特許 7276895 遺伝子発現抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-10

(45)【発行日】2023-05-18

(54)【発明の名称】遺伝子発現抑制剤

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20230511BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20230511BHJP

   C07K 7/64 20060101ALI20230511BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230511BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20230511BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20230511BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20230511BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20230511BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20230511BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06 ZNA

C07K7/08

C07K7/64

C07K14/00

A61P31/12

A61K38/08

A61K38/10

A61K38/16

A61K38/12

A61P31/04

A61P33/00

A61P31/10

A61P31/20

A61P31/22

【請求項の数】 25

(21)【出願番号】P 2020537870

(86)(22)【出願日】2018-09-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-12-17

(86)【国際出願番号】 EP2018075817

(87)【国際公開番号】W WO2019057973

(87)【国際公開日】2019-03-28

【審査請求日】2021-08-18

(31)【優先権主張番号】A60096/2017

(32)【優先日】2017-09-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AT

(31)【優先権主張番号】A50613/2018

(32)【優先日】2018-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AT

(73)【特許権者】

【識別番号】520102750

【氏名又は名称】ピヴァリス バイオサイエンス ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ハラン ハンナ

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１４／０４７２６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Journal of Virology，2004年，Vol.78, No.5，pp.2637-2641

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＬＡＦＹＡＣＦＷＣ（配列番号２）、ＣＬＡＦＹＡＣＬＷＣ（配列番号３）、ＣＬＡＦＹＡＣＦＡＣ（配列番号４）、ＣＬＶＦＹＡＣＦＣ（配列番号５）、ＣＬＡＦＹＡＣＦＣ（配列番号６）、ＣＬＬＹＦＣＦＣ（配列番号７）、ＣＡＡＦＹＡＣＦＣ（配列番号８）、ＳＬＡＦＹＡＣＦＡＣ（配列番号９）、ＣＬＡＦＹＡＲＦＣ（配列番号１０）、ＣＬＡＦＹＣＦＡＣ（配列番号１１）、ＣＬＡＦＹＣＦＣ（配列番号１２）、およびＣＬＡＹＦＣＦＣ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を備える、又は該アミノ酸配列からなるペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドが、直鎖又は環状ペプチドである、
請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のペプチドと同一のペプチドを２つ又はそれ以上を備える、ペプチド系化合物。

【請求項4】

前記化合物が、請求項１又は２に記載のペプチドと同一のペプチドを、３個又は４個備える、
請求項３に記載の化合物。

【請求項5】

前記化合物が細胞透過性を示すように修飾される、
請求項３又は４に記載の化合物。

【請求項6】

前記化合物又は少なくとも１つのペプチドが、少なくとも１つの細胞透過性ペプチドに、Ｃ末端および／又はＮ末端で融合される、
請求項３から５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項7】

前記細胞透過性ペプチドが、ＴＡＴペプチドおよびポリカチオン性タグを含む群から選択される、
請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

前記細胞透過性ペプチドが、
配列番号１４、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１５）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６）、ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１７）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＧ（配列番号１８）、又はＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９）のうち、３７から７２個のアミノ酸残基、より好ましくは３７から６０個のアミノ酸残基、より好ましくは４８から６０個のアミノ酸残基を備えるＨＩＶ ＴＡＴタンパク質の群から選択されるアミノ酸配列を備える、又は前記選択されるアミノ酸配列からなるか、
好ましくはＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２２）、ＲＲＲＲＲＲＲＣ（配列番号２３）、ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２４）、又はＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２５）のポリアルギニンタグを備える、又は前記ポリアルギニンタグからなるか、
ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ（配列番号２６）のブフォリン由来であるか、
ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２７）のトランスポータン由来であるか、
ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号２８）の配列を備えるＫＡＬＡペプチド由来であるか、
ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２９）の配列を備えるＭＡＰであるか、
ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３０）の配列を備えるＰｅｐ－１由来であるか、
ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ（配列番号３１）の配列を備えるｈＣＴ（９‐３２）であるか、
ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号３２）の配列を備えるｐＶＥＣであるか、
ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号３３）の配列を備えるｐＩＳＬであるか、
ＲＱＧＡＡＲＶＴＳＷＬＧＲＱＬＲＩＡＧＫＲＬＥＧＲＳＫ（配列番号３４）の配列を備えるＥｒｎｓであるか、
ＫＬＩＫＧＲＴＰＩＫＦＧＫ（配列番号３５）の配列を備えるレストリクトシンＬ３であるか、
ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ（配列番号３６）又はＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ‐システアミドの配列を備えるＭＰＧであるか、
ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ（配列番号３７）又はＣＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＥＤ（配列番号３８）の配列を備えるＳＶ４０ラージＴ抗原の核内局在化シグナル（ＮＬＳ）由来であるか、
ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号３９）の配列を備える狂犬病ウイルスの糖タンパク質（ＲＶＧ）であるか、或いは、
好ましくはＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２１）であるアンテナペディアのタンパク質ホモドメインに由来するペプチドである、
請求項６又は７に記載の化合物。

【請求項9】

少なくとも１つのペプチドが標識に融合又は複合される、
請求項３から８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項10】

前記標識が、染料、好ましくは蛍光染料、より好ましくは蛍光タンパク質、蛍光ストレプトアビジン、蛍光ビオチン、又は染料結合ペプチドを含む群から選択される、
請求項９に記載の化合物。

【請求項11】

哺乳類又はヒト個体の細胞における異種核酸分子の転写および／又は翻訳に関連する障害又は疾患の治療に使用するための、
請求項１又は２に記載のペプチド、又は請求項３から８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項12】

前記細胞における異種核酸分子の転写および／又は翻訳に関連する障害又は疾患が、ウイルス性感染症を含む群から選択される、
請求項１１に記載の使用のためのペプチド又は化合物。

【請求項13】

哺乳類又はヒト個体における、ウイルス性、細菌性、寄生虫又は真菌性の感染症の治療に使用するための、
請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３から８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項14】

前記治療は、細菌性細胞が、前記細菌性細胞に抗生物質耐性を与えることが可能な遺伝子又はその機能的断片を獲得することを防止することを特徴とする、
請求項１３に記載の使用のためのペプチド又は化合物。

【請求項15】

ＤＮＡウイルスであって、好ましくはポックスウイルス科のウイルス、より好ましくはアデノウイルス科のウイルス、最も優先的にはヘルペスウイルス科のウイルス、具体的には単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスである、２本鎖ＤＮＡウイルスなどのＤＮＡウイルスによる感染症の治療に使用するための、
請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３から８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項16】

請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３から１０のいずれか１項に記載の化合物をコードする核酸分子。

【請求項17】

インビトロにおいて、細胞内における異種核酸分子の転写および／又は翻訳を抑制するための、請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３から１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。

【請求項18】

前記異種核酸分子がウイルス、細菌、寄生虫又は真菌由来である、
請求項１７に記載の使用。

【請求項19】

前記異種核酸分子が抗生物質耐性遺伝子又はその機能的断片をコードする核酸の並びを含む、
請求項１７又は１８に記載の使用。

【請求項20】

インビトロにおいて、細菌性細胞が、前記細菌性細胞に抗生物質耐性を与えることが可能な遺伝子又はその機能的断片を獲得することを防止するための、
請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３から１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。

【請求項21】

具体的には、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルス科に属するウイルスなどの２本鎖ＤＮＡウイルス、或いは、２本鎖ＤＮＡウイルス群に属する別のウイルスなどの、ＤＮＡウイルスを含む生ワクチンなどを含む、弱毒性生ワクチン用の添加剤の製造における、
請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３から１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。

【請求項22】

細胞培養液におけるウイルスの拡散を抑制又は防止するための、
請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３から１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。

【請求項23】

インビトロにおいて、細菌のファージ感染を抑制するための、
請求項１又は２に記載のペプチド又は請求項３から１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。

【請求項24】

インビトロにおいて、真核細胞内で異種核酸分子の転写および／又は翻訳を局在化するための、
請求項９又は１０に記載の化合物の使用。

【請求項25】

前記異種核酸分子が、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌由来である、
請求項２４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の分野］
本発明は、生物内、細胞内、又は組織内の核酸分子の転写および翻訳に影響を与えるペプチドおよび化合物に関する。

【0002】

［発明の背景］
真核細胞のゲノムＤＮＡは核に局在し、染色体に密に内包されている。ＤＮＡからＲＮＡへの転写は核内で行われ、その後、ＲＮＡは細胞質基質へ輸送され、リボソームにてタンパク質が合成される。一方で、染色体外ＤＮＡ、外来生ＤＮＡ、又は異種ＤＮＡとも呼ばれる「外来」ＤＮＡは、非自己ＤＮＡと定義され、通常は標的細胞内に存在せず、細胞外から細胞内へ侵入できる。「外来」ＤＮＡ分子は、例えば、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物、合成ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ又はファージＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、或いは他のあらゆる人工ＤＮＡであり得る。ＲＮＡもまた、例えばＲＮＡウイルスがもたらす「外来」核酸であり得る。

【0003】

例えば、ウイルスからの、又は細菌間における「外来」ＤＮＡ分子等の非自己ＤＮＡの転移は、真核標的細胞又は原核標的細胞内で発生し得る。真核標的細胞又は原核標的細胞内では、ＤＮＡ分子が細胞に進入して宿主ゲノムに組み込まれ得る、或いは、非自己ＤＮＡ自身の複製、転写、および「外来」ＤＮＡをコードするタンパク質の翻訳に、宿主細胞機構が利用される。「外来」ＤＮＡは、エンドサイトーシス又は、ウイルスによる内包等の他の手段によって細胞内に取り込まれ、裸の状態で、又はウイルスに内包された状態で細胞質基質を通過し、標的細胞の核に進入することができる。ウイルスＤＮＡは、核内移行の際に細胞質基質内でウイルスから解放され得る。

【0004】

真核生物には、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体および他の核酸感知分子等のパターン認識受容体を含む、「外来」核酸を認識するための宿主細胞防御機構が備えられている。こうした機構は、ウイルス又は細菌感染に対する初期反応、および、初期反応に続く感染の排除に向けた一連のカスケードの活性化を誘因する、自然免疫系を代表するものである。

【0005】

ウイルス性感染症の予防又は治療は、依然として大きな障害である。ワクチン接種によるウイルス性感染症の予防が特定のウイルスに限られる一方で、すでに定着しているウイルス性感染症に対する根治的な治療は、多くの場合不可能である。また、ウイルスは変異しやすいため、すでに確立された予防的又は根治的治療をすり抜けることがあり得る。さらに、感染した個体においてウイルスを減少させる、又は排除することすら可能な薬品は、いくつかのウイルス性感染症用にしか用意されていない。ウイルスは自らの複製のために、宿主細胞を必要とする。

【0006】

例えば、ヘルペスウイルス感染症の抑制方法は、ヌクレオシド類似体であるアシクロビル又はガンシクロビル、ホスカルネット等のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、或いは、プリテリビル等のプライマーゼ／ヘリカーゼ阻害剤等、異なるタイプの阻害剤を使用することである。この他の抗ウイルス剤には、アマンタジン又はエンフビルチド等の侵入阻害剤、或いは、インフルエンザ又はＨＩＶの治療用のプロテアーゼ阻害剤がある。しかしながら、ゲノムＤＮＡと「外来」ＤＮＡとを識別できる阻害剤はない。したがって、ウイルス特異的遺伝子発現に対処することが、宿主生物における早期のウイルス遺伝子発現および、それに続くウイルス複製を抑制するための、有望な介入方法の１つとなることが考えられる。

【0007】

［発明の概要］
本発明の目的は、生物における、遺伝子を含む外来核酸分子（つまり、異種又は外生核酸分子）の転写および／又は翻訳を抑制（遺伝子発現の抑制を含む）することができる化合物を提供することである。

