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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-10
(45)【発行日】2023-05-18
(54)【発明の名称】肌用製品の素材
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9789 20170101AFI20230511BHJP
A61Q 19/02 20060101ALI20230511BHJP
A61K 36/535 20060101ALI20230511BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9789
A61Q19/02
A61K36/535
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019084272
(22)【出願日】2019-04-25
(65)【公開番号】P2020180077
(43)【公開日】2020-11-05
【審査請求日】2021-12-20
(73)【特許権者】
【識別番号】399071421
【氏名又は名称】株式会社実正
(74)【代理人】
【識別番号】100107939
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 由美子
(74)【代理人】
【識別番号】100100413
【弁理士】
【氏名又は名称】渡部 温
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 聡
【審査官】松元 麻紀子
(56)【参考文献】
【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－００２７３２７（ＫＲ，Ａ）
【文献】特開２００４－１９６６６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００１－０３１５５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－１７９２２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－０２０９９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２７８５２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／９７８９
Ａ６１Ｑ １９／０２
Ａ６１Ｋ ３６／５３５
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＫＯＳＭＥＴ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
エゴマ種子超臨界ＣＯ
２
抽出物であり、美白効果を有し、かつ、細胞毒性を有しないことを特徴とする化粧料の素材。
【請求項2】
請求項１の化粧料の素材を含有することを特徴とする化粧料。
【請求項3】
前記化粧料の素材の添加濃度が１μｇ／ｍＬより大きいことを特徴とする請求項２に記載の化粧料。
【請求項4】
前記化粧料が、基礎化粧品、メーキャップ化粧品、ボディーケア商品、または、薬用化粧品であることを特徴とする請求項２または３のいずれか1項に記載の化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、肌用製品の素材に関し、特に、化粧品などの肌用製品であり、美白効果を有する肌用製品の素材に関する。
【背景技術】
【0002】
近年においては、特に美容の観点から、紫外線による皮膚の蓄積的なダメージが特に意識されるようになった。紫外線の照射は、皮膚の基底層と毛母に存在するメラノサイトを刺激し、メラニンを産生する。メラニンは、ヒトの肌、毛髪、目の色を決定すると共に、生体にとって有害な紫外線を遮断する役割を持つ重要な生体色素である。一方、紫外線を長年にわたって浴びることで、メラニン色素が過剰に生産され、シミやシワ、ソバカスなど、外観的に好ましくない事象が生じる。そのため、メラノサイトのメラニン産生を効率的に抑制することは美容上からも健康上からも非常に重要である、と考えられている。
【0003】
例えば、特許文献１には、琥珀熱水抽出物がメラニン産生を抑制し、美白効果を奏することから、琥珀熱水抽出物を有効成分として含有する美白剤が開示されている。また、より効果的な琥珀由来のメラニン産生抑制剤として、特許文献２には、琥珀抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分画する工程を含む製造方法によりメラニン産生抑制剤が得られることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２０１０－２３５５５１号公報
【文献】特許第５８５８５６２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は上記問題点に鑑み、なされたものであり、その目的は、メラノサイトのメラニン産生を効率的に抑制することができる肌用製品の素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の肌用製品の素材は、美白効果を有することを特徴とする。
【0007】
本発明においては、さらに、細胞毒性を有しないことが好ましい。
【0008】
本発明においては、肌用製品の素材が、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物であることが好ましい。
【0009】
本発明の肌用製品は、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物を含有することを特徴とする。
【0010】
