知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ビー−モーゲン・バイオテクノロジーズ，インコーポレーテッドの特許一覧
特許7275043増大したｈＡＴファミリートランスポゾン媒介遺伝子導入ならびに関連する組成物、システムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-09
(45)【発行日】2023-05-17
(54)【発明の名称】増大したｈＡＴファミリートランスポゾン媒介遺伝子導入ならびに関連する組成物、システムおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20230510BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230510BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20230510BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230510BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230510BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230510BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230510BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230510BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230510BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230510BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N15/62 Z
C12N9/12
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12N15/09 100
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2019554474
(86)(22)【出願日】2017-12-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-23
(86)【国際出願番号】 US2017066829
(87)【国際公開番号】W WO2018112415
(87)【国際公開日】2018-06-21
【審査請求日】2020-12-15
(31)【優先権主張番号】62/435,522
(32)【優先日】2016-12-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519216002
【氏名又は名称】ビー－モーゲン・バイオテクノロジーズ，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【氏名又は名称】中西 基晴
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】ラルガエスパーダ，デービッド
(72)【発明者】
【氏名】モリアリティ，ブランデン
(72)【発明者】
【氏名】ウェバー，ビュー
(72)【発明者】
【氏名】オットー，ニール
(72)【発明者】
【氏名】クマール，サンディープ
(72)【発明者】
【氏名】ホグダル，リア
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００６／０２５２１４０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Xianghong Li et al.，A resurrected mammalian hAT transposable element and a closely related insect element are highly active in human cell culture. ，PNAS， 110 (6) ，2013年，E478-E487
【文献】Database GenBank［online］，2007年12月31日，〈https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABF20545.1/〉，Accession No. ABF20545.1, Definition: transposase [Triboliumcastaneum]
【文献】Database GenBank［online］, Accession No. ABF20545.1 〈https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABF20545.1/〉 31-Dec-2007 uploaded, Definition: transposase [Triboliumcastaneum]，2007年12月31日
【文献】Definition: transposase [Triboliumcastaneum]，Database GenBank［online］，2007年12月31日，〈https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABF20545.1/〉，Accession No. ABF20545.1
【文献】Xianghong Li et al.，A resurrected mammalian hAT transposable element and a closely related insect element are highly active in human cell culture，PNAS，110(6)，2013年，E478-R487
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／５４
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ｃ１２Ｎ ９／１２
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
全長の配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ配列番号１に従って番号付けした場合、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ、Ｅ５７８Ｌ、Ｉ４５２Ｆ、Ｎ８５Ｓ、およびＡ３５８Ｋから選択される２つ以上のアミノ酸置換の組合せを含む、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、前記置換の組合せは、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａ;
Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌ;
Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａ;
Ｎ８５Ｓ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａ;
Ｎ８５Ｓ、Ｖ３７７Ｔ、およびＥ４６９Ｋ；
Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａ; および
Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ、およびＥ５７８Ｌ
から選択される、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項2】
配列番号１の野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列と比較して少なくとも２個そして最大で２５個のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項3】
配列番号１の野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列と比較して少なくとも５個のアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項4】
配列番号１に従って番号付けした場合、Ｎ８５Ｓ、Ｄ９９Ａ、Ｅ２４７Ｋから選択されるアミノ酸置換、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項5】
請求項１～４のいずれかに記載のＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼ。
【請求項6】
請求項５に記載のＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列を含む融合トランスポザーゼであって、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶ Ｒｅｐ ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含むＤＮＡ配列特異的結合ドメインから選択される、融合トランスポザーゼ。
【請求項7】
ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項５または請求項６に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項8】
ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、リンカーによって分離されている、請求項５～７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼであって、リンカーは、少なくとも３個のアミノ酸を含む、融合トランスポザーゼ。
【請求項9】
リンカーが配列番号９を含む、請求項８に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項10】
請求項１～４のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、または請求項５～９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドであって、ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項11】
化学的に修飾されたｍＲＮＡを含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
請求項１～４のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは請求項５～９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼを産生する細胞であって、請求項１０または請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
【請求項13】
請求項１～４のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは請求項５～９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを、インビトロまたは生体外で細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項14】
請求項１３に記載の方法であって、導入する工程が、細胞を、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと接触させること、そして、細胞を、トランスポゾンを含有するＤＮＡベクターと接触させることを含み、トランスポゾンは２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含み、
- ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号３または配列番号５を有する配列を含む；または
- ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号４または配列番号６を有する配列を含む、方法。
【請求項15】
カーゴカセットが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
導入する工程が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを利用して細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法であって、細胞が、対象から単離された細胞であり、細胞は、－胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせから選択される幹細胞、または人工多能性幹細胞を含む；または
－ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、ＣＤ３＋細胞であってもよい、初代白血球または初代Ｔ細胞を含む、そして、
カーゴカセットを含むトランスポゾンは導入遺伝子を含む、
方法。
【請求項18】
導入遺伝子が、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードし、ここで細胞受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
細胞が対象の血液から単離されたものである、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【0001】
相互参照 [0001]本出願は、２０１６年１２月１６日に出願された米国仮出願第６２／４３５，５２２号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
[0002]トランスポゾンとも呼ばれる転位遺伝エレメントは、単一細胞内のあるゲノム位置から別のゲノム位置へ動員することができるＤＮＡのセグメントである。トランスポゾンは、それらの転位メカニズムに従って２つの主要な群に分けることができる：転位は、（１）レトロトランスポゾンと呼ばれるエレメントに対するＲＮＡ中間体の逆転写を介して、および（２）ＤＮＡトランスポゾンに対して末端逆位リピート（ＴＩＲ）に隣接するＤＮＡの直接転位を介して起こり得る。活性トランスポゾンは、転位に必要とされる１つ以上のタンパク質をコードする。天然の活性なＤＮＡトランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素遺伝子を有する。
【0003】
[0003]ｈＡＴファミリーのＤＮＡトランスポゾンは、植物および動物に広く行き渡っている。限定されないが、Ｈｅｒｍｅｓトランスポゾン、Ａｃトランスポゾン、ｈｏｂｏトランスポゾン、およびＴｏｌ２トランスポゾンを含む、多数の活性なｈＡＴトランスポゾン系が同定され、機能的であることが見出されている。ｈＡＴファミリーは、それらのトランスポザーゼの一次配列に基づいて、ＡＣサブファミリーおよびＢｕｓｔｅｒサブファミリーとして分類されている２つのファミリーで構成される。ｈＡＴファミリーのメンバーはクラスＩＩ転位エレメントに属する。クラスＩＩの可動エレメントは、転位のカットアンドペーストメカニズムを使用する。ｈＡＴエレメントは、類似のトランスポザーゼ、短い末端逆位リピート、およびゲノム標的の８塩基対の重複を共有する。
【発明の概要】
【0004】
[0004]本開示の一態様は、全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を有する、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して、増加した転位効率を有する。
【0005】
[0005]本開示の別の態様は、全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ－ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を有する、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して、増加した転位効率を有する。
【0006】
[0006]本開示のなお別の態様は、全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を有する、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。
【0007】
[0007]一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上のアミノ酸は、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する。一部の実施形態では、近接は、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である。一部の実施形態では、近接は、約７０～８０アミノ酸の距離である。
【0008】
[0008]一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列は、全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。
【0009】
[0009]一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、リジンまたはアルギニンへの置換を含む。一部の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンへのアスパラギン酸またはグルタミン酸の置換を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表４からの１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表２からの１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表３からの１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む。
【0010】
[0010]一部の実施形態では、転位効率は、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、およびレポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを細胞の集団に導入するステップ、ならびに細胞の集団のゲノムにおけるレポーターカーゴカセットの転位を検出するステップを含むアッセイによって測定される。
【0011】
[0011]本開示のさらに別の態様は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼを提供する。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、全長の配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【0012】
[0012]一部の実施形態では、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶ Ｒｅｐ ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインはＴＡＬＥドメインを含む。
【0013】
[0013]一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ－ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上のアミノ酸置換は、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する。一部の実施形態では、近接は、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である。一部の実施形態では、近接は、約７０～８０アミノ酸の距離である。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、表２からの１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、表３からの１つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む。一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、全長の配列番号１に対して１００％の同一性を有する。
【0014】
[0014]融合トランスポザーゼの一部の実施形態では、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、リンカーによって分離されている。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも５０個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは配列番号９を含む。
【0015】
[0015]本開示のなお別の態様は、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
[0016]本開示のなお別の態様は、本明細書に記載される融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
[0016]本開示のなお別の態様は、本明細書に記載される融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0016】
[0017]一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、化学的に修飾されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡベクター中に存在する。一部の実施形態では、ＤＮＡベクターは、ミニサークルプラスミドを含む。
【0017】
[0018]本開示のなお別の態様は、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞を提供する。本開示のなお別の態様は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含有する細胞を提供する。
【0018】
[0019]本開示のなお別の態様は、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞内に導入するステップを含む方法を提供する。
【0019】
[0020]本開示のなお別の態様は、本明細書に記載される融合トランスポザーゼ、および融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞内に導入するステップを含む方法を提供する。
【0020】
[0021]方法の一部の実施形態では、導入するステップは、細胞を、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に修飾されている。
【0021】
[0022]方法の一部の実施形態では、導入するステップは、細胞を、トランスポゾンを含有するＤＮＡベクターと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡベクターはミニサークルプラスミドを含む。一部の実施形態では、導入するステップは、細胞を、トランスポゾンと、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含有するプラスミドベクターと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、導入するステップは、細胞を、精製タンパク質としての突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと接触させるステップを含む。
【0022】
[0023]方法の一部の実施形態では、トランスポゾンは、２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートは、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートうちの左側逆位リピートは、配列番号３を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートは、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートうちの右側逆位リピートは、配列番号４を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートは、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートうちの左側逆位リピートは、配列番号５を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートは、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートうちの右側逆位リピートは、配列番号６を含む。一部の実施形態では、カーゴカセットは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む。一部の実施形態では、カーゴカセットはＣＭＶプロモーターを含む。一部の実施形態では、カーゴカセットはフォワード方向に存在する。一部の実施形態では、カーゴカセットはリバース方向に存在する。一部の実施形態では、カーゴカセットは導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。一部の実施形態では、導入するステップは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション（impalefection）、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせの援助を受けて細胞をトランスフェクトするステップを含む。一部の実施形態では、導入するステップは、細胞をエレクトロポレートするステップを含む。
【0023】
[0024]方法の一部の実施形態では、細胞は、対象から単離された初代細胞である。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は疾患を有する患者である。一部の実施形態では、対象は癌または腫瘍と診断されている。一部の実施形態では、細胞は対象の血液から単離される。一部の実施形態では、細胞は初代免疫細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は初代白血球を含む。一部の実施形態では、細胞は初代Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、初代Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、初代免疫細胞はＣＤ３＋細胞を含む。一部の実施形態では、細胞は幹細胞を含む。一部の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞を含む。
【0024】
[0025]本開示のなお別の態様は、（ａ）トランスポゾン、およびトランスポゾンを認識する、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを細胞に導入し、それによって遺伝子修飾された細胞を生成するステップ；（ｂ）治療を必要とする患者に遺伝子修飾された細胞を投与するステップを含む治療の方法を提供する。一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、トランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、患者は、癌または腫瘍と診断されている。一部の実施形態では、投与するステップは、遺伝子修飾された細胞を患者の血管に輸注するステップを含む。
