという記述は、両ヌクレオチド配列が相互に相補的であるか実質的に相補的であるという状況および一方の配列の一部のみが他方の配列全体の一部と相補的であるか実質的に相補的であるという状況を含む。

【0032】

本明細書中で使用される、用語「アプタマー」は、１）典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択プロセス（例えば、指数関数的富化によるリガンドの体系的評価（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）プロセスまたはその変形形態が含まれるが、これらに限定されない）を使用して最初に同定され、２）非常に特異的な高次構造依存様式で結合パートナー（例えば、酵素が含まれるが、これに限定されない）を認識して結合するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドをいう。

【0033】

本明細書中で使用される、用語「またはこれらの組み合わせ」は、この用語に先行する列挙事項の全ての置換物および組み合わせをいう。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはこれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうちの少なくとも１つを含むことを意図し、特定の文脈で順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢも含むことを意図する。この例の連続物で明らかに含まれるのは、１つまたは複数の用語の連続物（ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、およびＣＡＢＡＢＢなど）を含む組み合わせである。当業者は、文脈から明らかでない限り、典型的には、任意の組み合わせ中のこの用語の数に制限はないと理解するであろう。

【0034】

本明細書中で使用される、用語「相補的な」および「相補性」を、塩基対合規則によって関連する少なくとも２つの核酸に関して使用する。例えば（制限されない）、配列「Ａ－Ｃ－Ｔ」は、配列「Ｔ－Ｇ－Ａ」に相補的である。塩基対合規則にしたがってヌクレオチドのいくつかのみが適合する場合、相補性は部分的であり得る。そうでなければ、核酸間は完全または全体的に相補的であり得る。核酸鎖間の相補度は、核酸鎖間のハイブリッド形成の有効性および強度に対して有意な影響を及ぼす。相補性は、安定な二重鎖の形成に完全に必要ではない（すなわち、安定な二重鎖はミスマッチした塩基対または非適合塩基を含み得る）。当業者は、多数の変動因子（核酸の長さ、核酸の塩基組成および配列、イオン強度、ならびにミスマッチした塩基対の発生率が含まれるが、これらに限定されない）を考慮して、二重鎖安定性を経験的に決定することができる。核酸二重鎖の安定性を、典型的には、その融点によって測定する。

【0035】

本明細書中で使用される、用語「複合体」および「酵素インヒビター－酵素複合体」は、本教示の酵素インヒビターと対応する酵素との間の会合をいう。いくつかの実施形態では、酵素インヒビター－酵素複合体は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、切断酵素、またはヘリカーゼを含む。用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｓ）」、およびその変形形態は、酵素に関して使用する場合、相対語であり、同一の増幅条件であるが酵素インヒビターの非存在下の酵素活性と比較した酵素活性の測定可能な減少をいう。一部の実施形態では、酵素インヒビターと複合体化した場合、酵素インヒビターの存在下および非存在下における並行した増幅反応で生成された所望のアンプリコンの量によって決定した場合、酵素の酵素活性は、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または９９％を超えて減少する。一部の実施形態では、複合体がアクセサリータンパク質、ＮＴＰ、ヌクレオチドアナログ、ＮＡＤ＋を含む物質、またはこれらの組み合わせをさらに含む場合、至適に阻害される。

【0036】

本明細書中で使用される、用語「対応する」は、この用語が関連するエレメント間の少なくとも１つの特異的関係をいう。例（制限されない）は以下である：特定のプライマー対の少なくとも１つの順方向プライマーが同一のプライマー対の少なくとも１つの逆方向プライマーに対応すること、少なくとも１つのプライマーが対応する標的核酸の隣接領域および／または少なくとも１つの対応するアンプリコンのプライマー結合部分とアニーリングするようにデザインすること、ライゲーションプローブ組の第１のプローブがライゲーション部位の上流、典型的にはこの部位に隣接した標的核酸および／またはアンプリコンにアニーリングすること、対応する第２のライゲーションプローブがライゲーション部位の下流、典型的にはこの部位に隣接した標的核酸および／またはアンプリコンにアニーリングすること、一定の酵素インヒビターの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、対応する第２のオリゴヌクレオチドとアニーリングして、少なくとも１つの二本鎖セグメントを含む二重鎖を形成することなど。

【0037】

本明細書中で使用される、用語「変性する（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）」および「変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）」は、二本鎖ポリヌクレオチド（少なくとも１つの標的核酸を含むｇＤＮＡフラグメント、二本鎖アンプリコン、または少なくとも１つの二本鎖セグメントを含むポリヌクレオチド（例えば、酵素インヒビターが含まれるが、これに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない）を、必要に応じて、第１の温度で二本鎖ポリヌクレオチドまたは一本鎖もしくは実質的に一本鎖のポリヌクレオチドに変換する任意のプロセスをいう。酵素インヒビターの二本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖セグメントには、酵素インヒビターの二本鎖核酸または二本鎖セグメントを一本鎖または実質的に一本鎖にする種々の熱技術および化学的技術（例えば、二本鎖ポリヌクレオチドまたは２つのオリゴヌクレオチドを含む二重鎖からの２つの各一本鎖成分の放出が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、使用される変性技術は、一般に、変性技術が増幅反応のその後のアニーリングもしくは酵素的工程、または、一定の方法では、蛍光シグナルの検出を実質的に妨害しない場合、制限されない。

【0038】

本明細書中で使用される、用語「二本鎖」は、その長さの少なくとも一部に沿ってハイブリッド形成した１つまたは２つの核酸鎖をいう。従って、一定の文脈では、「二本鎖」は、オリゴヌクレオチドの第１の領域の少なくとも１つのセグメントが同一のオリゴヌクレオチドの第３の領域の少なくとも１つのセグメントにハイブリッド形成するか、オリゴヌクレオチドの第４の領域の少なくとも１つのセグメントがそのオリゴヌクレオチドの第６の領域の少なくとも１つのセグメントにハイブリッド形成するか、またはその両方によって１つまたは複数の二本鎖セグメントおよび１つまたは複数の一本鎖部分を形成するように折り畳むことができる１つのオリゴヌクレオチドの一部をいうことができる。したがって、１つのヌクレオチド鎖は、二本鎖および一本鎖のセグメントを有するヘアピンまたはステム－ループ高次構造を形成することができる（例えば、図１を参照のこと）。同様に、２つの相補オリゴヌクレオチドが相互にハイブリッド形成して、二本鎖を形成することができる（例えば、図２を参照のこと）。したがって、「二本鎖」は、核酸が完全に二本鎖でなければならないことを意味しない。むしろ、二本酸核酸は、１つまたは複数の一本鎖セグメントおよび１つまたは複数の二本酸セグメントを有し得る。

【0039】

用語「第１の温度」は、酵素－酵素インヒビター複合体を形成することができる温度（しばしば、温度範囲）をいう。用語「第２の温度」は、酵素－酵素インヒビター複合体が解離するかこれを形成しない温度（しばしば、温度範囲）をいう。当業者が認識するように、第２の温度は、典型的には、酵素インヒビターが少なくとも１つの二本鎖セグメントを含む高次構造を担うために、酵素インヒビターのＴｍ未満である。例示的な第１の温度は、周囲温度、すなわち「室温」であり得る。

【0040】

本明細書中で使用される、用語「Ｔｍ」を、融点に関して使用する。融点は、二本鎖核酸分子集団が半分に解離して一本鎖になる温度である。

【0041】

「マイクロ流体デバイス」は、少なくとも１つのマイクロチャネル（一般に、内部の寸法が１ｍｍ以下である）を含む反応容器である。マイクロ流体デバイスは、典型的には、非常に小さな反応体積（しばしば、およそ１または数マイクロリットル（μＬ）、ナノリットル、またはピコリットル）を使用する。当業者は、マイクロ流体デバイスのサイズ、形状、および組成が本教示を制限しないと認識している。むしろ、開示の方法の１つまたは複数の工程の実施において、任意の適切なマイクロ流体デバイスを使用することができる。例示的マイクロ流体デバイスおよびその使用の説明は、特に、Ｆｉｏｒｉｎｉ ａｎｄ Ｃｈｉｕ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８：４２９－４６（２００５）；Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｗｏｏｌｌｅｙ，Ａｎａｌｙｔ．Ｃｈｅｍ．７７（５）：９６Ａ－１０２Ａ（２００５）；Ｃｈｅｕｋ－Ｗａｉ Ｋａｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２５：３５６４－８８（２００４）；およびＹｅｕｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：４０５－１２（２００１）に見出すことができる。

【0042】

本明細書中で使用される、用語「副溝結合剤」は、時折、配列特異的様式で二本鎖ＤＮＡの副溝に適合する小分子をいう。一般に、副溝結合剤は、三日月のような形状を取り、それにより、二重らせんの副溝にぴったり適合し、しばしば水を置換する長くて平坦な分子である。副溝結合剤分子は、典型的には、自由にねじれる結合によって連結されたいくつかの芳香環（フラン環、ベンゼン環、またはピロール環が含まれるが、これらに限定されない）を含む。

【0043】

本明細書中で使用される、用語「誤プライミング（ｍｉｓ－ｐｒｉｍｉｎｇ）」または「誤プライミングされた（ｍｉｓ－ｐｒｉｍｅｄ）」は、非標的核酸へのプライマーまたはプローブのハイブリッド形成をいう。当該分野で公知のように、プライマー（ランダムプライマーを除く）を、一般に、標的核酸に隣接する選択された配列またはアンプリコンのプライマー結合部位にハイブリッド形成し、その部位でＤＮＡ合成またはプライマー伸長が指示されるようにデザインする。しばしば低いまたは低下したストリンジェンシー条件下でプライマーまたはプローブが非標的核酸にハイブリッド形成し、次いで、その非標的部位からのプライマー伸長のための開始点としての機能を果たし、一定の所望の二次増幅産物が合成される場合に誤プライミングが起こり得る。ライゲーションプローブ対および切断プローブ対はまた、しばしば低いまたは低下したストリンジェンシー条件下で非標的核酸に誤アニーリングし得、それにより、望ましくない増幅産物も形成され得る。

【0044】

本明細書中で使用される、用語「非伸長ヌクレオチド」は、ポリメラーゼによって他のヌクレオチドを実質的に付加することができないヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態では、非伸長ヌクレオチドは、別のヌクレオチドとのホスホジエステル結合の形成のための至適な官能基を持たないヌクレオチドアナログである。一部の実施形態では、非伸長ヌクレオチドは、本質的にプライマー伸長できない鎖終結ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮｓ）（ｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧ、ｄｄｌ、ｄｄＴ、およびｄｄＵなど）である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、非伸長ヌクレオチドに他のヌクレオチドを結合することができるが、低速である。

【0045】

用語「非特異的」または「バックグラウンド」は、蛍光に関して使用する場合、所望のアンプリコン以外の二本鎖核酸に会合した核酸色素分子から放射された検出可能なシグナルをいう。所望のアンプリコンは、標的核酸の増幅産物を含み、いくつかの実施形態では、これらには、特に、標準化および／または定量のために本教示の一定の反応組成物に含まれ得る内部標準またはコントロール配列が含まれる。したがって、偽二次アンプリコンとの核酸色素分子の会合、しばしば、誤プライミング、誤ライゲーション、および／またはプライマー二量体形成の結果に起因する蛍光シグナルは、非特異的蛍光の１つの原因である。当業者は、本教示の酵素インヒビターが、核酸色素分子が会合することができる第１の温度で少なくとも１つの二本鎖セグメントを含む場合、インヒビターのクエンチャー部分が会合した核酸色素（バックグラウンドの第２の供給源）由来のいくつかの検出可能な蛍光シグナルを吸収し得るので、反応組成物の非特異的蛍光が減少すると認識している。

【0046】

時折、窒素塩基または窒素複素環塩基と呼ばれる、用語「ヌクレオチド塩基」は、ヌクレオチド成分としての機能を果たし得る置換または非置換芳香環をいう。一部の実施形態では、芳香環は窒素原子を含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド塩基は、相補ヌクレオチド塩基とワトソン－クリック水素結合またはフーグスティーン水素結合を形成することができる。例示的ヌクレオチド塩基およびそのアナログには、天然に存在するヌクレオチド塩基であるアデニン、グアニン、シトシン、５－メチルシトシン、ウラシル、およびチミン、ならびに天然に存在するヌクレオチド塩基のアナログ（７－デアザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザ－８－アザアデニン、Ｎ６－Δ２－イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６－Δ２－イソペンテニル－２－メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ２－ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７－メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，６－ジアミノプリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、５－プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、２－チオピリミジン、６－チオグアニン、４－チオチミン、４－チオウラシル、Ｏ^６－メチルグアニン、Ｎ^６－メチルアデニン、Ｏ^４－メチルチミン、５，６－ジヒドロチミン、５，６－ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４－Ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第６，１４３，８７７号および同第６，１２７，１２１号、ならびにＰＣＴ公開出願ＷＯ ０１／３８５８４号を参照のこと）、エテノアデニン、インドール（ニトロインドールおよび４－メチルインドールなど）、およびピロール（ニトロピロールなどが含まれる）が含まれる。ヌクレオチド塩基の非限定的な例を、例えば、Ｆａｓｍａｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３８５－３９４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８９）、およびその参考文献に見出すことができる。

【0047】

本明細書中で使用される、用語「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいい、最も一般的なエステル化部位はペントースのＣ－５部位に結合した水酸基である。用語「ヌクレオチド」はまた、一般に、文脈から明らかでない限り、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を含む化合物組をいうために使用される。本明細書中で使用される、用語「ヌクレオシド」は、糖（リボース、アラビノース、キシロース、ピラノース、およびこれらの糖アナログなど）のＣ－１’炭素に結合したヌクレオチド塩基を含む化合物をいう。糖は、置換されていても置換されていても良い。置換リボース糖には、１つまたは複数の炭素原子（例えば、２’－炭素原子）が１つまたは複数の同一または異なる－Ｒ基、－ＯＲ基、－ＮＲ_２アジド基、シアニド基、またはハロゲン基（式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、Ｃ_２～Ｃ_７アシル、またはＣ_５～Ｃ_１４アリールである）に置換されたリボースが含まれるが、これらに限定されない。例示的リボースには、２’－（Ｃ_１～Ｃ_６）アルコキシリボース、２’－（Ｃ_５～Ｃ_１４）アリールオキシリボース、２’，３’－ジデヒドロリボース、２’－デオキシ－３’－ハロリボース、２’－デオキシ－３’－フルオロリボース、２’－デオキシ－３’－クロロリボース、２’－デオキシ－３’－アミノリボース、２’－デオキシ－３’－（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルリボース、２’－デオキシ－３’－（Ｃ_１～Ｃ_６）アルコキシリボース、および２’－デオキシ－３’－（Ｃ_５～Ｃ_１４）アリールオキシリボース、リボース、２’－デオキシリボース、２’，３’－ジデオキシリボース、２’－ハロリボース、２’－フルオロリボース、２’－クロロリボース、および２’－アルキルリボース（例えば、２’－Ｏ－メチル）、４’－α－アノマーヌクレオチド、１’－α－アノマーヌクレオチド、２’－４’－および３’－４’－結合および他の「ロックド（ｌｏｃｋｅｄ）」または「ＬＮＡ」、二環式糖修飾物が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ９８／２２４８９号、ＷＯ９８／３９３５２号、およびＷＯ９９／１４２２６号；Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：１－７，２００１；ならびに米国特許第６，２６８，４９０号を参照のこと）。「ＬＮＡ」または「ロックド核酸」は、リボース環が、例えば、２’－酸素と３’－もしくは４’－炭素または３’－４’ＬＮＡとの間（限定されない）のメチレン結合によって固定されるように高次構造が固定されたヌクレオチドアナログである（例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ ａｎｄ Ｏｂｉｋａの米国特許第６，２６８，４９０号；およびＷｅｎｇｅｌ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎの米国特許第６，６７０，４６１号を参照のこと）。結合によって強いられた高次構造の制限により、しばしば、相補配列に対する結合親和性が増加し、かかる二重鎖の熱安定性が増加する。ポリヌクレオチド内の例示的ＬＮＡ糖アナログには、以下の構造：

【0048】

【化1】

（式中、Ｂは任意のヌクレオチド塩基である）が含まれる。

【0049】

リボースの２’位または３’位を、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、シアノ、アミド、イミド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモを含むように修飾することができる。ヌクレオチドには、天然のＤ型光学異性体形態およびＬ型光学異性体形態が含まれる（例えば、Ｇａｒｂｅｓｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４１５９－６５（１９９３）；Ｆｕｊｉｍｏｒｉら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３６－３８（１９９０）；Ｕｒａｔａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９－ ７０（１９９３）を参照のこと）。ヌクレオチド塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）である場合、ヌクレオチド塩基のＮ^９位にリボース糖が結合する。ヌクレオチド塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、Ｔ、たはＵ）である場合、ウラシルヌクレオチド塩基のＣ５位にペントース糖が結合するプソイドウリジン以外のヌクレオチド塩基のＮ^１位にペントース糖が結合する（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ Ｅｄ．（１９９２），Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡを参照のこと）。

【0050】

ヌクレオチドの１つまたは複数のペントース炭素を、式：

【0051】

【化2】

（式中、αは０～４の整数である）を有するリン酸エステルに置換することができる。一部の実施形態では、αは２であり、リン酸エステルはペントースの３’－または５’－炭素に結合する。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基がプリン、７－デアザプリン、ピリミジン、またはこれらのアナログであるヌクレオチドである。用語「ヌクレオチド５’－三リン酸」は、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいい、時折、リボース糖の構造的特徴を特に指摘するために、「ｒＮＴＰ」または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」、一般に「ＮＴＰ」と示す。三リン酸エステル基には、種々の酸素の硫黄置換物（例えば、α－チオ－ヌクレオチド５’三リン酸）が含まれ得る。ヌクレオチド化学の概説は、特に、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１８７－９１（１９９０）；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）；およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｇａｉｔ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６；以後“Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｇａｉｔ”）中に見出すことができる。

【0052】

用語「ヌクレオチドアナログ」は、一般的に本明細書中におよび他の場所に記載のように修飾ヌクレオチド塩基部分、修飾ペントース部分、および／または修飾リン酸部分を有し、ポリヌクレオチドの場合、修飾ヌクレオチド間結合を有する合成アナログをいう（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０；Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３０：６１３－２９，１９９１；Ａｇａｒｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９４；およびＳ．Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９－１３４，１９９８）。一般に、修飾リン酸部分は、リン原子が＋５酸化状態であり、１つまたは複数の酸素原子が非酸素部分（例えば、硫黄が含まれるが、これに限定されない）に置換されたリン酸のアナログを含む。リン酸アナログのいくつかの非限定的な例には、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロジセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホルアニリダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホルアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ボロノホスフェート（ｂｏｒｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）（かかる対イオンが存在する場合、関連対イオン（例えば、Ｈ^＋、ＮＨ_４ ^＋、Ｎａ^＋が含まれる）が含まれる。修飾ヌクレオチド塩基部分の非限定的な例には、５－メチルシトシン（５ｍＣ）；Ｃ－５－プロピニルアナログ（Ｃ－５プロピニル－ＣおよびＣ－５プロピニル－Ｕが含まれるが、これらに限定されない）、２，６－ジアミノプリン（２－アミノ アデニンまたは２－アミノ－ｄＡとしても公知）、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、２－チオピリミジン、イソシトシン（イソＣ）、５－メチルイソＣ、およびイソグアニン（イソＧ；例えば、米国特許第５，４３２，２７２号を参照のこと）が含まれる。修飾ペントース部分の非限定的な例には、ＬＮＡアナログ（Ｂｚ－Ａ－ＬＮＡ、５－Ｍｅ－Ｂｚ－Ｃ－ＬＮＡ、ｄｍｆ－Ｇ－ＬＮＡ、およびＴ－ＬＮＡが含まれるが、これらに限定されない）（例えば、Ｔｈｅ Ｇｌｅｎ Ｒｅｐｏｒｔ，１６（２）：５（２００３）；Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４：３６０７－３０（１９９８）を参照のこと）、ならびに２’位または３’位が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ）、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、またはブロモである２’または３’修飾物が含まれる。修飾ヌクレオチド間結合には、リン酸アナログ、アキラルおよび非荷電サブユニット間結合（例えば、Ｓｔｅｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．ら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．５２：４２０２（１９８７））、およびアキラルサブユニット間結合を有する非荷電モルホリノベースのポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号を参照のこと）が含まれる。ヌクレオチド間結合アナログのいくつかの非限定的な例には、モルホリデート、アセタール、およびポリアミド結合複素環が含まれる。ペプチド核（「ＰＮＡ」と総称される）（偽相補ペプチド核酸が含まれるが、これらに限定されない）として公知のヌクレオチドアナログの１つのクラスでは、従来の糖およびヌクレオチド間結合が、２－アミノエチルグリシンアミド骨格ポリマーに置換されている（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７－１５００（１９９１）；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１４：１８９５－ １８９７（１９９２）；Ｄｅｍｉｄｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：５９５３－５８（２００２）；Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）を参照のこと）。酵素的組み込みまたは化学合成で用いる広範なヌクレオチドアナログは、他の供給元（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＭＤ；Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａｎａｒｋｓｈｉｒｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ；およびＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、酸リン酸塩、ホスホルアミダート、またはＣＰＧ誘導体として利用可能である。オリゴヌクレオチド合成および一定のヌクレオチドアナログの説明は、特に、Ｓ．Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９－１３４（１９９９）；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１：１６５－８７（１９９０）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅら、ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００５年８月の最新版が含まれる（以後“Ｂｅａｕｃａｇｅら”）；およびＢｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｇａｉｔに見出すことができる。