【0008】

本目的は、化学式Ｉ Ｘ_１‐Ｘ_２‐Ｘ_３‐Ｘ_４‐Ｘ_５‐（Ａ）_ｍ‐Ｘ_６‐Ｘ_７‐（Ｘ_８）_ｎ‐Ｃ （Ｉ）に基づくアミノ酸配列（配列番号１）を備える、又は化学式Ｉに基づくアミノ酸配列からなるペプチドによって達成され、ここで、Ｘ_１はＣ又はＳであり、Ｘ_２はＬ又はＡであり、Ｘ_３はＡ、Ｖ又はＬであり、Ｘ_４はＦ又はＹであり、Ｘ_５はＹ又はＦであり、Ｘ_６はＣ又はＲであり、Ｘ_７はＦ又はＬであり、Ｘ_８はＷ又はＡであり、そして、ｍおよびｎは、それぞれ０又は１である。

【0009】

また、本発明は、化学式Ｉ Ｘ_１‐Ｘ_２‐Ｘ_３‐Ｘ_４‐Ｘ_５‐（Ａ）_ｍ‐Ｘ_６‐Ｘ_７‐（Ｘ_８）_ｎ‐Ｃ （Ｉ）を備える、又は化学式Ｉからなる少なくとも１つのペプチド（配列番号１）を有するペプチド系化合物にも関し、ここで、Ｘ_１はＣ又はＳであり、Ｘ_２はＬ又はＡであり、Ｘ_３はＡ、Ｖ又はＬであり、Ｘ_４はＦ又はＹであり、Ｘ_５はＹ又はＦであり、Ｘ_６はＣ又はＲであり、Ｘ_７はＦ又はＬであり、Ｘ_８はＷ又はＡであり、そして、ｍおよびｎは、それぞれ０又は１である。

【0010】

驚くべきことに、本発明のペプチドおよびペプチド系化合物は、細胞内で自然に生じる細胞遺伝子の発現に影響を与えることなく、当該細胞内における外来／異種／外来性核酸分子の転写および／又は翻訳、並びに／或いは、外来ＤＮＡ分子からの遺伝子発現を抑制できることが分かった。したがって、この抑制は細胞毒性がない、又は、実質的に細胞毒性がない。

【0011】

本発明のペプチドおよび化合物の、生物（つまり、生細胞）内の異種核酸分子の翻訳および／又は転写を顕著に抑制又は減少させる能力は、外来核酸分子の翻訳および／又は転写と関連する疾患の治療および／又は予防を可能にする。

【0012】

したがって、本発明の別の局面は、哺乳類又はヒト個体における、ウイルス性、細菌性、寄生虫又は真菌性の感染症の治療に用いる、本発明によるペプチドおよび／又は化合物に関する。

【0013】

本発明の更なる局面は、本発明によるペプチド又は化合物をコードする核酸分子に関する。
本発明の別の局面は、細胞内における異種核酸分子の転写および／又は翻訳を抑制するための、本発明によるペプチドおよび／又は化合物に関する。

【0014】

本発明の更なる局面は、細菌性細胞が、当該細菌性細胞に抗生物質耐性を与え得る遺伝子又はその機能的断片を獲得することを防止するための、本発明によるペプチドおよび／又は化合物の使用に関する。

【0015】

本発明の別の局面は、本発明によるペプチドおよび／又は化合物の、弱毒性生ワクチン用添加物としての使用に関する。
本発明の更なる局面は、細胞培養液におけるウイルスの拡散を抑制又は防止するための、本発明によるペプチドおよび／又は化合物の使用に関する。

【0016】

本発明のさらに別の局面は、細菌のファージ感染を抑制するための、本発明によるペプチドおよび／又は化合物の使用に関する。
本発明の更なる局面は、異種核酸分子の転写および／又は翻訳を真核細胞内に局在させるための、本発明によるペプチドおよび／又は化合物の使用に関する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1A】図１は、ルシフェラーゼおよびＳＥＡＰをコードするプラスミドベクターをトランスフェクションした細胞における、ルシフェラーゼレベル（ａ）およびＳＥＡＰ分泌（ｂ）の産生量における、Ｉ２４ペプチドの影響を示す。ｐ６５Ｍ２をコードするプラスミドをトランスフェクションしたときの、Ｐ６５突然変異体Ｍ２の発現におけるＩ２４ペプチドの影響を示す（図１ｃ）。ＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクションしたときの、ＧＦＰの発現および、ＧＦＰ陽性細胞の数におけるペプチドの影響を示す（図１ｄ，ｅ）。

【図1B】図１は、ルシフェラーゼおよびＳＥＡＰをコードするプラスミドベクターをトランスフェクションした細胞における、ルシフェラーゼレベル（ａ）およびＳＥＡＰ分泌（ｂ）の産生量における、Ｉ２４ペプチドの影響を示す。ｐ６５Ｍ２をコードするプラスミドをトランスフェクションしたときの、Ｐ６５突然変異体Ｍ２の発現におけるＩ２４ペプチドの影響を示す（図１ｃ）。ＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクションしたときの、ＧＦＰの発現および、ＧＦＰ陽性細胞の数におけるペプチドの影響を示す（図１ｄ，ｅ）。

【図2】切断されたＩＬ‐８プロモータの制御下でルシフェラーゼを駆動するプラスミドをトランスフェクションした場合（ａ）、および、ＩＬ‐８の分泌を抑制しない場合（ｂ）の、Ｉ２４ペプチドによるルシフェラーゼの発現抑制を示す。

【図3】Ｉ２４ペプチドでプラスミドをトランスフェクションした後、図示された時間後に分析された、ルシフェラーゼタンパク質（ａ）および、ｍＲＮＡ（ｂ）のレベルを示す。

【図4】ルシフェラーゼ遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子の両方を同一プラスミドに搭載してトランスフェクションしたとき、ＳＶ４０初期プロモータの制御下のネオマイシン耐性遺伝子のｍＲＮＡレベルと比較して、ＣＭＶプロモータの制御下のルシフェラーゼのｍＲＮＡレベルを、Ｉ２４ペプチドがより効果的に抑制することを示す。

【図5】異なる細胞株における、Ｉ２４ペプチドが抑制するプラスミドにコードされたルシフェラーゼレベルを示す。

【図6】ルシフェラーゼをコードするプラスミドの一過性トランスフェクション後のルシフェラーゼタンパク質レベル、並びに、Ｉ２４ペプチド、ＴＡＴペプチド、ＴＡＴ‐Ｉ２４ペプチド、およびＩ２４二量体ペプチドの異なる濃度を示す（より解像度を上げるために、両軸ともｌｏｇスケールで示す）。

【図7】（ａ）ＴＡＴ‐Ｉ２４融合ペプチドで処理されたＨＥＫ２９３細胞における、バキュロウイルスを形質導入したルシフェラーゼの遺伝子発現の抑制を示す（より解像度を上げるために、両軸ともｌｏｇスケールで示す）。（ｂ）溶媒対照群としてのＤＭＳＯ、ＴＡＴ‐Ｉ２４融合ペプチド、又はＴＡＴ単独による処理に加えて、バキュロウイルス発現ルシフェラーゼ、およびＴＮＦ‐αによる刺激によって処理した細胞内の、ルシフェラーゼおよびＩＬ‐８のｍＲＮＡレベルを示す（ｂ）。

【図8A】図８は、ルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードしたアデノウイルス粒子を感染させたＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼの発現を、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制することを示す（ａ）。ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、およびアデノウイルスをコードしたヘキソン遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制することを示す（ｂ）。感染細胞によるアデノウイルス粒子の上清中での形成および分泌を、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制すること示す（ｃ）。アデノウイルス感染から９６時間後の細胞分離を、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制することを示す（ｄ）。

【図8B】図８は、ルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードしたアデノウイルス粒子を感染させたＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼの発現を、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制することを示す（ａ）。ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、およびアデノウイルスをコードしたヘキソン遺伝子のｍＲＮＡレベルを、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制することを示す（ｂ）。感染細胞によるアデノウイルス粒子の上清中での形成および分泌を、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制すること示す（ｃ）。アデノウイルス感染から９６時間後の細胞分離を、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制することを示す（ｄ）。

【図9】ＨＥＫ２９３細胞における、ワクシニアウイルスのウイルス遺伝子の発現（ａ）および複製（ｂ，ｃ）を、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制することを示す。

【図10】レンチウイルスによるルシフェラーゼ遺伝子の発現を、ＴＡＴ‐Ｉ２４が抑制することを示す。

【図11】プラスミドとＩ２４とで同時に形質転換した大腸菌細胞において、コロニーの形成が抑制されることを示す。

【図12】Ｉ２４ペプチドの存在下でプラスミドＤＮＡを形質転換してから４時間、および６時間後の、大腸菌細胞におけるプラスミドのコピー数（ａ）およびβ‐ラクタマーゼ（ｂｌａ）ｍＲＮＡレベルの分析を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、化学式Ｉ Ｘ_１‐Ｘ_２‐Ｘ_３‐Ｘ_４‐Ｘ_５‐（Ａ）_ｍ‐Ｘ_６‐Ｘ_７‐（Ｘ_８）_ｎ‐Ｃ （Ｉ）に基づくアミノ酸配列（配列番号１）を備える、又は化学式Ｉに基づくアミノ酸配列からなるペプチドに関し、ここで、Ｘ_１はＣ又はＳであり、Ｘ_２はＬ又はＡであり、Ｘ_３はＡ、Ｖ又はＬであり、Ｘ_４はＦ又はＹであり、Ｘ_５はＹ又はＦであり、Ｘ_６はＣ又はＲであり、Ｘ_７はＦ又はＬであり、Ｘ_８はＷ又はＡであり、そして、ｍおよびｎは、それぞれ０又は１であり、或いはそのバリアントである。

【0019】

上述したように、本発明のペプチドは、細胞内で自然に生じる細胞遺伝子の発現に影響を与えることなく、当該細胞内における外来／異種／外来性核酸分子の転写および／又は翻訳、並びに／或いは、外来ＤＮＡ分子からの遺伝子発現を抑制することができる。

【0020】

本発明の好ましい実施形態によると、本発明は、細胞ゲノムがコードするタンパク質の遺伝子発現に影響を与えることなく、「外来」ＤＮＡからの遺伝子発現を抑制できるペプチドを提供する。Ｉ２４ペプチドが、インターロイキン８プロモータの制御下で、ルシフェラーゼをコードしたプラスミドと共にトランスフェクションされ、さらに腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）によって刺激されると、インターロイキン８プロモータの制御下でルシフェラーゼの発現を抑制できる一方で、ＴＮＦ‐α誘導性インターロイキン８の内在レベルは影響を受けない。

【0021】

本明細書における「外来核酸分子」（つまり、異種又は外来性核酸分子）とは、生物又は細胞内で自然に産生されず、通常は細胞融合、ウイルス感染、および他の一般的な周知の方法（例えば、電気穿孔法）など、本技術分野において周知の方法で生物又は細胞内に導入される核酸分子のことを指す。

【0022】

「外来」ＤＮＡの導入は、リポソーム型、非リポソーム型、電気穿孔法、又は本技術分野において周知の他のトランスフェクション手段を利用した、真核細胞のトランスフェクションによって行われ得るが、ウイルス感染、ファージ感染、或いは、細菌間又は他の生物間におけるＤＮＡの導入など、自然な導入メカニズムによっても行われ得る。また、「外来」ＤＮＡは、本技術分野において周知の形質転換手段や、遺伝子水平伝播などの自然な転移によって、原核細胞に導入されることもあり得る。

