特許 7275016 スペクトル測定装置およびスペクトル測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-09

(45)【発行日】2023-05-17

(54)【発明の名称】スペクトル測定装置およびスペクトル測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20230510BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20230510BHJP

【ＦＩ】

G01N21/64 Z

C12M1/34 B

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2019223796

(22)【出願日】2019-12-11

(65)【公開番号】P2021092470

(43)【公開日】2021-06-17

【審査請求日】2022-09-22

(73)【特許権者】

【識別番号】000006666

【氏名又は名称】アズビル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001737

【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】長谷川 倫男

【審査官】伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１８－１８３０８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１０８５４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６３－０９４１３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５２９３４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１８－１８６７６４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２１／００ － Ｇ０１Ｎ ２１／７４

Ｃ１２Ｍ １／００ － Ｃ１２Ｍ １／４２

Ｃ１２Ｑ １／００ － Ｃ１２Ｑ １／７０

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － Ｇ０１Ｎ ３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

培地と細胞とを含む培養液を収容する空間を有する収容部と、
前記空間の第１の面に励起光を照射する光源装置と、
前記第１の面から生ずる蛍光を受光する受光装置と、
前記受光装置によって受光された蛍光をスペクトル解析する演算装置と、
を具備し、
前記空間内の、前記励起光が入射して前記励起光により蛍光が生ずる蛍光領域の前記第１の面からの深さは、前記蛍光領域内における内部遮蔽が所定のレベル以下となる値であり、
前記演算装置は、前記受光装置で得られた前記培養液の前記蛍光に関するスペクトルから前記培地の蛍光スペクトルを差し引くことで、前記細胞に関する蛍光スペクトルを計算する、
スペクトル測定装置。

【請求項2】

前記蛍光領域の前記第１の面からの深さは、前記細胞の直径の８倍以上１０倍以下のいずれかの値である、請求項１のスペクトル測定装置。

【請求項3】

前記蛍光領域の深さは、前記第１の面から前記第１の面と対向する第２の面までの距離よりも小さく、
前記光源装置と前記第１の面との間、および前記受光装置と前記第１の面との間に焦点調節機構を備えた、請求項１または２のスペクトル測定装置。

【請求項4】

前記第１の面から前記第１の面と対向する第２の面までの距離は、前記細胞の直径の８倍以上１０倍以下のいずれかの値である、請求項１または２のスペクトル測定装置。

【請求項5】

前記距離は、８０μｍ以上１００μｍ以下のいずれかの値である、請求項４のスペクトル測定装置。

【請求項6】

前記受光装置で得られたスペクトルは、前記培養液に関する複数の蛍光波長ごとの蛍光強度を含み、
前記培地のスペクトルは、前記培地に関する前記複数の蛍光波長ごとの蛍光強度を含み、
前記細胞に関するスペクトルは、前記複数の蛍光波長ごとに、前記培養液に関する蛍光強度から前記培地に関する蛍光強度を引いた値である、
請求項１ないし請求項５のいずれか１項のスペクトル測定装置。

【請求項7】

培地と細胞とを含む培養液において、前記細胞の蛍光スペクトルを測定する方法であって、
第１の面を有する空間に前記培養液を収容する工程、
前記第１の面に励起光を照射する工程、
前記第１の面から生ずる蛍光を受光し、前記培養液の蛍光スペクトルを得る工程、および
前記培養液の蛍光スペクトルから、前記培地の蛍光スペクトルを差し引くことで、前記細胞の蛍光スペクトルを算出する工程
を含み、
前記空間内の、前記励起光が入射して前記励起光により蛍光が生ずる蛍光領域の前記第１の面からの深さは、前記蛍光領域内における内部遮蔽が所定のレベル以下となる値である、
スペクトル測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞の蛍光スペクトルを測定するスペクトル測定装置およびスペクトル測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

バイオプロセスにおける細胞の代謝状態を良好に維持するために、サンプリングによる培養液の成分などの分析により細胞の代謝状態を測定する方法がある。

【0003】

また、インラインで培養液のラマンスペクトル、近赤外スペクトル、または蛍光スペクトルの測定を行うプロセス管理方法がある。このプロセス管理方法では、スペクトルの変化などを細胞の代謝状態に回帰させて、培養条件の制御を行う。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Walter Beyeler et al.、「On-line measurements of culture fluorescence:Method and application」、European journal of applied microbiology and biotechnology、September 1981、Volume 13、Issue 1、pp 10-14