【0053】

本明細書中で使用される、用語「プライマー結合部位」は、ポリヌクレオチド配列（典型的には、プライマーが当該分野で公知の任意の適切なプライマー伸長反応（例えば、ＰＣＲが含まれるが、これに限定されない）のためにアニーリングすることができるテンプレートとして直接またはその相補物によって機能することができる標的核酸および／またはアンプリコン）の領域をいう。２つのプライマー結合部位が１つのポリヌクレオチド上に存在し、２つのプライマー結合部位の方向が一般に異なることが当業者に認識されるであろう。例えば、プライマー対の一方のプライマーが第１のプライマー結合部位に相補的であり、これとハイブリッド形成することができる一方で、プライマー対の対応するプライマーを、第２のプライマー結合部位の相補物にハイブリッド形成するようにデザインする。つまり、いくつかの実施形態では、第１のプライマー結合部位はセンス方向であり得、第２のプライマー結合部位はアンチセンス方向であり得る。アンプリコンのプライマー結合部位は、標的隣接配列またはその相補物と同一の配列またはその少なくともいくつかの配列を含み得るが、含む必要はない。

【0054】

当業者は、標的核酸および／または増幅産物が一定の増幅手段によって増幅された場合、相補アンプリコンまたはアンプリコンの相補鎖中にプライマー結合部位の相補物が合成されると理解している。したがって、プライマー結合部位の相補物は、本明細書中で使用される、用語「プライマー結合部位」の意図する意味の範囲内に明確に含まれると理解すべきである。

【0055】

本明細書中で使用される、用語「プローブ結合部位」は、ポリヌクレオチド配列（典型的には、プローブがアニーリングすることができるテンプレートとして直接またはその相補物によって機能することができる標的核酸および／またはアンプリコン）の領域をいう。当業者は、ライゲーションプローブ対のプローブ結合部位が上流のプローブ結合部位および下流のプローブ結合部位を含み、これらの２つの部位が典型的には相互に隣接していると認識するであろう。一部の実施形態では、上流のライゲーションプローブ結合部位および下流のプローブ結合部位は相互に隣接せず、増幅工程はギャップ充填反応を含み得る。当業者は、切断プローブ対のプローブ結合部位が上流のプローブ結合部位を含み、これは、下流の切断プローブ結合部位の少なくとも一部に隣接するが、これと重複する必要はないかもしれないということも認識するであろう。

【0056】

当業者は、標的核酸および／または増幅産物が一定の増幅手段によって増幅された場合、相補アンプリコンまたはアンプリコンの相補鎖中にプローブ結合部位の相補物が合成されると理解している。したがって、プローブ結合部位の相補物は、本明細書中で使用される、用語「プローブ結合部位」の意図する意味の範囲内に明確に含まれると理解すべきである。

【0057】

本明細書中で使用される、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」を、交換可能に使用し、これらは、ヌクレオチド単量体の一本鎖および二本鎖ポリマー（ヌクレオチド間ホスホジエステル結合および関連対イオン（例えば、Ｈ^＋、ＮＨ_４ ^＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ^２＋、およびＮａ^＋など）によって結合した２’－デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはヌクレオチド間アナログなどが含まれるが、これらに限定されない）をいう。ポリヌクレオチドは、完全なデオキシリボヌクレオチド、完全なリボヌクレオチド、またはそのキメラ混合物から構成され得、ヌクレオチドアナログが含まれ得る。ヌクレオチド単量体単位は、本明細書中に記載の任意のヌクレオチド（ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログが含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。ポリヌクレオチドは、典型的には、数個の単量体単位（例えば、これらが当該分野で時折オリゴヌクレオチドと呼ばれる場合、５～４０個）から数千個の単量体ヌクレオチド単位までのサイズ範囲である。他で示さない限り、ポリヌクレオチド配列を示す時は常に、ヌクレオチドは、左から右に５’→３’の順序であり、他で示さない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシトシンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｕ」はデオキシウリジンを示すと理解されるであろう。

【0058】

本明細書中で使用される、用語「クエンチャー」は、少なくともいくつかの強度の蛍光放射を吸収する部分をいう。クエンチャーを、蛍光クエンチャーおよびダーククエンチャー（ｄａｒｋ ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ）（時折、非蛍光クエンチャーとも呼ばれる）として分類することができる。蛍光クエンチャーは、第１の波長の蛍光源（例えば、核酸の二本鎖セグメントに会合した核酸色素が含まれるが、これに限定されない）から放射された蛍光シグナルを吸収することができる部分（典型的には、フルオロフォア）であり、十分な蛍光エネルギーの吸収後、蛍光クエンチャーは、クエンチャーに特徴的な第２の波長の蛍光を放射することができる（「蛍光共鳴エネルギー移動」またはＦＲＥＴと呼ばれる過程）。例えば（限定されない）、ＴＡＭＲＡ蛍光クエンチャーに会合したＦＡＭフルオロフォアは、４９２ｎｍ（ＦＡＭの励起ピーク）で発光し、５８０ｎｍ（ＴＡＭＲＡの放射ピーク）で蛍光を放射する。蛍光源と適切に対合したダーククエンチャーは、供給源からの蛍光エネルギーを吸収するが、それ自体は蛍光を発しない。むしろ、ダーククエンチャーは、吸収したエネルギーを典型的には熱として放散する。一部の実施形態では、ダーククエンチャーは、蛍光源（本教示の酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素など）からのエネルギー移動受容体として作用するがそれぞれの検出可能な蛍光シグナルを放射しない発色団を含む。ダーククエンチャーまたは非蛍光クエンチャーの非限定的な例には、ＤＡＢＣＹＬ（４－（４’－ジメチルアミノフェニルアゾ）スルホン酸）、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャーシリーズのクエンチャー（例えば、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、およびＢＨＱ－３が含まれるが、これらに限定されない）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ、ＱＳＹシリーズのクエンチャー（例えば、ＱＳＹ－７が含まれるが、これに限定されない）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ非蛍光クエンチャー、ナノ結晶（例えば、量子ドット）、金属（金ナノ粒子）などが含まれる。

【0059】

本明細書中で使用される、用語「反応容器」は、一般に、本教示にしたがって反応させることができる任意のコンテナ、チャンバー、デバイス、またはアセンブリをいう。いくつかの実施形態では、反応容器は、微小管（例えば、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）Ｏｐｔｉｃａｌ ｔｕｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの０．２ｍＬまたは０．５ｍＬの反応管）、微量遠心管、または分子生物学実験で一般的な他のコンテナであり得る。いくつかの実施形態では、反応容器は、マルチウェルプレートのウェル、スライドガラス上のスポット、マイクロ流体デバイスのチャネルまたはチャンバー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙが含まれるが、これらに限定されない）を含む。例えば（制限されない）、複数の反応容器は、同一の支持体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ ａｎｄ Ｆｌｕｉｄｇｍから利用可能なラボオンチップ（ｌａｂ－ｏｎ－ａ－ｃｈｉｐ）様デバイスは、開示の方法における反応容器としての機能を果たし得る。種々の反応容器が市販されているか、本教示の状況で使用するためにデザインすることができると認識されるであろう。

【0060】

用語「レポーター基」は、本明細書中にて広義で使用され、任意の識別可能なタグ、標識、または部分をいう。

【0061】

用語「小ＲＮＡ分子」は、本明細書中にて広義で使用され、非コードであり、典型的には、１５０ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、７５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、１９ヌクレオチドと２７ヌクレオチドとの間、および２１ヌクレオチドと２３ヌクレオチドとの間の長さを有するリボヌクレオチドを含む任意の核酸配列をいう。小ＲＮＡ分子は、一本鎖、二本鎖であり得るか、少なくとも１つの一本鎖領域および少なくとも１つの二本鎖領域（ステム－ループ領域またはヘアピン領域が含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。小ＲＮＡ分子の非限定的な例には、非翻訳機能的ＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、小さな非メッセンジャーＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、小さな非コードＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）、小さな調整ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ＲＮＡ）（ｓｍＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）および前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）などのｍｉＲＮＡ前駆体が含まれるが、これらに限定されない）、および小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が含まれる（例えば、Ｅｄｄｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：９１９－ ２９（２００１）；Ｓｔｏｒｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１２６０－６３（２００２）；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉａ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ＲＮＡｉｓｓａｎｃｅ：１－３（２００３））。一部の実施形態では、標的核酸は、小ＲＮＡ分子を含む。リボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドアナログを含む本教示の酵素インヒビターは、本明細書中で使用される、用語「小ＲＮＡ分子」の意図する範囲から明確に除外される。

【0062】

用語「熱安定性」は、酵素に関して使用する場合、酵素が高温（例えば、約５５℃またはそれ以上が含まれるが、これらに限定されない）で機能的であるか活性である（すなわち、触媒として機能することができる）ことを示す。本教示での使用に適切であり得る熱安定性酵素は、種々の業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏＩＩａ，ＣＡ）、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない）から市販されている。当業者は、熱安定性酵素を、種々の好熱性生物および／または超好熱性酵素生物（例えば、真正細菌種および古細菌種（かかる生物に感染する一定のウイルスが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない）から単離することができ、かかる熱安定性酵素は開示の複合体、方法、およびキットでの使用に適切であり得ると理解するであろう。

【0063】

用語「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）」または「普遍的ヌクレオチド（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」を、本明細書中で一般に交換可能に使用し、これは、ポリヌクレオチド（酵素インヒビターが含まれるが、これに限定されない）中の１種を超える天然に存在するヌクレオチドを構成し得るヌクレオチドアナログをいう。普遍的塩基は、典型的には、窒素原子を含んでいても含んでいなくても良い芳香環部分を含み、一般に、二重鎖を安定化させるために芳香環スタッキングを使用する。一部の実施形態では、普遍的塩基は、ペントース糖のＣ－１’炭素に共有結合して普遍的ヌクレオチドを形成することができる。一部の実施形態では、普遍的塩基は、別のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合しない。一部の実施形態では、普遍的塩基は、疎水性スタッキングによって同一の核酸鎖上の隣接ヌクレオチド塩基と相互作用することができる。普遍的ヌクレオチドおよび普遍的塩基の非限定的な例には、デオキシ－７－アザインドール三リン酸（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリル三リン酸（ｄＩＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリル三リン酸（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル－７－アザインドール三リン酸（ｄＭ７ＡｌＴＰ）、デオキシＩｍＰｙ三リン酸（ｄＩｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰ三リン酸（ｄＰＰＴＰ）、デオキシプロピニル－７－アザインドール三リン酸（ｄＰ７ＡＩＴＰ）、３－メチルイソカルボスチリル（ＭＩＣＳ）、５－メチルイソカルビル（５ＭＩＣＳ）、イミダゾール－４－カルボキシアミド、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、ヒポキサンチン、イノシン、デオキシイノシン、５－フルオロデオキシウリジン、４－ニトロベンズイミジゾール、および一定のＰＮＡ－塩基（一定の偽相補ＰＮＡ（ｐｃＰＮＡ）塩基が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。普遍的塩基の説明は、特に、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：２４３７－４７（２００１）；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９１１－１４（２０００）；Ｌｏａｋｅｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：４２６－３５（１９９７）；Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９－１３４（１９９８）；公開ＰＣＴ出願番号ＵＳ０２／３３６１９号、およびＰａｔｒｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｖｉｎの米国特許第６，４３３，１３４号に見出すことができる。

【0064】

２つの異なるオリゴヌクレオチドが同一の線状相補核酸の異なる領域にアニーリングし、一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が他方のオリゴヌクレオチドの５’末端に面するか対峙する場合、前者を「上流」オリゴヌクレオチドということができ、後者を「下流」オリゴヌクレオチドということができる。

【0065】

一定の例示的成分
用語「切断酵素」は、適切な条件下で核酸切断構造（時折、重複フラップ構造または侵襲性切断反応基質と呼ばれる）と組み合わされた場合に下流切断プローブの非アニーリングフラップ部分を切断してライゲーションニックを含む構造を生成する任意のポリペプチドをいう。切断酵素の制限されない例には、構造特異的ヌクレアーゼ（例えば、細菌およびバクテリオファージ由来の一定のＤＮＡポリメラーゼ（その単離５’エクソヌクレアーゼドメインが含まれる）、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）、真核生物フラップエンドヌクレアーゼ、および古細菌フラップエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：７７８－８３（１９９３）；Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２２１０９－１２（１９９５）；Ｗｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：２０３６－４３（１９９６）；Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７１５４－６１（１９９８）；Ｋａｉｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１３８７－９４（１９９９）；Ａｌｌａｗｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：５３７－５４（２００３）；および米国特許第５，６１４，４０２号および同第６，７０６，４７１号を参照のこと）。

【0066】

核酸切断構造は、典型的には、テンプレート鎖にハイブリッド形成して「フラップ」を形成する２つの重複プローブを含む切断プローブ対にハイブリッド結合したテンプレート鎖（一般に、標的核酸、一本鎖アンプリコン、または二本鎖アンプリコンの個別の鎖）を含む。第１または上流の切断プローブは、テンプレート鎖の第１の部分に相補的であり、第２または下流の切断プローブのテンプレート相補配列の５’末端に重複する配列を含み、第２または下流の切断プローブは、（１）テンプレート鎖の第１の部分に隣接するテンプレート鎖の第２の部分に相補的な配列、および（２）テンプレート鎖に相補的であっても相補的でなくても良いが、テンプレート鎖にハイブリッド形成した場合、上流の切断プローブの３’末端に置換される少なくとも１つのヌクレオチドを含む５’領域を含む（例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２９２－９６（１９９９）（特に、図１）；Ｎｅｖｉｌｌｅら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２：Ｓ３４－４３（２００２）（特に、図２Ａ）；Ａｌｌａｗｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：５３７－５４（２００３）（特に、図２）；およびＢｒｏｗらの米国特許第６，７０６，４７１号（例えば、図３２および６５）を参照のこと。本教示の一定の切断酵素インヒビターを、核酸切断構造に類似するかこれを模倣する第１の温度で高次構造を想定するようにデザインする。一定の開示の切断酵素インヒビターは、第１の温度で核酸切断構造を形成することができるが、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、切断酵素によって切断することができないかゆっくりと切断され得る少なくとも１つのヌクレオチドアナログおよび／または少なくとも１つのヌクレオチド間結合（「非切断性ヌクレオチド間結合」）を含む。非切断性ヌクレオチド間結合の非限定的な例には、ホスホロチオアート（ホスホロジチオアートが含まれるが、これらに限定されない）、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、およびボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が含まれる。

【0067】

「リガーゼ」は、適切な条件下で隣接してハイブリッド形成されるプローブの３’－ＯＨと５’－リン酸との間（ライゲーションプローブ組の第１のライゲーションプローブと第２のライゲーションプローブとの間または切断酵素によって切断された第１の切断プローブと第２の切断プローブのハイブリッド形成フラグメントとの間が含まれるが、これらに限定されない）のホスホジエステル結合形成を触媒するポリペプチドである。温度感受性リガーゼには、バクテリオファージＴ４リガーゼおよび大腸菌リガーゼが含まれるが、これらに限定されない。温度感受性リガーゼの非限定的な例には、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、ＴｆＩリガーゼ、Ｍｔｈリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ ＨＢ８リガーゼ、Ｔｓｃリガーゼ、サーマス属ＡＫ１６Ｄリガーゼ、Ａｐｅリガーゼ、Ｌｉｇ_Ｔｋリガーゼ、Ａａｅリガーゼ、Ｒｍリガーゼ、およびＰｆｕリガーゼが含まれる（例えば、Ｈｏｕｓｂｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：ｅ１０，２０００；Ｔｏｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：１４４７－ ５４，２０００；Ｎａｋａｔａｎｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：６５０－５６，２００２；およびＳｒｉｓｋａｎｄａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２２２１－２８，２０００を参照のこと）。当業者は、多くの中温性、熱安定性、および／または超好熱性のリガーゼ（ＤＮＡリガーゼおよびＲＮＡリガーゼが含まれる）を、中温性、好熱性、または超好熱性の生物（例えば、一定の真正細菌種および古細菌種ならびにかかる中温性、好熱性、または超好熱性の生物に感染するウイルス）から得ることができ、かかるリガーゼは、開示の複合体、方法、およびキットで適切であり得ると認識するであろう。

【0068】

本明細書中で使用される、用語「核酸色素」は、二本鎖ポリヌクレオチドに特異的であるか、一本鎖ポリヌクレオチドよりも二本鎖ポリヌクレオチドに会合する場合に少なくとも実質的により高く蛍光が増加する蛍光分子をいう。典型的には、核酸色素分子は、二本鎖セグメントの塩基対間の介入、二本鎖セグメントの主溝または副溝中の結合、またはその両方によってポリヌクレオチドの二本鎖セグメントに会合する。核酸色素の非限定的な例には、臭化エチジウム、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ誘導体（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２が含まれるが、これらに限定されない）、ランタノイドキレートを含む介入物（例えば、２つの蛍光テトラデンタート（ｔｅｔｒａｄｅｎｔａｔｅ）β－ケトン－Ｅｕ３＋キレートを含むナルサレンジイミド（ｎａｌｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｉｍｉｄｅ）誘導体（ＮＤＩ－（ＢＨＨＣＴ－Ｅｕ^３＋）_２が含まれるが、これらに限定されない）（例えば、Ｎｏｊｉｍａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌｅｍｎｅｎｔ Ｎｏ．１ ，１０５－０６（２００１）を参照のこと）、臭化エチジウム、および一定の非対称性シアニン色素（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、およびＢＯＸＴＯなど）が含まれる。

【0069】

一定の開示の酵素インヒビターの核酸配列は、アプタマーを含む。アプタマーは、高度に特異的な高次構造依存様式（典型的には、非常に高い親和性）で、標的分子に結合するが、当業者は、必要に応じて、より低い結合親和性を有するアプタマーを選択することができると理解するであろう。アプタマーは、非常に小さな構造の相違（メチル基またはヒドロキシル基の有無など）に基づいて標的を区別することが示されており、一定のアプタマーは、Ｄ鏡像異性体とＬ鏡像異性体を識別することができる。小分子標的（薬物、金属イオン、および有機色素、ペプチド、ビオチン、およびタンパク質（ストレプトアビジン、ＶＥＧＦ、ウイルスタンパク質、および種々の酵素（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ、およびプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる）に結合するアプタマーが得られている（例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１：１００－１１（１９９７）；Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７９８０－８６（１９９７）；Ｋｕｌｂａｃｈｉｎｓｋｉｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：４９２１－３１（２００４）；Ｈａｎｎｏｕｓｈら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．５：５２７－３３（２００４）；Ｂｅｌｌｅｃａｖｅら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３：４５５－６３（２００３）；およびＮｉｓｈｉｋａｗａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：１９３５－４３（２００３）を参照のこと）。アプタマーは、ビオチン化、フルオレセイン標識後、およびガラス表面およびミクロスフェアに結合した場合に機能的活性を保持することが示されている。

【0070】

アプタマー（スペイゲルマー（ｓｐｅｉｇｅｌｍｅｒｓ）が含まれる）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択プロセス（例えば、指数関数的増幅によるリガンドの体系的評価（ＳＥＬＥＸ）として公知のプロセスが含まれるが、これに限定されない）によって同定する。ＳＥＬＥＸプロセスでは、オリゴヌクレオチドの非常に大きな組み合わせライブラリー（例えば、１０^１４～１０^１５個の個別の配列、しばしば、６０～１００ヌクレオチド長の大きさ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択および増幅の反復プロセスによって日常的にスクリーニングする。ほとんどの標的は、８～１５サイクル以内で親和性富化され、このプロセスは、より速いアプタマー単離のために自動化されている。当業者は、アプタマーを過度に実験を行うことなく従来の手順後に得ることができると理解するであろう。アプタマーおよびその選択についての説明は、特に、Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（２３）：１３５８１－８４（１９９５）；Ｌ Ｇｏｌｄら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：７６３－９７（１９９５）；Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：６１１－４７（１９９９）；Ｃｏｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ１０８（２００２）；Ｈｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０－２５（２０００）；Ｖｕｙｉｓｉｃｈ ａｎｄ Ｂｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．９：９０７－１３（２００２）；Ｓ．Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５：１６２８－５０（１９９９）；Ｃｏｘ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：２５２５－３１（２００１）；Ｅｕｌｂｅｒｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ５（２００５）；およびＪａｙａｓｅｎａ ａｎｄ Ｇｏｌｄの米国特許第６，１８３，９６７号中に見出すことができる。

【0071】

用語「ＤＮＡポリメラーゼ」は、本明細書中にて広義で使用され、テンプレート依存様式でのデオキシリボヌクレオチドおよび／または一定のヌクレオチドアナログの付加によるハイブリッド形成したプライマーの５’－３’伸長を触媒することができる任意のポリペプチドをいう。例えば（限定されない）、プライマー伸長反応中に核酸テンプレートにアニーリングするプライマーの３’末端へのデオキシリボヌクレオチドの連続的付加。ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例には、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素が含まれるが、これに限定されない）およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。一定のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、一定の真正細菌Ａ型ＤＮＡポリメラーゼおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない）が構造特異的ヌクレアーゼ活性をさらに含むことができ、増幅反応が、切断酵素がＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応が侵襲性切断反応（例えば、ＦＥＮ－ＬＣＲまたはＰＣＲ－ＦＥＮ（例えば、Ｂｉらの米国特許第６，５１１，８１０号；およびＮｅｖｉｌｌｅら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３２：Ｓ３４－４３（２００２））を含む場合に、侵襲切断においてかかるポリメラーゼを本明細書中で切断酵素といい、対応する酵素活性が構造特異的オリゴヌクレオチド切断を含むと認識すべきである。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、重合活性および構造特異的切断活性の両方をもたらす。用語「ＲＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（しばしば、ＲＮＡレプリカーゼという）をいい、テンプレート依存様式でのリボヌクレオチドの５’－３’付加を触媒することができる任意のポリペプチドが含まれる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、プロモーター配列に結合し、転写を触媒する。ＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例には、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、ＳＰ６、ｆ２、ＭＳ２、およびＱβ由来のＲＮＡポリメラーゼが含まれる。