【0023】

「外来」核酸、染色体外、異種、又は外来性核酸は、通常は標的細胞内に存在せず、プラスミド、ＰＣＲ産物や、他のあらゆる合成ＤＮＡ又はＲＮＡ、或いは、ウイルス又はファージに内包された核酸や、細菌、原生動物、又は真菌などの生物に由来する核酸であり得、また、標的細胞にとって「外来」である。ＤＮＡを潜在させたＤＮＡ分子、生物又はウイルスは、化学的又は生物学的手段、エンドサイトーシス、感染、或いは侵入によって標的細胞に転移され得る。標的細胞は、真核細胞、哺乳類細胞、脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞、植物細胞、真性細菌又は古細菌に属するバクテリア、真菌、或いは原生動物であり得る。

【0024】

本発明の好ましい実施形態によると、「外来」核酸は、優先的にはＤＮＡ分子を意味し、最も優先的には２本鎖ＤＮＡ分子を意味するが、ＲＮＡ分子又はＲＮＡに関連するＤＮＡ分子でもあり得る。「外来」ＤＮＡは、超らせんＤＮＡ又は線状ＤＮＡでもあり得、プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物、又はオリゴヌクレオチドでもあり得る。「外来」核酸は、細菌、ファージ、ウイルス、真菌、又は原生動物や寄生蠕虫などの寄生生物に由来する、感染性病原体又は染色体外ＤＮＡのゲノムの一部であり得る。

【0025】

真核細胞のトランスフェクションに利用される発現プラスミドＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによってコードされた遺伝子の発現を駆動する真核性プロモータ（ＣＭＶ又はＳＶ４０プロモータなど）などの、特定の要素を含み得る。さらに、ポリアデニル化部位、リボソームプライミング部位、および、任意で、真核性の複製起点などの要素を含む。また、Ｔ７ポリメラーゼによるシークエンシング又はインビトロ発現に用いるＴ７プロモータも含み得る。細菌内におけるプラスミド伝播に関しては、発現プラスミドは、細菌性の複製起源、選択用の抗生物質耐性遺伝子および、抗生物質耐性遺伝子の発現を駆動する原核性プロモータも含み得る。

【0026】

「外来」ＤＮＡは、自然発生ＤＮＡウイルス又は遺伝子導入用の人工ウイルスなどの、ウイルスによって提供され得る。２本鎖ＤＮＡウイルスは、２本鎖ＤＮＡとして表されるウイルスゲノムを有する。２本鎖ＤＮＡウイルスは、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポリオーマウイルス科、パピローマウイルス科、カウドウイルス目、リガメンウイルス目、バキュロウイルス科などのバキュロ様ウイルス、および、ポックスウイルス科に属する巨大核質ＤＮＡウイルスの群に属する。円形で部分的な２本鎖ＤＮＡを有する別のウイルス群は、環状ＤＮＡが核に輸送されて転写された後合成されたプレゲノムＲＮＡが逆転写される、Ｂ型肝炎ウイルスに代表されるヘパドナウイルス科に属する。その他のウイルス群として、１本鎖ＤＮＡウイルス、および１本鎖又は２本鎖ＲＮＡを含むＲＮＡウイルスが存在する。「外来」ＤＮＡは、ファージＤＮＡでもあり得る。２本鎖ＤＮＡゲノムを有するファージは、ミオウイルス科、シホウイルス科、ポドウイルス科、テクティウイルス科、コルチコウイルス科、プラズマウイルス科、リポスリクスウイルス科、ルディウイルス科、フセロウイルス科、サルテルプロウイルス属、又はグッタウイルス科の群に属する。生体分子研究又は生体分子技術で用いられる、遺伝子の形質導入用ウイルスベクターの例として、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスが挙げられる。

【0027】

したがって、本発明のペプチドおよび化合物の応用の１つとして、ウイルス複製の低減又は抑制につながる、ウイルスＤＮＡからの早期遺伝子発現の防止が考えられる。
「外来」ＤＮＡの転移および遺伝子発現の防止とは対照的に、本発明のペプチドおよび化合物は、遺伝子導入などによる、遺伝子治療中の意図的な遺伝子発現の状況においても有用である可能性がある。本抑制剤は、抑制剤で処理されたほかの細胞種における遺伝子発現を除外することによる、特定の標的細胞種における導入遺伝子からの選択的遺伝子発現に対し有用となることが考えられる。

【0028】

本発明のペプチドおよび化合物の標的細胞は、初代細胞又は組織内の細胞などの真核細胞であり得るし、不死化腫瘍由来細胞株又は人工細胞株のいずれか、或いは、ウイルスなど他の方法で不死化した細胞株でもあり得る。標的細胞は、ヒト由来のものを含む哺乳類の細胞でもあり得るし、脊椎動物由来又は、昆虫細胞などの無脊椎動物由来の細胞でもあり得る。また、標的細胞は、細菌などの原核性細胞、又は古細菌などの古細菌細胞でもあり得る。

【0029】

例示のように、また、本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のペプチド、具体的にはＩ２４ペプチドは、ルシフェラーゼ発現プラスミドとペプチドとで同時にトランスフェクションされた細胞のルシフェラーゼｍＲＮＡレベルの低減によって例示したとおり、発現プラスミドとペプチドとで同時にトランスフェクションされた細胞からのｍＲＮＡレベルを抑制する。ｍＲＮＡレベルの低減およびタンパク質レベルの低減における時間依存性および用量依存性は、同等である。トランスフェクションされた細胞におけるｍＲＮＡレベルの抑制は、ペプチドとＤＮＡ分子との直接的な接触によって行われ、その後のＲＮＡ転写を防止するものでもよいし、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの活性を抑制することで行うものでもよいし、又は、宿主因子と転写促進に関わるＤＮＡ分子との結合又は相互作用を抑制することで行うものでもよく、転写促進に関わるＤＮＡ分子とは、例えば、転写因子、転写因子に関連する因子、又は、例えばＴＡＴＡボックス結合タンパク質又はその関係因子などの一般的な転写活性化に関わる因子などである。ＤＮＡとの相互作用は、ＤＮＡ分子が核に侵入する以前に、細胞膜や細胞質で既に発生していることもある。可能性は低いが、抑制剤は転写後の段階で作用してｍＲＮＡの安定性に影響を与えることもある。

【0030】

例示のとおり、本発明のペプチド、具体的にはＩ２４ペプチドは、発現プラスミドにトランスフェクションされた真核細胞のタンパク質レベルを、発現プラスミドの一定の要素とは無関係に抑制する。この抑制は、細菌性又は真核性の抗生物質耐性遺伝子の種類とは無関係に行われる。真核細胞におけるペプチドによるタンパク質産生の抑制は、発現プラスミドに存在する真核性プロモータの種類に一部依存する。プロモータは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、インターロイキン８（ＣＸＣＬ‐８）プロモータなどの真核性の天然プロモータ、又は、転写を駆動するＮＦ‐ＫＢ結合部位などの要素を有する最小プロモータなどの合成プロモータでもあり得る。ＣＭＶプロモータの制御下にあるルシフェラーゼと比較すると、ＳＶ４０初期プロモータの制御下にある遺伝子は、Ｉ２４ペプチドによって強力に抑制されない。

【0031】

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のペプチドのＮ末端はアミンで、Ｃ末端はアミド又は酸でもよい。
本発明のペプチドおよび化合物は、古典的なペプチド合成によって産生され得、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に可溶であるが、水溶液、アルコール、有機溶剤、又は乳剤などの他の溶剤にも可溶であってもよい。

【0032】

本発明のペプチドは、外来核酸分子の転写および／又は翻訳を「抑制」又は防止さえするため、「抑制剤」と考えることもできる。
本発明の別の局面は、化学式Ｉ Ｘ_１‐Ｘ_２‐Ｘ_３‐Ｘ_４‐Ｘ_５‐（Ａ）_ｍ‐Ｘ_６‐Ｘ_７‐（Ｘ_８）_ｎ‐Ｃ （Ｉ）（配列番号１）を備える、又は化学式Ｉ（配列番号１）からなる、少なくとも１つのペプチドを備えるペプチド系化合物に関し、ここで、Ｘ_１はＣ又はＳであり、Ｘ_２はＬ又はＡであり、Ｘ_３はＡ、Ｖ又はＬであり、Ｘ_４はＦ又はＹであり、Ｘ_５はＹ又はＦであり、Ｘ_６はＣ又はＲであり、Ｘ_７はＦ又はＬであり、Ｘ_８はＷ又はＡであり、そして、ｍおよびｎは、それぞれ０又は１であり、或いはそのバリアントである。

【0033】

本明細書における「ペプチド系化合物」とは、アミノ酸残基の鎖を形成するペプチド結合（つまり、アミノ結合）によって繋がり合うアミノ酸残基を有する化合物を指す。本発明における「ペプチド系化合物」は、化学式Ｉを備える又は化学式Ｉからなる、少なくとも１つのペプチドを備える。ペプチド系化合物は、本発明の当該少なくとも１つのペプチドに隣接して別の化学部分を備えることもある。別の化学部分とは、タンパク質、多糖類、パルミチン酸や脂質などの脂肪酸、これらの組み合わせであるリポタンパク質や糖脂質など、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、小分子薬物（例えば、ヌクレオシド類似体、ヘリカーゼ抑制剤）、およびイメージング剤（例えば、フルオロフォア、量子ドット、放射性トレーサー、金属キレート）などである。

【0034】

本明細書における「化合物」とは、ポリペプチド、ペプチド、又は
化学式（Ｉ）を備える又は化学式（Ｉ）からなる少なくとも１つのペプチドと複合又は結合した、他のあらゆる化学物質でもあり得る。したがって、本発明の「ペプチド系化合物」は、融合ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、或いはこれらの複合体又は結合体のいずれかでもあり得る。

【0035】

化学式Ｉを備える又は化学式Ｉからなる少なくとも１つのペプチドの「バリアント」とは、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つから、最大で５つまで、好ましくは最大で４つまで、より好ましくは最大で３つまで、より好ましくは最大で２つまで、具体的には１つの、保存的アミノ酸置換を備えてもよい。保存的置換の例として、Ｆ、Ｖ、Ｌ又はＡを互いに置換するような、１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換、或いは、Ｋ，Ｒ間、Ｅ，Ｄ間、又はＱ，Ｎ間の置換のような、１つの極性残基の別の極性残基への置換が挙げられる。他のこのような保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する全領域の置換などがよく知られている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ著、１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５‐１３２）。代表的なアミノ酸置換を次の表に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

本発明の好ましい実施形態によると、ペプチドの力価は、例えばペプチドの化学合成によって、ペプチドのアミノ酸残基を変更又は欠失すること、或いは、ペプチドにアミノ酸残基を挿入又は付加することによって修飾され得る。ペプチドの特定の部位におけるアミノ酸残基の保守的交換は、活性に影響を与えることなく許容される。アミノ酸の挿入もまた、可能である。ペプチドの活動の向上又は障害は、特定のアミノ酸置換によって生じ得る。細胞トランスフェクション分析における活性では、下記のアミノ酸変化が生じ得る。Ｉ２４ペプチドのＦ８，Ｃ９間におけるＷ又はＡが挿入され得、Ｆ８はＬになり得、Ａ３はＶ又はＬになり得、Ｆ４はＹになり得、Ｙ５はＦになり得、Ａ６は欠失し得、Ｃ１はＳになり得、Ｃ７はＲになり得る。本発明のペプチドのコアモチーフは、好ましくはＣ１‐Ｘ_１‐Ｘ_２‐Ｘ_３‐Ｘ_４‐（Ａ）‐Ｃ２‐Ｘ_５‐（ＷＡ）‐Ｃ３（配列番号５９）であり、ここでＸ_１はＬ又はＡであり、Ｘ_２は脂肪族残基Ａ、Ｖ又はＬであり、Ｘ_３およびＸ_４は芳香族アミノ酸残基Ｆ又はＹである。位置Ｃ２は、別のアミノ酸残基によって交換できる。本発明の特に好ましい実施形態では、このモチーフは、「外来」ＤＮＡからの遺伝子発現に対する抑制効果およびＲＮＡポリメラーゼ活性の抑制を引き起こす、最小モチーフを示す。

