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特許7274792キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体に対して拮抗作用を有する防除剤及び該防除剤を用いた防除方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-09
(45)【発行日】2023-05-17
(54)【発明の名称】キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体に対して拮抗作用を有する防除剤及び該防除剤を用いた防除方法
(51)【国際特許分類】
A01N 63/30 20200101AFI20230510BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20230510BHJP
A01N 25/08 20060101ALI20230510BHJP
C05F 11/08 20060101ALI20230510BHJP
A01G 13/00 20060101ALI20230510BHJP
【ＦＩ】
A01N63/30
A01P3/00
A01N25/08
C05F11/08
A01G13/00 Z
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2022071193
(22)【出願日】2022-04-22
【審査請求日】2022-07-01
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】390016964
【氏名又は名称】株式会社キングコール
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】飯島 隆介
(72)【発明者】
【氏名】後田 孝
【審査官】高橋 直子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１３９５７００３（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１４１６４１３５（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開平０２－１０８６０９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－１０５２２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Frontiers in Microbiology，2021年，12，1-13
【文献】Frontiers in Microbiology，2020年，11，1-13
【文献】Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2002年，28，303-310
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ０１Ｎ ６３／３０
Ａ０１Ｐ ３／００
Ａ０１Ｎ ２５／０８
Ｃ０５Ｆ １１／０８
Ａ０１Ｇ １３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐＨ７．５～９．５で粒度４～３０メッシュの多孔質担体に炭素率１５％以下で含水率が２５～３０重量部の有機物を２０～３０重量部用いて混練し、醗酵温度を５５～８０℃で発酵させた菌糸体肥料を用いた、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｒａｃｅ ４（Ｆｏｃ ＴＲ４）の防除方法。
【請求項2】
前記菌糸体肥料を植物一体当たり５００ｇの割合で植物体の存する土壌に散布して用いる、請求項１に記載の防除方法。
【請求項3】
ｐＨ７．５～９．５で粒度４～３０メッシュの多孔質担体に炭素率１５％以下で含水率が２５～３０重量部の有機物を２０～３０重量部用いて混練し、醗酵温度を５５～８０℃で発酵させた菌糸体肥料を含有する、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｒａｃｅ ４（Ｆｏｃ ＴＲ４）の防除剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体に対して拮抗作用を有する防除剤に関わり、さらに詳しくは、前記防除剤と前記防除剤を用いた前記病原体の防除方法の提供にある。
【背景技術】
【0002】
世界のバナナ生産は、パナマ病によって深刻な脅威にさらされている。
この病気は、土壌伝染性のフザリウム属の真菌であるFusarium oxysporum f.sp. cubense (Ｆｏｃ)によって引き起こされ、２０世紀半ばのカリブ海地域のグロスミシェル（Ｇｒｏｓ Ｍｉｃｈｅｌ）種に基づくバナナ産業は一掃された。
このＦｏｃの影響は、耐性品種であるキャベンディッシュ（ＣＡＶＥＮＤＩＳＨ）種への転換で克服され、キャベンディッシュ種は現在流通しているバナナのトップシェアを誇っている。
この病気は、土壌伝染性のフザリウム属の真菌であるFusarium oxysporum f.sp. cubense (Ｆｏｃ)によって引き起こされ、２０世紀半ばのカリブ海地域のグロスミシェル（Ｇｒｏｓ Ｍｉｃｈｅｌ）種に基づくバナナ産業は一掃された。
このＦｏｃの影響は、耐性品種であるキャベンディッシュ（ＣＡＶＥＮＤＩＳＨ）種への転換で克服され、キャベンディッシュ種は現在流通しているバナナのトップシェアを誇っている。
【0003】
１９９０年代に入ると、キャベンディッシュ種を宿主とするFusarium oxysporum f.sp. cubense Tropical Race 4（Ｆｏｃ ＴＲ４）と呼ばれる新しいフザリウム属の真菌による新しいパナマ病が流行し、現在なお、世界中のバナナ栽培の大きな脅威となっている。
【0004】
国際連合食糧農業機関（ＦＡＯ）の２０１４年５月の報告書「Technical Manual Prevention and diagnostic of Fusarium Wilt (Panama disease) of banana caused by Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4 (TR4)」によると、「ＴＲ４(VCG 01213)は１９９０年代初頭にマレーシアとインドネシアで発生し(Masdek et al., 2003; Nasdir, 2003)、東南アジアとオーストラリアで１０年足らずで蔓延し、被害を受けたすべての国の何千人もの労働者や農家の家計に大きな影響を与えた。」と報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１５―１０５２２５号公報
【文献】特開平１―２６４９８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
現在のところ、パナマ病の病原体であるＦｏｃ ＴＲ４に対して拮抗作用を有する有効な防除剤や防除方法は見つかっておらず、遺伝子組換え技術によるＦｏｃ ＴＲ４耐性を持つ品種の開発等が進められ、パナマ病の克服が切に求められている。
【0007】
そのような事情に照らし、本願の発明者らは、鋭意研究を行い、木炭の土壌改良材である菌糸体肥料が、Ｆｏｃ ＴＲ４に有効な拮抗作用を有することを見出した。
【0008】
「菌糸体肥料」とは、生物資源を材料とした、生物の活性化および環境の改善に効果のある炭（バイオ炭）であるヤシガラ活性炭等の多孔質担体に、有効微生物を培養固定した微生物入りの土壌改良材である。
【課題を解決するための手段】
【0009】
請求項１に係る発明は、ｐＨ７．５～９．５で粒度４～３０メッシュの多孔質担体に炭素率１５％以下で含水率が２５～３０重量部の有機物を２０～３０重量部用いて混練することにより自然発酵させた菌糸体肥料を用いたキャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４の防除方法に関する。