【0072】

用語「プライマー」は、適切なストリンジェンシー条件下で標的核酸の隣接配列または増幅産物の対応するプライマー結合部位に選択的にハイブリッド形成するようにデザインされ、３’末端由来の対応するポリヌクレオチドテンプレートに相補的なヌクレオチド配列の合成開始点としての機能を果たす、典型的には約１２～３５ヌクレオチド長の「標的」結合部分を含むポリヌクレオチド（一般に、オリゴヌクレオチド）をいう。

【0073】

用語「順方向」および「逆方向」は、プライマー対のプライマーに関して使用される場合、ポリヌクレオチド配列上のプライマーの相対的方向を示す。例として（制限されない）、左から右の方向に水平に置いた一本鎖ポリヌクレオチドにおいて、左側を５’末端とする。「逆方向」プライマーを、右から左に５’→３’方向で例示的ポリヌクレオチドの「３’」末端またはその付近で下流プライマー結合部位にアニーリングするようにデザインする。対応する「順方向」プライマーを、左から右に５’→３’の「順」方向でポリヌクレオチドの「５’」末端またはその付近で上流プライマー結合部位の相補物にアニーリングするようにデザインする。したがって、逆方向プライマーは、ヌクレオチドの逆方向または下流プライマー結合部位に相補的な配列を含み、順方向プライマーは、順方向または上流プライマー結合部位と同一または実質的に同一の配列を含む。本パラグラフ中で使用される、用語「３’末端」および「５’末端」は例示のみを目的とし、必ずしも文字通りにポリヌクレオチドの各末端をいうわけではないと理解すべきである。むしろ、この例示的プライマー対の逆方向プライマーが、対応する順方向プライマーの「標的」結合部分と同一または実質的に同一の配列を含む順方向プライマー結合部位の下流である逆方向プライマー結合部位にアニーリングするという点のみが制限される。当業者に認識されるように、これらの用語は、制限を意図しないが、むしろ、所与の実施形態において例示的方向を提供することを意図する。

【0074】

本教示の「プライマー対」は、順方向プライマーおよび対応する逆方向プライマーを含む。順方向プライマーは、第１または上流の標的隣接配列のヌクレオチド配列と同一または実質的に同一であり、特に、逆方向増幅産物中に存在する上流標的隣接配列の相補物に選択的にハイブリッド形成するようにデザインされた配列を含む第１の標的特異的部分を含む。プライマー対の逆方向プライマーは、特に、順方向増幅産物中に存在する第２または下流の標的領域隣接配列に相補的または実質的に相補的であり、これに選択的にハイブリッド形成ようにデザインされた配列を含む第２の標的特異的部分を含む。一部の実施形態では、プライマー対の順方向プライマー、逆方向プライマー、または順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、レポータープローブ結合部位、普遍的プライマー結合部位、および／またはレポーター基（例えば、蛍光レポーター基が含まれるが、これに限定されない）をさらに含む。いくつかの実施形態では、配列決定プライマーは、蛍光レポーター基を含む。一部の実施形態では、プライマー対の順方向プライマーおよび対応する逆方向プライマーは、温度ベースの非対称ＰＣＲが可能なように異なる融点を有する。

【0075】

普遍的プライマーまたはプライマー組を、本教示の一部の実施形態にしたがって使用することができる。一部の実施形態では、普遍的プライマーまたはプライマー組は、２つまたはそれを超える異なる標的核酸種および／または２つまたはそれを超える異なる所望のアンプリコン種にハイブリッド形成し、それにより、これらを増幅するために使用することができる。

【0076】

用語「プローブ」は、配列特異的様式で特定の核酸配列（例えば、標的核酸または増幅産物が含まれるが、これらに限定されない）上の相補プローブ結合部位にハイブリッド形成するようにデザインされた部分を含むポリヌクレオチドをいう。一部の実施形態では、ライゲーションプローブ組の対応するプローブを共にライゲーションして、ライゲーションしたプローブを形成する。いくつかの実施形態では、切断プローブ組の対応するプローブがテンプレート鎖にアニーリングして、核酸切断構造を形成し、これを適切な条件下で適切な切断酵素によって切断して、テンプレート鎖、上流切断プローブ、および第２の切断プローブのハイブリッド形成したフラグメントを含むハイブリッド形成構造を形成することができる。一部の実施形態では、アニーリングした上流切断プローブおよび下流切断プローブのハイブリッド形成したフラグメントを共にライゲーションして、ライゲーションされたプローブを形成する。一部の実施形態では、プローブは、レポーター基（例えば、レポータープローブが含まれるが、これに限定されない）を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、プライマー結合部位を含む。

【0077】

本教示のプローブおよびプライマーの配列特異的部分は、標的核酸および所望のアンプリコン中の相補配列への特異的アニーリングを可能にするのに十分な長さである。プライマーおよびプローブデザインの詳細な説明を、特に、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５；以後「ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ」）、Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ，Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（２０００），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（以後「Ｒａｐｌｅｙ」）、Ｓｃｈｅｎａ；ａｎｄ Ｋｗｏｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：９９９－１００５（１９９０）に見出すことができる。プライマーおよびプローブデザインのソフトウェアプログラムも市販されており、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ａｎｄ Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＰＲＥＭＩＥＲ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ４，Ｓｃｉ－Ｅｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｖｅ，ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、Ｏｌｉｇｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ、ｉＯｌｉｇｏ，Ｃａｅｓａｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ、およびワールドワイドウェブ上のｒｅａｌｔｉｍｅｐｒｉｍｅｒｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔ．ｓｔまたはｍｅｄｇｅｎ３１．ｕｒｇｅｎｔ．ｂｅ／ｐｒｉｍｅｒｄａｔａｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘ のＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ（Ｐａｔｔｙｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：１２２－２３（２００３）も参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。

【0078】

当業者は、開示のプローブおよびプライマー、標的核酸、所望のアンプリコン、またはこれらの組み合わせの相補物を本教示の一部の実施形態で使用することができると認識するであろう。例えば、制限されないが、ゲノムＤＮＡサンプルは、標的核酸配列およびその相補物の両方を含み得る。したがって、一部の実施形態では、ゲノムサンプルが変性される場合、標的核酸およびその相補物の両方は、一本鎖配列としてサンプル中に存在する。一部の実施形態では、プライマー、ライゲーションプローブ対、切断プローブ対、またはこれらの組み合わせを、適切な配列（標的核酸、標的核酸の相補物、アンプリコン、および／またはアンプリコンの相補物が含まれるが、これらに限定されない）に選択的にハイブリッド形成するようにデザインすることができる。

【0079】

用語「レポータープローブ」は、標的核酸および／またはアンプリコンにアニーリングするヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログの配列をいい、放射波長の強度の変化（これに限定されない）が検出された場合、これを使用して、終点またはリアルタイム検出技術（例えば、Ｑ－ＰＣＲ技術が含まれるが、これに限定されない）において対応する標的核酸を同定および／または定量する。ほとんどのレポータープローブを、その作用様式に基づいて分類することができ、これらのプローブには、例えば、以下が含まれるが、これらに限定されない：ヌクレアーゼプローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが含まれるが、これに限定されない（例えば、Ｌｉｖａｋ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １４：１４３－１４９（１９９９）；Ｙｅｕｎｇら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３６：２６６－７５（２００４）を参照のこと））、伸長プローブ（スコーピオンプライマー（ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）、Ｌｕｘ（商標）プライマー、およびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒｓなど）、ハイブリッド形成プローブ（分子ビーコン、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ、ライトアッププローブ、単一標識されたレポータープローブ対、およびハイブリッド形成プローブ対など）、またはこれらの組み合わせ。一部の実施形態では、レポータープローブは、ＰＮＡ、ＬＮＡ、普遍的塩基、またはこれらの組み合わせを含み、ステム－ループおよびステムレスレポータープローブ立体配置が含まれ得る。一定のレポータープローブは単一標識される一方で、他のレポータープローブは二重標識される。隣接してハイブリッド形成されるプローブの間にＦＲＥＴを含む二重プローブ系は、用語「レポータープローブ」の意図する範囲内に含まれる（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３６：７２３－２８（２００３）を参照のこと）。

【0080】

当該分野で時折非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ）シアニン色素または非対称（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ）シアニン色素と記載される、「非対称（ｕｎｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ）シアニン色素」は、一般式Ｒ_２Ｎ［ＣＨ＝ＣＨ］_ｎＣＨ＝ＮＲ_２（式中、ｎは少数であり、Ｒ基は、典型的には、少なくとも１つのベンザゾールおよび少なくとも１つのキノリン基または少なくとも１つのピリジン基を含む）の色素分子をいう。非対称性シアニン色素の非限定的な例には、［２－Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ－プロピルアミノ］－４－［２，３－ジヒドロ－３－メチル－（ベンゾ－１，３－チアゾール－２－イル）－メチリデン］－１－フェニル－キノリニウム］（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）、［２－Ｎ－ビス－（３－ジメチルアミノプロピル）－アミノ］－アミノ］－４－［２，３－ジヒドロ－３－メチル－（ベンゾ－１，３－チアゾール－２－イル）－メチリデン］－１－フェニル－キノリニウム］（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標））、４－［（３－メチル－６－（ベンゾチアゾール－２－イル）－２，３－ジヒドロ－（ベンゾ－１，３－チアゾール）－２－メチリデン）］－１－メチル－ピリジニウムヨージド（ＢＥＢＯ）、ＢＯＸＴＯ、およびＢＥＴＯが含まれる。非対称性シアニン色素の説明を、特に、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：６２２７－ ３４（２００３）；Ｚｉｐｐｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ１０３（２００４）；Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ４５（２００３）；およびＧｏｒａｎｓｓｏｎら、Ａｓｙｍｅｔｔｒｉｃ ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅｓ，ＤＮＡ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５，Ｃｈａｌｍｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５；以下のワールドワイドウェブ上で利用可能：ｍｏｌｂｉｏｔｅｃｈ．Ｃｈａｌｍｅｒｓ．ｓｅ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｍｋ／Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ％ｃｙａｎｉｎｅ％ｄｙｅｓ．ｄｏｃ）に見出すことができる。

【0081】

用語「標的核酸」または「標的」は、本技術の組成物、方法、およびキットを使用して特異的に増幅および／または検出される核酸配列をいう（二次増幅産物と対照的に、典型的には、後プライミングによる偽副反応の結果である）。一部の実施形態では、標的核酸は、プライマー伸長反応においてテンプレートとしての機能を果たす。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ライゲーションテンプレートとしての機能を果たす。いくつかの実施形態では、標的核酸は、核酸切断構造においてテンプレート鎖としての機能を果たす。一部の実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡを含み、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）またはミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）中に存在する。一部の実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡ（例えば、リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ前駆体（プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、またはプリｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない）など）が含まれるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、小ＲＮＡ分子（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、または他のｎｃＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない）を含む。標的核酸は、核酸分子全体を構成する必要はない。例えば（限定されない）、巨大な核酸（例えば、ｇＤＮＡフラグメント）は、複数の異なる標的核酸分子を含み得る。典型的には、標的核酸は、少なくとも１つの定義した末端を有する。多くの核酸増幅反応では、標的は、定義の末端を含む。

【0082】

一部の実施形態では、標的核酸は、２つの隣接配列（標的核酸のいずれかの側面であるが、必ずしも直接隣接する必要はない場所に存在する第１の標的隣接配列および第２の標的隣接配列）の間に存在する。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡフラグメントなどのポリヌクレオチドは、複数の異なる標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、１つまたは複数の異なる標的核酸に連続しているか隣接している。いくつかの実施形態では、所与の標的核酸は、その５’末端上の一方の標的核酸、その３’末端上の他方の標的核酸、またはその両方が重複し得る。他の実施形態では、例えば（制限されない）、標的が小ＲＮＡ分子を含む場合、標的は隣接領域を含まなくてよく、プライマーを、小さなＲＮＡ標的の一部（典型的には、標的核酸の末端）にアニーリングするようにデザインする（例えば、Ｃｈｅｎらの米国特許出願番号１０／９４７，４６０号を参照のこと）。

【0083】

一定の例示的成分の技術
本教示によれば、標的核酸を、任意の生きている生物または生きていた生物（原核生物、古細菌、または真核生物（例えば、昆虫（ショウジョウバエが含まれるが、これに限定されない）、寄生虫（線虫が含まれるが、これに限定されない）、植物（シロイヌナズナが含まれるが、これに限定されない）、動物（ヒト、マウス、家畜、または非ヒト霊長類が含まれるが、これらに限定されない）、原核細胞、および真核生物から得た細胞、組織、および器官（例えば、臨床生検材料、口腔スワブ、培養細胞、および血球が含まれるが、これらに限定されない）これらに限定されない）が含まれる）から得ることができる。ウイルス核酸も本教示の範囲内に含まれる。一部の実施形態では、標的核酸は、二本鎖形態または一本鎖形態で存在し得る。当業者は、ｇＤＮＡには全長材料だけでなく、多数の手段（例えば、酵素消化、超音波処理、および剪断力などが含まれるが、これらに限定されない）によって生成されたフラグメントも含まれ、すべてのかかる材料は、全長またはフラグメントにかかわらず、本教示の増幅反応のためのテンプレートとしての機能を果たしうるｇＤＮＡの形態を表すものと認識する。

【0084】

標的核酸は、合成または天然に存在する標的核酸のいずれかであり得る。一定の標的核酸（必要に応じて、隣接配列が含まれる）を、当該分野で周知のオリゴヌクレオチド合成方法を使用して合成することができる。かかる技術の詳細な説明を、特に、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＢｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｇａｉｔに見出すことができる。標的核酸および他のオリゴヌクレオチド（一定の酵素インヒビター、プローブ、およびプライマーが含まれるが、これらに限定されない）の合成に有用な自動化ＤＮＡ合成機は、多数の業者から市販されており、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ合成機モデル３８１Ａ、３９１、３９２、および３９４（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が含まれる。標的核酸（必要に応じて、隣接領域が含まれる）および他のオリゴヌクレオチドを、当該分野で周知のｉｎ ｖｉｖｏ法および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法を使用して合成的に生成することもできる。かかる技術の説明を、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００５年９月２６日までの増補が含まれる）（以後「Ａｕｓｕｂｅｌら」）に見出すことができる。

【0085】

本教示の方法で使用される標的核酸（含まれるが限定されない）を、当該分野で公知の任意の適切なサンプル調製技術を使用して生体物質からｇＤＮＡを得ることができる。市販の核酸抽出装置およびシステムには、特に、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）６１００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎおよびＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）６７００ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎが含まれる。核酸サンプル調製試薬およびキットも市販されており、ＮｕｃＰｒｅｐ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＢｌｏｏｄＰｒｅｐ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＴｒａｎｓＰｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ、およびＰｒｅｐＭａｎ（商標）Ｕｌｔｒａ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびにｍｉＲｖａｎａ ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）が含まれるが、これらに限定されない。精製核酸または部分精製核酸（ｇＤＮＡ、総ＲＮＡ、および組織特異的核酸調製物が含まれるが、これらに限定されない）は、多数の業者（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ ＪｏＩＩａ ＣＡ、Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から市販されている。

【0086】

用語「増幅（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」および「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、本明細書中にて広義で使用され、標的核酸、アンプリコン、標的核酸の少なくとも一部、またはアンプリコンの少なくとも一部がテンプレート依存様式（線形または指数関数的な広範な核酸配列増幅技術が含まれる）で再生またはコピーされる当該分野で公知の任意の技術をいう。いくつかの増幅技術は等温的に行われ、いくつかの増幅技術は温度サイクリングを使用して行われ、いくつかの増幅技術はサーモサイクリングを含む少なくとも１つの等温増幅工程および少なくとも１つの増幅工程を含む。増幅技術のいくつかの非限定的な例には、プライマー伸長（ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、非同期ＰＣＲ（Ａ－ＰＣＲ）、非対称ＰＣＲ、定量的またはＱ－ＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）（それぞれのギャップ充填バージョンおよびギャップオリゴヌクレオチドバージョンが含まれるが、これらに限定されない）（例えば、Ｃａｏ，Ｃｈａｐｔｅｒ １．３ ｉｎ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｄｅｍｉｄｏｖ ａｎｄ Ｂｒｏｕｄｅ，ｅｄｓ．，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００４；以後「Ｄｅｍｉｄｏｖ ａｎｄ Ｂｒｏｕｄｅ」）；Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５－８２（１９９５）；Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：２２５－３２（１９９８）；およびＳｅｇｅｖの米国特許第６，００４，８２６号を参照のこと）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（時折、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）と呼ばれる）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および多置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（時折、転写媒介増幅（ＴＭＡ）または自律維持複製（３ＳＲ）と呼ばれる）、ＳＰＩＡ（商標）およびＲｉｂｏＳＰＩＡ（商標）増幅（例えば、Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１ ，６３９号および米国特許公報番号ＵＳ２００３／００１７５９１ Ａ１号を参照のこと）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ；例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ら、ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：７９５－８００（２００４）を参照のこと）（その多重バージョンおよび／または組み合わせ（例えば、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（組み合わせ鎖反応（ＣＣＲ）としても公知）が含まれる）が含まれる。一定の増幅技術の説明を、特に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，３ｄ ｅｄ．（２００１；以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ａｕｓｕｂｅｌら；ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；Ｒａｐｌｅｙ；Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：２２５－３２（１９９８）；Ｗｉｅｄｍａｎｎら、Ｓ５１－６４，ｉｎ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｃａｏ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３８－４４（２００４）；およびＷｅｎｚ ａｎｄ Ｓｃｈｒｏｔｈの米国特許公報番号ＵＳ２００３／０１９０６４６Ａ１号に見出すことができる。

【0087】

一部の実施形態では、増幅技術は、少なくとも１つの増幅サイクル（例えば（制限されない）、二本鎖核酸を変性させて成分鎖を分離する工程、プライマーをアンプリコン（または、必要に応じて、いずれかの相補物）の標的隣接配列またはプライマー結合部位にハイブリッド形成させる工程、およびＤＮＡポリメラーゼを使用したテンプレート依存様式でヌクレオチド鎖を合成する工程）を含む。一部の実施形態では、増幅工程は、二本鎖核酸を変性させて成分鎖を分離する工程、第１のライゲーションプローブおよび対応する第２のライゲーションプローブを、（１）標的核酸または標的核酸の対応する第２のライゲーションプローブまたは（２）アンプリコンにハイブリッド形成する工程、およびリガーゼで隣接してハイブリッド形成したプローブをライゲーションして、ライゲーションしたプローブ（例示的アンプリコン）を形成する工程を含む。一部の実施形態では、増幅サイクルは、二本鎖核酸を変性させて成分鎖を分離する工程、上流切断プローブおよび対応する下流切断プローブを（１）標的核酸または標的核酸の相補物または（２）アンプリコンにハイブリッド形成して、核酸切断構造を形成する工程、切断構造を切断してフラップを放出させ、下流切断プローブのハイブリッド形成したフラグメントに隣接してアニーリングした上流切断プローブを含むハイブリッド形成構造を形成する工程、および、任意選択的に、隣接してハイブリッド形成したプローブをリガーゼでライゲーションしてライゲーションしたプローブを形成する工程を含む。サイクルを反復しても反復しなくても良い。一部の実施形態では、増幅サイクルは、複数の増幅サイクル（例えば、２０増幅サイクル、２５増幅サイクル、３０増幅サイクル、３５増幅サイクル、４０増幅サイクル、４５増幅サイクル、または４５を超える増幅サイクルが含まれるが、これらに限定されない）を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、増幅は、装置（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、９６００、２７００、または２４００サーモサイクラー（全て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれるが、これらに限定されない）を使用したサーモサイクリングを含む。一部の実施形態では、一本鎖アンプリコンを、増幅反応（例えば、非対称ＰＣＲまたはＡ－ＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない）で生成する。

【0089】

核酸を含む反応組成物でのサーマルサイクリング反応および検出を行い、特定の波長の光ビームを放射し、二本鎖核酸に会合した核酸色素分子から放射された蛍光シグナルの強度を読み取り、各サイクル後の蛍光強度を表示することができるデバイスが開発されている。サーマルサイクラー、光ビーム放射体、および蛍光シグナル検出器を含むデバイスは、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号、同第６，０１５，６７４号、および同第６，１７４，６７０号に記載されており、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。

【0090】

一部の実施形態では、これらの機能を個別のデバイスによって行うことができる。例えば（制限されない）、増幅のためにＱ－βレプリカーゼ反応を使用する場合、この反応は、サーマルサイクラー中ではなく、特定の波長を放射する光ビーム、蛍光シグナルの検出、ならびにモニターまたは他の読み取りデバイスでの増幅産物両の計算および表示を含み得る装置内で行うことができる。

