特許 7277926 安全を確保しながら転移性がんまで効果的に治療可能な、搭載する免疫誘導遺伝子の最適発現レベルを与える発現制御システムを有する腫瘍溶解性ウイルス（腫瘍溶解性免疫治療）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-11

(45)【発行日】2023-05-19

(54)【発明の名称】安全を確保しながら転移性がんまで効果的に治療可能な、搭載する免疫誘導遺伝子の最適発現レベルを与える発現制御システムを有する腫瘍溶解性ウイルス（腫瘍溶解性免疫治療）

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20230512BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20230512BHJP

   A61K 35/768 20150101ALI20230512BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230512BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 15/27 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230512BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20230512BHJP

   A61K 38/19 20060101ALN20230512BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

A61K35/761

A61K35/768

A61P35/00

A61P37/04

C12N15/19

C12N15/27

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

A61K38/19

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2019552379

(86)(22)【出願日】2018-11-08

(86)【国際出願番号】 JP2018041541

(87)【国際公開番号】W WO2019093435

(87)【国際公開日】2019-05-16

【審査請求日】2021-10-20

(31)【優先権主張番号】P 2017215579

(32)【優先日】2017-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(31)【優先権主張番号】P 2018050722

(32)【優先日】2018-03-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504258527

【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(72)【発明者】

【氏名】小戝 健一郎

(72)【発明者】

【氏名】伊地知 暢広

【審査官】山▲崎▼ 真奈

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５２２８０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００５／０１８６１７８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１３－５３２９７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／０４３７１０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００５／０１２５３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】ZHU Mingzhu, et al.，Linked Tumor-Selective Virus Replication and Transgene Expression from E3-Containing Oncolytic Adenoviruses，J. Virol.，2005年，Vol.79, No.9，pp.5455-5465

【文献】BRISTOL J. Andrew, et al.，In Vitro and in Vivo Activities of an Oncolytic Adenoviral Vector Designed to Express GM-CSF，Mol. Ther.，2003年，Vol.7, No.6，pp.755-764

【文献】小戝健一郎，多因子増殖制御型アデノウイルスの開発と実用化の展望，実験医学，2016年，Vol.34, No.1，pp.19-25

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｅ２Ｆプロモーター（Ｅ２Ｆｐ）の下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有し、かつ、少なくとも１つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターが、サバイビンプロモーターで置換されていることを特徴とする、腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項2】

前記免疫誘導遺伝子が、サイトカイン遺伝子である、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項3】

前記サイトカイン遺伝子が、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＡＮＧＰＴＬ５、ＢＡＦＦ、ＢＤ－２（β－Ｄｅｆｅｎｓｉｎ－２）、ＢＤ－３（β－Ｄｅｆｅｎｓｉｎ－３）、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１０、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－１β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ＭＣＰ－２）、ＣＣＬ９（ＭＩＰ－１γ）、ＣＣＬ１１（Ｅｏｔａｘｉｎ－１）、ＣＣＬ１２（ＭＣＰ－５）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－１δ）、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（Ｅｘｏｄｕｓ－２）、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４（Ｅｏｔａｘｉｎ－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（ＭＩＰ－４α）、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＤ４０－Ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＰ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）－Ｌｉｇａｎｄ、ＣＮＴＦ、ＣＴ－１、ＣＸ３ＣＬ１（Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ２（ＭＩＰ－２α、ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＭＩＰ－２β、ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ４（ＰＦ４）、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ－１α）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＤＫＫ－１、ＤＬＬ１、ＥＧＦｓ、ＥＧ－ＶＥＧＦ（Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ １）、ＦａｓＬ、ＦＧＦ－１（ａｃｉｄｉｃ ＦＧＦ）、ＦＧＦ－２（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４（ＨＧＢＦ－４）、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７（ＫＧＦ、ＨＢＧＦ－７）、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９ （ＨＢＧＦ－９）、ＦＧＦ－１０ （ＫＧＦ－２）、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２、ＦＧＦ－２３、Ｆｌｔ３－Ｌｉｇａｎｄ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＦ－１１、ＧＤＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＦＮ－α２ａ、ＩＦＮ－α２ｂ、ＩＦＮ－β１ａ、ＩＦＮ－β１ｂ、ＩＦＮ－γ１ｂ、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＬＩＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＮＧＦ－β、Ｎｏｇｇｉｎ、ＮＴ－３（ＮＴＦ－３）、ＮＴ－４（ＮＴＦ－４）、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、ＯＰＧ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ（Ｍａｍｍｏｔｒｏｐｉｎ）、ＲＡＮＫＬ、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－１、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－２、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－３、ＳＣＦ（ｃ－ｋｉｔ Ｌｉｇａｎｄ）、ＳＨＨ（Ｃ２４ＩＩ）、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＴＰＯ（ＭＤＧＦ）、ＴＲＡＩＬ、ＴＳＬＰ、ＶＥＧＦ、ＸＣＬ１、及びＸＣＬ２からなる群から選択される１つのサイトカインの遺伝子である、請求項２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項4】

前記サイトカイン遺伝子がＧＭ－ＣＳＦである、請求項３に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項5】

アデノウイルスである、請求項１～４のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項6】

少なくとも１つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＡΔ２４、Ｅ１Ｂ、およびＥ１ＢΔ５５Ｋから選択される因子である、請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項7】

少なくとも１つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、Ｅ１Ａである、
請求項５に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項8】

更に、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に連結した、外来性プロモーターを含む発現カセットを包含する請求項１～７のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含有するがん治療剤。

【請求項10】

非標的細胞への傷害が少ない、請求項９に記載のがん治療剤。

【請求項11】

サイトカインを発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞へ投与することを含むがん治療方法において用いられ、脾臓又は血清における前記サイトカインの量が、ＣＡプロモーター又はＲＳＶプロモーターの下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスを投与した場合と比較して少ないことを特徴とする、請求項１～８いずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、又は前記腫瘍溶解性ウイルスを含有するがん治療剤。

【請求項12】

サイトカインを発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞へ投与することを含むがん治療方法において用いられ、脾臓における前記サイトカインの消失が、ＣＡプロモーター又はＲＳＶプロモーターの下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスを投与した場合と比較して早いことを特徴とする、請求項１～８のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス、又は前記腫瘍溶解性ウイルスを含有するがん治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫誘導遺伝子を搭載した腫瘍溶解性ウイルスを利用したがん治療、いわゆる腫瘍溶解性免疫治療の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

「がん細胞で特異的にウイルスが増殖し殺傷効果を示す遺伝子組換えウイルス」である腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ）に免疫誘導遺伝子を搭載した腫瘍溶解性免疫治療法（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）は、２０１５年末に欧米でサイトカイン遺伝子を搭載した（Ａｍｇｅｎ社のＴ－Ｖｅｃ）がＦｉｒｓｔ－ｉｎ－ｃｌａｓｓ（画期的医薬品）として医薬承認されたように、世界的には革新的がん治療薬の最有力候補として期待されている（非特許文献１～非特許文献３）。

【0003】

本発明者らは、遺伝子治療の黎明期である１９９０年代に、非増殖型ウイルスベクターによる免疫遺伝子の導入による、免疫遺伝子治療法を世界に先駆け開発している（非特許文献４～６）。その後、免疫遺伝子治療に関する多くの論文を発表しているように長年に渡り独自の研究開発を行ってきた。

【0004】

また一方、本発明者らは、これまで腫瘍溶解性ウイルスの一つである制限増殖型アデノウイルス（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）に関して、ウイルスの増殖制御部、治療遺伝子、ウイルス特性の３つの要素を改変した、多因子で高度にがん細胞特異的にウイルス増殖制御して安全性を確保し、また治療効果を増強できる治療遺伝子も導入できる、次世代の制限増殖型アデノウイルスとなる、「多因子増殖制御型アデノウイルスｍ－ＣＲＡ（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）の効率的作製法を開発した（非特許文献７、特許文献１）。アデノウイルスはゲノムサイズが３０－４０ｋｂの中型のウイルスではあるとはいえ遺伝子組み換えは容易ではなく、非増殖型アデノウイルスとは異なり、制限増殖型アデノウイルスの効率的な標準化作製技術さえも存在しなかった。よって、複数箇所を高度に遺伝子組換えしたｍ－ＣＲＡの開発や、さらに複数の候補ｍ－ＣＲＡを作製してスクリーニング的に比較実験する研究も難しかった。よって本発明者らはまずｍ－ＣＲＡ技術を開発することにより、この技術により初めて多くの候補ｍ－ＣＲＡを作製して探索的に検証し、競合技術となる腫瘍溶解性ウイルスを遥かに凌ぐ医薬性能を持つｍ－ＣＲＡ医薬を開発してきた。まずｍ－ＣＲＡの基本骨格となる、ウイルス増殖制御部の腫瘍特異的プロモーターでとしては、本発明でも使用しているサバイビン遺伝子のプロモーターでウイルス増殖制御するサバイビン反応性ｍ－ＣＲＡ（Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ）、あるいはオーロラキナーゼ遺伝子のプロモーターでウイルス増殖制御するオーロラキナーゼ反応性ｍ－ＣＲＡ（特許文献２）を開発した。Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡは、これまで最良の競合技術（Ｔｅｒｔプロモーターでウイルス増殖されるＣＲＡ；基本骨格が同種のものは臨床試験で良好な結果が出されているためこれまで最良の競合技術の一つ；非特許文献８）よりも安全性と治療効果の両面ですぐれる（非特許文献９）という競合技術への優位性、既存の治療技術（抗がん剤、放射線治療）が無効のがん幹細胞も有効に治療できる（非特許文献１０）という従来技術への優位性を示した。「治療遺伝子を搭載していない」Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡをＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ－１と命名し、これは非臨床試験でも安全性は確認され、現在、発明者らによりヒトがん患者さんで医師主導治験を実施しており、ヒトでも良好な結果が確認されつつある。Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ－１はがん細胞内でのみ特異的に、高効率にウイルス増殖することで、増幅したウイルスタンパク質によりがん細胞を特異的（安全）かつ効果的に治療する、腫瘍溶解性ウイルス治療薬である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】日本国特許第４４７８７７５号

【文献】日本国特許第５９６３３６３号

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｂｉｌｓｌａｎｄ， ＡＥら（２０１６）Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ．；５：２１０５．

【文献】Ｌｉｕ ＢＬら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．；１０（４）：２９２－３０３．

【文献】Ｃｈｅｎ ＤＳら（２０１３）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．；３９（１）：１－１０．

【文献】Ｃｈｅｎ ＳＨら（１９９５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．；９２（７）：２５７７－２５８１．

【文献】Ｃｈｅｎ ＳＨら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；５６（１６）：３７５８－３７６２．

【文献】Ｃａｒｕｓｏ Ｍら（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．；９３（２１）：１１３０２－１１３０６．

【文献】Ｎａｇａｎｏ Ｓ，ら（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ．１２（１８）：１３８５－１３９３

【文献】Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１０ １８：４２９－３４

【文献】Ｋａｍｉｚｏｎｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．： Ｓｕｒｖｉｖｉｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｃａｎｃｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６５（１２）： ５２８４－５２９１， ２００５

【文献】Ｔａｎｏｕｅ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ．１２：２７．ｄｏｉ： １０．１１８６ ／ １４７９－５８７６－１２－２７， ２０１４

【発明の概要】

【0007】

これまで、腫瘍溶解性免疫治療の分野においては、有効な治療効果を発揮する免疫誘導遺伝子の探索に焦点がある一方で、「『腫瘍においてのみ増殖する』という腫瘍溶解性ウイルスの特性から、特段の安全性の確保が必要なのではないか？」とは考えられていなかった。しかし、本発明者らは、腫瘍溶解性ウイルスはがん細胞内で「増殖」するため、腫瘍溶解性ウイルスに搭載される免疫誘導遺伝子もそれに相関して増幅され、その結果、従来の非増殖型ベクターでの（多くは一細胞に一遺伝子、あるいは例え一細胞あたり複数個の導入遺伝子でもその数自体は導入時から変化しない）遺伝子治療とは異なり、産生される免疫誘導因子が過剰となることによる安全性の問題に初めて着目した。すなわち、本発明者らは、腫瘍溶解性免疫治療剤の使用においては、増殖した腫瘍溶解性ウイルスに搭載された免疫誘導遺伝子から免疫誘導因子が過剰に産生されることにより安全性の点で憂慮されること、及びその解決策として腫瘍溶解性ウイルスに搭載する免疫誘導遺伝子には、このシステム特有の最適な遺伝子発現レベルが存在すること、より具体的には、腫瘍溶解性ウイルスに搭載する免疫誘導遺伝子には、最適の発現レベルを誘導・制御するプロモーターを選択する必要があることを見出した。