【0010】
請求項２に係る発明は、前記菌糸体肥料を植物一体当たり５００ｇの割合で用いるキャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４の防除方法に関する。
【0011】
請求項３に係る発明は、ｐＨ７．５～９．５で粒度４～３０メッシュの多孔質担体に炭素率１５％以下で含水率が２５～３０重量部の有機物を２０～３０重量部用いて混練することにより自然発酵させた菌糸体肥料を含有するキャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４の防除剤に関する。
【発明の効果】
【0012】
請求項１に係る発明によれば、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４に対して拮抗作用を有する前記菌糸体肥料を用いた防除方法により、パナマ病の発病、拡大を抑止することができる。
【0013】
請求項２に係る発明によれば、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４に対して拮抗作用を有する前記菌糸体肥料を、植物一体当たり５００ｇの割合で用いることにより、より効果的にパナマ病の発病、拡大を抑止することができる。
【0014】
請求項３に係る発明によれば、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４に対して拮抗作用を有する前記菌糸体肥料を含有する防除剤により、パナマ病の発病、拡大を抑止することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】パナマ病に感染したキャベンディッシュ種の外部症状及び内部症状を示した図である。
【図2】ダバオ市カリナン地区ラマナンにおけるハイプロバイオチャー実験で観察された、パナマ病の外部症状及び内部症状を示した図である。
【図3】分離したＦｏｃ ＴＲ４を７日間培養した後の図である。
【図4】ハイプロバイオチャー純粋培養液濃度の違いによる、７日間培養後のＦｏｃ ＴＲ４の増殖への影響を表した図である。
【図5】Ｆｏｃ ＴＲ４に感染したキャベンディッシュバナナ苗における異なる割合のハイプロバイオチャーの効果を表す図である。
【図6】Ｆｏｃ ＴＲ４に感染した植物体の、根茎の維管束組織の変色を示した図である。
【図7】（Ａ）Ｆｏｃ ＴＲ４の感染率、（Ｂ）Ｆｏｃ ＴＲ４に対する防除率、（Ｃ）Ｆｏｃ ＴＲ４による症状発現までの平均日数に関する図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明者がダバオ市の研究センター、及び民間プランテーション企業の研究所で行ったラボ実験、次いで、フィリピンのミンダナオ島で行った苗木に対する実験について詳細に説明する。
【0017】
（菌糸体肥料の製造方法）
本実験に用いた菌糸体肥料の好適な製造方法について説明する。
本実験に用いた菌糸体肥料の好適な製造方法について説明する。
【0018】
まず、ｐＨ７．５～９．５で粒度４～３０メッシュの多孔質担体に、炭素率１５％以下で含水率が２５～３０重量部の有機物を２０～３０重量部用いて混練する。
【0019】
多孔質担体は、前述の如く耐熱性放線菌及び耐熱性細菌の好適な生育ｐＨ域を菌糸体肥料の製造中及び保存中に確保するため、そのｐＨ域を７．５～９．５と限定する。多孔質担体のｐＨ域を限定することによってアルカリ性条件下で生育しにくい糸状菌等の有害菌の繁殖を阻むという効果をも奏する。
この多孔質担体はその粒度を４～３０メッシュとする必要がある。その理由は、後期醗酵の際に、３０メッシュを超える細かい多孔質担体の場合には、醗酵温度を４０℃以上に維持することが難しく耐熱性放線菌及び耐熱性細菌の充分な生育が望めず、逆に４メッシュ未満の粒度が大きい多孔質担体においては製造時の取扱いの煩雑性があり望ましくないからである。
この多孔質担体はその粒度を４～３０メッシュとする必要がある。その理由は、後期醗酵の際に、３０メッシュを超える細かい多孔質担体の場合には、醗酵温度を４０℃以上に維持することが難しく耐熱性放線菌及び耐熱性細菌の充分な生育が望めず、逆に４メッシュ未満の粒度が大きい多孔質担体においては製造時の取扱いの煩雑性があり望ましくないからである。
【0020】
ヤシガラ活性炭、活性コークス、バーミキュライト等の多孔質担体に、特開平１－２６４９８７号で開示した技術に準じて炭素率１５％以下で含水率が２５～６０％の有機物を２０～３０重量部用いて混練する。炭素率を１５％以下の有機物と限定する理由は、炭素率が１５％を超える有機物の場合には繊維質セルロース系の含有物が多くなり、その結果セルラーゼの所用量が多くなり放線菌中セルラーゼの生育が優勢となり、この発明の所期の目的を達成できないというこの発明者の実験的知見によるものである。また有機物の含水率を２５～６０％と限定する理由は、混練物の醗酵系の水分が有機物からのみ供給されるとともに醗酵物系の水分が２５～６０％好ましくは３０～４０％ないと、充分な耐熱性放線菌の醗酵温度が得られないからである。逆に醗酵物系に６０％を超える含水率の場合や２５％未満の場合にはいずれも耐熱性放線菌を醗酵させる充分な醗酵条件が得られず好ましくないからである。
さらに有機物を２０～３０重量部使用する理由は、２０重量部未満の場合は有機物の量が少なすぎて各担体に対する菌糸体の生長が小さく、各多孔質担体に対して均一に分散して菌糸体が付着せず、逆に３０重量部を超えて配合した場合には、菌糸体と多孔質担体との配合バランスがくずれ菌糸体が過剰になったり有機物の未分解率が多くなったり、いずれの場合も好ましくないからである。
さらに有機物を２０～３０重量部使用する理由は、２０重量部未満の場合は有機物の量が少なすぎて各担体に対する菌糸体の生長が小さく、各多孔質担体に対して均一に分散して菌糸体が付着せず、逆に３０重量部を超えて配合した場合には、菌糸体と多孔質担体との配合バランスがくずれ菌糸体が過剰になったり有機物の未分解率が多くなったり、いずれの場合も好ましくないからである。
【0021】
有機物は、抗菌性物質を含まないものを使用する。有機物としては鶏糞等を用いることができるが、このとき、抗菌性物質を含まない飼料を与えた鶏の糞を用いる。一般に抗菌性物質には抗生物質や合成抗菌剤が含まれ、抗生物質としては、アミノグリコシド系、セフィム系、テトラサイクリン系、ペニシリン系、マクロライド系が挙げられ、抗菌性物質としては、キノロン系、スルフォンアミド系、チアンフェニコール系、フルオロキノロン系が挙げられるが、鶏に与える飼料はこれら抗菌性物質を含まない。
これら抗生物質や合成抗菌剤等の抗菌性物質を含まない飼料を与えた鶏の糞を用いることにより、耐熱性放線菌に加えて耐熱性細菌の生育が促進され、菌糸体が菌糸体肥料１ｇに対し耐熱性放線菌及び耐熱性細菌を合計１．０×１０６／ｇ以上含む菌糸体肥料を製造することができる。
使用する鶏糞の鶏名としては、例えばボリスブラウン（別名 赤玉鶏、学名 Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）を挙げることができるがこれに限定されず、家畜用鶏であれば全てよい。鶏に与える飼料（抗菌性物質を含まない飼料）としては、穀類５０～６０％、植物性油かす１０～２０％、動物質性飼料５～１０％、そうこう類などからなる配合飼料を挙げることができ、例えば、イーテン１７（日清丸紅飼料）を挙げることができる。
これら抗生物質や合成抗菌剤等の抗菌性物質を含まない飼料を与えた鶏の糞を用いることにより、耐熱性放線菌に加えて耐熱性細菌の生育が促進され、菌糸体が菌糸体肥料１ｇに対し耐熱性放線菌及び耐熱性細菌を合計１．０×１０６／ｇ以上含む菌糸体肥料を製造することができる。
使用する鶏糞の鶏名としては、例えばボリスブラウン（別名 赤玉鶏、学名 Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）を挙げることができるがこれに限定されず、家畜用鶏であれば全てよい。鶏に与える飼料（抗菌性物質を含まない飼料）としては、穀類５０～６０％、植物性油かす１０～２０％、動物質性飼料５～１０％、そうこう類などからなる配合飼料を挙げることができ、例えば、イーテン１７（日清丸紅飼料）を挙げることができる。