【文献】Saskia M. Faassen and Bernd Hitzmann、「Fluorescence Spectroscopy and Chemometric Modeling for Bioprocess Monitoring」、Sensors 2015、15、10271－10291

【文献】「高濃度試料（オリーブオイル）の測定 ３次元蛍光スペクトル」、日立ハイテクノロジーズ、［令和１年１１月１２日検索］＜URL: https://www.hitachi-hightech.com/file/hhs/pdf/products/apli/ana/fl/fl130002.pdf＞

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記のサンプリングによる測定方法では、サンプリング時のコンタミネーションのリスクがあり、かつ測定結果を得るまでに時間がかかる。また、人による作業を必要とするため、作業労力の軽減が困難である。

【0006】

また、上記のサンプリングによる測定方法およびプロセス管理方法のいずれであっても、得られる結果は基本的に培地と細胞とを含む培養液全体の結果であり、細胞からの直接の結果ではない。例えば、培養液中でグルコースのような炭素源を細胞の育成に十分な濃度に保ったとしても、細胞が炭素源をエネルギーとして利用したか否かの確証を得ることが困難である。したがって、培養液から得られる間接的な指標ではなく、細胞の代謝状態を直接測定したいという要望は強い。

【0007】

一方で、可視光域の細胞の自家蛍光は、主にＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）またはフラビンによるものであり、炭素代謝または酸素呼吸と密接に関係している。したがって、細胞の自家蛍光を測定することにより、細胞の代謝状態を把握することが可能である。

【0008】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、バイオプロセスにおいて、細胞に由来する蛍光スペクトルを正確に測定するスペクトル測定装置およびスペクトル測定方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明に係るスペクトル測定装置は、培地と細胞とを含む培養液を収容する空間を有する収容部と、空間の第１の面に励起光を照射する光源装置と、第１の面から生ずる蛍光を受光する受光装置と、受光装置によって受光された蛍光をスペクトル解析する演算装置とを具備する。空間内の、励起光が入射して励起光により蛍光が生ずる蛍光領域の第１の面からの深さは、蛍光領域内における内部遮蔽が所定のレベル以下となる値である。また、演算装置は、受光装置で得られた培養液の蛍光に関するスペクトルから培地の蛍光スペクトルを差し引くことで、細胞に関する蛍光スペクトルを計算する。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、細胞に由来する蛍光スペクトルを測定し、細胞の代謝状態を示す精度のよい情報を取得することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、実施形態のスペクトル測定方法を示すフローチャートである。

【図2】図２は、実施形態の収容部の使用時の様子を示す斜視図および断面図である。

【図3】図３は、実施形態の収容部の内部空間の使用時の様子を示す斜視図および断面図である。

【図4】図４は、実施形態のスペクトル測定方法によって得られる蛍光スペクトルの一例を示すグラフである。

【図5】図５は、実施形態のスペクトル測定方法によって得られる蛍光スペクトルの一例を示すグラフである。

【図6】図６は、実施形態のスペクトル測定方法を示すフローチャートである。

【図7】図７は、実施形態のスペクトル測定装置を示すブロック図である。

【図8】図８は、実施形態の収容部の内部空間の使用時の様子を示す斜視図および断面図である。

【図9】図９は、実施例１の結果を示す蛍光スペクトルである。

【図10】図１０は、比較例１の結果を示す蛍光スペクトルである。

【図11】図１１は、実施例２の結果を示す顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、図面を参照しながら各実施形態について説明する。以下の説明において、略または実質的に同一の機能および構成要素については、同一符号を付し、説明を省略するか、または、必要に応じて説明を行う。

【0013】

（第１の実施形態）
・スペクトル測定方法
第１実施形態に従うスペクトル測定方法は、培地と細胞とを含む培養液において、細胞の蛍光スペクトルを測定する方法である。

【0014】

本明細書において「細胞」とは、限定されるものではないが、ヒトまたはチンパンジーなどの霊長類、あるいはマウス、ラット、モルモットまたはハムスターなどの齧歯類などの哺乳動物由来の細胞であることが好ましい。特に、細胞はＣＨＯ細胞であることが好ましい。他には、ＮＳ０細胞またはＳｐ１／２細胞などのマウス骨髄腫細胞など、物質生産に一般的に使用されている細胞であることが好ましい。細胞は、上記に限定されるものではなく、植物細胞、細菌、酵母または菌類などであってもよい。

