知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ セミニス・ベジタブル・シーズ・インコーポレイテツドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-12
(45)【発行日】2023-05-22
(54)【発明の名称】ホウレンソウにおけるペロノスポラ耐性のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A01H 6/02 20180101AFI20230515BHJP
A01H 1/02 20060101ALI20230515BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20230515BHJP
A01H 5/02 20180101ALI20230515BHJP
A01H 5/04 20180101ALI20230515BHJP
A01H 5/06 20180101ALI20230515BHJP
A01H 5/10 20180101ALI20230515BHJP
A01H 5/12 20180101ALI20230515BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20230515BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20230515BHJP
C12N 15/00 20060101ALN20230515BHJP
【ＦＩ】
A01H6/02
A01H1/02 Z
A01H5/00 Z
A01H5/02
A01H5/04
A01H5/06
A01H5/10
A01H5/12
C12N5/04
C12Q1/68
C12N15/00 ZNA
【請求項の数】
9
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020177569
(22)【出願日】2020-10-22
(62)【分割の表示】P 2015036977の分割
【原出願日】2015-02-26
(65)【公開番号】P2021019623
(43)【公開日】2021-02-18
【審査請求日】2020-11-04
(31)【優先権主張番号】61/945,675
(32)【優先日】2014-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【微生物の受託番号】ATCC PTA-12486
【微生物の受託番号】ATCC PTA-12041
【微生物の受託番号】ATCC PTA-120472
【微生物の受託番号】ATCC PTA-120473
【微生物の受託番号】ATCC PTA-120474
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】500195035
【氏名又は名称】セミニス・ベジタブル・シーズ・インコーポレイテツド
【氏名又は名称原語表記】Ｓｅｍｉｎｉｓ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｓｅｅｄｓ，Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】バルト・ウィレム・ブルフマンス
(72)【発明者】
【氏名】ジョン・メーウセン
(72)【発明者】
【氏名】クラウディア・ノーイェン
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００５５４２２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１９８８８２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１３／０６４４３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００５３２９３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２１２７２６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／００５５４５６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Plant Disease，2014年01月，Vol.98，p.145-152
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ０１Ｈ １／００－１７／００
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与えるアレルのヘテロ接合性の組み合わせをゲノム内に含み、前記アレルはアレルＣ及びアレルＶｔである、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物であって、アレルＶｔは前記植物のゲノム内に配列番号３、６、８、１１、１４、１７、２０または２３の一つ以上が存在することによって特徴づけられ、
アレルＣは前記植物のゲノム内に配列番号１２、１５、１８または２１の一つ以上が存在することによって特徴づけられ、
前記アレルＣ及びアレルＶｔは、各々、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２４８６及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４１として寄託された種子と遺伝源を共有している、前記植物。
【請求項2】
前記広範な耐性が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の少なくとも１０レースに対する耐性を含む、請求項１記載のホウレンソウ植物。
【請求項3】
前記植物が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース７、８、１０、１１、１２、１３、及び分離菌ＵＡ４７１２に対して耐性である、請求項２記載のホウレンソウ植物。
【請求項4】
請求項１記載の植物を産出する種子。
【請求項5】
前記植物は、葉、茎、根、花、又は細胞である、請求項１記載の植物の植物部位。
【請求項6】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性をホウレンソウ植物に導入する方法であって：（ａ）アレルＶｔ及びアレルＣから選択される第１のアレルをゲノム内に含む第１のホウレンソウ植物を、アレルＶｔ及びアレルＣから選択される第２の異なるアレルをゲノム内に含む第２のホウレンソウ植物と交配することであって、
アレルＶｔは前記植物のゲノム内に配列番号３、６、８、１１、１４、１７、２０または２３の一つ以上が存在することによって特徴づけられ、
アレルＣは前記植物のゲノム内に配列番号１２、１５、１８または２１の一つ以上が存在することによって特徴づけられ、
前記アレルＣ及びアレルＶｔは、各々、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２４８６及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４１として寄託された種子と遺伝源を共有している交配；
（ｂ）後代植物のゲノム内に、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３から成る群から選択されるＤＮＡ配列の存在を検出することによって、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性のための前記第１のアレルを含む少なくとも１つの後代植物を選択することを含む、方法。
【請求項7】
前記交配が後代植物の集団を生成することを含む、請求項６記載の方法。
【請求項8】
配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３から成る群から選択される少なくとも２つの核酸配列の存在について後代植物をスクリーニングすることを含む、請求項６記載の方法。
【請求項9】
請求項６記載の方法によって生産された、アレルＣおよびアレルＶｔを含む植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植物育種分野に関し、詳しくは、べと病に対する耐性を備えたホウレンソウ植物を生産するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
べと病は、植物病原菌Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）が引き起こすものであり、ホウレンソウ、特に最も一般的な栽培ホウレンソウ種であるＳｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａにとって、世界全体で経済的に重要な病気となっている。現在、べと病（ＤＭ）の原因となる病原体は、１４レースが公的に認められているが、新たな分離菌が今でも毎年発見及び命名されている。これまで、ホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性は、不完全且つレース特異的であると考えられてきた。したがって、病原体の新たな株がホウレンソウ植物の耐性を克服する能力のため、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する有効なレベルの耐性を備えたホウレンソウ変種の開発は困難になると共に、その重要性が更に高まりつつある。
【発明の概要】
【0003】
一態様において、本発明は、本明細書に記載のアレルＡをゲノム内に含むＳｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物を提供する。他の態様において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与えるアレルのヘテロ接合性の組み合わせをゲノム内に含むＳｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物を提供する。一実施形態において、広範な耐性は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の少なくとも１０レースに対する耐性を含む。他の実施形態において、広範な耐性を与えるアレルの組み合わせは、アレルＡ、アレルＶｔ、及びアレルＣから成る群から選択されたアレルの組み合わせである。他の実施形態において、アレルの組み合わせは、アレルＡ及びＣを含み、植物は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース７、８、１０、１１、１２、１４、及び分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を有し、アレルの組み合わせは、アレルＡ及びＶｔを含み、植物は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース７、８、１０、１１、１２、１３、及び１４に対する耐性を有し、或いは、アレルの組み合わせは、アレルＣ及びＶｔを含み、植物は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース７、８、１０、１１、１２、１３、及び分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を有する。他の実施形態において、アレルＡ、アレルＣ、及びアレルＶｔを含む種子の代表試料は、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４７２、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２４８６、及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４１として寄託されている。他の実施形態において、アレルＡ、アレルＣ、及び／又はアレルＶｔは、配列番号：１乃至２５の群から選択された少なくとも１つの配列と遺伝的に連鎖する。
【0004】
他の実施形態において、本発明の植物は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４７２、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２４８６、又はＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４１として寄託された種子と遺伝源を共有するアレルＡ、アレルＣ、及び／又はアレルＶｔを含む。他の実施形態において、本発明の植物は、インブレッド又はハイブリッドにし得る。更に他の実施形態において、本発明は、このような植物、又はこのような植物の植物部位を産生する種子を提供する。他の実施形態において、植物部位は、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、雌蘂、花、細胞、及び茎から成る群から選択される。更に他の実施形態において、本発明は、こうしたホウレンソウ植物の収穫された葉を含む食品を提供する。
【0005】
他の態様において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与えるアレルのヘテロ接合性の組み合わせをゲノム内に含むＳｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物を提供し、一方のアレルは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース７及び１３に対する劣性耐性を与える。一実施形態において、広範な耐性は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の少なくとも１０レースに対する耐性を含む。他の実施形態において、一方のアレルはアレルＶｔ、他方のアレルはアレルＣであり、又は一方のアレルはアレルＡ、他方はアレルＶｔであり、又は一方のアレルはアレルＡ、他方はアレルＣである。