本発明においては、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物の添加濃度が１μｇ／ｍＬより大きいことが好ましい。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、メラノサイトのメラニン産生を効率的に抑制することができる肌用製品の素材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞の顕微鏡写真であり、（ａ）は無刺激細胞（ＩＢＭＸ無添加）、（ｂ）は対照、（ｃ）は１μｇ／ｍＬのエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加した細胞であり、（ｄ）は１０μｇ／ｍＬのエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加した細胞であり、（ｅ）は１００μｇ／ｍＬのエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加した細胞の顕微鏡写真である。
【図2】エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量比を示すグラフである。
【図3】エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示すグラフである。
【図4】抽出法の異なるエゴマ種子抽出物がＢ１６マウスメラノーマ細胞のメラニン産生に与える影響を示すグラフであり、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）、エタノール抽出物（エキス）（液相）およびエタノール抽出物（エキス）（固相）をそれぞれ添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量の割合を示すグラフである。
【図5】エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）と青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）がＢ１６マウスメラノーマ細胞のメラニン産生に与える影響を示すグラフであり、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）および青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）をそれぞれ添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量の割合を示すグラフである。
【図6】エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）とエゴマ油がＢ１６マウスメラノーマ細胞のメラニン産生に与える影響を示すグラフであり、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）およびエゴマ油をそれぞれ添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量の割合を示すグラフである。
【図7】エゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（液相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示すグラフである。
【図8】エゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（固相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示すグラフである。
【図9】青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示すグラフである。
【図10】エゴマ油のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の肌用製品の素材は、美白効果を有する。本発明において、肌用製品とは、人体の皮膚等に適用される製品であり、基礎化粧品、メーキャップ化粧品、洗顔石鹸やボディー石鹸、ボディー乳液等のボディーケア商品などの化粧品類のみならず、医薬部外品に分類される薬用化粧品なども含む。
【0014】
本発明において、肌用製品の素材としては、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物、エゴマ種子エタノール抽出物（液相、固相）、エゴマ油、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物等が挙げられるが、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物が好ましい。エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物は、メラニン産生抑制効果が非常に高いという利点を有する。なお、本発明においては、本発明の効果を発揮する限りにおいて、超臨界ＣＯ２抽出物は亜臨界ＣＯ２抽出物も含むものとする。また、抽出物の形状としては、液体、固体、オイル状態などが挙げられ、液相、固相、オイルなども含むものとする。本発明においては、抽出物をエキスと表記することもあるが、同等のものである。
【0015】
本発明において、美白効果は、メラノサイトのメラニン産生を効率的に抑制することができるか否かで評価する。エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物、エゴマ種子エタノール抽出物（液相、固相）、エゴマ油、および青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物は、メラノサイトのメラニン産生を抑制することができることが本発明によって見出された。
【0016】
ただし、上記抽出物の中には細胞毒性を有するものが存在し、例えば、エゴマ種子エタノール抽出物は５０μｇ／ｍＬ以上、青ジソ種子抽出物は１００μｇ／ｍＬ以上の添加濃度では、細胞毒性を有し、細胞生存率を低下させる。したがって、細胞生存率の低下を避けるためには、肌用製品への使用濃度の上限値が必要であり、必然的にメラニン産生抑制効果にも限界があることになる。
【0017】
