▶ カドモン コーポレイション，リミティド ライアビリティ カンパニーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-12
(45)【発行日】2023-05-22
(54)【発明の名称】免疫調節剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230515BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230515BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230515BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230515BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230515BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230515BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230515BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230515BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230515BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230515BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20230515BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230515BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230515BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
A61P37/04
A61P35/00
A61P31/12
A61P35/02
A61K39/395 T
A61K39/395 S
【請求項の数】
18
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021189428
(22)【出願日】2021-11-22
(62)【分割の表示】P 2020005892の分割
【原出願日】2015-01-15
(65)【公開番号】P2022019807
(43)【公開日】2022-01-27
【審査請求日】2021-12-08
(31)【優先権主張番号】61/927,907
(32)【優先日】2014-01-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】513190449
【氏名又は名称】カドモン コーポレイション，リミティド ライアビリティ カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】サミュエル ディー．ワクサル
(72)【発明者】
【氏名】ジェンピーン ジュウ
(72)【発明者】
【氏名】ヤン ウー
(72)【発明者】
【氏名】ステラ エー．マートモ
(72)【発明者】
【氏名】ジャオジーン ジョーン
(72)【発明者】
【氏名】ダン ルウ
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】BioDrugs, Published online: 2013年，Vol.28, No.2，p.123-131
【文献】Clin. Cancer Res., 2013年，Vol.19, No.5，p.1021-1034
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含む第１領域であって、抗体またはその抗原結合性断片が、（ａ）配列番号：２６６を有する重鎖ＣＤＲ－１Ｈ、配列番号：２４３を有する重鎖ＣＤＲ－２Ｈ、及び配列番号：２４５を有する重鎖ＣＤＲ－３Ｈ、ならびに配列番号：２４７を有する軽鎖ＣＤＲ－１Ｌ、配列番号：２４８を有する軽鎖ＣＤＲ－２Ｌ、及び配列番号：２４９を有する軽鎖ＣＤＲ－３Ｌ、あるいは
（ｂ）配列番号：２４１を有する重鎖ＣＤＲ－１Ｈ、配列番号：２４３を有する重鎖ＣＤＲ－２Ｈ、及び配列番号：２４５を有する重鎖ＣＤＲ－３Ｈ、ならびに配列番号：２４７を有する軽鎖ＣＤＲ－１Ｌ、配列番号：２４８を有する軽鎖ＣＤＲ－２Ｌ、及び配列番号：２４９を有する軽鎖ＣＤＲ－３Ｌ
を含む、第１領域、
（ｉｉ）ＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）に結合する第２領域であって、
ＩＬ－１５、またはＩＬ－１５に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、第２領域、ならびに
（ｉｉｉ）ＩＬ－１５受容体α ｓｕｓｈｉドメイン
を含む、融合タンパク質。
【請求項2】
配列番号：３１５、配列番号：３１７、配列番号：３１９、配列番号：３２１、配列番号：３２３または配列番号：２６１を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
ＩＬ－１５ＲαのｓｕｓｈｉドメインをＩＬ－１５に結合するフレキシブルなリンカーをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
フレキシブルなリンカーが、主にセリンとグリシンである１５～２０個のアミノ酸を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
配列番号：２６１を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号：２６７を有する重鎖可変領域、および／または配列番号：２５０を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号：２４６を有する重鎖可変領域、および／または配列番号：２５０を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
造影剤、治療薬、または細胞毒性剤を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質のコンジュゲート。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離した核酸。
【請求項10】
請求項９に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項11】
請求項９に記載の核酸を含む、原核または真核宿主細胞。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び製薬上許容できる担体を含む組成物。
【請求項13】
対象における、ＰＤ１のＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害するための医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項14】
対象における、ＰＤ－Ｌ１により仲立ちされる免疫抑制を阻害するための医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項15】
ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に対する免疫応答を刺激するための医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項16】
ＰＤ－Ｌ１を発現する前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項17】
ＰＤ－Ｌ１を発現する前記細胞がウイルスに感染している、請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項18】
癌を治療する際に使用するための医薬の製造における、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明では、ＰＤ－Ｌ１、並びに、ＩＬ１５及びＩＬ１５受容体α ｓｕｓｈｉドメインと共に構築されたＰＤ－Ｌ１結合タンパク質を含む二重特異的融合分子に特異的に結合するモノクローナル抗体、これをコードする核酸分子、並びにこれらの治療用組成物を提供する。この作用物質はＴ細胞及びＮＫ細胞の機能を高めて、癌及び感染症を含む、種々の免疫機能障害が関係する疾患の治療のための、細胞及びサイトカインが仲立ちする免疫を増大させる。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／９２７，９０７号（２０１４年１月１５日出願）に対する優先権を主張し、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
本出願は、米国仮特許出願第６１／９２７，９０７号（２０１４年１月１５日出願）に対する優先権を主張し、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