【0015】

本明細書において「培地」は、流動性のある培地、例えば、液体培地である。培地の種類は、用いられる細胞の種類に応じて選択される細胞の生存および増殖に適切な組成を有するものであればよく、限定されるものではない。培地は、例えば、アミノ酸、ビタミン、糖質および／または塩類などの栄養分を含む。培地は、細胞の足場としてゲルなどを含んでもよい。培地は、限定されるものではないが、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２培地またはＲＰＭＩ１６４０培地、あるいはこれらの培地を改変したものなどを用いることができる。細胞がＣＨＯ細胞である場合、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などの無血清合成培地を用いることが好ましい。培地は、フェノールレッドなどの自家蛍光を生じる色素を含むものであってもよい。

【0016】

本明細書において「培養液」とは、培地と細胞とを含むものをいう。培養液は、例えば、培地に細胞を添加し、培養を行っている途中のものであってもよいし、単に培地と細胞とを混合したものであってもよい。

【0017】

実施形態に従うスペクトル測定方法は、図１に示すように、次の工程を含む：
培養液を第１の面を有する空間に収容する工程（Ｓ１）、
第１の面に励起光を照射する工程（Ｓ２）、
第１の面から生ずる蛍光を受光し、培養液の蛍光スペクトルを得る工程（Ｓ３）、および
培養液の蛍光スペクトルから、培地の蛍光スペクトルを差し引くことで、細胞の蛍光スペクトルを算出する工程（Ｓ４）。

【0018】

以下、第１実施形態のスペクトル測定方法の一例について詳細に説明する。

【0019】

まず、第１の面を有する空間を備える収容部（容器）を用意する。図２の（ａ）は収容部１の一例の斜視図を示す。図２の（ｂ）は、図２の（ａ）のＢ－Ｂ’に沿って切断した断面図である。収容部１は、例えば、角筒状の容器であり、薄い板状の直方体の内部空間１ａを有する。以下、内部空間１ａを単に空間１ａとも称する。

【0020】

空間１ａは、最も広い面積を有する第１の面２、および第１の面２に対向する第２の面３を有する。収容部１は、４つ側壁部、即ち、第１の面２側に備えられる第１側壁部４と、第２の面３側に備えられる第２側壁部５と、第１側壁部４と第２側壁部５とに直角に隣接する、第３側壁部６および第４側壁部７と、天面部８と、底面部９とを備える。即ち、「第１の面２」とは第１側壁部４の内側面でもあり、「第２の面３」とは収容部１の第２側壁部５の内側面でもある。

【0021】

収容部１の使用時、空間１ａには培地１０および細胞１１を含む培養液１２が収容される。天面部８には、例えば、空間１ａに培養液１２を流入させる第１流路１３が設けられている。第１流路１３は、例えば、細胞１１の培養を行っている培養槽と連通している。底面部９には、例えば、収容部１から培養液１２を排出する第２流路１４が設けられている。例えば、第２流路１４もまた培養槽と連通している。

【0022】

詳しくは後述するが、第１側壁部４を介して第１の面２に励起光を照射することにより、培養液１２の蛍光スペクトルを得る。したがって、少なくとも第１側壁部４は、光透過性の材料からなる。光透過性の材料は、例えば石英ガラスなどである。

【0023】

第２側壁部５、第３側壁部６、第４側壁部７、天面部８および底面部９の材料および厚さは、第１側壁部４と同様であってもよい。または、容器に適した異なる材料や厚さであってもよい。

【0024】

第１の面２の長軸方向および短軸方向の長さは限定されるものではなく、励起光が照射される領域よりも第１の面２が大きくなる長さであればよい。

【0025】

第１の面２と第２の面３との間の距離Ｄ１は、内部遮蔽を所定のレベル以下とすることができる範囲に設定される。内部遮蔽とは、励起光Ｅｘが細胞１１に当たって散乱し、励起光Ｅｘが弱まり、それに伴って生じる蛍光Ｅｍの強度も弱まることをいう。「所定のレベル以下」とは、内部遮蔽による蛍光強度の低減率、即ち、遮蔽量が無視できる程度に低い範囲であることをいう。

【0026】

内部遮蔽を所定がレベル以下となる距離Ｄ１は、細胞や培地の種類などに応じて変化するため限定されるものではなく、予備的な実験結果を元に決定することができる。

【0027】

例えば距離Ｄ１は、細胞１１の直径の約１０倍以下であることが好ましい。細胞１１の直径とは、細胞１１を球状と仮定したときの直径であればよく、例えば、細胞１１の長径と短径の平均値であってもよい。細胞１１の直径は、例えば用いられる細胞集団全体の平均値であってもよい。細胞１１の直径は、例えば、フローサイトメトリー、または顕微鏡画像解析などにより測定することができる。または細胞１１の直径に関する過去の知見を使用してもよい。