【0008】

本発明の動機となる問題点の発見は、本発明者の独自の専門的な知見と長年の経験より得られたものであり、本研究者の未公開のノウハウとして蓄えられてきたものである。すなわち、本発明は、長年蓄えてきた免疫遺伝子治療に関する独自の未公開の知見を元に、独自開発したＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ－１に、さらに独自開発のｍ－ＣＲＡ作製技術で免疫関連遺伝子を搭載した候補Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ－２を複数作製して解析することで、本医薬（前述の問題点を克服した最適の腫瘍溶解性免疫治療剤）とその技術の発明に至ったものである。

【0009】

よって、本発明は、「腫瘍溶解性免疫治療剤（免疫誘導遺伝子を搭載した腫瘍溶解性ウイルス）において、副作用をなくし安全性を確保しながら、転移性がんにまで強力な治療効果を誘導するための、搭載する免疫誘導遺伝子の最適発現レベルを与える発現制御システムを見出す」というこれまでにない新規のコンセプトに基づき、高い安全性が確保されながら最適な治療効果を有する腫瘍溶解性免疫治療のウイルスを開発することを目的とする。

【0010】

本発明者らは、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡへの免疫誘導遺伝子の組み込みを想定し、様々な強度のプロモーターと種々のサイトカイン遺伝子との組み合わせを網羅的に比較検討した。その結果、細胞周期特異的あるいは腫瘍特異的なＥ２Ｆのプロモーター（Ｅ２Ｆｐ）により発現制御する免疫誘導遺伝子を搭載した、新規Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ（以下、「本遺伝子組換えウイルス」ということがある）が、高い安全性を持って最適の治療効果を有する腫瘍溶解性免疫治療剤となることを見出した。つまりこれまでにもＵｂｉｑｕｉｔｏｕｓに強い転写活性を有すると示唆されていた、いわゆる恒常強活性プロモーターは複数報告されているが、そのそれぞれのプロモーターの詳細な特性の違い、特に発現レベルの詳細な違いまでは明確ではなく、特に腫瘍溶解性ウイルスに搭載する免疫誘導遺伝子の発現制御に用いる場合の種々の恒常強活性プロモーターの詳細な特性の解析はなされていなかった。今回の我々の検討により初めて、「その中の一つのＣＡプロモーター（サイトメガロウイウルス前初期遺伝子エンハンサーを付加した修正ニワトリベータアクチンプロモーター； ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ）は極めて強いプロモーター活性を持ち、また、恒常強活性プロモーターの中の一つのＲＳＶプロモーター（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）は、ＣＡプロモーターと比較するとその活性はかなり低いものの強度な活性を持つ。特に腫瘍溶解性ウイルスに搭載された遺伝子のがん細胞内でのコピー数は、ウイルス増殖に伴い著しく増幅される状況となる。腫瘍溶解性免疫治療のウイルスに搭載して、免疫誘導遺伝子を発現制御する目的の場合、「最適（中等度）」の転写活性プロモーターと位置付けることが適切」ということを見出した。つまり腫瘍溶解性ウイルスで免疫誘導遺伝子の発現を目的とする場合、極めて強力なプロモーター（ＣＡプロモーターなど）及び強力なプロモーター（ＲＳＶプロモーター）での発現制御と比較して、Ｅ２Ｆプロモーターを使用すると、劇的に安全性を向上させることが可能である。がん抑制遺伝子産物ｐＲＢを主な標的遺伝子とする転写因子Ｅ２Ｆのプロモーター（Ｅ２Ｆｐ）は、細胞周期特異的あるいはがん特異的な発現制御を行う。これにより、がん細胞以外の正常細胞ではＳ期において一過性に、それも低レベルでしか発現せず、しかし一方でがん細胞では特異的に「最適（中等度）」の免疫誘導遺伝子の発現制御ががん細胞特異的に行われ、強力な治療効果を示しながら、劇的に安全性を向上させることが可能である。さらに驚くべきことには、免疫誘導遺伝子をＥ２Ｆプロモーターで発現制御する腫瘍溶解性ウイルス（腫瘍溶解性免疫治療剤）においては、劇的な安全性の向上だけでなく、免疫誘導遺伝子の治療効果をも増強して最大化できることを見出した。

【0011】

特に、本発明者らは、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦが、ハムスター由来がん細胞に効率的に感染、増殖し、細胞内で高レベルのＧＭ－ＣＳＦ発現を誘導すること、及び、ハムスター同種移植担がんモデルにおいて致死性の副作用を引き起こすことなく、ウイルスを注入した原発巣のがんだけでなく、転移巣に対してまで強力な腫瘍抑制効果を示すことを見出した。この治療効果は、腫瘍溶解性ウイルスによる直接的な細胞死誘導に加え、がん細胞に特異的（安全）かつ強力な殺傷をもたらすことで種々のがん抗原を局所で創出することになるため、同時にその腫瘍局所で高濃度の免疫誘導因子を持続分泌させることで、細胞性免疫を中心とするがん特異的な全身性の抗腫瘍免疫を非常に効率よく誘導でき、それにより原発巣だけでなく転移巣のがんも全身性の抗腫瘍免疫誘導により殺傷できるものと推察される。これに符合して、本発明の実施例としてこれらのｉｎ ｖｉｖｏ治療効果は、現在医師主導治験実施中のサイトカインを搭載していないＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ－１（ヒトでも標準治療が無効だった患者に治療効果が現在実証されつつある）に比べても、投与した腫瘍部に対しての腫瘍消失効果が有意に増加したみならず、局所治療による全身性の抗腫瘍免疫誘導による遠隔転移の劇的な阻止が達成できた（従来の治療技術では局所治療で全身の転移がんを治療することはできないため本治療剤は大きな差別化・優位性を持つ）ため、劇的な安全性の向上と革新的に強力ながん治療効果の点から、早期の臨床実用化が大きく期待できるものである。

【0012】

すなわち、本発明は、免疫誘導遺伝子と機能的に連結したＥ２Ｆプロモーター（Ｅ２Ｆｐ）を有する遺伝子組換えウイルスに関する。より好ましくは、本発明は、多因子制御の腫瘍特異的増殖型（腫瘍溶解性）ウイルスに関する。具体的には、本発明は以下の発明に関するものである：
（１） Ｅ２Ｆプロモーター（Ｅ２Ｆｐ）、又はこれと同等の活性を示すプロモーターの下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルス。
（２） 前記Ｅ２Ｆプロモーター（Ｅ２Ｆｐ）と同等の活性を示すプロモーターが、サバイビンプロモーター、ＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子プロモーター、又はＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子プロモーターである、（１）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（３） 前記プロモーターが、Ｅ２Ｆプロモーター（Ｅ２Ｆｐ）、又はサバイビンプロモーターである、（１）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（４） 前記プロモーターが、Ｅ２Ｆプロモーター（Ｅ２Ｆｐ）である、（１）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（５） 前記免疫誘導遺伝子が、サイトカイン遺伝子である、（１）～（４）のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（６） 前記サイトカイン遺伝子が、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＡＮＧＰＴＬ５、ＢＡＦＦ、ＢＤ－２（β－Ｄｅｆｅｎｓｉｎ－２）、ＢＤ－３（β－Ｄｅｆｅｎｓｉｎ－３）、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１０、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－１β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ＭＣＰ－２）、ＣＣＬ９（ＭＩＰ－１γ）、ＣＣＬ１１（Ｅｏｔａｘｉｎ－１）、ＣＣＬ１２（ＭＣＰ－５）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－１δ）、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（Ｅｘｏｄｕｓ－２）、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４（Ｅｏｔａｘｉｎ－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（ＭＩＰ－４α）、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＯ４０－Ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＰ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）－Ｌｉｇａｎｄ、ＣＮＴＦ、ＣＴ－１、ＣＸ３ＣＬ１（Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ２（ＭＩＰ－２α、ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＭＩＰ－２β、ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ４（ＰＦ４）、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ－１α）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＤＫＫ－１、ＤＬＬ１、ＥＧＦｓ、ＥＧ－ＶＥＧＦ（Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ １）、ＦａｓＬ、ＦＧＦ－１（ａｃｉｄｉｃ ＦＧＦ）、ＦＧＦ－２（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４（ＨＧＢＦ－４）、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７（ＫＧＦ、ＨＢＧＦ－７）、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９ （ＨＢＧＦ－９）、ＦＧＦ－１０ （ＫＧＦ－２）、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２、ＦＧＦ－２３、Ｆｌｔ３－Ｌｉｇａｎｄ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＦ－１１、ＧＤＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＦＮ－α２ａ、ＩＦＮ－α２ｂ、ＩＦＮ－β１ａ、ＩＦＮ－β１ｂ、ＩＦＮ－γ１ｂ、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＬＩＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＮＧＦ－β、Ｎｏｇｇｉｎ、ＮＴ－３（ＮＴＦ－３）、ＮＴ－４（ＮＴＦ－４）、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、ＯＰＧ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ（Ｍａｍｍｏｔｒｏｐｉｎ）、ＲＡＮＫＬ、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－１、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－２、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－３、ＳＣＦ（ｃ－ｋｉｔ Ｌｉｇａｎｄ）、ＳＨＨ（Ｃ２４ＩＩ）、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＴＰＯ（ＭＤＧＦ）、ＴＲＡＩＬ、ＴＳＬＰ、ＶＥＧＦ、ＸＣＬ１、及びＸＣＬ２からなる群から選択される１つのサイトカインの遺伝子である、（５）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（７） 前記サイトカイン遺伝子がＧＭ－ＣＳＦである、（６）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（８） 更に、少なくとも１つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターが、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、又はがん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターで置換されていることを特徴とする、（１）～（７）のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（９） 前記臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、アルブミンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）プロモーター、ミトコンドリア型クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢ）プロモーター、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、及び神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターから選択されるプロモーターである、（８）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（１０） 前記がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーター、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、低酸素応答性領域（ＨＲＥ）プロモーター、Ｇｒｐ７８プロモーター、Ｌ－プラスチンプロモーター、ヘキソキナーゼＩＩプロモーター、サバイビンプロモーター、及びＡｕｒｏｒａキナーゼプロモーターから選択されるプロモーターである、（８）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（１１） 前記がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、サバイビンプロモーター、ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子のプロモーター、又は、ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子のプロモーターである、（１０）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（１２） 前記がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターが、サバイビンプロモーターである、（１０）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（１３） アデノウイルスである、（１）～（１２）のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（１４） 少なくとも１つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＡΔ２４、Ｅ１Ｂ、およびＥ１ＢΔ５５Ｋから選択される因子である、（１３）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（１５） 少なくとも１つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子が、Ｅ１Ａである、（１３）に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（１６） 更に、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に連結した、外来性プロモーターを含む発現カセットを包含する（１）～（１５）のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
（１７） （１）～（１６）のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含有するがん治療剤。

【発明の効果】

【0013】

本発明のウイルスは、適切な強度のプロモーター活性を有するプロモーターを採用して免疫誘導遺伝子の発現を制御することにより、副作用を起こすことなく、高い抗がん効果を達成することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】アデノウイルスの増殖に必須の初期遺伝子であるＥ１Ａの上流にＳｕｒｖｉｖｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒを組み込んだＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ内に、Ｅ２Ｆプロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びＣＡプロモーターの各プロモーターとｍｏｕｓｅ ＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡを連結した発現カセットを挿入したＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの模式図である。

【図2A】ハムスター由来のがん細胞（ＨａＫ）に対し、コントロールのＡｄ．ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（Ｅ１領域を欠損させて代わりにＣＭＶプロモーターでＥＧＦＰを発現する遺伝子構築を組込んだ「非」増殖型アデノウイルス）をＭＯＩ０．１～１０００にて感染させ、４８時間後のＥＧＦＰの発現を示す写真である。

【図2B】ハムスター由来のがん細胞（ＨａＰ－Ｔ１）に対し、コントロールのＡｄ．ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（Ｅ１領域を欠損させて代わりにＣＭＶプロモーターでＥＧＦＰを発現する遺伝子構築を組込んだ「非」増殖型アデノウイルス）をＭＯＩ０．１～１０００にて感染させ、４８時間後のＥＧＦＰの発現を示す写真である。

【図2C】ハムスター由来の正常細胞（ＢＨＫ－２１）に対し、コントロールのＡｄ．ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（Ｅ１領域を欠損させて代わりにＣＭＶプロモーターでＥＧＦＰを発現する遺伝子構築を組込んだ「非」増殖型アデノウイルス）をＭＯＩ０．１～１０００にて感染させ、４８時間後のＥＧＦＰの発現を示す写真である。

【図3】図２の各ＭＯＩに対するＥＧＦＰの発現を示すグラフである。縦軸はアデノウイルス感染効率（ＡＧＴＥ）を示し、横軸はウイルス感染時のＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を示す。