【0091】

一部の実施形態では、サーマルサイクリングと蛍光検出デバイスとの組み合わせを、サンプル中の標的核酸配列の正確な定量のために使用することができる。一部の実施形態では、蛍光シグナルを、１つまたは複数のサーマルサイクル中および／または後に検出および表示することができ、それにより、反応が「リアルタイム」で起こるにつれて、増幅産物がモニタリングされる。一部の実施形態では、増幅産物量および増幅サイクル数を使用して、増幅前にどの程度の標的核酸配列がサンプル中に存在したかを計算することができる。

【0092】

いくつかの実施形態では、１つの核酸について１つのライゲーションプローブを準備し、標的を線形に増幅する（例えば、ＬＤＲが含まれるが、これに限定されない）。一部の実施形態では、１つの標的核酸について２つのライゲーションプローブ組を準備し、標的を指数関数的に増幅する（例えば、ＬＣＲが含まれるが、これに限定されない）。いくつかの実施形態では、第１の切断プローブおよび対応する第２の切断プローブが標的核酸にアニーリングして重複配列またはフラップ配列を含む核酸切断構造を形成し、これが切断酵素のための適切な基質を形成する。一部の実施形態では、切断後、第１の切断プローブおよび第２の切断プローブのハイブリッド形成したフラグメントをライゲーションして、ライゲーションしたプローブを形成することができる。いくつかの実施形態では、ライゲーションプローブは、プライマー結合部位を含み、プライマー伸長反応（例えば、ＰＣＲが含まれるが、これに限定されない）のためのテンプレートして機能を果たし得る。

【0093】

本教示のプライマー伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを使用した５’→３’方向でテンプレートにアニーリングされるプライマーの伸長を含む増幅プロセスである。一部の実施形態によれば、適切な緩衝液、塩、ｐＨ、温度、および適切なＮＴＰ（ヌクレオチドアナログを含み得るが、必要ない）を使用して、ＤＮＡポリメラーゼは、アニーリングしたプライマーの３’末端から開始されるテンプレート鎖に相補的なヌクレオチドを組み込んで、相補鎖を生成する。一部の実施形態では、プライマー伸長のために使用されるＤＮＡポリメラーゼは、５’－エクソヌクレアーゼ活性、３’－エクソヌクレアーゼ活性、またはその両方を欠くか実質的に欠く。いくつかの実施形態では、プライマー伸長は逆転写を含み、ＤＮＡポリメラーゼは、一定の条件下で逆転写酵素活性を含む逆転写酵素またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、高度好熱菌（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、組換えＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（ｒＴｔｈ ｐｏｌ）、ＧｅｎｅＡｍｐ ＡｃｃｕＲＴ ＲＮＡ ＰＣＲ酵素、サーマスＺ０５属（ＴＺ０５）ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない）を含む（例えば、Ｓｍｉｔｈら、ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，ａｔ ｐａｇｅｓ ２１１－２１９を参照のこと）。一部の実施形態では、プライマー伸長は、逆転写酵素およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。一定のかかる実施形態では、反応組成物は、１つのＤＮＡポリメラーゼインヒビターまたは少なくとも２つの異なるＤＮＡポリメラーゼインヒビター（例えば、逆転写酵素と複合体を形成することができるＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成することができる第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビターが含まれるが、これらに限定されない）を含み得る。一定のプライマー伸長反応の説明を、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ａｕｓｕｂｅｌら、およびＣｈｅｎらの米国特許公報番号１０／９４７，４６０号に見出すことができる。

【0094】

本教示のいくつかの実施形態では、増幅は、２工程反応（限定されたサイクル数（例えば、２、３、４、または５回の増幅サイクルが含まれるが、これらに限定されない）の増幅が起こる増幅前工程、およびその後の得られたアンプリコンを一般に希釈し、希釈アンプリコンの一部をさらなる増幅サイクルに供するその後の増幅工程が含まれるが、これらに限定されない）を含む（例えば、Ｍａｒｍａｒｏ ａｎｄ Ｇｏｒｄｅｓの米国特許第６，６０５，４５１号およびＡｎｄｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｒｕｆｆの米国特許公報番号ＵＳ２００４／０１７５７３３号を参照のこと）。いくつかの実施形態では、増幅前工程、その後の増幅工程、またはその両方は、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。

【0095】

一部の実施形態では、増幅反応は、多重増幅を含む。この多重増幅は、複数の異なる標的核酸および／または複数の異なる増幅産物種を、複数の異なるプライマー組、複数の異なるライゲーションプローブ組、複数の異なる切断プローブ組、またはこれらの組み合わせを使用して同時に増幅する（例えば、Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：５０４－１１，１９９７；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ，Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９５）；およびＲａｐｌｅｙ（特に、７９章）を参照のこと）。開示の方法の一部の実施形態は、並行して行われる多重増幅反応および単回（ｓｉｎｇｌｅ－ｐｌｅｘ）増幅反応（複数の単回または少数回（ｌｏｗｅｒ－ｐｌｅｘｙ）の反応（例えば、二重、三重、四重、五重、または六重の反応が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる）を含む。

【0096】

一部の実施形態では、増幅反応は、非対称ＰＣＲを含む。一部の実施形態によれば、非対称ＰＣＲは、（ｉ）プライマー対の対応するプライマーと比較してあるプライマーが過剰な（例えば、５倍、１０倍、または２０倍過剰が含まれるが、これらに限定されない）少なくとも１つのプライマー対、（ｉｉ）たった１つの順方向プライマーまたはたった１つの逆方向プライマーを含む少なくとも１つのプライマー対、（ｉｉｉ）所与の増幅条件中に１つの鎖および無効の対応するプライマーが増幅されるプライマーを含む少なくとも１つのプライマー対、または（ｉｖ）上記の（ｉ）および（ｉｉｉ）の両方の記載を満たす少なくとも１つのプライマー対を含む反応組成物を含む。したがって、標的核酸および／またはアンプリコンが増幅される場合、（その相補物と比較して）その後の増幅産物の一方の鎖が過剰に生成される。非対称ＰＣＲの説明を、特に、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（特に、第５章）およびＲａｐｌｅｙ（特に、第６４章）に見出すことができる。

【0097】

一部の実施形態では、一方のプライマーのＴｍが他方のプアリマーのＴｍより高い少なくとも１つのプライマー対を使用することができる（時折、Ａ－ＰＣＲと呼ばれる）（例えば、Ｃｈｅｎらの米国特許公報番号ＵＳ２００３／０２０７２６６Ａ１号を参照のこと）。一部の実施形態では、順方向プライマーのＴｍは、対応する逆方向プライマーのＴｍと少なくとも４～１５℃異なる。一部の実施形態では、順方向プライマーのＴｍは、対応する逆方向プライマーのＴｍと少なくとも８～１５℃異なる。一部の実施形態では、順方向プライマーのＴｍは、対応する逆方向プライマーのＴｍと少なくとも１０～１５℃異なる。一部の実施形態では、順方向プライマーのＴｍは、対応する逆方向プライマーのＴｍと少なくとも１０～１２℃異なる。一部の実施形態では、少なくとも１つのプライマー対で、順方向プライマーのＴｍは、対応する逆方向プライマーのＴｍと少なくとも約４℃、少なくとも約８℃、少なくとも約１０℃、または少なくとも約１２℃異なる。

【0098】

Ａ－ＰＣＲの一部の実施形態では、プライマー対中のプライマーのＴｍの相違に加えて、プライマー対中の一方のプライマーが他方のプライマーと比較して過剰でもある。一部の実施形態では、プライマー対中の一方のプライマーが他方のプライマーと比較して５倍～２０倍過剰に存在する。Ａ－ＰＣＲの一部の実施形態では、プライマー濃度は、少なくとも５０ｎＭである。

【0099】

一定のＡ－ＰＣＲの実施形態によれば、二本鎖アンプリコンまたは標的核酸の両方プライマーがアニーリングし、両方の鎖が増幅されるような第１の増幅サイクル中で従来のＰＣＲを使用することができる。しかし、たった１つの鎖が増幅されるようにより低いＴｍのプライマーを無効にすることができる。したがって、より低いＴｍのプライマーを無効にするその後のＡ－ＰＣＲサイクルにより、非対称に増幅される。したがって、標的核酸または増幅産物が増幅される場合、（その相補物と比較して）その後の増幅産物の一方の鎖が過剰に生成される。

【0100】

一定のＡ－ＰＣＲの実施形態によれば、従来のＰＣＲサイクリングの第１段階の間のサイクル数の変化によって、増幅レベルを調節することができる。かかる実施形態では、最初の従来のサイクル数の変化により、二本鎖増幅産物の量を変化させることができ、これを、より低いＴｍのプライマーが無効なより高い温度のその後のＰＣＲのサイクルに供する。

【0101】

増幅産物の一定の至適化方法は、当業者に公知である。例えば、アニーリング、重合、および変性の時間および温度の変化、ならびに反応組成物中の緩衝液、塩、および他の試薬の変化によってＰＣＲを至適化することができることが公知である。使用されるプローブおよび／またはプライマーのデザインも、至適化に影響を及ぼし得る。例えば、プローブおよび／またはプライマーの長さならびにＧ－Ｃ：Ａ－Ｔ比は、アニーリング効率を変化させ、それにより、増幅反応を変化させることができる。増幅至適化の説明を、特に、Ｊａｍｅｓ Ｇ．Ｗｅｔｍｕｒ，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｓ，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，” ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．６０５－８，（Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ ｅｄ．，１９９５）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（特に第４章）；Ｒａｐｌｅｙ；およびＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ，ｒｅｖ．９／０４，Ｐｒｏｍｅｇａに見出すことができる。

【0102】

一定の反応組成物は、ｄＵＴＰおよびウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ；例えば、ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）をさらに含む。増幅反応におけるｄＵＴＰおよびＵＮＧの使用の考察を、例えば、Ｋｗｏｋら、Ｎａｔｕｒｅ，３３９：２３７－ ２３８，１９８９；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；Ｌｏｎｇｏら、Ｇｅｎｅ，９３：１２５－１２８，１９９０；およびＧｅｌｆａｎｄらの米国特許第５，４１８，１４９号に見出すことができる。

【0103】

一定の方法の実施形態では、増幅は、ヘリカーゼ（大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、またはバクテリオファージＴ７遺伝子４タンパク質が含まれるが、これらに限定されない）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩまたはＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントが含まれるが、これらに限定されない）、ヘリカーゼアクセサリータンパク質（ＭｕｔＬタンパク質が含まれるが、これに限定されない）、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）（大腸菌ＳＳＢ、Ｔ７遺伝子２．５ ＳＳＢ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、および／またはＲＢ４９遺伝子３２タンパク質が含まれるが、これらに限定されない）、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビターを、第１の温度で複合体中にて酵素インヒビターおよびヘリカーゼが相互に会合するが、第２の温度では会合せず、この温度で酵素インヒビターおよびヘリカーゼが解離する場合、ヘリカーゼの酵素活性を阻害するようにデザインする。一部の実施形態では、ヘリカーゼインヒビターのヌクレオチド配列はアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ヘリカーゼインヒビターのヌクレオチド配列は、第１の温度で二本鎖セグメントを形成することができるが、典型的には、第２の温度で形成できない。

【0104】

いくつかの実施形態では、増幅は、リガーゼ媒介増幅技術（例えば、ＬＤＲ、ＬＣＲ、ＦＥＮ－ＬＣＲ、ライゲーション媒介増幅技術のギャップオリゴヌクレオチドおよびギャップ充填バージョン、リガーゼ媒介増幅のパッドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）バージョン、ならびにＰＣＲおよび／または他の増幅アプローチと併せたライゲーションアプローチ（その多重バージョンが含まれる）を含む（例えば、Ｄｅｍｉｄｏｖ ａｎｄ Ｂｒｏｕｄｅ（特に、第１．３章）；Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：２２５－３２（１９９８）；Ｂｉらの米国特許第６，５１１ ，８１０号；およびＷｅｎｚ ａｎｄ Ｓｃｈｒｏｔｈの米国特許公報番号ＵＳ ２００３／０１９０６４６Ａ１号を参照のこと）。リガーゼ媒介増幅を含む一定の方法によれば、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むリガーゼインヒビターは、第１の温度で会合して、リガーゼ－リガーゼインヒビター複合体を形成する。リガーゼインヒビターと会合した場合、リガーゼの酵素活性は阻害されてリガーゼインヒビターの非存在下で起こり得る誤ライゲーションの少なくともいくつかが減少し、それより、一定の二次アンプリコンが減少し、バックグラウンド蛍光が減少する。リガーゼ－リガーゼインヒビター複合体を含む反応組成物を第２の温度に加熱した場合、リガーゼインヒビターがリガーゼから解離し、隣接してハイブリッド形成したプローブを効率的にライゲーションすることができる。一部の実施形態では、５’末端下流ライゲーションプローブおよび対応する上流ライゲーションプローブの３’末端は、これらが標的核酸またはその相補物にハイブリッド形成する場合に直接隣接せず、ギャップ充填工程を使用して、下流プローブの５’末端と並列して上流プローブの３’末端に伸長する。他の実施形態では、「ギャップオリゴヌクレオチド」がライゲーションプローブの対峙する末端の間のギャップ中でハイブリッド形成することができるように、下流プローブの５’末端と上流プローブの３’末端との間にギャップが存在する。一定のかかる実施形態では、５’末端下流プローブをギャップオリゴヌクレオチドの３’末端にライゲーションすることができ、上流プローブの３’末端をギャップオリゴヌクレオチド５’末端にライゲーションすることができる。

【0105】

一部の実施形態では、リガーゼインヒビターのヌクレオチド配列は、アプタマーを含む。いくつかの実施形態では、リガーゼインヒビターのヌクレオチド配列は、第１の温度で二本鎖セグメントを形成することができるが、典型的には、第２の温度では形成できない。

【0106】

一定のギャップ充填ＬＣＲまたはギャップ充填ＬＤＲ増幅技術によれば、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む複合体を第１の温度で形成し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害することができる。一部の実施形態では、リガーゼおよびリガーゼインヒビターは第１の温度で複合体を形成し、誤アニーリングされたライゲーションプローブのライゲーション（時折、誤ライゲーションと呼ばれる）を阻害する。

【0107】

当業者は、開示の酵素インヒビター、複合体、方法、およびキットを、プライマーおよび／またはプローブが誤アニーリングし、その後に望ましくない二次アンプリコンが形成され得る酵素媒介増幅を行う種々の異なる状況で適用することができると認識する。バックグラウンド蛍光を少なくとも減少させるためのクエンチャーを含む酵素インヒビターの使用から利益を得ることができる任意の酵素媒介増幅技術は、本教示の意図する範囲内に含まれる。

【0108】

増幅されたか配列決定された標的核酸を、当該分野で公知の任意の技術（消光可能な放射（蛍光、化学発光、生物発光、およびリン光など（例えば、レーザー誘導蛍光および電気化学発光が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない）の直接または間接的な測定、定量、および／または観察を含む）によって検出することができる。開示の方法のいくつかの実施形態によれば、検出は、任意のリアルタイム検出技術または終点検出技術を含み得る。適切な検出技術のいくつかの非限定的な例には、核酸色素、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのレポータープローブを含む融解曲線技術、Ｑ－ＰＣＲ、または他のリアルタイム技術、および電気泳動技術（ゲル電気泳動が含まれるが、これに限定されない）が含まれる。当業者は、広範な検出可能な放射を集合的に対象とし、適切な吸収スペクトルを有するクエンチャーの放射源との対合によって放射源らの少なくともいくらかの放射を減少させることができる種々のクエンチャー部分が利用可能である。

【0109】

いくつかの実施形態では、本教示の方法は、Ｑ－ＰＣＲを含む。リアルタイムＰＣＲとしても公知の用語「定量ＰＣＲ」または「Ｑ－ＰＣＲ」は、ＰＣＲ増幅産物を特異的、非特異的、またはその両方で定量するための種々の方法をいう（例えば、Ｒａｅｙｍａｋｅｒｓ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１１５－ ２２（２０００）；Ｊｏｙｃｅ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１９３，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｐｉｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１４）：ｅ７３（２００３））。かかる方法を、速度ベースの系（典型的に、一般に増幅因子（閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）（Ｃ_ｔ）など）を決定または比較する）または同時増幅法（一般に、標的および標準的テンプレートの同時増幅から生成された産物の量を比較する）として分類する。Ｑ－ＰＣＲ技術は、一般に、レポータープローブ、核酸色素、または両方を含む。例えば（制限されない）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｉ－プローブ、分子ビーコン、Ｅｃｌｉｐｓｅプローブ、スコーピオンプライマー、Ｌｕｘ（商標）プライマー、ＦＲＥＴプライマー、臭化エチジウム、および非対称性シアニン色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＹＯ－ＰＲＯ－１、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＢＯＸＴＯ（ＴＡＴＡＡ Ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ，Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）、およびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない）。

【0110】

いくつかの実施形態では、本教示の方法を、配列決定反応前または同時に行う。用語「配列決定」は、本明細書中にて広義で使用され、ポリヌクレオチドの少なくとも一部における少なくともいくつかの連続ヌクレオチド（例えば、標的核酸またはアンプリコンが含まれるが、これらに限定されない）の順序が同定される当該分野で公知の任意の技術をいう。配列決定技術のいくつかの非限定的な例には、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシターミネーター法およびＭａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔの化学的切断法（これらの方法の変形形態が含まれる）、ハイブリッド形成による配列決定、合成による配列決定、および制限マッピングが含まれる。いくつかの配列決定法は、電気泳動（キャピラリー電気泳動およびゲル電気泳動が含まれる）、ハイブリッド形成（マイクロアレイハイブリッド形成が含まれる）による配列決定、質量分析、および単一分子の検出を含む。いくつかの実施形態では、配列決定法は、直接配列決定、二重鎖配列決定、サイクル配列決定、単一塩基伸長配列決定（ＳＢＥ）、固相配列決定、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、配列決定法は、装置（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡシークエンサー、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０、３１００、３１００－Ａｖａｎｔ、３７３０、または３７３ＯｘＩ遺伝子分析器、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＤＮＡ分析器（全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、または質量分析計が含まれるが、これらに限定されない）を使用した配列決定産物の検出を含む。いくつかの実施形態では、配列決定法は、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｌＴＰ、またはこれらの組み合わせが含まれる）（ｄＮＴＰのジデオキシリボヌクレオチドアナログが含まれる）の増幅産物への組み込みを含む。

【0111】

当業者は、典型的には、使用される配列決定法が本発明の方法を制限しないと認識するであろう。むしろ、典型的には、対応するアンプリコンまたは標的核酸の少なくとも一部の少なくともいくつかの連続するヌクレオチドの順序が得られる任意の配列決定技術を、本方法と共に使用することができる。いくつかの実施形態では、配列決定工程前に、酵素分解（エクソヌクレアーゼＩおよびエビアルカリホスファターゼ消化（例えば、ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ（登録商標）試薬（ＵＳＢ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）が含まれるが、これに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない）によって非組み込みプライマーおよび／またはｄＮＴＰを除去する。いくつかの実施形態では、非組み込みプライマー（ｄＮＴＰｓおよび／またはｄｄＮＴＰ）を、ゲルまたはカラムでの精製、沈殿、濾過、ビーズ、磁選、またはハイブリッド形成ビーズの取り出しによって除去する（例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｄｕｐｌｅｘ（商標）３８４ Ｗｅｌｌ Ｆ／Ｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ４３０８０８２を参照のこと）。一部の実施形態では、増幅産物またはかかる反応組成物の少なくとも一部を含む反応組成物を、精製工程を介入することなく配列決定反応に供する（例えば、Ｂａｓｋｉｎらの米国特許公報番号ＵＳ ２００２／０１３７０４７ Ａ１号を参照のこと）。配列決定技術の説明を、特に、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（特に、第５章）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ；Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｓｉｕｚｄａｋ，Ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＣＣ Ｐｒｅｓｓ，２００３（特に、第７章）；およびＲａｐｌｅｙ（特に、パートＶＩ）に見出すことができる。

【0112】

いくつかの実施形態では、開示の方法およびキットは、マイクロ流体デバイス、「ラボオンチップ」、またはマイクロトータル分析システム（ｍｉｃｒｏｔｏｔａｌ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ）（μＴＡＳ）を含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用して、サンプル調製を行う。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用して、増幅反応を行う。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用して、配列決定またはリアルタイムＰＣＲ反応を行う。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスを使用して、増幅産物の少なくとも一部のヌクレオチド配列を得る。例示的マイクロ流体デバイスの説明を、特に、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ／０１８５３４１号およびＷＯ ０４／０１１６６６号；Ｋａｒｔａｌｏｖ ａｎｄ Ｑｕａｋｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：２８７３－７９，２００４；およびＦｉｏｒｉｎｉ ａｎｄ Ｃｈｉｕ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８：４２９－４６，２００５に見出すことができる。

【0113】

一定の例示的実施形態
本教示は、典型的には、少なくとも１つの酵素ならびに少なくとも１つのヌクレオチド配列および少なくとも１つのクエンチャーを含む少なくとも１つの酵素インヒビターを含む反応組成物中の標的核酸の増幅およびバックグラウンド蛍光の減少のための組成物、方法、およびキットを提供する。