【0022】
次いでこの混練物を、系内温度１５℃以上に維持できる雰囲気内に静置する。
その理由は、系内温度と外気温とを遮蔽し、一定の保温状態を保つことにより醗酵の均一性を保持するためである。この温度が１５℃以下の場合には、醗酵温度が十分に上昇せず好ましくない。
その理由は、系内温度と外気温とを遮蔽し、一定の保温状態を保つことにより醗酵の均一性を保持するためである。この温度が１５℃以下の場合には、醗酵温度が十分に上昇せず好ましくない。
【0023】
系内温度を一定にし外気温と遮断した後、醗酵物系の温度を５５～８０℃、望ましくは６０～７０℃に維持する。
醗酵温度が５５℃以下の場合には、醗酵を促進するために系内の１５℃以上に維持された空気を一定時間醗酵槽の底面部等より付設されたパイプやポンプを通して送りこみ（エアレーション）醗酵温度を５５～８０℃に維持するが、セルロース含量が炭素率１５％以下の有機物を使用するとして制限され、しかも多孔質担体が多量に混合されている含水率が制限されているという理由で８０℃以上に醗酵温度が上昇することは実際上おこり得ない。
醗酵温度が５５℃以下の場合には、醗酵を促進するために系内の１５℃以上に維持された空気を一定時間醗酵槽の底面部等より付設されたパイプやポンプを通して送りこみ（エアレーション）醗酵温度を５５～８０℃に維持するが、セルロース含量が炭素率１５％以下の有機物を使用するとして制限され、しかも多孔質担体が多量に混合されている含水率が制限されているという理由で８０℃以上に醗酵温度が上昇することは実際上おこり得ない。
【0024】
この状態で少なくとも２日間醗酵することによりｐＨ７．５～９．５の多孔質担体中に耐熱性放線菌及び耐熱性細菌を培養、醗酵させてなることを特徴とする菌糸体肥料が製造される。
醗酵期間は少なくとも２日間、望ましくは５日間とするのが望ましい。
尚、醗酵温度を５５～８０℃に維持する理由は５５℃未満では耐熱性放線菌及び耐熱性細菌が所期の目的の如く菌糸体群集中の割合で得られず、逆に８０℃を超える場合においては嫌気性菌が生育するため、結局いずれの場合も望ましくないからである。
醗酵期間は少なくとも２日間、望ましくは５日間とするのが望ましい。
尚、醗酵温度を５５～８０℃に維持する理由は５５℃未満では耐熱性放線菌及び耐熱性細菌が所期の目的の如く菌糸体群集中の割合で得られず、逆に８０℃を超える場合においては嫌気性菌が生育するため、結局いずれの場合も望ましくないからである。
【0025】
菌糸体肥料の好適な一例としては、ハイプロ（株式会社キングコール製）が挙げられる。
【0026】
前述の如く炭素率１５％以下の有機物を２０～３０重量部用いること、この有機物の含水率を２５～６０％と限定すること、更に多孔質担体を５０～７８重量部用い、且つ粒度を４～３０メッシュとすることによって醗酵温度が８０℃以上になることがない。
従って、通常の醗酵工程で行なわれる水を醗酵物にかけて醗酵温度を下げるいわゆる切り返し工程がなくとも８０℃以上に醗酵温度が上昇することがない。
従って、通常の醗酵工程で行なわれる水を醗酵物にかけて醗酵温度を下げるいわゆる切り返し工程がなくとも８０℃以上に醗酵温度が上昇することがない。
【0027】
（Ｆｏｃ ＴＲ４の同定方法）
本実験に用いた病原体がＦｏｃ ＴＲ４であると同定した方法について述べる。
本実験に用いた病原体がＦｏｃ ＴＲ４であると同定した方法について述べる。
【0028】
（発生状況、病態による同定）
フィリピン政府公認の研究所ＥＲＤＳ（ＥＡＧＲＩ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＳＥＲＶＩＣＥＳ）が、２００５年から２００７年にかけて、ミンダナオ島の２つのキャベンディッシュ農場において、パナマ病の発生状況をモニタリングした。
フィリピン政府公認の研究所ＥＲＤＳ（ＥＡＧＲＩ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＳＥＲＶＩＣＥＳ）が、２００５年から２００７年にかけて、ミンダナオ島の２つのキャベンディッシュ農場において、パナマ病の発生状況をモニタリングした。
【0029】
図１は、キャベンディッシュのパナマ病の外部及び内部症状を示したものである。若い植物（ａ）、及びより古い植物（ｂ）での、古い葉から始まる黄変や、偽茎（pseudostem）の分割（ｃ）、偽茎（pseudostem）の断面に見られる、導管組織の暗褐色変色が見られた（ｄとｅ）。
【0030】
図２は、ダバオ市カリナン地区ラマナンにおけるハイプロバイオチャー実験で観察されたパナマ病の外部及び内部症状を示したものである。葉の黄変は古い葉から始まる（Ａ）。感染した植物は最終的に枯れる（Ｂ及びＣ）。実験終了時には、導管組織の暗色変色が見られた（Ｄ及びＥ）。
このハイプロバイオチャー実験で現れた症状は、論文で言及されたＦｏｃ ＴＲ４と類似していた。
このハイプロバイオチャー実験で現れた症状は、論文で言及されたＦｏｃ ＴＲ４と類似していた。
【0031】
典型的な外部症状及び内部症状を示す植物を定期的にモニタリングし、葉の黄変、仮根の裂開、仮根断面の導管組織の黒褐色への変色を、論文で言及されたＴＲ４の症状との比較を行うことで、本実験に用いた病原体がＴＲ４であることを特定した。
【0032】
上述で参照した論文は、主に次の２本である。
（１）Kristle Grace I. Aguilar－Hawod, etc. Genetic Diversity of Fusarium oxysporum f. sp. cubense Causing Panama Wilt of Banana in the Philippines (Published: 28 December 2019)
（２）Agustin Molina, etc. CONFIRMATION OF TROPICAL RACE 4 OF Fusarium oxysporum f. sp. cubense INFECTING CAVENDISH BANANAS IN THE PHILIPPINES (Poster paper presented during the Centennial Meeting of the American Phytopathological Society, July 26 - 30, 2008, Minneapolis, Minnesota, USA)
（１）Kristle Grace I. Aguilar－Hawod, etc. Genetic Diversity of Fusarium oxysporum f. sp. cubense Causing Panama Wilt of Banana in the Philippines (Published: 28 December 2019)
（２）Agustin Molina, etc. CONFIRMATION OF TROPICAL RACE 4 OF Fusarium oxysporum f. sp. cubense INFECTING CAVENDISH BANANAS IN THE PHILIPPINES (Poster paper presented during the Centennial Meeting of the American Phytopathological Society, July 26 - 30, 2008, Minneapolis, Minnesota, USA)
【0033】
（Ｆｏｃの単離）
本実験では、Vicente et.al (2014)が記載したＦｏｃの単離プロトコルを採用した。
内部組織から感染した導管を小片に切断した。内部組織の感染した導管は、標本の先端部分から長さ３～６ｍｍの切片を採取した。