【0006】
他の態様において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を備えたホウレンソウ植物を生産する方法であって、（ａ）Ａ、Ｖｔ、及びＣから成る群から選択された第１のアレルをゲノム内に含む第１のホウレンソウ植物を、Ａ、Ｖｔ、及びＣから成る群から選択された第２のアレルをゲノム内に含む第２のホウレンソウ植物と交配させ、ハイブリッド後代植物の個体群を生産することと、（ｂ）Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与える前記第１のアレルと前記第２のアレルとの組み合わせを含む前記個体群から、少なくとも１つのハイブリッド後代植物を選択することと、を含む方法を提供する。一実施形態において、方法は、更に、ハイブリッド植物の個体群の生産を含む。他の実施形態において、第１のホウレンソウ植物はアレルＡ、第２のホウレンソウ植物はアレルＣを含み、又は第１のホウレンソウ植物はアレルＡ、第２のホウレンソウ植物はアレルＶｔを含み、又は第１のホウレンソウ植物はアレルＣ、第２のホウレンソウ植物はアレルＶｔを含む。他の実施形態において、本発明は、こうした方法により生産されたハイブリッド後代植物を提供する。更に他の実施形態において、植物の第１のアレルはアレルＡ、第２のアレルはアレルＣであり、又は第１のアレルはアレルＡ、第２のアレルはアレルＶｔであり、又は第１のアレルはアレルＣ、第２のアレルはアレルＶｔである。
【0007】
他の態様において、本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性をホウレンソウ植物に導入する方法であって、（ａ）Ａ、Ｖｔ、及びＣから成る群から選択された第１のアレルをゲノム内に含む第１のホウレンソウ植物を、第２の別個のアレルをゲノム内に含む第２のホウレンソウ植物と交配させることと、（ｂ）Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性について、前記第１のアレルを含む少なくとも１つの後代植物を、配列番号：１乃至２５から選択された配列の、植物ゲノム内における存在に基づいて選択することと、を含む方法を提供する。他の実施形態において、方法は、前記植物のゲノムにおいて、配列番号：１乃至２５から成る群から選択された少なくとも２つの多型核酸配列を検出することを含み、多型核酸配列の存在は、アレルＡ、Ｖｔ、及びＣから選択されたＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性を与える少なくとも２つのアレルが植物に存在することを示す。
【0008】
更に他の態様において、本発明は、アレルＡ、Ｖｔ、及びＣのうちの異なるアレルに関連する少なくとも２つの多型ＤＮＡ配列を含むホウレンソウ植物、細胞、又は細胞含有植物部位を提供する。一実施形態において、提供されるホウレンソウ植物、細胞、又は細胞含有植物部位は、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）として指定されたもののうち異なる群において表される少なくとも２つのＤＮＡ配列を含み、前記群は、次のように構成される：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含むＤＮＡ配列、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含むＤＮＡ配列、及び（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含むＤＮＡ配列。本発明は、更に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１乃至２５から成る群から選択されたＤＮＡ配列を提供する。
本発明は一態様において、以下を提供する。
[項目１]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与えるアレルのヘテロ接合性の組み合わせをゲノム内に含み、前記アレルはアレルＣ及びアレルＶｔである、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物。
[項目２]
前記広範な耐性が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の少なくとも１０レースに対する耐性を含む、項目１記載のホウレンソウ植物。
[項目３]
前記植物が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース７、８、１０、１１、１２、１３、及び分離菌ＵＡ４７１２に対して耐性である、項目２記載のホウレンソウ植物。
[項目４]
前記アレルＣ及びアレルＶｔは、各々、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２４８６及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４１として寄託された種子と遺伝源を共有している、項目３記載のホウレンソウ植物。
[項目５]
耐性は、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～２５から成る群から選択された少なくとも１つの配列と遺伝的に連鎖する、項目３記載のホウレンソウ植物。
[項目６]
項目１記載の植物を産出する種子。
[項目７]
前記植物は、葉、茎、根、花、又は細胞である、項目１記載の植物の植物部位。
[項目８]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を備えたホウレンソウ植物の種子を生産する方法であって、
（ａ）第１のホウレンソウ植物を第２のホウレンソウ植物と交配させることと、前記第１のホウレンソウ植物および第２のホウレンソウ植物はアレルＶｔ又はアレルＣから選択される少なくとも２つのアレルを集合的に含み、
（ｂ）Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与える前記アレルのヘテロ接合性の組み合わせを含む、前記交配により生じた少なくとも第１の種子を取得することと、を含む方法。
[項目９]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与える前記アレルのヘテロ接合性の組み合わせを含む、前記交配により生じた種子の集合を得ることをさらに含む、項目８記載の方法。
[項目１０]
項目８記載の方法であって、
（ａ）前記第１のホウレンソウ植物がアレルＣを含み、前記第２のホウレンソウ植物がアレルＶｔを含む；
（ｂ）前記第１のホウレンソウ植物又は前記第２のホウレンソウ植物がアレルＶｔ又はアレルＣにホモ接合性である；又は
（ｃ）前記第１のホウレンソウ植物又は前記第２のホウレンソウ植物がアレルＶｔ又はアレルＣから成る群から選択される前記２つのアレルにホモ接合性である
である方法。
[項目１１]
項目８記載の方法により生産された種子。
[項目１２]
第１のアレルがアレルＣであり、第２のアレルがアレルＶｔである、項目１１記載の種子。
[項目１３]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性をホウレンソウ植物に導入する方法であって：
（ａ）アレルＶｔ及びアレルＣから選択される第１のアレルをゲノム内に含む第１のホウレンソウ植物を、第２の異なるアレルをゲノム内に含む第２のホウレンソウ植物と交配し；
（ｂ）後代植物のゲノム内に、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～２５から成る群から選択されるＤＮＡ配列の存在を検出することによって、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性のための前記第１のアレルを含む少なくとも１つの後代植物を選択することを含む、方法。
[項目１４]
前記交配が後代植物の集団を生成することを含む、項目１３記載の方法。
[項目１５]
配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～３５から成る群から選択される少なくとも２つの核酸配列の存在について後代植物をスクリーニングすることを含む、項目１３記載の方法。
[項目１６]
項目１３記載の方法によって生産された植物。
[項目１７]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性を与える望ましいアレルを含む植物を同定する方法であって、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～２５から成る群から選択されるＤＮＡ配列を前記植物のゲノム内で検出することを含む方法。
[項目１８]
前記植物のゲノム内で、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～２５から成る群から選択される少なくとも２つの多型核酸配列を検出することをさらに含み、多型核酸配列の存在が、アレルＶｔ及びアレルＣから選択されるＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性を与える少なくとも２つのアレルが植物に存在することの指標である、項目１７記載の方法。
[項目１９]
項目１７記載の方法によって得られた植物。
[項目２０]
下記（ａ）及び（ｂ）に示される異なる群に示す少なくとも２つのＤＮＡ配列を含む植物部位を含むホウレンソウ植物、細胞又は細胞を含む植物部位：
（ａ）配列番号：１、配列番号：４、列番号：９、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１８又は配列番号：２１を含むＤＮＡ配列；及び
（ｂ）配列番号：３、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：１７、配列番号：２０又は配列番号：２３を含むＤＮＡ配列。
本発明は一態様において、以下を提供する。
[項目１]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与えるアレルのヘテロ接合性の組み合わせをゲノム内に含み、前記アレルはアレルＣ及びアレルＶｔである、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物。
[項目２]
前記広範な耐性が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の少なくとも１０レースに対する耐性を含む、項目１記載のホウレンソウ植物。
[項目３]
前記植物が、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース７、８、１０、１１、１２、１３、及び分離菌ＵＡ４７１２に対して耐性である、項目２記載のホウレンソウ植物。
[項目４]
前記アレルＣ及びアレルＶｔは、各々、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２４８６及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４１として寄託された種子と遺伝源を共有している、項目３記載のホウレンソウ植物。
[項目５]
耐性は、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～２５から成る群から選択された少なくとも１つの配列と遺伝的に連鎖する、項目３記載のホウレンソウ植物。
[項目６]
項目１記載の植物を産出する種子。
[項目７]
前記植物は、葉、茎、根、花、又は細胞である、項目１記載の植物の植物部位。
[項目８]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を備えたホウレンソウ植物の種子を生産する方法であって、
（ａ）第１のホウレンソウ植物を第２のホウレンソウ植物と交配させることと、前記第１のホウレンソウ植物および第２のホウレンソウ植物はアレルＶｔ又はアレルＣから選択される少なくとも２つのアレルを集合的に含み、
（ｂ）Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与える前記アレルのヘテロ接合性の組み合わせを含む、前記交配により生じた少なくとも第１の種子を取得することと、を含む方法。
[項目９]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範な耐性を与える前記アレルのヘテロ接合性の組み合わせを含む、前記交配により生じた種子の集合を得ることをさらに含む、項目８記載の方法。
[項目１０]
項目８記載の方法であって、
（ａ）前記第１のホウレンソウ植物がアレルＣを含み、前記第２のホウレンソウ植物がアレルＶｔを含む；
（ｂ）前記第１のホウレンソウ植物又は前記第２のホウレンソウ植物がアレルＶｔ又はアレルＣにホモ接合性である；又は
（ｃ）前記第１のホウレンソウ植物又は前記第２のホウレンソウ植物がアレルＶｔ又はアレルＣから成る群から選択される前記２つのアレルにホモ接合性である
である方法。
[項目１１]
項目８記載の方法により生産された種子。
[項目１２]
第１のアレルがアレルＣであり、第２のアレルがアレルＶｔである、項目１１記載の種子。
[項目１３]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性をホウレンソウ植物に導入する方法であって：
（ａ）アレルＶｔ及びアレルＣから選択される第１のアレルをゲノム内に含む第１のホウレンソウ植物を、第２の異なるアレルをゲノム内に含む第２のホウレンソウ植物と交配し；
（ｂ）後代植物のゲノム内に、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～２５から成る群から選択されるＤＮＡ配列の存在を検出することによって、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性のための前記第１のアレルを含む少なくとも１つの後代植物を選択することを含む、方法。
[項目１４]
前記交配が後代植物の集団を生成することを含む、項目１３記載の方法。