【0114】

本発明の酵素インヒビターは、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む。かかる酵素インヒビターのヌクレオチド配列を、特に、非標的配列の誤プライミング事象、ライゲーションプローブおよび／または切断プローブの誤アニーリング、およびプライマー二量体形成、第１の温度で酵素活性を阻害するが第２の温度で阻害しないことによる望ましくない増幅産物の形成を減少させるようにデザインする。二次アンプリコン形成の減少により、反応組成物中の非特異的蛍光の少なくとも１つの成分が減少する。開示の酵素インヒビターも、適切な条件下で自己消光するようにデザインする。開示のインヒビターのクエンチャー部分を、酵素インヒビターが溶液中で遊離しているか酵素と複合体化する場合に、第１の温度範囲での酵素インヒビターの二本鎖セグメントへの核酸色素分子の会合によって生成される蛍光シグナルの少なくともいくつかが吸収されるようにデザインする。したがって、酵素インヒビターのクエンチャーにより、バックグラウンド蛍光のこの第２の供給源の少なくともいくつかが阻害され、さらに、反応組成物中の非特異的蛍光を減少する。

【0115】

一定の例示的酵素インヒビター
本教示によれば、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビターを、酵素の少なくとも１つの酵素活性を阻害するようにデザインする一方で、酵素インヒビター－酵素複合体中で酵素インヒビターを酵素に会合する。少なくとも１つの二本鎖セグメントを含む構造を形成することができるように酵素インヒビターのヌクレオチド配列をデザインし、酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した場合に核酸色素から放射される蛍光のすくなくともいくつかを吸収することができるようにクエンチャーを選択する。酵素－酵素インヒビター複合体は、第１の温度（例えば、室温（典型的には、約２２℃～２８℃）および望ましいテンプレート伸長温度を超えるか、この温度か、これをわずかに超える温度が含まれるが、これらに限定されない）で形成し、そして／または会合を維持することができる。酵素－酵素インヒビター複合体を含む反応組成物を第２の温度に加熱した場合、複合体が解離するにつれて酵素が放出される。開示のＲＮＡポリメラーゼインヒビターを、インヒビターおよびＲＮＡポリメラーゼが複合体中で会合された場合にＲＮＡポリメラーゼの重合活性を阻害するようにデザインする。開示のリガーゼインヒビターを、リガーゼインヒビターおよびリガーゼが複合体中で会合した場合にテンプレート上の２つの隣接してハイブリッド形成したヌクレオチド鎖の間のホスホジエステル形成を阻害するようにデザインする。開示のヘリカーゼインヒビターを、複合体中でヘリカーゼインヒビターおよびヘリカーゼが会合した場合に二本鎖核酸のほぐれを触媒するヘリカーゼの能力を阻害するようにデザインする。一定の開示の切断酵素インヒビターを、複合体中で切断酵素インヒビターおよび切断酵素が会合した場合に切断酵素の５’－ヌクレアーゼ活性を阻害するようにデザインする。一部の実施形態では、リガーゼインヒビター、ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、ヘリカーゼインヒビター、および／または切断酵素インヒビターのヌクレオチド配列は、アプタマーを含む。本教示の酵素インヒビターの阻害活性は、典型的には、正確なインヒビター配列に有意に依存しない。むしろ、酵素インヒビターの全構造およびその融点が、酵素インヒビターが対応する酵素の意図する酵素活性を阻害するかどうかの主な決定因子である。一部の実施形態では、酵素インヒビターを、対応する酵素の基質を模倣し、それにより、酵素がインヒビターに結合して酵素活性が阻害された複合体を形成する第１の温度での高次構造を想定するようにデザインする。第２の温度では、ほはや基質を模倣せず、複合体から酵素が放出されるように、酵素インヒビターの高次構造を変化させることができる。したがって、開示のインヒビターは、典型的には、阻害効果がある場合、インヒビターが実質的に一本鎖であり、そして／または酵素と複合体を形成しない場合、阻害効果が有意に低い。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターのヌクレオチド配列は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、非ヌクレオチドリンカー、またはこれらの組み合わせを含む。

【0116】

開示のリガーゼインヒビターは、標的核酸または所望のアンプリコン上の対応する配列へのライゲーションプローブまたは切断プローブのアニーリング（例えば、ライゲーションしたプローブ）を有意に妨害しない。開示のヘリカーゼインヒビターは、対応する標的隣接配列またはアンプリコンへのプライマーのハイブリッド形成を有意に妨害しない。開示の切断酵素インヒビターは、標的核酸もしくは所望のアンプリコン上の対応する配列への切断プローブまたはライゲーションプローブのアニーリングまたは対応する標的隣接配列および／またはアンプリコンとのプライマーのハイブリッド形成を有意に妨害しない。

【0117】

開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、第１の温度（例えば、プライマーのおよそＴｍまたはＴｍ未満の温度）にてＤＮＡポリメラーゼインヒビター－ＤＮＡポリメラーゼ複合体中でインヒビターがＤＮＡポリメラーゼ、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログと会合した場合にＤＮＡポリメラーゼの重合活性を阻害するようにデザインする。本教示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターの阻害能力は、一般に、正確なインヒビター配列に有意に依存しない。むしろ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの全構造およびその融点が、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがＤＮＡポリメラーゼの酵素活性（すなわち、重合）を阻害するかどうかの主な決定因子である。典型的には、開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、これらが二本鎖セグメントを含み、且つ、複合体中でＤＮＡポリメラーゼ、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログと会合した場合にＤＮＡポリメラーゼの重合活性を阻害する。しかし、開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、阻害効果がある場合、インヒビターが一本鎖であり、且つＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成しない場合、阻害効果が有意に低い。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのＴｍを、選択した重合反応またはプライマー伸長反応で使用されるアニーリングされたプライマーのプライマー伸長のために使用される温度とおよそ同一であるかより低いように選択するが、常にそうと言うわけではない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの融点は、プライマー伸長温度よりもいくらか高い（例えば、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを低濃度で使用する反応組成物が含まれるが、これに限定されない）。

【0118】

典型的には、本教示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第１の温度またはそれ未満で少なくとも１つの二本鎖セグメントを含むが、第２の温度またはそれを超える温度で一本鎖または実質的に一本鎖である。したがって、第１の温度では、複合体中のＤＮＡポリメラーゼの酵素活性が阻害され、第２の温度ではＤＮＡポリメラーゼが活性を示して増幅反応が起こり得る。

【0119】

例示的な第１の温度には、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、約２２℃～約４０℃、約２５℃～約３５℃、および約２２℃～約２８℃が含まれ、特定の第１の温度範囲の全ての介入温度が明確に含まれる。例示的な第２の温度には、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、約４８℃～約７３℃、約５３℃～約６７℃、約６３℃～約６７℃、および約６４℃～約６６℃が含まれ、特定の第２の温度範囲の全ての介入温度が明確に含まれる。当業者は、所与の増幅反応のための適切な第１および第２の温度は、少なくとも一部が、酵素、酵素インヒビターのＴｍ、ならびに／またはプライマーおよび／もしくはプローブのＴｍに依存するが、適切な温度を、当該分野で公知の方法を使用して、過度に実験することなる日常的に決定することができ、本教示によってその情報が与えられることを理解するであろう。

【0120】

一部の実施形態では、本教示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列は、１つのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、かかるＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第１の領域、第２の領域、第３の領域、および、任意選択的に第４の領域を含み、第１の領域が第３の領域に相補的である。適切な条件下（第１の温度が含まれる）では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターがステム－ループまたはヘアピン高次構造を想定するように、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの第１の領域および第３の領域がアニーリングして少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成することができる。一部の実施形態では、第１の領域中のヌクレオチドのたった１つのサブセットが第３の領域中の対応するサブセットに相補的である。いくつかの実施形態では、開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、ヌクレオチドアナログを含み、このアナログは、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのＴｍに影響を及ぼしても及ぼさなくても良い。

【0121】

１つのオリゴヌクレオチドを含むいくつかの例示的なＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、図１に概略的に示す。図１Ａに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼは、図１を通して黒のストライプで示す第１の領域（１）、図１を通して波線で示す第２の領域（２）、第３の領域（３）、および任意選択的な第４の領域（［４］、本実施形態で任意選択的であることを示すために角括弧で示す）を含む。この例示的インヒビターの３’末端は、ジデオキシシトシン（ｄｄＣと示す）を含む末端ヌクレオチドによって伸長できない。第１の領域（１）は、クエンチャー（５）をさらに含む。インヒビターがループを形成する第２の領域（２）および５’一本鎖オーバーハングとしての第４の領域（４）とステム－ループ高次構造で存在するように、例示的インヒビターを、第３の領域（３）にアニーリングして二本鎖セグメントを形成する第１の領域（１）と共に示す。一部の実施形態では、特に、インヒビターを一定の逆転写酵素と複合体化するようにデザインする場合、かかるＤＮＡポリメラーゼインヒビターの第４の領域の一本鎖オーバーハングは、少なくともいくつかのリボヌクレオチドを含む。図１Ｂに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第１の領域（１）、第２の領域（２）、および第３の領域（３）を含むが、第４の領域を含まない。第１の領域（１）および第３の領域（３）はアニーリングしてステムを形成し、第２の領域（２）はループ構造を形成し、クエンチャー（５）をさらに含む。図１Ｃに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、Ｑ１として示す第１のクエンチャー（６）を含む第１の領域（１）、Ｑ２として第２のクエンチャー（７）を含む第２の領域（２）、第３の領域（３）、および任意選択的な第４の領域（［４］）を含む。図１Ｄに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第１の領域（１）、第２の領域（２）、第３の領域（３）、および５’末端にＱとして示すクエンチャー（５）を含む任意選択的な第４の領域（［４］）を含む。

【0122】

一定のＤＮＡポリメラーゼインヒビターの実施形態では、ヌクレオチド配列は、第１の領域、第２の領域、第３の領域、第４の領域、第５の領域、および第６の領域を含み、第１の領域は第３の領域に相補的であり、第１の温度で第１の領域および第３の領域が少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成することができ、第４の領域は第６の領域に相補的であり、第１の温度で第４の領域および第６の領域は少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成することができ、第６の領域の３’末端と第１の領域の５’末端との間に少なくとも１つの一本鎖領域が存在し、第６の領域の３’末端は伸長できないヌクレオチドを含む。

【0123】

他のＤＮＡポリメラーゼインヒビターの実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチド（例えば、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない）を含む。ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが２つのオリゴヌクレオチドを含む一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは第１の領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドは第３の領域、および、任意選択的な第４の領域を含み、第１のオリゴヌクレオチドの第１の領域は第２のオリゴヌクレオチドの第３の領域に相補的である。一部の実施形態では、第１の領域中のたった１つのサブセットが第３の領域の対応するセグメントに相補的である。適切な条件下（第１の温度が含まれる）では、第１のオリゴヌクレオチドの第１の領域および第２のオリゴヌクレオチドの第３の領域がアニーリングして、少なくとも１つの二本鎖セグメントを含む二重鎖を形成することができる。本教示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターが第２の温度（例えば、第２の温度範囲が含まれるが、これに限定されない）に加熱される場合、このインヒビターは、一本鎖または実質的に一本鎖の高次構造を想定するが、ステム－ループまたは二重鎖高次構造を想定しない。

【0124】

２つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含むいくつかの例示的酵素インヒビターを、図２に概略的に示す。図２Ａに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第３の領域（３）を含む第２のオリゴヌクレオチドにアニーリングする、図２を通して黒のストライプで示す第１の領域（１）および図２を通して黒で影をつけた第４の領域（４）を含む。この例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの第１のオリゴヌクレオチドは、Ｑとして示すクエンチャーをさらに含む。図２Ｂに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第３の領域（３）および第４の領域（４）を含む第２のオリゴヌクレオチドにアニーリングする、第１の領域（１）を含む第１のオリゴヌクレオチドを含む。この例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターでは、クエンチャー（Ｑ）は第４の領域（４）に結合している。図２Ｃに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第１のクエンチャー（Ｑ１として示す）を含む第１の領域を含む第１のオリゴヌクレオチドならびに第３の領域（３）および第２のクエンチャー（Ｑ２として示す）を含む第４の領域（４）を含む第２のオリゴヌクレオチドを含む。図２Ｄに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第３の領域（３）を含む第２のオリゴヌクレオチドにアニーリングする、第１の領域（１）を含む第１のオリゴヌクレオチドを含み、第２のオリゴヌクレオチドはクエンチャー（Ｑとして示す）を含む。図２Ｅに示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、第１の領域（１）を含み、第３の領域（３）を含む第２のオリゴヌクレオチドにアニーリングする第１のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの両方がクエンチャーを含む（Ｑ１およびＱ２として示す）。

【0125】

一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列は、アプタマーに結合した場合にＤＮＡポリメラーゼに結合してその酵素活性を阻害するアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、少なくとも１つの二本鎖セグメントを含むアプタマーを含む。アプタマーが溶液中で遊離しているか複合体中でＤＮＡポリメラーゼに結合している場合、クエンチャーは、アプタマーに会合した核酸色素分子によって生成された少なくともいくつかの蛍光シグナルを吸収する。

【0126】

開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、対応する標的隣接配列および／またはアンプリコンとのプライマーハイブリッド形成を有意に妨害しない。ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子の蛍光強度の減少および二次アンプリコン形成の減少に加えて、本教示のいくつかのＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含まない並行増幅反応と比較して所望のアンプリコンの収率を増加させる。

【0127】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの３’末端は、典型的には、非伸長ヌクレオチド（遮断基を含む末端ヌクレオチドが含まれるが、これに限定されない）の存在により、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長できない。遮断基は、ＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド付加を防止または最小にするためにヌクレオチドまたは核酸に付加することができる化学的部分である。末端３’－ＯＨへの遮断基の付加により、ヌクレオチドは、もはやＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるホスホジエステル結合の形成に関与できない。遮断基のいくつかの非限定的な例には、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホチオアート、アルカン－ジオール残基、ＰＮＡ、ＬＮＡ、３’－ヒドロキシル基の代わりに３’アミノ基を含むヌクレオチドアナログ、５’リン酸基の代わりに５’ヒドロキシル基を含むヌクレオチドアナログ、および３’ＯＨ基を欠くヌクレオチドアナログが含まれる。アルキル遮断基は、直鎖、分岐鎖、環式、またはこれらの組み合わせであり得る飽和炭化水素である。非伸長ヌクレオチドのいくつかの非限定的な例は、水素またはフッ素との置換またはエステル、アミド、スルフェート、またはグリコシドの形成などによって修飾された３’－ヒドロキシル基を有するヌクレオチドが含まれる。これらのヌクレオチドは、一般に、鎖が伸長できない。使用することができる非伸長ヌクレオチドの他の例には、修飾リボース部分を有するヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、リボヌクレオチドにおけるオリゴヌクレオチドの終結によって一定のＤＮＡポリメラーゼによって伸長することができないので、リボヌクレオチドは、非伸長ヌクレオチドとしての機能を果たし得る。リボースを、３’－デオキシ誘導体（３’－ヒドロキシが水素以外の官能基（例えば、アジド基など）に置換される誘導体が含まれる）を含むように修飾することができる。一部の実施形態では、非伸長ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮ）（例えば、ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、ジデオキシシトシン（ｄｄＣ）、ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）、ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、またはジデオキシウリジン（ｄｄＵ）を含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、酵素インヒビターは、２つのクエンチャー、３つのクエンチャー、または３つを超えるクエンチャーを含む。一定のインヒビターの実施形態では、第１の領域はクエンチャーを含み、そして／または第３の領域は第３のクエンチャーを含む。一部の実施形態では、第２の領域はクエンチャーを含む。いくつかの実施形態では、第４の領域はクエンチャーを含む。一部の実施形態では、第５の領域はクエンチャーを含む。一部の実施形態では、第６の領域はクエンチャーを含む。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターは、ヌクレオチド配列の３’末端、ヌクレオチド配列の５’末端、および／または内部にクエンチャーを含む。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターは、第２の領域を含み、いくつかの実施形態では、ステム－ループ高次構造のループを形成する第５の領域を含む。一部の実施形態では、ループはクエンチャーを含む。

【0129】

開示のリガーゼインヒビターは、対応する標的核酸および／またはアンプリコンとのライゲーションプローブアニーリング、および、一部の実施形態では、切断プローブアニーリングおよび／またはプライマーアニーリングを有意に妨害しない。開示の切断酵素インヒビターは、対応する標的核酸またはアンプリコンとの切断プローブアニーリング、および、一部の実施形態では、ライゲーションプローブアニーリングおよび／またはプライマーアニーリングを有意に妨害しない。開示のヘリカーゼインヒビターは、対応する標的核酸またはアンプリコンとのプライマーアニーリング、および、一部の実施形態では、切断プローブアニーリングおよび／またはライゲーションプローブアニーリングを有意に妨害しない。酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子の蛍光強度の減少および二次アンプリコン形成の減少に加えて、本教示のいくつかの酵素インヒビターは、酵素インヒビターを含まない並行増幅反応と比較して所望のアンプリコンの収率を増加させる。

【0130】

一部の実施形態では、酵素インヒビターの二本鎖セグメントは、内部塩基対のミスマッチを含む。一部の実施形態では、酵素インヒビターは、ループ構造、典型的には、二本鎖セグメントおよび一本鎖ループを含むステム－ループ構造を含む。一部の実施形態では、酵素インヒビターは、２つのループ構造を含む。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターの第２の領域および／または第５の領域は、インヒビターの相補配列が相互にアニーリングする場合に第１の温度でループ構造（例えば、第３の領域にアニーリングした第１の領域および／または第６の領域にアニーリングした第４の領域が含まれるが、これらに限定されない）を形成することができる。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の第２の領域、第５の領域、または第２の領域および第５の領域は、２～１２個のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ、および、いくつかの実施形態では、２～６個のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態では、第２および／または第５の領域は、非ヌクレオチドリンカーを含む。一部の実施形態では、酵素インヒビターの第２の領域、第５の領域、または第２および第５の領域は、配列（Ｔ）_ｎ（式中、ｎは１と８との間のＴヌクレオチドの任意の数である）（例えば、ＴＴ、ＴＴＴ、ＴＴＴＴ、またはＴＴＴＴＴ）からなるか、本質的になるか、含む。他の実施形態では、第２の領域および／または第５の領域は、ヌクレオチドＡ、Ｃ、および／またはＧ（これらのいずれかのヌクレオチドアナログが含まれるが、これらに限定されない）からなるか、本質的になるか、含む。いくつかの実施形態では、第２の領域および／または第５の領域は、（１）少なくとも１つのヌクレオチドアナログ（例えば、ＰＮＡおよび／またはＬＮＡが含まれるが、これらに限定されない）、および／または（２）非ヌクレオチドリンカー（例えば、炭化水素基（－ＣＨ_２－）を含む非ヌクレオチド（アルカン、アルケン、またはアルキレン部分、およびエチレングリコール（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれるが、これに限定されない）を含むリンカーが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない）を含む。典型的には、リンカー基は疎水性ではない。一部の実施形態では、リンカーは親水性であるか、リンカーの少なくとも一部が親水性を示す。当業者は、リンカーが酵素－酵素インヒビター相互作用を妨害せず、第１の温度でリンカーが酵素インヒビター自体をアニーリングするのに十分に柔軟である場合、開示の酵素インヒビター中のリンカーの組成は一般に制限されないと認識する。

【0131】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、ヌクレオチド配列の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に副溝結合剤を含む。いくつかの実施形態では、副溝結合剤は、内在している。一部の実施形態では、副溝結合剤は、クエンチャー（例えば、ＭＧＢ－ＮＦＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれるが、これに限定されない）をさらに含む。副溝結合剤の非限定的な例には、抗生物質（ネトロプシン、ジスタマイシン、ベレニル、ペンタミジン、および他の芳香族ジアミジンなど）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＮ ６９９９、アウレオル酸抗腫瘍薬（クロモマイシンおよびミトラマイシンなど）、ＣＣ－１０６５、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ_３）、１，２－ジヒドロ－（３Ｈ）－ピロロ［３，２－ｅ］インドール－７－カルボキシラート（ＣＤＰＩ_３）、ならびに関連する化合物およびアナログが含まれる。副溝結合剤の説明を、特に、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ａｎｄ Ｇａｉｔ（特に、第８．３項）；Ｋｕｍａｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：８３１－３８，１９９８；Ｋｕｔｙａｖｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：６５５－６１，２０００；Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｄｅｎｎｙ，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ １：１－１４，２０００；Ｋｕｔｙａｖｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３７１８－２５，１９９７；Ｌｕｋｈｔａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７：５６４－７，１９９６；Ｌｕｋｈｔａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：４１８－２６，１９９５；米国特許第６，４２６，４０８号；およびＰＣＴ公開出願番号ＷＯ０３／０７８４５０号に見出すことができる。当業者は、副溝結合剤が、典型的には、結合するオリゴヌクレオチドのＴ_ｍを増加させ、それにより、より高い温度でかかるオリゴヌクレオチドを効率的にハイブリッド形成することが可能であると理解している。副溝結合剤は、特に、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＥｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）から市販されている。

【0132】

いくつかの実施形態では、酵素インヒビターのヌクレオチド配列は、普遍的塩基を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、普遍的塩基を含む第４の領域または第６の領域を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼの第３の領域に直接隣接する第４の領域のヌクレオチドは、普遍的塩基を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの第６の領域と第１の領域との間の一本鎖領域に直接隣接する第６の領域のヌクレオチドは、普遍的塩基を含む。いくつかの実施形態では、普遍的塩基は、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター－ＤＮＡポリメラーゼ複合体中のＮＴＰと相互作用する。