【0025】
[0026]本開示のなお別の態様は、本明細書中に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含む、ゲノム編集システムを提供する。
【0026】
[0027]本開示のなお別の態様は、本明細書中に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含む、ゲノム編集システムを提供する。
【0027】
[0028]システムの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは化学的に修飾されている。一部の態様では、トランスポゾンはＤＮＡベクター中に存在する。一部の実施形態では、ＤＮＡベクターはミニサークルプラスミドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびトランスポゾンは、同じプラスミド中に存在する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートは、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートは、配列番号３を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートは、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートは配列番号４を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートは、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートは配列番号５を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートは、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートは配列番号６を含む。一部の実施形態では、カーゴカセットは、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む。一部の実施形態では、カーゴカセットはＣＭＶプロモーターを含む。一部の実施形態では、カーゴカセットは導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする。一部の実施形態では、カーゴカセットはフォワード方向に存在する。一部の実施形態では、カーゴカセットはリバース方向に存在する。
【0028】
参照による組み込み
[0029]本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的および個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた用語が本明細書において定義された用語と矛盾するという限度において、本明細書が支配する。
[0029]本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的および個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた用語が本明細書において定義された用語と矛盾するという限度において、本明細書が支配する。
【0029】
[0030]本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】[0031]図１は、野生型（ＷＴ）ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよび例示的ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンでトランスフェクトされた細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のパーセントによって測定した場合の、いくつかの例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンベクター構築物の転位効率を示す図である。
【図3A】[0033]図３Ａは、例示的ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＴｎ－８（ｐｕｒｏ－ｍＣｈｅｒｒｙカセットを含有する；図１に示される）およびＷＴ ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたはＶ５９６Ａ突然変異型トランスポザーゼ（Ｖ５９６Ａ置換を含有する）によるトランスフェクションの２週間後のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の代表的な明視野画像および蛍光画像を示す図である。トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションの２日後に１μｇ／ｍＬのピューロマイシンとともに６ウェルプレートに播種され、固定し、コロニー定量のためにトランスフェクションの２週間後にクリスタルバイオレットで染色された。
【図5】[0035]図５は、ＢｕｓｔｅｒサブファミリーにおけるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ対他の多数のトランスポザーゼメンバーのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。特定の例示的なアミノ酸置換は、タンパク質配列の上に示され、それとともに、アラインメントの上部に示されるパーセンテージは、ＴｃＢｕｓｔｅｒ配列内に置換されると考えられるアミノ酸を含有する他のＢｕｓｔｅｒサブファミリーメンバーのパーセンテージ、および下部に示されるパーセンテージは、その位置に標準のＴｃＢｕｓｔｅｒアミノ酸を含有する他のＢｕｓｔｅｒサブファミリーメンバーのパーセンテージである。
【図7】[0037]図７は、例示的なトランスポザーゼ突然変異体を用いて、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンＴｎ－８（図１に示される）でトランスフェクトされたＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のパーセントによって測定した場合の、例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ突然変異体の転位効率を定量化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0031】
[0047]概要
[0048]ＤＮＡトランスポゾンは、非複製の「カットアンドペースト」機構を介して転位することができる。これは、その標的を切断し、結果として、そのドナー鋳型からＤＮＡトランスポゾンを放出することができる触媒酵素、すなわちトランスポザーゼによる２つの末端逆位リピートの認識を必要とする。切除すると、続いて、ＤＮＡトランスポゾンは、同じトランスポザーゼによって切断されるアクセプターＤＮＡに組み込まれ得る。それらの天然の立体配置のいくつかにおいて、ＤＮＡトランスポゾンは、２つの逆位リピートに隣接し、転位を触媒するトランスポザーゼをコードする遺伝子を含有し得る。
[0048]ＤＮＡトランスポゾンは、非複製の「カットアンドペースト」機構を介して転位することができる。これは、その標的を切断し、結果として、そのドナー鋳型からＤＮＡトランスポゾンを放出することができる触媒酵素、すなわちトランスポザーゼによる２つの末端逆位リピートの認識を必要とする。切除すると、続いて、ＤＮＡトランスポゾンは、同じトランスポザーゼによって切断されるアクセプターＤＮＡに組み込まれ得る。それらの天然の立体配置のいくつかにおいて、ＤＮＡトランスポゾンは、２つの逆位リピートに隣接し、転位を触媒するトランスポザーゼをコードする遺伝子を含有し得る。
【0032】
[0049]ＤＮＡトランスポゾンを用いたゲノム編集用途について、トランスポザーゼが逆位リピートに隣接する目的の遺伝子を含有するトランスポゾンＤＮＡから物理的に分離されている２つの異なるプラスミドに基づく二元システムを開発するためのトランスポゾンを設計することが望ましい。トランスポゾンおよびトランスポザーゼプラスミドの標的細胞への同時送達は、従来のカットアンドペースト機構による転位を可能にする。
【0033】
[0050]ＴｃＢｕｓｔｅｒは、ｈＡＴファミリーのＤＮＡトランスポゾンのメンバーである。ファミリーの他のメンバーには、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙおよびＰｉｇｇＢａｃが含まれる。本明細書では、ｈＡＴファミリートランスポゾン成分を用いて、ヒト造血系細胞および免疫系細胞への遺伝子導入を増大させるための相乗的アプローチに関する様々な装置、システムおよび方法が検討されている。本開示は、改良されたｈＡＴトランスポザーゼ、トランスポゾンベクター配列、トランスポザーゼ送達方法、およびトランスポゾン送達方法に関する。一実施態様では、本研究は、高活性ｈＡＴトランスポザーゼを作製するための特定の普遍的な部位を同定した。別の実施において、ゲノム空間を節約する最小サイズのｈＡＴトランスポゾンベクター逆位末端リピート（ＩＴＲ）を作製するための方法が記載される。別の実施において、化学的に修飾され、インビトロ転写されたｍＲＮＡとしてｈＡＴファミリートランスポザーゼを送達するための改良された方法が記載される。別の実施において、ＤＮＡの「ミニチュア」サークルとしてｈＡＴファミリートランスポゾンベクターを送達するための方法が記載され、実質的に全ての原核生物配列が組換え法によって除去されている。別の実施において、ｈＡＴトランスポザーゼに融合した転写アクチベーター様（ＴＡＬ）ドメインを用いて、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインを融合する方法が記載される。これらの改善は、個々においてまたは組み合わせて、問題となっている細胞型への予想外に高レベルの遺伝子導入、および目的の配列へのトランスポゾンベクターの送達の改善をもたらすことができる。
【0034】
[0051]突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ
[0052]本開示の一態様は、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。
[0052]本開示の一態様は、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供する。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。
【0035】
[0053]突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの全長配列（配列番号１）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの全長配列（配列番号１）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの全長配列（配列番号１）に対して少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または少なくとも９９．９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0036】
[0054]突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの全長配列（配列番号１）と異なる少なくとも１つのアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの全長配列（配列番号１）とは異なる、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、またはそれを超えるアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの全長配列（配列番号１）とは異なる、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、または少なくとも３００個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの場合、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの全長配列（配列番号１）とは異なる、最大で３個、最大で６個、最大で１２個、最大で２５個、最大で３５個、最大で４５個、最大で５５個、最大で６５個、最大で７５個、最大で８５個、最大で９５個、最大で１５０個、最大で２５０個、または最大で３５０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0037】
[0055]図４に示されるように、典型的には、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、Ｎ末端からＣ末端に、ＺｎＦ－ＢＥＤドメイン（アミノ酸７６～９８）、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン（アミノ酸１１２～２１３）、第１の触媒ドメイン（アミノ酸２１３～３１２）、挿入ドメイン（アミノ酸３１２～５４３）、および第２の触媒ドメイン（アミノ酸５８３～６２０）、ならびにこれらの注釈されたドメイン間において少なくとも４つのドメイン間領域を含むものと見なすことができる。別段の指定がない限り、本明細書で使用されるアミノ酸の参照符号は全て配列番号１によるものである。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、これらのドメインのうちの任意の１つ、またはそれらの任意の組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの場合、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、ＺｎＦ－ＢＥＤドメイン、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン、第一の触媒ドメイン、挿入ドメイン、またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、２つの触媒ドメインのうちの少なくとも１つにおいて、１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。
【0038】
[0056]例示的な突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。時として、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表１からのアミノ酸置換のうちの少なくとも１つを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表１からの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、またはそれを超えるアミノ酸置換を含み得る。
【0039】
【表1-1】
【0040】
【表1-2】
【0041】
【表1-3】
【0042】
[0057]例示的な突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表２からの１つ以上のアミノ酸置換、または置換の組み合わせを含む。時として、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表２からの少なくとも１つのアミノ酸置換、または置換の組み合わせを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表２からの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換、または置換の組み合わせを含み得る。
【0043】
【表2-1】
【0044】
【表2-2】
【0045】
[0058]例示的な突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表３からの１つ以上のアミノ酸置換、または置換の組み合わせを含む。時として、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表３からの少なくとも１つのアミノ酸置換、または置換の組み合わせを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表３からの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、もしくはそれを超えるアミノ酸置換、または置換の組み合わせを含み得る。
【0046】
【表3】
【0047】
[0059]高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ
[0060]本開示の別の態様は、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供することである。本明細書で使用される「高活性」突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して、転位効率が増加した任意の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを指し得る。
[0060]本開示の別の態様は、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを提供することである。本明細書で使用される「高活性」突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して、転位効率が増加した任意の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを指し得る。
【0048】
[0061]一部の実施形態では、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して、特定の状況下で増加した転位効率を有し得る。例えば、特定のタイプの逆位リピート配列を有するトランスポゾンの転位を触媒するために使用される場合、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼよりも良好な転位効率を有し得る。他のタイプの逆位リピート配列を有するいくつかの他のトランスポゾンでは、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して、増加した転位効率を有さない場合がある。いくつかの他の非限定的な例では、特定のトランスフェクション条件下で、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して、増加した転位効率を有し得る。限定されないが、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較した場合、温度が通常の細胞培養温度よりも高いと、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、より良好な転位効率を有し得る；高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、比較的酸性または塩基性の水性媒体中でより良好な転位効率を有し得る；特定のタイプのトランスフェクション技術（例えば、エレクトロポレーション）が行われた場合、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、より良好な転位効率を有し得る。
【0049】
[0062]転位効率は、宿主細胞の集団に導入されたトランスポゾンおよびトランスポザーゼの量によって標準化された、宿主細胞の集団において生じる成功した転位事象のパーセントによって測定することができる。多くの場合、２つ以上のトランスポザーゼの転位効率を比較する場合、同じトランスポゾン構築物が、同じまたは類似のトランスフェクション条件下での宿主細胞のトランスフェクションのために２つ以上のトランスポザーゼの各々と対にされる。宿主細胞における転位事象の量は、種々のアプローチによって調べることができる。例えば、トランスポゾン構築物は、逆位リピート間に配置されるレポーター遺伝子を含有するように設計され得、レポーター遺伝子に対して陽性のトランスフェクト細胞は、成功した転位事象が起こる細胞として数えられ得、これは、転位事象の量の推定を与えることができる。別の非限定的な例には、トランスポゾンのカセットカーゴの挿入を調べるための宿主細胞ゲノムの配列決定が含まれる。一部の実施形態では、２つ以上の異なるトランスポゾンの転位効率を比較する場合、同じまたは類似のトランスフェクション条件下で、宿主細胞のトランスフェクションのために、同じトランスポザーゼを異なるトランスポゾンの各々と対にすることができる。類似したアプローチを転位効率の測定値に利用することができる。転位効率の比較のために、当業者に公知である他の方法もまた実施することができる。
【0050】
[0063]高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを得る方法もまた本明細書において提供される。
[0064]１つの例示的な方法は、アミノ酸配列の正味電荷を増加させるためにＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸を系統的に突然変異させるステップを含み得る。時として、本方法は、中性ｐＨで負に帯電しているアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）をアラニン残基に突然変異させるために系統的なアラニンスキャニングを行うステップを含み得る。方法は、中性ｐＨで正に帯電しているリジン（lysing）（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基に対して系統的な突然変異を行うステップを含み得る。
[0064]１つの例示的な方法は、アミノ酸配列の正味電荷を増加させるためにＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸を系統的に突然変異させるステップを含み得る。時として、本方法は、中性ｐＨで負に帯電しているアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）をアラニン残基に突然変異させるために系統的なアラニンスキャニングを行うステップを含み得る。方法は、中性ｐＨで正に帯電しているリジン（lysing）（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基に対して系統的な突然変異を行うステップを含み得る。
【0051】
[0065]特定の理論に束縛されることを望むものではないが、中性ｐＨでのアミノ酸配列の正味電荷の増加は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの転位効率を増加させ得る。特に、正味電荷がトランスポザーゼの触媒ドメインに近接して増加した場合、転位効率は増加することが予想される。正に帯電したアミノ酸は、ＤＮＡ標的との接触点を形成し、触媒ドメインがＤＮＡ標的に作用することを可能にすると考えられることができる。また、これらの正に帯電したアミノ酸の喪失は、トランスポザーゼにおける切り出し活性または組み込み活性のいずれかを減少させ得ると考えられ得る。
【0052】
[0066]図１１は、ＷＴ ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を示し、ＤＮＡとの接触点となり得るアミノ酸を強調している。図１１において、大きな太字は、触媒トライアドアミノ酸を示す；四角で囲った文字は、正に帯電したアミノ酸に置換した場合に転位を増加させるアミノ酸を示す；イタリック体および小文字のレタリングは、異なるアミノ酸に置換した場合に転位を減少させる正に帯電したアミノ酸を示す；太字のイタリック体および下線付きのアミノ酸は、正に帯電したアミノ酸に置換した場合に転位が増加し、負に帯電したアミノ酸に置換した場合に転位が減少するアミノ酸を示す；下線を引いたレタリングは、Ｂｕｓｔｅｒサブファミリーへのタンパク質配列アラインメントに基づいて、正に帯電したアミノ酸であり得るアミノ酸を示す。
【0053】
[0067]突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。時として、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは高活性であり得る。時として、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、限定されないが、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）などの正に帯電したアミノ酸への１つ以上の置換を含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、限定されないが、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）などの負に帯電したアミノ酸の、中性アミノ酸または正に帯電したアミノ酸による１つ以上の置換を含み得る。
【0054】
[0068]１つの非限定的な例としては、配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで、正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼが挙げられる。触媒ドメインは、第１触媒ドメインまたは第２触媒ドメインであり得る。触媒ドメインはまた、トランスポザーゼの両方の触媒ドメインを含み得る。
【0055】
[0069]本開示の例示的な方法は、ＤＮＡに非常に近接するかまたはＤＮＡと直接接触することが予測されるアミノ酸を突然変異させるステップを含み得る。これらのアミノ酸は、ｈＡＴファミリーの他のメンバー（単数または複数）（例えば、Ｂｕｓｔｅｒおよび／またはＡｃサブファミリーの他のメンバー）に保存されているものとして同定された置換アミノ酸であり得る。ＤＮＡに非常に近接するかまたはＤＮＡと直接接触することが予測されるアミノ酸は、例えば、結晶構造、予測構造、突然変異分析、機能分析、ｈＡＴファミリーの他のメンバーとのアラインメント、または他の適切な方法を参照することによって同定することができる。
【0056】
[0070]特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ｈＡＴトランスポザーゼファミリーの他のメンバーのように、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、ＤＤＥモチーフを有し、これはトランスポゾンの移動を触媒する活性部位であり得る。Ｄ２２３、Ｄ２８９、およびＥ５８９は、酸性残基のトライアドである活性部位を作り上げると考えられる。ＤＤＥモチーフは、二価金属イオンを配位し得、触媒反応において重要であり得る。一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み得、１つ以上のアミノ酸は、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する。
【0057】
[0071]特定の実施形態では、本明細書に提供される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、触媒トライアド、すなわちＤ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９のいずれの破壊も含まない。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９のいずれものアミノ酸置換も含まない可能性がある。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９でアミノ酸置換を含み得るが、このような置換は、触媒トライアドによってもたらされる触媒活性を乱さない。