[項目１５]
配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～３５から成る群から選択される少なくとも２つの核酸配列の存在について後代植物をスクリーニングすることを含む、項目１３記載の方法。
[項目１６]
項目１３記載の方法によって生産された植物。
[項目１７]
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性を与える望ましいアレルを含む植物を同定する方法であって、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～２５から成る群から選択されるＤＮＡ配列を前記植物のゲノム内で検出することを含む方法。
[項目１８]
前記植物のゲノム内で、配列番号：１、３、４、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１及び２３～２５から成る群から選択される少なくとも２つの多型核酸配列を検出することをさらに含み、多型核酸配列の存在が、アレルＶｔ及びアレルＣから選択されるＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する耐性を与える少なくとも２つのアレルが植物に存在することの指標である、項目１７記載の方法。
[項目１９]
項目１７記載の方法によって得られた植物。
[項目２０]
下記（ａ）及び（ｂ）に示される異なる群に示す少なくとも２つのＤＮＡ配列を含む植物部位を含むホウレンソウ植物、細胞又は細胞を含む植物部位：
（ａ）配列番号：１、配列番号：４、列番号：９、配列番号：１２、配列番号：１５、配列番号：１８又は配列番号：２１を含むＤＮＡ配列；及び
（ｂ）配列番号：３、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１１、配列番号：１４、配列番号：１７、配列番号：２０又は配列番号：２３を含むＤＮＡ配列。
【0009】
配列表の簡単な説明
配列番号：１ － スキャフォールドＳＦ６３８１５に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２ － スキャフォールドＳＦ６３８１５に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：３ － スキャフォールドＳＦ６３８１５に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：４ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：５ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：６ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：７ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：８ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：９ － スキャフォールドＳＦ９５４８７に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１０ － スキャフォールドＳＦ９５４８７に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１１ － スキャフォールドＳＦ９５４８７に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１２ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１３ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１４ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１５ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１６ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１７ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１８ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１９ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２０ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２１ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２２ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２３ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２４ － スキャフォールドＳＦ６２７４９のアレルＡ、Ｃ、及びＶｔに対応するＤＮＡ配列。
配列番号：２５ － スキャフォールドＳＦ１７８６３７のアレルＡ、Ｃ、及びＶｔに対応するＤＮＡ配列。
配列番号：１ － スキャフォールドＳＦ６３８１５に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２ － スキャフォールドＳＦ６３８１５に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：３ － スキャフォールドＳＦ６３８１５に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：４ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：５ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：６ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：７ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：８ － スキャフォールドＳＦ５９００２に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：９ － スキャフォールドＳＦ９５４８７に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１０ － スキャフォールドＳＦ９５４８７に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１１ － スキャフォールドＳＦ９５４８７に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１２ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１３ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１４ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１５ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１６ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１７ － スキャフォールドＳＦ９０９０６に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１８ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：１９ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２０ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２１ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＣを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２２ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＡを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２３ － スキャフォールドＳＦ３４７３２に対応し、アレルＶｔを判定するＤＮＡ配列。
配列番号：２４ － スキャフォールドＳＦ６２７４９のアレルＡ、Ｃ、及びＶｔに対応するＤＮＡ配列。
配列番号：２５ － スキャフォールドＳＦ１７８６３７のアレルＡ、Ｃ、及びＶｔに対応するＤＮＡ配列。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、べと病（ＤＭ）に対する耐性を備えたホウレンソウ変種の開発のための方法及び組成物を提供する。本発明は、Ａ、Ｖｔ、及びＣと命名された、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａの３つの別個のアレルの同定を提供する。これらのアレルは、ＤＭに対する独自の広範な耐性を備えたホウレンソウ植物を得るために、様々な組み合わせで用いることができる。
【0012】
３つのアレルは、ホウレンソウ系統ＳＭＢＳ０１１－１１６２ＭからＡ、ＳＭＢ－６６－１１４３ＭからＣ、及びＳＳＢ－６６－１１３１ＭからＶｔとして定めたものであり、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａにおいて同定され、既存及び新たなＤＭ株に対する耐性をもたらすことが発見された。各アレルは、特定の１組のレース及び／又は分離菌に対する耐性を有することが発見された。アレルは、様々な組み合わせで、所望のＤＭ耐性を備えたハイブリッドを作成するために用いることができる。
【0013】
本明細書で更に詳細に示すように、アレルＣは、レース１、２、３、４、５、６、７、８、１０と、新たに発見された、レース１５の候補株であるＰｆｓ分離菌ＵＡ４７１２とに対する耐性を与えることが分かった。アレルＡは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ（Ｐｆｓ）レース１、３、５、７、８、１１、１２、１３、及び１４に対する耐性を与えることが分かった。レース７及び１３に対する耐性は、殆どのＤＭレースとは異なり、劣性遺伝する。アレルＶｔは、レース１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、及び１３に対する耐性を与えることが分かった。これらの新たに特徴付けされたアレルは、新規のヘテロ接合性の組み合わせで用いて、幅広いＤＭ耐性を備えたホウレンソウ植物を得ることができる。ホウレンソウ植物は、インブレッド植物及び／又はハイブリッド植物にしてよく、本明細書に記載のアレルの様々な組み合わせを含むことができる。
【0014】
例えば、本発明の一実施形態によれば、アレルＣ及びＶｔは、ホウレンソウ植物（即ち、ヘテロ接合型ホウレンソウ植物）に存在し、Ｐｆｓレース１乃至８、１０乃至１３、及び新たに発見されたＰｆｓ分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性をもたらすことができる。他の実施形態において、アレルＡ及びＶｔは、ホウレンソウ植物に存在し、Ｐｆｓレース１乃至８及び１０乃至１４に対する耐性をもたらすことができる。アレルＶｔは、アレルＡによる劣性耐性を補完する。同様に、アレルＡ及びＣが共にホウレンソウ植物に存在する場合、植物は、Ｐｆｓレース１乃至８、１０乃至１２、１４、及びＵＡ４７１２に対して耐性となる。アレルは、任意の組み合わせで利用して、特定の市場又は領域に対して所望の耐性を提供することができる。例えば、アレルＣ及びＶｔを有するハイブリッドは、Ｐｆｓ１４を除く全てのＰｆｓレースに対する耐性を示す。Ｐｆｓレース１４は、欧州では発生しないため、このハイブリッドは、その地勢において完全な耐性を有することになる。他の例として、アレルＡ及びＶｔを有するハイブリッドは、分離菌ＵＡ４７１２を除く全てのＰｆｓレースに対する耐性を示す。新たな分離菌ＵＡ４７１２が見つかっている場所は限られているため、このハイブリッドは、多くの地域で完全な耐性を有する。
【0015】
更に他の実施形態において、記載した全てのＤＭレース及び分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を有する３元ハイブリッドが考えられる。本発明によれば、限定ではないが、Ａ、Ｃ、及びＶｔを含む本明細書に記載の１つ又は２つのアレルを含むホウレンソウ植物は、限定ではないが、Ａ、Ｃ、及びＶｔを含む第２又は第３のアレルを含む第２の別個のホウレンソウ植物と交配させ、有益な１組の本明細書に記載のアレルを含むハイブリッドホウレンソウ植物を生産することができる。
【0016】
本明細書において更に説明するように、アレルは、ＤＭに対する所望の耐性をもたらす任意の組み合わせで、選択されたホウレンソウ変種に移入することができる。本発明によれば、こうしたＤＭに対する耐性を与えるアレルは、特定のホウレンソウ変種又は栽培品種における任意の所望のゲノム的背景に移入し得る。例えば、本発明による所定のＤＭ耐性アレルを含む開始ホウレンソウ植物を、十分な世代数に亘り自花受精させ、ＤＭに対する耐性を与えるアレルについてホモ接合型であるインブレッドホウレンソウ変種を生産することができる。こうしたインブレッド植物は、その後、別個のＤＭ耐性アレルを含む他のホウレンソウ植物と交配させ、本明細書に記載した、ＤＭに対する望ましい耐性を与えるアレルの組み合わせを含むホウレンソウインブレッド又はハイブリッドを安定的に生産し得る。本発明によるＤＭに対する耐性を示すホウレンソウ植物は、更に、他のホウレンソウ植物と交配させ、本発明による選択を行うことにより、本明細書に記載のアレルの任意の所望の組み合わせを備えた新しいＤＭ耐性ホウレンソウインブレッド又はハイブリッドを取得し得る。