一方、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物は１００μｇ／ｍＬという高濃度においてさえも細胞毒性を有しておらず、細胞生存率を低下させることがないという効果も併せ持つ優れた素材であり、非常に高いメラニン産生抑制効果を実現できるものである。したがって、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物を肌用製品の素材として一般的な方法で使用する場合には、使用濃度の上限値は特に限定する必要はなく、所望のメラニン産生抑制効果を考慮しつつ、肌用製品の他の有効成分の含有量やその他の要素によって適宜決定されることが好ましい。なお、美白効果を発揮させるという観点から言えば、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物の使用濃度は、１μｇ／ｍＬより大きく、好ましくは２μｇ／ｍＬ以上であり、更に好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上であり、特に好ましくは１００μｇ／ｍＬ以上である。
【0018】
本発明において、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物は、例えば、エゴマ種子を乳鉢ですり潰して粉体状にしても良いし、あるいは粉体状のものを商業的に入手しても良いが、粉体状のエゴマ種子粉を超臨界抽出システムに充填して、抽出物を得ることができる。超臨界ＣＯ２抽出システムを用いる場合には、温度、圧力、ＣＯ２の流速を所定条件に設定する必要があり、温度は２５℃～８０℃の範囲内であり、好ましくは３０℃～８０℃の範囲内であり、更に好ましくは３５℃～４５℃の範囲内である。また、圧力は５～４０ＭＰａの範囲内であり、好ましくは７．５～４０ＭＰａの範囲内であり、更に好ましくは１５～２５ＭＰａの範囲内である。また、ＣＯ２の流速は１～４０ｍＬ／ｍｉｎの範囲内であることが好ましい。
【実施例】
【0019】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【0020】
（試料の調製）
（１）エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物
エゴマ種子粉（合同会社ＰＡＬ 梅田町工場製（宮城県））を、商業的に入手した。このエゴマ種子粉を、日本分光株式会社製の超臨界抽出システムに適量充填し、温度４０℃、圧力２０ＭＰａ、ＣＯ２流速３．０ｍＬ／ｍｉｎの条件で抽出することにより、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（オイル状）を得た。
（１）エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物
エゴマ種子粉（合同会社ＰＡＬ 梅田町工場製（宮城県））を、商業的に入手した。このエゴマ種子粉を、日本分光株式会社製の超臨界抽出システムに適量充填し、温度４０℃、圧力２０ＭＰａ、ＣＯ２流速３．０ｍＬ／ｍｉｎの条件で抽出することにより、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（オイル状）を得た。
【0021】
（２）エゴマ種子エタノール抽出物
エゴマ種子粉（合同会社ＰＡＬ 梅田町工場製（宮城県））を、商業的に入手した。このエゴマ種子粉を容器に入れ、これに３倍重量のエタノール（富士フィルム和光純薬株式会社製）を加えて２日間撹拌した後、濾過し、上澄みを蒸発させて残渣を回収してエゴマ種子のエタノール抽出物を得た。ただし、この残渣は、液相と固相に分離しており、両者を別々に回収して試料（液相）および試料（固相）とした。
エゴマ種子粉（合同会社ＰＡＬ 梅田町工場製（宮城県））を、商業的に入手した。このエゴマ種子粉を容器に入れ、これに３倍重量のエタノール（富士フィルム和光純薬株式会社製）を加えて２日間撹拌した後、濾過し、上澄みを蒸発させて残渣を回収してエゴマ種子のエタノール抽出物を得た。ただし、この残渣は、液相と固相に分離しており、両者を別々に回収して試料（液相）および試料（固相）とした。
【0022】
（３）青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物
青ジソ種子（日栄株式会社製（東京都））を商業的に入手し、この青ジソ種子を乳鉢ですり潰して青ジソ種子粉を作製した。この青ジソ種子粉を、日本分光株式会社製の超臨界抽出システムに適量充填し、温度４０℃、圧力２０ＭＰａ、ＣＯ２流速３．０ｍＬ／ｍｉｎの条件で抽出することにより、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物を得た。
青ジソ種子（日栄株式会社製（東京都））を商業的に入手し、この青ジソ種子を乳鉢ですり潰して青ジソ種子粉を作製した。この青ジソ種子粉を、日本分光株式会社製の超臨界抽出システムに適量充填し、温度４０℃、圧力２０ＭＰａ、ＣＯ２流速３．０ｍＬ／ｍｉｎの条件で抽出することにより、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物を得た。
【0023】
（４）エゴマ油
エゴマ油は、有限会社九南サービス（宮崎県）から商業的に入手した。
エゴマ油は、有限会社九南サービス（宮崎県）から商業的に入手した。
【0024】
（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の培養）
メラニン産生抑制試験に汎用されるＢ１６マウスメラノーマ細胞（メラノサイト由来の癌化細胞）を、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより商業的に入手した。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞は、５％ＣＯ２、３７℃の環境下にて、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；Biological Industries, CT）を含有するEagle’s MEM（富士フィルム和光純薬株式会社製）を培地とし、２５ｃｍ２フラスコ中で培養した。