【0058】
[0072]いくつかの場合、「近接」という用語は、トランスポザーゼの一次構造における直線距離の測定値を指し得る。例えば、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの一次構造におけるＤ２２３とＤ２８９の間の距離は、６６アミノ酸である。特定の実施形態では、近接とは、約７０～８０アミノ酸の距離を指し得る。多くの場合、近接とは、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離を指し得る。
【0059】
[0073]いくつかの場合、「近接」という用語は、トランスポザーゼの二次構造または三次構造における空間的関係の測定、すなわち、トランスポザーゼがその三次元立体配置に折り畳まれるときの測定を指し得る。タンパク質の二次構造は、タンパク質の局所セグメントの三次元形態を指し得る。一般的な二次構造エレメントとしては、アルファヘリックス、ベータシート、ベータターンおよびオメガループが挙げられる。タンパク質がその三次元の三次構造に折り畳まれる前に、二次構造エレメントが中間体として形成し得る。タンパク質の三次構造は、タンパク質の三次元形状を指し得る。タンパク質の三次構造は、生理学的条件または他の条件下で、動的な立体配置変化を示し得る。三次構造は、１つ以上のタンパク質二次構造、タンパク質ドメインを有する単一のポリペプチド鎖「骨格」を有する。アミノ酸側鎖は、多数の方法で相互作用し、結合し得る。特定のタンパク質内の側鎖の相互作用および結合がその三次構造を決定する。多くの実施において、近接は、約１Å、約２Å、約５Å、約８Å、約１０Å、約１５Å、約２０Å、約２５Å、約３０Å、約３５Å、約４０Å、約５０Å、約６０Å、約７０Å、約８０Å、約９０Å、または約１００Åの距離を指し得る。
【0060】
[0074]中性ｐＨは、約７のｐＨ値であり得る。時として、中性ｐＨは、６．９～７．１の間、６．８～７．２の間、６．７～７．３の間、６．６～７．４の間、６．５～７．５の間、６．４～７．６の間、６．３～７．７の間、６．２～７．８の間、６．１～７．９の間、６．０～８．０の間、５～８の間、またはそれから派生する任意の範囲内にあるｐＨ値であり得る。
【0061】
[0075]配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む非限定的であり、例示的な突然変異型ＴｃＢａｓｔｅｒトランスポザーゼには、表４からのアミノ酸置換の少なくとも１つの組み合わせを含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼが含まれる。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表４からの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、またはそれを超えるアミノ酸置換を含み得る。
【0062】
[0076]一部の実施形態では、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１と比較して、非中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの場合、正味電荷は、非中性ｐＨで触媒ドメイン内にまたはそれに近接して増加する。多くの場合、正味電荷は、非中性ｐＨで、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して増加する。非中性ｐＨは、７より低い、６．５より低い、６より低い、５．５より低い、５より低い、４．５より低い、４より低い、３．５より低い、３より低い、２．５より低い、２より低い、１．５より低い、または１より低いｐＨ値であり得る。非中性ｐＨはまた、７より高い、７．５より高い、８より高い、８．５より高い、９より高い、９．５より高い、または１０より高いｐＨ値であり得る。
【0063】
【表4】
【0064】
[0077]例示的な一実施形態では、方法は、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメインのアミノ酸を系統的に突然変異させるステップを含み得る。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメインにおける突然変異は、ＤＮＡ標的に対する結合親和性を増加させ、トランスポザーゼのオリゴマー化活性を促進し得、これは結果として転位効率を促進し得る。より具体的には、本方法は、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン内にまたはそれに近接して１つずつ系統的にアミノ酸を突然変異させるステップを含み得る（例えば、アミノ酸１１２～２１３）。この方法はまた、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン内にまたはそれに近接して１を超えるアミノ酸を突然変異させるステップを含み得る。本方法はまた、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン内にまたはそれに近接して１つ以上のアミノ酸を、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメインの外側の１つ以上のアミノ酸と一緒に突然変異させるステップを含み得る。
【0065】
[0078]一部の実施形態では、本方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒと他のｈＡＴファミリートランスポザーゼ（Ａｃ、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｈｏｂｏ、Ｔａｇ２、Ｔａｍ３、Ｈｅｒｍｅｓ、ＲｅｓｔｌｅｓｓおよびＴｏｌ２）またはＢｕｓｔｅｒサブファミリー（例えば、ＡｅＢｕｓｔｅｒ１、ＡｅＢｕｓｔｅｒ２、ＡｅＢｕｓｔｅｒ３、ＢｔＢｕｓｔｅｒ１、ＢｔＢｕｓｔｅｒ２、ＣｆＢｕｓｔｅｒ１、およびＣｆＢｕｓｔｅｒ２）の他のメンバーとの複数の配列アラインメントに基づいて、選択的なアミノ酸残基の合理的な置換を行うステップを含み得る。特定の理論に束縛されることなく、他のｈＡＴファミリートランスポザーゼ、特に活性なものの中での特定のアミノ酸の保存は、トランスポザーゼの触媒活性にとってそれらの重要性を示し得る。したがって、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒ配列（配列番号１）の保存されていないアミノ酸を他のｈＡＴファミリーの保存されているアミノ酸と置換することにより、高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを得ることができる。本方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒならびに他のｈＡＴファミリートランスポザーゼの配列を得るステップ；ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を他のｈＡＴファミリートランスポザーゼの中で異なる保存された対応物と整列させ、同定するステップ；部位特異的変異誘発を実施して、突然変異（単数または複数）を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを産生するステップを含み得る。
【0066】
[0079]高活性突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、Ｂｕｓｔｅｒサブファミリーの他のメンバーまたはｈＡＴファミリーの他のメンバーへのアラインメントに基づいて１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。多くの場合、１つ以上のアミノ酸置換は、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒ配列（配列番号１）中の保存されていないアミノ酸の保存されているアミノ酸での置換であり得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの非限定的な例としては、表５からのアミノ酸置換の少なくとも１つを含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼが挙げられる。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、表５から少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、またはそれを超えるアミノ酸置換を含み得る。
【0067】
[0080]別の例示的な方法は、酸性アミノ酸を塩基性アミノ酸に系統的に突然変異させるステップ、および高活性突然変異型トランスポザーゼを同定するステップを含み得る。
[0081]いくつかの場合、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含み得る。
[0081]いくつかの場合、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含み得る。
【0068】
【表5】
【0069】
[0082]融合トランスポザーゼ
[0083]本発明の別の態様は、融合トランスポザーゼを提供する。融合トランスポザーゼは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含み得る。
[0083]本発明の別の態様は、融合トランスポザーゼを提供する。融合トランスポザーゼは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含み得る。
【0070】
[0084]融合トランスポザーゼのＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのいずれかのアミノ酸配列を含み得る。融合トランスポザーゼのＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列はまた、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列を含み得る。
【0071】
[0085]本明細書に記載されるＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、特異的配列モチーフを含有する配列領域（「標的配列」）でＤＮＡ分子に結合するように適合されているタンパク質ドメインを指し得る。例えば、例示的なＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、配列モチーフＴＡＴＡに選択的に結合し得るが、一方、別の例示的なＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、異なる配列モチーフＡＴＧＣＮＴＡＧＡＴ（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを示す）に選択的に結合し得る。
【0072】
[0086]本明細書に提供される融合トランスポザーゼは、トランスポゾンの配列特異的挿入を指向し得る。例えば、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、結合ドメインの結合特異性に基づいて、融合トランスポザーゼを標的配列に結合するように誘導し得る。特定の配列領域に結合または制限されると、融合トランスポザーゼとトランスポゾンの間の相互作用が空間的に限定され、それによって標的化配列に近接した配列領域への触媒転位が限定される。ＤＮＡ結合ドメインのサイズ、三次元立体配置、および配列結合親和性、ならびにＤＮＡ結合ドメインとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列の間の空間的関係、および２つのドメイン間の接続の可撓性に応じて、標的配列への実際の転位部位の距離は異なり得る。融合トランスポザーゼ立体配置の適切な設計は、望ましい標的ゲノム領域への転位を指向することができる。
【0073】
[0087]転位のための標的ゲノム領域は、適用目的に応じて、任意の特定のゲノム領域であり得る。例えば、時として、細胞の特定の重要な内在性遺伝子の発現レベルの望ましくない、またはさらには有害な変化を引き起こし得る、転位のための転写開始部位を回避することが望ましい。融合トランスポザーゼは、宿主ゲノムの安全な避難場所への転位を標的とすることができるＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含有し得る。安全な避難場所の非限定的な例には、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ部位（例えば、ＡＡＶＳ１、ＡＡＶＳ２、ＥＴＣ）、ＣＣＲ５、またはＲｏｓａ２６が含まれ得る。安全な避難場所は、一般的に、その使用が細胞のゲノムの完全性、または細胞の健康および機能にほとんどないかまたは全く破壊的な影響を及ぼさない導入遺伝子挿入のための部位を指し得る。
【0074】
[0088]ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、配列特異性を有する任意のＤＮＡ結合タンパク質に由来し得るか、またはその変異体であり得る。多くの場合、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み得る。天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の非限定的な例としては、様々な起源由来の転写因子、特異的配列ヌクレアーゼ、およびウイルス複製タンパク質が挙げられる。天然に存在する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質はまた、様々な起源からの特異的結合能力を有する他の任意のタンパク質であり得る。ＤＮＡ結合タンパク質の選択および予測は、限定されないが、ＤＰ－Ｂｉｎｄ（http://lcg.rit.albany.edu/dp-bind/）またはＤＮＡＢＩＮＤ（http://dnabind.szialab.org/）のようなオンラインで入手可能な計算予測データベースを使用することを含む様々なアプローチによって行うことができる。
【0075】
[0089]「転写因子」という用語は、特定のＤＮＡ配列に結合することによって、ＤＮＡからメッセンジャーＤＮＡへの遺伝情報の転写速度を調節するタンパク質を指し得る。本明細書に記載される融合トランスポザーゼにおいて使用され得る転写因子は、標的ＤＮＡ分子に結合した場合に配列特異性を付与する限り、原核生物転写因子または真核生物転写因子に基づき得る。ＤＢＤ（http://www.transcriptionfactor.org）などの転写因子予測データベースは、本明細書の開示の適用のための適切な転写因子の選択に使用され得る。
【0076】
[0090]本明細書で使用されるＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、天然に存在する転写因子由来の１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含み得る。転写因子のＤＮＡ結合ドメインの非限定的な例には、塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス、塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）、二部応答調節因子のＣ末端エフェクタードメイン、ＡＰ２／ＥＲＦ／ＧＣＣボックス、ヘリックス－ターン－ヘリックス、ホメオドメインタンパク質、ラムダリプレッサー様、ｓｒｆ様（血清応答因子）ペアードボックス、ウイングドヘリックス、ジンクフィンガー、マルチドメインＣｙｓ２Ｈｉｓ２（Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガー、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６、またはＺｎ２／Ｃｙｓ８核内受容体ジンクフィンガーのようなファミリーに属するＤＮＡ結合ドメインが含まれる。
【0077】
[0091]ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、特定のＤＮＡ配列に結合する人工的に操作されたアミノ酸配列であり得る。このような人工的に設計されたアミノ酸配列の非限定的な例としては、エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質、および本明細書に記載される任意の他の適切なＤＮＡ結合タンパク質のような転写アクチベーターのようなフレームワークに基づいて作製される配列が挙げられる。
【0078】
[0092]天然ＴＡＬＥは、植物種の感染を援助するためにキサントモナス（Xanthomonas）細菌によって分泌されるタンパク質である。天然ＴＡＬＥは、特定のＤＮＡ配列に結合して宿主遺伝子の発現を活性化することによって感染を補助することができる。一般的に、ＴＡＬＥタンパク質は、ＤＮＡ標的特異性を決定し、デノボで迅速に合成することができる中心リピートドメインからなる。ＴＡＬＥは、残基の反復配列を含有するモジュラーＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を有する。一部のＴＡＬＥでは、各々の反復領域は３４アミノ酸を含有する。本明細書で使用される「ＴＡＬＥドメイン」という用語は、ＴＡＬＥのモジュラー式ＤＢＤを指し得る。各々の反復領域の１２位および１３位にある一対の残基は、ヌクレオチド特異性を決定することができ、これは反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。半反復と呼ばれる最後の反復領域は、典型的には、２０アミノ酸に切断されている。これらの反復領域を組み合わせることにより、配列特異的合成ＴＡＬＥを合成することが可能になる。Ｃ末端は、通常、ＴＡＬＥを核に指向する核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ならびに酸性活性化ドメイン（ＡＤ）などの転写を調節する機能ドメインを含有する。内因性ＮＬＳは、生物特異的局在化シグナルによって置換され得る。例えば、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原由来のＮＬＳを哺乳動物細胞に使用することができる。ＲＶＤのＨＤ、ＮＧ、ＮＩ、およびＮＮは、それぞれＣ、Ｔ、Ａ、およびＧ／Ａを標的とする。ヌクレオチドについての特定の状況下でのＲＶＤおよびそれらの結合優先性のリストを表６に見出すことができる。追加のＴＡＬＥ ＲＶＤはまた、カスタム縮重ＴＡＬＥ－ＤＮＡ相互作用に使用することができる。例えば、ＮＡは、ＤＮＡの４塩基全てに対して高い親和性を有する。さらに、Ｎ*（*は、１３番目の残基に欠失を有するＲＶＤである）は、メチル化シトシンを含む全ての文字のＤＮＡを収容することができる。また、Ｓ*は、任意のＤＮＡヌクレオチドに結合する能力を有し得る。
【0079】
[0093]特定のＤＮＡ配列を標的とするようにＴＡＬＥを設計するための多数のオンラインツール、例えば、ＴＡＬＥ－ＮＴ（https://tale-nt.cac.cornell.edu/）、Ｍｏｊｏ Ｈａｎｄ（http://www.talendesign.org/）が利用可能である。市販のキットはまた、タンパク質のＮ末端とＣ末端の間のＴＡＬＥ反復領域のカスタムアセンブリーの作製を補助することができる。これらの方法を使用してカスタムＤＢＤをアセンブルすることができ、次に、機能ドメイン、例えば、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列を含有する発現ベクターにクローニングする。
【0080】
【表6】
【0081】
[0094]ＴＡＬＥは、例えば、ゴールデンゲート反応における消化およびライゲーションステップをＩＩ型制限酵素と組み合わせることによって、実験室でデノボ合成することができる。あるいは、ＴＡＬＥは、限定されないが、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）、高速ライゲーションベースの自動可能な固相ハイスループット（ＦＬＡＳＨ）アセンブリー、および反復キャップドアセンブリー（ＩＣＡ）を含む、多数の異なるアプローチによってアセンブルされ得る。
【0082】
[0095]ジンクフィンガー（ＺＦ）は、約３ヌクレオチドの限られた組み合わせに結合することができる約３０アミノ酸である。Ｃ２Ｈ２ ＺＦドメインは、最も一般的なタイプのＺＦであり得、真核細胞において最も豊富に発現されるタンパク質の１つであるようである。ＺＦは、それらの構造において亜鉛分子と配位結合した、小さく機能的であり、独立して折り畳まれたドメインである。各々のＺＦのアミノ酸は、特定のヌクレオチドに対して親和性を有し、各々のフィンガーにＤＮＡの３～４ヌクレオチドを選択的に認識させることができる。複数のＺＦをタンデムアレイに配置して、ＤＮＡ上の一組のヌクレオチドを認識することができる。異なるジンクフィンガーの組み合わせを使用することによって、ゲノム内の固有のＤＮＡ配列を標的とすることができる。
様々な長さの異なるＺＦＰを生成することができ、可能性のある６４の三重項サブサイトの中からほとんどいずれもの所望のＤＮＡ配列の認識を可能にし得る。
様々な長さの異なるＺＦＰを生成することができ、可能性のある６４の三重項サブサイトの中からほとんどいずれもの所望のＤＮＡ配列の認識を可能にし得る。
【0083】
[0096]本開示に関連して使用されるジンクフィンガーは、Ｂａｒｂａｓらによって開発された一組のモジュラーアセンブリーフィンガードメイン、およびさらにはＴｏｏｌＧｅｎによって開発された別の一組のモジュラーアセンブリーフィンガードメインなどの確立されたモジュラーアセンブリーフィンガーを使用して作製することができる。両方のドメインセットは、３ｂｐのＧＮＮ、ほとんどのＡＮＮ、多くのＣＮＮ、およびいくつかのＴＮＮ三重項（Ｎは４つのヌクレオチドのいずれかであり得る）の全てをカバーする。両者は異なるフィンガーセットを有し、必要に応じて、異なるＺＦモジュールを検索してコーディングすることが可能である。タンパク質中のフィンガーの位置および隣接フィンガーの配列を伴うモジュラーアセンブリーの文脈依存的な影響を最小限にするために、コンビナトリアル選択に基づくオリゴマー化プールエンジニアリング（ＯＰＥＮ）戦略もまた採用され得る。ＯＰＥＮ ＺＦアレイは、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｄａｔａｂａｓｅから公衆に入手可能である。
【0084】
[0097]ＡＡＶ Ｒｅｐ ＤＮＡ結合ドメインは、本開示の主題に関連して使用することができる他のＤＮＡ配列特異的結合ドメインである。ウイルスのシス作用逆位末端リピート（ＩＴＲ）、およびトランス作用ウイルスＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ）は、ヘルパーウイルスの非存在下で宿主ゲノムのＡＡＶＳ１部位へのＡＡＶの優先的な組み込みを媒介する因子であると考えられている。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶＳ１部位の特定のＤＮＡ配列に結合することができる。したがって、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載されるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼドメインと一緒に融合することができる。
【0085】
[0098]本明細書に提供される融合トランスポザーゼは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびタグ配列を含み得る。本明細書で提供されるタグ配列は、融合タンパク質の検出タグとして使用され得る任意のタンパク質配列を指し得、例えば、限定されないが、レポータータンパク質、および抗体によって認識され得る親和性タグが挙げられる。レポータータンパク質には、限定されないが、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＹＦＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が含まれる。親和性タグの非限定的な例としては、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、インテイン－キチン結合ドメイン（インテイン－ＣＢＤ）、ストレプトアビジン／ビオチンベースのタグ、ＦＬＡＧのようなエピトープタグ、ＨＡ、ｃ－ｍｙｃ、Ｔ７、Ｇｌｕ－Ｇｌｕおよび他多数が含まれる。
【0086】
[0099]本明細書で提供される融合トランスポザーゼは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列、およびいずれの中間配列も伴わずに一緒に融合されるＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列（例えば、「背中合わせ」）を含み得る。いくつかの場合、本明細書に提供される融合トランスポザーゼは、リンカー配列によって連結された、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列を含み得る。図８は、リンカーによって連結された、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインおよびＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列を含む例示的な融合トランスポザーゼの概略図である。例示的な融合トランスポザーゼにおいて、リンカーは、主に、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドの間のスペーサーとして役立ち得る。リンカーは、単一のポリペプチド中の複数ドメインを分離するための短いアミノ酸配列であり得る。リンカー配列は、天然のマルチドメインタンパク質に生じるリンカーを含み得る。いくつかの例において、リンカー配列は、人工的に作製されたリンカーを含み得る。リンカー配列の選択は、融合トランスポザーゼの用途に基づく場合がある。リンカー配列は、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも５０個のアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、最大で４個、最大で５個、最大で６個、最大で７個、最大で８個、最大で９個、最大で１０個、最大で１１個、最大で１２個、最大で１５個、最大で２０個、最大で３０個、最大で４０個、最大で５０個、または最大で１００個のアミノ酸を含み得る。特定の場合、限定されないが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝２～８）、（Ｇｌｙ）８、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ、（ＧＧＧＧＳ）４のようなＧｌｙおよびＳｅｒ残基のストレッチ（「ＧＳ」リンカー）などの可撓性リンカー配列を使用することが望ましい場合がある。時として、限定されないが、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝２～７）、（ＸＰ）ｎ（Ｘは任意のアミノ酸を示す）のようなＰｒｏ－ｒｉｃｈ配列などの剛性リンカー配列を使用することが望ましい場合がある。
【0087】