プログラム死１（ＰＤ－１）は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡを含む、受容体ＣＤ２８ファミリーの一員である（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８）。ＰＤ－１は、免疫病理学的状態の進行中に活性化Ｔ細胞及びＢ細胞上で主に上方制御される、誘発性免疫抑制受容体である。ＰＤ－１が、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１と相互作用することにより、ＴＣＲ及びＢＣＲが仲立ちする増殖、及びサイトカイン産生の阻害、並びに、固有のＰＤ－１が仲立ちする、免疫レセプターチロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）の陰性シグナル伝達による、抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスの誘発がもたらされる（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５、Ｕｎｋｅｌｅｓｓ ａｎｄ Ｊｉｎ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：３３８－３４３、Ｏｋｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３８６６－７１，Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３－８００）。ＰＤ－Ｌ１は細胞表面糖タンパク質であり、ＰＤ－１に対する主要なリガンドである。ＰＤ－Ｌ１はまた、細胞活性化後にリンパ組織及び末梢非リンパ組織上でも誘発可能である。ＰＤ－Ｌ１は免疫細胞に加え、癌細胞及びストローマ細胞を含む種々の病的細胞型において上方制御され、病気の悪化の過程における免疫抑制に積極的役割を果たす（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ （２００２）ＰＮＡＳ ９９：１２２９３－７、Ｏｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２９４７－５３）。ＰＤ－Ｌ１の上方制御は、種々の癌及びウイルス感染での不十分な臨床的成果と関係している（Ｈｏｆｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．ＢｉｏＭｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１１：１－９、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ．２：６６
２－７３）。抗体によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１をブロックすることはＣＤ８ Ｔ細胞浸潤、ＣＴＬ活性を促進し、前臨床及び臨床症状におけるＴｈ１サイトカインＩＦＮ－γの存在を増加させた（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５０８２－９２，Ｎｏｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２１５２－７、Ｆｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．４８：４０９－２１、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ．（２０１２）Ｏｎｃｏｌｍｍｕｎｏｌ．１：１２２３－２５）。免疫制御剤としてのＰＤ－Ｌ１抗体は、単剤療法として使用した場合、または他の免疫抑制分子と組み合わせた場合に効果的であることが示されている。
２－７３）。抗体によりＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１をブロックすることはＣＤ８ Ｔ細胞浸潤、ＣＴＬ活性を促進し、前臨床及び臨床症状におけるＴｈ１サイトカインＩＦＮ－γの存在を増加させた（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：５０８２－９２，Ｎｏｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２１５２－７、Ｆｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．４８：４０９－２１、Ｚｉｔｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｋｒｏｅｍｅｒ．（２０１２）Ｏｎｃｏｌｍｍｕｎｏｌ．１：１２２３－２５）。免疫制御剤としてのＰＤ－Ｌ１抗体は、単剤療法として使用した場合、または他の免疫抑制分子と組み合わせた場合に効果的であることが示されている。
【0004】
しかし、免疫抑制因子への免疫制御介入（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）は、癌、感染症、及びその他の病気における、免疫障害に関係する問題を部分的にしか解決しない。生物学的治療薬を利用して、弱体化した先天性免疫応答及び適応免疫応答を、腫瘍及び感染症を制御するのに一層効果的なレベルまで上げるために、エフェクター免疫細胞を直接刺激及び拡大させることが依然として非常に望まれている。インターロイキン（即ちＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＩＬ－２１）、及びＴＮＦα、ＧＭ－ＣＳＦ等を含むサイトカインを使用する免疫療法は、癌及び感染症の治療にある程度効果的であることが示されているが、臨床的成果は多くの場合、有効性を得るために必要なサイトカインの高血中濃度と関係する全身毒性、並びに病的細胞及び組織における標的の特異性の欠如により制限されている。
【0005】
評価したサイトカインの中でもＩＬ１５は、抗原特異的ＣＤ８細胞のサブセットからなるエフェクター及びセントラルメモリーＣＤ８細胞を刺激することに専念し、他のＴ細胞集団にて効果を制御することなく、抗腫瘍免疫を発揮することが認識されている。更に、Ｔｒｅｇを活性化するＩＬ－２とは異なり、ＩＬ１５は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、並びにエフェクター及びメモリーＣＤ８ Ｔ細胞を活性化する能力に加えて、Ｔｒｅｇ及び他の免疫抑制細胞により誘発されるアポトーシスからＴ細胞を救出する能力を有することが示されている（Ｖａｎ Ｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４５２９９、Ｏｂａｒ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓ．（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：２６３－７２、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｇｉｒａｒｄ．（２００６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７：１００－１０８、Ｅｌｐｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＮＡＳ １０７：２１６４７－２１６５２）。
【0006】
ＩＬ１５は、マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ－２の増殖を刺激する能力に基づいて、１９９４年にγｃサイトカインと決定された（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５－８、Ｂａｍｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＰＮＡＳ ９３：２８９７－９０２）。ヒトＩＬ１５は、サル及びカニクイザルＩＬ１５とそれぞれ、約９７％及び９６％のアミノ酸配列同一性を共有している。ヒト及びマウスＩＬ１５は７３％の相同性を有し、マウス細胞上で同程度に活性である。ＩＬ１５はＤＣ、マクロファージ及び顆粒細胞により１４～１５ｋＤａの糖タンパク質として分泌される、１２．５ＫＤのタンパク質（１１４アミノ酸）であり、４つのαヘリックスバンドルを含有するサイトカインの一員でもある（Ａｎｄｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７０：２９８６２－９、Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３３：３５－４１）。ＩＬ１５は通常、Ｔ細胞及びＮＫ細胞上で機能性ＩＬ１５受容体β及びγユニットに結合する前に、ＡＰＣ上に発現するＩＬ１５受容体αとの複合体を形成する。ＩＬ１５は、膜形態の受容体α鎖に結合した、サイトカインそのものを発現する細胞により、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２を発現する応答細胞に対してトランスに提示されてよい（Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：５３７－４７）。ＩＬ１５受容体α ｓｕｓｈｉドメイン（サイズは２９．５ＫＤ）は、受容体β及びγと適切に関わる前に、ＩＬ１５との複合