メラニン産生抑制試験に汎用されるＢ１６マウスメラノーマ細胞（メラノサイト由来の癌化細胞）を、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより商業的に入手した。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞は、５％ＣＯ２、３７℃の環境下にて、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；Biological Industries, CT）を含有するEagle’s MEM（富士フィルム和光純薬株式会社製）を培地とし、２５ｃｍ２フラスコ中で培養した。
【0025】
試験例１
（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞への試料の添加）
培養されたＢ１６マウスメラノーマ細胞は、０．２５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ混液（富士フィルム和光純薬株式会社製）を用いて２５ｃｍ２フラスコから剥離され、６穴培養プレートに２．４×１０５cells/wellの密度で播種した。
（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞への試料の添加）
培養されたＢ１６マウスメラノーマ細胞は、０．２５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ混液（富士フィルム和光純薬株式会社製）を用いて２５ｃｍ２フラスコから剥離され、６穴培養プレートに２．４×１０５cells/wellの密度で播種した。
【0026】
播種した翌日、メラニン産生を促進するため、１０％ＦＢＳを含有する培地に、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ；富士フィルム和光純薬株式会社製）を１００μＭの濃度で加えて刺激した。この培地に、エタノールに１０ｍｇ／ｍＬの割合で試料（エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物）を溶解したものを、所定量（添加濃度：１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）を添加した。ただし、試料の添加濃度にかかわらずエタノール濃度が一定になるように、エタノールを後添して調製した。これらの培地をＢ１６マウスメラノーマ細胞に２ｍＬ／wellで加えた（ｎ＝３）。
【0027】
対照群の細胞には、１００μＭのＩＢＭＸと共に、試料添加群と同じ濃度になるようエタノールを加えて調製し、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞に２ｍＬ／wellで加えた（ｎ＝３）。
【0028】
無刺激群の細胞には、ＩＢＭＸを添加していない１０％ＦＢＳ含有培地を２ｍＬ／well供した。
【0029】
（細胞の撮影）
上記のようにして“Ｂ１６マウスメラノーマ細胞への試料の添加”の操作を行ってから、３日後に、各wellの細胞を顕微鏡下にて撮影した。ただし、撮影時には、メラニンの色を識別し易いように、位相差は外した。その顕微鏡写真を図１に示す。
上記のようにして“Ｂ１６マウスメラノーマ細胞への試料の添加”の操作を行ってから、３日後に、各wellの細胞を顕微鏡下にて撮影した。ただし、撮影時には、メラニンの色を識別し易いように、位相差は外した。その顕微鏡写真を図１に示す。
【0030】
試験例２
（メラニン定量）
上記“細胞の撮影”が終了した直後、各wellの細胞を、２ｍＬのリン酸緩衝食塩水（Phosphate Buffered Saline；ＰＢＳ（富士フィルム和光純薬株式会社製））で１回洗浄し、１ＭのＮａＯＨを２５０μＬ／well加えて溶解した。溶出したメラニンをピペッティングにより均一にした後、各wellから１１５μＬを採取して９６穴プレートに移した。同時に、検量線作成用として、１ＭのＮａＯＨに溶解した標準メラニン（富士フィルム和光純薬株式会社製）の希釈系列を作り、同一の上記９６穴プレートに移した。この９６穴プレート上の各液につき、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ただし、バックグラウンドを消去するため、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設定した。
（メラニン定量）
上記“細胞の撮影”が終了した直後、各wellの細胞を、２ｍＬのリン酸緩衝食塩水（Phosphate Buffered Saline；ＰＢＳ（富士フィルム和光純薬株式会社製））で１回洗浄し、１ＭのＮａＯＨを２５０μＬ／well加えて溶解した。溶出したメラニンをピペッティングにより均一にした後、各wellから１１５μＬを採取して９６穴プレートに移した。同時に、検量線作成用として、１ＭのＮａＯＨに溶解した標準メラニン（富士フィルム和光純薬株式会社製）の希釈系列を作り、同一の上記９６穴プレートに移した。この９６穴プレート上の各液につき、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ただし、バックグラウンドを消去するため、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設定した。
【0031】
（タンパク定量）
上記“メラニン定量”の操作において１ＭのＮａＯＨにより溶解した各wellの液から１０μＬを採取し、これに精製水９０μＬを加え、別途用意した９６穴プレートに、すなわち、メラニン定量の操作において使用した９６穴プレートとは別の９６穴プレートに移した。同時に、検量線作成用として、ＢＣＡタンパク質定量キット（Takara BCA Protein Assay Kit、タカラバイオ株式会社製）付属のStandard Proteinの希釈系列を作り、同じ９６穴プレートに移した。この９６穴プレート上の各液にTakara BCA Protein Assay Kitの反応液を加え、３７℃の環境下で発色させた後、マイクロプレートリーダーで５４５ｎｍの吸光度を測定した。ただし、バックグラウンドを消去するため、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設定した。