[00100]本明細書に提供される例示的な融合トランスポザーゼにおいて、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列のＮ末端に融合され得る。あるいは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列は、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列のＣ末端に融合することができる。一部の実施形態では、融合トランスポザーゼの用途に応じて、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼとＤＮＡ配列特異的結合ドメインまたはタグ配列の間に第３のドメイン配列またはそれを超える他の配列が存在し得る。
【0088】
[00101]ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン
[00102]本開示の別の態様は、２つの逆位リピート間に配置されたカセットカーゴを含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを提供する。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンは、本明細書に記載されるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識され得、例えば、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを認識し、ＤＮＡ配列へのＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンの転位を触媒することができる。
[00102]本開示の別の態様は、２つの逆位リピート間に配置されたカセットカーゴを含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを提供する。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンは、本明細書に記載されるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識され得、例えば、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを認識し、ＤＮＡ配列へのＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンの転位を触媒することができる。
【0089】
[00103]本明細書で互換的に使用される「逆位リピート」、「末端逆位リピート」、「逆位末端リピート」という用語は、天然のトランスポゾンのトランスポザーゼ遺伝子または人工的に操作されたトランスポゾンのカセットカーゴに隣接する短い配列リピートを指し得る。２つの逆位リピートは、一般的に、対応するトランスポザーゼの存在下でのトランスポゾンの動員に必要とされる。本明細書に記載される逆位リピートは、１つ以上の直接リピート（ＤＲ）配列を含有し得る。これらの配列は、通常、エレメントの末端逆位リピート（ＴＩＲ）に埋め込まれている。本明細書で使用される「カーゴカセット」という用語は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ遺伝子を含有する逆位リピート間の天然ヌクレオチド配列以外のヌクレオチド配列を指し得る。カーゴカセットは人工的に設計することができる。
【0090】
[00104]本明細書に記載されるトランスポゾンは、ＩＲ／ＤＲ配列が隣接するカーゴカセットを含有し得る。一部の実施形態では、少なくとも１つのリピートは、少なくとも１つの直接リピートを含有する。図１および図２に示されるように、トランスポゾンは、ＩＲＤＲ－Ｌ－Ｓｅｑ１（配列番号３）およびＩＲＤＲ－Ｒ－Ｓｅｑ１（配列番号４）に隣接するカーゴカセットを含有し得る。多くの場合、左側逆位リピートは、ＩＲＤＲ－Ｌ－Ｓｅｑ１（配列番号３）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み得る。時として、右側逆位リピートは、ＩＲＤＲ－Ｒ－Ｓｅｑ１（配列番号４）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み得る。他の場合、右側逆位リピートは、ＩＲＤＲ－Ｌ－Ｓｅｑ１（配列番号３）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み得る。時として、左側逆位リピートは、ＩＲＤＲ－Ｒ－Ｓｅｑ１（配列番号４）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み得る。本明細書で使用される「左側」および「右側」という用語は、それぞれ、二本鎖トランスポゾンのセンス鎖上のカーゴカセットの５’側および３’側を指し得る。また、トランスポゾンがＩＲＤＲ－Ｌ－Ｓｅｑ２（配列番号５）およびＩＲＤＲ－Ｒ－Ｓｅｑ２（配列番号６）に隣接するカーゴカセットを含有し得ることも可能である。多くの場合、左側逆位リピートは、ＩＲＤＲ－Ｌ－Ｓｅｑ２（配列番号５）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み得る。時として、右側逆位リピートは、ＩＲＤＲ－Ｒ－Ｓｅｑ２（配列番号６）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み得る。他の場合、右側逆位リピートは、ＩＲＤＲ－Ｌ－Ｓｅｑ２（配列番号５）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み得る。時として、左側逆位リピートは、ＩＲＤＲ－Ｒ－Ｓｅｑ２（配列番号６）に対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含み得る。トランスポゾンは、図２に示したものとは異なるヌクレオチド配列を有する２つの逆位リピート、または当業者に公知である様々な配列の組み合わせが隣接するカーゴカセットを含有し得る。本明細書に記載されるトランスポゾンの２つの逆位リピートのうちの少なくとも１つは、配列番号３～６のいずれか１つに対して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含有し得る。本明細書に記載されるトランスポゾンの少なくとも１つの逆位リピートは、配列番号３または４に対して少なくとも８０％同一である配列を含有し得る。本明細書に記載されるトランスポゾンの少なくとも１つの逆位リピートは、配列番号５または６に対して少なくとも８０％同一である配列を含有し得る。逆位リピートの選択は、予想される転位効率、修飾される細胞のタイプ、使用するトランスポザーゼ、および他の多くの要因に応じて異なり得る。
【0091】
[00105]多くの実施において、ゲノム空間を節約する最小サイズのトランスポゾンベクター逆位末端リピートが使用され得る。ｈＡＴファミリートランスポゾンのＩＴＲは、右手と左手のＩＴＲの違いによって大きく異なる。多くの場合、ちょうど１００～２００ヌクレオチドからなるより小さなＩＴＲは、ｈＡＴトランスポゾンベクターにおけるより長い天然のＩＴＲと同程度に活性である。これらの配列は、ｈＡＴファミリーの転位を媒介しながら一貫して減少し得る。これらのより短いＩＴＲは、ｈＡＴトランスポゾンベクター内のゲノム空間を節約することができる。
【0092】
[00106]本明細書で提供されるトランスポゾンの逆位リピートは、約５０～２０００ヌクレオチド、約５０～１０００ヌクレオチド、約５０～８００ヌクレオチド、約５０～６００ヌクレオチド、約５０～５００ヌクレオチド、約５０～４００ヌクレオチド、約５０～３５０ヌクレオチド、約５０～３００ヌクレオチド、約５０～２５０ヌクレオチド、約５０～２００ヌクレオチド、約５０～１８０ヌクレオチド、約５０～１６０ヌクレオチド、約５０～１４０ヌクレオチド、約５０～１２０ヌクレオチド、約５０～１１０ヌクレオチド、約５０～１００ヌクレオチド、約５０～９０ヌクレオチド、約５０～８０ヌクレオチド、約５０～７０ヌクレオチド、約５０～６０ヌクレオチド、約７５～７５０ヌクレオチド、約７５～４５０ヌクレオチド、約７５～３２５ヌクレオチド、約７５～２５０ヌクレオチド、約７５～１５０ヌクレオチド、約７５～９５ヌクレオチド、約１００～５００ヌクレオチド、約１００～４００ヌクレオチド、約１００～３５０ヌクレオチド、約１００～３００ヌクレオチド、約１００～２５０ヌクレオチド、１００～２２０ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオチド、またはそれから派生する任意の範囲内であり得る。
【0093】
[00107]いくつかの場合、カーゴカセットは、プロモーター、導入遺伝子、またはそれらの組み合わせを含み得る。プロモーターと導入遺伝子の両方を含むカーゴカセットにおいては、導入遺伝子の発現は、プロモーターによって指示され得る。プロモーターは、当業者に利用可能な任意のタイプのプロモーターであり得る。ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンにおいて使用され得るプロモーターの非限定的な例としては、ＥＦＳ、ＣＭＶ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＧｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅが挙げられる。ＴｃＢｕｓｔｅｒ転位に使用されるプロモーターの選択は、限定されないが、プロモーターの発現効率、遺伝子修飾される細胞のタイプ、および所望の導入遺伝子発現レベルなどの多数の要因に依存する。
【0094】
[00108]ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン中の導入遺伝子は、目的の任意の遺伝子であり得、当業者に利用可能であり得る。導入遺伝子は、天然の遺伝子に由来するか、もしくはその遺伝子の変異体であり得るか、または人工的に設計され得る。導入遺伝子は、修飾されるべき細胞と同種起源のものであり得るか、または異種由来のものであり得る。導入遺伝子は、原核生物遺伝子または真核生物遺伝子であり得る。時として、導入遺伝子は、ヒト以外の動物、植物、またはヒトに由来する遺伝子であり得る。導入遺伝子はイントロンを含み得る。あるいは、導入遺伝子は、イントロンが除去されていてもよく、または存在していなくてもよい。
【0095】
[00109]一部の実施形態では、導入遺伝子はタンパク質をコードすることができる。例示的なタンパク質としては、限定されないが、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。時として、本明細書に記載される細胞受容体には、限定されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【0096】
[00110]本明細書に記載されるカーゴカセットは、いずれのタイプのタンパク質産物をコードする導入遺伝子を含まなくてもよいが、それは他の目的に有用である。例えば、カーゴカセットは、例えば、それが宿主ゲノム中の遺伝子のエクソンに挿入された場合、挿入部位にフレームシフトを作製するために使用され得る。これは、遺伝子産物の短縮またはヌル変異をもたらし得る。時として、カーゴカセットは、内因性ゲノム配列を外因性ヌクレオチド配列で置換し、それによって宿主ゲノムを修飾するために使用され得る。
【0097】
[00111]本明細書に記載されるトランスポゾンは、フォワード方向またはリバース方向のいずれかでカーゴカセットを有し得る。多くの場合、カーゴカセットには独自の方向性がある。例えば、導入遺伝子を含有するカーゴカセットは５’から３’へのコーディング配列を有する。プロモーターおよび遺伝子挿入を含有するカーゴカセットは、遺伝子挿入の５’部位にプロモーターを有する。本明細書で使用される「フォワード方向」という用語は、カーゴカセットが二本鎖トランスポゾンのセンス鎖上でその指向性を維持する状況を指し得る。本明細書で使用される「リバース方向」という用語は、カーゴカセットが二本鎖トランスポゾンのアンチセンス鎖上でその指向性を維持する状況を指し得る。
【0098】
[00112]ゲノム編集システムおよび使用方法
[00113]本開示の別の態様は、ゲノム編集システムを提供する。システムは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを含み得る。システムを用いて、宿主細胞のゲノムを編集し、宿主細胞の内因性ゲノム領域を破壊または修飾し、外因性遺伝子を宿主ゲノム内に挿入し、内因性ヌクレオチド配列を外因性ヌクレオチド配列またはそれらの任意の組み合わせで置換することができる。
[00113]本開示の別の態様は、ゲノム編集システムを提供する。システムは、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを含み得る。システムを用いて、宿主細胞のゲノムを編集し、宿主細胞の内因性ゲノム領域を破壊または修飾し、外因性遺伝子を宿主ゲノム内に挿入し、内因性ヌクレオチド配列を外因性ヌクレオチド配列またはそれらの任意の組み合わせで置換することができる。
【0099】
[00114]ゲノム編集システムは、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼ、および変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含み得る。突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを精製タンパク質として提供することができる。タンパク質の産生および精製技術は当業者に公知である。精製タンパク質は、トランスポゾンとは異なる容器に保存することができ、または同じ容器に保存することができる。
【0100】
[00115]多くの場合、ゲノム編集システムは、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含み得る。時として、システムのポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含み得る。あるいはまたはさらに、このシステムのポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。ｍＲＮＡは、限定されないが、インビボ転写およびＲＮＡ精製、インビトロ転写、ならびにデノボ合成などの当業者に周知である多数の手法によって産生させることができる。多くの場合、ｍＲＮＡは化学的に修飾することができる。化学的に修飾されたｍＲＮＡは、未修飾もしくは天然のｍＲＮＡよりも分解に対して抵抗性であり得るか、またはより急速に分解し得る。多くの場合、ｍＲＮＡの化学修飾は、ｍＲＮＡをより効率的に翻訳させ得る。ｍＲＮＡの化学修飾は、当業者に利用可能な周知の技術を用いて、または商業的供給業者によって行うことができる。
【0101】
[00116]多数の用途について、安全性は、ｈＡＴトランスポザーゼ発現の持続時間が安全なトランスポゾン送達を媒介するのに十分に長いだけであることを要求する。さらに、トランスポゾンベクターレベルの高さと一致するｈＡＴトランスポザーゼ発現のパルスは、最大の遺伝子送達を達成することができる。実施は、ＤＮＡプラスミド鋳型からのＲＮＡ分子のインビトロ転写のための利用可能な技術を用いて行われる。ＲＮＡ分子は、ＤＮＡコピーからのインビトロ（例えば、無細胞）転写のための様々な方法を用いて合成することができる。これを行う方法は記載されており、市販されている。例えば、ｍＭｅｓｓａｇｅ Ｍａｃｈｉｎｅインビトロ転写キットは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを通じて入手可能である。
【0102】
[00117]サービス料に基づいてインビトロ転写を実行することができる会社も多数ある。本発明者らはまた、ｈＡＴ発現のための化学的に修飾されたＲＮＡが遺伝子導入に特に有効であることを見出した。これらの化学的に修飾されたＲＮＡは、細胞性免疫応答を誘導せずに、ＲＮＡは、細胞性免疫応答も回避する独自の方法を使用して生成される。これらのＲＮＡ調製物はＲＮＡ二量体を除去し（Ｃｌｅａｎ－Ｃａｐ）、細胞反応性（シュードウリジンの取り込み）は、本発明者らの手に毒性を与えることなく、ヒトＴ細胞においてより良好な一過性遺伝子発現を生じさせる（データは示さず）。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡトランスフェクションのための多くの記載された方法のいずれかを用いて細胞に導入することができ、それは通常、大部分の細胞に対して無毒である。これを行う方法は記載されており、市販されている。例えば、Ａｍａｘａヌクレオファクター、Ｎｅｏｎエレクトロポレーター、およびＭａｘｃｙｔｅプラットフォームである。
【0103】
[00118]本明細書に記載されるトランスポゾンは、発現ベクター中に存在し得る。多くの場合、発現ベクターはＤＮＡプラスミドであり得る。時として、発現ベクターはミニサークルベクターであり得る。本明細書で使用される「ミニサークルベクター」という用語は、全部ではないにしてもほとんどの原核生物ベクター部分（例えば、調節配列または原核生物起源の非機能的配列）を含まない小さい環状プラスミド誘導体を指し得る。状況下では、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって作製された細胞に対する毒性は、本明細書に記載される「ミニサークル」を使用することによって軽減することができる。
【0104】
[00119]ミニサークルベクターは、利用可能な周知の分子クローニング技術によって調製することができる。第一に、大腸菌などの細菌における「親プラスミド」（トランスポゾン構築物などの挿入を有する細菌プラスミド）を作製することができ、続いて部位特異的リコンビナーゼの誘導を行うことができる。次に、これらのステップに続いて、インサートの両端にある２つのリコンビナーゼ－標的配列を介した原核生物ベクター部分の切除、ならびに得られたミニサークルベクターの回収を行うことができる。精製されたミニサークルは、トランスフェクションまたはリポフェクションによってレシピエント細胞に、例えば、ジェット注入によって分化した組織に移すことができる。ミニサークル含有ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンは、約１．５ｋｂ、約２ｋｂ、約２．２ｋｂ、約２．４ｋｂ、約２．６ｋｂ、約２．８ｋｂ、約３ｋｂ、約３．２ｋｂ、約３．４ｋｂ、約３．６ｋｂ、約３．８ｋｂ、約４ｋｂ、約４．２ｋｂ、約４．４ｋｂ、約４．６ｋｂ、約４．８ｋｂ、約５ｋｂ、約５．２ｋｂ、約５．４ｋｂ、約５．６ｋｂ、約５．８ｋｂ、約６ｋｂ、約６．５ｋｂ、約７ｋｂ、約８ｋｂ、約９ｋｂ、約１０ｋｂ、約１２ｋｂ、約２５ｋｂ、約５０ｋｂ、またはこれらの数のうちの任意の２つの間の値のサイズを有することができる。時として、本明細書で提供されるミニサークル含有ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンは、最大で２．１ｋｂ、最大で３．１ｋｂ、最大で４．１ｋｂ、最大で４．５ｋｂ、最大で５．１ｋｂ、最大で５．５ｋｂ、最大で６．５ｋｂ、最大で７．５ｋｂ、最大で８．５ｋｂ、最大で９．５ｋｂ、最大で１１ｋｂ、最大で１３ｋｂ、最大で１５ｋｂ、最大で３０ｋｂ、または最大で６０ｋｂのサイズを有することができる。
【0105】
[00120]特定の実施形態では、本明細書に記載されるシステムは、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、およびトランスポゾンを含有し得、これらは同じ発現ベクター、例えば、プラスミド中に存在する。
【0106】
[00121]本開示のなお別の態様は、遺伝子操作の方法を提供する。遺伝子操作の方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞内に導入するステップを含み得る。遺伝子操作の方法はまた、無細胞環境においても実施され得る。無細胞環境における遺伝子操作の方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾン、および標的核酸をウェルまたはチューブなどの容器に合わせるステップを含み得る。
【0107】
[00122]本明細書に記載される方法は、本明細書に提供される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入するステップを含み得る。ゲノム編集の方法は、本明細書に提供される融合トランスポザーゼ、および融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入するステップを含み得る。
【0108】
[00123]突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼは、タンパク質として、または突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼもしくは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドを介して細胞に導入され得る。上記で検討したように、ポリヌクレオチドは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを含み得る。
【0109】
[00124]多くの場合、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼは、タンパク質として宿主細胞にトランスフェクトされ得、タンパク質の濃度は、少なくとも０．０５ｎＭ、少なくとも０．１ｎＭ、少なくとも０．２ｎＭ、少なくとも０．５ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも２μＭ、少なくとも５μＭ、少なくとも７．５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１５μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも２５μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも２００μＭ、少なくとも５００μＭ、または少なくとも１μＭであり得る。時として、タンパク質の濃度は、約１μＭ～約５０μＭ、約２μＭ～約２５μＭ、約５μＭ～約１２．５μＭ、または約７．５μＭ～約１０μＭであり得る。
【0110】
[00125]多くの場合、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼは、ポリヌクレオチドを介して宿主細胞にトランスフェクトすることができ、ポリヌクレオチドの濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２８０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６５０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、または８００μｇ／ｍｌであり得る。時として、ポリヌクレオチドの濃度は、約５～２５μｇ／ｍｌ、２５～５０μｇ／ｍｌ、５０～１００μｇ／ｍｌ、１００～１５０μｇ／ｍｌ、１５０～２００μｇ／ｍｌ、２００～２５０μｇ／ｍｌ、２５０～５００μｇ／ｍｌ、５～８００μｇ／ｍｌ、２００～８００μｇ／ｍｌ、２５０～８００μｇ／ｍｌ、４００～８００μｇ／ｍｌ、５００～８００μｇ／ｍｌ、またはそれらに由来する任意の範囲であり得る。多くの場合、トランスポゾンは、トランスポザーゼとは別の発現ベクター中に存在し、トランスポゾンの濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２８０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６５０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、または８００μｇ／ｍｌであり得る。時として、トランスポゾンの濃度は、約５～２５μｇ／ｍｌ、２５～５０μｇ／ｍｌ、５０～１００μｇ／ｍｌ、１００～１５０μｇ／ｍｌ、１５０～２００μｇ／ｍｌ、２００～２５０μｇ／ｍｌ、２５０～５００μｇ／ｍｌ、５～８００μｇ／ｍｌ、２００～８００μｇ／ｍｌ、２５０～８００μｇ／ｍｌ、４００～８００μｇ／ｍｌ、５００～８００μｇ／ｍｌ、またはそれらに由来する任意の範囲であり得る。トランスポゾン対トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの比は、最大で１００００、最大で５０００、最大で１０００、最大で５００、最大で１００、最大で２００、最大で５０、最大で２０、最大で１０、最大で５、最大で２、最大で１、最大で０．１、最大で０．０５、最大で０．０１、最大で０．００１、最大で０．０００１、またはそれらの任意の２つの間の任意の数であり得る。
【0111】
[00126]一部の他の場合、トランスポゾン、およびトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドは同じ発現ベクター中に存在し、トランスポゾンとトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含有する発現ベクターの濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２０ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２８０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６５０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、または８００μｇ／ｍｌであり得る。時として、トランスポゾンとトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含有する発現ベクターの濃度は、約５～２５μｇ／ｍｌ、２５～５０μｇ／ｍｌ、５０～１００μｇ／ｍｌ、１００～１５０μｇ／ｍｌ、１５０～２００μｇ／ｍｌ、２００～２５０μｇ／ｍｌ、２５０～５００μｇ／ｍｌ、５～８００μｇ／ｍｌ、２００～８００μｇ／ｍｌ、２５０～８００μｇ／ｍｌ、４００～８００μｇ／ｍｌ、５００～８００μｇ／ｍｌ、またはその中で導き出される任意の範囲であり得る。
【0112】
[00127]いくつかの場合、エレクトロポレーションによって細胞に導入され得るポリ核酸の量は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために変動され得る。いくつかの場合、約１００ｐｇ未満の核酸を各細胞試料（例えば、エレクトロポレートされた１つ以上の細胞）に添加し得る。いくつかの場合、少なくとも約１００ｐｇ、少なくとも約２００ｐｇ、少なくとも約３００ｐｇ、少なくとも約４００ｐｇ、少なくとも約５００ｐｇ、少なくとも約６００ｐｇ、少なくとも約７００ｐｇ、少なくとも約８００ｐｇ、少なくとも約９００ｐｇ、少なくとも約１マイクログラム、少なくとも約１．５μｇ、少なくとも約２μｇ、少なくとも約２．５μｇ、少なくとも約３μｇ、少なくとも約３．５μｇ、少なくとも約４μｇ、少なくとも約４．５μｇ、少なくとも約５μｇ、少なくとも約５．５μｇ、少なくとも約６μｇ、少なくとも約６．５μｇ、少なくとも約７μｇ、少なくとも約７．５μｇ、少なくとも約８μｇ、少なくとも約８．５μｇ、少なくとも約９μｇ、少なくとも約９．５μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約１１μｇ、少なくとも約１２μｇ、少なくとも約１３μｇ、少なくとも約１４μｇ、少なくとも約１５μｇ、少なくとも約２０μｇ、少なくとも約２５μｇ、少なくとも約３０μｇ、少なくとも約３５μｇ、少なくとも約４０μｇ、少なくとも約４５μｇ、または少なくとも約５０μｇの核酸を各細胞試料（例えば、エレクトロポレートされた１つ以上の細胞）に添加し得る。例えば、１マイクログラムのｄｓＤＮＡをエレクトロポレーション用に各細胞試料に添加し得る。いくつかの場合、最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率に必要とされるポリ核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は細胞型に特異的であり得る。
【0113】