その後、70％エチルアルコールを含むプレートに切断した組織を約1分間浸漬し、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）を含む別のプレート３枚で洗浄した後、あぶらとり紙で水分を拭き取り、抗菌剤（硫酸ストレプトマイシン１．２ｍＬ／ＰＤＡ２４０ｍＬ）を含むプレート上の培地（１/４強度のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）またはウォーターアガー（ＷＡ））に等分に植え付けを行なった。
本実験では、Vicente et.al (2014)が記載したＦｏｃの単離プロトコルを採用した。
内部組織から感染した導管を小片に切断した。内部組織の感染した導管は、標本の先端部分から長さ３～６ｍｍの切片を採取した。
その後、70％エチルアルコールを含むプレートに切断した組織を約1分間浸漬し、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）を含む別のプレート３枚で洗浄した後、あぶらとり紙で水分を拭き取り、抗菌剤（硫酸ストレプトマイシン１．２ｍＬ／ＰＤＡ２４０ｍＬ）を含むプレート上の培地（１/４強度のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）またはウォーターアガー（ＷＡ））に等分に植え付けを行なった。
【0034】
（Ｆｏｃ ＴＲ４の量産）
Ｆｏｃ ＴＲ４を１/２強度のポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）で大量純粋培養生産した。Ｆｏｃ ＴＲ４の純粋培養から寒天ディスクを得、滅菌移植針で新鮮なＰＤＡ培地に植え付けた（図３）。
Ｆｏｃ ＴＲ４を１/２強度のポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）で大量純粋培養生産した。Ｆｏｃ ＴＲ４の純粋培養から寒天ディスクを得、滅菌移植針で新鮮なＰＤＡ培地に植え付けた（図３）。
【0035】
（単離した病原体の形態的特徴による同定）
分離体をポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）中で７日間培養したものは、形態に大きなばらつきがあった。色調は淡紫色、淡橙色から濃赤色まで、また色素のないものもあった。 菌糸の外観は、扁平から気生、フロック状から綿状、円形から不定形とさまざまであった。
ミクロコニダは楕円形と腎臓型で、通常単細胞であるが、短い単葉から発生する単隔膜を持つものもあり、空中菌糸の提示で偽頭と見られる。どの菌株も多くの微小子実体を形成した。マクロコニダは通常３つの中隔を有し、薄く、直線状から鎌状で、明瞭な足球を有していた。クラミド胞子の形態は様々で、平滑壁と粗面壁があり、単胞子、対胞子、集胞子と末端部や間質部に見られた。
このような形態学的特徴は、Aguilar－Hawod et. al, (2019)が引用したLeslie and Summerellの記述と一致する。
これらによって、本実験に用いた病原体がＦｏｃ ＴＲ４であることを特定した。
分離体をポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）中で７日間培養したものは、形態に大きなばらつきがあった。色調は淡紫色、淡橙色から濃赤色まで、また色素のないものもあった。 菌糸の外観は、扁平から気生、フロック状から綿状、円形から不定形とさまざまであった。
ミクロコニダは楕円形と腎臓型で、通常単細胞であるが、短い単葉から発生する単隔膜を持つものもあり、空中菌糸の提示で偽頭と見られる。どの菌株も多くの微小子実体を形成した。マクロコニダは通常３つの中隔を有し、薄く、直線状から鎌状で、明瞭な足球を有していた。クラミド胞子の形態は様々で、平滑壁と粗面壁があり、単胞子、対胞子、集胞子と末端部や間質部に見られた。
このような形態学的特徴は、Aguilar－Hawod et. al, (2019)が引用したLeslie and Summerellの記述と一致する。
これらによって、本実験に用いた病原体がＦｏｃ ＴＲ４であることを特定した。
【0036】
（インビトロでの菌糸体肥料のＦｏｃ ＴＲ４に対する拮抗作用の実験）
ダバオ市の研究センターで行った菌糸体肥料のＦｏｃ ＴＲ４に対する拮抗作用の実験について詳述する。
ここでは、菌糸体肥料として、ハイプロ（株式会社キングコール製。以下同じ。）を用いて実施した。
（実験の目的）
１．ハイプロのＦｏｃ ＴＲ４に対する拮抗作用の評価
２．ハイプロのＦｏｃ ＴＲ４に対する最も効果的な使用率の決定
ダバオ市の研究センターで行った菌糸体肥料のＦｏｃ ＴＲ４に対する拮抗作用の実験について詳述する。
ここでは、菌糸体肥料として、ハイプロ（株式会社キングコール製。以下同じ。）を用いて実施した。
（実験の目的）
１．ハイプロのＦｏｃ ＴＲ４に対する拮抗作用の評価
２．ハイプロのＦｏｃ ＴＲ４に対する最も効果的な使用率の決定
【0037】
（実験計画）
実験室での実験は完全無作為化法により行われた。４つの処理区を３回複製し、１回の複製につき３枚のプレートを使用した。
実験室での実験は完全無作為化法により行われた。４つの処理区を３回複製し、１回の複製につき３枚のプレートを使用した。
【0038】
（Ｆｏｃの単離）
本実験では、Vicente et.al (2014)が記載したＦｏｃの単離プロトコルを採用した。
内部組織から感染した導管を小片に切断した。内部組織の感染した導管は、標本の先端部分から長さ３～６ｍｍの切片を採取した。
その後、70％エチルアルコールを含むプレートに切断した組織を約1分間浸漬し、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）を含む別のプレート３枚で洗浄した後、あぶらとり紙で水分を拭き取り、抗菌剤（硫酸ストレプトマイシン１．２ｍＬ／ＰＤＡ２４０ｍＬ）を含むプレート上の培地（１/４強度のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）またはウォーターアガー（ＷＡ））に等分に植え付けを行なった。
本実験では、Vicente et.al (2014)が記載したＦｏｃの単離プロトコルを採用した。
内部組織から感染した導管を小片に切断した。内部組織の感染した導管は、標本の先端部分から長さ３～６ｍｍの切片を採取した。
その後、70％エチルアルコールを含むプレートに切断した組織を約1分間浸漬し、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）を含む別のプレート３枚で洗浄した後、あぶらとり紙で水分を拭き取り、抗菌剤（硫酸ストレプトマイシン１．２ｍＬ／ＰＤＡ２４０ｍＬ）を含むプレート上の培地（１/４強度のポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）またはウォーターアガー（ＷＡ））に等分に植え付けを行なった。
【0039】
（Ｆｏｃ ＴＲ４の量産）
Ｆｏｃ ＴＲ４を１/２強度のポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）で大量純粋培養生産した。Ｆｏｃ ＴＲ４の純粋培養から寒天ディスクを得、滅菌移植針で新鮮なＰＤＡ培地に植え付けた（図３）。
Ｆｏｃ ＴＲ４を１/２強度のポテトデキストロース寒天培地（ＰＤＡ培地）で大量純粋培養生産した。Ｆｏｃ ＴＲ４の純粋培養から寒天ディスクを得、滅菌移植針で新鮮なＰＤＡ培地に植え付けた（図３）。
【0040】
（ハイプロから細菌の単離と量産）
ハイプロを、Nutrient Agarのプレート培地に植え付けた。
２４時間後、植え付けたハイプロの周囲で増殖した細菌を他のプレートに移し、目的の細菌の純粋培養を獲得した。
ハイプロを、Nutrient Agarのプレート培地に植え付けた。
２４時間後、植え付けたハイプロの周囲で増殖した細菌を他のプレートに移し、目的の細菌の純粋培養を獲得した。
【0041】
（ハイプロのＦｏｃ ＴＲ４に対する拮抗作用に関する試験）
ハイプロの拮抗作用をインビトロで評価するために、以下の濃度のハイプロ由来細菌の純粋培養液をＦｏｃ ＴＲ４に対して試験した。
処理 ／ 純粋培養菌濃度
（１）Ｆｏｃ ＴＲ４（対照） ／ －