【0038】

化学式（Ｉ）における「Ａ」はアラニンの略であり、「Ｃ」はシステインの略であり、「Ｓ」はセリンの略であり、「Ｌ」はロイシンの略であり、「Ｖ」はバリンの略であり、「Ｆ」はフェニルアラニンの略であり、「Ｙ」はチロシンの略であり、「Ｒ」はアルギニンの略であり、「Ｗ」はトリプトファンの略である。化学式（Ｉ）における「‐」は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質で生じる、２つのアミノ酸残基間のペプチド結合を示す。

【0039】

本発明の特に好ましい実施形態では、化学式（Ｉ）のＸ_６はＣである。
本発明のさらに好ましい実施形態では、Ｘ_１はＣであり、Ｘ_２はＬであり、Ｘ_６はＣである。

【0040】

本発明の別の好ましい実施形態では、ｍは１である。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１‐Ｘ_２‐Ｘ_３‐Ｘ_４‐Ｘ_５‐（Ａ）_ｍ‐Ｃ‐Ｘ_７‐（Ｘ_８）_ｎ‐Ｃ（配列番号６０）を備える、又は当該アミノ酸配列からなり、ここで、Ｘ_１はＣ又はＳであり、Ｘ_２はＬ又はＡであり、Ｘ_３はＡ、Ｖ又はＬであり、Ｘ_４はＦ又はＹであり、Ｘ_５はＹ又はＦであり、Ｘ_７はＦ又はＬであり、Ｘ_８はＷ又はＡであり、そして、ｍおよびｎは、それぞれ０又は１であり、或いはそのバリアントである。

【0041】

本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、アミノ酸配列Ｃ‐Ｌ‐Ｘ_３‐Ｘ_４‐Ｘ_５‐（Ａ）_ｍ‐Ｃ‐Ｘ_７‐（Ｘ_８）_ｎ‐Ｃ（配列番号６１）を備える、又は当該アミノ酸配列からなり、ここで、Ｘ_３はＡ、Ｖ又はＬであり、Ｘ_４はＦ又はＹであり、Ｘ_５はＹ又はＦであり、Ｘ_７はＦ又はＬであり、Ｘ_８はＷ又はＡであり、そして、ｍおよびｎは、それぞれ０又は１であり、或いはそのバリアントである。

【0042】

生物／細胞内における外来核酸分子の翻訳および／又は転写を抑制又は防止するために、本発明の化合物の能力を増大させるため、当該化合物は、化学式（Ｉ）および本発明によるペプチドを１つ以上備えてもよい。したがって、本発明の化合物は１個から４個、好ましくは１個から３個、より好ましくは１個から２個の、化学式Ｉを備える又は化学式Ｉからなるペプチドを備えても、又は当該ペプチドからなってもよい。

【0043】

本発明のペプチド系化合物は、化学式（Ｉ）によるペプチドを１つ以上備えてもよく、各ペプチドは、同一のアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列からなってもよい。本発明の特に好ましい実施形態では、化合物は、化学式（Ｉ）および本発明による同一のアミノ酸配列からなるペプチドを２つ以上備える。結果として得られる多量体（例えば、二量体および三量体）は、本発明のペプチドの転写／翻訳抑制効果が著しく向上し得るという利点を有する。

【0044】

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のペプチドは、８から４０個、好ましくは８から３０個、より好ましくは８から２０個、より好ましくは８から１５個、より好ましくは８から１２個、より好ましくは８から１０個のアミノ酸残基からなる。

【0045】

本発明のペプチドは、直鎖又は環状ペプチドでもよい。環状化合物、特に環状ペプチドを産生する方法は、本技術分野において周知のものである。化学式（Ｉ）および本発明によるペプチドのＣ末端、場合によってはＮ末端における、システイン残基の存在によって、環状ペプチドの産生が促進される。言うまでもなく、環状ペプチドは、本発明のペプチドのＮ末端とＣ末端との間でアミド結合を行うことによっても合成し得る。

【0046】

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、ＣＬＡＦＹＡＣＦＷＣ（配列番号２）、ＣＬＡＦＹＡＣＬＷＣ（配列番号３）、ＣＬＡＦＹＡＣＦＡＣ（配列番号４）、ＣＬＶＦＹＡＣＦＣ（配列番号５）、ＣＬＡＦＹＡＣＦＣ（配列番号６）、ＣＬＬＹＦＣＦＣ（配列番号７）、ＣＡＡＦＹＡＣＦＣ（配列番号８）、ＳＬＡＦＹＡＣＦＡＣ（配列番号９）、ＣＬＡＦＹＡＲＦＣ（配列番号１０）、ＣＬＡＦＹＣＦＡＣ（配列番号１１）、ＣＬＡＦＹＣＦＣ（配列番号１２）、およびＣＬＡＹＦＣＦＣ（配列番号１３）からなる群から選択される。

【0047】

本発明の特に好ましいペプチドは、ＣＬＡＦＹＡＣＦＷＣ（配列番号２）、ＣＬＡＦＹＡＣＬＷＣ（配列番号３）、ＣＬＡＦＹＡＣＦＡＣ（配列番号４）、ＣＬＶＦＹＡＣＦＣ（配列番号５）、ＣＬＡＦＹＡＣＦＣ（配列番号６）およびＣＬＬＹＦＣＦＣ（配列番号７）からなる群から選択され、特に、ＣＬＡＦＹＡＣＦＷＣ（配列番号２）又はＣＬＡＦＹＡＣＬＷＣ（配列番号３）から選択される、アミノ酸配列を備え、又は当該アミノ酸配列からなる。

【0048】

本発明の化合物およびペプチドの、細胞内への転位、又は細胞コンパートメント間での転位を促進するため、本発明の化合物又は本発明による少なくとも１つのペプチドは、細胞透過性を示すように修飾される。本発明のペプチド系化合物内における細胞透過部分の存在は、当該化合物の細胞内への転位、又は細胞コンパートメント間での転位をより効率的に制御することを可能にする。本発明の化合物およびペプチドは、翻訳および／又は転写が抑制又は低減される細胞又は生物内に配置され得るため、細胞又は生物内における外来核酸分子の翻訳および／又は転写を、より一層の抑止又は防止に繋がる可能性がある。

【0049】

本発明の好ましい実施形態によると、少なくとも１つのペプチド又はペプチド系化合物は、少なくとも１つの細胞透過性ペプチドに、Ｃ末端および／又はＮ末端で直接、或いはリンカーを介して融合される。

【0050】

本明細書における「細胞透過性ペプチド」という用語は、異なる種類の分子を原形質膜を横断して輸送することができ、したがって様々な分子量の分子（ナノ粒子から小化学分子、高分子、およびＤＮＡの大型断片まで）の細胞取り込みを促進することができる（短鎖）ペプチドを指す。輸送される分子は、共有結合を介した化学結合（例えば、複合、融合）或いは、Ｐｅｐ－１等による非共有結合性相互作用のいずれかにより、細胞透過性ペプチドに会合される。通常、細胞透過性ペプチドは、リジンやアルギニンなどの正電荷を持つアミノ酸を高い相対存在量で含むか、又は、極性／荷電アミノ酸、および、非極性、疎水性アミノ酸の交互パターンを含む配列を有するかのいずれかであるアミノ酸組成を有する。これら２つのタイプの構造は、それぞれ、ポリカチオン性、および両親媒性と言われる。細胞透過性ペプチドは、異なるサイズ、アミノ酸配列、および電荷を有するが、当該ペプチドは全て、原形質膜を転位し、細胞質又は細胞小器官への様々な分子の送達を促進する能力、という共通の特性を持つ。

【0051】

本発明のペプチド又はペプチド系化合物は、少なくとも１つの細胞透過性ペプチドに、Ｃ末端および／又はＮ末端で直接、或いはリンカーを介して融合されてもよい。リンカーは、本発明によるペプチドおよび／又は化合物と細胞透過性ペプチドとの間に距離を設けるという利点を有する。さらなる利点は、本発明によるペプチドおよび／又は化合物と細胞透過性ペプチドとの間に１つ以上の切断部位を組み込み、例えばプロテアーゼに細胞透過性ペプチドの除去を許容することである。

【0052】

本発明の別の好ましい実施形態によると、細胞透過性ペプチドは、ＴＡＴペプチドおよびポリカチオン性タグを含む群から選択される。
上述のとおり、細胞透過性ペプチドは、ポリカチオン性構造を有し得る。したがって、本発明によるペプチドおよび／又は化合物にポリカチオン性ペプチド（つまり、ポリカチオン性タグ）を添加することが特に好ましい。他の細胞透過性ペプチドは、細胞膜を介した他の分子の転位を支持することが知られている、自然発生タンパク質に由来し得る。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）から得られるＴＡＴペプチドは、周知の細胞透過性ペプチドである。

【0053】

本発明の好ましい実施形態によると、細胞透過性ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴＡＴタンパク質に由来し、配列番号１４（ＭＥＰＶＤＰＲＬＥＰＷＫＨＰＧＳＱＰＫＴＡＣＴＴＣＹＣＫＫＣＣＦＨＣＱＶＣＦＴＴＫＡＬＧＩＳＹＧＲＫ‐ＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＧＳＱＴＨＱＶＳＬＳＫＱＰＴＳＱＰＲＧＤＰＴＧＰＫＥ）の３７から７２個のアミノ酸残基、より好ましくは３７から６０個のアミノ酸残基、より好ましくは４８から６０個のアミノ酸残基を備えても、又は当該アミノ酸残基からなってもよく、具体的には、アミノ酸配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１５）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６）、ＣＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１７）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＧ（配列番号１８）又は、ＣＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９）のアミノ酸配列を備えても、又は当該アミノ酸配列からなってもよく、ＧＲＫ‐ＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１５）が最も好ましく使われる。

【0054】

上述のとおり、本発明の別の局面は、Ｉ２４ペプチド或いは、細胞浸透性又は細胞透過性を向上可能な分子に融合された本発明の他のあらゆるペプチドに関する。このようなタグは、例えば、ＴＡＴペプチド又は、ポリアルギニンタグなどのポリカチオン性タグでもよい。実験によると、例えば、ＴＡＴタグ（ＴＡＴ‐Ｉ２４：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣＬＡＦＹＡＣＦＣ；配列番号２０）は、ＴＡＴペプチド単独では不活性であるところ、プラスミドＤＮＡ（ＩＣ５０=０.０６μＭ）と共にトランスフェクションされた場合に、プラスミドでコードされたルシフェラーゼレベルの抑制におけるペプチドの力価を増大させる。

【0055】

また、本発明で使用される細胞透過性ペプチドは、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２１）の配列を備えるショウジョウバエアンテナペディアのタンパク質ホメオドメイン由来でも、ＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２２）つまり（Ａｒｇ）７、又はＲＲＲＲＲＲＲＣ（配列番号２３）つまり（Ａｒｇ）７‐Ｃ、又はＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２４）つまり（Ａｒｇ）８、又はＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２５）つまり（Ａｒｇ）９を備えるポリアルギニンの伸長物でも、ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ（配列番号２６）の配列を備えるブフォリンに由来しても、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２７）の配列を有するトランスポータンに由来しても、ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号２８）の配列を備えるＫＡＬＡペプチド又はＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号２９）の配列を備えるＭＡＰから選択されても、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３０）の配列を備えるＰｅｐ－１、ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ（配列番号３１）の配列を備えるｈＣＴ（９‐３２）から選択されても、ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ（配列番号３２）の配列を備えるｐＶＥＣであっても、ＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号３３）の配列を備えるｐＩＳＬであっても、ＲＱＧＡＡＲＶＴＳＷＬＧＲＱＬＲＩＡＧＫＲＬＥＧＲＳＫ（配列番号３４）の配列を備えるＥｒｎｓであっても、ＫＬＩＫＧＲＴＰＩＫＦＧＫ（配列番号３５）の配列を備えるレストリクトシンＬ３であっても、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ（配列番号３６）又はＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ‐システアミドの配列を備えるＭＰＧであっても、ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ（配列番号３７）又はＣＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＥＤ（配列番号３８）の配列を備えるＳＶ４０ラージＴ抗原の核内局在化シグナル（ＮＬＳ）に由来しても、或いは、ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号３９）の配列を備える狂犬病ウイルスの糖タンパク質（ＲＶＧ）に由来してもよい。