[00128]本明細書に開示される主題は、広範囲の様々な種類の宿主細胞のゲノム編集において使用を見出すことができる。好ましい実施形態では、宿主細胞は真核生物由来であり得る。一部の実施形態では、細胞は哺乳動物起源に由来し得る。一部の実施形態では、細胞はヒト起源のものであり得る。
【0114】
[00129]一般的に、細胞は、不死化細胞株または初代細胞由来であり得る。
[00130]本明細書で互換的に使用される「細胞株」および「不死化細胞株」という用語は、通常、無期限に増殖することはないが、突然変異のために正常な細胞老化を回避した可能性がある生物由来の細胞の集団を指し得、代わりに分裂を受け続けることができる。本明細書で提供される主題は、一般的な確立した細胞株の範囲における使用を見出すことができ、細胞には、例えば、限定されないが、ヒトＢＣ－１細胞、ヒトＢＪＡＢ細胞、ヒトＩＭ－９細胞、ヒトＪｉｙｏｙｅ細胞、ヒトＫ－５６２細胞、ヒトＬＣＬ細胞、マウスＭＰＣ－１１細胞、ヒトＲａｊｉ細胞、ヒトＲａｍｏｓ細胞、マウスＲａｍｏｓ細胞、ヒトＲＰＭＩ８２２６細胞、ヒトＲＳ４－１１細胞、ヒトＳＫＷ６．４細胞、ヒト樹状細胞、マウスＰ８１５細胞、マウスＲＢＬ－２Ｈ３細胞、ヒトＨＬ－６０細胞、ヒトＮＡＭＡＬＷＡ細胞、ヒトマクロファージ細胞、マウスＲＡＷ ２６４．７細胞、ヒトＫＧ－１細胞、マウスＭ１細胞、ヒトＰＢＭＣ細胞、マウスＢＷ５１４７（Ｔ２００－Ａ）５．２細胞、ヒトＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞、マウスＥＬ４細胞、ヒトジャーカット細胞、ヒトＳＣＩＤ．ａｄｈ細胞、ヒトＵ－９３７細胞、またはそれらの細胞の任意の組み合わせが含まれる。
[00130]本明細書で互換的に使用される「細胞株」および「不死化細胞株」という用語は、通常、無期限に増殖することはないが、突然変異のために正常な細胞老化を回避した可能性がある生物由来の細胞の集団を指し得、代わりに分裂を受け続けることができる。本明細書で提供される主題は、一般的な確立した細胞株の範囲における使用を見出すことができ、細胞には、例えば、限定されないが、ヒトＢＣ－１細胞、ヒトＢＪＡＢ細胞、ヒトＩＭ－９細胞、ヒトＪｉｙｏｙｅ細胞、ヒトＫ－５６２細胞、ヒトＬＣＬ細胞、マウスＭＰＣ－１１細胞、ヒトＲａｊｉ細胞、ヒトＲａｍｏｓ細胞、マウスＲａｍｏｓ細胞、ヒトＲＰＭＩ８２２６細胞、ヒトＲＳ４－１１細胞、ヒトＳＫＷ６．４細胞、ヒト樹状細胞、マウスＰ８１５細胞、マウスＲＢＬ－２Ｈ３細胞、ヒトＨＬ－６０細胞、ヒトＮＡＭＡＬＷＡ細胞、ヒトマクロファージ細胞、マウスＲＡＷ ２６４．７細胞、ヒトＫＧ－１細胞、マウスＭ１細胞、ヒトＰＢＭＣ細胞、マウスＢＷ５１４７（Ｔ２００－Ａ）５．２細胞、ヒトＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞、マウスＥＬ４細胞、ヒトジャーカット細胞、ヒトＳＣＩＤ．ａｄｈ細胞、ヒトＵ－９３７細胞、またはそれらの細胞の任意の組み合わせが含まれる。
【0115】
[00131]本明細書で使用される「初代細胞」という用語およびその文法上の同等物は、生物、典型的には、動物または植物などの多細胞生物の生体組織から直接採取された細胞を指し得る。多くの場合、初代細胞は、インビトロでの増殖のために樹立され得る。いくつかの場合、初代細胞は、生物から取り出されたばかりであり得、トランスフェクションの前にまだインビトロでの増殖について確立されていない。一部の実施形態では、初代細胞はまた、インビトロで拡大させることができ、すなわち、初代細胞はまた、生物から直接採取された細胞の増殖から生成される子孫細胞を含み得る。これらの場合、子孫細胞は、樹立された細胞株中の細胞のように不明確な増殖特性を示さない。例えば、宿主細胞はヒト初代Ｔ細胞であり得るが、トランスフェクション前に、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖および細胞集団の拡大をもたらし得る刺激因子（単数または複数）に曝露されている。
【0116】
[00132]遺伝子修飾される細胞は、限定されないが、脳、肺、肝臓、心臓、脾臓、膵臓、小腸、大腸、骨格筋、平滑筋、皮膚、骨、脂肪組織、毛髪、甲状腺、気管、胆嚢、腎臓、尿管、膀胱、大動脈、静脈、食道、横隔膜、胃、直腸、副腎、気管支、耳、目、網膜、性器、視床下部、喉頭、鼻、舌、脊髄、または尿管、子宮、卵巣、精巣、およびそれらの任意の組み合わせなどの組織または臓器由来の初代細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞には、限定されないが、血球、トリコサイト、ケラチノサイト、性腺刺激ホルモン、コルチコトロープ、甲状腺刺激ホルモン、ソマトトロープ、プロラクチン産生細胞、クロマフィン細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜角化細胞、網膜ミュラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア、上衣細胞、松果体細胞、肺細胞、クララ細胞、杯細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、エンテロクロマフィン様細胞、胃の主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、パンス細胞、腸細胞、マイクロフォールド細胞、肝細胞、肝星状細胞、胆嚢細胞、中心腺細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞、膵ε細胞、甲状腺副甲状腺、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、ミオサテライト細胞、腱細胞、心筋細胞、リポ芽細胞、ａｄ腹腔細胞、カヤル間質細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞、傍糸球体細胞、間質細胞（stromal cell）、間質細胞（interstitial cell）、テロサイト、単純上皮細胞、ポドサイト、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、ペグ細胞、生殖細胞、精子卵子、リンパ球、骨髄細胞、内皮前駆細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中血管芽細胞、周皮細胞壁細胞、およびそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。多くの場合、修飾される細胞は、限定されないが、胚性幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、表皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせなどの幹細胞であり得る。時として、細胞は、任意の種類の組織に由来する人工多能性幹細胞であり得る。
【0117】
[00133]一部の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は哺乳動物細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞であり得る。細胞の非限定的な例としては、Ｂ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、ガンマデルタＴ細胞、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ球細胞、先天性リンパ球細胞（ＩＬＣ）、マクロファージ、肥満細胞、巨核球、メモリーＴ細胞、単球、骨髄細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、好中球、先駆細胞、形質細胞、前駆細胞、制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、それらの任意の分化もしくは脱分化細胞、またはそれらの細胞の任意の混合物もしくは組み合わせが含まれ得る。
特定の場合、細胞はＴ細胞であり得る。一部の態様では、細胞は初代Ｔ細胞であり得る。特定の場合、細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり得る。一部の実施形態では、細胞は初代ＡＰＣであり得る。本開示に関連するＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、他の非専門ＡＰＣ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
特定の場合、細胞はＴ細胞であり得る。一部の態様では、細胞は初代Ｔ細胞であり得る。特定の場合、細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり得る。一部の実施形態では、細胞は初代ＡＰＣであり得る。本開示に関連するＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、他の非専門ＡＰＣ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【0118】
[00134]一部の実施形態では、細胞は、ＩＬＣ（先天性リンパ球細胞）であり得、ＩＬＣは、グループ１ ＩＬＣ、グループ２ ＩＬＣ、またはグループ３ ＩＬＣであり得る。グループ１ ＩＬＣは、一般的に、細胞内病原体に応答してＩＦＮ－ガンマおよびＴＮＦ－アルファなどの１型サイトカインを分泌する、Ｔ－ｂｅｔ転写因子によって調節される細胞として記載され得る。グループ２ ＩＬＣは、一般的に、細胞外寄生虫感染に応答して２型サイトカインを産生する、ＧＡＴＡ－３およびＲＯＲ－アルファ転写因子に依存する細胞として記載され得る。グループ３ ＩＬＣは、一般的に、ＲＯＲ－ガンマｔ転写因子によって調節される細胞として記載され得、ＩＬ－１７および／またはＩＬ－２２を産生する。
【0119】
[00135]一部の実施形態では、細胞は、所与の因子に対して陽性または陰性である細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ３－細胞、ＣＤ５＋細胞、ＣＤ５－細胞、ＣＤ７＋細胞、ＣＤ７－細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１４－細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ８－細胞、ＣＤ１０３＋細胞、ＣＤ１０３－細胞、ＣＤ１１ｂ＋細胞、ＣＤ１１ｂ－細胞、ＢＤＣＡ１＋細胞、ＢＤＣＡ１－細胞、Ｌ－セレクチン＋細胞、Ｌ－セレクチン－細胞、ＣＤ２５＋、ＣＤ２５－細胞、ＣＤ２７＋、ＣＤ２７－細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ２８－細胞、ＣＤ４４＋細胞、ＣＤ４４－細胞、ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６－細胞、ＣＤ５７＋細胞、ＣＤ５７－細胞、ＣＤ６２Ｌ＋細胞、ＣＤ６２Ｌ－細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＣＤ６９－細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ－細胞、ＣＤ１２７＋細胞、ＣＤ１２７－細胞、ＣＤ１３２＋細胞、ＣＤ１３２－細胞、ＩＬ－７＋細胞、ＩＬ－７－細胞、ＩＬ－１５＋細胞、ＩＬ－１５細胞、レクチン様受容体Ｇ１陽性細胞、レクチン様受容体Ｇ１陰性細胞、またはそれらの分化もしくは脱分化細胞であり得る。細胞によって発現される因子の例には、限定的であることを意図しない。当業者は、細胞が当該技術分野において公知である任意の因子に対して陽性または陰性であり得ることを理解する。一部の実施形態では、細胞は、２つ以上の因子に対して陽性であり得る。例えば、細胞はＣＤ４＋およびＣＤ８＋であり得る。一部の実施形態では、細胞は、２つ以上の因子について陰性であり得る。例えば、細胞はＣＤ２５－、ＣＤ４４－、およびＣＤ６９－であり得る。一部の実施形態では、細胞は、１つ以上の因子に対して陽性であり得、１つ以上の因子に対して陰性であり得る。例えば、細胞はＣＤ４＋およびＣＤ８－であり得る。
【0120】
[00136]本明細書に開示された方法のうちのいずれかにおいて使用される細胞は、本明細書に開示された細胞のうちのいずれかのものの混合物（例えば、２つ以上の異なる細胞）であり得ることを理解するべきである。例えば、本開示の方法は細胞を含み得、細胞はＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の混合物である。別の例では、本開示の方法は細胞を含み得、細胞はＣＤ４＋細胞とナイーブ細胞との混合物である。
【0121】
[00137]本明細書に提供されるように、トランスポザーゼおよびトランスポゾンは、多数のアプローチを通して細胞に導入することができる。本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語およびその文法上の同等物は、一般的に、それによって核酸が真核細胞に導入されるプロセスを指し得る。主題に関連して使用され得るトランスフェクション法には、限定されないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。多くの場合、本明細書に記載されるトランスポザーゼおよびトランスポゾンは、エレクトロポレーションによって宿主細胞にトランスフェクトすることができる。時として、トランスフェクションはまた、ヌクレオフェクション（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）テクノロジーとしても知られている）などのエレクトロポレーション法の変法によって行うことができる。本明細書で使用される「エレクトロポレーション」という用語およびその文法上の同等物は、細胞膜の透過性を増加させるために細胞に電場を印加し、化学物質、薬物またはＤＮＡを細胞に導入できるようにするプロセスを指し得る。エレクトロポレーションの間、電場は、しばしば非常に短い期間、例えば、５ミリ秒、１０ミリ秒、および５０ミリ秒の「パルス」の形で提供される。当業者には理解されるように、エレクトロポレーションは、パルス回転電場の使用により細胞の外膜の孔を一時的に開く。インビトロおよびインビボでのエレクトロポレーションに使用される方法および装置はまた周知である。エレクトロポレートされる細胞型、および細胞によって取り込まれる分子の物理的特性（パルス強度、パルス長、パルス数など）に応じて様々な電気的パラメータを選択することができる。
【0122】
[00138]用途（Applications）
[00139]本明細書に提供される主題、例えば、組成物（例えば、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、融合トランスポザーゼ、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン）、システムおよび方法は、現代の生活の様々な態様において、ゲノム編集に関する広範囲の用途における使用を見出すことができる。
[00139]本明細書に提供される主題、例えば、組成物（例えば、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、融合トランスポザーゼ、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン）、システムおよび方法は、現代の生活の様々な態様において、ゲノム編集に関する広範囲の用途における使用を見出すことができる。
【0123】
[00140]特定の状況下では、本明細書に記載される主題の利点には、限定されないが、費用の削減、規制上の考慮事項、免疫原性の低下および複雑さの軽減が含まれ得る。場合によっては、本開示の重要な利点は、高い転位効率である。本開示の別の利点は、多数の場合、本明細書において提供される転位システムが「調節可能」であり得ること、例えば、転位がランダム挿入よりもむしろ選択ゲノム領域を標的とするように設計され得ることである。
【0124】
[00141]１つの非限定的な例は、研究用途および臨床用途のための遺伝子修飾された細胞を作製することに関する。例えば、上記で検討されたように、遺伝子修飾されたＴ細胞は、本明細書に提供される主題を使用して作製することができ、それは、限定されないが、癌および感染症などの様々な疾患と闘う人々の支援における使用を見い出し得る。
【0125】
[00142]１つの特定の例は、本明細書に提供される方法を用いた、遺伝子修飾された初代白血球の生成、およびそれを必要とする患者への遺伝子修飾された初代白血球の投与を含む。遺伝子修飾された初代白血球の生成は、トランスポゾン、およびトランスポゾンを認識することができる、本明細書に記載される突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを白血球に導入し、それによって遺伝子修飾された白血球を生成することを含み得る。多くの場合、トランスポゾンは導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。時として、細胞受容体は、限定されないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの他の場合、トランスポゾンおよびトランスポザーゼは、内因性遺伝子、例えば、サイトカイン、免疫学的チェックポイントタンパク質、癌遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせを欠失または修飾するように設計される。初代白血球の遺伝子修飾は、患者を罹患状態にする感染性病原体または癌細胞に対する免疫を促進するように設計することができる。
【0126】
[00143]別の非限定的な例は、農業、食料生産、医学、および薬学のために遺伝子修飾された生物を作製することに関する。遺伝子修飾され得る種は、限定されないが、植物および動物を含み、広範囲にわたる。遺伝子修飾された作物または家畜などの遺伝子修飾された生物は、それらの生理学的特性の特定の態様において修飾され得る。食用作物における例には、特定の害虫、疾病、または環境条件に対する耐性、腐敗の低減、または化学的処理に対する耐性（例えば除草剤に対する耐性）、または作物の栄養プロファイルの改善が含まれる。食料以外の作物の例には、医薬品、バイオ燃料、およびその他の産業上有用な商品の生産、ならびにバイオレメディエーションのためのものが含まれる。家畜の例には、特定の寄生虫に対する耐性、特定の栄養素の生産、成長率の増加、および牛乳生産の増加が含まれる。
【0127】
[00144]本明細書で使用される「約」という用語、ならびにその基準数値およびその文法的な同等物に関する文法的な同等物は、その値から±１０％の範囲の値を含み得る。例えば、「約１０」という量は、９～１１の量を含む。基準数値に関する用語「約」はまた、その値から±１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲の値を含み得る。
【実施例】
【0128】
[00145]以下の実施例は、本開示の範囲を限定することなく記載された実施形態をさらに説明する。
[00146]実施例１．材料および方法
[00147]この実施例は、例示的な突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの生成および評価に利用されるいくつかの方法を記載する。
[00146]実施例１．材料および方法
[00147]この実施例は、例示的な突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの生成および評価に利用されるいくつかの方法を記載する。
【0129】
[00148]ＴｃＢｕｓｔｅｒ変異体調製のための部位特異的変異誘発
[00149]推定される高活性ＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴｃＢ）トランスポザーゼ突然変異体は、ｈＡＴおよびＢｕｓｔｅｒサブファミリーのヌクレオチド配列およびアミノ酸アラインメントによって同定された。Ｑ５部位特異的突然変異誘発キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を全ての部位特異的突然変異誘発に使用した。ＰＣＲ突然変異誘発後、ＰＣＲ産物をＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。精製されたＰＣＲ産物の２０μＬの連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて行われた。５μＬの連結反応は、ＤＨ１０ベータ細胞における形質転換に使用された。Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈによる直接コロニーシークエンシングを使用して、所望の突然変異の存在を確認した。確認された突然変異のためのＤＮＡは、ＺｙｍｏＰＵＲＥプラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて調製された。
[00149]推定される高活性ＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴｃＢ）トランスポザーゼ突然変異体は、ｈＡＴおよびＢｕｓｔｅｒサブファミリーのヌクレオチド配列およびアミノ酸アラインメントによって同定された。Ｑ５部位特異的突然変異誘発キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を全ての部位特異的突然変異誘発に使用した。ＰＣＲ突然変異誘発後、ＰＣＲ産物をＧｅｎｅＪＥＴ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。精製されたＰＣＲ産物の２０μＬの連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて行われた。５μＬの連結反応は、ＤＨ１０ベータ細胞における形質転換に使用された。Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈによる直接コロニーシークエンシングを使用して、所望の突然変異の存在を確認した。確認された突然変異のためのＤＮＡは、ＺｙｍｏＰＵＲＥプラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて調製された。
【0130】
[00150]ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクション効率の測定
[00151]トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの１ウェルあたり３００，０００細胞で播種した。製造業者の説明書（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）に従って、ＴｒａｎｓＩＴ Ｘ２試薬を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ－ピューロマイシンカセットを有する５００ｎｇのトランスポゾンおよび６２．５ｎｇのＴｃＢトランスポザーゼを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞は、ＤＭＥＭ完全培地中、３重にした６ウェルプレートのウェルあたり３，０００細胞の密度でピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）とともに再播種されるか、またはピューロマイシン選択なしで再播種された。導入遺伝子の安定な組み込みは、ピューロマイシン処理された細胞（薬物選択を生き残った各細胞がコロニーを形成した）のコロニー計数またはフローサイトメトリーによって評価された。ピューロマイシン選択の２週間後のコロニー計数のために、ＤＭＥＭ完全＋ピューロマイシン培地を除去した。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、細胞を１×クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、コロニーを計数した。
[00151]トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートの１ウェルあたり３００，０００細胞で播種した。製造業者の説明書（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）に従って、ＴｒａｎｓＩＴ Ｘ２試薬を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ－ピューロマイシンカセットを有する５００ｎｇのトランスポゾンおよび６２．５ｎｇのＴｃＢトランスポザーゼを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、細胞は、ＤＭＥＭ完全培地中、３重にした６ウェルプレートのウェルあたり３，０００細胞の密度でピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）とともに再播種されるか、またはピューロマイシン選択なしで再播種された。導入遺伝子の安定な組み込みは、ピューロマイシン処理された細胞（薬物選択を生き残った各細胞がコロニーを形成した）のコロニー計数またはフローサイトメトリーによって評価された。ピューロマイシン選択の２週間後のコロニー計数のために、ＤＭＥＭ完全＋ピューロマイシン培地を除去した。細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、細胞を１×クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、コロニーを計数した。
【0131】
[00152]フローサイトメトリー分析のために、導入遺伝子の安定な組み込みは、薬物選択なしで増殖させた細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によって評価された。トランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション後の指示された時点で回収され、ＰＢＳで１回洗浄され、分析のために２００μＬのＲＤＦＩＩ緩衝液に再懸濁された。細胞をノボサイト（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析し、ＰＥ－テキサスレッドチャネルを用いてｍＣｈｅｒｒｙ発現を評価した。
【0132】
[00153]ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるＴｃＢトランスポザーゼ突然変異体のスクリーニング
[00154]トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートの１ウェルあたり７５，０００細胞で播種した。製造業者の説明書（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）に従って、ＴｒａｎｓＩＴ Ｘ２試薬を用いて、５００ｎｇのトランスポゾンおよび１２５ｎｇのトランスポザーゼを細胞にトランスフェクトした。導入遺伝子の安定な組み込みは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によって評価された。トランスフェクションの１４日後に細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、２００μＬのＲＤＦＩＩ緩衝液に再懸濁した。細胞をノボサイト（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析し、ＰＥ－テキサスレッドチャネルを用いてｍＣｈｅｒｒｙ発現を評価した。