上記“メラニン定量”の操作において１ＭのＮａＯＨにより溶解した各wellの液から１０μＬを採取し、これに精製水９０μＬを加え、別途用意した９６穴プレートに、すなわち、メラニン定量の操作において使用した９６穴プレートとは別の９６穴プレートに移した。同時に、検量線作成用として、ＢＣＡタンパク質定量キット（Takara BCA Protein Assay Kit、タカラバイオ株式会社製）付属のStandard Proteinの希釈系列を作り、同じ９６穴プレートに移した。この９６穴プレート上の各液にTakara BCA Protein Assay Kitの反応液を加え、３７℃の環境下で発色させた後、マイクロプレートリーダーで５４５ｎｍの吸光度を測定した。ただし、バックグラウンドを消去するため、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設定した。
【0032】
上記“メラニン定量”の操作において測定した各wellのメラニン濃度は、上記“タンパク定量”の操作において測定した各wellのタンパク濃度で除した上で、下記式により、対照群を１００％（無刺激群を０％、但し、図示せず）としたときの割合で表した。
【0033】
メラニン量の割合（％）＝｛（試料添加細胞の個別値－無刺激群の平均値）／（対照群の平均値－無刺激群の平均値）｝×１００
【0034】
（統計処理）
測定データは、ｔ－検定により、各群の数値間につき、有意差の有無を確認した。
なお、実施例においては、後続する試験例においても、全て、同様の統計処理を行った。
測定データは、ｔ－検定により、各群の数値間につき、有意差の有無を確認した。
なお、実施例においては、後続する試験例においても、全て、同様の統計処理を行った。
【0035】
エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物を添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量の割合（％）を、図２に示す。
【0036】
試験例３
（細胞生存率の測定）
試験例１における“Ｂ１６マウスメラノーマ細胞への試料の添加”の操作と同様にして、２５ｃｍ２フラスコから剥離したＢ１６マウスメラノーマ細胞を９６穴培養プレートに８×１０３cells/wellの密度（上記操作における６穴培養プレートに播種したときと同等の密度）で播種し、翌日、上記操作と同様にして、１００μＭのＩＢＭＸ及び各試料（エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物；添加濃度１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）を添加した培地と、並びに、対照群（ＩＢＭＸ無添加）及び無刺激群用の培地を１００μＬ／wellでＢ１６マウスメラノーマ細胞に加えた（ｎ＝３）。
（細胞生存率の測定）
試験例１における“Ｂ１６マウスメラノーマ細胞への試料の添加”の操作と同様にして、２５ｃｍ２フラスコから剥離したＢ１６マウスメラノーマ細胞を９６穴培養プレートに８×１０３cells/wellの密度（上記操作における６穴培養プレートに播種したときと同等の密度）で播種し、翌日、上記操作と同様にして、１００μＭのＩＢＭＸ及び各試料（エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物；添加濃度１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）を添加した培地と、並びに、対照群（ＩＢＭＸ無添加）及び無刺激群用の培地を１００μＬ／wellでＢ１６マウスメラノーマ細胞に加えた（ｎ＝３）。
【0037】
３日後、各wellの細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide：ＭＴＴ、株式会社同仁化学研究所製）の０．５％ＰＢＳ溶液を１０％混合した培地を１００μＬ／well加え、５％ＣＯ２、３７℃の環境下にて２時間培養した。培養終了後、各wellの細胞を２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、形成されたホルマザンを１００μＬ／wellのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フィルム和光純薬株式会社製）により溶解した。
【0038】
溶媒のみの測定値を他の試料の測定値から差し引くためのブランクとして、未使用のwellにＤＭＳＯを１００μＬ入れたものを作製した。
【0039】
この９６穴プレート上の各液について、マイクロプレートリーダーで５４５ｎｍの吸光度を測定した（ただし、ブランクの値を差し引いた）。バックグラウンドを消去するために、６３０ｎｍの吸光度を差し引くように設計した。
【0040】
各群の細胞生存率は、下記式により求め、対照群を１００％としたときの割合で示した。
【0041】
細胞生存率（％）＝
（試料添加細胞の個別値／対照群の平均値）×１００
（試料添加細胞の個別値／対照群の平均値）×１００
【0042】
エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図３に示す。
【0043】
図１および図２から、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）が美白効果を有することが分かった。
図１はＢ１６マウスメラノーマ細胞の顕微鏡写真であり、図１の（ａ）は、無刺激細胞（ＩＢＭＸ無添加）の顕微鏡写真であり、（ｂ）は対照群（ＩＢＭＸ添加）の顕微鏡写真であり、（ｃ）はエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加濃度１μｇ／ｍＬでマウスメラノーマ細胞に添加した顕微鏡写真であり、（ｄ）はエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加濃度１０μｇ／ｍＬでマウスメラノーマ細胞に添加した顕微鏡写真であり、（ｅ）はエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加濃度１００μｇ／ｍＬでマウスメラノーマ細胞に添加した顕微鏡写真である。なお、スケールバー（Scale bar）は１００μｍを示す。