【0028】

距離Ｄ１の下限値は、収容部１の空間１ａ内に細胞１１が入り込むことができる値であればよいが、例えば、細胞１１の直径の約８倍とすることが好ましい。

【0029】

距離Ｄ１の長さは、限定されるものではないが、例えば、１００μｍ以下とすることが好ましく、８０μｍ以上１００μｍ以下の範囲とすることが更に好ましい。

【0030】

上記のような収容部１を用意した後、例えば、培養槽から第１流路１３を介して培養液１２を送液することによって収容部１内に培養液１２を収容し（工程（Ｓ１））、第１の面２に励起光Ｅｘを照射する（工程（Ｓ２））。

【0031】

工程（Ｓ２）について図３を用いて説明する。図３の（ａ）は、収容部１の内部空間１ａを示す斜視図であり、収容部１の第１側壁部４、第２側壁部５、第３側壁部６、第４側壁部７、天面部８、底面部９、第１流路１３および第２流路１４を省略している。図３の（ｂ）は、図３の（ａ）のＢ－Ｂ’に沿って切断した断面図である。なお、図３の（ａ）では、光源装置１５、受光装置１７を省略している。

【0032】

工程（Ｓ２）においては、例えば、光源装置１５を用いて励起光Ｅｘが第１の面２に対して照射される。光源装置１５は、例えば、ＬＥＤライトなどの光源を備える。光源装置１５は、例えば、励起光Ｅｘの波長を変更するフィルタを備えてもよい。

【0033】

励起光Ｅｘの照射によって、励起光Ｅｘが当たった培養液１２の培地１０および細胞１１中の蛍光物質が励起されて蛍光Ｅｍが生じる。蛍光Ｅｍは、励起光Ｅｘの入射角によらず全方向に発せられ得る。蛍光Ｅｍは、蛍光Ｅｍを受光できる位置に配置された受光装置１７によって受光される。受光装置１７は、励起光Ｅｘが入射角と対称な角度で反射して生じる反射光が検出されるのを避ける位置に配置されることが好ましい。例えば、第１の面２に対して励起光Ｅｘの入射角を６０°に設定し、受光装置を３０°の位置に配置することなどにより反射光が検出されるのを防止することができる。励起光Ｅｘは、例えば図示しない第１側壁部４を介して照射されるが、第１側壁部４を介した場合に上記の入射角が得られるように照射の角度が調節され得る。あるいは、第１側壁部４の厚さを励起光Ｅｘの入射角に実質的に影響がない程度に薄くしてもよい。

【0034】

距離Ｄ１が細胞１１の直径の約８倍以上約１０倍以下に設定されていることによって、空間１ａ内の、励起光Ｅｘが入射して蛍光Ｅｍが生じる領域（以下、「蛍光領域１６」と称する）の深さを細胞１１の直径の約８倍以上約１０倍以下とすることができる。ここで、蛍光領域１６は、第１の面２の励起光Ｅｘが当たった略円状の領域を底面１６ａとし、励起光Ｅｘが届く範囲の深さ（この例においては距離Ｄ１）を高さとする円柱状の三次元的領域である。ここで、「深さ」とは、第１の面２と垂直に第２の面３へ向かう方向における、第１の面２からの距離をいう。

【0035】

蛍光領域１６の底面１６ａの大きさは、細胞１１が蛍光領域１６内に存在できる大きさに設定され、細胞１１の濃度、培地１０と細胞１１との蛍光強度差などに応じて決定される。底面１６ａの位置は、第１の面２上の何れかの位置であればよいが、第１の面２の端と重ならないように中ほどとすることが好ましい。

【0036】

例えば、工程（Ｓ２）において、波長３００ｎｍ～５００ｎｍの範囲の異なる励起光Ｅｘを照射し、工程（Ｓ３）においては波長ごとに蛍光Ｅｍを受光することが好ましい。または、一定の励起光Ｅｘで受光を行ってもよい。受光装置１７例えば、一般的な蛍光センサなどであればよい。受光装置１７は、例えば受光した蛍光Ｅｍの波長および強度を検出することができる。

【0037】

このようにして得られた蛍光Ｅｍの波長および強度（受光データ）から、培養液１２の蛍光スペクトルを作成する。一定の励起光Ｅｘ波長における蛍光スペクトルの一例を図４の（ａ）に示す。このグラフの縦軸は蛍光Ｅｍの強度であり、横軸は蛍光Ｅｍの波長であり、複数の蛍光Ｅｍ波長ごとの蛍光Ｅｍ強度を示している。このグラフは培養液１２全体の蛍光スペクトルを示すものであり、培地１０に関する蛍光スペクトルと、細胞１１に関する蛍光スペクトルとが混在したものである。