【図4】ハムスター由来のがん細胞（ＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１）及び正常細胞（ＢＨＫ－２１）に対し、各プロモーター活性を調べるため、いずれも遺伝子導入だけ可能な「非」増殖型アデノウイルスベクターのＡｄ．ｄＥ１．３ （コントロールとして発現する外来ＬａｃＺ遺伝子を持たない）、Ａｄ．Ｅ２Ｆｐ－ＬａｃＺ（Ｅ２ＦプロモーターでＬａｃＺを発現）、Ａｄ．ＲＳＶｐ－ＬａｃＺ（ＲＳＶプロモーターでＬａｃＺを発現）、及びＡｄ．Ｓｕｒｖｐ－ＬａｃＺ（ＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーターでＬａｃＺ遺伝子を発現）を感染・遺伝子導入して４８時間後の、β－ガラクトシダーゼ活性を示すグラフである。縦軸はコントロールウイルスＡｄ．ｄＥ１．３感染時に対する相対的β－ガラクトシダーゼ活性を示し、横軸は各ハムスター由来細胞を示す。

【図5】ハムスター由来のがん細胞（ＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１）及び正常細胞（ＢＨＫ－２１）に対し、Ａｄ．ｄＥ１．３ （Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、およびＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦを感染させた４８時間後のＧＭ－ＣＳＦタンパク質の発現量を示すグラフである。図中では名称が長いため簡便に、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、およびＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、それぞれ発現遺伝子の名称、すなわちＥ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦと表記している。

【図6A】ハムスター由来のがん細胞（ＨａＫ）に対し、コントロールとして「非」増殖型アデノウイルスベクターのＡｄ．ｄＥ１．３、ならびに各腫瘍溶解性ウイルスのＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ（治療遺伝子なし）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦをＭＯＩ３（上図）又はＭＯＩ３０（下図）で感染させた３日後及び５日後の細胞傷害性を示すグラフである。

【図6B】ハムスター由来のがん細胞（ＨａＰ－Ｔ１）に対し、コントロールとして「非」増殖型アデノウイルスベクターのＡｄ．ｄＥ１．３、ならびに各腫瘍溶解性ウイルスのＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ（治療遺伝子なし）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦをＭＯＩ３（上図）又はＭＯＩ３０（下図）で感染させた３日後及び５日後の細胞傷害性を示すグラフである。

【図6C】ハムスター由来の正常細胞（ＢＨＫ－２１）に対し、コントロールとして「非」増殖型アデノウイルスベクターのＡｄ．ｄＥ１．３、ならびに各腫瘍溶解性ウイルスのＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ（治療遺伝子なし）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦをＭＯＩ３（上図）又はＭＯＩ３０（下図）で感染させた３日後及び５日後の細胞傷害性を示すグラフである。

【図7】１×１０^７個のＨａＫを背側に皮下移植したメス５週齢のＳｙｒｉａｎハムスターに、１×１０^９ＰＦＵの各ウイルスを腫瘍内に単回投与した後の、腫瘍径の経時変化を示すグラフである。

【図8】１×１０^７個のＨａＫを背側に皮下移植したメス５週齢のＳｙｒｉａｎハムスターに、１×１０^９ＰＦＵの各ウイルスを腫瘍内に単回投与した後の、生存率の経時変化を示すグラフである。

【図9】担がんハムスターモデルへのｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染後の組織内ｍＧＭ－ＣＳＦ発現量を示すグラフである。

【図10】同所移植（Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）担がんハムスターモデルにおけるｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染後の生存曲線を示すグラフである。

【図11】同所移植（Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）担がんハムスターモデルにおけるｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染後又は抗ＰＤ－１抗体投与後の生存曲線を示すグラフである。

【図12】アデノウイルスの増殖に必須の初期遺伝子であるＥ１Ａの上流にＳｕｒｖｉｖｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒを組み込んだＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ内に、Ｅ２Ｆプロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びＣＡプロモーターの各プロモーターとマウス又はヒトＩＬ－２又はＩＬ－１５ ｃＤＮＡを連結した発現カセットを挿入したＩＬ－２又はＩＬ－１５発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、及びの模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスに搭載された免疫誘導遺伝子が、Ｅ２Ｆプロモーター、又はこれと同等の活性を示すプロモーターの下流に機能的に連結されることにより、致死性の副作用を引き起こすことなく、強力な腫瘍抑制効果を示すことを特徴とする。

【0016】

「免疫誘導遺伝子」は、免疫を活性化する作用を有するタンパク質又はその機能性ペプチド断片をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、好ましくはサイトカイン遺伝子又はその機能性ペプチド断片であり、例えば、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、ＡＮＧＰＴＬ５、ＢＡＦＦ、ＢＤ－２（β－Ｄｅｆｅｎｓｉｎ－２）、ＢＤ－３（β－Ｄｅｆｅｎｓｉｎ－３）、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－１０、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－１β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ＭＣＰ－２）、ＣＣＬ９（ＭＩＰ－１γ）、ＣＣＬ１１（Ｅｏｔａｘｉｎ－１）、ＣＣＬ１２（ＭＣＰ－５）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－１δ）、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（Ｅｘｏｄｕｓ－２）、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４（Ｅｏｔａｘｉｎ－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（ＭＩＰ－４α）、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＯ４０－Ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＰ）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）－Ｌｉｇａｎｄ、ＣＮＴＦ、ＣＴ－１、ＣＸ３ＣＬ１（Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ２（ＭＩＰ－２α、ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＭＩＰ－２β、ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ４（ＰＦ４）、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ－１α）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７、ＤＫＫ－１、ＤＬＬ１、ＥＧＦｓ、ＥＧ－ＶＥＧＦ（Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ １）、ＦａｓＬ、ＦＧＦ－１（ａｃｉｄｉｃ ＦＧＦ）、ＦＧＦ－２（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４（ＨＧＢＦ－４）、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７（ＫＧＦ、ＨＢＧＦ－７）、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９ （ＨＢＧＦ－９）、ＦＧＦ－１０ （ＫＧＦ－２）、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２、ＦＧＦ－２３、Ｆｌｔ３－Ｌｉｇａｎｄ、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１、Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＤＦ－１１、ＧＤＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＦＮ－α２ａ、ＩＦＮ－α２ｂ、ＩＦＮ－β１ａ、ＩＦＮ－β１ｂ、ＩＦＮ－γ１ｂ、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３４、ＩＬ－３５、ＩＬ－３６、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＬＩＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＮＧＦ－β、Ｎｏｇｇｉｎ、ＮＴ－３（ＮＴＦ－３）、ＮＴ－４（ＮＴＦ－４）、Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ、ＯＰＧ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ（Ｍａｍｍｏｔｒｏｐｉｎ）、ＲＡＮＫＬ、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－１、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－２、Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ－３、ＳＣＦ（ｃ－ｋｉｔ Ｌｉｇａｎｄ）、ＳＨＨ（Ｃ２４ＩＩ）、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β３、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＴＰＯ（ＭＤＧＦ）、ＴＲＡＩＬ、ＴＳＬＰ、ＶＥＧＦ、ＸＣＬ１、及びＸＣＬ２などが挙げられる。

【0017】

「Ｅ２Ｆプロモーター」は、代表的ながん抑制遺伝子産物ｐＲＢの主な標的であるＥ２Ｆ遺伝子のプロモーター領域である。例えば、Ｅ２Ｆプロモーターとして、配列番号２に記載の配列が挙げられる。Ｅ２Ｆプロモーターとしては、配列番号２に記載の配列の全長を有する必要はなく、本発明の目的を達成できる限り配列番号２の一部の配列からなっていてもよい。

【0018】

Ｅ２Ｆプロモーターと同等の活性を示すプロモーターとは、腫瘍細胞内において、Ｅ２Ｆプロモーターと同等のプロモーター活性を示すプロモーターであれば、特に制限されるものではなく、例えば、サバイビンプロモーター、ＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子プロモーター、及びＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子プロモーターなどが挙げられる。

【0019】

マウスおよびヒトのサバイビン遺伝子のプロモーターは単離されており、その配列情報は開示されている（例えば、Ｌｉ，Ｆ．ａｎｄ Ａｌｔｉｅｒｉ，Ｄ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：３１４３－３１５１，１９９９；Ｌｉ，Ｆ．ａｎｄ Ａｌｔｉｅｒｉ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４４：３０５－３１１，１９９９を参照）。本ウイルスに用いられるサバイビンプロモーターとしては、ヒトサバイビン遺伝子または他の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等）におけるそのオルソログ遺伝子のプロモーター、好ましくはヒトまたはマウス由来のサバイビン遺伝子のプロモーター、より好ましくはヒトサバイビン遺伝子のプロモーターである。

【0020】

サバイビンプロモーターのヌクレオチド配列長は、標的がん細胞特異的で、かつがん細胞に対して十分な治療活性を発揮する程度に、下流に連結された遺伝子の転写を活性化し得る限り特に制限されない。例えば、マウスサバイビン遺伝子プロモーターの場合、翻訳開始点を＋１として－１７３～－１９位のヌクレオチド配列（配列番号３に示されるヌクレオチド配列中１１２４～１２７８番目のヌクレオチド配列）、ヒトサバイビン遺伝子プロモーターの場合、翻訳開始点を＋１として－１７３～－１位のヌクレオチド配列（配列番号４に示されるヌクレオチド配列中１２９６～１４６８番目のヌクレオチド配列）を含んでいれば、目的の特異性および転写活性が得られうる。従って、好ましくは、本遺伝子組換えウイルスに用いられるサバイビンプロモーターは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列中少なくとも１１２４～１２７８番目のヌクレオチド配列、または配列番号４に示されるヌクレオチド配列中少なくとも１２９６～１４６８番目のヌクレオチド配列を含む。サバイビンプロモーターのヌクレオチド配列長の上限も特に制限はないが、５’上流域の長さが大きくなりすぎると却ってプロモーターの転写活性や特異性に好ましくない影響を与える場合がある。例えば、ヒトサバイビン遺伝子プロモーターの場合、翻訳開始点を＋１として約－６０００～－１位のヌクレオチド配列であれば、目的の特異性および転写活性が得られうるが、好ましくはプロモーターの５’末端は－３０００位より下流、より好ましくは－１５００位より下流である。他の哺乳動物由来のサバイビンプロモーターを用いる場合も、種々の長さのプロモーターの下流にレポーター遺伝子を繋いだベクターを作製し、がん細胞に導入してレポーターの発現を指標にして該プロモーター活性を評価することにより、該プロモーターの好適な配列長の範囲を決定することができる。

【0021】

サバイビンプロモーターは、ヒトまたは他の哺乳動物（例、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等）由来の細胞・組織から抽出したゲノムＤＮＡより、公知のサバイビン遺伝子プロモーター配列（例えば、Ｌｉ， Ｆ．ａｎｄ Ａｌｔｉｅｒｉ，Ｄ．Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：３１４３－３１５１，１９９９；Ｌｉ，Ｆ．ａｎｄ Ａｌｔｉｅｒｉ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４４：３０５－３１１，１９９９を参照）からなる核酸をプローブとして該プロモーター領域を含むゲノムＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ分解酵素、例えば、適当な制限酵素を用いて所望の部分プロモーター配列を含むＤＮＡ断片に切断、ゲル電気泳動で分離後、所望のバンドを回収してＤＮＡを精製することにより調製することができる。あるいは、上記細胞の粗抽出液もしくはそこから単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、公知のサバイビン遺伝子プロモーター配列を基に合成したプライマーを用いたＰＣＲにより、サバイビンプロモーター部分配列を増幅、単離することもできる。サバイビンプロモーターのヌクレオチド配列が未知の哺乳動物については、該動物のサバイビンｃＤＮＡ配列をクエリーとして該動物のゲノムＤＮＡに対してＢＬＡＳＴ検索を行うことにより、該動物のサバイビンプロモーター領域のヌクレオチド配列を入手することができる。また、サバイビンプロモーターは、公知のサバイビン遺伝子プロモーター配列（例えば、配列番号３または配列番号４に示されるヌクレオチド配列）を基に、そのヌクレオチド配列の全部または一部を含む核酸を、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて化学合成することによっても得ることができる。

【0022】

ヒトのＡｕｒｏｒａキナーゼＡおよびＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子のプロモーターは既に報告されている（Ｔａｎａｋａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１２）：１０７１９－２６，２００２；Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１６：９３０－６，２００４）。Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーターとしては、Ａｕｒｏｒａキナーゼファミリーに属する遺伝子由来のプロモーターであれば特に制限はないが、例えば、ショウジョウバエＡｕｒｏｒａ－Ａ、－Ｂおよび－Ｃ遺伝子の哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等）オルソログが挙げられる。好ましくはヒトまたは他の哺乳動物由来のＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子またはＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子のプロモーターであり、より好ましくはヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子またはヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子のプロモーターである。