[00154]トランスフェクションの１日前に、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートの１ウェルあたり７５，０００細胞で播種した。製造業者の説明書（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）に従って、ＴｒａｎｓＩＴ Ｘ２試薬を用いて、５００ｎｇのトランスポゾンおよび１２５ｎｇのトランスポザーゼを細胞にトランスフェクトした。導入遺伝子の安定な組み込みは、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によって評価された。トランスフェクションの１４日後に細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、２００μＬのＲＤＦＩＩ緩衝液に再懸濁した。細胞をノボサイト（Ａｃｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析し、ＰＥ－テキサスレッドチャネルを用いてｍＣｈｅｒｒｙ発現を評価した。
【0133】
[00155]ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンおよびトランスポザーゼのトランスフェクション
[00156]ＣＤ３＋Ｔ細胞を濃縮し、白血球（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から凍結保存した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を解凍し、ヒト血清ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７サイトカインを補足したＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地中でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて２日間活性化した。トランスフェクション前に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を洗浄し、ＲＮＡ形態でＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン（ＴｃＢｕｓｔｅｒおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ ＩＲ／ＤＲおよびＧＦＰカーゴを有するミニサークル）を含むＮｅｏｎトランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＲＮＡ形態のＴｃＢｕｓｔｅｒまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼを用いてエレクトロポレートした。生存率対照として、細胞をＤＮＡまたはＲＮＡなしで「パルス」エレクトロポレートした。エレクトロポレートされた細胞をトランスフェクション後の２１日間増殖させ、ＧＦＰカーゴの生存率安定な組み込みをフローサイトメトリーによって評価した。生存率をＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａによって測定し、パルスのみの対照に標準化し、ＧＦＰ発現は、２、７、１４および２１日目にＦＩＴＣチャンネルを用いて評価された。
[00156]ＣＤ３＋Ｔ細胞を濃縮し、白血球（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から凍結保存した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を解凍し、ヒト血清ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５およびＩＬ－７サイトカインを補足したＸ－Ｖｉｖｏ－１５培地中でＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて２日間活性化した。トランスフェクション前に、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を洗浄し、ＲＮＡ形態でＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン（ＴｃＢｕｓｔｅｒおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ ＩＲ／ＤＲおよびＧＦＰカーゴを有するミニサークル）を含むＮｅｏｎトランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＲＮＡ形態のＴｃＢｕｓｔｅｒまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼを用いてエレクトロポレートした。生存率対照として、細胞をＤＮＡまたはＲＮＡなしで「パルス」エレクトロポレートした。エレクトロポレートされた細胞をトランスフェクション後の２１日間増殖させ、ＧＦＰカーゴの生存率安定な組み込みをフローサイトメトリーによって評価した。生存率をＳＳＣ－Ａ対ＦＳＣ－Ａによって測定し、パルスのみの対照に標準化し、ＧＦＰ発現は、２、７、１４および２１日目にＦＩＴＣチャンネルを用いて評価された。
【0134】
[00157]実施例２．例示的なトランスポゾン構築物
[00158]この研究の目的は、異なる例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン構築物の転位効率を調べることであった。本発明者らは、哺乳動物細胞におけるそれらの転位効率を試験するために、１０個のＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴｃＢ）トランスポゾン（Ｔｎ）立体配置（図１Ａ）を比較した。これら１０個のＴｃＢ Ｔｎは、使用されたプロモーター（ＥＦＳ対ＣＭＶ）、ＩＲ／ＤＲ配列およびトランスポゾンカーゴの方向が異なっていた。トランスポゾンはそれぞれ、２Ａによって薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシンに連結されたｍＣｈｅｒｒｙをコードする同一のカセットを含有し、そのため、トランスフェクトされた細胞は、蛍光および／またはピューロマイシンによる選択によって同定され得た。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞は、１０個のＴｃＢ ＴｎｓおよびＴｃＢ野生型トランスポザーゼ（１トランスポゾン：１トランスポザーゼの比）のうちの１つでトランスフェクトした。導入遺伝子の安定な組み込みは、トランスフェクション後の１０～３０日間、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によるフローサイトメトリーによって評価された（図１Ｂ）。
[00158]この研究の目的は、異なる例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾン構築物の転位効率を調べることであった。本発明者らは、哺乳動物細胞におけるそれらの転位効率を試験するために、１０個のＴｃＢｕｓｔｅｒ（ＴｃＢ）トランスポゾン（Ｔｎ）立体配置（図１Ａ）を比較した。これら１０個のＴｃＢ Ｔｎは、使用されたプロモーター（ＥＦＳ対ＣＭＶ）、ＩＲ／ＤＲ配列およびトランスポゾンカーゴの方向が異なっていた。トランスポゾンはそれぞれ、２Ａによって薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシンに連結されたｍＣｈｅｒｒｙをコードする同一のカセットを含有し、そのため、トランスフェクトされた細胞は、蛍光および／またはピューロマイシンによる選択によって同定され得た。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞は、１０個のＴｃＢ ＴｎｓおよびＴｃＢ野生型トランスポザーゼ（１トランスポゾン：１トランスポザーゼの比）のうちの１つでトランスフェクトした。導入遺伝子の安定な組み込みは、トランスフェクション後の１０～３０日間、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の検出によるフローサイトメトリーによって評価された（図１Ｂ）。
【0135】
[00159]実験条件下で、導入遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの安定な発現は、ＥＦＳと比較して、ＣＭＶプロモーターを使用して大きく増強されることが見出された。転位は、配列１ ＩＲ／ＤＲを用いた場合にのみ起こるように見えた。リバース方向へのカーゴの転位がフォワード方向と比較してより大きな転位活性を促進することもまた見出された。
【0136】
[00160]ＴｃＢ Ｔｎ－８は、フローサイトメトリーによる試験１０個のＴｎｓの間で最大の転栗効率を示した。ＴｃＢ Ｔｎ－８の転位効率を確認するために、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞は、ＷＴトランスポザーゼまたはＶ５９６Ａ突然変異トランスポザーゼを有するＴｃＢ Ｔｎ－８を用いてトランスフェクトされた。トランスフェクションの２日後に、細胞は、ＤＭＥＭ完全培地中で３重にした６ウェルプレートのウェルあたり３，０００細胞の密度でピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）とともに再播種された。２週間の選択後、薬物選択を生き残った各細胞はコロニーを形成し、これをｍＣｈｅｒｒｙ発現について評価し（図３Ａ）、導入遺伝子の安定な組み込みを確認するために計数された（図３Ｂ～Ｃ）。ＴｃＢ－Ｔｎ ８の転位効率は、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙおよびピューロマイシン耐性コロニーの発現によって確認された。
【0137】
[00161]実施例３．例示的なトランスポザーゼ突然変異体
[00162]この研究の目的は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ突然変異体を生成し、それらの転位効率を調べることであった。
[00162]この研究の目的は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ突然変異体を生成し、それらの転位効率を調べることであった。
【0138】
[00163]この目的のために、本発明者らは、野生型ＴｃＢトランスポザーゼのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を他の類似したトランスポザーゼと比較することによってコンセンサス配列を生成した。比較のために、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙは、１３個の類似したトランスポザーゼのアラインメントによって復活され、ＳＰＩＮは、８つの別々の生物由来のＳＰＩＮ様トランスポザーゼのアラインメントによって復活された。ＳＰＩＮおよびＴｃＢｕｓｔｅｒは、ｈＡＴファミリーの豊富なトランスポザーゼの一部である。
【0139】
[00164]ｈＡＴトランスポゾンファミリーは、２つのサブファミリー、すなわち、ｈｏｂｏ、ｈｅｒｍｅｓ、およびＴｏｌ２を有するものなどのＡＣ、ならびにＳＰＩＮおよびＴｃＢｕｓｔｅｒなどのＢｕｓｔｅｒサブファミリーからなる。ＴｃＢｕｓｔｅｒのアミノ酸配列は、ＡＣとＢｕｓｔｅｒサブファミリーの両方のメンバーのアミノ酸配列に整列されて、ＴｃＢｕｓｔｅｒにおいて保存されていない、高活性な置換の標的であり得る重要なアミノ酸を同定した。ＴｃＢｕｓｔｅｒをＡＣサブファミリーのメンバーであるＨｅｒｍｅｓ、Ｈｏｂｏ、Ｔａｇ２、Ｔａｍ３、Ｈｅｒｖｅｓ、Ｒｅｓｔｌｅｓｓ、およびＴｏｌ２にアラインメントすることにより、ＴｃＢｕｓｔｅｒで置換することができる高度に保存された領域内のアミノ酸を同定することができた（図４）。さらに、ＴｃＢｕｓｔｅｒのＢｕｓｔｅｒサブファミリーへの配列アラインメントは、置換され得るより多数の候補アミノ酸をもたらした（図５）。候補ＴｃＢトランスポザーゼ突然変異体は、表７に列挙される部位突然変異を含むオリゴヌクレオチドを用いて生成された。次に、突然変異体は配列確認され、ｐＣＤＮＡ－ＤＥＳＴ４０発現ベクターにクローニングされ（図６）、トランスフェクション前にミニプレップされた。
【0140】
【表7-1】
【0141】
【表7-2】
【0142】
【表7-3】
【0143】
[00165]ＴｃＢトランスポザーゼ突然変異体の転位効率を調べるために、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞は、ＷＴトランスポザーゼもしくはＶ５９６Ａ突然変異型トランスポザーゼを有するＴｃＢ Ｔｎ－８（ｍＣｈｅｒｒｙ－ピューロマイシンカセット）、または候補トランスポザーゼ突然変異体を二連にしてトランスフェクトされた。細胞を完全なＤＭＥＭ中で増殖させ（薬物選択なし）、ｍＣｈｅｒｒｙ発現をトランスフェクション後の１４日目にフローサイトメトリーにより評価した。野生型トランスポザーゼよりも高い転位効率を有する２０個を超えるＴｃＢトランスポザーゼ突然変異体が同定された（図７）。これらの調べられた突然変異体のうち、３つのアミノ酸置換Ｄ１８９Ａ、Ｖ３７７Ｔ、およびＥ４６９Ｋの組み合わせを含有する１つの突然変異型トランスポザーゼが、それぞれの単一の置換体を含有する突然変異体と比較して、転位活性の実質的な増加をもたらすことが発見された。高い転位活性を有する突然変異体はまた、とりわけ、Ｋ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌ、Ｉ４５２Ｆ、Ａ３５８Ｋ、Ｖ２９７Ｋ、Ｎ８５Ｓ、Ｓ４４７Ｅ、Ｅ２４７Ｋ、およびＱ２５８Ｔを含んでいた。
【0144】
[00166]これらの試験された突然変異体の中で、触媒トライアドアミノ酸（Ｄ２３４、Ｄ２８９、およびＥ５８９）のうちの１つに近接した、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）などの正に帯電したアミノ酸への置換の大部分が転位を増加したことが発見された。さらに、正電荷の除去、または負電荷の付加は、転位を減少させた。これらのデータは、特にこれらのアミノ酸が正に帯電したアミノ酸に突然変異している場合、触媒ドメインに近いアミノ酸はＴｃＢの転位活性を促進するのを支援し得ることを示唆している。
【0145】
[00167]高活性なＴｃＢｕｓｔｅｒ突然変異体Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋのアミノ酸配列（配列番号７８）を図１２に示す。この突然変異体のさらなる突然変異分析を実施する。図１３に示されるように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ突然変異体Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｉ４５２Ｆ（配列番号７９）が構築される。図１４に示されるように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ突然変異体Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｎ８５Ｓ（配列番号８０）が構築される。図１５に示すように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ突然変異体Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｓ３５８Ｋ（配列番号８１）が構築される。図１６に示すように、ＴｃＢｕｓｔｅｒ突然変異体Ｄ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｋ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌ（配列番号１３）が構築される。図１２～１６の各々において、ＴｃＢｕｓｔｅｒのドメインは、以下：ＺｎＦ－ＢＥＤ（小文字のレタリング）、ＤＮＡ結合／オリゴ化ドメイン（太字のレタリング）、触媒ドメイン（下線のレタリング）、および挿入ドメイン（イタリック体のレタリング）のように指示される。コアのＤ１８９Ａ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ置換は、より大きな、太字、イタリック体、下線の文字で指示される；追加の置換は、大きな太字で指示される。これらの構築物の各々は、既に記載されたように試験され、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒと比較して高活性を示すと予想される。
【0146】
[00168]実施例４．タグを含有する例示的な融合トランスフェラーゼ
[00169]この研究の目的は、融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの転位効率を生成し、試験することであった。一例として、タンパク質タグ、ＧＳＴまたはＰＥＳＴドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのＮ末端に融合して、融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを生成した。可撓性リンカーＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＴＳ（配列番号９）は、配列番号１０によってコードされ、これを用いて、ＧＳＴドメイン／ＰＥＳＴドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼから分離した。この可撓性リンカーの存在は、融合タンパク質中の非特異的相互作用を最小化し、そのため、その活性を増加させ得る。例示的な融合トランスポザーゼは上記のようにＴｃＢ Ｔｎ－８でトランスフェクトされ、転位効率は、１４日目にフローサイトメトリーによってｍＣｈｅｒｒｙ発現によって測定された。転位効率は、ＧＦＰまたはＰＥＳＴドメインのタグ化による影響を受けなかった（図９）。これは、トランスポザーゼＤＮＡ結合ドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒカーゴの直接組み込みに融合してセーフハーバー部位などのゲノム部位を選択することがＴｃＢｕｓｔｅｒにとって実行可能な選択肢であり得、より安全な組み込みプロファイルを可能にすることを示唆する。
[00169]この研究の目的は、融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの転位効率を生成し、試験することであった。一例として、タンパク質タグ、ＧＳＴまたはＰＥＳＴドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのＮ末端に融合して、融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを生成した。可撓性リンカーＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＴＳ（配列番号９）は、配列番号１０によってコードされ、これを用いて、ＧＳＴドメイン／ＰＥＳＴドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼから分離した。この可撓性リンカーの存在は、融合タンパク質中の非特異的相互作用を最小化し、そのため、その活性を増加させ得る。例示的な融合トランスポザーゼは上記のようにＴｃＢ Ｔｎ－８でトランスフェクトされ、転位効率は、１４日目にフローサイトメトリーによってｍＣｈｅｒｒｙ発現によって測定された。転位効率は、ＧＦＰまたはＰＥＳＴドメインのタグ化による影響を受けなかった（図９）。これは、トランスポザーゼＤＮＡ結合ドメインをＴｃＢｕｓｔｅｒカーゴの直接組み込みに融合してセーフハーバー部位などのゲノム部位を選択することがＴｃＢｕｓｔｅｒにとって実行可能な選択肢であり得、より安全な組み込みプロファイルを可能にすることを示唆する。
【0147】
[00170]実施例５．ＴＡＬＥドメインを含む例示的な融合トランスポザーゼ
[00171]この研究の目的は、ＴＡＬＥドメインを含む融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを生成し、融合トランスポザーゼの転位活性を調べることである。ＴＡＬＥ配列（配列番号１１）は、ヒトゲノムのヒトＡＡＶＳ１（ｈＡＡＶＳ１）部位を標的とするように設計される。このようにして、ＴＡＬＥ配列を野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）のＮ末端に融合させて、融合トランスポザーゼを生成する。可撓性リンカーＧｌｙ４Ｓｅｒ２は、配列番号１２によってコードされ、ＴＡＬＥドメインとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列を分離するために使用される。例示的な融合トランスポザーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。
[00171]この研究の目的は、ＴＡＬＥドメインを含む融合ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを生成し、融合トランスポザーゼの転位活性を調べることである。ＴＡＬＥ配列（配列番号１１）は、ヒトゲノムのヒトＡＡＶＳ１（ｈＡＡＶＳ１）部位を標的とするように設計される。このようにして、ＴＡＬＥ配列を野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１）のＮ末端に融合させて、融合トランスポザーゼを生成する。可撓性リンカーＧｌｙ４Ｓｅｒ２は、配列番号１２によってコードされ、ＴＡＬＥドメインとＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列を分離するために使用される。例示的な融合トランスポザーゼは、配列番号８のアミノ酸配列を有する。
【0148】
[00172]例示的な融合トランスポザーゼは、エレクトロポレーションの援助を受けて、上記のようにＴｃＢ Ｔｎ－８でＨｅｌａ細胞にトランスフェクトされる。ＴｃＢ Ｔｎ－８は、レポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙを含む。トランスフェクション効率は、トランスフェクションの２日後にｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を計数するフローサイトメトリーによって調べることができる。さらに、次世代シークエンシングが、ゲノム内のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子挿入部位を評価するために行われる。設計されたＴＡＬＥ配列は、ｈＡＡＶＳ１部位の近くのゲノム部位におけるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の標的挿入を媒介し得ることが予想される。
【0149】
[00173]実施例６．初代ヒトＴ細胞における転位効率
[00174]この研究の目的は、初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を操作するためのＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンシステムを開発することであった。この目的のために、本発明者らは、ＧＦＰ導入遺伝子を保有する例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンをミニサークルプラスミドに組み入れた。活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＴｃＢミニサークルトランスポゾン、およびＷＴ ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼなどのＲＮＡトランスポザーゼでエレクトロポレートされ、実施例２に記載されるように例示的な突然変異体を選択した。導入遺伝子発現は、フローサイトメトリーによってエレクトロポレーション後の２１日間、モニターされた。
[00174]この研究の目的は、初代ＣＤ３＋Ｔ細胞を操作するためのＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンシステムを開発することであった。この目的のために、本発明者らは、ＧＦＰ導入遺伝子を保有する例示的なＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンをミニサークルプラスミドに組み入れた。活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＴｃＢミニサークルトランスポゾン、およびＷＴ ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼなどのＲＮＡトランスポザーゼでエレクトロポレートされ、実施例２に記載されるように例示的な突然変異体を選択した。導入遺伝子発現は、フローサイトメトリーによってエレクトロポレーション後の２１日間、モニターされた。
【0150】
[00175]ＴｃＢトランスポゾンの転位は、ＷＴ ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびＶ５９６Ａ突然変異型トランスポザーゼと比較して、トランスフェクションの１４日後、例示的な突然変異体Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９ＫおよびＶ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａを用いると、ほぼ２倍改善されることが見出された（図１０Ａ）。さらに、高活性な突然変異体Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９ＫおよびＶ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａの平均転位効率は、それぞれＳＢ１１（平均＝８．４）と比較して２倍（平均＝２０．２）および３倍（平均＝２４．１）効率的であった。
【0151】
[00176]次に、ＣＤ３＋Ｔ細胞の生存率は、ミニサークルＴｃＢトランスポゾンおよびＲＮＡトランスポザーゼを用いたエレクトロポレーションの２日後に評価された。ＣＤ３＋Ｔ細胞をＴｃＢミニサークルおよびＲＮＡトランスポザーゼでトランスフェクトした場合、生存率は中程度に減少することが見出された。しかしながら、細胞は７日目までに生存率を急速に回復した（図１０Ｂ）。これらの実験は、本開示の一部の実施形態による、初代Ｔ細胞の細胞工学におけるＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンシステムの能力を実証する。
【0152】
[00177]実施例７．癌患者の治療のためのキメラ抗原受容体修飾されたＴ細胞の生成
[00178]前述のＴｃＢ Ｔｎ－８構築物を含有するミニサークルプラスミドは、トランスポゾンの逆位リピート配列の間にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子を収容するように設計することができる。ＣＡＲは、ＣＤ１３７（Ｔ細胞の共刺激受容体［４－１ＢＢ］）およびＣＤ３－ゼータ（Ｔ細胞抗原受容体のシグナル伝達成分）シグナル伝達ドメインでカップリングされた、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９に対する特異性を有するように設計することができる。
[00178]前述のＴｃＢ Ｔｎ－８構築物を含有するミニサークルプラスミドは、トランスポゾンの逆位リピート配列の間にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子を収容するように設計することができる。ＣＡＲは、ＣＤ１３７（Ｔ細胞の共刺激受容体［４－１ＢＢ］）およびＣＤ３－ゼータ（Ｔ細胞抗原受容体のシグナル伝達成分）シグナル伝達ドメインでカップリングされた、Ｂ細胞抗原ＣＤ１９に対する特異性を有するように設計することができる。
【0153】