【0017】
ＤＭの特定のレースに対する耐性を与える他のアレルは、ホウレンソウにおいて以前から同定されているが、こうしたアレルは、ハイブリッドの組み合わせであっても、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓｅ（Ｐｆｓ）の一部のレースに対する耐性しか付与していない。ＤＭに対する非宿主耐性も、Ｓｐｉｎａｃｉａ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ及びＳｐｉｎａｃｉａ ｔｅｔｒａｎｄｒａ等のホウレンソウの近縁野生種において発見される場合がある。しかしながら、近縁野生種由来の遺伝子は、収量及び品質を含む商業的特性にとって負のドラッグをもたらす場合が多い。近縁野生種に見られる好ましくないアレルは、ＤＭ耐性アレルと共にエリート生殖質に導入される場合が多い。本発明は、レース特異的且つ広範なＤＭ耐性を提供する、新規のＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ耐性源、アレル、及びマーカを記載する。
【0018】
本発明の一実施形態において、ＤＭに対する耐性を与えるアレルＡ、Ｃ、及びＶｔは、遠位位置において配列スキャフォールドＳＦ３４７３２及びＳＦ６３８１５、近位位置においてＳＦＳＦ５９００２、ＳＦ９５４８７、及びＳＦ９０９０６内の共通のマーカにより、ホウレンソウ第６連鎖群に存在するものとして定義し得る。耐性アレルに関連する判定用のヌクレオチド配列は、配列番号：１乃至２５に記載している。アレルＡ、Ｃ、及びＶｔ間の多型は、図３に示している。他の実施形態において、ＤＭに対する広範な耐性を提供するアレルは、種子の代表寄託物がＡＴＣＣにより受託番号ＰＴＡ－１２０４７２、ＰＴＡ－１２４８６、及びＰＴＡ－１２０４１の下でそれぞれ作成された系統種ＳＭＢＳ０１１－１１６２Ｍ、ＳＭＢ－６６－１１４３Ｍ、及びＳＳＢ－６６－１１３１Ｍから選択された遺伝源に由来するか、又はこれを共有するものとして定義し得る。
【0019】
本発明は、更に、ＤＭに対する広範な耐性を備えたホウレンソウ植物を生産する方法と、こうした方法により作成されたホウレンソウ植物及びその部位とを提供する。一実施形態において、核酸配列又はゲノムマーカを用いて、本発明によるアレルを同定し得る。これらの核酸配列は、本発明によるＤＭ耐性付与アレルと、ホウレンソウゲノムにおいて遺伝的に連鎖する多型又はマーカの同定において使用し得る。本発明は、更に、こうした植物と、その生産方法とに由来する食品を提供する。
【0020】
本発明のＤＭ耐性アレルと連鎖不平衡となる遺伝子マーカにより、基本的には任意のホウレンソウゲノムにＤＭ耐性を効率的に導入することが可能となり得る。また、これにより、コストが高く、時間集約的で、信頼性が低くなる恐れのある表現型アッセイの代用が可能となることで、大幅な経済化がもたらされる。更に、特定の遺伝子型を標的とすることにより、特定の良好な表現型の頻度を明示的に操作するように育種プログラムを設計することができる。こうした関連性の忠実度を継続的に監視することにより、予測能力が維持された状態が確保され、したがって、情報に基づく育種決定を保証し得る。
【0021】
本発明によれば、当業者は、本明細書に記載の系統種等から、望ましいＤＭ耐性表現型を有する候補生殖質源を同定し得る。本発明の一実施形態は、任意の付加的なホウレンソウ系統種から、ＤＭに対する広範な耐性を与えるアレルを取得するために、本発明の材料及び方法を用いることを含む。限定ではないが、ホウレンソウ第６染色体由来の配列スキャフォールドを含め、本明細書に記載の情報を用いることで、ＤＭ耐性を、他の任意のホウレンソウ変種に移入することができる。
【0022】
ホウレンソウ育種プログラムにおけるホウレンソウ変種の開発では、一般に、ホモ接合型インブレッド系統の開発と、これらの系統の交配と、結果的に生じたハイブリッド植物の評価とが必要となる。ホウレンソウ育種プログラムでは、２つ以上のインブレッド系統又は他の様々な生殖質源由来の遺伝的背景を組み合わせて、育種個体群としたものから、自家受粉と所望の表現型の選択とにより、新たなインブレッド系統を開発する。ハイブリッドも、植物育種材料のソースとして、或いは新たなホウレンソウ系統を開発又は導出するソース個体群として用いることができる。当該技術分野において公知であり、ホウレンソウ育種プログラムにおいて用いられる植物育種手法には、限定ではないが、循環選択、戻し交配、倍加半数体、家系育種、遺伝子マーカ強化選択、及び形質転換が含まれる。多くの場合、こうした手法の組み合わせが用いられる。したがって、ハイブリッド由来のインブレッド系統は、上述した植物育種手法を用いて開発することができる。新たなインブレッド系統は、他のインブレッド系統と交配させることが可能であり、こうした交配によるハイブリッドを評価して、そのうちどれが商業的可能性を有するかを判定する。
【0023】
本発明の手法は、望ましい耐病性表現型を、こうした表現型を与えるアレル又は座位に遺伝的に連鎖する遺伝子マーカを同定することにより同定するために使用し得る。本発明によれば、当業者は、例えば、ホウレンソウゲノムにおけるＳＮＰ及び／又はインデルに基づいた分子マーカアッセイを開発し得る。一実施形態において、本発明によるＤＭ耐性ホウレンソウ植物の同定に有用な分子マーカアッセイは、ホウレンソウ第６染色体由来の配列スキャフォールドに基づいて設計し得る。こうした手法には、所望の植物を同定する表現型アッセイを単体で、或いは遺伝的アッセイと組み合わせて含めることにより、本明細書に記載の方法による新たな変種の生産に使用し得る形質に関連するマーカ遺伝子型を更に同定し得る。
【0024】
本発明は、ＤＭに対する耐性を与えるアレルの組み合わせを含む栽培ホウレンソウ植物の生産を提供する。ホウレンソウ生産の成功は、様々な園芸活動に対する配慮に左右される。これらには、適切な施肥に特に配慮した土壌管理、適切な間隔での作物の定着、雑草防除、及びミツバチ等の授粉用昆虫の導入、灌漑、及び有害生物管理が含まれる。
ホウレンソウ作物は、種子から、或いは移植により、定着させることができる。移植することで、直播きにより生産される作物に比べ、早期に作物が生じる。移植は、特に３倍体種子のように種子のコストが高く直播きにリスクが伴う場合、完全に生育した植物を素早く達成するのに役立つ。
ホウレンソウ作物は、種子から、或いは移植により、定着させることができる。移植することで、直播きにより生産される作物に比べ、早期に作物が生じる。移植は、特に３倍体種子のように種子のコストが高く直播きにリスクが伴う場合、完全に生育した植物を素早く達成するのに役立つ。
【0025】
べと病に対する耐性を備えたホウレンソウ植物の開発
本開示では、ＤＭに対する広範な耐性を与える栽培ホウレンソウ由来のアレル及びその組み合わせと、マーカ支援選択及び／又はマーカ支援戻し交配等により、座位の追跡及び所望の生殖質への移入に使用可能なホウレンソウ第６染色体由来の配列スキャフォールドとを特定する。
本開示では、ＤＭに対する広範な耐性を与える栽培ホウレンソウ由来のアレル及びその組み合わせと、マーカ支援選択及び／又はマーカ支援戻し交配等により、座位の追跡及び所望の生殖質への移入に使用可能なホウレンソウ第６染色体由来の配列スキャフォールドとを特定する。
【0026】
本発明は、こうした任意のアレル及び／又はこうしたアレル他の耐性座位との任意の組み合わせを追跡し、所定の遺伝的背景に導入することを提供する。本明細書記載のアレルにより付与されたＤＭに対する耐性を、ある遺伝子型から他の遺伝子型へマーカ支援選択により移入し得ることは、当業者に理解されよう。その結果、ＤＭに対する耐性を有する生殖質源を選択することができる。こうしたアレルを用いて、育種者は、ＤＭに対する耐性を備えたホウレンソウ植物を選択し、本明細書記載の領域に対するマーカ支援選択を用いた育種中に、こうした表現型を追跡し得る。本発明によれば、隣接マーカによる選別は、単一の耐性アレルについて分離した家系において所望のＤＭ耐性を保有する後代を選択する上で十分となり得る。更に、例えば、あるアレルとは適合性相互作用を示し、他のアレルとは不適合性相互作用を示す様々なレースによる表現型の選別により、マーカを補完し、２つ以上のハプロタイプについて分離した個体群において所望の耐性を備えた個体を選択可能であることは、当業者に理解されよう。
【0027】
べと病に対する耐性を有するホウレンソウハイブリッドの開発
本明細書に記載したように、本発明によるホウレンソウ植物は、アレルＣ、アレルＡ、及びアレルＶｔの任意のヘテロ接合性の組み合わせを含み、幅広いＤＭ耐性を付与し得る。例えば、一実施形態において、アレルＣ及びＶｔは、ヘテロ接合型ホウレンソウ植物に存在してＰｆｓレース１乃至８、１０乃至１３、及び新たに発見されたＰｆｓ分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を付与することができる。他の実施形態において、アレルＡ及びＶｔは、ホウレンソウ植物に存在してＰｆｓレース１乃至８及び１０乃至１４に対する耐性を付与することが可能であり、又はアレルＡ及びＣは、ホウレンソウ植物に存在してＰｆｓレース１乃至８、１０乃至１２、１４、及びＵＡ４７１２に対する耐性を付与することができる。更に、本発明によれば、記載した全てのＤＭレース及び分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を有する３元ハイブリッドがある。こうした本明細書に記載の１つ又は２つのアレルを含むホウレンソウ植物は、本明細書に記載の第２又は第３のアレルを含む第２の別個のホウレンソウ植物と交配させ、有益な一組の本明細書に記載のアレルを含むハイブリッドホウレンソウ植物を生産し得る。
本明細書に記載したように、本発明によるホウレンソウ植物は、アレルＣ、アレルＡ、及びアレルＶｔの任意のヘテロ接合性の組み合わせを含み、幅広いＤＭ耐性を付与し得る。例えば、一実施形態において、アレルＣ及びＶｔは、ヘテロ接合型ホウレンソウ植物に存在してＰｆｓレース１乃至８、１０乃至１３、及び新たに発見されたＰｆｓ分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を付与することができる。他の実施形態において、アレルＡ及びＶｔは、ホウレンソウ植物に存在してＰｆｓレース１乃至８及び１０乃至１４に対する耐性を付与することが可能であり、又はアレルＡ及びＣは、ホウレンソウ植物に存在してＰｆｓレース１乃至８、１０乃至１２、１４、及びＵＡ４７１２に対する耐性を付与することができる。更に、本発明によれば、記載した全てのＤＭレース及び分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を有する３元ハイブリッドがある。こうした本明細書に記載の１つ又は２つのアレルを含むホウレンソウ植物は、本明細書に記載の第２又は第３のアレルを含む第２の別個のホウレンソウ植物と交配させ、有益な一組の本明細書に記載のアレルを含むハイブリッドホウレンソウ植物を生産し得る。
【0028】
新規の耐性遺伝子を、受け入れ可能な市販型に移入するプロセスは、困難なプロセスとなる場合があり、リンケージドラッグ、エピスタシス、及び低い遺伝率等の要因により複雑化する恐れがある。形質の遺伝率は、遺伝的分散に起因する表現型変異の割合であり、０乃至１．０で変化する。したがって、１．０に近い遺伝率を有する形質は、環境により大きく影響されない。当業者は、高い遺伝率を有する園芸的形質を備えた商業用系統を形成することの重要性を認識しており、これは、こうした栽培品種により、栽培者が均一な市場規格の作物を生産することが可能となるためである。
【0029】
本明細書に記載の耐性アレルを組み合わせて、特に、ＤＭレースの混合群が発生し得る土地において耐性を改良可能であることは、当業者に理解されよう。本発明によれば、本明細書記載のアレルは、マーカ支援及び／又は表現型選択により、ハイブリッドの親に移入し得る。育種者は、レース特異性を相互に補完し、ＤＭに対する幅広い耐性を達成するアレルを選択し得る。記載した耐性ドナーは、結合能力が実証されたインブレッドと交配させる。各初期交配から生じたＦ１は、その後、レシピエント遺伝子型、即ち、反復親と戻し交配させる。本発明によれば、ヘテロ接合相で耐性を保有する個体は、マーカ支援及び／又は表現型選択を用いて選択される。この戻し交配及び選択ステップは、例えば、３回繰り返す。所望の耐性アレルを保有する個体は、その後、自家受粉を、例えば、単粒系統法により２世代に亘り行う。育種者は、各家系の後代から所望の耐性アレルを保有するインブレッドホウレンソウ植物を回収し、それぞれの反復親と同じ、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する遺伝的背景に導入する。商業用の耐性栽培品種は、相補的な耐性アレルをそれぞれ備えた親系統の交配により生成され、これにより、優れた耐性を有するハイブリッドが作出される。
【0030】
本発明によれば、複数の耐性ドナーを、個別に同じレシピエント遺伝子型と交配し得る。上述した戻し交配及び選択ステップに続いて、反復親と同じ、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する遺伝的背景に導入された、別個の耐性アレルを保有するインブレッドホウレンソウ植物を取得し得る。異なる耐性アレルを、同一の固定された遺伝的背景、即ち、準同質遺伝子系統において維持し得ることは、当業者に理解されよう。耐性アレルについて準同質遺伝子型のインブレッドを作出するステップは、任意のハイブリッドの両方のインブレッド親に適用することができる。本発明によれば、育種者は、１つの親系統に由来する２つの準同質遺伝子系統を交配してＦ１種子親を生成することにより３元ハイブリッドを作出し得る。Ｆ１種子親は、相補的な耐性アレルを保有する第３の親と交配させる。結果的に生じた３元ハイブリッドは、ＤＭ耐性アレルの相補的組み合わせを除き、均一となる。ハイブリッド植物は、反復親と同じ、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する遺伝的背景を常に共有し、耐性アレルの様々な組み合わせを保有する。本明細書記載のアレルにより、幅広いＤＭ耐性を備えた商業用変種の安定生産が可能となる。更に、本発明は、個別のＤＭ集団を有する各地域及び／又は領域用のホウレンソウ植物を提供するために異なる組み合わせで使用可能なアレルを提供する。加えて、耐性克服レース又は新生分離菌が存在する時に、病原体の圧力を低減する耐性アレルの混合を備えた単一変種を得ることができる。