【0056】

ルシフェラーゼ発現の抑制において、タグなしＩ２４ペプチドが僅かな活性しかない一方で、バキュロウイルスなどの感染性ウイルスからの遺伝子発現は、細胞浸透性タグに融合されたペプチドによって低減され得る。これは、Ｎ末端ＴＡＴタグに融合したＩ２４（ＴＡＴ‐Ｉ２４：ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣＬＡＦＹＡＣＦＣ；配列番号２０）を用いた、ＣＭＶプロモータの制御下のルシフェラーゼ遺伝子をコードするバキュロウイルスにおけるルシフェラーゼ発現の低減によって例示したとおりである。ＴＡＴ‐Ｉ２４によるバキュロウイルス仲介ルシフェラーゼ発現抑制のＩＣ５０は、０．１５μＭである。一局面では、本発明はペプチドとタグの融合に関するものであり、ペプチドとタグとの融合はペプチド又はタグ単体より優れている。別の局面では、本発明は、細胞遺伝子の発現を抑制することなく、遺伝子をコードするバキュロウイルスのｍＲＮＡレベルを低減することもできる、ペプチドとタグとの融合に関するものであり、インターロイキン８ｍＲＮＡが影響を受けずに発現することで実証された。

【0057】

本発明の別の局面は、ＴＡＴタグの付いたＩ２４ペプチドに関する。ＴＡＴタグペプチドは、本発明の全てのペプチドおよび化合物と同様に、２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスによる遺伝子発現を抑制することができるが、抑制は、高濃度（ＩＣ５０=６μＭ）で生じる。レポーター遺伝子発現の抑制に加えて、ウイルスのヘキソン遺伝子の発現も、これに相当する方法で抑制される。

【0058】

本発明の好ましい実施形態によると、ＴＡＴタグ付きＩ２４ペプチドは、標的細胞内でのウイルス複製を抑制することができ、これはアデノウイルス感染後に溶媒処理された細胞と比較して、上清に放出されたアデノウイルス粒子および細胞分離が低減し、標的細胞におけるウイルス産生の抑制が示されたことで実証された。

【0059】

本発明の別の局面は、ＴＡＴタグ付きＩ２４ペプチドに関する。ＴＡＴタグペプチドは、本発明の全てのペプチドおよび化合物と同様に、ポックスウイルス科の巨大核質ＤＮＡウイルスに属するＤＮＡウイルスであるワクシニアウイルスの遺伝子発現および複製を抑制することができる。ＨＥＫ２９３細胞がワクシニアウイルスに感染し、ＴＡＴ‐Ｉ２４で処理された場合、ＴＡＴ‐Ｉ２４の濃度２０μＭで、ウイルス遺伝子発現は９５％より高い確率で抑制され、ウイルス複製は９０％より高い確率で抑制された。

【0060】

本発明の別の局面は、ＴＡＴタグ付きＩ２４ペプチドに関する。ＴＡＴタグペプチドは、本発明の全てのペプチドおよび化合物と同様に、２本鎖ＤＮＡウイルスであるヘルペスウイルスの遺伝子発現および複製を抑制することができ、これは単純ヘルペスウイルスの複製の抑制で実証された。ヘルペスウイルス科には、ほかにもサイトメガロウイルス又は水痘帯状疱ウイルスがあり、エプスタイン・バーウイルスなどもその１つである。

【0061】

本発明の別の局面は、ＴＡＴタグ付きＩ２４ペプチドに関する。ＴＡＴタグペプチドは、本発明の全てのペプチドおよび化合物と同様に、ＲＮＡウイルスの遺伝子発現を抑制できる。部分的な遺伝子発現の抑制は１本鎖ＲＮＡウイルスに見られ、ＣＭＶプロモータの制御下にルシフェラーゼを含有するレトロウイルスであるレンチウイルスＬｕｃで実証された。ＨＥＫ２９３細胞をＴＡＴ‐Ｉ２４ペプチドで処理し、ＣＭＶプロモータの制御下にルシフェラーゼをコードするレンチウイルスに感染させた場合、最高濃度（２０μＭ）において、７５％のルシフェラーゼレベルの低減が観察された。

【0062】

Ｉ２４ペプチドに代表される本発明の抑制剤／ペプチドは、以下の配列（アミノ（Ｎ）末端からカルボキシ（Ｃ）末端）、Ｃｙｓ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｐｈｅ‐Ｔｙｒ‐Ａｌａ‐Ｃｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ｃｙｓ（配列番号６）の、９つのアミノ酸残基からなる。当該ペプチドは、恐らくは標的細胞の細胞膜で又は細胞質基質内で、任意の方法によって標的細胞に導入されるときに、ＤＮＡ分子に接触してもよい。当該ペプチドは、細胞に進入する前にＤＮＡ分子に接触していてもよいし、細胞透過性のペプチドを介して細胞内でＤＮＡ分子に接触してもよい。

【0063】

Ｉ２４ペプチドの配列は、シグナルペプチドのペプチドバインダーを特定するための、翻訳中のリボソームに対するファージスクリーニングによって最初に特定された、国際公開第２０１１／０８６１１６号に記載されているペプチド（ＬＡＦＹＡＣＦ（国際公開第２０１１／０８６１１６号に記載の配列番号３９））に由来する。しかしながら、本明細書に記載の、発明を実施するための形態は、最初のシグナルペプチドスクリーニングターゲットとは無関係である。様々な細胞系で実施するペプチドの試験は、最初のシグナルペプチドターゲットとは無関係な効果を示した。驚くことに、ペプチドは、標的細胞に持ち込まれた「外来」ＤＮＡからの遺伝子発現を、細胞の、ゲノムによってコードされた遺伝子発現に影響を与えることなく抑制した。本技術分野において、シグナルペプチドと「外来」ＤＮＡからの遺伝子発現の規則との間に周知の関係はないため、上記の結果の新規性はサポートされる。

【0064】

本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明のペプチド系化合物および／又は少なくとも１つのペプチドは、標識に融合又は複合される。
本発明のペプチドおよび／又は化合物は、融合又は複合産物の標識として働く別の分子と複合又は融合してもよい。標識の存在によって、本発明によるペプチドおよび／又は化合物の、例えば細胞又は生物における、直接的又は非直接的な検出と局在化とが許容される。

【0065】

本発明内で使用される標識は、ポリペプチド、タンパク質、および他の化学構造を含む、様々な構造を有してもよい。好ましくは、標識は、染料、好ましくは蛍光染料、より好ましくは蛍光タンパク質、蛍光ストレプトアビジン、蛍光ビオチン、又は染料結合ペプチドを含む群から選択される。

【0066】

また、本発明のペプチドは、優先的にはＮ末端を介して、染料やビオチンなどの他のペプチド又は化学物質などの、局在化および活性研究に有用であろう他の成分に融合され得る。本発明の化合物、好ましくはＩ２４ペプチドを備える化合物は、多量体、好ましくは二量体でもあり得る。例示した二量体は、単量体（ＩＣ５０=０．０９μＭ）と比較して力価が増大した。

【0067】

本発明の更なる局面は、哺乳類又はヒト個体の細胞における異種核酸分子の転写および／又は翻訳に関連する障害又は疾患の治療に用いるための、本発明によるペプチド又は化合物に関する。

【0068】

本発明のペプチドおよび化合物は、哺乳類およびヒト被験体の細胞における異種核酸分子の翻訳および／又は転写によって生じる疾患又は障害の治療に利用できる。このような疾患および障害には、とりわけ、口唇ヘルペスおよび陰部ヘルペスを発生させる単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘および成人の帯状疱疹を発生させる水痘帯状疱疹ウイルス、疣贅又はある種の癌を発生させるパピローマウイルス、又はアデノウイルスによる感染症などの、ウイルス性感染症が含まれる。

【0069】

「細胞における異種核酸分子の転写および／又は翻訳に関連する障害又は疾患」は、健康とされる細胞には通常存在しない核酸分子の翻訳又は転写によって発生する障害および疾患を含む。

【0070】

本発明の別の局面は、哺乳類又はヒト個体における、ウイルス性、細菌性、寄生虫又は真菌性の感染症の治療に用いる、本発明のペプチド又はペプチド化合物に関する。本発明のペプチド又はペプチド化合物は、好ましくはポックスウイルス科のウイルス、より好ましくはアデノウイルス科のウイルス、最も優先的にはヘルペスウイルス科のウイルス、具体的には、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスである、２本鎖ＤＮＡウイルスなどのＤＮＡウイルスによる感染症の治療に利用できる。

【0071】

本発明のペプチドおよびペプチド系化合物は、細胞又は（多細胞）生物に存在する異種（「外来」）核酸分子の転写および／又は翻訳の比率を顕著に抑制又は低減することが示されている。この特徴を有する本発明のペプチドおよび、ひいては化合物は、哺乳類又はヒト個体における、ウイルス性、細菌性、寄生虫又は真菌性の感染症の治療を達成させる。ウイルスは通常、その複製に他の生物又は細胞を必要とするため、特にウイルスによって発生する感染症は、本発明のペプチドおよび化合物を利用して治療され得る。

【0072】

本発明のペプチドおよび化合物は、哺乳類又はヒト被験体に、経口投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、膣内投与、眼内投与、吸入投与、又は経鼻投与によって投与され得る。

【0073】

本明細書に記載の本発明のペプチドおよび化合物は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、膣内投与、眼内投与、吸入投与、経鼻投与によって、（例えば、精製ペプチド又は化合物として）又は本明細書に記載のとおり、組成物又は薬剤の成分として、被験体のみに投与され得る。当該組成物は、医薬組成物を調合するために、生理学的に許容可能な担体又は賦形剤と共に製剤化される。製剤は、例えば静脈内又は皮下投与などの、投与方法に適したものであるべきである。組成物を製剤化する方法は、本技術分野において周知のものである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集）（１９８９）参照）。

【0074】

薬学的に許容可能な適切な担体には、水、塩類溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレン・グリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、又は澱粉などの炭水化物、マンニトール、スクロース、デキストロース又はその他の糖類、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、リポソーム、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、およびこれらの組み合わせが含まれる。製剤は、本発明のペプチドおよび化合物と有害な反応をしない、又は本発明のペプチドおよび化合物の活性を干渉しない補助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩類、緩衝剤、着色および／又は芳香物質など）と混合され得る。好ましい実施形態では、静脈内投与に適した水溶性の担体が利用される。

【0075】

本明細書に記載のペプチドおよび化合物を備える本発明の製剤は、湿潤剤又は乳化剤、或いはｐＨ緩衝剤も含み得る。組成物は、液体溶液、懸濁液、乳剤、徐放性製剤、又は粉末であり得る。また、組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体を有する坐薬としても製剤化され得る。

【0076】

本発明の好ましい実施形態では、静脈内投与用の組成物は、概して、滅菌等張性水性緩衝液である。必要な場合、組成物は、注射部位の痛みを和らげるために、可溶化剤および局所麻酔剤を含んでもよい。通常、原料は、例えば、活性薬剤の量を表示したアンプル又は小袋などの気密容器に入った凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、個別に提供されるか、又は単位剤形中に混ぜて提供される。組成物が点滴投与される場合、滅菌製薬等級水、生理食塩水、又はブドウ糖液を含む点滴ボトルで投薬されてよい。組成物が注射で投与される場合、投与前に原料を混ぜることができるように、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。