[00179]自己Ｔ細胞は、癌、例えば、白血病を有する患者の末梢血から得られる。Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離により単球を枯渇させることにより単離することができる。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＤＹＮＡＢＥＡＤ Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コンジュゲートビーズを用いたフローサイトメトリーによって単離することができる。単離されたＴ細胞は、ＧＭＰガイダンスに従って標準条件下で培養される。
【0154】
[00180]初代Ｔ細胞の遺伝子修飾は、上記される、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ（配列番号１３）、ならびにＣＡＲを含むＴｃＢｕｓｔｅｒ Ｔｎ－８トランスポザーゼを用いて実行される。Ｔ細胞は、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびＣＡＲ含有Ｔｎ－８トランスポザーゼの存在下でエレクトロポレートされる。トランスフェクション後、Ｔ細胞は、活性化および増殖のために免疫刺激試薬（抗ＣＤ３抗体ならびにＩＬ－２、ＩＬ－７、およびＩＬ－１５など）で処理される。トランスフェクションの検証は、トランスフェクションの２週間後に次世代シークエンシングによって行われる。トランスフェクトされたＴ細胞におけるトランスフェクション効率およびトランスジーン負荷は、治療レジメンの設計を補助するために決定することができる。危険な導入遺伝子挿入部位が配列決定の結果によって明らかにされた場合、安全上の懸念を排除するために特定の対策もまた取られる。
【0155】
[00181]癌患者へのキメラ抗原受容体修飾されたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の注入は、導入遺伝子挿入の検証および臨床的に望ましいレベルへのＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロでの拡大後に開始される。
【0156】
[00182]注入量は、限定されないが、処置の日における、癌の病期、患者の治療歴、ならびにＣＢＣ（完全血球数）および患者のバイタルサインなどの多数の要因によって決定される。疾患の進行、患者の嫌悪反応、および他の多くの医学的要因に応じて、注入量を上昇または緩和させることができる。その間、治療レジメン中に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析が行われて、血液および骨髄中のキメラ抗原受容体Ｔ細胞が検出される。ｑＰＣＲ分析は、投薬戦略および他の治療計画に関して医学的決定を下すために利用することができる。
【0157】
【表8-1】
【0158】
【表8-2】
【0159】
【表8-3】
【0160】
【表8-4】
【0161】
【表8-5】
【0162】
【表8-6】
【0163】
【表8-7】
【0164】
【表8-8】
【0165】
[00183]本発明の好ましい実施形態は、本明細書において示され、説明されているが、
このような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかである。多数の変形、変更、および置換は、ここでは、当業者に、本発明から逸脱することなく、想到される。本明細書中に記載された本発明の実施形態に対する種々の代替物が本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって包含されることが意図される。
国際出願時の特許請求の範囲
[項１] 全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２] １つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項１に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項３] １つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸から中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項１または２に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項４] 表４からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項５] 全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ－ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項６] 全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項７] 配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項８] 配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上のアミノ酸が、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する、請求項１～７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項９] 近接が、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である、請求項７または８に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１０] 近接が、約７０～８０アミノ酸の距離である、請求項７または８に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１１] 突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列が、全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１２] 表２からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１３] 表３からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１４] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１５] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１６] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１７] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１８] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１９] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２０] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２１] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２２] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２３] 転位効率が、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびレポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを細胞の集団に導入すること、そして、細胞の集団のゲノムにおけるレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２４] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼであって、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が全長の配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する融合トランスポザーゼ。
[項２５] ＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶ Ｒｅｐ ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２４に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２６] ＤＮＡ配列特異的結合ドメインがＴＡＬＥドメインを含む、請求項２４または２５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２７] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２８] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２９] １つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項２８に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３０] １つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸の、中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンでの置換を含む、請求項２８または２９に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３１] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ－ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３２] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３３] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３４] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３５] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３６] 近接が、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である、請求項３４または３５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３７] 近接が、約７０～８０アミノ酸の距離である、請求項３４または３５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３８] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表２からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３９] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表３からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４０] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４～３９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４１] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項２４～４０のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４２] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む、請求項２４～４１のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４３] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む、請求項２４～４２のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４４] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む、請求項２４～４３のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４５] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む、請求項２４～４４のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４６] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４～４５のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４７] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４～４６のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４８] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項２４～４７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４９] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号１に対して１００％の同一性を有する、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５０] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、リンカーによって分離されている、請求項２４～４８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５１] リンカーが、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項５０に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５２] リンカーが配列番号９を含む、請求項５０または５１に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５３] 請求項１～２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項５４] 請求項２４～４９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項５５] 突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項５３または５４に記載のポリヌクレオチド。
[項５６] 突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項５７] ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
[項５８] 突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、請求項５３～５７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項５９] ＤＮＡベクター中に存在する、請求項５３～５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項６０] ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
[項６１] 請求項１～４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞。
[項６２] 請求項５３～６０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
[項６３] 請求項１～２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項６４] 請求項２４～４９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ、および融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項６５] 導入する工程が、細胞を、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む、請求項６３または６４に記載の方法。
[項６６] ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項６５に記載の方法。
[項６７] ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項６５に記載の方法。
[項６８] ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項６７に記載の方法。
[項６９] 導入する工程が、細胞を、トランスポゾンを含有するＤＮＡベクターと接触させることを含む、請求項６３～６８のいずれか一項に記載の方法。
[項７０] ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項６９に記載の方法。
[項７１] 導入する工程が、細胞を、トランスポゾンと、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含有するプラスミドベクターと接触させることを含む、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の方法。
[項７２] 導入する工程が、細胞を、精製タンパク質としての突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと接触させることを含む、請求項６３～７１のいずれか一項に記載の方法。
[項７３] トランスポゾンが、２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の方法。
[項７４] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７５] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号３を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７６] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
[項７７] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号４を含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
[項７８] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７９] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号５を含む、請求項７３に記載の方法。
[項８０] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３、７８、または７９に記載の方法。
[項８１] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号６を含む、請求項７３、７８、または７９に記載の方法。
[項８２] カーゴカセットが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項７３～８１のいずれか一項に記載の方法。
[項８３] カーゴカセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項７３～８２のいずれか一項に記載の方法。
[項８４] カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項７３～８３のいずれか一項に記載の方法。
[項８５] カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項７３～８３のいずれか一項に記載の方法。
[項８６] 導入する工程が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを利用して細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項６３～８５のいずれか一項に記載の方法。
[項８７] 導入する工程が、細胞をエレクトロポレートするステップを含む、請求項６３～８６のいずれか一項に記載の方法。
[項８８] 細胞が、対象から単離された初代細胞である、請求項６３～８７のいずれか一項に記載の方法。
[項８９] 対象がヒトである、請求項８８に記載の方法。
[項９０] 対象が疾患を有する患者である、請求項８８または８９に記載の方法。
[項９１] 対象が癌または腫瘍と診断されている、請求項８８～９０のいずれか一項に記載の方法。
[項９２] 細胞が対象の血液から単離される、請求項８８～９１のいずれか一項に記載の方法。
[項９３] 細胞が初代免疫細胞を含む、請求項６３～９２のいずれか一項に記載の方法。
[項９４] 細胞が初代白血球を含む、請求項６３～９３のいずれか一項に記載の方法。
[項９５]
細胞が初代Ｔ細胞を含む、請求項６３～９４のいずれか一項に記載の方法。
[項９６] 初代Ｔ細胞が、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９５に記載の方法。
[項９７] 初代免疫細胞がＣＤ３＋細胞を含む、請求項９３～９６のいずれか一項に記載の方法。
[項９８] 細胞が幹細胞を含む、請求項６３～９７のいずれか一項に記載の方法。
[項９９] 幹細胞が、以下の細胞からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法：
胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項１００] 幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項９８に記載の方法。
[項１０１] カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項７３～１００のいずれか一項に記載の方法。
[項１０２] 導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１０１に記載の方法：
細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項１０３] 導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項１０１または１０２に記載の方法：
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせ。
[項１０４] （ａ）トランスポゾン、およびトランスポゾンを認識する請求項１～４７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを細胞に導入し、それによって遺伝子修飾された細胞を生成すること；ならびに
（ｂ）遺伝子修飾された細胞を、治療を必要とする患者に投与すること
を含む治療の方法。
[項１０５] 遺伝子修飾された細胞が、トランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む、請求項１０４に記載の方法。
[項１０６] 患者が癌または腫瘍と診断されている、請求項１０４または１０５に記載の方法。
[項１０７] 投与するステップが、遺伝子修飾された細胞を患者の血管内に輸注するステップを含む、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。
[項１０８] 請求項１～４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項１０９] 請求項１～４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項１１０] ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項１０９に記載のシステム。
[項１１１] ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１０９または１１０に記載のシステム。
[項１１２] ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項１１１に記載のシステム。
[項１１３] トランスポゾンがＤＮＡベクター中に存在する、請求項１０８～１１２のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１４] ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項１１３に記載のシステム。
[項１１５] ポリヌクレオチドおよびトランスポゾンが同じプラスミド中に存在する、請求項１０９～１１４のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１６] トランスポゾンが、２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項１０８～１１５のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１７] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１１８] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号３を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１１９] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２０] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号４を含む、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２１] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはと少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１２２] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号５を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１２３] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６、１２１、または１２２に記載のシステム。
[項１２４] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号６を含む、請求項１１６、１２１、または１２２に記載のシステム。