【0031】
ＤＭ耐性に関連するゲノム領域、多型核酸、及びアレル
出願者は、ハイブリッド（ヘテロ接合型）ホウレンソウ植物において特定の組み合わせで共に存在する場合に、ＤＭに対する広範な耐性を与える、栽培ホウレンソウＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ由来の３つのアレルを発見した。本明細書において概要を述べた方法を用いて、これらのアレルは、ホウレンソウ第６染色体上で、遠位位置において配列スキャフォールドＳＦ３４７３２及びＳＦ６３８１５、近位位置においてＳＦ５９００２、ＳＦ９５４８７、及びＳＦ９０９０６、或いは、それに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列であって、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するものを含む配列により定義し得る座位に位置することが発見され、こうした領域において、異なる個体群で多型が存在し得ることは当業者に理解されよう。耐性アレルＣ、Ａ、及び／又はＶｔの存在を同定又は判定するために使用し得る多型を図３に示す。こうしたヌクレオチド配列の例は、配列番号：１乃至２５に記載している。こうした配列は、本発明により、植物内の特定のアレルの存在又は同一性を同定又は判定するために使用し得るものであり、したがってＤＭに対する耐性を保有する植物を同定するために使用し得る。当業者には、更に、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａゲノム全体で多くの遺伝子マーカを見つけることが可能であり、マーカは、本明細書記載の配列の隣接配列及びＳ．ｏｌｅｒａｃｅａゲノム全体に位置する他の断片におけるＳＮＰ及び／又はインデルから開発し得ることは理解されよう。こうしたマーカは、本発明による耐性アレルの有無を特定する上で有用となる。ホウレンソウゲノムにおけるマーカの例は、例えば、Khattak et al. (Euphytica 148:311-318、2006)に記載されている。本明細書に記載のアレル及びＤＭ耐性付与アレルの同定では、同じ領域にあり、それらに遺伝的に連鎖する（連鎖不平衡にある）他の任意のこうしたマーカの使用が可能となる。
出願者は、ハイブリッド（ヘテロ接合型）ホウレンソウ植物において特定の組み合わせで共に存在する場合に、ＤＭに対する広範な耐性を与える、栽培ホウレンソウＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ由来の３つのアレルを発見した。本明細書において概要を述べた方法を用いて、これらのアレルは、ホウレンソウ第６染色体上で、遠位位置において配列スキャフォールドＳＦ３４７３２及びＳＦ６３８１５、近位位置においてＳＦ５９００２、ＳＦ９５４８７、及びＳＦ９０９０６、或いは、それに対して少なくとも９５％の同一性を有する配列であって、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するものを含む配列により定義し得る座位に位置することが発見され、こうした領域において、異なる個体群で多型が存在し得ることは当業者に理解されよう。耐性アレルＣ、Ａ、及び／又はＶｔの存在を同定又は判定するために使用し得る多型を図３に示す。こうしたヌクレオチド配列の例は、配列番号：１乃至２５に記載している。こうした配列は、本発明により、植物内の特定のアレルの存在又は同一性を同定又は判定するために使用し得るものであり、したがってＤＭに対する耐性を保有する植物を同定するために使用し得る。当業者には、更に、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａゲノム全体で多くの遺伝子マーカを見つけることが可能であり、マーカは、本明細書記載の配列の隣接配列及びＳ．ｏｌｅｒａｃｅａゲノム全体に位置する他の断片におけるＳＮＰ及び／又はインデルから開発し得ることは理解されよう。こうしたマーカは、本発明による耐性アレルの有無を特定する上で有用となる。ホウレンソウゲノムにおけるマーカの例は、例えば、Khattak et al. (Euphytica 148:311-318、2006)に記載されている。本明細書に記載のアレル及びＤＭ耐性付与アレルの同定では、同じ領域にあり、それらに遺伝的に連鎖する（連鎖不平衡にある）他の任意のこうしたマーカの使用が可能となる。
【0032】
本明細書において特定したゲノム領域、アレル、及び多型マーカは、公開されている物理又は遺伝地図に対してマッピングし、こうした地図に本明細書記載の領域を配置することができる。当業者には、更に、ホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性に関連するアレルと遺伝的に連鎖する本明細書記載の付加的な多型核酸と、ＤＭに対する抵抗性に関連するアレル又はマーカの約４０ｃＭ、２０ｃＭ、１０ｃＭ、５ｃＭ、又は１ｃＭ内の地図も利用し得ることは理解されよう。
【0033】
したがって、上述したマーカ及びアレルの状態は、例示的なものである。本開示と一致するホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性に関連した他の多型核酸マーカ及びそのアレル状態により、ホウレンソウ植物を同定する方法は、当業者に認識されよう。更に、ゲノム領域（群）に位置する、或いは本明細書において特定したアレル又は他のマーカに連鎖する他の多型核酸マーカのアレル状態を同定して、ホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性との関連性を判定する方法は、当業者に公知であろう。
【0034】
レシピエントペアレントに関連するゲノム領域、多型核酸、及び遺伝的背景
ここでは耐性アレルの有無の特定に用いるマーカについて説明する。本発明によれば、耐性座位に関連しない、或いは耐性座位との有意な遺伝連鎖を欠いているホウレンソウゲノム内のマーカにより、遺伝的背景の選択が可能となる。背景の選択の一例は、循環戻し交配スキームにおけるレシピエントペアレントのゲノムの回収であり、その例は本明細書に記載している。循環選択では、良好な特性を保有する同胞間の交配を複数回実施し、後代を選択することにより、１つ以上のエリートペアレントの良好な特質を維持しつつ、ＤＭ耐性付与アレルを遺伝的多様性と共に家系に導入させる。ゲノム全体に分布し、本発明の方法による植物の生産に使用し得るホウレンソウ用のマーカの例は、例えば、Khattak et al. (Euphytica 148:311-318、2006)に記載されている。背景の選択と並行した本明細書に記載のＤＭ耐性付与アレルの同定では、ゲノム断片の同じ遺伝子間隔にある任意のマーカと、他の遺伝子間隔にある任意のマーカとの使用が可能となる。
ここでは耐性アレルの有無の特定に用いるマーカについて説明する。本発明によれば、耐性座位に関連しない、或いは耐性座位との有意な遺伝連鎖を欠いているホウレンソウゲノム内のマーカにより、遺伝的背景の選択が可能となる。背景の選択の一例は、循環戻し交配スキームにおけるレシピエントペアレントのゲノムの回収であり、その例は本明細書に記載している。循環選択では、良好な特性を保有する同胞間の交配を複数回実施し、後代を選択することにより、１つ以上のエリートペアレントの良好な特質を維持しつつ、ＤＭ耐性付与アレルを遺伝的多様性と共に家系に導入させる。ゲノム全体に分布し、本発明の方法による植物の生産に使用し得るホウレンソウ用のマーカの例は、例えば、Khattak et al. (Euphytica 148:311-318、2006)に記載されている。背景の選択と並行した本明細書に記載のＤＭ耐性付与アレルの同定では、ゲノム断片の同じ遺伝子間隔にある任意のマーカと、他の遺伝子間隔にある任意のマーカとの使用が可能となる。
【0035】
ホウレンソウにおけるＤＭに対する耐性に関連するゲノム遺伝子座の移入
ここではＤＭに対する広範な耐性を与えるアレルの組み合わせを含むホウレンソウ植物（Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ）と、その取得方法とを記載する。本発明によれば、マーカ支援遺伝子移入には、１つ以上のマーカにより定められた染色体領域の、ある生殖質から第２の生殖質への移動が含まれる。移入されたゲノム領域を含む交配の子孫は、第１の生殖質（即ち、ＤＭに対する耐性を備えた生殖質）由来の所望の移入ゲノム領域の特徴を示すマーカと、第２の生殖質の所望の遺伝的背景の特徴を示す連鎖及び非連鎖マーカの両方との組み合わせにより同定することができる。
ここではＤＭに対する広範な耐性を与えるアレルの組み合わせを含むホウレンソウ植物（Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ）と、その取得方法とを記載する。本発明によれば、マーカ支援遺伝子移入には、１つ以上のマーカにより定められた染色体領域の、ある生殖質から第２の生殖質への移動が含まれる。移入されたゲノム領域を含む交配の子孫は、第１の生殖質（即ち、ＤＭに対する耐性を備えた生殖質）由来の所望の移入ゲノム領域の特徴を示すマーカと、第２の生殖質の所望の遺伝的背景の特徴を示す連鎖及び非連鎖マーカの両方との組み合わせにより同定することができる。
【0036】
同定されたＤＭ耐性アレルを含む座位、或いはアレル又は座位の移入を、そのアレル又は座位を含むソース生殖質に由来する外来性連鎖ＤＮＡが存在しない状態で可能にする本明細書に記載の座位に連鎖及び／又は直に隣接するマーカは、本明細書により提供される。本明細書に記載のＤＭに対する耐性に関連するアレル又は座位を含む小さなゲノム領域を移入する場合には、そのアレル又は座位を含む、より大きなゲノム領域に直に隣接するテロメア近位又はセントロメア近位マーカの何れかを用いて、その小さなゲノム領域を移入可能であることは、当業者に理解されよう。
【0037】
したがって、ＤＭに対する耐性に関連する、こうした移入領域を含むホウレンソウ植物又は生殖質であって、残りのゲノム配列の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、又は９９％が、他の場合又は通常の場合、他の表現型に関連するゲノム領域を含む植物又は生殖質の特徴を示すマーカを保有するものが、特定の実施形態において提供される。更に、本明細書により提供されるゲノム領域、アレル又は座位、及び／又はマーカに隣接及び／又は直に隣接する密接に連鎖した領域が、他の場合又は通常の場合には表現型に関連するゲノム領域を含むホウレンソウ植物又は生殖質の特徴を示すマーカを保有するゲノム配列を含む遺伝子移入領域を含んだホウレンソウ植物が、更に提供される。
【0038】
分子支援育種手法
本発明の実施において使用可能な遺伝子マーカには、限定ではないが、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、単純反復配列（ＳＳＲ）、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入欠失多型（インデル）、縦列反復配列多型（ＶＮＴＲ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、アイソザイム、及び他の当業者に公知のものが含まれる。作物におけるマーカの発見及び開発は、マーカ支援育種活動へ応用するための初期の枠組みを提供する（米国特許公開番号第２００５／０２０４７８０号、第２００５／０２１６５４５号、第２００５／０２１８３０５号、及び第２００６／００５０４５３８号）。結果的にもたらされる「遺伝子地図」は、特徴付けされた座位（多型核酸マーカ又はアレルを同定可能な他の任意の座位）の互いに対する相対位置を表すものとなる。
本発明の実施において使用可能な遺伝子マーカには、限定ではないが、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、単純反復配列（ＳＳＲ）、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入欠失多型（インデル）、縦列反復配列多型（ＶＮＴＲ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、アイソザイム、及び他の当業者に公知のものが含まれる。作物におけるマーカの発見及び開発は、マーカ支援育種活動へ応用するための初期の枠組みを提供する（米国特許公開番号第２００５／０２０４７８０号、第２００５／０２１６５４５号、第２００５／０２１８３０５号、及び第２００６／００５０４５３８号）。結果的にもたらされる「遺伝子地図」は、特徴付けされた座位（多型核酸マーカ又はアレルを同定可能な他の任意の座位）の互いに対する相対位置を表すものとなる。
【0039】
単一の核酸の変化のような僅かな変化を含む多型を、多数の方法で分析することができる。例えば、一本鎖高次構造多型分析（Orita et al. Genomics、8(2):271-278、1989）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（Myers EPO 0273085、1985）、又は切断断片長多型分析（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイザースバーグ、２０８７７）を含む電気泳動手法による検出が可能であるが、ＤＮＡシーケンシングマシンが広く利用可能であることから、増幅産物の配列決定のみを直接的に行うことが容易となる場合が多い。多型配列の差が判明すれば、後代検定のための迅速なアッセイを設計することが可能となり、一般的には、特異的アレルのＰＣＲ増幅（ＰＡＳＡ、Sommer et al., Biotechniques 12(1):82-87, 1992）、又は複数の特異的アレルのＰＣＲ増幅（ＰＡＭＳＡ、Dutton et al., Biotechniques 11(6):700-702, 1991）の何らかのバージョンが含まれる。