体を形成する、重要な構成成分である（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２７７－８２）。ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒα複合体、並びにＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン融合タンパク質は、ＩＬ１５のみと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞を刺激する能力が大変高いことが報告されている（Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８１：１６１２－１９、Ｓｔｏｋｌａｓｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：６０７２－８０）。ＩＬ１５はまた、刺激されたヒトＢ細胞の増殖及び分化を誘発する（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：４８３－９０）。ＩＬ１５は殆どの場合、Ｔリンパ球の生残を引き延ばすように作用することで、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を妨害することが示唆されている（Ｍａｒｋｓ－Ｋｏｎｃｚａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ ９７：１１４４５－５０）。ＩＬ１５は、ＮＫ細胞、並びにメモリー表現型及び抗原特異的メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の維持を支援する例外的な能力を有する（Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６５７－７９）。したがって、免疫制御における最も活性なサイトカインの中でも、ＩＬ１５は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＬＣＭＶ等を含む種々の腫瘍型及びウイルス感染に対して、免疫における多くの重要な側面を仲立ちする独自の能力を有する（Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３３：３５－４１、Ｖｅｒｂｉｓｔ ａｎｄ Ｋｌｏｎｏｗｓｋｉ，（２０１２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．５９：４６７－４７８）。
体を形成する、重要な構成成分である（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２７７－８２）。ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒα複合体、並びにＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン融合タンパク質は、ＩＬ１５のみと比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞を刺激する能力が大変高いことが報告されている（Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８１：１６１２－１９、Ｓｔｏｋｌａｓｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：６０７２－８０）。ＩＬ１５はまた、刺激されたヒトＢ細胞の増殖及び分化を誘発する（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：４８３－９０）。ＩＬ１５は殆どの場合、Ｔリンパ球の生残を引き延ばすように作用することで、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を妨害することが示唆されている（Ｍａｒｋｓ－Ｋｏｎｃｚａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ ９７：１１４４５－５０）。ＩＬ１５は、ＮＫ細胞、並びにメモリー表現型及び抗原特異的メモリーＣＤ８ Ｔ細胞の維持を支援する例外的な能力を有する（Ｍａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６５７－７９）。したがって、免疫制御における最も活性なサイトカインの中でも、ＩＬ１５は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＬＣＭＶ等を含む種々の腫瘍型及びウイルス感染に対して、免疫における多くの重要な側面を仲立ちする独自の能力を有する（Ｓｔｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．３３：３５－４１、Ｖｅｒｂｉｓｔ ａｎｄ Ｋｌｏｎｏｗｓｋｉ，（２０１２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．５９：４６７－４７８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体及び結合タンパク質を提供する。本発明のある種の実施形態において、抗体はＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１との相互作用をブロックする。ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１との相互作用をブロックすることにより、このような抗体は免疫抑制を低下させるまたは阻害するのに有用となる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
別の態様では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１、及び少なくとも１つの別の分子に特異的に結合する抗体及び結合タンパク質を提供する。このような実施形態の例としては、１つ以上の他のリガンド及び／または受容体にも結合する、膜結合性または可溶性であり得るＰＤ－Ｌ１結合タンパク質が挙げられる。
【0009】
別の態様では、本発明は、分子、例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合することにより免疫抑制を低下させるまたは阻害することを除いて、他のリガンドまたは受容体との相互作用により１種以上の免疫応答もまた促進する、ＰＤ－Ｌ１を結合する融合タンパク質を提供する。本発明の一実施形態において、分子は標的細胞上でＰＤ－Ｌ１に結合し、例えば、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞の増殖を促進することにより、細胞性免疫反応もまた刺激する。本発明の一実施形態において、分子は、例えばＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、及びＩＬ２１に限定されないインターロイキンまたはインターフェロンに応答する細胞を刺激する。本発明の一実施形態において、分子はＩＬ１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）のＩＬ１５の刺激を促進する配列またはドメインを含む。本発明の一実施形態において、ＩＬ１５Ｒの刺激を促進する分子は、ｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ１５Ｒ α鎖の一部である。本発明の一実施形態において、分子はＩＬ１５Ｒ α鎖のｓｕｓｈｉドメインを提供する。本発明の一実施形態において、分子はＩＬ１５と、ＩＬ１５Ｒ α鎖のｓｕｓｈｉドメインとの複合体を提供し、これは共有結合、または非共有結合であってよい。本明細書にて開示した実験は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をブロックするＰＤ－Ｌ１結合領域、及びＩＬ１５Ｒ刺激領域の両方を含有する単一分子が、別々の分子を合わせて使用するよりも良好な免疫応答を促進することを示している。より詳細には、抗ＰＤ－Ｌ１抗体領域、及びＩＬ１５とＩＬ１５ α鎖ｓｕｓｈｉドメインとを含むハイブリッド領域を提供する分子を提供することで、別々の分子にドメインを提供する場合と比較して、増殖の増加、Ｔｈ１サイトカイン放出の増加、並びにＮＫ及びＴ細胞の殺傷活性関連分子の増加を促進した。
【0010】
一実施形態において、本発明は、配列Ｘ1ＹＸ2ＭＸ3（配列番号：３２８）（式中、Ｘ1はＡ、Ｇ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、またはＷであり、Ｘ2はＡ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、かつＸ3はＡ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＹである）を有する重鎖ＣＤＲ－１Ｈ、配列番号：２４３を有する重鎖ＣＤＲ－２Ｈ、及び配列番号：２４５の配列を有する重鎖ＣＤＲ－３Ｈを含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体または断片を提供する。ある種のかかる実施形態において、重鎖ＣＤＲ－１Ｈは、配列番号：２４１、配列番号：２６４、配列番号：２６６、配列番号：２６８、配列番号：２７０、配列番号：２７２、配列番号：２７４、配列番号：２７６、配列番号：２７８、配列番号：２８０、配列番号：２８２、配列番号：２８４、配列番号：２８６、配列番号：２８８、配列番号：２９０、配列番号：２９２、配列番号：２９４、配列番号：２９６、配列番号：２９８、配列番号：３００、配列番号：３０２、配列番号：３０４、配列番号：３０６、配列番号：３０８、配列番号：３１０、及び配列番号：３１２から選択される配列を有する。かかる実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号：２４６に対して少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。抗体は更に軽鎖可変領域を含んでよく、この領域は配列番号：２４７を有するＣＤＲ－１Ｌ、配列番号：２４８を有するＣＤＲ－２Ｌ、及び配列番号：２４９を有するＣＤＲ－３Ｌを含む。いくつかのかかる実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号：２５０に対して少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。別の実施形態において、本発明はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体またはその断片を提供し、軽鎖は、配列番号：２４７を有するＣＤＲ－１Ｌ、配列番号：２４８を有するＣＤＲ－２Ｌ、及び配列番号：２４９を有するＣＤＲ－３Ｌを含む。