【0038】

次に、培養液１２の蛍光スペクトル（図４の（ａ））から、培地１０の蛍光スペクトル（図４の（ｂ））を差し引き、細胞１１の蛍光スぺクトル（図４の（ｃ））を得る（工程（Ｓ４））。例えば、細胞１１の蛍光スペクトルは、複数の蛍光Ｅｍ波長ごとに、培養液１２に関する蛍光Ｅｍ強度から培地１０に関する蛍光Ｅｍ強度を引いた値である。

【0039】

培地１０の蛍光スペクトルは、予め測定されたものであり、例えば、細胞１１を含まない培地１０を同じ収容部１に収容し、上記工程（Ｓ２）と同様に励起光Ｅｘを照射し、同じ受光装置１７を用いて得られた蛍光Ｅｍの波長および強度を測定することにより得ることができる。

【0040】

工程（Ｓ３）および（Ｓ４）においては、複数の励起光Ｅｘにおける蛍光Ｅｍ波長および強度の結果を含む蛍光スペクトルを作成して用いてもよい。このような蛍光スペクトルは、励起光Ｅｘ波長、蛍光Ｅｍ波長、および蛍光強度を三次元のグラフで示すものであってもよい。例えば、図５に示すように、縦軸を励起光Ｅｘ波長とし、横軸を蛍光Ｅｍ波長とし、蛍光強度を等高線または色で示したものであってもよい。

【0041】

以上の工程により、培地１０のスペクトルを除いた細胞１１のスペクトルを得ることができる。

【0042】

上記の方法に使用した培養液１２は、第２流路１４を介して再び培養槽に戻すことが可能である。

【0043】

実施形態のスペクトル測定方法によれば、培地１０のスペクトルを除いた細胞１１のスペクトルを正確に得ることができる。特に、本方法によれば、たとえ色素を含む培地を用いたとしても正確に細胞１１のスペクトルを得ることができる。その理由の一つについて、以下に説明する。

【0044】

従来の測定方法では、特に色素を含む培地を用いる場合など、細胞の蛍光が相対的に弱い場合には細胞のスペクトルが培地のスペクトルに埋もれ、培養液の蛍光スペクトルから培地の蛍光スペクトルを差し引くと細胞の蛍光スペクトルがマイナスとなり、正しい細胞の蛍光スペクトルを得られない場合があった。また、培養液内に細胞のような粒子が存在する場合など内部遮蔽が生じやすい場合においても、内部遮蔽により正しい細胞のスペクトルを得られない場合があった。内部遮蔽を避けるために表面測定法を用いた場合であっても、励起光が深く入り込み、特に粒子が存在するサンプルにおいては内部遮蔽が結果に大きな影響を及ぼす場合があった。

【0045】

内部遮蔽の影響が大きい場合、以下の式（１）および（２）に示すように、細胞の蛍光は、細胞密度に依存する遮蔽量と、細胞の蛍光強度との２つのパラメータに依存するため、定量的な取り扱いが困難である。

【0046】

Ｉ_ｃｅｌｌ＝Ｉ_ｓｕｓ（Ｅｘ）－Ｉ_{ｂｒｏｔｈ}（Ｅｘ） …（１）
Ｅｘ＝Ｅｘ_０×Ｂ …（２）
ここで、Ｉ_ｃｅｌｌは細胞の蛍光であり、Ｉ_ｓｕｓ（Ｅｘ）は励起光強度Ｅｘにおける培養液の蛍光であり、Ｉ_{ｂｒｏｔｈ}（Ｅｘ）は励起光強度Ｅｘにおける培地の蛍光であり、Ｅｘは細胞による遮蔽後の励起光強度であり、Ｅｘ_０は照射した励起光強度であり、Ｂは遮蔽量である。

【0047】

しかしながら、第１の実施形態に係る方法においては、蛍光領域１６の深さが従来よりも薄く設定されている。それにより蛍光領域１６に入る細胞数、細胞密度をより少なく制限することができ、内部遮蔽を細胞１１の蛍光に影響しないレベルまで弱めることができる。その結果、上記式（２）を考慮する必要が無く、式（１）で細胞１１由来の蛍光を抽出することができる。

【0048】

また、実施形態の方法によれば蛍光領域１６に入る培地１０の量もより少なく制限することができ、培地１０からの蛍光を減らすことができる。それによって細胞１１の蛍光が培地１０の蛍光に埋もれることを防止することができる。