（２）ハイプロ＋Ｆｏｃ ＴＲ４ ／ 5ml 純粋培養菌
（３）ハイプロ＋Ｆｏｃ ＴＲ４ ／ 3ml 純粋培養菌＋2ml 滅菌蒸留水
（４）ハイプロ＋Ｆｏｃ ＴＲ４ ／ 1ml 純粋培養菌＋4ml 滅菌蒸留水
Kirby－Bauer（1940）によるディスク拡散法を用いて、ハイプロ由来細菌の純粋培養液の異なる濃度での評価を行った。濾紙ディスクを濃度の異なるハイプロ由来細菌の純粋培養液（純粋培養菌5ml、純粋培養菌3ml＋滅菌蒸留水2ml、純粋培養菌1ml＋滅菌蒸留水4ml）に２分間浸漬した。
その後、浸漬したディスク4枚を、プレート中央のＦｏｃ ＴＲ４の菌糸体ディスクから3cm離して植え付けた。試験した真菌株を室温で７日間培養した後、対照（Ｆｏｃ ＴＲ４）と処理プレートの真菌の生育の直径を測定した。
ハイプロの拮抗作用をインビトロで評価するために、以下の濃度のハイプロ由来細菌の純粋培養液をＦｏｃ ＴＲ４に対して試験した。
処理 ／ 純粋培養菌濃度
（１）Ｆｏｃ ＴＲ４（対照） ／ －
（２）ハイプロ＋Ｆｏｃ ＴＲ４ ／ 5ml 純粋培養菌
（３）ハイプロ＋Ｆｏｃ ＴＲ４ ／ 3ml 純粋培養菌＋2ml 滅菌蒸留水
（４）ハイプロ＋Ｆｏｃ ＴＲ４ ／ 1ml 純粋培養菌＋4ml 滅菌蒸留水
Kirby－Bauer（1940）によるディスク拡散法を用いて、ハイプロ由来細菌の純粋培養液の異なる濃度での評価を行った。濾紙ディスクを濃度の異なるハイプロ由来細菌の純粋培養液（純粋培養菌5ml、純粋培養菌3ml＋滅菌蒸留水2ml、純粋培養菌1ml＋滅菌蒸留水4ml）に２分間浸漬した。
その後、浸漬したディスク4枚を、プレート中央のＦｏｃ ＴＲ４の菌糸体ディスクから3cm離して植え付けた。試験した真菌株を室温で７日間培養した後、対照（Ｆｏｃ ＴＲ４）と処理プレートの真菌の生育の直径を測定した。
【0042】
（成長直径及び成長阻害率）
培養菌コロニーの直径は、各コロニーについて直角にとった長径と短径の2つの平均値を定規でミリメートル（mm）単位で測定し、記録した。
培養した7日後の真菌の増殖を測定し、阻害領域（Zone of Inhibition）を決定した。以下の式で阻害率を算出した（Alwathnani and Perveen; 2012）。
培養菌コロニーの直径は、各コロニーについて直角にとった長径と短径の2つの平均値を定規でミリメートル（mm）単位で測定し、記録した。
培養した7日後の真菌の増殖を測定し、阻害領域（Zone of Inhibition）を決定した。以下の式で阻害率を算出した（Alwathnani and Perveen; 2012）。
【0043】
【数1】
【0044】
（統計分析）
データは完全無作為化設計の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析し、処理区の平均の差はテューキーの範囲検定（ＴＨＳＤ）を用いて比較した。
データは完全無作為化設計の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析し、処理区の平均の差はテューキーの範囲検定（ＴＨＳＤ）を用いて比較した。
【0045】
（結果及び考察）
ハイプロの濃度の違いによる７日間培養後のＦｏｃ ＴＲ４の（１）増殖直径（mm）と（２）抑制率（％）の結果を表１に示した。また、ハイプロ由来細菌の純粋培養液の濃度の違いによる７日間培養後のＦｏｃ ＴＲ４の増殖への影響を図４に示した。
ハイプロの濃度の違いによる７日間培養後のＦｏｃ ＴＲ４の（１）増殖直径（mm）と（２）抑制率（％）の結果を表１に示した。また、ハイプロ由来細菌の純粋培養液の濃度の違いによる７日間培養後のＦｏｃ ＴＲ４の増殖への影響を図４に示した。
【0046】
【表1】
【0047】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）による、Ｆｏｃ ＴＲ４の増殖に対するハイプロ由来細菌の純粋培養液の濃度の有意な影響を表２に示した。
【0048】
【表2】
【0049】
その結果、純度5 mlのハイプロ由来細菌の純粋培養液を処理した場合、培養7日後の増殖量が最も小さく（26.17mm）、増殖阻害率は54.09%であったことが有意に示された。その結果、ハイプロ由来細菌の純粋培養液の濃度が3mlと1mlでは、Ｆｏｃ ＴＲ４の増殖（直径33.83mmから51.17mm）に対して同等の効果があり、10.23%から40.65%の範囲の増殖阻害が見られた。一方、最も大きく増殖したのは対照区のプレートで、平均直径は57.00mmであった。
【0050】
以上の結果から、最高レベルのハイプロ由来細菌の純粋培養液で処理することにより、インビトロ試験におけるＦｏｃ ＴＲ４の増殖に大きな影響を与えることが示唆された。さらに、ハイプロ由来細菌の純粋培養液の使用量を増やすと、Ｆｏｃ ＴＲ４の増殖が抑制されることが示唆された。
【0051】
民間プランテーション企業であるLapandy Agricultural & Development Corporationが行った、キャベンディッシュバナナのパナマ病に対する、ハイプロバイオチャー（バイオチャコール）の生物学的検定（バイオアッセイ BIOASSAY）試験（インビトロ）実験内容と結果を説明する。
【0052】
キャベンディッシュバナナに発生するパナマ病（Fusarium Wilt disease）の病原体に対するハイプロバイオチャー（バイオチャコール）の有効性を評価するため，バイオアッセイ試験を実施した。
ハイプロバイオチャー（バイオチャコール）は１～５gm/Lの濃度で使用し、室温で７日間培養した。その結果、５１．３４％～６３．３３％の増殖阻害率を示し、市販の殺菌剤と同等の結果を示した。このことにより、ハイプロバイオチャー（バイオチャコール）がパナマ病の病原体の増殖を素材する能力を有することが示された（表３）。
ハイプロバイオチャー（バイオチャコール）は１～５gm/Lの濃度で使用し、室温で７日間培養した。その結果、５１．３４％～６３．３３％の増殖阻害率を示し、市販の殺菌剤と同等の結果を示した。このことにより、ハイプロバイオチャー（バイオチャコール）がパナマ病の病原体の増殖を素材する能力を有することが示された（表３）。
【0053】
【表3】
【0054】
（インビボでのハイプロのＦｏｃ ＴＲ４に対する拮抗作用を評価する実験）
ダバオ市カリナン区ラマナンにあるＥＲＤＳ実験農園ステーションにおける、Ｆｏｃ ＴＲ４に対する防除剤としてのハイプロバイオチャーをバナナ苗木の根元に散布し、ハイプロバイオチャーの生物学的有効性の評価を行った実験について、以下説明する。
ダバオ市カリナン区ラマナンにあるＥＲＤＳ実験農園ステーションにおける、Ｆｏｃ ＴＲ４に対する防除剤としてのハイプロバイオチャーをバナナ苗木の根元に散布し、ハイプロバイオチャーの生物学的有効性の評価を行った実験について、以下説明する。
【0055】
（実験環境）
実験は完全無作為化計画（ＣＲＤ）により行われ、６つの処理区（Ｔ１～Ｔ６）を４回複製した。各複製は10本のサンプル植物体で構成され、1処理区あたり合計40本の植物体とした。鉢植えの殺菌済み園芸用土（14Wx12Lインチサイズ）は、実験計画に従って、鉢と鉢の間隔が12インチ、区画の間隔が1.0メートルとなるように、オープンフィールドに適切に配置された。
６つの処理区は次のとおりである。
Ｔ１：対照（未処理）
Ｔ２：ハイプロバイオチャー ５０ｇ
Ｔ３：ハイプロバイオチャー １５０ｇ
Ｔ４：ハイプロバイオチャー ２５０ｇ
Ｔ５：ハイプロバイオチャー ５００ｇ
Ｔ６：ハタケ １ｇ
実験は完全無作為化計画（ＣＲＤ）により行われ、６つの処理区（Ｔ１～Ｔ６）を４回複製した。各複製は10本のサンプル植物体で構成され、1処理区あたり合計40本の植物体とした。鉢植えの殺菌済み園芸用土（14Wx12Lインチサイズ）は、実験計画に従って、鉢と鉢の間隔が12インチ、区画の間隔が1.0メートルとなるように、オープンフィールドに適切に配置された。
６つの処理区は次のとおりである。
Ｔ１：対照（未処理）
Ｔ２：ハイプロバイオチャー ５０ｇ
Ｔ３：ハイプロバイオチャー １５０ｇ