【0023】

Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーターのヌクレオチド配列長は、標的疾患細胞（例えば、がん細胞）特異的で、かつ目的の疾患に対して十分な治療活性を発揮する程度に、下流に連結された遺伝子の転写を活性化し得る限り特に制限されない。例えば、ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子プロモーターの場合、転写開始点を＋１として－１２４～＋３５４位のヌクレオチド配列（配列番号６に示されるヌクレオチド配列；配列番号５に示されるヌクレオチド配列中１３６３～１８４０番目のヌクレオチド配列）を含んでいれば、目的の特異性および転写活性が得られる。本明細書において、ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子プロモーターとは、全長のヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子プロモーターのみならず、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含むプロモーターをも包含する。ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子プロモーターの場合、転写開始点を＋１として－１８５～＋３６１位のヌクレオチド配列（配列番号８に示されるヌクレオチド配列；配列番号７に示されるヌクレオチド配列中１５９５～２１４０番目のヌクレオチド配列）を含んでいれば、目的の特異性および転写活性が得られる。本明細書において、ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子プロモーターとは、全長のヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子プロモーターのみならず、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含むプロモーターをも包含する。好ましくは、Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーターは、配列番号５に示されるヌクレオチド配列中少なくとも１３６３～１８４０番目のヌクレオチド配列、または、配列番号７に示されるヌクレオチド配列中少なくとも１５９５～２１４０番目のヌクレオチド配列を含む。Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーターのヌクレオチド配列長の上限も特に制限はないが、５’上流域の長さが大きくなりすぎると却ってプロモーターの転写活性や特異性に好ましくない影響を与える場合がある。例えば、ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＡ遺伝子プロモーターの場合、転写開始点を＋１として－１４８６～＋３５４位のヌクレオチド配列（配列番号５に示されるヌクレオチド配列）、ヒトＡｕｒｏｒａキナーゼＢ遺伝子プロモーターの場合、転写開始点を＋１として－１７７９～＋３６１位のヌクレオチド配列（配列番号７に示されるヌクレオチド配列）であれば、目的の特異性および転写活性が得られうる。従って、好ましい一実施態様においては、本発明のベクターに用いられるヒトＡｕｒｏｒａキナーゼプロモーターの５’末端の核酸は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列中１～１３６３番目のヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチド、または配列番号７に示されるヌクレオチド配列中１～１５９５番目のヌクレオチドのいずれか１つのヌクレオチドである。他の哺乳動物由来のＡｕｒｏｒａキナーゼプロモーターを用いる場合も、同様にして好ましい領域を選択することができる。

【0024】

Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーターは、ヒトまたは他の哺乳動物（例：サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等）由来の細胞・組織から抽出したゲノムＤＮＡより、公知のＡｕｒｏｒａキナーゼ遺伝子プロモーター配列（例えば、Ｔａｎａｋａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１２）：１０７１９－２６，２００２；Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１６：９３０－６，２００４参照）からなる核酸をプローブとして該プロモーター領域を含むゲノムＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ分解酵素、例えば、適当な制限酵素を用いて所望の部分プロモーター配列を含むＤＮＡ断片に切断、ゲル電気泳動で分離後、所望のバンドを回収してＤＮＡを精製することにより調製することができる。あるいは、上記細胞の粗抽出液もしくはそこから単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、公知のＡｕｒｏｒａキナーゼ遺伝子プロモーター配列を基に合成したプライマーを用いたＰＣＲにより、Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーター部分配列を増幅、単離することもできる。Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーターのヌクレオチド配列が未知の哺乳動物については、該動物のＡｕｒｏｒａキナーゼｃＤＮＡ配列をクエリーとして該動物のゲノムＤＮＡに対してＢＬＡＳＴ検索を行うことにより、該動物のＡｕｒｏｒａキナーゼプロモーター領域のヌクレオチド配列を入手することができる。

【0025】

免疫誘導遺伝子は、それを産生する細胞・組織から自体公知の方法によりｃＤＮＡとして単離し、Ｅ２Ｆプロモーター、又はこれと同等の活性を示すプロモーターの下流に機能的に連結することができる。このようなプロモーターの制御下にある免疫誘導遺伝子をコードする核酸を含む発現カセットは、好ましくは該核酸または遺伝子の下流に適当なポリアデニレーション配列を含む。免疫誘導遺伝子と機能的に連結したＥ２Ｆプロモーター、又はこれと同等の活性を示すプロモーターを含む遺伝子組換えウイルスは、後述の通り、ウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸が、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、又はがん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターの制御下に置かれていてもよい。また、免疫誘導遺伝子と機能的に連結したＥ２Ｆプロモーター、又はこれと同等の活性を示すプロモーターを含む遺伝子組換えウイルスは、ウイルスタンパク質に含まれる領域のうち、正常細胞におけるウイルスの増殖に必要な細胞環境を誘導するのに必須であるが、がん細胞におけるウイルスの増殖には必要でない領域が欠損した遺伝子組換えウイルスであってもよい。更に、免疫誘導遺伝子と機能的に連結したＥ２Ｆプロモーター、又はこれと同等の活性を示すプロモーターを含む遺伝子組換えウイルスは、ウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸が、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、又はがん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターと機能的に連結しており、かつ、正常細胞におけるウイルスの増殖に必要な細胞環境を誘導するのに必須であるが、がん細胞におけるウイルスの増殖には必要でない領域が欠損した遺伝子組換えウイルスであってもよい。

【0026】

本明細書において「機能的に連結された」とは、プロモーターがその活性を発揮することにより下流の遺伝子の発現を可能とするようにプロモーターが結合されていることを意味する。

【0027】

一態様において、本発明の遺伝子組換えウイルスは、少なくとも１つのウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子をコードする核酸のプロモーターが、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、又はがん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターで置換されていることを特徴とする腫瘍溶解性ウイルス（Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ）、言い換えれば、腫瘍特異的増殖型ウイルス（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ；ＣＲＶ）である。本遺伝子組換えウイルスは、当該プロモーター活性が高いがん細胞などの標的疾患細胞において特異的に（正常細胞よりも優位に）ウイルス増殖が促進され、それにより当該細胞特異的な細胞傷害活性を示すとともに、当該細胞特異的にウイルス遺伝子に組み込んだ他の遺伝子を発現する。即ち、本発明は、増殖することを特徴とするベクターに関する。さらに、本遺伝子組換えウイルスは、感染した標的細胞で特異的にウイルスの増殖を引き起こして同細胞を殺傷（溶解）するのみならず、さらに、溶解した細胞から放出された娘ウイルスが周辺のウイルス未感染の標的細胞に感染して当該細胞をも殺傷するステップを繰り返すことで、最終的には注入部位の原発巣内の多くの標的がん細胞に遺伝子組換えウイルスが導入され治療効果を得ることができる。さらに、がん細胞に特異的（安全）かつ強力な殺傷をもたらし腫瘍を縮小させ、さらに細胞死は種々のがん抗原を局所で創出することになるため、そこで同時に腫瘍局所で高濃度の免疫誘導因子を持続分泌させることで細胞性免疫を中心とするがん特異的な全身性の抗腫瘍免疫を非常に効率よく誘導できる。この誘導された抗腫瘍免疫により、原発巣の遺伝子未導入のがん細胞だけでなく、ウイルスが投与されていない遠隔転移巣のがん細胞まで、効果的に治療することができる。

【0028】

「ウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子」とは、ウイルスの構造タンパク質などの、ウイルスが自己複製を行うために必須のタンパク質のいずれかをコードする遺伝子、またはウイルスがアッセンブリを行うために必須のタンパク質のいずれかをコードする遺伝子を意味する。ウイルスの複製またはアッセンブリに必須の因子は，用いるウイルス種によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合、感染初期から転写が開始された後のウイルスタンパク質の転写制御に働く初期遺伝子（Ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）であるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４、または後述のＲｂ結合領域欠損型Ｅ１Ａ（Ｅ１ＡΔ２４）、ｐ５３結合領域欠損型Ｅ１Ｂ（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）などが挙げられる。特にＥ１Ａは、アデノウイルスの感染後最初に転写され、Ｅ１Ａの発現がなければその後のウイルス複製が起こらないことから、がんなどの標的細胞特異的にウイルス増殖制御を行なう目的に非常に適している遺伝子である。また、ウイルスの複製に必須のその他の初期遺伝子を制御することでも同様の効果を得ることができる。更に、アデノウイルスの構造遺伝子をコードする後期遺伝子（Ｌａｔｅ ｇｅｎｅ）のＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５などは、感染後の細胞分裂が起こる後期に転写されて、ウイルス構造を構成するタンパク質であるが、これらの後期遺伝子の発現制御によってもがんなどの標的細胞特異的にウイルス増殖を制御できる。増殖制御型ウイルスは、ウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする遺伝子の内因性プロモーターを臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、又はがん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターで置換することにより得ることができる。

【0029】

「臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター」（臓器特異的プロモーター）としては、例えば、肝臓などに特異的なアルブミンおよびα－フェトプロテインのプロモーター、前立腺に特異的な前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のプロモーター、筋肉や脳など様々な臓器に特異的なミトコンドリア型クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）のプロモーター、ならびに、脳などの神経系に特異的なミエリン塩基性タンパク質（ＭＢ）、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）のプロモーターなどを例示できる。

【0030】

「がん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーター」（がん細胞特異的プロモーター）としては、例えば、がん細胞でのみ特異的に発現するＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ、がん胎児性抗原）プロモーター（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０（６），２７３８－２７４８，１９９０）、Ｅ２Ｆプロモーター（Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４（１０），６６０７－６６１５，１９９４）、ＯＣ（オステオカルシン）プロモーター（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１１５８－１１６１，１９８９）、悪性黒色腫、線維肉腫などに特異的なＦＬＫ－１プロモーター（Ｘｉｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８１，１３３５－１３４３，１９９９）、肺がんなどに特異的なＶＥＧＦプロモーター（Ｋｏｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０，２９３６－２９４１，２０００）、小細胞肺がんなどに特異的なｃ－Ｍｙｃプロモーター（Ｋｕｍａｇａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３５４－３５８，１９９６）、肺がん、卵巣がんなどに特異的なＳＬＰＩプロモーター（Ｇａｒｖｅｒ，Ｒ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１，４６－５０，１９９４）、前立腺がんに特異的なＰＳＡプロモーター（Ｌａｔｈａｍ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６０，３３４－３４２，２０００）、悪性黒色腫などに特異的なＴｙｒｏｓｉｎａｓｅプロモーター（Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３，９６２－９６７，１９９３）、乳がんに特異的なＡＰ－２プロモーター（Ｐａｎｄｈａ，Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，２１８０－２１８９，１９９９）、脳腫瘍をはじめ多くのがんに特異的なテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）プロモーター（Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９，５５１－５５７，１９９９）、ならびに、様々ながんに特異的な低酸素応答性領域（ＨＲＥ）プロモーター、Ｇｒｐ７８プロモーター、Ｌ－プラスチンプロモーター、ヘキソキナーゼＩＩプロモーター、およびサバイビンプロモーターなどを例示できる。

【0031】

また、本ベクターが有する各種プロモーターは、公知のプロモーター配列を基に、そのヌクレオチド配列の全部または一部を含む核酸を、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて化学合成することによっても得ることができる。

【0032】

ウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸の少なくとも１つが、臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、又はがん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターの制御下におかれていれば、ウイルスの増殖またはアッセンブリは当該プロモーターが活性化される環境下に限定されるので、他のウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質をコードする核酸は任意の外来性プロモーターの制御下に置かれてよい。例えば、外来性プロモーターとして、哺乳類において恒常的に発現し得るプロモーターを使用する場合、サイトメガロウイル（ＣＭＶ）由来プロモーター（例：ＣＭＶ前初期プロモーター）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来プロモーター（例：ＨＩＶ ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来プロモーター（例：ＲＳＶ ＬＴＲ）、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）由来プロモーター（例：ＭＭＴＶ ＬＴＲ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来プロモーター（例：ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来プロモーター（例：ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター）、ＳＶ４０由来プロモーター（例：ＳＶ４０初期プロモーター）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来プロモーター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来プロモーター（例：ＡＡＶ ｐ５プロモーター）、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来プロモーター（Ａｄ２またはＡｄ５腫瘍後期プロモーター）など、ならびにβ－アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質の遺伝子プロモーターなどの構成的プロモーターを用いることができる。

【0033】

あるいは、任意の外来性プロモーターとして、誘導性プロモーターを用いることもでき、このような誘導性プロモーターとしては、例えば、メタロチオネイン－１遺伝子プロモーターなどを用いることができる。メタロチオネイン－１遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイトカインなどの誘導物質を、所望の時期に標的疾患細胞の位置に局所投与することにより、任意の時期に標的疾患細胞特異的にウイルスタンパク質の発現を誘導することができる。

【0034】

あるいは、２以上のウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質の遺伝子を、同一又は異なる臓器特異的に発現が亢進している因子のプロモーター、又はがん細胞特異的に発現が亢進している因子のプロモーターの制御下におくこともできる。