【0049】

また、実施形態に係る収容部１を用いれば、細胞培養装置から培養液をサンプリングすることなく、インラインで細胞の蛍光スペクトルを得ることができる。それにより、サンプリングの手間が削減され、またコンタミネーションが防止される。加えて分析を行った培養液を培養槽に戻せば培養液のロスも最小限にすることができる。

【0050】

更なる実施形態においては、スペクトル測定方法は、図６に示すように、工程（Ｓ４）で得られた細胞１１の蛍光スぺクトルから、細胞１１の代謝状態を決定する工程（Ｓ５）を更に含んでもよい。細胞１１の代謝状態は、例えば、次のように決定することができる。

【0051】

細胞１１の蛍光スペクトルは、例えば、細胞１１のエネルギー生産（酸素呼吸、炭素代謝）に用いられるＮＡＤＨまたはフラビンなどに主に由来する細胞１１の自家蛍光のスペクトルを表す。したがって、例えば、蛍光スペクトルから励起光Ｅｘおよび蛍光Ｅｍのピーク波長などの情報を細胞１１の代謝状態と結びつけることができる。例えば、ピーク波長に閾値を設け、閾値以下の時は壊死状態、閾値以上の時は生存状態などと判定することなどが可能である。

【0052】

工程（Ｓ１）～（Ｓ４）によれば、細胞に由来する蛍光スペクトルを正確に測定し、細胞の代謝状態を示す精度のよい情報を取得することができるため、工程（Ｓ５）の細胞の代謝状態をより精度よく判定することができる。

【0053】

更に、細胞培養において、上記の方法で得られた細胞１１の蛍光スペクトルおよび／または細胞の代謝状態に基づいて、培養槽の温度、ｐＨ、栄養量、溶存酸素量などを変更することにより、細胞１１の代謝状態を良好な状態で維持することが可能である。例えば、細胞１１を用いて物質生産を行う場合は、効率的な物質生産を安定して行うことが可能である。

【0054】

更なる実施形態においては第１の面２および第２の面３は、平面でなくともよい。例えば、収容部１は管状の流路などの形状の容器であってもよい。その場合、流路の直径が上記蛍光領域１６の深さと同様に設定されていてもよい。

【0055】

更なる実施形態においては、収容部１は、培養槽と連通せず、培養装置と別体として提供されてもよい。その場合、培養槽から培養液１２をピペットやシリンジなどを用いて一部採取し、収容部１に収容して上記方法を行うことも可能である。

【0056】

・スペクトル測定装置
第１の実施形態に係るスペクトル測定装置は、定量的な取り扱いを容易にする。以下で、第１の実施形態に係るスペクトル測定装置を具体的に説明する。

【0057】

図７は、第１の実施形態に係るスペクトル測定装置１００の構成の一例を示すブロック図である。

【0058】

スペクトル測定装置１００は、培養槽１０１、送液部１０２、送液制御部１０３、光源部１０４、光源制御部１０５、測定部１０６、受光部１０７、記憶部１０８、演算装置１０９、表示部１１０、出力部１１１および培養コントローラ１１２を具備する。

【0059】

培養槽１０１は、培養対象の細胞１１と培地１０とを含む培養液１２を内部に蓄え、そこで細胞１１の培養が行われている。培養槽１０１は、例えば、通気、攪拌、各種材料の継ぎ足しなどの機能を備える。また、培養槽１０１内には、温度センサ、ｐＨセンサおよび溶存酸素センサなどの槽内の環境条件を検知するセンサ、また、培養槽１０１に試薬（例えば、消泡剤、ｐＨ調整剤など）を添加する試薬ポッドなどが備えられている。

【0060】

送液部１０２は、培養槽１０１から、例えば流路を介して測定部１０６へ培養液１２を送る。

【0061】

送液制御部１０３は、送液部１０２による培養液１２の送液を制御する。

【0062】

測定部１０６は、収容部１を備える。収容部１は、上記の何れかのものである。測定部１０６は、例えば測定対象の培養液１２を、培養槽１０１から送液部１０２経由で受け、収容部１に収容する。