【0011】
本発明はまた、抗体のコンジュゲートを、例えば非限定的に造影剤、治療薬、または細胞毒性剤に提供する。
【0012】
本発明は更に、抗体及びコンジュゲート、並びに製薬上許容できる担体を含む組成物を提供する。
【0013】
別の態様では、本発明は、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞により仲立ちされる免疫応答もまた刺激する、ＰＤＬ１に結合可能な融合タンパク質を提供する。本発明の一実施形態において、融合タンパク質はＩＬ１５受容体に結合する部分を含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、例えばインターロイキン受容体またはインターフェロン受容体に結合する部分を含む。本発明の一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１に結合する融合タンパク質の部分は、抗体またはそのＰＤ－Ｌ１結合断片である。本発明の一実施形態において、ＩＬ１５受容体結合部はＩＬ１５であり、この結合は、ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインの融合タンパク質における存在により向上されてよい。
【0014】
本発明は、有効量の本発明の抗体または断片を投与することを含む、対象におけるＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１との相互作用の阻害方法を提供する。本発明は更に、有効量の本発明の抗体もしくは断片、または本発明の融合タンパク質を投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１により仲立ちされる免疫抑制の阻害方法を提供する。
【0015】
本発明は更に、対象に、有効量の本発明の抗体もしくは断片、または本発明の融合タンパク質を投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞または組織に対して免疫応答を刺激する方法を提供する。ある種の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞または組織は、新生細胞または感染細胞である。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】抗体ｔｃｃＲ３λＦ８、ｔｃｃＲ３κＡ１１、ｔｃｃＲ３λＨ４、ｔｃｔＲ３κＡ８、ｓＲ３λＤ７、及びＲ２κＡ６の、ヒトｈＰＤＬ１－Ｆｃへの結合（左上パネル）、ｈＰＤＬ１のｈＰＤ１に対するブロック（左下パネル）、マウスｍＰＤＬ１－Ｆｃへの結合（右上パネル）、及びｍＰＤＬ１のｈＰＤ１に対するブロック（右下パネル）を示す。
【図2】抗体ｓＲ３λＤ７、ｔｃｃＲ３κＢ７、ｔｃｃＲ３κＡ４、ｔｃｃＲ３λＦ８、ｔｃｃＲ３λＤ７、ｔｃｃＲ３λＨ４、及びｔｃｃＲ３κＤ９の、ヒトｈＰＤＬ１－Ｆｃへの結合（左上パネル）、ｈＰＤＬ１のｈＰＤ１に対するブロック（左下パネル）、マウスｍＰＤＬ１－Ｆｃへの結合（右上パネル）、及びｍＰＤＬ１のｈＰＤ１に対するブロック（右下パネル）を示す。
【図3】抗体ｔｃｃＲ３κＦ８、ｔｃｃＲ３κＤ９、ｔｃｃＲ３λＤ７、ｔｃｃＲ３λＤ７、ｓＲ３κＦ１０、ｓＲ３λＤ７、及びｔｃｃＲ３λＦ８の、ヒトｈＰＤＬ１－Ｆｃへの結合（左上パネル）、ｈＰＤＬ１のｈＰＤ１に対するブロック（左下パネル）、マウスｍＰＤＬ１－Ｆｃへの結合（右上パネル）、及びｍＰＤＬ１のｈＰＤ１に対するブロック（右下パネル）を示す。
【図4】抗体Ｒ２κＡ６、ｓＲ３λＤ７、ｔｃｃＲ３λＤ７、ｔｃｃＲ３κＢ７、及びｔｃｃＲ３κＨ４の、ヒトｈＰＤＬ１－Ｆｃへの結合（左上パネル）、ｈＰＤＬ１のｈＰＤ１に対するブロック（左下パネル）、マウスｍＰＤＬ１－Ｆｃへの結合（右上パネル）、及びｍＰＤＬ１のｈＰＤ１に対するブロック（右下パネル）を示す。
【図5】抗体ｓＲ３λＤ７、ｔｃｔＲ３κＡ８、ｔｃｃＲ３κＡ１１、ｔｃｃＲ３λＤ７、ｔｃｃＲ３κＤ９、ｔｃｃＲ３λＦ８、ｔｃｃＲ３κＦ８、ｔｃｃＲ３κＦ１０、ｔｃｃＲ３λＨ４、ｔｃｃＲ３κＢ７、及びｔｃｃＲ３κＡ４の、ＰＤＬ１－２９３細胞（上）及びＭＤＳ－ＭＢ－２３１（下）細胞への結合を示す。
【図6】（Ａ）ヒト単核細胞由来の樹状細胞、（Ｂ）ＰＤ－Ｌ１ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を発現するヒト癌細胞株、及び（Ｃ）ＰＤ－Ｌ１ Ｂ１６－Ｆ１０を発現するマウス細胞株への、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合を示す。
【図7】（Ａ）ａＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズにより活性化された場合の、ＣＤ４増殖の増加、（Ｂ）ＳＥＢで活性化したヒトＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌の増加、及び（Ｃ）ｍｏ－ＤＣとの混合リンパ球反応における、ＣＤ４増殖の増加、により測定した、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の機能ブロック活性を示す。
【図8】抗ＰＤＬ１抗体及びＩＬ１５の両方が、（Ａ）ｍｏ－ＤＣとの混合リンパ球反応、並びに（Ｂ）αＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ ＦｃでコーティングしたビーズによるＣＤ８の刺激、の際に存在する場合の、ＣＤ４及びＣＤ８の活性化を示す。
【図9】（Ａ）固相ＥＬＩＳＡ、及び（Ｂ）ａＣＤ３でコーティングしたビーズによって活性化されたＣＤ４への結合、による測定で、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｕｓｈｉドメイン－ＩＬ１５（抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５と称する）融合タンパク質が、ＰＤ－Ｌ１への結合を維持することを示す。
【図10】抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質と共にｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＰＢＭＣが、ＮＫ細胞数の増加（Ａ）、ＣＤ８細胞数の増加（Ｂ）、及びグランザイムＢ（％）により測定した活性化状態（Ｃ）をもたらしたことを示す。ＣＤ４細胞（Ｄ）では効果は観察されなかった。
【図11】ａＣＤ３でコーティングしたビーズ（Ａ）の存在下において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ８の刺激を加えた場合に、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質が、ＩＬ１５と同様にＣＤ８を活性化するように機能することを示す。しかし、ａＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズの存在下において、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質はＩＬ１５（Ｂ）と比較した場合に、ＣＤ８の増殖を５倍超で増加することができる。ｃＤ７－ＳＤ１５ｎｅｇは、陰性対照として機能する、非機能的ＩＬ１５を有する抗ＰＤ－Ｌ１ ｃＤ７である。
【図12】抗原提示細胞上にＰＤ－Ｌ１ Ｆｃが存在する場合の、ＣＤ８の活性化を示す。（Ａ）グランザイムＢ陽性ＣＤ８における割合（％）の増加、及び（Ｂ）全サイトカイン分泌の増加、による測定のとおり、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質であるｃＤ７－ＳＤ１５は、著しく低い濃度でＣＤ８を刺激した。ｃＤ７－ＳＤ１５の添加により、ＩＬ１５と比較して、ａＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃにより活性化されたＣＤ８において、ＣＤ８活性化の最大量もまた増加した。（Ｃ）抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び遊離ＩＬ１５の両方の存在下におけるＣＤ８増殖のデータ（点線）は、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質の存在下でのＣＤ８増殖のデータ（直線）と重なり合う。
【図13A1】抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶH（図１３Ａ１～３）及びＶL（図１３Ｂ１～３）鎖のアミノ酸配列を示す。ＶH配列に関して、四角で囲った領域はＣＤＲを示す。ＣＤＲ－１Ｈに関して、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲはイタリック体であり、Ｋａｂａｔ ＣＤＲは下線を引いてある。ＣＤＲ－２Ｈに関して、Ｋａｂａｔ ＣＤＲは四角で囲った配列のＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ（イタリック体）と同一の広がりを持つ。ＶL配列に関して、四角で囲った領域はＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲを示す。
【図13A2】同上。
【図13A3】同上。
【図13B1】同上。
【図13B2】同上。
【図13B3】同上。