Ｔ４：ハイプロバイオチャー ２５０ｇ
Ｔ５：ハイプロバイオチャー ５００ｇ
Ｔ６：ハタケ １ｇ
【0056】
（土壌の準備と播種）
Ｆｏｃ ＴＲ４感染地域から土壌培地を収集した。収集した感染土壌を14W x 12Lインチの黒色プラスチック袋に入れた。１日後、この土壌に1500万のＦｏｃ ＴＲ４の胞子を播種し、病原を２５日間潜伏させて、鉢植えした培地中のＦｏｃ ＴＲ４の播種量の均一であることを確認した。
Ｆｏｃ ＴＲ４感染地域から土壌培地を収集した。収集した感染土壌を14W x 12Lインチの黒色プラスチック袋に入れた。１日後、この土壌に1500万のＦｏｃ ＴＲ４の胞子を播種し、病原を２５日間潜伏させて、鉢植えした培地中のＦｏｃ ＴＲ４の播種量の均一であることを確認した。
【0057】
（処理と定植）
黒色のプラスチック製の大きなポリ袋または鉢（14W x 12Lインチ）に入れた感染土壌を、ハイプロバイオチャーで処理し、処理区で、３０日間感染土壌を治療した。その後、組織培養した月齢２か月のキャベンディッシュバナナ苗を植え付けた。ハイプロバイオチャーの散布は1回だけであり、植物が成長する中でそれ以上の処理はしなかった。この試験は、ハイプロバイオチャーとハタケによる防除処理として開始された。
処理、散布量、散布方法は次のとおりである。
Ｔ１：対照（未処理）、Ｔ２：ハイプロバイオチャー ５０ｇ、Ｔ３：ハイプロバイオチャー １５０ｇ、Ｔ４：ハイプロバイオチャー ２５０ｇ、Ｔ５：ハイプロバイオチャー ５００ｇ、Ｔ６：ハタケ １ｇに対して、Ｔ２～Ｔ５について、定植の前に土壌の中で混合を行った。Ｔ６について、定植の前に土壌の中に浸透させた。５０ｇ／ｈｉｌｌの完全肥料を、植え付け後、１４日目と４５日目に全植物体に均一に散布した。
黒色のプラスチック製の大きなポリ袋または鉢（14W x 12Lインチ）に入れた感染土壌を、ハイプロバイオチャーで処理し、処理区で、３０日間感染土壌を治療した。その後、組織培養した月齢２か月のキャベンディッシュバナナ苗を植え付けた。ハイプロバイオチャーの散布は1回だけであり、植物が成長する中でそれ以上の処理はしなかった。この試験は、ハイプロバイオチャーとハタケによる防除処理として開始された。
処理、散布量、散布方法は次のとおりである。
Ｔ１：対照（未処理）、Ｔ２：ハイプロバイオチャー ５０ｇ、Ｔ３：ハイプロバイオチャー １５０ｇ、Ｔ４：ハイプロバイオチャー ２５０ｇ、Ｔ５：ハイプロバイオチャー ５００ｇ、Ｔ６：ハタケ １ｇに対して、Ｔ２～Ｔ５について、定植の前に土壌の中で混合を行った。Ｔ６について、定植の前に土壌の中に浸透させた。５０ｇ／ｈｉｌｌの完全肥料を、植え付け後、１４日目と４５日目に全植物体に均一に散布した。
【0058】
（Ｆｏｃ ＴＲ４の校正と散布時期）
試験植物体として、Ｆｏｃ ＴＲ４感受性品種であるキャベンディッシュバナナ「グランナイン」を使用した。Ｆｏｃ ＴＲ４分離体は Lapanday Research Laboratory から入手し、ＥＲＤＳ研究所で大量生産した。Ｆｏｃ ＴＲ４の純粋培養物を1Ｌの水に混合し、Ｆｏｃ ＴＲ４懸濁液の容量を校正した。1mlの懸濁液を収集し、顕微鏡下で血球計算盤を用いて胞子をカウントしたところ、標準播種量75,000胞子/mlを達成した。この校正に基づき、200mlのＦｏｃ ＴＲ４強毒性懸濁液を無菌庭園土壌に散布して播種し、土壌に感染させた。土壌に播種したＦｏｃ ＴＲ４は、ハイプロバイオチャーで処理する前に２５日間潜伏させた。この実験全体にわたってＦｏｃ ＴＲ４を播種したのは1回だけで、これは圃場に存在するＦｏｃ ＴＲ４の集団のみが植物の根系に感染することを考慮した圃場の状況を模擬したものである。
試験植物体として、Ｆｏｃ ＴＲ４感受性品種であるキャベンディッシュバナナ「グランナイン」を使用した。Ｆｏｃ ＴＲ４分離体は Lapanday Research Laboratory から入手し、ＥＲＤＳ研究所で大量生産した。Ｆｏｃ ＴＲ４の純粋培養物を1Ｌの水に混合し、Ｆｏｃ ＴＲ４懸濁液の容量を校正した。1mlの懸濁液を収集し、顕微鏡下で血球計算盤を用いて胞子をカウントしたところ、標準播種量75,000胞子/mlを達成した。この校正に基づき、200mlのＦｏｃ ＴＲ４強毒性懸濁液を無菌庭園土壌に散布して播種し、土壌に感染させた。土壌に播種したＦｏｃ ＴＲ４は、ハイプロバイオチャーで処理する前に２５日間潜伏させた。この実験全体にわたってＦｏｃ ＴＲ４を播種したのは1回だけで、これは圃場に存在するＦｏｃ ＴＲ４の集団のみが植物の根系に感染することを考慮した圃場の状況を模擬したものである。
【0059】
（モニタリング方法及び分析）
植物体は２週間ごとに検査し、Ｆｏｃ ＴＲ４感染の発生をモニタリングした。
読み取りの最終週に、植物の下部（球茎）を切り取り、状態を調べ、維管束と根茎の状態を判断した。最初の症状が現れ、古葉に黄色い筋を示すまでの日数を記録した。
分散分析（ＡＮＯＶＡ）は統計解析ソフトＳＰＳＳを用いて行い、平均値の比較はダンカンの多重範囲検定（ＤＭＲＴ）を用いて決定した。より詳しくは、以下のとおりである。
植物体は２週間ごとに検査し、Ｆｏｃ ＴＲ４感染の発生をモニタリングした。
読み取りの最終週に、植物の下部（球茎）を切り取り、状態を調べ、維管束と根茎の状態を判断した。最初の症状が現れ、古葉に黄色い筋を示すまでの日数を記録した。
分散分析（ＡＮＯＶＡ）は統計解析ソフトＳＰＳＳを用いて行い、平均値の比較はダンカンの多重範囲検定（ＤＭＲＴ）を用いて決定した。より詳しくは、以下のとおりである。
【0060】
（a）植物毒性
定植後３０日目、６０日目、９０日目に処理区の植物毒性をモニタリングした。徒長、クロロシス、葉焼け、巻葉、生育不良という形態の薬害を未処理の対照を基準として下記の標準的な評価尺度で評価した。
尺度１ 農作物損傷（％） 無し
尺度３ 農作物損傷（％） １－１０
尺度５ 農作物損傷（％） １１－２０
尺度７ 農作物損傷（％） ２１－３０
尺度９ 農作物損傷（％） ３０より大
（b）Ｆｏｃ ＴＲ４感染率
サンプル植物体を２週間ごとに観察及び検査をし、Ｆｏｃ ＴＲ４に感染した植物体を記録した。以後、２週間ごとに４か月間モニタリングした。
（c）症状発現までの日数
古葉の黄変が見られる植物を、２週間ごとに観察し記録した。
（d）データ分析
データは、統計解析ソフトＳＰＳＳ（Statistical Package for the Social Science）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）をした。処理の平均値の差は、ダンカンの多重範囲検定（ＤＭＲＴ）を用いて5％の有意水準で決定された。
定植後３０日目、６０日目、９０日目に処理区の植物毒性をモニタリングした。徒長、クロロシス、葉焼け、巻葉、生育不良という形態の薬害を未処理の対照を基準として下記の標準的な評価尺度で評価した。
尺度１ 農作物損傷（％） 無し
尺度３ 農作物損傷（％） １－１０
尺度５ 農作物損傷（％） １１－２０
尺度７ 農作物損傷（％） ２１－３０
尺度９ 農作物損傷（％） ３０より大
（b）Ｆｏｃ ＴＲ４感染率
サンプル植物体を２週間ごとに観察及び検査をし、Ｆｏｃ ＴＲ４に感染した植物体を記録した。以後、２週間ごとに４か月間モニタリングした。
（c）症状発現までの日数
古葉の黄変が見られる植物を、２週間ごとに観察し記録した。
（d）データ分析
データは、統計解析ソフトＳＰＳＳ（Statistical Package for the Social Science）を用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）をした。処理の平均値の差は、ダンカンの多重範囲検定（ＤＭＲＴ）を用いて5％の有意水準で決定された。
【0061】
（結果及び考察）
定植後６週目にＦｏｃ ＴＲ４によるパナマ病の症状が植物体に見られた（表４）。すべての処理区で感染が発生し、未処理の植物体の20％が被害を受けた。ハイプロバイオチャーの処理区のうち、500g/植物体と250g/植物体の２つの高濃度のものは、植物体におけるパナマ病の発症が最も遅く、2.5％の感染率を示した。一方、150gと50gのハイプロバイオチャーは、植物体にパナマ病に対する耐性を持たせることを助け、それぞれの感染率は5％と7.5％であり、ハタケ（感染率18.5％）および未処理の対照（感染率20％）で記録された感染レベルに比べてはるかに低いことが示された。