【0035】

本遺伝子組換えウイルスは、ウイルスタンパク質に含まれる領域のうち、正常細胞におけるウイルスの増殖に必要な細胞環境を誘導するのに必須であるが、がん細胞におけるウイルスの増殖には必要でない領域が欠損した遺伝子組換えウイルスであってもよい。例えば、正常細胞内でアデノウイルスが増殖するためには、細胞周期を回すためにＲｂやｐ５３を不活性化することが必要であるが、がん細胞では既に細胞周期が回っている状態にあるため、がん細胞内でのアデノウイルスの増殖には、Ｅ１ＡのＲｂ結合領域やＥ１Ｂのｐ５３結合領域は必須ではない。よって、アデノウイルスの場合、Ｅ１Ａ２４ＫＤａの領域を欠損させ（Ｅ１ＡΔ２４）、Ｅ１Ｂ５５ＫＤａの領域を欠損させ（Ｅ１ＢΔ５５Ｋ）、またはＥ１Ｂ１９ＫＤａの領域を欠損させる（Ｅ１ＢΔ１９）ことにより、がん細胞では増殖するが、正常細胞では増殖しない、すなわち、がん細胞特異的なウイルスの増殖が可能になる。このタイプの遺伝子組換えウイルスの場合、ウイルスの複製に必要なタンパク質の遺伝子が、がん細胞特異的なプロモーターの制御下におかれていなくてもがん細胞特異的な増殖を起こすことができる。本発明の遺伝子組換えウイルスは、このようなウイルスの複製またはアッセンブリに必要なタンパク質の遺伝子が、組織特異的プロモーター又はがん細胞特異的プロモーターの制御下になく、かつ、正常細胞内におけるウイルスの増殖に必要な細胞環境を誘導するのに必須であるが、がん細胞内におけるウイルスの増殖には必要でない領域（例えば、Ｅ１Ａ２４ＫＤａ領域、Ｅ１Ｂ５５ＫＤａ領域、およびＥ１Ｂ１９ＫＤａ領域）の少なくとも１つが欠損した遺伝子組換えウイルスであってもよい。

【0036】

特に、このような正常細胞におけるウイルスの増殖に必要な細胞環境を誘導するのに必須であるが、がん細胞におけるウイルスの増殖には必要でない領域が欠損した遺伝子が、臓器特異的プロモーター又はがん細胞特異的プロモーターの下流に機能的に連結されている遺伝子組換えウイルスは、多因子制御型がん特異的増殖遺伝子組換えウイルス（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ；ｍ－ＣＲＶ）と呼ばれる（特開２００５－０４６１０１号及び国際公開第２００５／０１２５３６号）。好ましくは、本発明は、このような多因子制御型がん特異的増殖ウイルスである。

【0037】

本多因子制御型がん特異的増殖ウイルスは、以下のように作製することができる。例えば、組織特異的プロモーター又はがん特異的プロモーターと機能的に連結したＥ１Ａ遺伝子（２４ＫＤａ領域を欠損していてもよい）、および構成的プロモーター（ＣＭＶプロモーターなど）と機能的に連結したＥ１Ｂ遺伝子（１９ＫＤａまたは５５ＫＤａ領域を欠損していてもよい）を含むプラスミドベクターＰ１；ＲＳＶプロモーター及びＥ２Ｆプロモーター、並びにこれらと同等の活性を示すプロモーターから選択されるいずれか１種類のプロモーターと機能的に連結された免疫誘導遺伝子を含むプラスミドベクターＰ２；ならびにＥ１領域を欠失するアデノウイルスゲノム（ファイバー遺伝子内に標的細胞特異的な変異を有していてもよい）を含むバックボーンプラスミドＰ３を用意し、これら３種のプラスミドを適宜組み合わせ、ＣｒｅリコンビナーゼｌｏｘＰシステムを用いてプラスミド融合させる。各プラスミドに搭載された薬剤耐性遺伝子とｏｒｉを利用して目的プラスミドの選択により、織特異的プロモーター又はがん特異的プロモーター－Ｅ１Ａ発現カセット、構成的プロモーター－Ｅ１Ｂ発現カセット、およびＲＳＶプロモーター及びＥ２Ｆプロモーター、並びにこれらと同等の活性を示すプロモーターから選択されるいずれか１種類のプロモーター－免疫誘導遺伝子発現カセットを搭載した、がん細胞特異的増殖型アデノウイルス（ＣＲＡ）ベクタープラスミドを作製することができる。続いて、該ベクターを用いて、Ｅ１Ａを相補する細胞株（例：２９３細胞）にトランスフェクションすることにより、ＣＲＡベクターを作製することができる。

【0038】

本遺伝子組換えウイルスは、宿主細胞で自律増幅するための複製起点や、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。

【0039】

本遺伝子組換えウイルスを治療用ベクターとして使用し得る疾患はがんである。本明細書における「がん」としては、例えば、腎細胞がん、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原生がん、肝臓がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性白血病、真性赤血球増多症、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0040】

「腫瘍溶解性ウイルス」とは、感染した腫瘍細胞内において増殖し、当該感染細胞を溶解して娘ウイルスを細胞外に放出する遺伝子組換えウイルスを意味する。これにより、腫瘍溶解性ウイルスは、感染した腫瘍細胞を殺傷すると共に、周辺の未感染の腫瘍細胞に娘ウイルスが感染して同様に当該細胞を殺傷する。これを繰りかえすことにより、腫瘍細胞の殺傷効率が高いことが特徴である。腫瘍溶解性ウイルスは、通常は正常細胞においては細胞溶解を起こさない。このような腫瘍選択的な細胞溶解メカニズムとして様々な方法が既に本技術分野において知られている。腫瘍溶解性ウイルス用いられる遺伝子組換えウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、及びセンダイウイルスを挙げることができる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能であり、導入遺伝子の宿主染色体への組込みが極めて稀である等の利点を有する。

【0041】

一態様において、本遺伝子組換えウイルスは、細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸と機能的に連結した臓器特異的プロモーター又はがん特異的プロモーターを含んでいてもよい。細胞毒性因子をコードする核酸は、例えば、該核酸が転写（および翻訳）された場合に、直接的もしくは間接的に、細胞に対して死、もしくは少なくとも増殖阻害をもたらすタンパク質またはＲＮＡをコードすることができる。治療因子は、該遺伝子が転写（および翻訳）された場合に、細胞毒性作用以外の作用によって直接的もしくは間接的に標的疾患に対して治療効果をもたらすタンパク質（もしくはＲＮＡ）をコードするものであってもよい。例えば、細胞毒性因子または治療因子としては、腫瘍サプレッサー遺伝子（ｐ５３、ｐ２１など）、サイトカイン遺伝子（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮなど）、アポトーシス誘導遺伝子（Ｆａｓなど）、イオンチャネル（ナトリウムチャネルなど）の構成タンパク質をコードする遺伝子、プロドラッグを毒物に変換することによって細胞を傷害しうるタンパク質の遺伝子（自殺遺伝子）（ＨＳＶ－チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼなど）、がん原因遺伝子に対するアンチセンス核酸（ＴＧＦ－βに対するアンチセンス核酸、サバイビンに対するアンチセンス核酸など）、血管新生抑制遺伝子（血小板第ＩＶ因子、アンジオスタチン、エンドスタチン、可溶性ＶＥＧＦレセプターなど）、がん抑制作用のあるｍｉＲＮＡ若しくはそのｍｉｍｉｃ、またはがん促進作用のあるｍｉＲＮＡのアンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム等が挙げられる。なお、既に述べたウイルスの増殖を制御するプロモーター及び／又は遺伝子を採用することにより、遺伝子組換えウイルスの増殖が十分に制御できる場合、すなわち、遺伝子組換えウイルスが正常細胞ではほとんど増殖せず、がん細胞では十分に増殖する場合、上述の細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸は、上述の任意の外来性プロモーターと機能的に連結していてもよい。

【0042】

細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸は、それを産生する細胞・組織から自体公知の方法によりｃＤＮＡとして単離することができ、Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーターの下流に機能的に連結することができる。Ａｕｒｏｒａキナーゼプロモーターの制御下にある細胞毒性因子または治療因子をコードする核酸を含む発現カセットは、好ましくは該核酸または遺伝子の下流に適当なポリアデニレーション配列を含む。

【0043】

治療対象である哺乳動物に応じて、それと同種のプロモーターを用いることが好ましいが、十分な感染効率と殺傷効果を与える程度のプロモーター活性を発揮し得る限り、異種プロモーターを用いてもよい。例えば、ヒト治療用ベクターとして、マウス遺伝子のプロモーターを用いることができる。

【0044】

本明細書において、がん細胞「特異的」であるとは、正常細胞で全く活性を示さない場合に限定されるものではなく、治療上許容される範囲で正常細胞においても遺伝子発現を駆動する場合も包含される。

【0045】

本遺伝子組換えウイルスは、標的がん細胞で特異的に増殖し、該細胞特異的に細胞傷害性を発揮させるとともに最適な発現レベルで免疫誘導遺伝子を発現させることができるので、必要に応じて薬理学的に許容し得る担体とともに混合して注射剤などの種々の製剤形態とした後に、よりサイトカイン依存性の副作用が軽減されたがんの治療薬として用いることができる。ここで薬理学的に許容し得る担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。

【0046】

一態様において、本発明は、本遺伝子組換えウイルスを腫瘍細胞へ投与することを含む、非標的細胞への傷害の少ないがんの治療方法に関する。本遺伝子組換えウイルスを用いたがんの治療方法においては、本遺伝子組換えウイルスにより導入された免疫誘導遺伝子から発現した免疫誘導タンパク質が、全身の副作用に直接関連する血清及び脾臓からは、速やかにクリアランスされる。そのため、過剰な免疫誘導遺伝子のタンパク質が全身を巡ることによる副作用の抑制に有利である。このように本遺伝子組換えウイルスにより導入された免疫誘導遺伝子から発現した免疫誘導タンパク質が短時間で消失するにもかかわらず、本遺伝子組換えウイルスは、ＣＡなどの非常に活性の強いプロモーター制御下で大量の免疫誘導遺伝子発現をもたらす治療用ウイルスと比べても、体内(in vivo)では同等以上の腫瘍抑制（腫瘍細胞殺傷）効果を示す。驚くべきことに、さらに生存率の延長という最終的かつ最重要の治療効果の判定においては、本遺伝子組換えウイルスの方が, ＣＡなどの非常に活性の強いプロモーター制御下で大量の免疫誘導遺伝子発現による大量の免疫誘導タンパク質がもたらす治療用ウイルスよりも、むしろ強力な治療効果をもたらす。すなわち、本遺伝子組み換えウイルスは、腫瘍内において短期的に、つまり抗腫瘍免疫を誘導するのに必要な期間のみ、高濃度の免疫誘導タンパク質の産生をもたらし、そのような一時的な腫瘍局所のみでの高濃度、つまり至適な期間の至適な量の免疫誘導タンパク質が、腫瘍に対する特異的な全身性の抗腫瘍免疫を効率よく誘導し、その結果として腫瘍細胞の細胞死を誘導することで腫瘍の増殖を十分に抑制する効果がある。このように、一時的な腫瘍局所のみでの高濃度、つまり至適な期間の至適な量の免疫誘導タンパク質が、極めて安全かつ、十分な腫瘍増殖抑制の治療効果と、腫瘍局所の治療で、全身性の特異的（安全）な抗腫瘍免疫が、効率的に誘導でき、治療していない部位の転移も完全に阻止・治療できること、さらには最終的な治療効果となる生存率の延長に極めて有効であることは本発明により初めて示された。よって、本遺伝子組み換えウイルスを患者に投与することを含むがん治療方法は、腫瘍以外の臓器又は組織における不要で副作用をもたらす免疫誘導タンパク質の量が少ないこと、かつ／又は、免疫誘導遺伝子の発現による最終産物の免疫誘導タンパク質が短期間に消失することにより、標的としない細胞（特には正常細胞）への毒性や傷害性が低く、腫瘍細胞特異的に傷害を与え又は殺傷する。一例として、本発明は、本遺伝子組換えウイルスを腫瘍細胞へ投与することを含む、免疫誘導遺伝子を発現する腫瘍溶解性ウイルスによるがん治療方法であって、免疫誘導タンパク質の副作用の誘導とその危険性が明確に示唆される代表的な器官・組織である脾臓又は血清における前記免疫誘導タンパク質の量が、ＣＡプロモーター又はＲＳＶプロモーターの下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスを投与した場合と比較して短期間で少ない（至適な期間に至適な量が供給される）ことを特徴とする方法である。あるいは、別の表現において、本発明は、本遺伝子組換えウイルスを腫瘍細胞へ投与することを含む、免疫誘導遺伝子を発現する腫瘍溶解性ウイルスによるがん治療方法であって、前記免疫誘導遺伝子から発現したタンパク質の脾臓又は血清などの全身への不要な循環・供給が、ＲＳＶプロモーターの下流に機能的に連結された免疫誘導遺伝子を有する腫瘍溶解性ウイルスを投与した場合と比較して、劇的に量が少なくしかも短期間である（すなわち治療効果は減ずることなくむしろ増強して、しかも副作用の可能性が極めて低い）ことを特徴とする方法であってもよい。