【0133】

当業者は、酵素インヒビターのＴｍを、過度の実験を行うことなく、周知の方法および本教示によって教授された方法を使用して経験的に決定することができるか、アルゴリズムを使用してＴｍを評価することができる。評価したＴｍの計算のためのいくつかの式およびコンピュータアルゴリズム（従来のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含むキメラオリゴマーが含まれる）は、当該分野で周知である。オリゴヌクレオチドの１つのかかる予想式（Ｔｍ＝（４×Ｇ＋Ｃの数）＋（２×ＡおよびＴの数））によれば、特定のオリゴヌクレオチド（酵素インヒビター、プローブ、またはプライマーなど）のＴｍを、過度の実験を行うことなく、公知の方法を使用して日常的に決定することもできる。Ｔｍ／融点およびその計算の説明を、特に、Ｒａｐｌｅｙ；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｅｘｉｑｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ ＬＮＡ ０２／０７．２００２，Ｅｘｉｑｏｎ
Ａ／Ｓ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ；Ｆｉｎｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：３３５７－６３，１９９６に見出すことができる。

【0134】

本教示の酵素インヒビターの融点を、種々の方法で調整することができる。例えば、当業者は、第１および第３の領域、および、一部の実施形態では、第４および第６の領域の相補配列の長さおよび／または組成を、酵素インヒビターの融点を増加または減少するように変化させることができ、第４および第６の領域の相補配列の長さおよび／または組成を、酵素インヒビターのＴｍを増加または減少させるために変化させることができると理解している。したがって、一般に、より多数のハイブリッド形成塩基対を有する二本鎖セグメントは、通常、より少数のハイブリッド形成塩基対を有する二本鎖セグメントよりも高い温度で融解する。しかし、長い二本鎖セグメントが望ましい場合、当業者は、塩基対ミスマッチ（例えば、Ｇ：Ｔ塩基対が含まれるが、これに限定されない）を導入して、融点を調整することができる。一部の実施形態では、酵素インヒビターの二本鎖セグメントは、１つのミスマッチした塩基対、２つのミスマッチした塩基対、３つのミスマッチした塩基対、４つのミスマッチした塩基対、または４つを超えるミスマッチした塩基対を含み、２つまたはそれを超えるミスマッチした塩基対が連続し得るが、その必要はない。

【0135】

したがって、開示の酵素インヒビターの二本鎖セグメントは、１００％相補的である必要はない。その代わり、二本鎖セグメントは、多数または一定の比率のミスマッチまたはゆらぎ塩基対を有し得る。例えば、二本鎖セグメントは、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、または２０％の塩基対ミスマッチを有し得る。一部の実施形態では、酵素インヒビターの融点を、脱塩基ヌクレオチドアナログ（例えば、糖または糖アナログおよびリン酸またはリン酸アナログを含むアナログが含まれるが、これらに限定されない）を含む二本鎖セグメントのデザインによって調整するが、特に、二本鎖領域中の塩基対を排除するヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基アナログでは調整されない。

【0136】

第２の領域および／または第５の領域を含む酵素インヒビターの融点を、ループ中のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ数の増加または減少によって調整することもできる。１つのオリゴヌクレオチドを含む酵素インヒビターの融点を、第１の温度での少なくとも１つの二本鎖セグメントを含み得る領域と第１の温度で二本鎖セグメントを含まない領域との間の接合部での１つまたは複数の「ＧＣクランプ」の有無によって調整することもできる。例えば（限定されない）、ループ構造の塩基（一部の実施形態では、第２の領域に隣接する第１の領域のヌクレオチドであって、第２の領域に隣接する第３の領域のヌクレオチドにアニーリングするヌクレオチド（例えば、図１Ａを参照のこと）および／または、いくつかの実施形態では、第５の領域に隣接する第４の領域のヌクレオチドであって、第５の領域に隣接する第６の領域のヌクレオチドにアニーリングするヌクレオチド（例えば、図１Ｅを参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない）。同様に、特に、必要に応じて、ＧＣクランプが酵素インヒビターの第１および第３の領域（ループの塩基が含まれるが、これに限定されない）の相補セグメントの一方または両方の末端、一部の実施形態では、酵素インヒビターの第４および第６の領域の相補セグメントの一方または両方の末端に存在する場合、２つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドを含む酵素インヒビターのＴｍを、ＧＣクランプの有無によって調整することができる。酵素インヒビターの融点を、ヌクレオチド配列の第１および／または第３の領域、一部の実施形態では、ヌクレオチド配列の第４および／または第６の領域（例えば、デアザ－ｄＡが含まれるが、これに限定されない）中のヌクレオチドアナログによって調整することもできる。Ｔｍを増加させるヌクレオチドアナログのいくつかの非限定的な例には、Ｃ－５プロピニル－ｄＣまたはｄＣと置換した５－メチル－２’－デオキシシチジン、ｄＡと置換した２，６－ジアミノプリン２’－デオキシリボシド（２－アミノ－ｄＡ）、ならびにｄＴと置換したＣ－５プロピニル－ｄＵが含まれ、これらは、置換当たり相対融点をそれぞれ約２．８℃、１．３℃、３．０℃、および１．７℃増加させる。

【0137】

二本鎖セグメントの長さを考慮する場合、酵素インヒビターの融点を考慮すべきである。例えば（制限されない）、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのＴ_ｍが高すぎる場合、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターはプライマー伸長のための増幅で使用される温度を超える温度で変性し、それにより、所望の重合反応が阻害され、所望のアンプリコンの収量が減少し得る。Ｔｍが非常に低い場合、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは融解し、プライマーが非標的核酸にハイブリッド形成して伸長する温度で不活化するようになり得る。ＤＮＡポリメラーゼがかかる非標的核酸を増幅することができる場合、多くの望ましくない産物が最終増幅産物の混合物（プライマー－二量体）中に存在するであろう。一部の実施形態では、酵素インヒビターは、必要に応じて、増幅反応の選択された伸長、ライゲーション、および／または切断反応温度に近いが、有意に高くない融点を有する。いくつかの実施形態では、特に、酵素インヒビターを低濃度で使用する場合、必要に応じて、プライマー伸長温度、ライゲーション温度、または切断反応温度を超える融点を有する酵素インヒビターを使用することができる。典型的には、当業者は、例えば、核酸重合条件下で使用される条件下での酵素インヒビターの融点を決定することができる。

【0138】

例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、以下：

【0139】

【化3】

（式中、第４の領域を角括弧で示し、第３の領域を下線で示し、第２の領域を太字で示し、第１の領域を斜体で示し、第２の領域は第１のクエンチャーを含み（この例では、ＤＡＢＣＹＬとして示す）、第１の領域は、第２のクエンチャーを含む副溝結合剤を含む（この例では、ＭＧＢ－ＮＦＱとして示す））を含むか、これからなるか、本質的になる。第１の領域は、２つの領域間の２つの内部Ｇ：Ｔ塩基対ミスマッチによってこの領域に実質的に相補的であるが、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは依然として第１の温度で自己アニーリングする。例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのいくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの３’末端上の末端Ｃヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログであるジデオキシシトシン（ｄｄＣ）を含む。いくつかの実施形態では、第２の領域は、ＴＴ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴＴを含むか、これからなるか、本質的になる。他の実施形態では、第２の領域は、非ヌクレオチドリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第２の領域は、クエンチャーを含まない。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの５’末端は、クエンチャーをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのＧヌクレオチドの少なくとも１つは、ヌクレオチドアナログであるデアザ－ｄＧを含む。いくつかの実施形態では、第１のクエンチャーは、ＴＡＭＲＡ（商標）（カルボキシテトラメチルローダミン）、 Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ色素（例えば、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、またはＢＨＱ－３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれるが、これらに限定されない）、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、ＲＯＸ（商標）（カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、ＤＡＢＳＹＬ（４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－スルホニルクロリド）、またはＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）（ＤＡＢＣＹＬ部分の代わりまたはこれに加えて）を含む。いくつかの実施形態では、第２のクエンチャーは、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＲＯＸ、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ、またはＴＥＴ（ＭＧＢ－ＮＦＱの代わりまたはこれに加えて）を含む。選択したクエンチャーが核酸色素に特徴的である波長の蛍光を吸収することができ、インヒビター中のクエンチャーおよび／またはクエンチャーの位置は、インヒビターが自己アニーリングし、そして／または酵素と複合体を形成する能力が実質的に低下しない場合、クエンチャーの選択は、典型的には、本教示を制限しない。

【0140】

別の例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、以下：

【0141】

【化4】

（式中、第４の領域を角括弧で示し、第３の領域を下線で示し、第２の領域を太字で示し、第１の領域を斜体で示し、第４の領域はクエンチャーを含む（この例では、ＴＥＴとして示す））を含むか、これからなるか、本質的になる。第１の領域は、第３の領域に相補的である。ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの第１の３’末端上の末端Ｃヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログであるジデオキシシトシン（ｄｄＣ）を含み、ｄｄＣがこの例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを非伸長性にする。いくつかの実施形態では、第２の領域は、ＴＴ、ＴＴＴＴ、またはＴＴＴＴＴを含むか、これからなるか、本質的になる。いくつかの実施形態では、第２の領域は、非ヌクレオチドリンカーを含む。一部の実施形態では、第２の領域は、クエンチャーを含まない。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの５’末端は、クエンチャーをさらに含む。一部の実施形態では、Ｇヌクレオチドの少なくとも１つはヌクレオチドアナログであるデアザ－ｄＧを含み、少なくとも１つのＡヌクレオチドはヌクレオチドアナログデアザ－ｄＡを含むか、Ｇヌクレオチドの少なくとも１つはデアザ－ｄＧを含み、少なくとも１つのＡヌクレオチドはデアザ－ｄＡを含む。いくつかの実施形態では、クエンチャーは、ＴＡＭＲＡ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ色素、ＲＯＸ、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ、ＤＡＢＣＹＬまたはＤＡＢＳＹＬ（ＴＥＴ部分）（ＴＥＴ部分の代わりまたはこれに加えて）を含む。

【0142】

当業者は、典型的には、開示の酵素インヒビターの長さおよびヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ組成を、インヒビター（特に、二本鎖セグメント）の安定性を最適にし、複合体中で会合した場合に対応する酵素の酵素活性を阻害する能力を増加させるように変化させることができると認識するであろう。当業者はまた、開示の酵素インヒビターが、典型的には、第１の温度での酵素－酵素インヒビター複合体の解離速度（時折、「脱離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）」と呼ばれる）が低い場合に二次増幅産物の形成の阻害でより有効であると認識するであろう。しかし、一定の適用では、より高い濃度の酵素インヒビターの使用によって「より速い」脱離速度を補うことができるかもしれない。当業者は、特定の適用のための酵素インヒビターの適切な濃度を経験的に決定することができると理解するであろう。

【0143】

本教示の酵素インヒビターは、検出が融解曲線分析（時折、解離曲線分析と呼ばれる）を含む場合に特に有用である。融解曲線または解離曲線を作成するために、反応組成物を、典型的には、段階的様式または漸増的様式で加熱し、反応混合物の蛍光を適切な間隔で検出する。最初に、反応組成物中の非特異的蛍光は、酵素インヒビター中のクエンチャー部分によって最初の加熱プロセス中に減少し、それにより、第１の温度範囲での酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子から放射される蛍光が減少する。温度が第２の温度に上昇するにつれて、酵素インヒビターの二本鎖セグメントは融解し始め、酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子が放出される。解離曲線中のピーク（蛍光の第１の微分対温度としてプロット）は、酵素インヒビターの解離によって１つまたは複数のアンプリコンの評価を複雑にし得るようであると予想されるであろう。酵素インヒビター中のクエンチャーの存在により、インヒビターの融解に関連する解離ピークが減少するか検出されず、これは、クエンチャーが会合した色素分子から放射された蛍光の少なくともいくつかを吸収し、それにより、酵素インヒビターの解離ピークが少なくとも減少するからである（図３～６を参照のこと）。

【0144】

一般に、本教示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、ＤＮＡポリメラーゼを使用する任意の増幅方法で使用することができる。例えば、開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、１つまたは複数の以下の方法で使用することができる：ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅、逆転写、ＤＮＡ合成、および／またはプライマー伸長。開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、プライマー伸長（ＰＣＲおよび／または逆転写）による標的核酸の増幅のための反応組成物中で使用することができる。本教示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、一定の配列決定技術で使用することもできる。開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、終結ヌクレオチドを使用した一塩基プライマー伸長による一塩基多型（ＳＮＰ）の試験で使用することができる。その変形形態を含む任意のかかる手順（例えば、ポリヌクレオチドまたはプライマーの標識、およびミニシーケンシングなどが含まれるが、これらに限定されない）は、本明細書中に開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターと使用することが意図される。

【0145】

いくつかの実施形態では、リガーゼインヒビターは、第１の温度で、リガーゼによってライゲーションすることができるニックを含む基質であるライゲーション基質模倣物としての機能を果たし得るオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、リガーゼインヒビターは、２つの隣接してハイブリッド形成した核酸末端を含むが、少なくとも１つの末端の少なくとも１つの末端ヌクレオチドはインヒビターの「テンプレート」鎖にハイブリッド形成せず、２つの末端は共にライゲーションすることができない。一部の実施形態では、リガーゼインヒビターは、２つの隣接するハイブリッド形成した核酸末端を含むが、少なくとも１つの末端は、リガーゼによってライゲーションされない末端ヌクレオチドを含む。例えば、３’末端ヌクレオチドは３’－ヒドロキシル基を含まないか、５’末端ヌクレオチドは５’－リン酸基を含まないか、その両方である。リガーゼによって閉じることができないニックを含む例示的リガーゼインヒビターの実施形態を、図１Ｅに示す。この例示的リガーゼインヒビターは、第１の領域（１）、第２の領域（２）、第３の領域（３）、第４の領域（４）、第５の領域（８）、および第６の領域（９）を含む。ループ構造として示される第２の領域（２）は、第１のクエンチャー（６）および第５の領域（８）をさらに含み（ループ構造として示される）、第２のクエンチャー（７）をさらに含む。第１の領域（１）は第３の領域（３）にアニーリングして第１の二本鎖セグメントを形成し、第４の領域（４）は第６の領域（９）にアニーリングして第２の二本鎖セグメントを形成する（例えば、第１の温度でも起こり得る）。第６の領域（９）の３’末端は、非ライゲーション末端（１０）（例えば、３’－ＯＨ基を欠く末端ヌクレオチド（Ｘとして示す）が含まれるが、これに限定されない）を含む。一部の実施形態では、かかる例示的なリガーゼインヒビターの第６の領域の３’末端および／または第１の領域の５’末端は、「テンプレート鎖」（この例示では、それぞれ、第４の領域（４）および／または第３の領域（３））にアニーリングされない。一部の実施形態では、リガーゼインヒビターの上流末端（図１Ｅに示す例示的リガーゼインヒビター中で９として示す）は、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、または２０を超えるヌクレオチドを含む。リガーゼインヒビターの「上流鎖」の長さを、典型的には、所望のリガーゼのフットプリントと少なくとも同一の長さであるようにデザインし、この長さはより長くても良いと認識すべきである。

【0146】

一部の実施形態では、リガーゼインヒビターは、テンプレート鎖に隣接してハイブリッド形成することができる２つのオリゴヌクレオチドを含むが、ニックの対峙した末端は共にライゲーションに適切であり、例えば（制限されない）、上流鎖の３’末端は３’－ＯＨ基を含まないか、下流鎖の５’末端は５’リン酸基を含まないか、その両方である。

【0147】

いくつかのリガーゼインヒビターの実施形態は、少なくとも３つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド、および第３のオリゴヌクレオチド）を含み、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは第１の領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドは第３の領域および第４の領域を含み、第３のオリゴヌクレオチドは第６の領域を含み、ここで、第１の領域は第３の領域に相補的であり、第４の領域は第６の領域に相補的である。

【0148】

一定のリガーゼインヒビターは、２つのオリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）を含み、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは第１の領域、第２の領域、第３の領域、および第４の領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドは第６の領域を含み、ここで、第１の領域は第３の領域に相補的であり、第４の領域は第６の領域に相補的である。適切な条件下（第１の温度を含む）では、第１の領域および第３の領域がアニーリングして少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成することができ、第４の領域および第６の領域がアニーリングして少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成することができる。他のリガーゼインヒビターの実施形態は、２つを超えるオリゴヌクレオチドを含み、これらが適切な条件下（第１の温度を含む）でアニーリングして、リガーゼによって閉じることができない２つの隣接してハイブリッド形成したオリゴヌクレオチド末端の間にニックまたはギャップを含むハイブリッド形成構造を形成することができる。一定のリガーゼインヒビターの実施形態では、上流オリゴヌクレオチドの３’末端、下流オリゴヌクレオチドの５’末端、またはその両方またはこれら付近の少なくとも１つのヌクレオチドは、第１および第２のオリゴヌクレオチドが隣接してアニーリングする第３のオリゴヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的でない。したがって、少なくとも１つの逆末端は、テンプレートに十分にアニーリングされず、リガーゼは相互にライゲーションすることができない。

【0149】

一部の実施形態では、切断酵素インヒビターは、切断酵素によって切断できないかゆっくり切断される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含むフラップ配列を含む。かかるインヒビターの例示的実施形態を、図１Ｆに概略的に示す。例示的インヒビターは、第１の領域（１）、第２の領域（２）、第１のクエンチャー（６）を含む第３の領域（３）、第４の領域（４）、第５の領域（８）、および第６の領域（９）（この例示的インヒビターでは、第２のクエンチャー（７）を含む）を含む。第１の領域（１）および第３の領域（３）がアニーリングして第１の二本鎖セグメントを形成し、第４の領域（４）および第６の領域（９）がアニーリングして第２の二本鎖セグメントを形成し、第２の領域（２）および第５の領域（８）を、それぞれループ構造として示す。第１の領域（１）から上流は、フラップ配列（１１）であり、これは、この例示的実施形態では、切断酵素（１２）によって切断できない複数のヌクレオチド間結合を含む。この高次構造では、例示的酵素インヒビターは、切断構造模倣物を含み、これは、切断酵素の無効な基質としての機能を果たす核酸切断構造に類似する二次構造である。一部の実施形態では、例えば（制限されない）、切断酵素が重合活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む場合および／または反応組成物が切断酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む場合、切断酵素インヒビターの３’末端は、非伸長ヌクレオチド（ｄｄＮが含まれるが、これに限定されない）を含む。

【0150】

一部の実施形態では、酵素インヒビターのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二本鎖セグメントを含み、アプタマーに結合した場合に酵素に結合してその酵素活性を阻害するアプタマーを含む。アプタマーが第２の温度未満の溶液中で遊離しているか複合体中で酵素に結合している場合、クエンチャーは、アプタマーに会合した核酸色素分子によって生成された少なくともいくつかの蛍光シグナルを吸収する。

【0151】

一定の例示的複合体
本教示の複合体は、少なくとも１つの酵素活性が阻害されるように酵素に会合した酵素インヒビターを含む。一部の実施形態では、複合体は、増幅酵素（例えば、増幅反応に含まれる任意の酵素）に会合した酵素インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、ＲＮＡポリメラーゼインヒビターに会合したＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、リガーゼに会合したリガーゼインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、ヘリカーゼに会合したヘリカーゼインヒビターを含む。一部の実施形態では、複合体は、切断酵素インヒビターに会合した切断酵素を含む。いくつかの複合体は、さらなる成分（例えば、デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、リボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）、ヌクレオチドアナログ、ヘリカーゼアクセサリータンパク質、ＳＳＢ、または酵素補因子（ＡＴＰおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）ならびに一定の酵素－酵素インヒビター複合体の形成および／または安定化に関与し得るその非切断アナログが含まれるが、これに限定されない））、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）含む。

【0152】

一部の実施形態では、酵素－酵素インヒビター複合体は、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターに会合したＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターおよびＤＮＡポリメラーゼを含む複合体は、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター－ＤＮＡポリメラーゼ複合体に関与し得るＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを含む。本教示によれば、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログと複合体化する（すなわち、複合体中で会合する）場合、プライマーまたは隣接するポリヌクレオチド鎖の３’末端へのヌクレオチドの付加を触媒する能力に関するＤＮＡポリメラーゼの酵素活性が阻害される。典型的には、開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、第１の温度で少なくとも１つの二本鎖セグメントおよびＤＮＡポリメラーゼとの複合体を形成するようにデザインする。複合体を第２の温度に加熱する場合、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの二本鎖セグメントが変性し、複合体が解離する。複合体から放出される場合、ＤＮＡポリメラーゼの合成活性が修復され、適切な条件下で、一定の核酸配列を増幅することができる。

【0153】

一部の実施形態によれば、複合体は、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性が阻害されるようにＤＮＡポリメラーゼに会合したＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、ＤＮＡポリメラーゼに会合した一本鎖または二本鎖のステム－ループ高次構造のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、アニーリングして少なくとも１つの二本鎖セグメントを形成する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビターに会合したＤＮＡポリメラーゼを含む。

【0154】

典型的には、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの第１および第３の領域が第１の温度でアニーリングして二本鎖セグメントを形成し、必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターはステム－ループ高次構造または二重鎖高次構造を想定する。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの第４および第６の領域が第１の温度でアニーリングして二本鎖セグメントを形成し、必要に応じて、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、ステム－ループ高次構造、二本鎖ステム－ループ高次構造、または二本鎖高次構造を想定する。ステム－ループ高次構造または二重鎖高次構造中のＤＮＡポリメラーゼインヒビターをＤＮＡポリメラーゼと組み合わせる場合、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターおよびＤＮＡポリメラーゼが会合して複合体を形成し、ここで、ＤＮＡポリメラーゼ活性が阻害される。反応温度が上昇するにつれて、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの二本鎖セグメントは第２の温度または第２の温度付近で変性し、複合体が解離し、ＤＮＡポリメラーゼの阻害が放出される。