【0077】

本発明のペプチドおよび化合物は、中性又は塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容可能な塩類として、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離アミノ基と共に形成されるもの、および、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する遊離カルボシキル基と共に形成されるものなどが挙げられる。

【0078】

本発明のペプチドおよびペプチド系化合物は、任意の適切なルートで、好ましくは、局所投与、経鼻投与、皮下投与、静脈内投与、吸入投与、非経口投与、皮内投与、経皮投与、直腸投与、膣内投与、眼内投与、又は経粘膜投与によって投与され得る。所望であれば、同時に１つ以上のルートを利用することもできる。

【0079】

本発明による具体的な用量又は投与量は、例えば、所望する結果の性質および／又は程度、投与ルートおよび／又は投与タイミングの詳細、並びに／或いは１つ又はそれ以上の特性（例えば、体重、年齢、生育歴、遺伝的特徴、ライフスタイル要因など、又はこれらの組み合わせ）によって変わってもよい。この用量又は投与量は、当業者によって決定できる。適切な用量又は投与量が、標準的な臨床技術によって求められる実施形態もある。例えば、いくつかの実施形態では、適切な用量又は投与量は、疾患重症度指標スコアを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００％、又はそれ以上減らすのに十分な用量又は投与量である。例えば、いくつかの実施形態では、適切な用量又は投与量は、疾患重症度指標スコアを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００％減らすのに十分な用量又は投与量である。上記に代わって、又は上記に加えて、所望の又は最適な用量範囲又は投与量の特定を促進するために、１つ又はそれ以上のインビトロ又はインビボアッセイを利用して、適切な用量又は投与量を決定する実施形態もある。

【0080】

本発明のペプチドおよび化合物は、好ましくは、治療上有効な量で投与される。本明細書における「治療上有効な量」は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療薬の総量に基づいて決定される。一般的に、治療上有効な量は、哺乳類又はヒト個体に有意義な利益（例えば、根本にある疾患又は障害の治療、調整、治癒、防止および／又は改善）をもたらすに足りる量をいう。適切な用量又は投与量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから導き出された用量反応曲線から推定されてもよい。

【0081】

本発明のペプチドおよび化合物の、塩類を含む治療上有効な投与用量は約１０‐１０００ｍｇの範囲（例えば、約２０ｍｇ‐１，０００ｍｇ、３０ｍｇ‐１，０００ｍｇ、４０ｍｇ‐１，０００ｍｇ、５０ｍｇ‐１，０００ｍｇ、６０ｍｇ‐１，０００ｍｇ、７０ｍｇ‐１，０００ｍｇ、８０ｍｇ‐１，０００ｍｇ、９０ｍｇ‐１，０００ｍｇ、約１０‐９００ｍｇ、１０‐８００ｍｇ、１０‐７００ｍｇ、１０‐６００ｍｇ、１０‐５００ｍｇ、１００‐１０００ｍｇ、１００‐９００ｍｇ、１００‐８００ｍｇ、１００‐７００ｍｇ、１００‐６００ｍｇ、１００‐５００ｍｇ、１００‐４００ｍｇ、１００‐３００ｍｇ、２００‐１０００ｍｇ、２００‐９００ｍｇ、２００‐８００ｍｇ、２００‐７００ｍｇ、２００‐６００ｍｇ、２００‐５００ｍｇ、２００‐４００ｍｇ、３００‐１０００ｍｇ、３００‐９００ｍｇ、３００‐８００ｍｇ、３００‐７００ｍｇ、３００‐６００ｍｇ、３００‐５００ｍｇ、４００ｍｇ‐１，０００ｍｇ、５００ｍｇ‐１，０００ｍｇ、１００ｍｇ‐９００ｍｇ、２００ｍｇ‐８００ｍｇ、３００ｍｇ‐７００ｍｇ、４００ｍｇ‐７００ｍｇ、および５００ｍｇ‐６００ｍｇ）であってもよい。本発明の好ましい実施形態によると、本発明のペプチドおよび化合物は、約１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇに等しいか又はそれより多い、および／或いは、約１０００ｍｇ、９５０ｍｇ、９００ｍｇ、８５０ｍｇ、８００ｍｇ、７５０ｍｇ、７００ｍｇ、６５０ｍｇ、６００ｍｇ、５５０ｍｇ、５００ｍｇ、４５０ｍｇ、４００ｍｇ、３５０ｍｇ、３００ｍｇ、２５０ｍｇ、２００ｍｇ、１５０ｍｇ、又は１００ｍｇより少ない量で投与される。

【0082】

本発明のペプチドおよび化合物は、１用量又はそれ以上の用量で投与されてもよい。本発明によるペプチドおよび／又は化合物の治療上有効な量は、１日又はそれ以上の日数で、最も好ましくは１日で投与されてもよい。

【0083】

治療上有効な投与用量は、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から５００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から３００ｍｇ／ｋｇ体重、／ｋｇ体重約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。本明細書における治療上有効な量は、１日あたり１錠で提供されてもよい。

【0084】

治療上有効な投与用量は、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重から約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重から約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重から約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重から約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０２ｍｇ／ｋｇ体重から約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重から約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重から約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重から約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重から約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３ｍｇ／ｋｇ体重から約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重から約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重から約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重から約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重から約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重から約０．５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約０．９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約０．７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約０．６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約０．５ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。

【0085】

治療上有効な投与用量は、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．１ｍｇ／ｋｇ体重であってよく、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．００９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．００８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．００７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．００６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．００４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．００３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から０．００２ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。いくつかの実施形態では、治療上有効な用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００６ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００７ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００８ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００９ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重、０．００２ｍｇ／ｋｇ体重、０．００３ｍｇ／ｋｇ体重、０．００４ｍｇ／ｋｇ体重、０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、０．００６ｍｇ／ｋｇ体重、０．００７ｍｇ／ｋｇ体重、０．００８ｍｇ／ｋｇ体重、０．００９ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、又は０．１ｍｇ／ｋｇ体重でもよい。特定の対象における有効な用量は、当該対象（つまり、哺乳類又はヒト個体）のニーズに応じて時間と共に変化（例えば、増大又は低減）し得る。

【0086】

本発明のペプチドおよび化合物は、約１‐１,０００μｇ／ｋｇ体重／日の範囲の有効な用量で投与されてもよい（例えば、約１‐９００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐８００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐７００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐６００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐５００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐４００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐３００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐２００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐１００μｇ／ｋｇ体重／日、１‐９０μｇ／ｋｇ体重／日、１‐８０μｇ／ｋｇ体重／日、１‐７０μｇ／ｋｇ体重／日、１‐６０μｇ／ｋｇ体重／日、１‐５０μｇ／ｋｇ体重／日、１‐４０μｇ／ｋｇ体重／日、１‐３０μｇ／ｋｇ体重／日、１‐２０μｇ／ｋｇ体重／日、１‐１０μｇ／ｋｇ体重／日の範囲）。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドおよび化合物は、約１‐５００μｇ／ｋｇ体重／日の範囲の有効な用量で投与される。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドおよび化合物は、約１‐１００μｇ／ｋｇ体重／日の範囲の有効な用量で投与される。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドおよび化合物は、約１‐６０μｇ／ｋｇ体重／日の範囲の有効な用量で投与される。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドおよび化合物は、約１、２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１,０００μｇ／ｋｇ体重／日から選択される有効な用量で投与される。

【0087】

本発明のペプチドおよび化合物は、継続的な点滴、好ましくは継続的な静脈内点滴によって投与されてもよい。本発明のペプチドおよび化合物は、隔月、毎月、月２回、３週間毎、隔週、毎週、週２回、週３回、毎日、１日２回、又は臨床的に望ましい他の投与スケジュールで投与されてもよい。単一の対象用の投与計画は、固定間隔おきである必要はなく、当該対象のニーズに応じて時間と共に変化し得る。

【0088】

本発明の別の局面は、本発明によるペプチド又は化合物をコードする核酸分子に関する。
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。当該核酸分子はベクターの一部、好ましくはクローニングベクター又は発現ベクターの一部であり得、これらベクターは本技術分野において周知のものである。

【0089】

本発明の別の局面は、細胞内、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳類又はヒトの細胞、或いは生物（例えば、哺乳類又はヒト被験体）における、異種核酸分子の転写および／又は翻訳を抑制するための、本発明によるペプチド又は化合物の使用に関する。

【0090】

本発明の好ましい実施形態によると、異種核酸分子は、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌由来である。
本発明のさらなる実施形態によると、異種核酸分子は、抗生物質耐性遺伝子又はその機能的断片をコードする核酸の並びを含む。

【0091】

また、本発明のペプチドおよび化合物は、抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸分子の転写および／又は翻訳を抑制することもでき、延いては、細菌のような微生物の抗生物質耐性を防ぐ、又は顕著に低減することもできる。これは、本発明のペプチドおよび化合物が、抗生物質耐性の原因となるタンパク質を産生できるにもかかわらず、細菌を抗生物質への感受性を高めるため、特に有利である。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、抗生物質耐性細菌との戦いに利用できる。

【0092】

プラスミドＤＮＡ、例えば抗生物質抵抗性遺伝子を含むＤＮＡ（例えば、Ｒ‐プラスミド）は、遺伝子水平伝播によって細菌間で転移され得る。プラスミドは、細菌ゲノムの外で複製され得るか、又は細菌ゲノム内に統合され得る。このようなＤＮＡを取り込むと、細菌は抗生物質に対する耐性を得ることができる。さらに、毒性遺伝子も細菌間で転移され得る。細菌の抗生物質耐性の世界的な進行および、適切な薬剤候補の欠如により、細菌感染の管理は将来の大きな課題となるであろう。細菌間の遺伝子転移の抑制剤は、例えば、病院のように抵抗性の形成が発生する場所における医療又は衛生対策において、影響を及ぼす可能性があると考えられる。したがって、「外来」ＤＮＡ分子転移の抑制および、抑制剤分子によるタンパク質産生の抑制は、感染性疾患に対する治療的介入、又は抗生物質耐性細菌の拡散および形成の防止に有用であると考えられる。

【0093】

よって、本発明の別の局面は、細菌性細胞が、当該細菌性細胞に抗生物質耐性を与えることが可能な遺伝子又はその機能的断片を獲得することを防止するための、本発明によるペプチド又は化合物の使用に関する。

【0094】

本発明の好ましい実施形態によると、本発明のペプチドおよび化合物、具体的にはＩ２４ペプチドは、抗生物質耐性遺伝子を含有するプラスミドとＩ２４ペプチドとを同時に形質転換された大腸菌が、抗生物質含有寒天平板上にコロニーを形成するのを抑制する。ペプチドは、形質転換が完了した後に塗布された場合は不活性である。アンピシリン又はカナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドを形質転換された大腸菌のコロニー形成の減少、およびアンピシリン又はカラマイシン含有寒天平版上における成長の減少によって実証されるように、ペプチドによる抑制は、使用される抗生物質耐性遺伝子とは無関係である。

【0095】

さらに、抗生物質耐性を含有するプラスミドとペプチドとを同時に形質転換された大腸菌における、β‐ラクタマーゼｍＲＮＡの発現の減少によって実証されるように、本発明のペプチドおよび化合物、具体的にはＩ２４ペプチドは、抗生物質抵抗性遺伝子におけるプラスミドの複製およびＲＮＡの産出を抑制することが分かった。

【0096】

本発明のペプチドおよび化合物は、ウイルス核酸分子の転写および／又は翻訳を抑制、或いは、顕著に低減することができる。したがって、これらペプチドおよび化合物は、生ワクチンの安全性を高めるため、又は生ワクチンを非直接的に弱毒化するために、弱毒化ウイルスを含有するワクチンへの添加剤として利用され得るか、或いは、弱毒化ウイルスと共に投与され得る。