図１はＢ１６マウスメラノーマ細胞の顕微鏡写真であり、図１の（ａ）は、無刺激細胞（ＩＢＭＸ無添加）の顕微鏡写真であり、（ｂ）は対照群（ＩＢＭＸ添加）の顕微鏡写真であり、（ｃ）はエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加濃度１μｇ／ｍＬでマウスメラノーマ細胞に添加した顕微鏡写真であり、（ｄ）はエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加濃度１０μｇ／ｍＬでマウスメラノーマ細胞に添加した顕微鏡写真であり、（ｅ）はエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加濃度１００μｇ／ｍＬでマウスメラノーマ細胞に添加した顕微鏡写真である。なお、スケールバー（Scale bar）は１００μｍを示す。
【0044】
図１の（ａ）の無刺激細胞の顕微鏡写真では透明な細胞でほぼ占められているが、（ｂ）のＩＢＭＸを添加しエゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物を添加していない対照群では黒色の細胞が多数存在することが観察された。これに対し、図１の（ｄ）および（ｅ）では、すなわち、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物が添加濃度１０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの顕微鏡写真では、黒色の細胞が減少していることが観察された。
【0045】
図２は、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物を添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量の割合を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図２から、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物の添加濃度が１０μｇ／ｍＬ以上ではメラニン量が有意に減少しており、特に１００μｇ／ｍＬ添加群では３．７％にまで減っていることが分かった。すなわち、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物はメラノサイトのメラニン産生を効率的に抑制することができ、美白効果は非常に優れていることが分かった。
【0046】
図３は、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図３から、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物を添加した場合には、すなわち、添加濃度が１００μｇ／ｍＬであっても、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の細胞生存率は殆ど変化がなく、対照とほぼ同じであり、細胞生存率の低下をもたらさず、細胞毒性を有しないことが分かった。したがって、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物は高い添加濃度で使用することができ、例えば添加濃度が１００μｇ／ｍＬで使用した場合には、メラニン産生を９６％以上抑制することができ、非常に優れた美白効果を有する極めて強力な肌用製品の素材であることが分かった。
【0047】
試験例４
試験例１および試験例２において、試料をエゴマ種子エタノール抽出物（液相）またはエゴマ種子のエタノール抽出物（固相）に変更し、所定量として添加濃度が１０μｇ／ｍＬを採用した以外は同様にして（ただし、顕微鏡写真は撮影せず）、メラニン定量およびタンパク定量の操作を行ない、エゴマ種子のエタノール抽出物（液相）のメラニン量の割合、およびエゴマ種子のエタノール抽出物（固相）のメラニン量の割合を求めた。
試験例１および試験例２において、試料をエゴマ種子エタノール抽出物（液相）またはエゴマ種子のエタノール抽出物（固相）に変更し、所定量として添加濃度が１０μｇ／ｍＬを採用した以外は同様にして（ただし、顕微鏡写真は撮影せず）、メラニン定量およびタンパク定量の操作を行ない、エゴマ種子のエタノール抽出物（液相）のメラニン量の割合、およびエゴマ種子のエタノール抽出物（固相）のメラニン量の割合を求めた。
【0048】
エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（添加濃度１０μｇ／ｍＬ）のメラニン量の割合、エゴマ種子エタノール抽出物（液相）のメラニンの割合、およびエゴマ種子エタノール抽出物（固相）のメラニン量の割合を図４に示す。
【0049】
試験例５
試験例１および試験例２において、試料を青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物に変更し、所定量として添加濃度が１０μｇ／ｍＬを採用した以外は同様にして（ただし、顕微鏡写真は撮影せず）、メラニン定量およびタンパク定量の操作を行ない、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物のメラニン量の割合を求めた。
試験例１および試験例２において、試料を青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物に変更し、所定量として添加濃度が１０μｇ／ｍＬを採用した以外は同様にして（ただし、顕微鏡写真は撮影せず）、メラニン定量およびタンパク定量の操作を行ない、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物のメラニン量の割合を求めた。
【0050】
エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（添加濃度１０μｇ／ｍＬ）のメラニン量の割合、および青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物のメラニン量の割合を図５に示す。
【0051】
試験例６
試験例１および試験例２において、試料をエゴマ油に変更し、所定量として添加濃度が１００μｇ／ｍＬを採用した以外は同様にして（ただし、顕微鏡写真は撮影せず）、メラニン定量およびタンパク定量の操作を行ない、エゴマ油のメラニン量の割合を求めた。