【0155】

本教示のＤＮＡポリメラーゼには、典型的には、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。一定の逆転写酵素は、一定の反応条件下（ＡＭＶ逆転写酵素およびＭＭＬＶ逆転写酵素が含まれる）でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、かかる逆転写酵素は、開示の方法との使用に適切であり得、これは明確に本教示の意図の範囲内である。ＤＮＡポリメラーゼの説明を、特に、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｄ ｅｄ．，Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０００（特に、第２６章および第２９章）；Ｔｗｙｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９；Ａｕｓｕｂｅｌら；Ｌｉｎ ａｎｄ Ｊａｙｓｅｎａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１：１００－１１ ，１９９７；Ｐａｖｌｏｖら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２５３－６０，２００４；およびＥｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｇｕｉｄｅ：ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，１９９８，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌに見出すことができる。

【0156】

二次アンプリコンの合成、より一般には、ＤＮＡポリメラーゼによる全核酸合成に関するＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害が認められる。一般に、当業者は、偽副産物の合成を最小にしながら所望のアンプリコンの合成を至適化するように選択することができる。したがって、所望のアンプリコンを生成する場合、開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、選択されたＤＮＡポリメラーゼインヒビターの非存在下で合成した二次アンプリコンの量と比較した場合、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または９９％を超える二次アンプリコンの合成を阻害することができる。

【0157】

望ましくない副産物（誤ライゲーション産物が含まれるが、これに限定されない）の合成、より一般には、反応組成物（例えば、ＬＣＲ、ＬＤＲ、ＬＤＲ－ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＬＤＲ、またはＦＥＮ－ＬＣＲで生じる反応組成物が含まれるが、これらに限定されない）中の全核酸アンプリコン増幅に関するリガーゼ活性の阻害が認められる。一般に、当業者は、偽副産物の合成を最小にしながら所望のアンプリコンの合成を至適化するように選択することができる。したがって、所望のアンプリコンを生成する場合、開示のリガーゼインヒビターは、選択されたリガーゼインヒビターの非存在下で合成した二次アンプリコンの量と比較した場合、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または９９％を超える望ましくない副産物の合成を阻害することができる。

【0158】

望ましくない副産物の合成、より一般には、反応組成物（例えば、ＦＥＮ－ＬＣＲで生じる反応組成物が含まれるが、これらに限定されない）中の全核酸アンプリコン増幅に関する切断酵素活性の阻害が認められる。一般に、当業者は、偽副産物の合成を最小にしながら所望のアンプリコンの合成を至適化するように選択することができる。したがって、所望のアンプリコンを生成する場合、開示の切断酵素インヒビターは、選択された切断酵素インヒビターの非存在下で合成した二次アンプリコンの量と比較した場合、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または９９％を超える望ましくない副産物の合成を阻害することができる。

【0159】

二次アンプリコンの合成、より一般には、反応組成物（例えば、ＨＤＡで生じる反応組成物が含まれるが、これに限定されない）中の全核酸アンプリコン増幅に関するヘリカーゼ活性の阻害が認められる。一般に、当業者は、偽副産物の合成を最小にしながら所望の標的核酸の合成を至適化するように選択することができる。したがって、所望のアンプリコンを生成する場合、開示のヘリカーゼインヒビターは、選択されたヘリカーゼインヒビターの非存在下で合成した二次アンプリコンの量と比較した場合、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または９９％を超える二次アンプリコンの合成を阻害することができる。

【0160】

開示の酵素インヒビターを、酵素と種々の比率または濃度で混合して複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、酵素インヒビターは、酵素よりも高いモル濃度で存在する。他の実施形態では、酵素インヒビターは、酵素のモル濃度とほぼ同一またはそれ未満で存在する。当業者は、各酵素分子が酵素インヒビターと会合して複合体を形成することができるように、確実に十分な酵素インヒビターを存在させるために、１：１（インヒビター：酵素）を超える酵素インヒビター：酵素モル比で使用するように選択することができる。一般に、高度に有効な酵素インヒビターを、有効性がより低い酵素インヒビターより低い濃度で使用することができる。したがって、酵素インヒビターを、種々の濃度で反応組成物に準備することができる。かかる濃度は、例えば、約１ｎＭ～約１０ｍＭ、約５ｎＭ～約１ｍＭ、約１０ｎＭ～約１００μＭ、または当業者によって選択された他の都合の良い濃度に変化させることができる。

【0161】

増幅反応条件が第１の温度での少なくとも１つの工程を含む場合、本明細書中に開示の酵素インヒビターを、増幅反応前または増幅反応中のいずれかで酵素と組み合わせて複合体を形成することができる。一部の実施形態では、酵素および酵素インヒビターを、反応組成物が形成される前に第１の温度で組み合わせる。かかるプレインキュベーション工程により、酵素インヒビター－酵素複合体の形成を容易にし、望ましくない副産物（誤プライミングされたアンプリコン、誤ライゲーションされたプローブ、およびオリゴマー化したプライマーなど）の合成の減少または排除を補助することができる。

【0162】

一定の例示的方法
開示の酵素インヒビターは、本教示の方法で少なくとも２つの機能を果たす。第１に、開示の酵素インヒビターは、第１の温度で対応する酵素の酵素活性を阻害し、特に、誤アニーリングによる二次アンプリコンの形成または標的核酸以外の配列に対するプライマーおよび／またはプローブ、ならびにプライマー二量体形成を減少させる。当業者は、二次増幅産物形成の減少により、本教示の酵素インヒビターが反応組成物の非特異的蛍光を減少させることができると認識するであろう。第２に、少なくとも１つのクエンチャー部分が酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子によって放射された少なくともいつくかの蛍光を吸収することができるので、開示の酵素インヒビターはまた、酵素インヒビターの自己消光能力によって反応組成物中の非特異的蛍光を減少させることができる。一部の実施形態では、酵素インヒビターはまた、開示の方法におけるアンプリコンの生成を減少させる。

【0163】

標的核酸の増幅方法を提供する。一定の方法の実施形態によれば、第１の温度で反応組成物を形成し、ここで、反応組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）（典型的には、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の混合物）、標的核酸、プライマー、および核酸色素を含む。一部の実施形態では、反応組成物は、ヌクレオチドアナログをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを、反応組成物の形成前に合わせる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、反応組成物の形成前に第１の温度でプレインキュベーションする。第１の温度で、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの二本鎖セグメントを含み、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを会合して複合体を形成する。同一のＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列を含むがクエンチャーを欠く並行反応組成物中で検出されたシグナルと比較して、クエンチャーは、ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子によって放射された少なくともいくつかの蛍光シグナルを吸収する。次いで、反応組成物を、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの融点付近、融点、またはそれを超える第２の温度に加熱して二本鎖セグメントを変性させ、複合体を解離する。複合体からのＤＮＡポリメラーゼインヒビターの放出により、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性はもはや阻害されない。反応組成物を少なくとも１つの増幅サイクルに供して複数のアンプリコンを生成する。

【0164】

反応組成物中の非特異的蛍光を減少させる方法を提供する。一定のかかる方法によれば、反応組成物を、第１の温度で形成し、ここで、反応組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ＮＴＰ（典型的にはｄＮＴＰの混合物）、標的核酸、プライマー、および核酸色素を含む。一部の実施形態では、反応組成物は、ヌクレオチドアナログをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを、反応組成物の形成前に合わせる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、反応組成物の形成前に第１の温度でプレインキュベーションして複合体を形成する。同一のＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列を含むがクエンチャーを欠く並行反応組成物中で検出されたシグナルと比較して、クエンチャーは、ヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子によって放射された少なくともいくつかの蛍光シグナルを吸収する。次いで、反応組成物を、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターの融点付近、融点、またはそれを超える第２の温度に加熱して二本鎖セグメントを変性させ、複合体を解離する。複合体からのＤＮＡポリメラーゼインヒビターの放出により、ＤＮＡポリメラーゼの重合活性はもはや阻害されない。反応組成物を少なくとも１つの増幅サイクルに供して複数のアンプリコンを生成する。適切な検出条件下で、反応組成物中の複数のアンプリコンに会合した核酸色素の蛍光を検出することができる一方で、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターのヌクレオチド配列の二本鎖セグメントに会合した核酸色素の蛍光は、クエンチャーによって少なくとも減少する。

【0165】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの増幅サイクルは、複数の増幅サイクル（例えば、少なくとも１０サイクル、少なくとも１５、サイクル、少なくとも２０サイクル、少なくとも２５サイクル、少なくとも３０サイクル、少なくとも３５サイクル、少なくとも４０サイクル、４０サイクルを超える増幅が含まれるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１増幅サイクルへの反応組成物の適用は、ＰＣＲ（ＰＣＲの変形形態（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、または定量もしくはリアルタイムＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる）を含む（例えば、Ｒａｐｌｅｙ（特に、パートＶＩＩ）；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ，ｒｅｖ．９／０４，Ｐｒｏｍｅｇａ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎを参照のこと）。

【0166】

開示の方法の一部の実施形態は、複数の増幅工程（複数の並行単回または少数回の増幅反応（例えば、二重、三重、四重、五重、または六重の増幅反応）が含まれるが、これらに限定されない）、複数の検出工程（少数回の検出工程の複数の並行単回検出工程が含まれるが、これらに限定されない）（例えば、同一の反応組成物中の２つ、３つ、４、つ、５つ、または６つの異なるアンプリコンを検出する）、または多重増幅反応および多重検出手順の両方を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、複数の異なる標的核酸を含み、プライマーは複数の異なるプライマーまたは複数の異なるプライマー対を含み、複数のアンプリコンは複数の異なるアンプリコンを含み、検出は複数の異なるアンプリコンに会合した核酸色素の蛍光の検出を含む。

【0167】

開示のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを使用して得た酵素阻害度を変化させることができ、使用した方法、ＤＮＡポリメラーゼ、選択したＤＮＡポリメラーゼインヒビターの構造および融点、ならびに他の要因（プライマー伸長温度など）に依存し得る。当業者は、これらの各変動因子を、非標的核酸の産生を最小にしながら所望の産物を至適に産生するための本明細書中の教示および／または利用可能な手順を使用して至適化することができる。同様に、非特異的蛍光の減少レベルは、特に、ヌクレオチド配列中の特定のクエンチャー、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターあたりに使用されるクエンチャーの数、使用される核酸色素、反応条件、および二次増幅産物量の減少に及ぼすＤＮＡポリメラーゼインヒビターの有効性に応じて変化し得る。当業者は、特定のＤＮＡポリメラーゼインヒビター中の特定のクエンチャーの数および配置、特定のＤＮＡポリメラーゼインヒビターとの特定のＤＮＡポリメラーゼの対合、および特定の核酸色素との特定のクエンチャーの対合を、当該分野で公知の日常的方法を使用して、特定の反応組成物中の非特異的蛍光の減少を至適化するための過度の実験および増幅技術を行うことなく、経験的に評価することができると認識するであろう。

【0168】

一定の方法の実施形態によれば、リガーゼは、標的核酸およびライゲーションプローブ対を含む反応組成物中で、第１の温度にてリガーゼインヒビターと複合体を形成する。一部の実施形態では、リガーゼおよびリガーゼインヒビターを組み合わせ、反応組成物の形成前にプレインキュベーションする。最初の第２の温度では、リガーゼ－リガーゼインヒビター複合体は解離し、リガーゼを放出する。ライゲーションプローブ対の上流および下流のライゲーションプローブは、標的核酸と選択的にハイブリッド形成し、リガーゼはライゲーションしたプローブの形成を触媒する。いくつかのかかる実施形態は、変性する工程、上流および下流のライゲーションプローブをアニーリングする工程、およびプローブをライゲーションしてライゲーションされたプローブを生成する工程を含む、複数の増幅サイクルを含む。一部の実施形態では、反応組成物は、ライゲーションしたプローブの相補物の少なくとも一部に特異的にハイブリッド形成するようにデザインされたライゲーションプローブ対を含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションプローブはプライマー結合部位を含み、反応組成物はプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ－ＤＮＡポリメラーゼ複合体を含む。

【0169】

一定の開示の方法によれば、第１の温度で、切断酵素は切断酵素インヒビターと複合体を形成し、リガーゼはリガーゼインヒビターと複合体を形成する。一部の実施形態では、最初の第２の温度で、切断酵素－切断酵素インヒビター複合体は解離する。次いで、放出された切断酵素は、（１）標的核酸または一本鎖アンプリコン、（２）上流切断プローブ、および（３）少なくとも１つのヌクレオチドによって上流切断プローブの３’末端が重複する５’オーバーハングまたはフラップ配列を含む対応する下流切断プローブを含むフラップ部分を一定の重複フラップ構造から切断することができる。切断酵素によってフラップを切断する場合、ハイブリッド形成構造は、テンプレート鎖、上流切断プローブ、および下流切断プローブのハイブリッド形成したフラグメントを含み、上流切断プローブの３’末端と下流切断プローブのハイブリッド形成されたフラグメント５’末端の間にライゲーション可能なニックを有する。いくつかの実施形態では、２番目の第２の温度で、リガーゼ－リガーゼインヒビター複合体が解離し、放出されたリガーゼはハイブリッド形成構造中のニックをライゲーションして、ライゲーションされたプローブおよびテンプレート鎖を含む二重鎖が生成される。一部の実施形態では、ライゲーションされたプローブは、少なくとも１つのプライマー結合部位を含む。当業者は、最初の第２の温度および２番目の第２の温度はほぼ同一の温度であり得るか、異なる温度であり得ると認識するであろう。

【0170】

いくつかの方法の実施形態は、第１の温度でＤＮＡポリメラーゼ－ＤＮＡポリメラーゼインヒビター複合体をさらに含む。適切な３番目の第２の温度で、ＤＮＡポリメラーゼ－ＤＮＡポリメラーゼインヒビター複合体が解離する。適切な条件下で、プライマーはライゲーションされたプローブのプライマー結合部分に特異的にハイブリッド形成し、プライマー伸長が起こり得る。当業者は、反応組成物中で異なる酵素インヒビターを使用する場合、最初の第２の温度、２番目の第２の温度、および３番目の第２の温度のうちの少なくとも２つがほぼ同一の温度であり得るか、全てが異なる温度であり得ると認識するであろう。

【0171】

開示の複合体、方法、およびキットで使用するための例示的切断酵素には、以下が含まれるが、これらに限定されない：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、高度好熱菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、哺乳動物ＦＥＮ－１、アーケオグロブス・フルギダス ＦＥＮ－１、メタノコッカス・ヤナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）ＦＥＮ－１、パイロコッカス・フリオサスＦＥＮ－１、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＦＥＮ－１、高度好熱菌ＦＥＮ－１、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）酵素（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）、出芽酵母 ＲＴＨ１、出芽酵母ＲＡＤ２７、分裂酵母ｒａｄ２、バクテリオファージＴ５ ５’－３’エクソヌクレアーゼ、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）ＦＥＮ－１、ヒトエクソヌクレアーゼ１、仔牛胸腺５’－３’エクソヌクレアーゼ（細菌、真核生物、および古細菌のそのホモログが含まれる）（構造特異的酵素のクラスＩＩファミリーのメンバーなど）。切断酵素の説明を、特に、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：７７８－８３（１９９３）；Ｅｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６７３－７６（２００１）；Ｓｈｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ．Ｓｃｉ．２３：１７１－７３（１９９８）；Ｋａｉｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１３８７－９４（１９９９）；Ｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｉ．Ｃｈｅｍ．２７５：２４６９３－７００（２０００）；Ａｌｌａｗｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：５３７－５４（２００３）；Ｓｈａｒｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３４８７－９６（２００３）；およびＦｅｎｇら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４５０－５６（２００４）に見出すことができる。

【0172】

一定の開示の方法によれば、ＤＮＡポリメラーゼを、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログと組み合わせて複合体を形成する。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、または逆転写酵素およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、（１）適切な第１の温度で逆転写酵素と複合体を形成することができる第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビター、（２）適切な第１の温度でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成することができる第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビター、（３）適切な第１の温度で逆転写酵素と複合体を形成することができる第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビターおよび適切な第１の温度でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成することができる第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含み、ここで、第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビターおよび第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、同一のヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を含み、第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビターに適切な第１の温度および第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビターに適切な第１の温度は、同一の温度または異なる温度である。

【0173】

一定の開示の方法によれば、増幅は、２つの異なる反応組成物、第１の反応組成物および第２の反応組成物（それぞれ、ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む）を含む二相ＰＣＲ反応を含む。一定のかかる実施形態では、第１の反応組成物は、第１のＤＮＡポリメラーゼ、第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ＮＴＰ（典型的には、ＮＴＰの混合物）、プライマー（典型的には、複数の異なるプライマー対）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを、第１の反応組成物の形成前に合わせる。第１の反応組成物を、制限されたサイクル数の増幅（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５サイクルの増幅が含まれるが、これらに限定されない）に供する。制限された第１段階の増幅後に第１の反応組成物を希釈し、希釈された第１の反応組成物の一部を、第２のＤＮＡポリメラーゼ、第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビター、ＮＴＰ（典型的には、ＮＴＰの混合物）、およびプライマー（典型的には、プライマー対）と合わせる。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを、第２の反応組成物の形成前に合わせる。各サイクル数を本明細書中で明確に列挙しているかのように、第２の反応組成物を、複数回のサイクルの増幅（例えば、１０～４５サイクルの増幅または２０～４０サイクルの増幅（列挙した範囲内の任意の増幅サイクル数））に供する。いくつかの実施形態では、希釈された第１の反応組成物中に第１のＤＮＡポリメラーゼが十分に残存し、第２のＤＮＡポリメラーゼは必要ない。いくつかの実施形態では、希釈された第１の反応組成物中に第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビターが十分に残存し、第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは必要ない。一部の実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼおよび第２のＤＮＡポリメラーゼは同一のポリメラーゼまたは異なるポリメラーゼであり、このポリメラーゼには、逆転写酵素およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビターおよび第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、同一のインヒビターまたは異なるインヒビターである。かかる実施形態を制限しない例示として、逆転写酵素、第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを含む第１の反応ならびに熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビター、および、任意選択的に、ＮＴＰおよび／またはヌクレオチドアナログを含む第２の反応組成物を含む例示的ＲＴ－ＰＣＲを考慮する。第１のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、逆転写酵素の至適温度未満の温度（すなわち、例示的な第１段階の第１の温度）で逆転写酵素活性を阻害するが、至適逆転写酵素温度またはこの温度を超える温度（すなわち、例示的第１段階の第２の温度）で阻害しないようにデザインすることができる。第２のＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、第２段階の第１の温度未満の温度で熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害するようにデザインすることができる。例えば（制限されない）、少なくとも１つのＰＣＲプライマーのＴｍより約５℃～約１０℃または約４℃～約６℃低い温度（すなわち、例示的な第２段階の第１の温度）で阻害するが、ＰＣＲプライマーのＴｍを超える温度（すなわち、例示的な第１段階の第２の温度）で阻害しない。

【0174】

本教示の方法を、典型的には、任意の標的核酸と共に使用することができる。開示の方法は、大量の所望のアンプリコンの産生だけでなく、存在することは知られているが、完全に配列決定や精製が行われていない核酸の産生または配列決定にも有用である。配列決定プライマーとしての機能を果たし得る少なくとも１つのプライマーを調製することができるように、標的（すなわち、標的隣接配列）の１つまたは２つの末端の十分な数の塩基の同一性を知ることのみが必要である。許容可能な第２の標的隣接配列の配列決定および同定後、第２のプライマーを作製することができ、隣接配列間に存在する標的核酸を指数関数的に増幅することができ、いくつかの実施形態では、定量することができる。他の実施形態では、十分な配列が得られた場合、適切なライゲーションプローブ組および／または適切な切断プローブ組を合成することができる。

【0175】

開示の方法の一部の実施形態では、検出は、内部標準またはコントロール配列を評価する工程を含み、これには、所望のアンプリコンの量を検量線または内部サイズ標準と比較する工程を含み得る。いくつかの実施形態では、レーン毎、キャピラリー毎、および／またはアッセイ毎のばらつきを明らかにするために、コントロール配列、パッシブリファレンス色素、またはその両方を反応組成物中に含める。

【0176】

本方法の一部の実施形態は、複数の増幅反応、いくつかの実施形態では、複数の検出を、典型的には、並行して行うマルチウェル反応容器（マルチウェルプレートが含まれるが、これらに限定されない）または多室マイクロ流体デバイスをさらに含む。一部の実施形態では、アンプリコンを生成するための１つまたは複数の多重反応を、同一の反応容器（マルチウェルプレート（９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、および１５３６ウェルプレートなど）、マイクロ流体デバイス（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）低密度アレイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が含まれるが、これに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない）で行う。いくつかの実施形態では、大量の並行増幅工程は、マルチウェル反応容器（複数の反応ウェルを含むプレート（例えば、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる）または多室マイクロ流体デバイス（例えば、ＴａｑＭａｎ低密度アレイが含まれるが、これらに限定されない）を含み、ここで、各室またはウェルは、必要に応じて、適切なプライマー、プライマー組、および／またはレポータープローブを含む。典型的には、かかる増幅工程を、一連の単回、二重、三重、四重、五重、または六重の反応で行うが、より高い並行増幅レベルも本教示の意図する範囲に含まれる。