ハイプロバイオチャーは長期間の防除効果があり、引き続き処理を行わなかったにもかかわらず、500gのものは10週目になってもさらなる感染を示さなかった。250g、150g、50gのハイプロバイオチャーの濃度のものは、８週目までは感染がわずかしか観察されなかったが、10週目になると後者の２つの処理区では力が弱まり、植物体当たり500g、250gのハイプロバイオチャーのものと比較して感染した植物体の数が多くなった。
１２週目には感染症状が進行し、翌週（１４週目）にはその症状が激しくなった。しかし、パナマ病の発生が蓄積しているにもかかわらず、500gの最も高い割合のハイプロバイオチャーのものは、最も感染した植物体の数が少なくなった。１６週目には、500g/植物体の割合のハイプロバイオチャーのものにおける植物体感染の発生が減少していることからわかるように、防除が可能であることが、実際に植物が順調に成長していることから示唆された。植物体当たり250gと150gの２つの割合でハイプロバイオチャーを散布した植物体では、Ｆｏｃ ＴＲ４による病害の発生は同じであったが、50g/植物体で記録された感染はやや進行したものであった。回復した植物では、新芽が伸長し、株立ちが良くなるなど、回復した様子が観察された（図５）。
一方、ハタケで処理したものは、新たに感染した植物体が、１０週目から現れ始め、感染の発生は著しく強く、１６週目にかけて増加の一途をたどった。
さらに、ハイプロバイオチャーの４つの処理区では、植物の成長段階において、同様に感染を強く抑えることができないことが明らかとなった。そして、評価の最終週（１８週目）では、一部の感染した植物体は、根茎の維管束組織の変色を示したことが認められた（図６の（Ａ）及び（Ｂ））。
定植後６週目にＦｏｃ ＴＲ４によるパナマ病の症状が植物体に見られた（表４）。すべての処理区で感染が発生し、未処理の植物体の20％が被害を受けた。ハイプロバイオチャーの処理区のうち、500g/植物体と250g/植物体の２つの高濃度のものは、植物体におけるパナマ病の発症が最も遅く、2.5％の感染率を示した。一方、150gと50gのハイプロバイオチャーは、植物体にパナマ病に対する耐性を持たせることを助け、それぞれの感染率は5％と7.5％であり、ハタケ（感染率18.5％）および未処理の対照（感染率20％）で記録された感染レベルに比べてはるかに低いことが示された。
ハイプロバイオチャーは長期間の防除効果があり、引き続き処理を行わなかったにもかかわらず、500gのものは10週目になってもさらなる感染を示さなかった。250g、150g、50gのハイプロバイオチャーの濃度のものは、８週目までは感染がわずかしか観察されなかったが、10週目になると後者の２つの処理区では力が弱まり、植物体当たり500g、250gのハイプロバイオチャーのものと比較して感染した植物体の数が多くなった。
１２週目には感染症状が進行し、翌週（１４週目）にはその症状が激しくなった。しかし、パナマ病の発生が蓄積しているにもかかわらず、500gの最も高い割合のハイプロバイオチャーのものは、最も感染した植物体の数が少なくなった。１６週目には、500g/植物体の割合のハイプロバイオチャーのものにおける植物体感染の発生が減少していることからわかるように、防除が可能であることが、実際に植物が順調に成長していることから示唆された。植物体当たり250gと150gの２つの割合でハイプロバイオチャーを散布した植物体では、Ｆｏｃ ＴＲ４による病害の発生は同じであったが、50g/植物体で記録された感染はやや進行したものであった。回復した植物では、新芽が伸長し、株立ちが良くなるなど、回復した様子が観察された（図５）。
一方、ハタケで処理したものは、新たに感染した植物体が、１０週目から現れ始め、感染の発生は著しく強く、１６週目にかけて増加の一途をたどった。
さらに、ハイプロバイオチャーの４つの処理区では、植物の成長段階において、同様に感染を強く抑えることができないことが明らかとなった。そして、評価の最終週（１８週目）では、一部の感染した植物体は、根茎の維管束組織の変色を示したことが認められた（図６の（Ａ）及び（Ｂ））。
【0062】
（パナマ病の感染率）
500g／植物体のハイプロバイオチャー処理のものは植物体の15％しか感染せず、他の250g（23.33%）、150g（30%）、50g（30%）の他の３つのハイプロバイオチャーの処理区、およびハタケ（47.50%）よりも感染発生率が著しく低いことがわかった（図７の（Ａ））。
250gのハイプロバイオチャーのものにおける感染率が上昇したが、Ｆｏｃ ＴＲ４の防除には、この処理区は、500g／植物体の最も高い割合に次いで最良の処理区であった。未処理の植物体では、初期の数週間は植物体が無症状であったため、フザリウム病の感染が徐々にしか進行しなかった。しかし、１２週目には古葉が黄変の症状が１６週目にかけて明らかに増加し、１８週目にはすべての植物体がＦｏｃ ＴＲ４によって被害を受けた。
その結果、500g/植物体である最も高い割合のハイプロバイオチャーの効果は、非常に期待できるものであり、キャベンディッシュバナナのＦｏｃ ＴＲ４に対して優れた防除効果があり、他の３つの割合のハイプロバイオチャーおよびハタケよりもはるかに優れていたことが明らかとなった。
500g／植物体のハイプロバイオチャー処理のものは植物体の15％しか感染せず、他の250g（23.33%）、150g（30%）、50g（30%）の他の３つのハイプロバイオチャーの処理区、およびハタケ（47.50%）よりも感染発生率が著しく低いことがわかった（図７の（Ａ））。
250gのハイプロバイオチャーのものにおける感染率が上昇したが、Ｆｏｃ ＴＲ４の防除には、この処理区は、500g／植物体の最も高い割合に次いで最良の処理区であった。未処理の植物体では、初期の数週間は植物体が無症状であったため、フザリウム病の感染が徐々にしか進行しなかった。しかし、１２週目には古葉が黄変の症状が１６週目にかけて明らかに増加し、１８週目にはすべての植物体がＦｏｃ ＴＲ４によって被害を受けた。
その結果、500g/植物体である最も高い割合のハイプロバイオチャーの効果は、非常に期待できるものであり、キャベンディッシュバナナのＦｏｃ ＴＲ４に対して優れた防除効果があり、他の３つの割合のハイプロバイオチャーおよびハタケよりもはるかに優れていたことが明らかとなった。
【0063】
【表4】
【0064】
（Ｆｏｃ ＴＲ４の防除効果）
図７（Ｂ）に基づき説明する。
ハイプロバイオチャーによる、植物体の根部の領域を強化する効果は、感染した植物がほとんどないことから、良好であることが確認された。したがって、根系が元気であることは、植物が病害の攻撃から耐える力が強いことに対応する。パナマ病を防除する最も効果的な処理は、500g/植物体のハイプロバイオチャーであり、85%という高い防除率を示した。また、76.67％の防除率を有する250g/植物体のハイプロバイオチャーの効果は、70％の防除率を有する50g/植物体と150g/植物体の２つの低い割合のハイプロバイオチャーと互角であることが示された。しかし、後者の２つの処理区は、52.50％の防除効果を示したハタケよりも優れた防除効果を示した。さらに、最も高い割合である500g/植物体のハイプロバイオチャーは、他のハイプロバイオチャーの３つの処理区に比べてＦｏｃ ＴＲ４の防除に有利な効果があることが確認された。
図７（Ｂ）に基づき説明する。