試験例１および試験例２において、試料をエゴマ油に変更し、所定量として添加濃度が１００μｇ／ｍＬを採用した以外は同様にして（ただし、顕微鏡写真は撮影せず）、メラニン定量およびタンパク定量の操作を行ない、エゴマ油のメラニン量の割合を求めた。
【0052】
エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）（添加濃度１００μｇ／ｍＬ）のメラニン量の割合、およびエゴマ油のメラニン量の割合を図６に示す。
【0053】
試験例７
試験例３において、試料をエゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（液相）（添加濃度：１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）に変更した以外は同様にして、細胞生存率を求めた。
エゴマ種子エタノール抽出物（液相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図７に示す。
試験例３において、試料をエゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（液相）（添加濃度：１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）に変更した以外は同様にして、細胞生存率を求めた。
エゴマ種子エタノール抽出物（液相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図７に示す。
【0054】
試験例８
試験例３において、試料をエゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（固相）（添加濃度；１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）に変更した以外は同様にして、細胞生存率を求めた。
エゴマ種子エタノール抽出物（固相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図８に示す。
試験例３において、試料をエゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（固相）（添加濃度；１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）に変更した以外は同様にして、細胞生存率を求めた。
エゴマ種子エタノール抽出物（固相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図８に示す。
【0055】
試験例９
試験例３において、試料を青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）（添加濃度：１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）に変更した以外は同様にして、細胞生存率を求めた。
青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図９に示す。
試験例３において、試料を青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）（添加濃度：１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）に変更した以外は同様にして、細胞生存率を求めた。
青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図９に示す。
【0056】
試験例１０
試験例３において、試料をエゴマ油（添加濃度：１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）に変更した以外は同様にして、細胞生存率を求めた。
エゴマ油のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図１０に示す。
試験例３において、試料をエゴマ油（添加濃度：１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）に変更した以外は同様にして、細胞生存率を求めた。
エゴマ油のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を図１０に示す。
【0057】
図４から、抽出法の異なるエゴマ種子抽出物を添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のメラニン産生に与える影響が分かる。図４は、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）、エゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（液相）、およびエゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（固相）を添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量の割合を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図４から、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物、エゴマ種子エタノール抽出物（液相）、およびエゴマ種子エタノール抽出物（固相）は、いずれも対照に対してメラニン量が有意に減少していることが分かった。なお、エゴマ種子エタノール抽出物（固相）を細胞に添加したメラニン量の割合が他に比べて小さい値を示したが、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物、エゴマ種子エタノール抽出物（液相）、およびエゴマ種子エタノール抽出物（固相）の３者間に有意差はなかった。
【0058】