【図14】ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン及びＩＬ１５を含むＳＤ１５のアミノ酸配列（配列番号：２６１）、ｔｃｃλＤ７ＨＣ－ＳＤ１５のアミノ酸配列（配列番号：２６２）、及びｔｃｃλＤ７ＨＣ－ＳＤ１５のＬＡＬＡ変異のアミノ酸配列（配列番号：２６３）を示し、これは、ＦｃγＲＩにとって重要な重鎖定常領域内の位置（Ｌｅｕ234及びＬｅｕ235）にて、隣接する２つのロイシンのアラニン置換を含む。
【図15】分子のＰＤ－Ｌ１結合部のみ（ｃＤ７）、並びにＫＬＨに特異的な結合領域及びＩＬ１５領域を含有する融合タンパク質（ＫＬＨＳＤ１５）と比較した、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質（ＣＤ７ＳＤ１５）の毒性を示す。ヒトＣＤ８ Ｔ細胞及びＭＡＤ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ内で７日間共培養した。腫瘍細胞殺活性は、ＦＡＣＳ内でＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０により染色した、死滅腫瘍細胞の数を測定することにより評価した。
【図16】抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍を有するマウスの生残率を引き延ばしたことを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２×１０5個のマウスＣＴ２６結腸腫瘍細胞を静脈内注射した。２４時間後、マウスは抗ＰＤ－Ｌ１抗体ｃＤ７（紫の線：一投与あたり７５ｕｇ）、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質ｃＤ７－ＳＤ１５（緑の線：一投与あたり７５ｕｇ、青の線：一投与あたり２５ｕｇ）、またはｓＤ７－ＳＤ１５（灰色の線：一投与あたり７５ｕｇ、赤の線：一投与あたり２５ｕｇ）の腹腔内投与を、最初の週は週に二度、次いで残りの治療過程においては週に一度で受けた。対照群のマウスは、等体積の生理食塩水または通常のＩｇＧ溶液を受けた。生残率は、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒプロットを使用して測定した。
【図17】可溶性ヒトＰＤＬ１、可溶性マウスＰＤＬ１、及び可溶性ラットＰＤＬ１に対する、２つの親和性成熟抗ＰＤＬ１抗体の結合、並びに、ヒトＰＤＬ２への非結合を示す。
【図18】親ｔｃｃλＤ７抗体と比較した、２つの親和性成熟抗ＰＤＬ１抗体による、ヒトＰＤ１のヒトＰＤＬ１に対するブロック（左パネル）、及びマウスＰＤ１のマウスＰＤＬ１に対するブロック（右パネル）を示す。
【図19】抗ＰＤ－Ｌ１抗体ｔｃｃλＤ７の２つの親和性成熟変異体は、フローサイトメトリーにより測定したとおり、ＰＤ－Ｌ１を発現するヒトＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞に対するより高い結合活性を有することを示す。
【図20】Ｔｈ１サイトカインＩＬ２（上のパネル）及びＩＦＮγ（下のパネル）の産生を促進する能力が増大した、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ｔｃｃλＤ７の親和性成熟変異体を示す。
【図21】本発明の融合タンパク質の、ＰＤ－Ｌ１発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞への結合を示す。
【図22】本発明のタンパク質の、ＩＬ１５応答性ヒト巨核芽球性白血病細胞への刺激活性を示す。
【図23】本発明の融合タンパク質に対する、ｈＰＤ－Ｌ１結合（左パネル）及びリガンドブロック（右パネル）活性を示す。
【図24】本発明の融合タンパク質に対する、サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。
【図25】本発明の融合タンパク質に対する血清の安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
免疫細胞上でＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１と相互作用することで、免疫細胞による増殖及びサイトカイン産生が阻害される。ＰＤ－Ｌ１はまた、癌を含む種々の組織で誘発可能かつ上方制御される。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１は共に、免疫抑制の役割を果たす。本発明は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１との相互作用をブロックする新規の抗体、及びかかる抗体の抗原結合断片を提供する。本発明の実施形態において、抗体は免疫抑制を低下させるかまたは阻害する。
【0018】
本発明の新規の抗体は表１、及び添付の配列一覧に記述されており、これらは、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの識別システムにしたがって識別）、並びに完全な重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列について説明している。最初の２つの重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの一般的なシステムにしたがって識別され、これらにより、区別できるが重なり合う、ＣＤＲの位置が提供される。多数の重鎖及び軽鎖を比較することで、多くのＣＤＲ配列の中で著しい類似性が示される。したがって、多くのＣＤＲを混合し、配列内でマッチングさせることができると予想される。
【0019】
抗体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、及び／または付加を有することができる。ある種の実施形態において、抗体は上述の重鎖可変領域の１つ及び上述の軽鎖可変領域の１つを含む。ある種の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１抗体またはその結合断片は、表１で説明したＣＤＲ及び可変領域配列に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、１つ以上のＣＤＲまたは１つ以上の可変領域を含む。
【0020】
「同一性」とは、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れた、２つのアミノ酸または核酸配列により共有されている、同一位置の数または割合を意味し、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要がある。「実質的に同一である」とは、保存的アミノ酸置換、例えば同一クラスの別のアミノ酸に対するアミノ酸置換（例えばグリシンに対するバリン、リジンに対するアルギニン等）によって、または、タンパク質の機能を破壊しないアミノ酸配列の位置における１つ以上の非保存的置換、欠失、もしくは挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味する。アミノ酸置換は、場合によっては、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、を維持する効果が著しく異ならない置換を選択することにより行うことができる。例えば、天然の残基は側鎖の性質に基づいてグループ：（１）疎水性アミノ酸（ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン）；（２）中性親水性アミノ酸（システイン、セリン及びスレオニン）；（３）酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；（４）塩基性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リジン及びアルギニン）；（５）鎖配向に影響を与えるアミノ酸（グリシン及びプロリン）；並びに（６）芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニン）に分けることが可能である。これらのグループ内で行われる置換は、保存的置換と考えることができる。置換の例としては、非限定的に、アラニンに対するバリン、アルギニンに対するリジン、アスパラギンに対するグルタミン、アスパラギン酸に対するグルタミン酸、システインに対するセリン、グルタミンに対するアスパラギン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、グリシンに対するプロリン、ヒスチジンに対するア
ルギニン、イソロイシンに対するロイシン、ロイシンに対するイソロイシン、リジンに対するアルギニン、メチオニンに対するロイシン、フェニルアラニンに対するロイシン、プロリンに対するグリシン、セリンに対するスレオニン、スレオニンに対するセリン、トリプトファンに対するチロシン、チロシンに対するフェニルアラニン、及び／またはバリンに対するロイシンの置換が挙げられる。
ルギニン、イソロイシンに対するロイシン、ロイシンに対するイソロイシン、リジンに対するアルギニン、メチオニンに対するロイシン、フェニルアラニンに対するロイシン、プロリンに対するグリシン、セリンに対するスレオニン、スレオニンに対するセリン、トリプトファンに対するチロシン、チロシンに対するフェニルアラニン、及び／またはバリンに対するロイシンの置換が挙げられる。
【0021】