【0047】

本遺伝子組換えウイルスを含有する疾患治療剤の投与は、治療対象動物自身の適切な細胞（あるいは治療対象動物と同種異形もしくは異種の動物における当該細胞）を体外に取り出し、培養してから導入を行って体内に戻す（あるいは移植する）ｅｘ ｖｉｖｏ法と、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うｉｎ ｖｉｖｏ法のいずれかで行われるが、ｉｎ ｖｉｖｏ法で行うことが好ましい。また、ｉｎ ｖｉｖｏ法の場合、該製剤の投与は、例えば、注射、カテーテル、バルーンカテーテル、局所注入などにより行うことができる。また、投与箇所としては、血中、腫瘍内、腹腔内、及び筋肉内などが挙げられるが、好ましくは、腫瘍内に投与される。

【0048】

本遺伝子組換えウイルスを含有する疾患治療剤の投与量は、遺伝子組換えウイルスの種類、標的細胞におけるプロモーター活性、治療因子の種類、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、例えば、遺伝子組換えウイルスとしてがん特異的増殖型アデノウイルスを用いる場合、従来のがん遺伝子治療の臨床試験において、ウイルス粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）で１×１０^１０～１０^１２ｐａｒｔｉｃｌｅ／腫瘍を用いて安全性が確認されているため、同量が投与の目安となる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：４２９－４３４，２０１０）。実際に発明者は、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ－１（治療遺伝子を搭載していない）の医師主導治験を１０^１０～１０^１２ｐａｒｔｉｃｌｅ／腫瘍の量で現在実施中であるが、現在まで全例で治療効果と安全性が確認されている。

【実施例】

【0049】

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は２０１７年１１月８日に出願された日本国特許出願第２０１７－２１５５７９号、及び２０１８年３月１９日に出願された同第２０１８－０５０７２２号からの優先権を主張する。本願が優先権を主張するこれらの日本国特許出願に記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。

【0050】

（実施例１）ＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの構造
アデノウイルスの増殖に必須の初期遺伝子であるＥ１Ａの上流にＳｕｒｖｉｖｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒを組み込んだＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ内に、Ｅ２Ｆプロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びＣＡプロモーターの各プロモーターとｍｏｕｓｅ ＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡを連結した発現カセットを挿入し、以下の３種のＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡを構築した（図１）。アデノウイルスの構築はＮａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００５） １２，１３８５－１３９３に記載の方法に基づいて行った。

【0051】

（１）Ｐ１＋３プラスミドの作製
作製の第一段階として、増殖制御プラスミドＰ１とアデノウイルスバックボーンプラスミドＰ３（ｐＡｄ．ＨＭ４，ｐＡｄ．ＨＭ１０；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｋａｙ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９）から制限酵素処理によりＰ１＋３を作製した。

【0052】

アデノウイルスバックボーンプラスミドＰ３は、ヒトアデノウイルス５型ゲノムＤＮＡが搭載されているが、ウイルス増殖に必要なＥ１遺伝子領域を欠損させている。このＥ１欠損領域に、増殖制御プラスミドＰ１（ｐＨＭ５－Ｓｕｒｖｐｒ－Ｅ１Ａ－ＣＭＶｐｒ－Ｅ１Ｂ１９Ｋ）をＩ－Ｃｅｕ Ｉ及びＰＩ－Ｓｃｅ Ｉを利用して調製した約３ｋｂの増殖制御カセット（Ｓｕｒｖｐｒ－Ｅ１Ａ－ＣＭＶｐｒ－Ｅ１Ｂ１９Ｋ）を挿入した。この増殖制御カセットは、がん特異的なＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーター及び恒常的ＣＭＶプロモーター下流にウイルス増殖因子であるＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子をそれぞれ連結した構造を有している。得られたＰ１＋３プラスミドはそれぞれｐＡｄ．ＨＭ４－Ｓｕｒｖｐｒ－Ｅ１Ａ－ＣＭＶｐｒ－Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びｐＡｄ．ＨＭ１０－Ｓｕｒｖｐｒ－Ｅ１Ａ－ＣＭＶｐｒ－Ｅ１Ｂ１９Ｋと名付けた。

【0053】

（２）Ｐ２プラスミドの作製
作製の第二段階として、３種のプロモーター（ＣＡプロモーター、Ｅ２Ｆプロモーター、及びＲＳＶプロモーター）それぞれの下流に、治療遺伝子としてマウスのＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡを連結した、治療遺伝子導入プラスミドＰ２を作製した。
（２）－１：ｐＵｎｉ／ＣＡｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ
作製順序として、まずＬｏｘＰ配列とＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａ配列を持つプラスミドｐＵｎｉ／Ｖ５－ＨｉｓＣ－ｔｅｔ（ｃ）（以下、ｐＵｎｉ）にＣＡプロモーターを挿入したのち、さらにその下流に治療遺伝子としてｍＧＭ－ＣＳＦのＣｏｒｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＣＤＳ）を挿入した。

【0054】

まず、ベクターとなるｐＵｎｉをＳｔｕ Ｉ （Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）で切断し、セルフライゲーションを防ぐ為、脱リン酸化処理した。インサートとなるＣＡプロモーターは、ｐＨＭ－ＣＡＧｐｒ－ｍＫａｔｅ２の５’側にあるＢｇＩ ＩＩ，３’側にあるＢａｍＨ Ｉを切断し、後方にＳｍａ Ｉサイトを含んだＣＡプロモーター配列として切断し、切り出し後に平滑末端処理した。これらをライゲーションさせｐＵｎｉ／ＣＡｐｒを作製した。

【0055】

次にｐＵｎｉ／ＣＡｐｒのＣＡプロモーター下流に位置するＳｍａ Ｉ（Ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）を切断し、セルフライゲーションを防ぐ為、脱リン酸化処理した。一方、インサートとなるｍＧＭ－ＣＳＦ ＣＤＳは、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋ｍＧＭ－ＣＳＦ（ＲＤＢ０１４６９；理化学研究所）の５’側のＥｃｏＲ Ｉ、３’側のＢａｍＨ Ｉをそれぞれ切断し、ｍＧＭ－ＣＳＦ ＣＤＳをそれぞれ切り出し平滑末端処理した。これらをそれぞれライゲーションし、ｐＵｎｉ／ＣＡｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦを作製した。

【0056】

（２）－２：ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ
Ｅ２Ｆプロモーター配列を含むｐＡＢＳ４－Ｅ２Ｆｐ－ＧＦＰを鋳型とし、５’側にＸｈｏ ＩとＮｃｏ Ｉサイトを付加したセンスプライマー；５’－ＴＣＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＣＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣ－３’（配列番号１０）、及び、３’側にＡｇｅ Ｉ、Ｓａｌ ｌ及びＳｐｅ Ｉサイトを付加したアンチセンスＰｒｉｍｅｒ；５’－ＧＧＡＣＧＴＡＣＣＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＴＣＧＡＧＧＧＣＴＣＧＡＴＣＣＣＧＣＴＣＣ－３’（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行い、Ｅ２Ｆプロモーター配列を増幅した。その後、Ｘｈｏ Ｉ及びＡｇｅ Ｉにて切断後、ｐＵｎｉのＸｈｏ Ｉ及びＡｇｅ Ｉサイトに挿入し、ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒを作製した。一方、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋ｍＧＭ－ＣＳＦを鋳型とし、５’側にＡｇｅ Ｉサイトを付加したセンスプライマー；５’－ＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＡＣＴ－３’（配列番号１２）、及び、３’側にＡｐａ Ｉサイトを付加したアンチセンスＰｒｉｍｅｒ；５’－ＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１３）を用いてＰＣＲを行い、ｍＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ配列を増幅した。その後、Ａｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉにて切断後、ｐＵｎｉ／Ｅ２ＦｐｒのＡｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉサイトに挿入し、ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦを作製した。

【0057】

（２）－３：ｐＵｎｉ／ＲＳＶｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ
ＲＳＶプロモーター配列を含むｐＧＥＭ－ＲＳＶ－Ｓを鋳型とし、５’側にＸｈｏ Ｉと Ｎｃｏ Ｉサイトを付加したセンスプライマー；５’－ＴＣＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＴＴＣＧＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡ－３’（配列番号１４）、及び、３’側にＡｇｅ Ｉ、Ｓａｌ ｌ及びＳｐｅ Ｉサトを付加したアンチセンスＰｒｉｍｅｒ；５’－ＧＧＡＣＧＴＡＣＣＧＧＴＧＴＣＧＡＣＡＣＴＡＧＴＡＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＴ－３’（配列番号１５）を用いてＰＣＲを行い、ＲＳＶプロモーター配列を増幅した。その後、Ｘｈｏ Ｉ及びＡｇｅ Ｉにて切断後、ｐＵｎｉのＸｈｏ Ｉ及びＡｇｅ Ｉサイトに挿入し、ｐＵｎｉ／ＲＳＶｐｒを作製した。一方、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋ｍＧＭ－ＣＳＦを鋳型とし、５’側にＡｇｅ Ｉサイトを付加したセンスプライマー；５’－ＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＡＣＴ－３’（配列番号１２）、及び、３’側にＡｐａ Ｉサイトを付加したアンチセンスＰｒｉｍｅｒ；５’－ＧＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１３）を用いてＰＣＲを行い、ｍＧＭ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ配列を増幅した。その後、Ａｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉにて切断後、ｐＵｎｉ／ＲＳＶｐｒのＡｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉサイトに挿入し、ｐＵｎｉ／ＲＳＶｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦを作製した。

【0058】

（３）Ｐ１＋２＋３プラスミドの作製
最終段階として、前述で説明したＰ１＋３プラスミドとＰ２プラスミドから、配列特異的組み換え酵素であるＣｒｅを用いた特定配列（ＬｏｘＰ）同士間での相同組み換えによってＰ１＋２＋３プラスミドを作製した。まず、Ｐ１＋３プラスミド（ｐＡｄ．ＨＭ４－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ）とＰ２プラスミド（ｐＵｎｉ／ＣＡｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ）をそれぞれ１：０．３のモル比で、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ相同組み換えを行い、Ｐ１＋２＋３プラスミド（ｐＡｄ．ＨＭ４－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ）を作製した。同様に、Ｐ１＋３プラスミド（ｐＡｄ．ＨＭ１０．Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ）とｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦあるいはｐＵｎｉ／ＲＳＶｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ）をそれぞれ１：０．３のモル比で、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ相同組み換えを行い、Ｐ１＋２＋３プラスミド（ｐＡｄ．ＨＭ１０－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ及びｐＡｄ．ＨＭ１０－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ）をそれぞれ作製した。

【0059】

（４）アデノウイルスの作製
プラスミドｐＡｄ．Ｓｕｒｖ．Ｅ１Ａ－ＣＭＶ．Ｅ１Ｂ１９Ｋ、ｐＡｄ．ＨＭ４－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、ｐＡｄ．ＨＭ１０－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ及びｐＡｄ．ＨＭ１０－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦをそれぞれ制限酵素Ｐａｃ Ｉで切断したのち、アデノウイルス産生細胞であるＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクション後、ウイルスプラークを単離し、シードウイルスとした。

【0060】

（５）アデノウイルスの増幅
各シードウイルスを２４ウェルプレートに播種したＨＥＫ２９３細胞にインフェクションし、９０％の細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ：ＣＰＥ）が観察された時点で細胞及び培養液を回収した。これらウイルス感染細胞懸濁液を３回の凍結、融解操作を繰り返した後、１０ｃｍディッシュに播種したＨＥＫ２９３細胞にインフェクションした。このようなウイルス感染、回収の操作を徐々にスケールアップさせ、最終的に１５ｃｍディッシュ４０枚分へと増幅し、これらの細胞及び培養液を回収し、凍結保存した。

【0061】

（６）アデノウイルスの精製
上記の回収細胞液から、各アデノウイルスを塩化セシウム密度勾配超遠心法により精製した。まず、３５，０００ｒｐｍ、１０℃、１時間の超遠心による１次精製を行い、ウイルスバンドを回収した。その後、３５，０００ｒｐｍ、１０℃、１８時間の超遠心による２次精製を行い、ウイルスバンドを回収した。回収したウイルス液を、Ｅｃｏｎｏ－ｐａｃ １０ＤＧ脱塩カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）によりフラクショネーションを行い、精製アデノウイルス液を得た。その後、ＯＤ_２６０によりウイルス粒子数を概算後、グリセロールを最終濃度１０％となるよう加え、凍結保存した。

【0062】

（７）ＩＬ－２及びＩＬ－１５発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの作製
（７－１）ヒトＩＬ－２発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの作製
まず、Ｅ２Ｆプロモーターの下流に、ヒトのＩＬ－２ ｃＤＮＡを連結した、治療遺伝子導入プラスミドＰ２（ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｈＩＬ－２）を作製した。その際、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋ｈＩＬ－２を鋳型とし、５’側にＡｇｅ Ｉサイトを付加したセンスプライマー；５’－ＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴ－３’（配列番号１６）、及び、３’側にＡｐａ Ｉサイトを付加したアンチセンスＰｒｉｍｅｒ；５’－ＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡ－３’（配列番号１７）を用いてＰＣＲを行い、ｈＩＬ－２ ｃＤＮＡ配列を増幅した。その後、Ａｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉにて切断後、ｐＵｎｉ／Ｅ２ＦｐｒのＡｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉサイトに挿入し、ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｈＩＬ－２を作製した。その後、Ｐ１＋２＋３プラスミド（ｐＡｄ．ＨＭ４－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｈＩＬ－２）を作製した。