【0040】
多型マーカは、組にすることで、植物のフィンガープリントを取得して系統又は変種の同一性の度合いを示すための有用なツールとして機能する（米国特許第６，２０７，３６７号）。こうしたマーカは、表現型との関連性を判定するための基礎となるものであり、遺伝獲得量を操作するために用いることができる。本発明の方法の特定の実施形態では、多型核酸を用いて、ＤＭに対する耐性に関連する遺伝子型をホウレンソウ植物において検出すること、ＤＭに対する耐性に関連する遺伝子型を有するホウレンソウ植物を同定すること、及びＤＭに対する耐性に関連する遺伝子型を有するホウレンソウ植物を選択することが可能となる。本発明の方法の特定の実施形態では、多型核酸を用いて、ＤＭに対する耐性に関連するアレルの組み合わせをゲノム内に含むホウレンソウ植物を生産することが可能となる。本発明の特定の実施形態では、多型核酸を用いて、ＤＭに対する耐性に関連するアレルの組み合わせを含む後代ホウレンソウ植物を育種することが可能となる。
【0041】
特定の遺伝子マーカは、「優性」又は「共優性」マーカを含み得る。「共優性」マーカは、２つ以上のアレル（２倍体個体当たり２個）の存在を明らかにする。「優性」マーカは、単一のアレルのみの存在を明らかにする。マーカは、２倍体遺伝子座における両方のアレル、又は３倍体又は４倍体遺伝子座における複数のアレルが容易に検出可能となり、環境変異が存在しない、即ち、その遺伝率が１となるような共優性の形で遺伝することが好ましい。マーカの遺伝子型は、一般に、２倍体生物の各座位に２つのマーカアレルを含む。各座位のマーカアレル組成は、ホモ接合性とヘテロ接合性との何れかにすることができる。ホモ接合性は、座位の両方のアレルが同一の核酸配列により特徴付けられる状態である。ヘテロ接合性は、座位におけるアレルの異なる状態を示す。
【0042】
遺伝子多型の有無を判定するための（即ち、遺伝子型判定のための）核酸に基づく分析は、同定、選択、遺伝子移入等の育種プログラムにおいて用いることができる。遺伝子多型分析用の様々な遺伝子マーカが利用可能であり、当業者に公知である。分析は、ＤＭ耐性表現型に関係又は関連する遺伝子マーカを含む、或いはこれと連鎖する遺伝子、遺伝子の一部、ＱＴＬ、アレル、又はゲノム領域を選択するために使用し得る。
【0043】
本明細書での使用において、核酸分析法には、限定ではないが、ＰＣＲに基づく検出方法（例えば、ＴａｑＭａｎアッセイ）、マイクロアレイ法、質量分析に基づく方法及び／又は全ゲノム配列決定を含む核酸配列決定法が含まれる。特定の実施形態において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡの試料における多型部位の検出は、核酸増幅法の使用により容易となり得る。こうした方法は、多型部位に渡る、或いは、その部位と、その部位に対して遠位又は近位に位置する配列とを含むポリヌクレオチドの濃度を特異的に増加させる。こうした増幅分子は、ゲル電気泳動法、蛍光検出法、又は他の手段により容易に検出することができる。
【0044】
こうした増幅を達成する一方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Mullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273、1986、欧州特許第５０，４２４号、欧州特許第８４，７９６号、欧州特許第２５８，０１７号、欧州特許第２３７，３６２号、欧州特許第２０１，１８４号、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，５８２，７８８号、及び米国特許第４，６８３，１９４号）を利用し、２本鎖形態において多型を定義する近位配列に対してハイブリダイズ可能なプライマ対を用いる。質量分析に基づくＤＮＡタイピング方法を用いることもできる。こうした方法は、米国特許第６，６１３，５０９号及び第６，５０３，７１０号、及びそれらに記載の参考文献において開示されている。
【0045】
ＤＮＡ配列内の多型は、限定ではないが、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書の一部とした米国特許第５，４６８，６１３号、第５，２１７，８６３号、第５，２１０，０１５号、第５，８７６，９３０号、第６，０３０，７８７号、第６，００４，７４４号、第６，０１３，４３１号、第５，５９５，８９０号、第５，７６２，８７６号、第５，９４５，２８３号、第５，４６８，６１３号、第６，０９０，５５８号、第５，８００，９４４号、第５，６１６，４６４号、第７，３１２，０３９号、第７，２３８，４７６号、第７，２９７，４８５号、第７，２８２，３５５号、第７，２７０，９８１号、及び第７，２５０，２５２号に開示されたものを含む、当該技術分野において周知の様々な効果的方法により検出又はタイピング可能である。しかしながら、本発明の組成物及び方法は、多型タイピング方法と併せて、ゲノムＤＮＡ試料における多型をタイピングするために用いることができる。こうした使用されるゲノムＤＮＡ試料には、限定ではないが、植物から直接単離したゲノムＤＮＡ、クローン化ゲノムＤＮＡ、又は増幅ゲノムＤＮＡが含まれる。
【0046】
例えば、ＤＮＡ配列内の多型は、米国特許第５，４６８，６１３号及び第５，２１７，８６３号に開示されたアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブに対するハイブリダイゼーションにより検出することができる。米国特許第５，４６８，６１３号には、 核酸配列における単一又は複数のヌクレオチド変異を、ヌクレオチド変異を含む配列を増幅し、膜上に点として付け、標識した配列特異的オリゴヌクレオチドプローブにより処理するプロセスにより、核酸において検出可能な、アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが開示されている。
【0047】
標的核酸配列は、対象の配列を増幅してプローブとハイブリダイズした後、ライゲーションによりプローブの標識部分を検出する、米国特許第５，８００，９４４号に記載のプローブライゲーション法により検出することもできる。
【0048】
マイクロアレイを、多型の検出に用いることも可能であり、この場合、オリゴヌクレオチドプローブセットを重ね合わせて組み立て、単一の配列を表現し、標的配列の１点における差異が部分的なプローブのハイブリダイゼーションを生じるようにする（Borevitz et al.、Genome Res. 13:513-523、2003、Cui et al.、Bioinformatics 21:3852-3858、2005）。何れか１つのマイクロアレイ上では、遺伝子及び／又は非コード領域を表現し得る複数の標的配列が存在することが見込まれ、各標的配列は、単一のプローブではなく、一連の重なり合ったオリゴヌクレオチドにより表現される。このプラットフォームは、複数の多型の高スループットスクリーニングを提供する。マイクロアレイに基づく方法による標的配列のタイピングは、米国特許第６，７９９，１２２号、第６，９１３，８７９号、及び第６，９９６，４７６号に開示されている。
【0049】
標的核酸配列は、標的核酸配列の隣接部分と相同な配列を有し且つ非共有結合的に結合して標的核酸配列に対するプローブの塩基対上にステムを形成する側鎖を有する少なくとも一対のプローブを利用する、米国特許第５，６１６，４６４号に開示されたプローブ連鎖方法により検出することもできる。側鎖の少なくとも一方は、ステムの他方の側鎖要素と共有結合架橋を形成可能な光活性化基を有する。
【0050】
ＳＮＰ及びインデルを検出するための他の方法には、一塩基伸長（ＳＢＥ）法が含まれる。ＳＢＥ法の例には、限定ではないが、米国特許第６，００４，７４４号、第６，０１３，４３１号、第５，５９５，８９０号、第５，７６２，８７６号、及び第５，９４５，２８３号に開示されたものが含まれる。ＳＢＥ法は、多型に隣接するヌクレオチドプライマを伸長し、プライマの伸長時に、検出可能なヌクレオチド残基を組み入れることに基づく。特定の実施形態において、ＳＢＥ法は、３つの合成オリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオチドのうち２つは、ＰＣＲプライマの役割を果たし、アッセイの対象となる多型を含む領域に隣接するゲノムＤＮＡの座位の配列に対して相補的となる。多型を含むゲノムの領域の増幅に続いて、ＤＮＡポリメラーゼ及び２種類の標識を施したジデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で多型に隣接する増幅ＤＮＡとハイブリダイズするように設計された第３のオリゴヌクレオチド（伸長プライマと呼ばれる）と、ＰＣＲ産物を混合する。鋳型に多型が存在する場合、標識ジデオキシヌクレオシド三リン酸の一方は、一塩基鎖伸長においてプライマに追加することができる。存在するアレルは、その後、２種類の標識のうち、どちらが伸長プライマに追加されたかを判定することにより推測される。ホモ接合性の試料では、２つの標識塩基のうち一方のみが組み込まれ、２つの標識のうち一方のみが検出される。ヘテロ接合性の試料では、両方のアレルが存在し、両方の標識が直接（伸長プライマの異なる分子に）組み込まれるため、両方の標識が検出される。
【0051】
多型を検出する他の方法において、ＳＮＰ及びインデルは、５’蛍光レポータ色素及び３’クエンチャ色素を有するオリゴヌクレオチドがプローブの５’及び３’末端に共有結合する、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，８７６，９３０号、及び第６，０３０，７８７号に開示された方法により検出することができる。プローブが完全である場合、レポータ色素がクエンチャ色素に近接すると、例えば、フェルスタ型のエネルギ移動により、レポータ色素の蛍光が抑制される。ＰＣＲ中、順方向及び逆方向プライマは、多型に隣接する標的ＤＮＡの特異的配列とハイブリダイズする一方、ハイブリダイゼーションプローブは、増幅ＰＣＲ産物内の多型含有配列とハイブリダイズする。後続のＰＣＲサイクルでは、５’→３ エキソヌクレアーゼ活性を備えたＤＮＡポリメラーゼによりプローブが切断され、レポータ色素がクエンチャ色素から分離されて、レポータの蛍光が増加する。
【0052】
他の実施形態において、対象のアレル又は座位は、核酸配列決定手法を用いて直接的に配列決定することができる。核酸配列決定方法は、当該技術分野において公知であり、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（コネチカット州ブランフォード）、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（マサチューセッツ州ビバリ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ネブラスカ州リンカーン）、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ウィスコンシン州マディソン）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（カリフォルニア州サンディエゴ）、及びＶｉｓｉＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（テキサス州ヒューストン）が提供する手法が含まれる。こうした核酸配列決定手法には、R.F. Service Science 311:1544-1546、2006にて検討されているように、パラレルビーズアレイ、ライゲーションによる配列決定、キャピラリ電気泳動、電子マイクロチップ、「バイオチップ」、マイクロアレイ、パラレルマイクロチップ、及び一分子アレイ等のプラットフォームが含まれる。
【0053】
本発明により使用されるマーカは、好ましくは、後続の個体群について推測を行うために、起源の特徴を示すべきである。これまでの経験から、ＳＮＰマーカは、特定のＳＮＰアレルが特定の種の現存個体群内の独立した起源に由来する可能性が非常に低いため、マッピングに理想的となり得ることが示唆される。そのため、ＳＮＰマーカは、アレル又は座位の移入の追跡及び支援に有用であると思われる。
【0054】
定義
以下の定義は、本発明をより優れた形で定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に記載しない限り、用語は、当業者による従来の用法に応じて理解されるべきである。
以下の定義は、本発明をより優れた形で定義し、本発明の実施において当業者を導くために提供される。特に記載しない限り、用語は、当業者による従来の用法に応じて理解されるべきである。
【0055】
本明細書での使用において、「植物」という用語は、植物細胞、植物プロトプラスト、ホウレンソウ植物を再生可能な組織培養の植物細胞、植物カルス、植物群、及び植物において又は花粉、花、種子、葉、茎等の植物の部分において、完全な状態である植物細胞を含む。
【0056】
本明細書での使用において、「ＤＭ」又は「べと病」という用語は、ペロノスポラ属由来の病原菌、特にＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）が引き起こす、ホウレンソウ等の植物の病気を示す。
【0057】
本明細書での使用において、「レース」は、ＤＭを引き起こすことが可能な、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の公的に指定された株を示す。本明細書での使用において、「分離菌」は、ＤＭを引き起こすことが可能であり、未だ公的に命名されていない、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）の新たに発見された株を示す。本発明によるＤＭに対する耐性を備えたホウレンソウ植物は、Ａ、Ｃ、及びＶｔから選択されたアレルの組み合わせを保有する。ＤＭ耐性は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅの１つ以上の公知のレースに対するもの、或いは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅの１つ以上の分離菌に対するものとなり得る。他の実施形態において、本発明の植物は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ Ｐｆｓ７、８、１０、１１、１２、１３、及び／又は１４に対する耐性を有するものとして定義される場合がある。