【0063】

光源部１０４は、異なる波長の励起光Ｅｘを照射できる光源装置１５を備え、光源装置１５から測定部１０６に対して励起光を照射する。

【0064】

光源制御部１０５は、光源部１０４による励起光の照射を制御する。

【0065】

受光部１０７は、測定部１０６の収容部１から生じる蛍光を受光する受光装置１７を含む。受光部１０７は、受光結果を示す受光データ１１３を記憶部１０８に記憶させる。

【0066】

記憶部１０８は、例えば不揮発性の記憶デバイスである。

【0067】

記憶部１０８は、上記の受光データ１１３を記憶する。

【0068】

記憶部１０８は、演算装置１０９によって生成された測定データ１１４を記憶する。測定データ１１４は、受光データ１１３に対してスペクトル解析を実行した結果を含み、具体的には、波長ごとの測定された蛍光スペクトルを含む。

【0069】

記憶部１０８は、培地のスペクトルを含む培地データ１１５をあらかじめ記憶している。培地データ１１５は、波長ごとの培地の蛍光スペクトルを含む。

【0070】

記憶部１０８は、後述のように演算装置１０９によって生成された結果データ１１６を記憶する。この結果データ１１６は、波長ごとの細胞の蛍光スペクトルを含む。

【0071】

演算装置１０９は、記憶部１０８から受光データ１１３を読み出し、受光データ１１３に対するスペクトル解析を実行する。演算装置１０９は、スペクトル解析により、波長ごとの測定された蛍光スペクトルを求め、波長ごとの測定された蛍光スペクトルを含む測定データ１１４を生成し、測定データ１１４を記憶部１０８に記憶させる。

【0072】

演算装置１０９は、記憶部１０８に記憶されている培地データ１１５と測定データ１１４とに基づいて、細胞の蛍光スペクトルの解析結果である結果データ１１６を計算する。より具体的には、演算装置１０９は、波長ごとに、測定された蛍光スペクトルから培地の蛍光スペクトルを引き算し、波長ごとの細胞の蛍光スペクトルを計算し、結果データ１１６を生成する。そして、計算部は、結果データ１１６を記憶部１０８に記憶する。

【0073】

また、演算装置１０９は、記憶部１０８に記憶されている各種のデータに関する表示制御、出力制御を実行する。

【0074】

表示部１１０は、演算装置１０９による制御にしたがって、各種データを表示する。

【0075】

出力部１１１は、演算装置１０９による制御にしたがって、各種データまたは制御信号を培養コントローラ１１２へ出力する。

【0076】

培養コントローラ１１２は、出力部１１１から受けた各種データ（特に、結果データ１１６）または制御信号に基づいて、培養槽１０１の通気、攪拌、各種材料の継ぎ足し、バルブの開閉などの制御を実行する。

【0077】

上記のようなスペクトル測定装置によって生成された結果データ１１６は、バイオプロセスにおける細胞の代謝状態の把握とプロセス制御とに使用することができる。

【0078】

更なる実施形態においては、演算装置１０９で、結果データ１１６から細胞１１の代謝状態を判定して結果を記憶部に格納し、代謝状態の結果に基づいて培養コントローラ１１２による培養槽１０１の制御を行ってもよい。細胞１１の代謝状態は、表示部１１０に表示されてもよい。

【0079】

（第２の実施形態）
第２の実施形態について図８の（ａ）、および図８の（ａ）のＢ－Ｂ’に沿って切断した断面図である図８の（ｂ）を用いて説明する。第２の実施形態において用いられる収容部は、第１の面２と第２の面３との距離Ｄ２が内部遮蔽が所定のレベル以下となる長さを超える空間１０ａを有する。

【0080】

このような収容部を用いた場合、工程（Ｓ２）で空間１ａの第１の面２から内部遮蔽が所定のレベル以下となる深さまでの領域内の蛍光Ｅｍを検出するように、励起光Ｅｘおよび受光装置１７の焦点深度を調整することで、蛍光領域１６の深さ（距離Ｄ３）を内部遮蔽が所定のレベル以下となるように設定することができる。それによって、内部遮蔽効果を得ることができる。

【0081】

例えば、それは上記深さの蛍光領域１６内で励起光Ｅｘの焦点が結ばれるように焦点深度を調節することによって実行することができる。焦点深度は、例えば、第１の面２と光源装置１５との間に備えられた第１の焦点調節機構により調節できる。例えば、第１の焦点調節機構は、例えば、図８の（ｂ）に示すようなピンホール１８ａを設けた板１９ａである。例えば、板１９の光源装置１５からの位置またはピンホール１８ａの大きさなどを変更することによって焦点深度を調節することができる。

【0082】

また、受光装置１７と第１の面２との間にもピンホール１８ｂを設けた板１９ｂの第２の焦点調節機構を配置することが好ましい。受光装置１７側に第２の焦点調節機構を配置することによって、所望の焦点深度における焦点平面から発する蛍光Ｅｍを検出することができ、且つ望まれない深度から発する蛍光Ｅｍの検出を防止することが可能である。