[項１２５] カーゴカセットが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１１６～１２４のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２６] カーゴカセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項１１６～１１６のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２７] カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項１１６～１２６のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２８] 導入遺伝子が、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１２７に記載のシステム。
[項１２９] 導入遺伝子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項１２７または１２８に記載のシステム。
[項１３０] カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項１１６～１２９のいずれか一項に記載のシステム。
[項１３１] カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項１１６～１２９のいずれか一項に記載のシステム。
このような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかである。多数の変形、変更、および置換は、ここでは、当業者に、本発明から逸脱することなく、想到される。本明細書中に記載された本発明の実施形態に対する種々の代替物が本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって包含されることが意図される。
国際出願時の特許請求の範囲
[項１] 全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２] １つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項１に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項３] １つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸から中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項１または２に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項４] 表４からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項５] 全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ－ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項６] 全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項７] 配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項８] 配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上のアミノ酸が、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する、請求項１～７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項９] 近接が、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である、請求項７または８に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１０] 近接が、約７０～８０アミノ酸の距離である、請求項７または８に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１１] 突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列が、全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１２] 表２からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１３] 表３からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１４] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１５] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１６] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１７] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１８] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１９] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２０] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２１] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２２] 配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２３] 転位効率が、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびレポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを細胞の集団に導入すること、そして、細胞の集団のゲノムにおけるレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２４] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼであって、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が全長の配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する融合トランスポザーゼ。
[項２５] ＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶ Ｒｅｐ ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２４に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２６] ＤＮＡ配列特異的結合ドメインがＴＡＬＥドメインを含む、請求項２４または２５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２７] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２８] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２９] １つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項２８に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３０] １つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸の、中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンでの置換を含む、請求項２８または２９に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３１] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ－ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３２] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３３] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３４] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３５] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する、請求項２４～３４のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３６] 近接が、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である、請求項３４または３５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３７] 近接が、約７０～８０アミノ酸の距離である、請求項３４または３５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３８] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表２からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３９] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表３からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４～３８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４０] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４～３９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４１] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項２４～４０のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４２] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む、請求項２４～４１のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４３] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む、請求項２４～４２のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４４] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む、請求項２４～４３のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４５] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む、請求項２４～４４のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４６] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４～４５のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４７] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４～４６のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４８] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項２４～４７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４９] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号１に対して１００％の同一性を有する、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５０] ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、リンカーによって分離されている、請求項２４～４８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５１] リンカーが、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項５０に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５２] リンカーが配列番号９を含む、請求項５０または５１に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５３] 請求項１～２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項５４] 請求項２４～４９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項５５] 突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項５３または５４に記載のポリヌクレオチド。
[項５６] 突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項５３～５５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項５７] ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
[項５８] 突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、請求項５３～５７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項５９] ＤＮＡベクター中に存在する、請求項５３～５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項６０] ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
[項６１] 請求項１～４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞。
[項６２] 請求項５３～６０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
[項６３] 請求項１～２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項６４] 請求項２４～４９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ、および融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項６５] 導入する工程が、細胞を、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む、請求項６３または６４に記載の方法。
[項６６] ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項６５に記載の方法。
[項６７] ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項６５に記載の方法。
[項６８] ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項６７に記載の方法。
[項６９] 導入する工程が、細胞を、トランスポゾンを含有するＤＮＡベクターと接触させることを含む、請求項６３～６８のいずれか一項に記載の方法。
[項７０] ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項６９に記載の方法。
[項７１] 導入する工程が、細胞を、トランスポゾンと、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含有するプラスミドベクターと接触させることを含む、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の方法。
[項７２] 導入する工程が、細胞を、精製タンパク質としての突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと接触させることを含む、請求項６３～７１のいずれか一項に記載の方法。
[項７３] トランスポゾンが、２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項６３～７２のいずれか一項に記載の方法。
[項７４] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７５] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号３を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７６] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
[項７７] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号４を含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
[項７８] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７９] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号５を含む、請求項７３に記載の方法。
[項８０] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３、７８、または７９に記載の方法。
[項８１] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号６を含む、請求項７３、７８、または７９に記載の方法。
[項８２] カーゴカセットが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項７３～８１のいずれか一項に記載の方法。
[項８３] カーゴカセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項７３～８２のいずれか一項に記載の方法。
[項８４] カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項７３～８３のいずれか一項に記載の方法。
[項８５] カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項７３～８３のいずれか一項に記載の方法。
[項８６] 導入する工程が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを利用して細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項６３～８５のいずれか一項に記載の方法。
[項８７] 導入する工程が、細胞をエレクトロポレートするステップを含む、請求項６３～８６のいずれか一項に記載の方法。
[項８８] 細胞が、対象から単離された初代細胞である、請求項６３～８７のいずれか一項に記載の方法。
[項８９] 対象がヒトである、請求項８８に記載の方法。
[項９０] 対象が疾患を有する患者である、請求項８８または８９に記載の方法。
[項９１] 対象が癌または腫瘍と診断されている、請求項８８～９０のいずれか一項に記載の方法。
[項９２] 細胞が対象の血液から単離される、請求項８８～９１のいずれか一項に記載の方法。
[項９３] 細胞が初代免疫細胞を含む、請求項６３～９２のいずれか一項に記載の方法。
[項９４] 細胞が初代白血球を含む、請求項６３～９３のいずれか一項に記載の方法。
[項９５]
細胞が初代Ｔ細胞を含む、請求項６３～９４のいずれか一項に記載の方法。
[項９６] 初代Ｔ細胞が、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９５に記載の方法。
[項９７] 初代免疫細胞がＣＤ３＋細胞を含む、請求項９３～９６のいずれか一項に記載の方法。
[項９８] 細胞が幹細胞を含む、請求項６３～９７のいずれか一項に記載の方法。
[項９９] 幹細胞が、以下の細胞からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法：
胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項１００] 幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項９８に記載の方法。
[項１０１] カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項７３～１００のいずれか一項に記載の方法。
[項１０２] 導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１０１に記載の方法：
細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項１０３] 導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項１０１または１０２に記載の方法：
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせ。
[項１０４] （ａ）トランスポゾン、およびトランスポゾンを認識する請求項１～４７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを細胞に導入し、それによって遺伝子修飾された細胞を生成すること；ならびに
（ｂ）遺伝子修飾された細胞を、治療を必要とする患者に投与すること
を含む治療の方法。
[項１０５] 遺伝子修飾された細胞が、トランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む、請求項１０４に記載の方法。
[項１０６] 患者が癌または腫瘍と診断されている、請求項１０４または１０５に記載の方法。
[項１０７] 投与するステップが、遺伝子修飾された細胞を患者の血管内に輸注するステップを含む、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。
[項１０８] 請求項１～４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項１０９] 請求項１～４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項１１０] ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項１０９に記載のシステム。
[項１１１] ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１０９または１１０に記載のシステム。
[項１１２] ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項１１１に記載のシステム。
[項１１３] トランスポゾンがＤＮＡベクター中に存在する、請求項１０８～１１２のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１４] ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項１１３に記載のシステム。
[項１１５] ポリヌクレオチドおよびトランスポゾンが同じプラスミド中に存在する、請求項１０９～１１４のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１６] トランスポゾンが、２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項１０８～１１５のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１７] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１１８] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号３を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１１９] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２０] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号４を含む、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２１] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはと少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１２２] ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号５を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１２３] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６、１２１、または１２２に記載のシステム。
[項１２４] ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号６を含む、請求項１１６、１２１、または１２２に記載のシステム。
[項１２５] カーゴカセットが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１１６～１２４のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２６] カーゴカセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項１１６～１１６のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２７] カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項１１６～１２６のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２８] 導入遺伝子が、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１２７に記載のシステム。
[項１２９] 導入遺伝子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項１２７または１２８に記載のシステム。
[項１３０] カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項１１６～１２９のいずれか一項に記載のシステム。
[項１３１] カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項１１６～１２９のいずれか一項に記載のシステム。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】