ハイプロバイオチャーによる、植物体の根部の領域を強化する効果は、感染した植物がほとんどないことから、良好であることが確認された。したがって、根系が元気であることは、植物が病害の攻撃から耐える力が強いことに対応する。パナマ病を防除する最も効果的な処理は、500g/植物体のハイプロバイオチャーであり、85%という高い防除率を示した。また、76.67％の防除率を有する250g/植物体のハイプロバイオチャーの効果は、70％の防除率を有する50g/植物体と150g/植物体の２つの低い割合のハイプロバイオチャーと互角であることが示された。しかし、後者の２つの処理区は、52.50％の防除効果を示したハタケよりも優れた防除効果を示した。さらに、最も高い割合である500g/植物体のハイプロバイオチャーは、他のハイプロバイオチャーの３つの処理区に比べてＦｏｃ ＴＲ４の防除に有利な効果があることが確認された。
【0065】
（症状発現までの平均日数）
図７（Ｃ）に基づき説明する。
実際の植物の立ち姿を目で観察したところ、Ｆｏｃ ＴＲ４による症状の発現は必ずしも顕著ではなく、特に未処理の植物体では、感染に対する植物の本能的な反応が同調しないことがあるようである。未処理の植物体は、無症状ですぐに症状が出ないが、植物体の内部はすでに侵されている。
しかし、ハイプロバイオチャーの処理区の場合、50g/植物体と150g/植物体の2つの低い割合のものでは、平均105.60日と102.67日とパナマ病の感染の発生を遅らせる効果が見られた。250gおよび500gのハイプロバイオチャーで処理した植物体で、感染症状が早く現れたが、感染に対する植物体の反応が早いことで、処理効果を低下させることはなかった。また、まもなく古葉に黄変症状が見られたが、病気が急速に進行したわけではないので、わずかな植物体しか被害を受けなかった。
また、ハイプロバイオチャーに含まれるバチルス（Bacillus）株の防除効果により症状が後で現れた可能性があり、このバチルス（Bacillus）株は植物の生長を促進し、病勢を抑制することができたものと考えられる。ハタケも植物に影響を与え、感染を遅らせることができるが、パナマ病の被害からの回復を助けることはできない。
図７（Ｃ）に基づき説明する。
実際の植物の立ち姿を目で観察したところ、Ｆｏｃ ＴＲ４による症状の発現は必ずしも顕著ではなく、特に未処理の植物体では、感染に対する植物の本能的な反応が同調しないことがあるようである。未処理の植物体は、無症状ですぐに症状が出ないが、植物体の内部はすでに侵されている。
しかし、ハイプロバイオチャーの処理区の場合、50g/植物体と150g/植物体の2つの低い割合のものでは、平均105.60日と102.67日とパナマ病の感染の発生を遅らせる効果が見られた。250gおよび500gのハイプロバイオチャーで処理した植物体で、感染症状が早く現れたが、感染に対する植物体の反応が早いことで、処理効果を低下させることはなかった。また、まもなく古葉に黄変症状が見られたが、病気が急速に進行したわけではないので、わずかな植物体しか被害を受けなかった。
また、ハイプロバイオチャーに含まれるバチルス（Bacillus）株の防除効果により症状が後で現れた可能性があり、このバチルス（Bacillus）株は植物の生長を促進し、病勢を抑制することができたものと考えられる。ハタケも植物に影響を与え、感染を遅らせることができるが、パナマ病の被害からの回復を助けることはできない。
【0066】
（総括）
ハイプロバイオチャーの４つの処理区は、ハタケ菌を用いた時と同様に、Ｆｏｃ ＴＲ４の感染を強く抑制することはできなかった。しかし、500g/植物体のハイプロバイオチャーは最も効果的な処理区であり、すべての観察項目で感染した植物体の発生率が最も低かった。 最終週には、この処理区で15％の感染が確認され、Ｆｏｃ ＴＲ４に対して最も効果的であることがわかった。この感染率は、250g、150g、50gの３つの低い割合のハイプロバイオチャー、およびハタケよりはるかに低いものであり、これらは、それぞれ23.33％、30％、47.5％の感染率を示し、根茎の導管組織の変色を示した。３つの低い割合のハイプロバイオチャーのもののうち、250g/植物体が、500g/植物体の最も高い割合に次いで、Ｆｏｃ ＴＲ４の防除に最良の処理区であった。
低い割合のハイプロバイオチャーの処理区では症状の発現が105.60日と102.67日と最も遅らせたが、さらなる感染から植物を守る能力は500g/植物体と250g/植物体の2つの高い割合のハイプロバイオチャーの処理区ほど良好ではなかった。150g/植物体と50g/植物体のハイプロバイオチャーはハタケと未処理の対照より病害の進行が遅かった。
500g/植物体のハイプロバイオチャーはＦｏｃ ＴＲ４の防除率が85.00%と最も高く、植物体当たり250g、150g、50gの３つの割合のハイプロバイオチャーより防除効果が優れていた。後者3つの処理区の防除効果は同等であったが、76.67％および70％のそれぞれの防除率は、1g/植物体のハタケに比べはるかに有利であった。
ハイプロバイオチャーの４つの処理区は、ハタケ菌を用いた時と同様に、Ｆｏｃ ＴＲ４の感染を強く抑制することはできなかった。しかし、500g/植物体のハイプロバイオチャーは最も効果的な処理区であり、すべての観察項目で感染した植物体の発生率が最も低かった。 最終週には、この処理区で15％の感染が確認され、Ｆｏｃ ＴＲ４に対して最も効果的であることがわかった。この感染率は、250g、150g、50gの３つの低い割合のハイプロバイオチャー、およびハタケよりはるかに低いものであり、これらは、それぞれ23.33％、30％、47.5％の感染率を示し、根茎の導管組織の変色を示した。３つの低い割合のハイプロバイオチャーのもののうち、250g/植物体が、500g/植物体の最も高い割合に次いで、Ｆｏｃ ＴＲ４の防除に最良の処理区であった。
低い割合のハイプロバイオチャーの処理区では症状の発現が105.60日と102.67日と最も遅らせたが、さらなる感染から植物を守る能力は500g/植物体と250g/植物体の2つの高い割合のハイプロバイオチャーの処理区ほど良好ではなかった。150g/植物体と50g/植物体のハイプロバイオチャーはハタケと未処理の対照より病害の進行が遅かった。
500g/植物体のハイプロバイオチャーはＦｏｃ ＴＲ４の防除率が85.00%と最も高く、植物体当たり250g、150g、50gの３つの割合のハイプロバイオチャーより防除効果が優れていた。後者3つの処理区の防除効果は同等であったが、76.67％および70％のそれぞれの防除率は、1g/植物体のハタケに比べはるかに有利であった。
【産業上の利用可能性】
【0067】
本発明の防除剤及び防除方法は、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体に対して拮抗作用を有するので、キャベンディッシュバナナの生産者において利用価値が極めて高い。
【要約】
【課題】
キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４に対して拮抗作用を有する防除剤、及び前記防除剤を用いた前記病原体の防除方法を提供する。
【解決手段】
ｐＨ７．５～９．５で粒度４～３０メッシュの多孔質担体に炭素率１５％以下で含水率が２５～３０重量部の有機物を２０～３０重量部用いて混練することにより自然発酵させた菌糸体肥料を含有するキャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４の防除剤を用い、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４の防除を行う。
【選択図】図７
キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４に対して拮抗作用を有する防除剤、及び前記防除剤を用いた前記病原体の防除方法を提供する。
【解決手段】
ｐＨ７．５～９．５で粒度４～３０メッシュの多孔質担体に炭素率１５％以下で含水率が２５～３０重量部の有機物を２０～３０重量部用いて混練することにより自然発酵させた菌糸体肥料を含有するキャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４の防除剤を用い、キャベンディッシュバナナのパナマ病の病原体Ｆｏｃ ＴＲ４の防除を行う。
【選択図】図７
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