【0083】

距離Ｄ３は、細胞１１の直径の８倍以上１０倍以下の範囲の何れかの値であることが好ましい。また、距離Ｄ３は好ましくは１００μｍ以下であり、８０μｍ以上１００μｍ以下の範囲のいずれかの値とすることがより好ましい。

【0084】

工程（Ｓ１）、工程（Ｓ３）および工程（Ｓ４）、ならびに必要に応じて工程（Ｓ５）は、第１実施形態と同様に行うことができる。また、第２の実施形態の方法は、スペクトル測定装置を用いて行うことができる。この例におけるスペクトル測定装置は、収容部の第１の面２と第２の面３との距離が内部遮蔽が所定のレベル以下となる長さを超えること、焦点調節機構を備えること、光源制御部１０５が励起光および蛍光受光装置の焦点深度を制御することができることなどを除いて、第１実施形態と同様である。

【0085】

第２の実施形態によれば、第１の面２と第２の面３との距離が内部遮蔽が所定のレベル以下となる長さを超える容器を用いた場合も、内部遮蔽を防止して、細胞のスペクトルを正確に測定することができる。

【0086】

なお、第１実施形態においても蛍光領域１６内で蛍光受光装置の焦点が結ばれるように焦点深度を調節してもよい。

【0087】

［例］
以下に、実施形態のスペクトル測定方法を用いた例について説明する。

【0088】

（実施例１）
実施例１は、第１実施形態の収容部を用いて酵母の蛍光スペクトルを得た例を示す。乾燥パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、平均直径約１０μｍ）を純水を用いて一回遠心して洗浄した後、培地または純水に懸濁し培養液を調製した。セルカウンター（商品名：ＴＣ－２０、バイオラッド・ラボラトリーズ製）で粒子数を測定し、酵母が同じ密度で含まれるように調整した。懸濁液を幅１００μｍの厚みのチャンバーを備えるセルカウンター用スライドのチャンバー内に収容して、蛍光分光光度計（商品名：ＦＰ８５００、日本分光製）で表面測光を行い、蛍光スペクトルを得た。励起光Ｅｘは、半径約２ｍｍの略円状でチャンバー表面に照射された。また、培地のみの蛍光スペクトルを上記と同様に測定した。

【0089】

得られた蛍光スペクトルを、培地のみの蛍光スペクトルから差し引いた。結果を図９に示す。図９に示すグラフの縦軸は励起光Ｅｘの波長、横軸は鰓得た蛍光Ｅｍの波長を示す。図９（ａ）は、培養液の蛍光スペクトルを示す。図９の（ｂ）は、培養液の蛍光スペクトルから、培地の蛍光スペクトルを差し引いた細胞の蛍光スペクトルを示す。

【0090】

図９（ｂ）において、細胞の自家蛍光のピーク波長を示す、励起光３４０ｎｍ、蛍光４６０ｎｍの位置において、７０～８０程度の強度の蛍光が観察された。この強度は、酵母を純水に懸濁した場合の蛍光とほぼ一致する位置に蛍光ピークがあり、正確に細胞の蛍光スペクトルが得られたことが明らかとなった。

【0091】

（比較例１）
厚みが３ｍｍであるチャンバーを用いて実施例１と同様の方法で培養液の蛍光スペクトルを得て、そこから培地の蛍光スペクトルを差し引いた。結果を図１０に示す。細胞の自家蛍光のピーク波長を示す、励起光３４０ｎｍ、蛍光４６０ｎｍの位置において、－５０程度の強度の蛍光が観察された。この結果は、細胞よりも培地の蛍光強度が大きく、細胞の蛍光スペクトルが埋もれて正確に測定できなかったことを示す。

【0092】

（実施例２）
実施例２は、第１実施形態の収容部（流路）を用いて酵母の蛍光スペクトルを得た例を示す。上記酵母を培地に懸濁し、８０μｍの厚みの流路に流し、顕微鏡で撮影した。顕微鏡写真を図１１に示す。図１１に示される通り、酵母が培地の蛍光に埋もれず、明確に観察することができた。

【符号の説明】

【0093】

１…収容部、１ａ、１０ａ…空間、２…第１の面、３…第２の面、
１０…培地、１１…細胞、１２…培養液、１５…光源装置、
１６…蛍光領域、１７…受光装置、
１００…スペクトル測定装置、１０１…培養槽、１０９…演算装置
Ｅｘ…励起光、Ｅｍ…蛍光

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】