好ましくは、アミノ酸配列は、本明細書にて開示したアミノ酸配列に少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である。配列類似性を測定するための方法及びコンピュータプログラムは一般に入手可能であり、非限定的に、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）、及びＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）が挙げられる。既知のＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた使用し、類似性を測定してよい。ＢＬＡＳＴプログラムはＮＣＢＩ及び他のソースからから入手可能である（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；ＢＬＡＳＴ ２．０、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／にて）。配列の比較において、これらの方法は種々の置換、欠失、及び他の変異を調査する。保存的置換としては通常、以下の群内の置換が挙げられる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン、リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
【0022】
本発明の抗体は更に、結合特性が直接変異、親和性成熟法、ファージディスプレイ、または鎖シャッフリングにより改善された抗体も含む。親和性及び特異性は、ＣＤＲを変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位に対してスクリーニングすることにより修正または向上されてよい。ＣＤＲは様々な方法で変異される。一方法は、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化することで、別様においては同一である抗原結合部位の母集団において、２０個のアミノ酸全てが特定の位置に見出されるようにすることである。あるいは、エラープローンＰＣＲ法により、ＣＤＲ残基の一連の範囲にわたり変異を誘発する（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２６：８８９－８９６（１９９２）を参照のこと）。例えば、重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージディスプレイベクターを、大腸菌の突然変異誘発株内で増殖させてよい（例えば、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２５０：３５９－３６８（１９９６）を参照のこと）。突然変異誘発のこれらの方法は、当業者に既知の多くの方法を代表するものである。
【0023】
免疫原性を最小限にするためには、ヒト定常領域配列を含む抗体が好ましい。抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ）、及びこれらのサブクラスの一員であってよいか、またはこれらを組み合わせてよい。抗体クラスは、自然抗体のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））を最適化するように選択されてよい。
【0024】
本発明のある種の実施形態は、ＰＤ－Ｌ１結合抗体断片の使用を伴う。Ｆｖは、６つ全ての超可変ループ（ＣＤＲ）を含む、完全な重鎖及び軽鎖可変領域を包含する最少の断片である。定常領域を欠いているため、可変領域は非共有結合である。ＶH及びＶL領域を結合させて抗原結合部位を形成することができるリンカーを使用して、重鎖及び軽鎖を結合し単一ポリペプチド鎖（「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」）にしてよい。本発明の一実施形態において、リンカーは（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）3である。ｓｃＦｖ断片は抗体全体の定常領域を欠いているため、これらは抗体全体よりも大幅に小さ
い。ｓｃＦｖ断片にはまた、通常の重鎖定常領域と他の生体分子との相互作用がなく、これは、ある種の実施形態において好ましくない場合がある。
い。ｓｃＦｖ断片にはまた、通常の重鎖定常領域と他の生体分子との相互作用がなく、これは、ある種の実施形態において好ましくない場合がある。
【0025】
ＶH、ＶL、及び任意にＣL、ＣH１、または他の定常領域を含む抗体断片もまた、使用することができる。パパイン分解によって生成された抗体一価の断片はＦａｂと呼ばれ、重鎖ヒンジ領域を欠いている。ペプシン分解によって生成された断片はＦ（ａｂ’）2と呼ばれ、重鎖ヒンジを保持し二価である。このような断片はまた、組み換えにより作製してもよい。他の多くの有用な抗原結合抗体断片は当技術分野において既知であり、二重特異性抗体、三重特異性抗体、単一領域抗体、並びに他の一価及び多価の形態が挙げられるが、これらに限定されない。
【0026】
本発明は更に多価の抗原結合タンパク質を提供し、抗体、その抗原結合断片、及び抗体の抗原結合部の全てまたは一部からなるタンパク質の形態とすることができるが、これらに限定されない。多価の抗原結合タンパク質は、単一特異的、二重特異的、または多重特異的であってよい。用語「特異性」とは、特定の分子が結合できる抗原決定基の異なる種類の数を意味する。免疫グロブリン分子が１種類のみの抗原決定基に結合する場合、その免疫グロブリン分子は単一特異的である。免疫グロブリン分子が異なる種類の抗原決定基に結合する場合、その免疫グロブリン分子は多重特異的である。
【0027】
本発明の一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で、少なくとも約１０2Ｍ-1ｓ-1；少なくとも約１０3Ｍ-1ｓ-1；少なくとも約１０4Ｍ-1ｓ-1；少なくとも約１０5Ｍ-1ｓ-1；または少なくとも約１０6Ｍ-1ｓ-1の結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で、１０2Ｍ-1ｓ-1～１０3Ｍ-1ｓ-1；１０3Ｍ-1ｓ-1～１０4Ｍ-1ｓ-1；１０4Ｍ-1ｓ-1～１０5Ｍ-1ｓ-1；または１０5Ｍ-1ｓ-1～１０6Ｍ-1ｓ-1の結合速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【0028】
別の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で、最大約１０-3ｓ-1；最大約１０-4ｓ-1；最大約１０-5ｓ-1；または最大約１０-6ｓ-1の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。一実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴による測定で、１０-3ｓ-1～１０-4ｓ-1；１０-4ｓ-1～１０-5ｓ-1；または１０-5ｓ-1～１０-6ｓ-1の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【0029】
別の実施形態において、ＰＤ－Ｌ１結合タンパク質は、最大約１０-7Ｍ；最大約１０-8Ｍ；最大約１０-9Ｍ；最大約１０-10Ｍ；最大約１０-11Ｍ；最大約１０-12Ｍ；または最大約１０-13Ｍの解離定数（Ｋd）を有する。一実施形態において、結合タンパク質は、その標的に対して、１０-7Ｍ～１０-8Ｍ；１０-8Ｍ～１０-9Ｍ；１０-9Ｍ～１０-10Ｍ；１０-10Ｍ～１０-11Ｍ；１０-11Ｍ～１０-12Ｍ；１０-12Ｍ～１０-13Ｍの解離定数（Ｋd）を有する。
【0030】
本明細書で記載される結合タンパク質は、造影剤、治療薬または細胞毒性剤を更に含むコンジュゲートであってよい。一実施形態において、造影剤は、放射線標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、またはビオチンである。別の実施形態では、放射線標識は3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ、177Ｌｕ、または153Ｓｍである。更に他の実施形態では、治療剤または細胞毒性剤は、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、血管新生阻害剤、有糸分裂阻害剤、アントラサイクリン、毒素、またはアポトーシス剤である。以下で論じる通り、免疫活性化サイトカインが特に重要である。
【0031】
本発明はまた、ＰＤ－Ｌ１に結合して免疫抑制を阻害して、他のリガンドまたは受容体
との相互作用により免疫応答も促進する分子も提供する。本明細書で例示するように、かかる分子は、抗体のＰＤ－Ｌ１結合領域を、ＮＫまたはＴ細胞機能を刺激する領域と結合する。かかる刺激領域は、非限定的に、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、及びＩＬ２１等に限定されないインターロイキンまたはインターフェロンに対して応答性の受容体に結合して、受容体を刺激する領域とすることができる。本明細書で例示する刺激領域は、リンカーにより、ＩＬ１５に結合したＩＬ１５Ｒα鎖のｓｕｓｈｉドメインを含むハイブリッド領域（例えば配列番号：２６１）である。完全分子の例は、配列番号：２６２により表記される。抗体領域とＩＬ１５Ｒ刺激領域との間にあり、領域内でのタンパク質分解を阻害する、２つのアミノ酸置換基で修飾されたほぼ同一の分子は、配列番号：２６３により表記される。本明細書で実証されるとおり、免疫抑制を阻害するＰＤ－Ｌ１結合領域、及び免疫応答を促進する第２領域を含む分子は、これらの機能を別々に付与する２つの異なる分子と比較して、増加した免疫細胞活性を付与する。