【0058】
本明細書での使用において、「家系」、「個体群」，及び「後代」という用語は、共通の親からの派生物を共有する植物の集合を意味する。
【0059】
本明細書での使用において、「変種」及び「栽培品種」という用語は、遺伝的家系及び能力により、同じ種内の他の変種から識別可能な類似する植物の群を意味する。
【0060】
本明細書での使用において、「アレル」は、染色体上の所定の座位におけるゲノム配列の２つ以上の代替形態の１つを示す。
【0061】
「量的形質座位（ＱＴＬ）」は、表現型の表現度に影響する少なくとも第１のアレルをコードする染色体位置である。
【0062】
本明細書での使用において、「マーカ」は、生物を区別するために使用できる検出可能な特徴を意味する。こうした特徴の例には、限定ではないが、遺伝子マーカ、生化学マーカ、代謝産物、形態学的特徴、及び農学的特徴が含まれる。
【0063】
本明細書での使用において、「表現型」という用語は、遺伝子発現により影響を受け得る細胞又は生物の検出可能な特徴を意味する。
【0064】
本明細書での使用において、「耐性」という用語は、感受性植物と比較した際の病徴の不在及び／又は減少により示すことが可能な、植物の自然免疫による病原体感染の回避及び／又は低減を意味する。
【0065】
本明細書での使用において、「感受性」という用語は、病態をもたらす、病原体による植物の感染を意味する。
【0066】
本明細書での使用において、「適合性相互作用」という用語は、病態をもたらす、病原体による感受性植物の感染を意味する
【0067】
本明細書での使用において、「不適合性相互作用」という用語は、病態の不在及び／又は減少により示すことが可能な、病原体による耐性植物の感染の回避及び／又は低減を意味する。
【0068】
本明細書での使用において、「遺伝子型」という用語は、植物の特異的なアレル構造を意味する。
【0069】
本明細書での使用において、「ヘテロ接合相」という用語は、アレルの２つの別個のコピーを保有する、ホウレンソウ等の２倍体植物を意味する。
【0070】
本明細書での使用において、「ホモ接合相」という用語は、アレルの２つの同一のコピーを保有する、ホウレンソウ等の２倍体植物を意味する。
【0071】
本明細書での使用において、「移入」という用語は、遺伝子座に関連して用いられる場合、戻し交配等により、新たな遺伝的背景に導入された遺伝子座を示す。したがって、遺伝子座の移入は、植物育種方法を介して、及び／又は分子遺伝学的方法により、達成することができる。こうした分子遺伝学的方法には、限定ではないが、様々な植物形質転換手法、及び／又は、相同組換え、非相同組換え、部位特異的組換え、及び／又は座位の置換若しくは座位の転換をもたらすゲノム修飾を提供する方法が含まれる。
【0072】
本明細書での使用において、「連鎖」という用語は、核酸マーカ及び／又はゲノム領域に関連して使用される場合、マーカ及び／又はゲノム領域が同じ連鎖群又は染色体上に位置し、減数分裂において共に分離する傾向を有するようになることを意味する。
【0073】
本明細書での使用において、「表示する（ｄｅｎｏｔｉｎｇ）」という用語は、植物の遺伝子型に関連して使用される場合、植物が特定の遺伝子型を有することを示す任意の方法を示す。これには、特定の遺伝子型を有する植物を同定する任意の手段が含まれる。特定の遺伝子型の表示は、限定ではないが、植物の遺伝子型を示す任意の種類の書面又は電子媒体又はデータベースへの任意の入力を含み得る。特定の遺伝子型の表示は、更に、限定ではないが、植物を物理的にマーク又はタグ付けする任意の方法が含まれる。本発明において有用な物理的マーキング又はタグを例示するものには、限定ではないが、バーコード、無線ＩＤタグ（ＲＦＩＤ）、標識等が含まれる。
【0074】
寄託情報
ＳＭＢＳ０１１－１１６２Ｍ、ＳＭＢ－６６－１１４３Ｍ、及びＳＳＢ－６６－１１３１Ｍとして指定されたＳｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ系統種の少なくとも２５００個の種子を寄託した。寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０－２２０９ ＵＳＡに対して行われた。寄託物には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４７２、ＰＴＡ－１２４８６、及びＰＴＡ－１２０４１がそれぞれ割り当てられた。これらの系統種の寄託日は、それぞれ２０１３年７月１７日、２０１２年２月２日、及び２０１１年８月１９日である。寄託物へのアクセスは、本願係属中、資格を有する人物の要求に応じて可能となる。寄託物は、公共の保管場所であるＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙにおいて、３０年間、又は直近の要求後５年間、又は特許の有効期間のうち、より長い期間に亘って維持され、その期間中に生育不能となった場合に交換される。出願者は、この特許又は植物変種保護法（７ Ｕ．Ｓ．Ｃ． ２３２１以下参照）を含む何らかの形式の品種保護の下で付与された権利の侵害を放棄しない。
ＳＭＢＳ０１１－１１６２Ｍ、ＳＭＢ－６６－１１４３Ｍ、及びＳＳＢ－６６－１１３１Ｍとして指定されたＳｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ系統種の少なくとも２５００個の種子を寄託した。寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ． ２０１１０－２２０９ ＵＳＡに対して行われた。寄託物には、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－１２０４７２、ＰＴＡ－１２４８６、及びＰＴＡ－１２０４１がそれぞれ割り当てられた。これらの系統種の寄託日は、それぞれ２０１３年７月１７日、２０１２年２月２日、及び２０１１年８月１９日である。寄託物へのアクセスは、本願係属中、資格を有する人物の要求に応じて可能となる。寄託物は、公共の保管場所であるＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙにおいて、３０年間、又は直近の要求後５年間、又は特許の有効期間のうち、より長い期間に亘って維持され、その期間中に生育不能となった場合に交換される。出願者は、この特許又は植物変種保護法（７ Ｕ．Ｓ．Ｃ． ２３２１以下参照）を含む何らかの形式の品種保護の下で付与された権利の侵害を放棄しない。
【実施例】
【0075】
実施例
以下に開示した実施形態は、様々な形態で実施し得る本発明の例示に過ぎない。したがって、以下の実施例に開示した具体的な構造、機能、及び手順の詳細は、限定と解釈されるべきではない。
以下に開示した実施形態は、様々な形態で実施し得る本発明の例示に過ぎない。したがって、以下の実施例に開示した具体的な構造、機能、及び手順の詳細は、限定と解釈されるべきではない。
【0076】
実施例１
Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａにおけるＤＭレースに対する新規の耐性の同定
実施例５に記載の疾患アッセイを用いて、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ生殖質において選別を行った。内部の遺伝子バンク内のＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ系統種を選別した。加えて、十分な感受性を有するか、或いは耐性特異性の組み合わせを有する公的に入手可能なホウレンソウハイブリッドを、感受性及び耐性の基準として試験に含めた。感染は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）レース７、８、及び１０乃至１４により、レース１乃至６に関する過去のデータを補完するように行った。レース９は、もはや栽培地には存在していない。レースを指定された株に加えて、２０１３年の春にカリフォルニア（米国）にて採取された耐性克服分離菌を含めた。この分離菌は、現在、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ ＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａによりＵＡ４７１２と呼ばれており、レースＰｆｓ１５の可能性が高い候補とされている。
Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａにおけるＤＭレースに対する新規の耐性の同定
実施例５に記載の疾患アッセイを用いて、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ生殖質において選別を行った。内部の遺伝子バンク内のＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ系統種を選別した。加えて、十分な感受性を有するか、或いは耐性特異性の組み合わせを有する公的に入手可能なホウレンソウハイブリッドを、感受性及び耐性の基準として試験に含めた。感染は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）レース７、８、及び１０乃至１４により、レース１乃至６に関する過去のデータを補完するように行った。レース９は、もはや栽培地には存在していない。レースを指定された株に加えて、２０１３年の春にカリフォルニア（米国）にて採取された耐性克服分離菌を含めた。この分離菌は、現在、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ ＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａによりＵＡ４７１２と呼ばれており、レースＰｆｓ１５の可能性が高い候補とされている。
【0077】
感染に対する対照エントリの応答は、表１に示しており、他の公開データと一致する（Correll et al., Eur J Plant Pathol 129:193-205, 2011）。両親が耐性特異性に寄与するにもかかわらず、試験に含めた全ての商業用ハイブリッド基準は、全ての分離菌に対する耐性を示すことができなかった。例えば、変種Ｌｉｏｎは、レース１０に対する感受性を有し、Ｌａｚｉｏはレース１１乃至１４に対する感受性を有し、Ｐｉｇｅｏｎは、レース１４に対する感受性を有する。レース１０及び１４の両方に対する耐性は、単一のハイブリッドでは観察されておらず、レース１３及び１４に対する耐性の組み合わせは、ハイブリッドＬｉｏｎのみで観察された。
【0078】
内部遺伝子バンクのＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ系統種のうち、３系統は、耐性の相補的な組み合わせを有することが分かった。インブレッド系統ＳＭＢＳ０１１－１１６２Ｍは、アレルＡとして同定されたアレルを保有し、レース１３及び１４を含む複数のレースに対する耐性を有した。第２のインブレッド系統ＳＳＢ－６６－１１３１Ｍは、Ｖｔに指定されたアレルを含み、レース１乃至１３に対する耐性を有することが分かった。最後のインブレッド系統ＳＭＢ－６６－１１４３Ｍは、アレルＣとして同定されたアレルを含み、レース１乃至１０に加え、新たな分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を有することが分かった。同定されたアレルのそれぞれは、異なるレースの組み合わせに対するＤＭ耐性を与えることが分かった。
【0079】
【表1】
【0080】
実施例２
ＤＭに対する耐性のマッピング
Irish et al. (2008)は、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ由来の耐性座位ＲＰＦ１と密接に連鎖する、Ｄｍ－１に指定された共優性マーカを同定した。Ｄｍ－１とＲＰＦ１との遺伝距離は、１．７ｃＭと推定された。ＲＰＦ１座位に対するＤｍ－１マーカの微細マッピングを更に行い、Ｄｍ－１マーカの近傍にある配列リソースを生成したが、ＲＰＦ１のクローニングは発生させていない（Yang et al., Initial fine-mapping of the spinach downy mildew resistance locus RPF1, University of Arkansas, 2013, 102 pages; 1536814）。原因となる多型の欠如と、Ｄｍ－１及びＲＰＦ１間の距離とを考えると、関連性は、戻し交配又は循環選択中に失われる可能性がある。そのため、耐性アレルの追跡及び更なる微細マッピングには、耐性の両側に隣接するマーカが必要となった。
ＤＭに対する耐性のマッピング
Irish et al. (2008)は、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ由来の耐性座位ＲＰＦ１と密接に連鎖する、Ｄｍ－１に指定された共優性マーカを同定した。Ｄｍ－１とＲＰＦ１との遺伝距離は、１．７ｃＭと推定された。ＲＰＦ１座位に対するＤｍ－１マーカの微細マッピングを更に行い、Ｄｍ－１マーカの近傍にある配列リソースを生成したが、ＲＰＦ１のクローニングは発生させていない（Yang et al., Initial fine-mapping of the spinach downy mildew resistance locus RPF1, University of Arkansas, 2013, 102 pages; 1536814）。原因となる多型の欠如と、Ｄｍ－１及びＲＰＦ１間の距離とを考えると、関連性は、戻し交配又は循環選択中に失われる可能性がある。そのため、耐性アレルの追跡及び更なる微細マッピングには、耐性の両側に隣接するマーカが必要となった。
【0081】