【0177】

一部の実施形態では、反応組成物は、パッシブリファレンス色素をさらに含む。パッシブリファレンス色素は、内部コントロールが蛍光における非ＰＣＲ関連変動（例えば、ウェル毎、チューブ毎、プレート毎、およびアッセイ毎の変動が含まれるが、これらに限定されない）を標準化する場合に反応組成物中に含まれる。一連の増幅反応中にその蛍光が変化しないので、パッシブリファレンスによって標準化のベースラインが得られる。典型的には、パッシブリファレンスは、増幅反応を妨害しない。パッシブリファレンス色素の使用およびパッシブリファレンスに基づいた標準化計算（例えば、ＲｎおよびΔＲｎが含まれるが、これらに限定されない）は、当該分野で周知である（例えば、Ｋｉｌｌｉｇｏｒｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．，３８：２５１６－１９，２０００；ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐ／Ｎ ４０２８２３ Ｒｅｖ．Ｄ ２００３；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＱＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ，１－ｓｔｅｐ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．＃ ７５００３ａ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，２００５；およびＥｓｓｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ ＰＣＲ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを参照のこと）。いくつかの実施形態では、パッシブリファレンス色素は、ＲＯＸ（商標）またはＴＡＭＲＡ（商標）を含む。

【0178】

一定の例示的キット
本発明の技術により、一定の開示の方法の実施を捗らせるためにデザインしたキットも提供する。キットは、方法の実施に必要な２つまたはそれを超える要素の組み立てによって一定の開示の方法の能力を高めるのに役立ち得る。一部の実施形態では、キットは、最終使用者が測定する必要性を最小にするために、予め測定した単位量で成分を含む。いくつかの実施形態では、キットは、１つまたは複数の開示の方法を実施するための説明書を含む。好ましくは、キットの成分を、相互に同時に操作するように至適化する。

【0179】

一定の開示のキットは、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含む酵素インヒビターを含む。一部の実施形態では、キットは、少なくとも１つの以下を含む：リガーゼインヒビター、ヘリカーゼインヒビター、ＲＮＡポリメラーゼインヒビター、切断酵素インヒビター、および／またはＤＮＡポリメラーゼインヒビター。本教示の一定のキットは、少なくとも１つの以下をさらに含む：リガーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および切断酵素。一定のキットは、酵素インヒビターを含み、少なくとも１つの以下をさらに含む：プライマー（ランダムプライマー、オリゴｄＴを含むプライマー、またはプライマー対が含まれるが、これらに限定されない）、ライゲーションプローブ対、切断プローブ組、リガーゼ補因子（ＡＴＰまたはＮＡＤが含まれるが、これらに限定されない）、ＳＳＢ、および／またはヘリカーゼアクセサリータンパク質。いくつかの実施形態では、キットは、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、キットは、ＮＴＰ、ヌクレオチドアナログ、またはその両方を含む。

【0180】

一定のキットの実施形態は、ヌクレオチド配列およびクエンチャーを含むＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。一部の実施形態では、キットは、以下を含む：ＤＮＡポリメラーゼ、調節配列（例えば、ハウスキーピング遺伝子および／または同時増幅配列（例えば、Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：２４４－４９（１９９３）；Ｊｏｙｃｅ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ，８３－９２，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１９３，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｅｙｍａｅｋｅｒｓ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１５－２２（２０００）を参照のこと）、または分子サイズまたは分子量標準を含むポリヌクレオチドラダーなどの内部標準配列が含まれるが、これらに限定されない）、プライマーおよび／またはプライマー対、レポータープローブ、核酸色素、パッシブリファレンス色素、またはこれらの組み合わせ。一部の実施形態では、キットは複数の異なるプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、キットは、順方向プライマー、逆方向プライマー、または順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含み、レポーター基をさらに含む。いくつかのかかる実施形態では、プライマー対の順方向プライマーのレポーター基は、プライマー対の逆方向プライマーのレポーター基と異なる。

【0181】

当業者は、多数の異なる種のレポーター基を、個別または１つまたは複数の異なるレポーター基と組み合わせて本教示で使用することができると認識するであろう。一部の実施形態では、レポーター基は、蛍光、化学発光、生物発光、リン光、または電気化学発光のシグナルを放射する。レポーター基のいくつかの非限定的な例には、フルオロフォア、放射性同位体、色原体、酵素、抗原（エピトープタグが含まれるが、これに限定されない）、半導体ナノ結晶（量子ドット）、重金属、色素、リン光基、化学発光基、電気化学的検出部分、結合タンパク質、リン光体、希土類キレート、遷移金属キレート、近赤外色素、電気化学発光標識、および質量分析計に適合するレポーター基（質量タグ、電荷タグ、および同位体など）が含まれる（例えば、Ｈａｆｆ ａｎｄ Ｓｍｉｒｎｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３７４９－５０，１９９７；Ｘｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：３５９５－３６０２，１９９７；Ｓａｕｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：ｅ６３，２００３を参照のこと）。核酸へのレポーター基の結合のための詳細なプロトコールを、特に、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅら、ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２０００）（２００５年８月の増補版を含む）；およびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，１０ｔｈ ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ－ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２００５に見出すことができる。

【0182】

一部の実施形態では、キットは、２つまたはそれを超える異なる酵素インヒビター（例えば、リガーゼインヒビターおよび切断酵素インヒビター、切断酵素インヒビター、リガーゼインヒビター、およびＤＮＡポリメラーゼインヒビター、またはヘリカーゼインヒビターおよびＤＮＡポリメラーゼインヒビターが含まれるが、これらに限定されない）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、２つまたはそれを超える異なるＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む。一部の実施形態では、キットは、２つの異なる酵素（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素など）、リガーゼおよび切断酵素、ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素が含まれるが、これに限定されない）、ならびにヘリカーゼおよびＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、キットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む。

【0183】

上記の本教示を、実施例を参照してより深く理解することができる。以下の実施例は、例示のみを目的とし、決して本明細書中の教示の範囲を制限すると解釈すべきではない。

【実施例】

【0184】

実施例１：一定の例示的酵素インヒビターのクエンチャー部分が例示的酵素インヒビターの二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子から放射された少なくともいくつかの蛍光を吸収する効果を評価するために、表１（以下）に示すように、５つの例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを合成した。クエンチャー部分の同一性、位置、および数を、変化させた。

【0185】

【表1】

一連の並行組成物（それぞれ、１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 核酸色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む１×反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９））、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２５０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、５００μＭ ｄＵＴＰ、６０ｎＭ ＲＯＸパッシブリファレンス色素、および必要に応じて５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、または１００ｎＭの濃度の表１に示す例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターを含む）を、室温で形成した。表１に示すように、「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＢ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＣ、およびＤＮＡポリメラーゼインヒビターＤは、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＤの３’末端のヌクレオチドがＣである一方で、「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａ、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＢ、およびＤＮＡポリメラーゼインヒビターＣの３’末端のヌクレオチドが全てジデオキシシトシン（ｄｄＣ）を含むことを除き、同一のヌクレオチド配列を有する。「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａはクエンチャー部分を欠き（したがって、Ａは、本教示の真のＤＮＡポリメラーゼインヒビターではなく、引用符：「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」の使用によって示す）、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＢはその５’末端にＤＡＢＣＹＬクエンチャー部分を含み、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＣはその５’末端にＲＯＸクエンチャー部分を含み、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＤはその３’末端に非蛍光クエンチャーを含む副溝結合剤を含む（ＭＧＢ－ＮＦＱ）。ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥは、その第１および第３の領域に４つのデアザ－ｄＡヌクレオチドアナログ（デアザＡとして示す）および２つのＧ：Ｔ塩基対ミスマッチを含むヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥもまた、２つのクエンチャー部分（第２の領域ループ中にＤＡＢＣＹＬ部分および３’末端にＭＧＢ－ＮＦＱ）を含む。

【0186】

ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴリアルタイム配列検出システム装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、３０℃～９５℃の温度範囲で各組成物についての解離曲線を作成した。蛍光の微分値対温度を、関連解離曲線ソフトウェアを使用して計算した。図３に示すように、このヌクレオチド配列のＴｍ（約５６℃）で１００ｎＭの「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａ（１００ｎＭ Ａとして示す）を含む組成物から得た解離ピークは、１００ｎＭ、７５ｎＭ、または５０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＢを含む組成物（それぞれ、１００ｎＭ Ｂ、７５ｎＭ Ｂ、および５０ｎＭ Ｂとして示す）から得た解離ピークよりもはるかに高かった。図３に証明するように、恐らくＤＮＡポリメラーゼインヒビターＢの二本鎖セグメントに会合した核酸色素分子から放射された蛍光シグナルに起因するバックグラウンド蛍光は、「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａと比較して減少する。

【0187】

１００ｎＭの「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａ、１００ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＣ、７５ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＣ、および５０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＣを含む組成物から得た解離曲線を図４にしめす。図４で認められるように、１００ｎＭの「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａを使用して得た解離ピークは、１００ｎＭ、７５ｎＭ、または５０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＣに関連する解離ピークより実質的に高い。

【0188】

５０ｎＭの「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａを含む組成物および５０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＤを含む組成物から得た解離曲線を、図５に示す。５０ｎＭの「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａを含む組成物から得た解離ピーク（図５でＡとして示す）は、５０ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＤを含む組成物から得た解離ピーク（Ｄとして示す）よりも実質的に高い。

【0189】

図６は、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭの「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａ（それぞれ、１００ｎＭ／Ｓｔｄ、７５ｎＭ／Ｓｔｄ、５０ｎＭ／Ｓｔｄ、２５ｎＭ／Ｓｔｄ、１０ｎＭ／Ｓｔｄ、および５ｎＭ／Ｓｔｄとして示す）および１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥを含む組成物から得た解離曲線を示す。図６に示すように、「ＤＮＡポリメラーゼインヒビター」Ａを含む各組成物から得た解離ピークは、検出可能により高く、ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥを含む組成物から得た解離ピークよりも概して実質的に高く、Ｅは本質的に「ベースライン」にまぎれ、容易に区別できない。

【0190】

これらの例示的ＤＮＡポリメラーゼインヒビターが種々のＤＮＡポリメラーゼインヒビターデザインの非限定的な例（例えば、副溝結合剤を有するか有さないヌクレオチド配列の異形ならびに異なるクエンチャー部分（インヒビターあたり異なるクエンチャー数、インヒビター内の異なるクエンチャーの位置（例えば、３’末端、５’末端、および内部）、および異なる特異的クエンチャー（ＤＡＢＣＹＬ、ＲＯＸ、およびＮＦＱ）が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない）を意図すると認識すべきである。当業者は、種々のＤＮＡポリメラーゼインヒビターデザインが可能であり、特定のＤＮＡポリメラーゼおよび所与の反応条件組と共に使用するために、適切なＤＮＡポリメラーゼインヒビターを、本教示によって知らされた種々のデザインの日常的評価によって得ることができると理解するであろう。

【0191】

実施例２：ｇＤＮＡのプラスミノゲン活性化因子ウロキナーゼ（ＰＡＵ）遺伝子中の例示的標的核酸のＰＣＲ増幅中の二次アンプリコンの阻害
ｇＤＮＡ中の標的核酸の増幅におけるＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥの阻害能力を評価するために、ＰＣＲ反応を行った。６つの並行した２０μＬの反応組成物を室温で形成した。各反応組成物は、４０ｎｇヒトｇＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ）、２．２５μＭの順方向プライマー：

【0192】

【化5】

および２．２５μＭの逆方向プライマー：

【0193】

【化6】

を含むＰＡＵ標的核酸特異的プライマー対、最終濃度が５、１０、２５、５０、７５、または１００ｎＭのいずれかのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥを、１×ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）、２５０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、５００μＭ ｄＵＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．６Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、６０ｎＭ ＲＯＸパッシブリファレンス色素、８％グリセロール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０１％ＮａＮ３、１×ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ核酸色素）に含む。ｇＤＮＡが存在せず、且つＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥの最終濃度が５０ｎＭであることを除いて他の６つと同一の処方物を含む第７の並行反応組成物中にテンプレートコントロールは含まれなかった。

【0194】

反応組成物を、室温で約１５分間インキュベートし、次いで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴリアルタイム配列検出システム装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてサーマルサイクリングを行った。以下のサイクルを使用した：９５℃で２分間、９６℃で５秒間を４０サイクル、および６０℃で２分間。各サーモサイクリングを行った反応組成物中で生成された増幅産物を評価するために、１５μＬの各反応組成物を、未変性４％アガロースＥ－ゲル（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の個別のレーンにロードし、これらと共に、２つのレーンに、５００塩基対、４００塩基対、３００塩基対、２００塩基対、および１００塩基対のマーカー（Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を含む分子サイズラダーをロードした。反応組成物を、以下のようにゲルのレーンにロードした：レーンＢ、５ｎＭインヒビターＥ；レーンＣ、１０ｎＭインヒビターＥ；レーンＤ、２５ｎＭインヒビターＥ；レーンＥ、５０ｎＭインヒビターＥ；レーンＦ、７５ｎＭインヒビターＥ；レーンＧ、１００ｎＭインヒビターＥ；レーンＨ、５０ｎＭインヒビターＥ、テンプレートなしのコントロール。サンプルを１５分間電気泳動し、臭化エチジウムによって視覚化した。図７に示すように、所望のアンプリコン（１１）の量は、約７５ｎＭの濃度（レーン７）までＤＮＡポリメラーゼインヒビターの濃度が増加するにつれて増加した。対照的に、二次アンプリコンバンドの強度は、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター濃度が増加するにつれて減少した。

【0195】

実施例３：ｃＤＮＡ中のヒトシトクロムＰ４５０の例示的標的核酸のＰＣＲ増幅中の二次アンプリコンの阻害
７つの並行した２０μＬの反応組成物を室温で形成した。各反応組成物は、１０ｎｇ普遍的基準ヒトｃＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、２００ｎＭの順方向プライマー：

【0196】

【化7】

および２００ｎＭの逆方向プライマー：

【0197】

【化8】

を含むＰ４５０標的核酸特的プライマー対、最終濃度が０、５、１０、２５、５０、７５、または１００ｎＭのいずれかのＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥを、１×ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９）、２５０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、５００μＭ ｄＵＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、６０ｎＭ ＲＯＸパッシブリファレンス色素、８％グリセロール、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０１％ＮａＮ_３、１×ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ核酸色素）に含む。ｃＤＮＡが存在せず、且つＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥの最終濃度が５０ｎＭであることを除いて他の７つと同一の処方物を含む第８の並行反応組成物中でテンプレートコントロールは含まれなかった。実施例２に記載のように、反応組成物を、室温で約１５分間インキュベートし、次いで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴリアルタイム配列検出システム装置にてサーマルサイクリングを行い、増幅産物を未変性アガロースゲルで分析した。反応組成物を、以下のようにゲルのレーンにロードした：レーンＢ、０ｎＭインヒビターＥ；レーンＣ、５ｎＭインヒビターＥ；レーンｄ、１０ｎＭインヒビターＥ；レーンＥ、２５ｎＭインヒビターＥ；レーンＦ、５０ｎＭインヒビターＥ；レーンＧ、７５ｎＭインヒビターＥ；レーンＨ、１００ｎＭインヒビターＥ、およびレーンＩ、５０ｎＭインヒビターＥ、テンプレートなしのコントロール。

【0198】

図８に示すゲルから認められるように、所望のアンプリコン（２１）の量は、約７５ｎＭの濃度までＤＮＡポリメラーゼインヒビターの濃度が増加するにつれて増加した。ＤＮＡポリメラーゼインヒビターＥを含まない反応組成物中に所望のアンプリコンはほとんどまたは全く認められなかった（レーンＡ）。二次アンプリコンバンドの強度は、ＤＮＡポリメラーゼインヒビター濃度が増加するにつれて減少した。

【0199】

実施例４：プライマー二量体を含む二次増幅産物の阻害
有効な遺伝子発現アッセイ（インターロイキン１，β（ＩＬ１β；アッセイＩＤ Ｈｓ００１７４０９７＿ｍ１）、ＴＲＡＦファミリーメンバー関連ＮＦＫＢアクチベーター（ＴＡＮＫ；アッセイＩＤ Ｈｓ００３７０３０５＿ｍ１）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳＮ；アッセイＩＤ Ｈｓ００１８８０１２＿ｍ１）、溶質キャリアファミリー２，メンバー１（ＳＬＣ２Ａ１；アッセイＩＤ Ｈｓ００１９７８８４＿ｍ１）、およびホスホリパーゼＤ１（ホスファチジルコリン特異的）（ＰＬＤ１；アッセイＩＤ Ｈｓ００１６０１１８＿ｍ１）のためのアッセイが含まれる）のための５つの市販のプライマー対および対応するＴａｑＭａｎレポータープローブを得た（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。

【0200】

プライマー二量体アンプリコンの形成に及ぼす例示的酵素インヒビターの影響を評価するために、標的核酸を欠く５つの対応する反応組成物組を並行して調製した。各２０μＬの反応組成物対は、１倍濃度の適切なプライマー対および対応するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、２５０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、５００μＭ ｄＵＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、６０ｎＭ ＲＯＸパッシブリファレンス、８％グリセロール、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０；０．０１％ＮａＮ_３、１×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｉを含む５０ｍＭ（ｐＨ９）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、および５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥまたはインヒビターなしのいずれかを含んでいた。５つの並行反応組成物組を、室温で３０分間インキュベートし、次いで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴリアルタイム配列検出システム装置に移した。反応組成物を９５℃に２分間加熱し、次いで、９６℃で５秒間を含む４０サイクルの増幅および６０℃で２分間に供した。１５μＬのサーモサイクリングした反応組成物を、以下のように４％アガロースＥ－ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の各レーンにロードした：ＩＬ１βアッセイ、レーンＢ（インヒビターなし）およびＣ（５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥ）；ＴＡＮＫアッセイ、レーンＤ（インヒビターなし）およびＥ（５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥ）；ＦＡＳＮアッセイ、レーンＦ（インヒビターなし）およびＧ（５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥ）；ＳＬＣ２Ａ１アッセイ、レーン（インヒビターなし）ＨおよびＩ（５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥ）；およびＰＬＤ１アッセイ、レーンＪ（インヒビターなし）およびＫ（５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥ）。１２００、８００、４００、２００、および１００塩基対のためのマーカーを含む分子量標準を、レーンＡおよびＬに加えた。ゲルを１５分間電気泳動し、核酸色素である臭化エチジウムでの染色によって視覚化した（図９に示す）。インヒビターを欠く対応する反応組成物と比較した場合（例えば、レーンＢ（ＩＬ１βアッセイ、インヒビターなし）およびＣ（ＩＬ１βアッセイ、５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥ）またはＤ（ＴＡＮＫアッセイ、インヒビターなし）およびＥ（ＴＡＮＬアッセイ、５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥ）と比較した）、インヒビターを含む反応組成物中の望ましくないプライマー二量体産物の量は少なくとも減少した。

【0201】

実施例５：酵素インヒビターに会合した非特異的蛍光の減少
ＰＣＲ増幅および融点曲線分析を使用した例示的ポリメラーゼインヒビターの例示的クエンチャー部分の影響を評価するために、２つの反応組成物を調製した。各２０μＬの反応組成物は、１倍濃度のＴＡＮＫアッセイ（実施例４に記載の）由来のプライマーおよびレポータープローブ、１０ｎｇ普遍的基準ヒトｃＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；２５０μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、５００μＭ ｄＵＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、６０ｎＭ ＲＯＸパッシブリファレンス、８％グリセロール、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０；０．０１％ＮａＮ_３、１×ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩを含む５０ｍＭ（ｐＨ９）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、および５０ｎＭ「ポリメラーゼインヒビターＡ」または５０ｎＭポリメラーゼインヒビターＥのいずれかを含んでいた。実施例４に記載のように、反応組成物を室温で約１５分間インキュベートし、次いで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴリアルタイム配列検出システム装置に移し、サーモサイクリングを行った。図１０に示すように、デフォルト条件に設定した機器関連ソフトウェアを使用して、２つのサーモサイクリングした反応組成物の解離曲線を作成した。サーモサイクリングした反応組成物が「ポリメラーゼインヒビターＡ」を含んでいた場合、２つの解離ピーク（ピークＡ（「ポリメラーゼインヒビターＡ」）およびピークＢ（ＴＡＮＫアンプリコン）が含まれる）が認められた。対照的に、ポリメラーゼインヒビターＢを含むサーモサイクリングした反応組成物を用いて得た解離曲線は、ＴＡＮＫアンプリコンのピーク（下のパネル中のＣとして示す）を含んでいたが、ポリメラーゼインヒビターＥの解離曲線は容易に区別できなかった。

【0202】

本教示の酵素インヒビター、酵素－酵素インヒビター複合体、方法、およびキットを、本明細書中に広範且つ一般的に記載した。一般的開示の範囲内に含まれるそれぞれのより狭い種および下位概念の分類も本教示の一部を形成する。これには、類概念由来の任意の主題を排除する但し書きまたは消極的な限定と共に本教示の一般的説明が含まれ、使用した材料を本明細書中に具体的に引用するかどうかと無関係である。

【0203】

上記実施例は、例示を目的とし、本明細書中の教示の範囲を制限することを意図しない。

【0204】

開示の教示は種々の酵素インヒビター、酵素－酵素インヒビター複合体、方法、およびキットを参照して記載されているが、本明細書中の教示を逸脱することなく、種々の変更形態および修正形態を実施することができると認識されるであろう。上記実施例を、本教示をより良好に例示するために提供し、上記実施例は、本明細書中の教示の範囲を制限することを意図しない。以下の特許請求の範囲を鑑みて、本教示の一定の態様をさらに理解することができる。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

0007274264000001.app