との相互作用により免疫応答も促進する分子も提供する。本明細書で例示するように、かかる分子は、抗体のＰＤ－Ｌ１結合領域を、ＮＫまたはＴ細胞機能を刺激する領域と結合する。かかる刺激領域は、非限定的に、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、及びＩＬ２１等に限定されないインターロイキンまたはインターフェロンに対して応答性の受容体に結合して、受容体を刺激する領域とすることができる。本明細書で例示する刺激領域は、リンカーにより、ＩＬ１５に結合したＩＬ１５Ｒα鎖のｓｕｓｈｉドメインを含むハイブリッド領域（例えば配列番号：２６１）である。完全分子の例は、配列番号：２６２により表記される。抗体領域とＩＬ１５Ｒ刺激領域との間にあり、領域内でのタンパク質分解を阻害する、２つのアミノ酸置換基で修飾されたほぼ同一の分子は、配列番号：２６３により表記される。本明細書で実証されるとおり、免疫抑制を阻害するＰＤ－Ｌ１結合領域、及び免疫応答を促進する第２領域を含む分子は、これらの機能を別々に付与する２つの異なる分子と比較して、増加した免疫細胞活性を付与する。
【0032】
本明細書で例示するように、分子のＰＤ－Ｌ１結合部は、抗体の抗原結合領域である。複数の、新規の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域、並びにこれらを含む抗体を提供する。本発明に従うと、ＰＤ－Ｌ１結合部は、ＰＤ－Ｌ１に結合して免疫抑制をブロックする任意の作用物質とすることができる。これらには、本明細書にて開示したこれらの新規の抗体、並びにＰＤ１由来のペプチド及びタンパク質（ＰＤ－Ｌ１の天然リガンド）に限定されない、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び断片が挙げられる。
【0033】
本明細書にて開示するとおり、ＰＤ－Ｌ１結合領域は、ＮＫ及びＴ細胞活性を刺激する領域に結合される。この領域はＩＬ１５を含み、フレキシブルなリンカーである、ＩＬ１５受容体のα鎖の「ｓｕｓｈｉ」ドメインにより刺激領域に結合される。ｓｕｓｈｉドメインはＩＬ１５に高い親和性を有して結合し、ｓｕｓｈｉドメインとＩＬ１５との複合体は、ＮＫ及びＴ細胞増殖の刺激に対して特に活性である。特に顕著なことは、実施例に示されるとおり、ＩＬ１５刺激領域と同一の分子内でＰＤ－Ｌ１結合領域を組み合わせた作用物質による治療は、別々の分子としてＰＤ－Ｌ１結合領域とＩＬ１５刺激領域を使用する併用治療よりも効果的である。
【0034】
したがって、ある種の実施形態では、本発明は、ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ１への結合をブロックする領域と、ＩＬ１５Ｒを刺激することで免疫細胞の増殖を刺激する領域とを含む、ハイブリッド分子を企図する。例示するように、ＩＬ１５Ｒ刺激領域は、例えば一本鎖Ｆｖ分子（即ち、主にセリンとグリシンである１５～２０個のアミノ酸を含有）に対して用いられるものに類似の、フレキシブルなリンカーによりＩＬ１５に結合したＩＬ１５Ｒ α鎖のｓｕｓｈｉドメインを含む。実際には、使用可能な他の方法が存在し、これらは例えば、製造手順に対して好ましい場合がある。更に、ある方法では領域の構造、したがって、開示したハイブリッドタンパク質のモジュール構造及び他の特徴を認識する。例えば、ｓｕｓｈｉドメインをＩＬ１５に結合するリンカーは、ハイブリッドを１つのポリペプチドとして発現するのに有用であるが、他の作用物質、リンカー、または架橋剤で置き換えることも同様に可能である。あるいは、ＩＬ１５Ｒ α鎖のｓｕｓｈｉ含有領域に対するＩＬ１５の高親和性は、ｓｕｓｈｉドメインとＩＬ１５が、共有結合を必要としない安定な複合体を形成し得ることを示す。同様に、例示のタンパク質が抗体全体の定常領域を構成する一方で、ＰＤ－Ｌ１結合抗体の他の抗原結合断片も十分間に合う。
【0035】
したがって、本発明は、ＩＬ１５Ｒ刺激領域に結合したＰＤ－Ｌ１結合領域を提供し、このＩＬ１５Ｒ刺激領域は、ＩＬ１５Ｒ α鎖のｓｕｓｈｉドメインまたはその変異体、及びＩＬ１５またはその変異体を含む。ある種の実施形態において、変異体は、本明細書にて開示した配列に８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％同一である。一実施形態では、ＩＬ１５Ｒ α鎖のｓｕｓｈｉドメインとＩＬ１５は共有結合複合体を形成する。別の実施形態において、ＩＬ１５Ｒ α鎖のｓｕ
ｓｈｉドメインとＩＬ１５は、非共有結合複合体を形成する。ＰＤ－Ｌ１結合領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲ、または、本明細書にて開示した抗体、その抗原結合断片、もしくはその変異体（例えば８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％同一である変異体）の重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域、もしくは、ＰＤ－１への結合をブロックする当該技術分野において公知のＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片を含むことができる。
ｓｈｉドメインとＩＬ１５は、非共有結合複合体を形成する。ＰＤ－Ｌ１結合領域は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのＣＤＲ、または、本明細書にて開示した抗体、その抗原結合断片、もしくはその変異体（例えば８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、もしくは９５％同一である変異体）の重鎖及び／もしくは軽鎖可変領域、もしくは、ＰＤ－１への結合をブロックする当該技術分野において公知のＰＤ－Ｌ１抗体もしくはその抗原結合断片を含むことができる。
【0036】
本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びハイブリッドタンパク質は、予防または治療目的で哺乳類に使用した場合、製薬上許容できる担体を更に含む組成物の形態で投与されることが理解される。製薬上許容できる好適な担体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、スクロース、ポリソルベート、エタノール等、加えてこれらの組み合わせの１つ以上が挙げられる。製薬上許容できる担体は更に、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤または緩衝剤等の少量の補助剤を含んでよく、これらは抗体の保存性または有効性を高める。
【0037】
本発明の方法において、治療に有効な量の、本発明のハイブリッドタンパク質の抗体は、それを必要とする哺乳類に投与される。本発明で使用する場合、用語「投与する」は、必要な結果を達成し得る任意の方法により、本発明の抗体及び融合タンパク質を哺乳類に送達することを意味する。抗体は例えば、静脈内または筋肉内投与をしてよい。本発明の例示の抗体はヒトへの投与に特に有用であるが、これらは他の哺乳類にも同様に投与してよい。本発明で使用する場合、用語「哺乳類」はヒト、実験動物、ペット、及び家畜を含むことを目的としているが、これらに限定されない。「治療に有効な量」とは、哺乳類に投与した際、キナーゼ活性阻害等、所望の治療効果を生み出すのに効果的である本発明の抗体の量を意味する。
【0038】
本発明の抗体及びハイブリッドタンパク質は、腫瘍及び他の腫瘍性疾患の阻害、並びに、免疫抑制と関係する他の病態の治療に有用である。治療可能な腫瘍としては、原発腫瘍、転移性腫瘍、及び難治性腫瘍を挙げることができる。難治性腫瘍としては、化学療法剤のみ、抗体のみ、放射線のみ、またはこれらの組み合わせによる治療に対して応答しない、または耐性のある腫瘍が挙げられる。難治性腫瘍はまた、このような作用物質により阻害されたように見えるが、治療を終えた後に最大５年で、場合によっては１０年以上で再発する腫瘍も包含する。抗体は、血管新生化腫瘍、及び血管新生化されていない、または依然として実質的に血管新生化されていない腫瘍の治療に効果的である。
【0039】
抗体により治療され得る充実性腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、神経膠腫及びリンパ腫が挙げられる。かかる腫瘍の幾つかの例としては、類表皮腫瘍、扁平腫瘍（例えば頭頸腫瘍）、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、胸腫瘍、小細胞及び非小細胞肺腫瘍を含む肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、並びに肝臓腫瘍が挙げられる。その他の例としては、カポジ肉腫、ＣＮＳ腫瘍、神経芽細胞腫、毛管血管芽細胞腫、髄膜腫及び脳転移、黒色腫、胃腸及び腎臓癌／肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、好ましくは多形性膠芽腫、並びに平滑筋肉腫が挙げられる。本発明の拮抗剤が効果的である血管新生化皮膚癌の例としては、悪性ケラチノサイト（例えばヒト悪性ケラチノサイト）の増殖を抑制することにより治療可能な扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、及び皮膚癌が挙げられる。
【0040】
非充実性腫瘍の例としては、ＩＬ１５等のサイトカインに対して非応答性である白血病、多発性骨髄腫及びリンパ腫が挙げられる。白血病の幾つかの例としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤血球白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、または単球性白血病が挙げられる。リンパ腫の幾つかの例としては、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。
【0041】