【0097】

そのため、本発明の別の局面は、弱毒性生ワクチン用の添加剤としての本発明によるペプチド又は化合物の使用に関する。本発明の代替の局面では、本発明によるペプチドおよび／又は化合物は、生ワクチンと共に併用投与されてもよい。

【0098】

本発明のペプチドおよび化合物は、生物中（例えば、哺乳類およびヒト個体）のウイルス価を低減させるために、細胞内のウイルス核酸分子の転写および／又は翻訳を抑制するのに使用され得る。この特性は、細胞培養液におけるウイルスの拡散を抑制又は防止するのにも利用され得る。

【0099】

したがって、本発明の別の局面は、細胞培養液におけるウイルスの拡散を抑制又は防止するための本発明によるペプチド又は化合物の使用に関する。
本発明の別の局面は、細菌のファージ感染を抑制するための本発明による化合物の使用に関する。

【0100】

本発明の化合物／抑制剤の別の潜在用途は、細菌内でファージ感染を防止することである。細菌培養物のファージ感染は、特に、大規模な発酵を含む生物工学的応用において問題となり得る。生物／細胞内で外来核酸分子の翻訳および／又は転写を抑制する本発明の化合物の能力により、細菌内におけるファージの複製は抑制、又は防止さえされ得る。つまり、本発明の化合物又は当該化合物を備える組成物は、細菌性細胞の培養中に培地に添加される。

【0101】

そのため、当該抑制剤の別の潜在用途は、細菌内ファージ感染の防止である。細菌培養物のファージ感染は、特に、大規模な発酵を含む生物工学的応用において問題となり得る。また、動物細胞培養におけるウイルス感染の防止も、生物工学的および生物薬剤学的に関連する別の用途であってよい。抑制剤は、標的細胞の細胞内に発現してもよく、また、ウイルス感染又はファージ感染の防止などの生物工学的用途において、又は、遺伝子発現の制御において有用であると考えられる。

【0102】

本発明の化合物は、その検出および／又は視覚化を許容するために、他の物質で標識化されてもよい。これは、本発明の化合物が異種／外来核酸分子の転写および／又は翻訳を抑制する細胞、組織、および生物における、当該化合物の局在化に有用である可能性がある。したがって、本発明の別の局面は、真核細胞内において異種核酸分子の転写および／又は翻訳を局在化するための本発明による化合物の使用に関する。

【0103】

本発明の好ましい実施形態によると、局在化される異種／外来核酸分子は、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌由来である。
一局面において、本発明は、発現プラスミドのトランスフェクション中に発現プラスミドに接触すると、プラスミドでコードされたタンパク質の真核細胞内における発現を低減させる、本発明のペプチドおよび化合物、好ましくはＩ２４ペプチドに関する。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、例えばリポソーム型試薬、カチオンポリアミドアミンポリマー、電気穿孔法、リン酸カルシウム、又はＤＥＡＥ‐デキストランを使用して実行し得る。

【0104】

ルシフェラーゼをコードした発現プラスミドとペプチドとを同時にトランスフェクションされた細胞の、ルシフェラーゼレベルの低減によって実証されるように、本発明のペプチドおよび化合物、好ましくはＩ２４ペプチドは、細胞可溶化物中の細胞質タンパク質レベルを低減することができる。

【0105】

分泌型アルカリホスファターゼでコードした発現プラスミドとペプチドとを同時にトランスフェクションされた細胞の、分泌型アルカリホスファターゼのレベルの低減によって実証されるように、本発明のペプチドおよび化合物、好ましくはＩ２４ペプチドは、細胞上清中の分泌性タンパク質のレベルを低減することができる。

【0106】

別の局面では、ＮＦ‐κＢｐ６５Ｍ２発現プラスミドとテストペプチドとを同時にトランスフェクションされた場合の、切断型ＮＦ‐κＢｐ６５（ＮＦ‐κＢｐ６５Ｍ２）のレベルの抑制によって実証されるように、本発明は、細胞可溶化物中の核タンパク質レベルを低減することができる本発明のペプチドおよび化合物、好ましくはＩ２４ペプチドを提供する。

【0107】

ウエスタンブロット手法に定められているように、真核細胞がＧＦＰ発現プラスミドとペプチドとを同時にトランスフェクションされた場合、本発明のペプチドおよび化合物、好ましくはＩ２４ペプチドは、細胞可溶化物中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レベルを低減することができる。本発明のペプチドおよび化合物が、ＧＦＰプラスミドとペプチドとを同時にトランスフェクションされた細胞中のＧＦＰ陽性細胞の総数を低減することが分かった。

【0108】

本発明のペプチドおよび化合物、好ましくはＩ２４ペプチドによる、発現プラスミドをトランスフェクションされた真核細胞中のタンパク質産生の抑制は、ＤＮＡの状態（例えば、環状、超らせん又は弛緩ＤＮＡ、線状ＤＮＡ、環状プラスミドＤＮＡ、直鎖状プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物および２本鎖オリゴヌクレオチド）とは無関係である。ペプチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られる直鎖状プラスミド又は２本鎖ＤＮＡ断片のような、直鎖状２本鎖ＤＮＡをトランスフェクションされると、真核細胞中のタンパク質産生を抑制する。

【0109】

別の局面では、本発明は、発現プラスミドでトランスフェクションされた真核細胞のタンパク質産生を、０．１から２μＭの間、好ましくは０．３から０．７μＭの間のＩＣ５０（最大抑制濃度の半分）で用量依存的に抑制する、本発明のペプチドおよび化合物、好ましくはＩ２４ペプチドを提供する。本発明のペプチドおよび化合物は、真核細胞のトランスフェクション中にＤＮＡに接触すると活性型であるが、トランスフェクション工程が完了した後にペプチドが添加された場合は非活性型である。

【0110】

本発明の別の局面は、細胞型に依存しないペプチドの効果に関する。ＨＥＫ２９３、ＣＶ‐１、ＣＯＳ‐７、ＭＣＦ‐７、又はＨＴ‐２９細胞の使用で実証されたように、Ｉ２４ペプチドは、種々の細胞株においてプラスミドと共にトランスフェクションされると、プラスミドでコードされたタンパク質の産生を抑制する。

【0111】

本発明を、以下の例によってさらに詳しく説明するが、以下の例は本発明を限定するものではない。
［例］
例１：Ｉ２４ペプチドの配列
Ｉ２４は、９つのアミノ酸残基、Ｃｙｓ‐Ｌｅｕ‐Ａｌａ‐Ｐｈｅ‐Ｔｙｒ‐Ａｌａ‐Ｃｙｓ‐Ｐｈｅ‐Ｃｙｓ（ＣＬＡＦＹＡＣＦＣ、配列番号６）からなるペプチドである。ペプチドは、システイン残基およびジスルフィド結合を介した直鎖状又は環状であり得る。

【0112】

例２：Ｉ２４は、一過性にトランスフェクションされた哺乳類細胞内における発現ベクターにコードされたタンパク質の産生を抑制する。
溶媒対照群としてのＤＭＳＯ、又は異なる用量のＩ２４ペプチドの存在下においてＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアゲン製）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞）をルシフェラーゼコンストラクト（ＣＭＶプロモータの制御下の真核性発現プラスミドに、ルシフェラーゼコード領域がクローニングされている）でトランスフェクションした。２４時間後、ルシフェラーゼ基質を使用して、細胞可溶化物からルシフェラーゼレベルを解析した。溶媒対照群と比較して、ペプチドは、ルシフェラーゼ産出を用量依存的に抑制した（図１ａ）。ＤＭＳＯ又は異なる用量のＩ２４ペプチドの存在下において、ＣＭＶプロモータの制御下の真核性の発現ベクターにクローニングされた分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。２４時間後、上清に分泌されたＳＥＡＰを比色分析によって分析した。溶媒対照群と比較して、Ｉ２４は、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞内におけるＳＥＡＰ産生を用量依存的に低減させた（図１ｂ）。Ｊ９ペプチド（Ｉ２４＿Ｍ２３；ＣＰＳＡＬＡＦＹＣ（配列番号５３）の環状型）およびＩ２１ペプチド（ＣＳＬＴＧＰＩＡＣ（配列番号５６））は、不活性対照とした。切断型のＮＦ‐ＫＢｐ６５（ｐ６５Ｍ２）をコードした発現プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に２４時間トランスフェクションした。ｐ６５の産生を、トランスフェクションされた細胞の溶解物を用いて、ウエスタンブロット法によって分析した（図１ｃ）。ｐ６５Ｍ２およびＩ２４ペプチド（２０μＭ）でトランスフェクションされた細胞では、ウエスタンブロット法でｐ６５Ｍ２は検出できなかった。Ｉ２４ペプチド（２μＭ）の存在下および非存在下において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードした発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ウエスタンブロット法による分析では、Ｉ２４ペプチドによってＧＦＰ産生およびＧＦＰ陽性細胞の数が低減したことが示された（図１ｄ、ｅ）。

【0113】

例３：Ｉ２４ペプチドは、一過性にトランスフェクションされた細胞における内在性インターロイキン８の発現を抑制することなく、切断されたインターロイキン８プロモータの制御下におけるプラスミドベクターにコードされた遺伝子発現を抑制する。

【0114】

ＨＥＫ２９３細胞に、切断されたインターロイキン８（ＩＬ‐８）プロモータの制御下のルシフェラーゼコード領域を含有したコンストラクトおよびＩ２４ペプチドを一過性にトランスフェクションし、トランスフェクションの６時間後に腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）‐αで刺激し、トランスフェクションの２４時間後に細胞可溶化物中のルシフェラーゼの発現および上清中のＩＬ‐８の放出をＥＬＩＳＡ法によって分析した。ペプチドはＴＮＦ‐α誘導ルシフェラーゼ発現を低減させたが、ＩＬ‐８の放出に影響を与えなかった（図２）。

【0115】

例４：Ｉ２４ペプチドを発現プラスミドと共に細胞内にトランスフェクションすると、タンパク質およびメッセンジャーＲＮＡのレベルが下方制御される。
アフリカミドリザル腎臓細胞ＣＯＳ‐７に、ＣＭＶプロモータの制御下でルシフェラーゼを駆動する発現プラスミドをトランスフェクションし、細胞可溶化物中のルシフェラーゼを測定した。ルシフェラーゼｍＲＮＡの発現分析のため、全ＲＮＡを分離してＤＮＡｓｅＩで処理し、ランダムヘキサマーを用いて逆転写した。リアルタイムＰＣＲは、ルシフェラーゼを検出する加水分解プローブを用いて行われ、１８ＳｒＲＮＡの転写レベルを標準化した。ルシフェラーゼタンパク質およびｍＲＮＡレベルは、異なる培養時間後に、いずれも下方制御された（図３）。

【0116】

例５：プラスミドベクターにコードされた遺伝子発現の抑制は、一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞内のプロモータに、部分的に依存する。
濃度を上昇させたＩ２４ペプチドの存在下において、ＣＭＶプロモータの制御下にルシフェラーゼを含有する発現プラスミド、およびＳＶ４０初期プロモータ制御下のネオマイシン耐性遺伝子を、ＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクションした。２４時間後、全ＲＮＡを細胞から分離し、プラスミドＤＮＡを除去するためにＤＮＡｓｅＩで消化し、逆転写した。ルシフェラーゼおよびネオマイシンｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲ分析は、加水分解プローブを用いて行われ、ＧＡＰＤＨ転写物に対して標準化された。濃度を上昇させたＩ２４ペプチドの存在下において、ルシフェラーゼ転写物が８７％低減された一方で、ネオマイシンｍＲＮＡレベルは約５０％しか低減されなかった（図４）。