【0063】

（７－２）マウスＩＬ－２発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの作製
まず、Ｅ２Ｆプロモーターの下流に、マウスのＩＬ－２ ｃＤＮＡを連結した、治療遺伝子導入プラスミドＰ２（ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＩＬ－２）を作製した。その際、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋ｍＩＬ－２を鋳型とし、５’側にＡｇｅ Ｉサイトを付加したセンスプライマー；５’－ＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＧＣ－３’（配列番号１８）、及び、３’側にＡｐａ Ｉサイトを付加したアンチセンスＰｒｉｍｅｒ；５’－ＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＧＡ－３’（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、ｍＩＬ－２ ｃＤＮＡ配列を増幅した。その後、Ａｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉにて切断後、ｐＵｎｉ／Ｅ２ＦｐｒのＡｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉサイトに挿入し、ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＩＬ－２を作製した。その後、Ｐ１＋２＋３プラスミド（ｐＡｄ．ＨＭ４－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＩＬ－２）を作製した。

【0064】

（７－３）ヒトＩＬ－１５発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの作製
まず、Ｅ２Ｆプロモーターの下流に、ヒトのＩＬ－１５ ｃＤＮＡを連結した、治療遺伝子導入プラスミドＰ２（ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｈＩＬ－１５）を作製した。その際、ｈＩＬ－１５ ｃＤＮＡを鋳型とし、５’側にＡｇｅ Ｉサイトを付加したセンスプライマー；５’－ＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＧＡＧＴＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＧＡＡＡＣＣＡＣＡ－３’（配列番号２０）、及び、３’側にＡｐａ Ｉサイトを付加したアンチセンスＰｒｉｍｅｒ；５’－ＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡ－３’（配列番号２１）を用いてＰＣＲを行い、ｈＩＬ－１５ ｃＤＮＡ配列を増幅した。その後、Ａｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉにて切断後、ｐＵｎｉ／Ｅ２ＦｐｒのＡｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉサイトに挿入し、ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｈＩＬ－１５を作製した。その後、Ｐ１＋２＋３プラスミド（ｐＡｄ．ＨＭ４－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｈＩＬ－１５）を作製した。

【0065】

（７－４）マウスＩＬ－１５発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの作製
まず、Ｅ２Ｆプロモーターの下流に、マウスのＩＬ－１５ ｃＤＮＡを連結した、治療遺伝子導入プラスミドＰ２（ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＩＬ－１５）を作製した。その際、ｍＩＬ－１５ ｃＤＮＡを鋳型とし、５’側にＡｇｅ Ｉサイトを付加したセンスプライマー；５’－ＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＧＴＴＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＡＡＣＣＡＴＡ－３’（配列番号２２）、及び、３’側にＡｐａ Ｉサイトを付加したアンチセンスＰｒｉｍｅｒ；５’－ＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＣＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡ－３’（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行い、ｍＩＬ－１５ ｃＤＮＡ配列を増幅した。その後、Ａｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉにて切断後、ｐＵｎｉ／Ｅ２ＦｐｒのＡｇｅ Ｉ及びＳｔｕ Ｉサイトに挿入し、ｐＵｎｉ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＩＬ－１５を作製した。その後、Ｐ１＋２＋３プラスミド（ｐＡｄ．ＨＭ４－Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＩＬ－１５）を作製した。

【0066】

その後、アデノウイルスの作製・増幅・精製を同様に行った。最終的に、各アデノウイルス由来ＤＮＡを調製後、各特異的プライマーによるＰＣＲを行い、特異的増幅を確認した。ウイルス力価が決定できたもののうち、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＬ－２は１．５×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｈＩＬ－１５は２．８×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬであった。

【0067】

（実施例２）ハムスター由来細胞におけるアデノウイルスの感染効率
ハムスター由来のがん細胞（ＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１）及び正常細胞（ＢＨＫ－２１）におけるアデノウイルスの感染効率を検討した。
Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｔｕｍｏｒ由来ＨａＫ細胞は、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＰｒｏｆ．Ｍ．Ｗｏｌｄにご供与頂いた。培養は、１０％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；Ｂｉｏｗｅｓｔ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；ナカライテスク）にて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で行った。Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ由来ＨａＰ－Ｔ１細胞は、理化学研究所ＢＲＣ ｃｅｌｌ ｂａｎｋより購入した（ＲＢＲＣ－ＲＣＢ０４１１）。培養は、１０％ＦＢＳ、１％ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ；ＳＩＧＭＡ）、１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＳＩＧＭＡ）にて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で行った。Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒの新生児腎臓由来ＢＨＫ－２１細胞は国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより購入した（ＪＣＲＢ９０２０）。培養は、１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク）含有ＭＥＭにて３７℃、５％ＣＯ_２条件下で行った。

【0068】

前日に１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ播種した各細胞を感染当日にカウントした結果、ＨａＫ：６．４５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＨａＰ－Ｔ１：６．７５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＢＨＫ－２１：６．７５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌであった。その後、恒常的かつ強力なＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター制御下にＥＧＦＰを発現する非増殖型アデノウイルス（Ａｄ．ＣＭＶ－ＥＧＦＰ）をｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）が０、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００、１０００条件にて１時間感染した（ＭＯＩ０はウイルス非感染コントロール）。その後４８時間培養し、蛍光顕微鏡下で図に示す倍率にて撮像した。その後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液にて細胞を乖離させ、フローサイトメーターＳＨ８００Ｚ（Ｓｏｎｙ）によるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）解析を行い、各条件下でのＥＧＦＰ陽性率（アデノウイルス感染効率）を検討した。

【0069】

その結果、ＭＯＩ依存的なＥＧＦＰ陽性率の上昇が観察された（図２及び図３）。ＭＯＩ３０におけるアデノウイルス感染効率（ＡＧＴＥ）は、ＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１では９５％以上、ＢＨＫ－２１においても７０％以上であり、いずれの細胞においても効率的なアデノウイルス感染が示された。一方、ＭＯＩ３００以上では、いずれの細胞においても強い細胞傷害効果が観察された。

【0070】

（実施例３）ハムスター由来細胞におけるプロモーター活性
ハムスター由来のがん細胞（ＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１）及び正常細胞（ＢＨＫ－２１）における、Ｅ２Ｆ、ＲＳＶ及びＳｕｒｖｉｖｉｎの各プロモーター活性を検討した。前日に６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ播種した各細胞を感染当日にカウントした結果、ＨａＫ：１．２９×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＨａＰ－Ｔ１：１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＢＨＫ－２１：１．７×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌであった。その後、ウイルス増殖に重要な遺伝子Ｅ１及びＥ３を欠損させたＡｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、及び各プロモーター制御下にβ－ガラクトシダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）を発現する、Ａｄ．Ｅ２Ｆｐ－ＬａｃＺ、Ａｄ．ＲＳＶｐ－ＬａｃＺ、及びＡｄ．Ｓｕｒｖｐ－ＬａｃＺをＭＯＩ３０にて１時間感染させた後、４８時間培養した。その後、Ｂｅｔａ－Ｇｌｏ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、細胞溶解液中のβ－ガラクトシダーゼ活性を検討した。実験は各条件にて３ｗｅｌｌずつ施行し、データは平均値±標準誤差で示した。

【0071】

結果を図４に示す。がん細胞（ＨａＫ細胞）においてはＲＳＶプロモーター及びＣＭＶプロモーターが強い活性を示す一方、Ｅ２Ｆプロモーターとサバイビンプロモーターは中程度の活性を示した。ＨａＰ－Ｔ１細胞では、サバイビンプロモーターとＥ２ＦプロモーターとＲＳＶプロモーターで中程度の活性が認められた。一方、正常細胞ではＳｕｒｉｖｉｖｎプロモーターはほぼ活性が見られなかった。その他のプロモーターも、がん細胞に比べて正常細胞では活性が低い傾向にあったが、Ｅ２Ｆプロモーターは、ＲＳＶプロモーターやＣＭＶプロモーターよりも、正常細胞ではさらに低い活性を示した。このことから、Ｅ２Ｆプロモーターとサバイビンプロモーターは、異なる２種類の癌細胞において中程度のプロモーター活性を示し、正常細胞ではＲＳＶプロモーター及びＣＭＶプロモーターより非常に低い活性を示す、つまりがん細胞特異的（優位な）プロモーターの特性を示すことが明らかになった。

【0072】

（実施例４）ｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染ハムスター細胞におけるＭｏｕｓｅ ＧＭ－ＣＳＦ発現
ハムスターＧＭ‐ＣＳＦの遺伝子配列は確かなものが報告されていないため、マウスＧＭ‐ＣＳＦ（ｍＧＭ－ＣＳＦ）を用いた。各ｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡを感染させたハムスター由来のがん細胞（ＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１）及び正常細胞（ＢＨＫ－２１）におけるｍＧＭ－ＣＳＦのタンパク質発現レベルをＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法にて検討した。前日に６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ播種した各細胞を感染当日にカウントした結果、ＨａＫ：１．４×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＨａＰ－Ｔ１：１．４７×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、ＢＨＫ－２１：２．２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌであった。Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦをそれぞれＭＯＩ１、１０、１００条件にて１時間感染後、４８時間培養した。その後、培養上清を回収し、Ｍｏｕｓｅ ＧＭ－ＣＳＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）にてｍＧＭ－ＣＳＦタンパク質の発現量を検討した。ＥＬＩＳＡ測定は各細胞上清につき２ｗｅｌｌずつ施行し、データは平均値±標準誤差にて示した。各条件間の統計学的有意差についてはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔにて検定した（＊，Ｐ＜０．０５）。加えて、ヒトＧＭ‐ＣＳＦ（ｈＧＭ－ＣＳＦ）を発現する各Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ（Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｈＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｈ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｈＧＭ－ＣＳＦ）についても同様に検討を行った。

【0073】

結果を図５に示す。いずれの細胞においてもＭＯＩ依存的なマウスＧＭ－ＣＳＦ発現上昇が観察された（図５Ａ‐Ｃ）。プロモーター間の比較では、ＣＡプロモーターが最も強力な発現誘導により、非常に高レベルのサイトカイン分泌を生じており、次にＲＳＶプロモーターが強力に発現を誘導（それによる高レベルのサイトカインを分泌）した一方、Ｅ２Ｆは中等度のサイトカインの発現・分泌を誘導することが示された。細胞間では発現レベルに顕著な差は観察されなかった。また、ヒトＧＭ‐ＣＳＦの発現についても同様の傾向が得られた（図５Ｄ）。これら（図４、図５）の結果から、ＲＳＶおよびＣＭＶプロモーターはユビキタス（細胞種を選ばず）かつ比較的強く活性化されること、及び、Ｅ２Ｆプロモーターは、がんではＳｕｒｖｉｖｉｎプロモーターより若干低いあるいは同等でＲＳＶあるいはＣＭＶよりは低い活性、正常ではＳｕｒｖｉｖｉｎほどではないがＲＳＶあるいはＣＭＶより低く、Ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーターよりは弱いながらもがん特異性が見られる、ということが示され、各プロモーターのハムスター細胞におけるプロモーターの特性、あるいは具体的にこれらの４つのプロモーターのがん細胞と正常細胞での「具体的」な相対的な活性レベルの違いとがん特異的活性の程度を初めて明らかにした。

【0074】

（実施例５）ｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染のハムスター細胞に対する細胞傷害効果
各ｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡを感染させたハムスター由来のがん細胞（ＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１）及び正常細胞（ＢＨＫ－２１）に対する細胞傷害効果について、生細胞数測定にて検討した。前日に９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅへ各細胞とも５×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて播種した。Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦをＭＯＩ３及び３０にて１時間感染後、培養を行った。感染後、３及び５日後の時点で生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク）を用いたＷＳＴ－８アッセイにより細胞傷害性を評価した。

【0075】

その結果、ＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１においては、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡとＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ３種はいずれもコントロールに比べ有意な細胞傷害効果が観察された（図６）。また、ＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ３種はいずれもＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡと比較しても有意に高い細胞傷害効果が観察された。特に、ＣＡプロモーターで強く、次いでＲＳＶプロモーターが強く、Ｅ２ＦはＣＡよりも低かった。ＭＯＩ３に比べ、ＭＯＩ３０でより強い傷害性が見られた。一方、ＢＨＫ－２１では、ＭＯＩ３０においてはｍｏｄｅｒａｔｅな細胞傷害効果がｍＧＭ－ＣＳＦ発現ウイルスにおいて見られたものの、ＭＯＩ ３においてはいずれのウイルスにおいても有意な細胞傷害効果は見られなかった。つまり、Ｓｕｒｖｉｖｉｎプロモーターでウイルス増殖を制御するＣＲＡである、基盤（骨格）となるＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの、高度ながん特異化による安全性という良好な特性が示された。