３つの耐性アレルＡ、Ｖｔ、又はＣの１つを保有するホウレンソウ系統を、レースＰｆｓ１乃至４に対する耐性を排他的に有する系統と個別に交配させた。殆どのレースに対する耐性は、両親に由来する耐性を区別するレースによりＦ１個体を感染させた際の症状の欠如に基づいて、優性遺伝する。対照的に、アレルＡ由来のレース７及び１３に対する耐性は、劣性であると思われる。Ｆ３ファミリを、別個の２親性Ｆ１交配からの単粒系統法により取得し、表現型により選別した。疾患アッセイには、Ｐｆｓレース８に感染させた、アレルＡについて分離した７４のＦ３ファミリと、レース７、１０、及び１２によるチャレンジを行った、アレルＶｔについて分離した１０７のＦ３ファミリと、レース１０を接種した、アレルＣについて分離した４０のＦ３ファミリを含めた。興味深いことに、Ｖｔ由来ファミリが１つのレースに対する抵抗を示す場合には、他の２レースに対する免疫も観察された。
【0082】
公開情報に基づいて、配列スキャフォールドの可能性のある位置を、ＤＭ耐性と同じ位置でＳＦ３４７３２、ＳＦ５９００２、ＳＦ６２７４９、ＳＦ６３８１５、ＳＦ９０９０６、ＳＦ９５４８７、及びＳＦ１７８６３７に指定した。ＤＭに対する耐性を与えるアレルアレルＣ、Ａ、及びＶｔに対応するヌクレオチド配列の例を、配列番号：１乃至２５として記載する。更に、スキャフォールドの個別のアレル間の多型を図３に示す。これらのスキャフォールドに由来する一塩基多型（ＳＮＰ）を、１つ以上のマッピング個体群において多型であることに基づいて選択した。ＳＮＰは、ＴａｑＭａｎ（ＴＭ）アッセイに変換し、各個体群のそれぞれのＦ３ファミリのＦ２個体の遺伝子型判定に用いた。連鎖不平衡を試験し、ＳＮＰ及び表現型間の遺伝距離を、ＪｏｉｎＭａを用いて推定した（Stam, Plant J 3:739-744, 1993）。関連解析により、配列スキャフォールドと耐性との連鎖を、単一の集合を組み立てることで確認した。この結果は、マッピングに使用したソース又はレースと無関係であることが分かった（図１）。観察された組換え頻度及び導出された遺伝距離は、各個体群の個別の試料サイズにより変化した。スキャフォールドＳＦ５９００２及びＳＦ９５４８７は、全ての個体群で同時分離すると思われた。スキャフォールド及び遺伝子マーカの順序は、アレルＶｔ又はアレルＣについて分離した個体群において一定となった。しかしながら、例えば、スキャフォールドＳＦ５９００２及びＳＦ９０９０６に対するＳＦ６２７４９の正確な位置は、不明確なままである。最後に、Khattak et al. (Euphytica 148:311-318、2006)により公開された、変換及びマッピング済みのＳＳＲマーカにより、連鎖群を公開されているＬＧ６として同定した。
【0083】
実施例３
ＤＭ耐性アレルの定量効果
実施例２において収集した遺伝子型及び表現型は、標準インターバルマッピング設定を利用して、ｍａｐＱＴＬによる定量解析に使用した（Van Ooijen、1996）。Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース８に対する耐性のための主要な座位は、アレルＡについて分離したマッピング個体群において検出された。ＬＯＤピーク値５７．５１により証明されるように、形質は、スキャフォールドＳＦ５９００２、ＳＦ９５４８７、及びＳＦ６３８１５由来のマーカとの関連性が高かった（表２）。座位は、大きな影響を有していると思われ、観察された９７．２％の分散を説明するものとなった。
ＤＭ耐性アレルの定量効果
実施例２において収集した遺伝子型及び表現型は、標準インターバルマッピング設定を利用して、ｍａｐＱＴＬによる定量解析に使用した（Van Ooijen、1996）。Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅレース８に対する耐性のための主要な座位は、アレルＡについて分離したマッピング個体群において検出された。ＬＯＤピーク値５７．５１により証明されるように、形質は、スキャフォールドＳＦ５９００２、ＳＦ９５４８７、及びＳＦ６３８１５由来のマーカとの関連性が高かった（表２）。座位は、大きな影響を有していると思われ、観察された９７．２％の分散を説明するものとなった。
【0084】
【表2】
【0085】
【表3】
【0086】
【表4】
【0087】
【表5】
【0088】
【表6】
【0089】
実施例４
ハイブリッドにおける耐性アレルＡ、Ｖｔ、及びＣの配置
耐性アレルＡ、Ｃ及びＶｔを感受性ハイブリッドに導入した。インブレッドＳＭＢＳ０１１－１１６２ＭをアレルＡのドナーとして用い、系統ＳＳＢ－６６－１１３１ＭをＶｔに対して用い、アレルＣには、ＳＭＢ－６６－１１４３Ｍをソースとして用いた。それぞれのアレルは、当該技術分野において公知の育種方法に続いて、感受性ハイブリッドのインブレッド親の両方に別々に移入した。次に、アレルＡについてホモ接合性（Ａ／Ａ）である第１のホウレンソウ植物を、第２のホウレンソウ植物（Ｃ／Ｃ）と交配させ、アレルＡ及びＣについてヘテロ接合性のハイブリッドＦ１を生成した（図２Ａ）。このハイブリッドをシングルハイブリッドＡ又はＦ１（Ａ／Ｃ）と称した。Ｆ１（Ａ／Ｃ）は、実施例５に記載したように、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅの公知のレース及び分離菌ＵＡ４７１２により選別した。このハイブリッドは、レース１３を除く全てのＰｆｓレースに対する耐性を有することが分かった（表７）。ハイブリッドＡは、新生分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性も有する。
ハイブリッドにおける耐性アレルＡ、Ｖｔ、及びＣの配置
耐性アレルＡ、Ｃ及びＶｔを感受性ハイブリッドに導入した。インブレッドＳＭＢＳ０１１－１１６２ＭをアレルＡのドナーとして用い、系統ＳＳＢ－６６－１１３１ＭをＶｔに対して用い、アレルＣには、ＳＭＢ－６６－１１４３Ｍをソースとして用いた。それぞれのアレルは、当該技術分野において公知の育種方法に続いて、感受性ハイブリッドのインブレッド親の両方に別々に移入した。次に、アレルＡについてホモ接合性（Ａ／Ａ）である第１のホウレンソウ植物を、第２のホウレンソウ植物（Ｃ／Ｃ）と交配させ、アレルＡ及びＣについてヘテロ接合性のハイブリッドＦ１を生成した（図２Ａ）。このハイブリッドをシングルハイブリッドＡ又はＦ１（Ａ／Ｃ）と称した。Ｆ１（Ａ／Ｃ）は、実施例５に記載したように、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅの公知のレース及び分離菌ＵＡ４７１２により選別した。このハイブリッドは、レース１３を除く全てのＰｆｓレースに対する耐性を有することが分かった（表７）。ハイブリッドＡは、新生分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性も有する。
【0090】
アレルＣ及びＶｔを保有するハイブリッドＢ（図２Ｂ）は、記載のように選別し、Ｐｆｓ１４を除く全てのＰｆｓレースに対する耐性を有することが分かった（表７）。Ｐｆｓレース１４は欧州において発生しないため、これは重要である。ホウレンソウ植物におけるアレルＣ及びＶｔの組み合わせは、欧州市場に対する完全な耐性品種をもたらす。
【0091】
アレルＡ及びＶｔを備えたハイブリッドＣは、分離菌ＵＡ４７１２を除く全てのＰｆｓレースに対する耐性を有した（表７）。新たな分離菌の分布は、当初は幾つかの場所に限定されているため、これも重要である。Ｆ１（Ａ／Ｖｔ）は、現在命名されている全てのＰｆｓレースに対する耐性を有する。
【0092】
２親性ハイブリッドに加え、３元ハイブリッドを生成した。３元ハイブリッドは、Ｆ１種子親をインブレッド親Ｐ２に交配させることで作出した。Ｆ１種子親は、Ｐ１の２つの準同質遺伝子系統間での交配により生じたものであり、それぞれ別個の耐性アレルを保有する。インブレッド親Ｐ２は、第３の相補的なアレルを保有する。３元ハイブリッドにより、同定された３つ全てのアレルを、２倍体ハイブリッド植物の混合個体群に配置することが可能となる。３種類の３元ハイブリッドが可能となる（図２Ｂ）。各交配により、公知の全Ｐｆｓレース及び分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性を備えたハイブリッド植物の個体群が生じる。しかしながら、各アレルの頻度は、どのように３元交雑が構築されたかに依存する。
【0093】
栽培ホウレンソウＳｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａに含まれる遺伝的変化を起源とする新規の耐性が同定された。この耐性は、栽培作物における遺伝的多様性が一般に狭小であるため、驚くべきことである（Fernie et al., Curr. Opinion Pl. Biol. 9:196-202, 2006）。３つのホウレンソウ系統における３つの独自の耐性アレルＡ、Ｖｔ、及び／又はＣの同定により、種内のＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ交配のみによるレース特異的ＤＭ耐性育種が提供される。加えて、これらのアレルは、新規の属性を組み合わせることにおいて最も優れたものとなるシングルハイブリッドの組み合わせにおいて、耐性の積み重ねを可能とし、公知の全Ｐｆｓレース、新たな分離菌ＵＡ４７１２に対する耐性、又は記述されている全ての欧州ＤＭ集団に対する耐性を含む。３つの耐性アレルに関連するマーカにより、任意の栽培ホウレンソウハイブリッドにおいて、記述されているＤＭ耐性アレル等の導入が可能となる。最後に、３元ハイブリッド法の開示により、更なるＤＭ耐性変種の開発が可能となる。
【0094】
【表7】
【0095】
実施例５
ＤＭに対する耐性についてホウレンソウ系統種を選別するためのアッセイ
べと病（ＤＭ）に対する耐性についてホウレンソウ系統種を選別するために、植物新品種保護国際同盟（ＵＰＯＶ）が策定した検定を利用した。“Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｓ ｏｎ Ｄｉｓｔｉｎｃｔｎｅｓｓ， Ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ， ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ． Ｓｐｉｎａｃｈ，” ＵＰＯＶ Ｃｏｄｅ： ＳＰＩＮＡ＿ＯＬＥ， ＣＰＶＯ－ＴＰ／０５５／５は、２０１３年２月２７日に採択及び施行された。プロトコルは次の通りである。
ＤＭに対する耐性についてホウレンソウ系統種を選別するためのアッセイ
べと病（ＤＭ）に対する耐性についてホウレンソウ系統種を選別するために、植物新品種保護国際同盟（ＵＰＯＶ）が策定した検定を利用した。“Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｓ ｏｎ Ｄｉｓｔｉｎｃｔｎｅｓｓ， Ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ， ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ． Ｓｐｉｎａｃｈ，” ＵＰＯＶ Ｃｏｄｅ： ＳＰＩＮＡ＿ＯＬＥ， ＣＰＶＯ－ＴＰ／０５５／５は、２０１３年２月２７日に採択及び施行された。プロトコルは次の通りである。
【0096】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．Ｓｐｉｎａｃｉａｅのレースは、Ｎａｋｔｕｉｎｂｏｕｗ（Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ ４０、ＮＬ－２３７０ ＡＡ、Ｒｏｅｌｏｆａｒｅｎｄｓｖｅｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｎａｋｔｕｉｎｂｏｕｗ．ｃｏｍ）から入手可能な生きた宿主植物において維持するか、或いは、－２０℃で最長１年間に亘り保管される胞子を有する植物材料において維持する。
【0097】
検定の実施：個体の成長段階：第１の子葉／葉、１１日齢個体、温度：日中１５℃／夜間１２℃、光：発芽後１日１５時間、生育方法：温室又は生育室内のポット又はトレイ内の土壌。
【0098】
接種方法：胞子形成している葉を、７日前に感染させた宿主個体から採取し、滅菌水道水により完全に洗い落とす（２２４個体につき最大１５０ｍｌの水）。胞子懸濁液をチーズクロスにより濾過し、検定個体に噴霧し、接種材料が葉を覆うが、流れ落ちない状態とする。１５０ｍｌの懸濁液は、３×２２４までの個体に対して十分となる。胞子密度は、２０，０００乃至１００，０００分生子／ｍｌ水とするべきである。胞子懸濁液は、新鮮なものを用いるべきである。ホウレンソウべと病は風媒性であるため、胞子形成植物は、閉じた容器又は隔離室に入れ、相互汚染を防止するべきである。
【0099】
各増殖及び各検定では、レースの同一性を確保するために耐性の制御が必要となる。苗の発育及び培養中の光及び湿度条件が重要となる。最適な略８９乃至９０％ＲＨの湿度により、植物の成長及び菌類の成長が可能となり、強い光により、胞子の発芽及び感染が阻害される。検定は、冬季に直射日光を防いで実施するべきである。接種後、植物は、３日間に亘りプラスチックを被せた状態とするべきである。この期間の後、日中は、プラスチックを僅かに持ち上げるべきである。
【0100】
検定期間：増殖産物は、接種後７日で胞子を形成する。播種から接種まで：１１日、接種から測定まで：１０日、検定個体数：５６個体、感染の評価：耐性は通常完全となり、感染の結果として壊死点が見える場合もある。感受性植物は、様々な度合いの胞子形成を示す。胞子形成は、葉を覆う灰色の部分として見え、水分の多い背軸側で始まる。
【0101】
レースを同定する判別品種：Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｆａｒｉｎｏｓａ ｆ．ｓｐ．ＳｐｉｎａｃｉａｅのレースＰｆｓ：１乃至８及び１０乃至１３は、表８による「判別品種」の標準セットにより定義される。
【0102】
【表8】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【配列表】