図５は、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）と青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）を添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量の割合を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図５から、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物、および青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物は、いずれも対照に対してメラニン量が有意に減少していることが分かった。なお、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物を細胞に添加したメラニン量比の方が他に比べて小さい値を示したが、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物および青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物の両者間に有意差はなかった。
【0059】
図６は、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）とエゴマ油を添加したＢ１６マウスメラノーマ細胞のタンパク量当たりのメラニン量の割合を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図６から、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物、およびエゴマ油は、いずれも対照に対してメラニン量が有意に減少していることが分かった。すなわち、エゴマ油は食用としての効果が一般的に知られていることであるが、肌への美白効果も有することが本発明によって初めて見出された。
【0060】
しかしながら、図６から明らかなように、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物とエゴマ油との間には群間の有意差（ｐ＜０．０５）が存在し、超臨界ＣＯ２抽出物はエゴマ油に対して非常に有意であり、美白効果という観点からは、超臨界ＣＯ２抽出物はエゴマ油と比較して、非常に優れた美白作用があることが分かった。
【0061】
図７は、エゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（液相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図７から、エゴマ種子エタノール抽出物（液相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞生存率は、添加濃度が５０μｇ／ｍＬおよび１００μ／ｍＬで、対照と比較して有意差（ｐ＜０．０１）があることが分かった。すなわち、エゴマ種子エタノール抽出物（液相）は５０μｇ／ｍＬ以上添加すると細胞生存率が低下し、細胞毒性を有することが分かった。
【0062】
図８は、エゴマ種子エタノール抽出物（エキス）（固相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図８から、エゴマ種子エタノール抽出物（固相）のＢ１６マウスメラノーマ細胞生存率は、添加濃度が５０μｇ／ｍＬでは対照と比較して有意差（ｐ＜０．０５）があり、また、添加濃度が１００μ／ｍＬでは対照と比較して有意差（ｐ＜０．０１）があることが分かった。すなわち、エゴマ種子エタノール抽出物（固相）は添加濃度５０μｇ／ｍＬ以上で添加すると細胞生存率が低下し、細胞毒性を有することが分かった。
【0063】
図９は、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図９から、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物のＢ１６マウスメラノーマ細胞生存率は、添加濃度が１００μ／ｍＬでは対照と比較して有意差（ｐ＜０．０１）があることが分かった。すなわち、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）は添加濃度が１００μｇ／ｍＬ以上では細胞生存率が低下し、細胞毒性を有することが分かった。
【0064】
図１０は、エゴマ油のＢ１６マウスメラノーマ細胞への細胞生存率を示したグラフである。ここでは、対照が１００％として示されている。図１０から、エゴマ油を添加した場合には、すなわち、添加濃度が１００μｇ／ｍＬであっても、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞の細胞生存率は殆ど変化がなく、対照とほぼ同じであり、細胞生存率の低下をもたらさないことが分かった。しかしながら、上記したように、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物（エキス）と比較すると、美白効果の点で劣ったものであることも分かっている。
【0065】
以上の結果から、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物、エゴマ種子エタノール抽出物、エゴマ油、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物は美白効果を有していることが分かった。ただし、エゴマ種子エタノール抽出物、青ジソ種子超臨界ＣＯ２抽出物は細胞毒性を有しており、高いメラニン産生抑制効果は実現できないものであることも分かった。一方、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物は特に優れた美白効果を有しており、エゴマ油の美白効果よりも非常に優れた美白効果を有するものであることも分かった。すなわち、エゴマ種子超臨界ＣＯ２抽出物は高い添加濃度でも使用することができ、メラニン産生を９６％以上抑制するということを実現することができ、非常に優れた美白効果を有する極めて強力な肌用製品の素材であることが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】