【0076】

（実施例６）担がんハムスターモデルにおけるｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡの腫瘍抑制効果
メス５週齢のＳｙｒｉａｎハムスターに１×１０^７個のＨａＫを背側に１カ所皮下移植した。その際、ＨａＫ細胞は５０％マトリゲル中１×１０^７ｃｅｌｌｓ／２００μｌとなるよう、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて調製した。約３３日後に、移植腫瘍の直径が６－１０ｍｍに達した段階で、Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦの各ウイルスをＰＢＳにて１×１０^９ＰＦＵ／１００μｌに調整後、腫瘍内に単回注入し、継時的な腫瘍径の変化を評価した（図７）。Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦウイルス投与した各群の匹数は、それぞれ、ｎ＝１２、９、１１、１１、及び１２であった。腫瘍の大きさはデジタルノギスを使用し、週に２回測定した。腫瘍体積は、長軸（ｍｍ）×短軸（ｍｍ）×短軸（ｍｍ）×０．５（ｍｍ^３）にて算出した。データは平均値±標準誤差にて示し、各群間の統計学的有意差についてはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔにて検定した（＊，Ｐ＜０．０５ ｖｓ Ａｄ．ｄＥ１．３；＃，Ｐ＜０．０５ ｖｓ Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ）。

【0077】

その結果、治療した原発巣のがん細胞（結節）に対して、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡとＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ３種はいずれもコントロール（Ａｄ．ｄＥ１．３）と比較し、有意な（強力な）治療効果（腫瘍抑制効果）がみられた（図７）。また、ＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ３種はいずれも、治療遺伝子を搭載していないＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡと比較した結果、治療効果（腫瘍抑制効果）のさらなる「増強」が有意にみられた。

【0078】

（実施例７）担がんハムスターモデルにおけるｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染後の生存曲線
上記各ウイルス単回注入によるＨａＫ移植ハムスターの生存への影響をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法による生存曲線解析により評価した。各群間の統計学的有意差についてはｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔにて検定した。

【0079】

その結果、期間全体における有意な差はいずれのグループ間においても観察されなかった（図８）。しかしながら、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ感染群においては、感染後１０～２０日の間に死亡例が出現した（図８）。これらの剖検の結果、肺の浮腫・水腫、脾臓の肥大、腎臓の暗調、肝臓の白斑などを認め、死因はサイトカインの過剰発現に伴う免疫系の異常による全身性の致死性副作用という結果が病理学的解析で確定した。これらの実験の結果から、ＧＭ－ＣＳＦの最適な発現レベルの必要性が改めて確認された。つまり従来、「強活性プロモーター」として漠然と捉えられていたＣＡ，Ｅ２Ｆ，ＲＳＶなどのプロモーターにおいて、ＣＡはＥ２Ｆよりも非常に強いプロモーター活性を持ち、特に腫瘍溶解性ウイルスに搭載する免疫誘導遺伝子の制御においては、ＣＡプロモーターは致死性副作用をもたらす使用に適さないプロモーターであること、反対にＥ２Ｆプロモーターは中程度の発現を誘導するにもかかわらず、強力な治療効果を示しながらも高い安全性を担保する「最適（中等度）」プロモーターであることが、本実験で初めて明らかになった。つまり本実験で、「腫瘍溶解性ウイルスに搭載する免疫誘導遺伝子の制御における最適（中等度）プロモーターが存在する」という新概念の創出と、Ｅ２Ｆプロモーターで誘導される発現レベルがこのシステムで最適という具体的発明も創出された。

【0080】

（実施例８）ｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ治療後のハムスターに対するリチャレンジテスト
メス５週齢のＳｙｒｉａｎハムスターに１×１０^７個のＨａＫを背側に１カ所皮下移植した。その際、細胞は５０％マトリゲル中に１×１０^７ｃｅｌｌｓ／２００μｌとなるよう、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて調製した。約２８日後に、移植腫瘍の直径が６－１０ｍｍに達した段階で、Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦの各ウイルスをＰＢＳにて１×１０^９ＰＦＵ／１００μｌに調整後、腫瘍内に単回注入した。Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦウイルス投与した各群の匹数は、それぞれ、ｎ＝４、５、４、３、及び３であった。ウイルス注入の１４日後に、７．５×１０^６個のＨａＫ及びＨａＰ－Ｔ１をそれぞれ５０％マトリゲル中に７．５×１０^６ｃｅｌｌｓ／２００μｌとなるよう調製後、背側に皮下移植し、その１５日後に２次移植腫瘍の形成を評価した。

【0081】

結果を以下の表１に示す。ＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ３種治療群では、ＨａＫの再移植では腫瘍形成が認められず、一方ＨａＰ－Ｔ１移植では全例で腫瘍形成が認められた。コントロール（Ａｄ．ｄＥ１．３）及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ治療群では、ＨａＫ、ＨａＰ－Ｔ１のいずれの２次移植においても全例で腫瘍形成が認められた。以上の結果から、ｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ治療群においては、Ｅ２Ｆプロモーターなどの中程度のプロモーターを用いた場合にも、ＣＡなどの強力なプロモーターを用いた場合と同様にＨａＫ（治療されたがん細胞）特異的な全身性の抗腫瘍免疫が誘導され、転移がん細胞を強力に阻止（治療）できることが明らかになった。

【0082】

【表1】

【0083】

（実施例９）担がんハムスターモデルへのｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染後の組織内ｍＧＭ－ＣＳＦ発現量の検討
メス５週齢のＳｙｒｉａｎハムスターに１×１０^７個のＨａＫを背側に１カ所皮下移植した。その際、細胞は５０％マトリゲル中１×１０^７ｃｅｌｌｓ／２００μｌとなるよう、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて調製した。約４２日後に、移植腫瘍の直径が６－１０ｍｍに達した段階で、Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦの各ウイルスをＰＢＳにて１×１０^９ＰＦＵ／１００μｌに調整後、腫瘍内に単回注入した。その後２及び７日後に血清、腫瘍、脾臓を単離し、組織内ｍＧＭ－ＣＳＦ発現レベルをＥＬＩＳＡ法により検討した。ウイルス投与した各群の匹数は各Ｄａｙそれぞれ全てｎ＝３であった。データは平均値±標準誤差にて示し、各群間の統計学的有意差についてはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔにて検定した（＊，Ｐ＜０．０５ ｖｓ Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ；＃，Ｐ＜０．０５ ｖｓ Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ）。

【0084】

その結果、ＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ３種はいずれもコントロール（Ａｄ．ｄＥ１．３）に比べ有意なｍＧＭ－ＣＳＦ発現レベルが観察された（図９）。特に、ＣＡプロモーターでのＤａｙ２におけるＳｅｒｕｍ内でのｍＧＭ－ＣＳＦ発現量は他の２つのプロモーターと比較して１０００倍以上の高値を示した。よってこの結果は、図８で観察されたＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ感染群における初期の死亡例の原因がサイトカインの過剰発現による異常な病的レベルの全身性の免疫活性化によるものであることを、さらに明確に立証したものである。驚くべきことに、Ｅ２Ｆプロモーターは、血清、腫瘍、脾臓のいずれにおいても５日目には検出限界より低い量のＧＭ－ＣＳＦしか存在しない程度の発現をもたらすにもかかわらず、上述の通り高い抗腫瘍活性、生存期間延長などの効果を発揮することが見出された。

【0085】

（実施例１０）同所移植（Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）担がんハムスターモデルにおけるｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染後の生存曲線
１×１０^７個のハムスター腎がん由来ＨａＫをメス５週齢のＳｙｒｉａｎハムスターの片側腎臓へ移植した。その際、細胞は５０％マトリゲル中に１×１０^７ｃｅｌｌｓ／２００μｌとなるよう、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて調製した。約１４日後に、Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦの各ウイルスをＰＢＳにて１×１０^９ＰＦＵ／１００μｌに調整後、腫瘍を移植した側の腎臓内に単回注入した。その後、同所移植担がんハムスターモデルにおける上記各ウイルス単回注入による生存への影響をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法による生存曲線解析により評価した。各群間の統計学的有意差についてはｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔにて検定した。

【0086】

その結果、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ群においては、皮下腫瘍モデルと同様、感染後５～１０日の間（治療早期）にサイトカインの過剰発現に伴う全身性の病的（異常）免疫活性の副作用を原因とする死亡例が出現し、Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ群と比較し、有意に生存率が短縮、つまり死亡率が上昇した。興味深いことに、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦを投与した群は、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ群に対してのみならず、Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ：非増殖型アデノルイス）及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ（治療遺伝子未搭載）群と比較しても、非常に著明で有意な生存延長を認めた。ただし、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ群とＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ群との間に有意な差は観察されなかった。特に注意すべきこととして、（単純で簡易な実験系で一般に用いられる）皮下腫瘍モデルでの腫瘍増大の抑制効果だけでは、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦの治療効果の差に有意差はない一方で、実際のヒトの臨床で最終的ながん治療薬の有用性を評価できる、病態を反映する同所性腫瘍モデルでの長期生存率の解析では、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦ及びＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＲＳＶｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦは非常に高い有効性を示し、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／ＣＡｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦではむしろ悪い（致死性で危険）という結果が、本発明で初めて明らかになったことである。さらに、図９にも示される通り、ＲＳＶプロモーターはＣＡプロモーターよりは低い発現であるものの、５日目に脾臓で検出されるレベルのＧＭ－ＣＳＦを発現させており、生存には表れていない副作用をもたらしている可能性がある。よって腫瘍溶解性ウイルスに免疫誘導遺伝子を搭載する場合、最適な発現レベルは安全性の劇的向上のみならず、さらに治療効果そのものも増強することは、本実験で初めて明らかになった。さらに、最適な発現レベルを達成できるプロモーターはＥ２Ｆプロモーター及びその発現レベルと同等の発現レベルをもたらすプロモーターであることも、初めて明らかになった。

【0087】

（実施例１１）同所移植（Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）担がんハムスターモデルにおけるｍＧＭ－ＣＳＦ発現Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ感染及び抗ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１抗体投与後の生存曲線比較
１×１０^７個のハムスター腎がん由来ＨａＫをメス５週齢のＳｙｒｉａｎハムスターの片側腎臓へ移植した。その際、細胞は５０％マトリゲル中に１×１０^７ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるよう、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて調製した。約１４日後に、Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、あるいはＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐ－ｍＧＭ－ＣＳＦの各ウイルスをＰＢＳにて１×１０９ＰＦＵ／１００μＬに調整後、腫瘍を移植した側の腎臓内に単回注入した。さらに、同日に５００μｇの抗ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１抗体、あるいはＩｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ抗体をそれぞれ腹腔内投与した。この日をＤａｙ０とし、同量の同抗体をＤａｙ２、４、６、８にも同様に投与した。その後、生存への影響を同様に解析した。

【0088】

その結果、Ｓｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡ／Ｅ２Ｆｐｒ－ｍＧＭ－ＣＳＦ群（Ｎ＝１４）においては、Ａｄ．ｄＥ１．３（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群（Ｎ＝１７）と比較し、有意に生存率が延長、つまり死亡率が低下した。さらに、抗ｍｏｕｓｅ ＰＤ－１抗体投与群（Ｎ＝１７）と比較しても同等かそれ以上の生存率延長の傾向を示した。

【0089】

これらすべての実施例の結果をまとめると、本発明において、「腫瘍溶解性免疫治療剤（免疫誘導遺伝子を搭載した腫瘍溶解性ウイルス）においては、ウイルスと一緒に搭載された免疫誘導遺伝子も増幅するため、免疫誘導因子の最適な発現レベルを精密に制御することが、劇的な安全性の確保（致死性副作用の除去）、そして強力な治療効果の誘導の、両方の目的に必須である」、という概念自体が、初めて創出された。「安全性」の面でも本概念を明確に表したものはこれまでなかったのみならず、「劇的な治療効果の増強」という点ではさらに本概念を示唆したものは全くなく、むしろ漠然とした根拠のない定説（治療遺伝子は発現増強した方が治療効果自体は上昇する）を覆すものともいえる。また本発明において、安全性と治療効果の両面ともの、腫瘍溶解性ウイルスにおける免疫誘導遺伝子の「最適（中等度）」発現を誘導するプロモーターも具体的に明らかにし、従来の腫瘍溶解性免疫治療剤を安全性と治療効果の両面で凌ぐ性能を持つ画期的な癌治療薬を創出した。治療遺伝子を搭載していないＳｕｒｖ．ｍ－ＣＲＡにおいても、これまでの発明者の医師主導治験において、非常に安全なだけでなく、これまで標準治療（これまでの癌治療薬や癌治療法）が無効だった難治性がんの全例で治療効果を認めている（ヒトの患者で実際に証明されつつある）ことから、本発明で創出された新たな腫瘍溶解性免疫治療剤とその方法は、さらに有望な革新的な癌治療薬となるものと期待される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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