【0117】

例６：プラスミドベクターにコードされた遺伝子発現の抑制は、使用する細胞株に依存しない。
アフリカミドリザル腎臓細胞の細胞株ＣＶ‐１およびＣＯＳ‐７、並びに、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ‐７およびヒト結腸がん細胞株ＨＴ‐２９に、ＣＭＶプロモータ制御下にルシフェラーゼを含有するプラスミド、および異なる濃度のＩ２４ペプチドを一過性にトランスフェクションした。レポーター遺伝子ルシフェラーゼの抑制は、使用した細胞株全てにおいて観察された（図５）。

【0118】

例７：アミノ末端基ＴＡＴタグの付加又は二量化による細胞透過性Ｉ２４は、Ｉ２４ペプチドの力価を高める。
Ｎ末端ＴＡＴタグの付加による細胞透過性Ｉ２４は、３つのグリシン残基によって分離された２つの単量体を有するＩ２４の二量体として生成された。ペプチドおよびルシフェラーゼをコードする発現プラスミドによる一過性トランスフェクションは、ＴＡＴ‐Ｉ２４によるルシフェラーゼ発現をより強力に抑制した。また、Ｉ２４二量体は、Ｉ２４ペプチドと比較してより強力であるが、ＴＡＴ‐Ｉ２４ほど強力ではない。ＴＡＴタグ単体（ＴＡＴ）を表すペプチドは、ルシフェラーゼの抑制において不活性であった（図６）。

【0119】

例８：アミノ末端基ＴＡＴタグに融合された細胞浸透性のＩ２４ペプチドを用いた、ＨＥＫ２９３細胞におけるバキュロウイルス仲介遺伝子発現の抑制。
ＣＭＶプロモータの制御下におけるルシフェラーゼコード領域をバキュロウイルスのウイルスゲノムに組み込んで、バキュロウイルスを産生した。ＤＭＳＯ又は濃度を上昇させたＩ２４ペプチド、ＴＡＴ、およびＴＡＴ‐Ｉ２４融合ペプチドで１０分間前処理を施したＨＥＫ２９３細胞に、当該バキュロウイルスを加えた。細胞浸透性ＴＡＴ‐Ｉ２４融合ペプチドで処理された細胞において、ルシフェラーゼ発現は用量依存的に低減される（図７ａ）。ＤＭＳＯ、ＴＡＴ‐Ｉ２４、又はＴＡＴで培養されたバキュロウイルス感染細胞をＴＮＦ‐αで刺激し、全ＲＮＡを細胞から分離した。ＲＮＡをＤＮＡｓｅＩで処理した後、逆転写を実施した。ルシフェラーゼおよびＩＬ‐８ｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで分析した。ルシフェラーゼｍＲＮＡがＴＡＴ‐Ｉ２４によって下方制御される一方、ＩＬ‐８のｍＲＮＡレベルは処理による影響を受けなかった（図７ｂ）。

【0120】

例９：細胞浸透性Ｉ２４ペプチドは、アデノウイルスによる遺伝子発現およびＨＥＫ２９３細胞におけるウイルス複製を抑制する。
ＨＥＫ２９３細胞を、濃度を上昇させたＩ２４ペプチド、ＴＡＴ‐Ｉ２４、又はＴＡＴ単体で処理し、アデノウイルスをコードするルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で、ＣＭＶプロモータの制御下に培養した。ルシフェラーゼタンパク質レベルは、ＴＡＴ‐Ｉ２４で下方制御され、ＩＣ５０が６μＭであった（図８ａ）。ＨＥＫ２９３細胞を、溶媒対照、Ｉ２４ペプチド、ＴＡＴ‐Ｉ２４、又はＴＡＴ単体（２０μＭ）、並びに、ルシフェラーゼおよびＧＦＰをコードするアデノウイルス粒子で処理した。７２時間後に、ＲＮＡを分離して、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、およびアデノウイルスのヘキソン転写レベルをリアルタイムＰＣＲによって分析し、ＧＡＰＤＨを標準化した。ＴＡＴ‐Ｉ２４は、アデノウイルスでコードされた３つの遺伝子全てを抑制した（図８ｂ）。上清からＤＮＡを分離し、リアルタイムＰＣＲを用いてアデノウイルスヘキソンＤＮＡを定量化した（図８ｃ）。ＴＡＴ‐Ｉ２４は、感染から９６時間後に固定およびクリスタルバイオレット染色によってウイルス感染が確定されたＨＥＫ２９３細胞の細胞分離を抑制させる（図８ｄ）。

【0121】

例１０：細胞浸透性ペプチドＴＡＴ‐Ｉ２４は、ＨＥＫ２９３細胞内におけるワクシニアウイルスの遺伝子発現および複製を抑制する。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ワクシニアウイルスに感染させる４時間前に、ＤＭＳＯ、ＴＡＴ‐Ｉ２４、又はＴＡＴで処理した。感染から２４時間後に、全ＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡ合成前にＤＮＡｓｅＩで処理した。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ２２の転写産物である、ワクシニアウイルスでコードされた遺伝子の発現は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用したリアルタイムＰＣＲによって分析され、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルを標準化した。ＴＡＴ‐Ｉ２４がｒｐｏ２２ｍＲＮＡレベルを用量依存的に抑制した一方で、ＴＡＴ単体による抑制は見られなかった（ａ）。感染から２４時間後に、上清からウイルスＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲにかけた。上清は、ＢＳＣ‐４０細胞を使ったプラークアッセイにかけた。ＴＡＴ‐Ｉ２４は、濃度２０μＭでウイルスＤＮＡの量を低減し（ｂ）、上清中のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数を９０％を超えて低減させた（ｃ）。

【0122】

例１１：細胞浸透性Ｉ２４ペプチドは、ＨＥＫ２９３細胞におけるレンチウイルスの遺伝子発現を抑制する。
ＣＭＶプロモータの制御下にルシフェラーゼを含有するレンチウイルスを添加したＨＥＫ２９３細胞を、Ｉ２４ペプチド、ＴＡＴタグＩ２４ペプチド（ＴＡＴ‐Ｉ２４）、又はＴＡＴと共に４８時間培養した。ルシフェラーゼは、２０μＭのＴＡＴ‐Ｉ２４の存在下において７５％下方制御された（図９）。

【0123】

例１２：Ｉ２４ペプチドのバリアントによるレポーター遺伝子発現の抑制
合計２９個のペプチドを合成した。合成したペプチドを、ルシフェラーゼをコードするプラスミドと共にトランスフェクション反応に用いて、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。全てのペプチドを最終濃度である２μＭで試験し、トランスフェクションの２４時間後にルシフェラーゼレベルの分析を行った。表１に、ＤＭＳＯ対照群と比較した、レポーター遺伝子発現の抑制を示す。

【0124】

【表2】

【0125】

例１３：抗生物質耐性遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡとＩ２４ペプチドとを同時に形質転換された細菌におけるコロニー形成の抑制
大腸菌コンピテント細胞に、アンピシリン耐性遺伝子又はカラマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドと、溶媒対照群としてのＤＭＳＯ又はＩ２４のいずれか一方とを形質転換した。その翌日、Ｉ２４ペプチドの存在下では、溶媒対照群と比較してコロニー数が減少した（図１１）。

【0126】

例１４：プラスミドとＩ２４ペプチドとを形質転換された大腸菌細胞におけるプラスミドの複製およびベータラクタマーゼｍＲＮＡの発現の抑制
大腸菌コンピテント細胞に、アンピシリン耐性遺伝子を含有するプラスミドとＩ２４ペプチドとを形質転換した。指定時間後に、総プラスミド数およびβ‐ラクタマーゼｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲで計測し、大腸菌の単一コピー遺伝子を標準化した。プラスミドのコピー数およびβ‐ラクタマーゼｍＲＮＡレベルは、いずれもＩ２４ペプチドの存在下で下方制御された（図１２）。

【0127】

例１５：比較データ
Ｄｅｎｇらによる出版物（２００４）には、ヒトパピローマウイルス１１型Ｅ２タンパク質のＤＮＡ結合、転写活性化因子、およびＤＮＡの複製を抑制できるペプチドが記載されている。このペプチドは、Ｅ２タンパク質に対するファージスクリーニングによって同定された。第１群のスクリーニングの結果、バイオパニングで得られた配列ＳＶＦＹＡＣＦＡＣＦ、とりわけＦＹＡＣＦのモチーフが、Ｉ２４ペプチドとの類似性を有する。Ｄｅｎｇらによる出版物に記載の別のペプチドは、配列ＷＳＥＱＣＦＴＣＷＷ（表１の配列２８）を有する。いずれの配列も、複数ラウンドのバイオパニング中に一度しか得られず、これらのペプチドに関する生物活性についてのデータは、出版物中に何ら記載されていない。配列ＳＶＦＹＡＣＦＡＣＦに基づいて、Ｉ２４バリアントにおいて特定のアミノ酸残基が変更又は含有された（表１のＩ２４＿Ｍ８）。別の変異としては、Ｆ８とＣ９との間へのＷ又はＡの挿入、或いはＦ８のＬへの変更がなされたが、Ｉ２４ペプチドの活性を阻害することはなかった。ＳでＣ１を置換したことが力価に多少の悪影響を及ぼした一方で、Ｉ２４の位置Ａ３をＶに変更したことは、力価に悪影響を及ぼさなかった。細胞トランスフェクションアッセイにおいて、Ｉ２４がレポーター遺伝子発現を約９０％抑制する濃度である２μＭでテストした場合、ＳＶＦＹＡＣＦＡＣペプチドおよびＷＳＥＱＣＦＴＣＷＷペプチドは抑制効果を発揮しなかった。しかしながら、Ｄｅｎｇらは、これら２つのペプチドに関して何のデータも提示しておらず、パピローマウイルス１１Ｅ２の転写促進および複製機能に対して抑制効果を示す第１群の３つ目の配列（ＥＤＧＧＳＦＭＣＬＷＣＧＥＶＨＧ；配列番号５７）に注目している。これらのペプチドとＩ２４ペプチドとの間に共通の作用機序が存在する可能性はあるが、Ｉ２４によって得られた結果の新規性を強力に支持する、「外来」ＤＮＡからの遺伝子発現の抑制に関する効果を支持するデータがない。Ｄｅｎｇら（２００４）は、細胞内に核内局在化シグナルを有して発現するＥＤＧＧＳＦＭＣＬＷＣＧＥＶＨＧペプチド（配列番号５７）による、Ｅ２依存性レポーター遺伝子の発現の抑制を示しているが、これらの効果をＥ２タンパク質との相互作用に結び付けて記載している。生細胞における他の効果も、細胞透過性ペプチドの使用も、この調査（Ｄｅｎｇら２００４）には明示されていない。対照的に、Ｉ２４ペプチド又はＴＡＴ‐Ｉ２４ペプチドは、核内局在化シグナルなしでは「外来」ＤＮＡ分子に対してのみ活性を有するが、細胞タンパク質の発現に対して活性を有さず、これらの効果を、Ｄｅｎｇら（２００４）による出版物又は本技術分野において周知の他のどの出版物にも示されていない、細胞への直接適用で発揮する。

【0128】

比較データには、国際公開第２０１１／０８６１１６号に記載の別の配列（ＰＳＡＬＡＦＹ（国際公開第２０１１／０８６１１６号における配列番号５８））も含まれた。Ｉ２４と同様にＬＡＦＹＣのモチーフを有する、ＣＰＳＡＬＡＦＹＣ（配列番号５３）の配列を有するペプチドＭ２３は、Ｉ２４がレポーター遺伝子発現を９０％抑制する２０μＭまでの濃度で実施された細胞トランスフェクションアッセイにおいて、不活性であった。

【0129】

例１６：細胞浸透性Ｉ２４ペプチドは、単純ヘルペスウイルスの複製を抑制する。
細胞を単純ヘルペスウイルスに感染させ、ウイルスの複製をプラーク形成アッセイで測定した（上記例を参照）。単純ヘルペスウイルスの複製は、ＴＡＴ‐Ｉ２４によって用量依存的に抑制された。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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