本発明のハイブリッドタンパク質を刺激するＰＤ－Ｌ１抗体及び免疫細胞はまた、ウイルス感染の治療にも使用される。Ｔ細胞上にＰＤ－１が発現することは、ＨＩＶのウイルス量及びＨＣＶに感染した患者と関係があり、ＰＤ－１の発現は、枯渇したウイルス特異的なＣＤ８+Ｔ細胞のマーカーとして識別されている。例えば、ＰＤ－１+ＣＤ８+Ｔ細胞は、エフェクター機能障害、及びＰＤ－１が関係するＴ細胞の枯渇を示すが、これらは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用をブロックすることにより回復可能である。このことは、ウイルス特異的なＣＤ８+Ｔ細胞が仲立ちする免疫の回復をもたらし、拮抗抗体を使用してＰＤ－１のシグナル伝達を妨げることにより、Ｔ細胞のエフェクター機能が回復することを示している。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１のブロックに基づく免疫療法は、腫瘍抗原に対するＴ細胞耐性の破壊をもたらすだけでなく、ウイルス特異的エフェクタ－Ｔ細胞を再活性化し、慢性的ウイルス感染での病原体を撲滅する戦略も提供する。したがって、本発明の抗体及びハイブリッドタンパク質は、非限定的にＨＣＶ及びＨＩＶ、並びにリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）を含む慢性ウイルス感染の治療に有用である。
【0042】
本発明の抗体及びハイブリッドタンパク質は、それを必要とする患者に、第二剤と共に有利に投与することができる。例えば、幾つかの実施形態では、本発明の抗体またはハイブリッドタンパク質は、抗新生物薬と共に対象に投与される。幾つかの実施形態では、本発明の抗体またはハイブリッドタンパク質は第２の血管新生阻害剤と共に対象に投与される。幾つかの実施形態では、本発明の抗体またはハイブリッドタンパク質は、抗炎症剤または免疫抑制剤と共に投与される。
【0043】
抗悪性腫瘍薬としては、細胞傷害性化学療法剤、標的低分子及び生体分子、並びに放射線が挙げられる。化学療法剤の非限定例としては、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、イリノテカン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテール）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクシウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、インターフェロンα、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル、タキソール、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【0044】
標的低分子及び生体分子としては、チロシンキナーゼ調節物質及び受容体型チロシンキナーゼ阻害剤等のシグナル伝達経路の成分阻害剤、並びに、腫瘍特異的抗原に結合する作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍形成に関係する成長因子受容体の非限定例は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦＲ）、神経成長因子（ＮＧＦＲ）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦＲ）に対する受容体、並びに、ＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）、ｅｒｂＢ３、及びｅｒｂＢ４を含む、上皮成長因子受容体ファミリーの受容体である。
【0045】
ＥＧＦＲ拮抗剤としては、ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲリガンドに結合し、リガンド結合及び／または受容体活性化を阻害する抗体が挙げられる。例えば、この作用物質は、他のＥＧＦＲファミリーメンバーとの、受容体ダイマーまたはヘテロダイマーの形成をブロックすることができる。ＥＧＦＲに対するリガンドとしては例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ－ＥＧＦ）、及びβレグルリン（ｂｅｔａｒ
ｅｇｕｌｌｕｌｉｎ）が挙げられる。ＥＧＦＲ拮抗剤はＥＧＦＲの細胞外部分に外的に結合することができ（これはリガンドの結合を阻害し得る、もしくは阻害し得ない）、または、チロシンキナーゼ領域に内的に結合することができる。ＥＧＦＲ拮抗剤としては更に、例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の成分の機能を阻害することにより、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達を阻害する作用物質が挙げられる。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲ拮抗剤の例としては、ＥＧＦＲに特異的な抗体（及びその機能的等価物）等の生体分子、並びに、ＥＧＦＲの細胞質領域に直接作用する合成キナーゼ阻害剤等の小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
ｅｇｕｌｌｕｌｉｎ）が挙げられる。ＥＧＦＲ拮抗剤はＥＧＦＲの細胞外部分に外的に結合することができ（これはリガンドの結合を阻害し得る、もしくは阻害し得ない）、または、チロシンキナーゼ領域に内的に結合することができる。ＥＧＦＲ拮抗剤としては更に、例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の成分の機能を阻害することにより、ＥＧＦＲ依存性シグナル伝達を阻害する作用物質が挙げられる。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲ拮抗剤の例としては、ＥＧＦＲに特異的な抗体（及びその機能的等価物）等の生体分子、並びに、ＥＧＦＲの細胞質領域に直接作用する合成キナーゼ阻害剤等の小分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0046】
小分子及び生物学的阻害剤としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びセツキシマブを含む上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤、ＨＥＲ２の阻害剤（例えばトラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン（トラスツズマブ－ＤＭ１；Ｔ－ＤＭ１）及びペルツズマブ）、抗ＶＥＧＦ抗体及び断片（例えばベバシズマブ）、ＣＤ２０を阻害する抗体（例えばリツキシマブ、イブリツモマブ）、抗ＶＥＧＦＲ抗体（例えばラムシルマブ（ＩＭＣ－１１２１Ｂ）、ＩＭＣ－１Ｃ１１、及びＣＤＰ７９１）、抗ＰＤＧＦＲ抗体、並びにイマチニブが挙げられる。低分子キナーゼ阻害剤は特定のチロシンキナーゼに特異的であることができるか、または２つ以上のキナーゼの阻害剤であることができる。例えば、化合物Ｎ－（３，４－ジクロロ－２－フルオロフェニル）－７－（｛［（３ａＲ，６ａＳ）－２－メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール－５－イル］メチル｝オキシ）－６－（メチルオキシ）キナゾリン－４－アミン（ＸＬ６４７、ＥＸＥＬ－７６４７及びＫＤ－０１９としても知られている）は、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＢ４、ＫＤＲ （ＶＥＧＦＲ）、Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）及びＥｒｂＢ２を含む複数の受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害剤であり、かつ、ＳＲＣキナーゼの阻害剤でもあり、特定のＴＫＩに対して腫瘍が非反応性となる経路に関係する。本発明の一実施形態において、必要な対象の治療には、式Ｉの化合物のＲｈｏキナーゼ阻害剤の投与、及びＫＤ－０１９の投与が含まれる。
【0047】
ダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は別の、経口投与可能なＡＴＰ部位競合Ｓｒｃ阻害剤である。ダサチニブはまた、Ｂｃｒ－Ａｂｌ（慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはフィラデルフィア染色体陽性（Ｐｈ＋）急性リンパ性白血病（ＡＬＬ））を有する患者にて使用するためのもので、ＦＤＡ認可済み）、並びにｃ－ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ、ｃ－ＦＭＳ、ＥｐｈＡ２、及びＳＦＫｓも標的とする。Ｓｒｃ及びＢｃｒ－Ａｂｌの他の２つの経口チロシンキナーゼ阻害剤は、ボスチニブ（ＳＫＩ－６０６）及びサラカチニブ（ＡＺＤ０５３０）である。
【0048】
本発明の一実施形態において、本発明のＰＤ－Ｌ１抗体またはコンジュゲートは、慢性ウイルス感染症を治療するために抗ウイルス剤と組み合わせて使用される。例えば、ＨＣＶに関しては、以下の作用物質を使用することができる。ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤としては、ボセプレビル、テラプレビル（ＶＸ－９５０）、ＩＴＭＮ－１９１、ＳＣＨ－９００５１８、ＴＭＣ－４３５、ＢＩ－２０１３３５、ＭＫ－７００９、ＶＸ－５００、ＶＸ－８１３、ＢＭＳ７９００５２、ＢＭＳ６５００３２及びＶＢＹ３７６が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶ非構造タンパク質４Ｂ（ＮＳ４Ｂ）阻害剤としては、クレミゾール、並びに、非限定的にベンゾイミダゾールＲＢＩ（Ｂ－ＲＢＩ）及びインダゾールＲＢＩ（Ｉ－ＲＢＩ）を含む他のＮＳ４Ｂ－ＲＮＡ結合阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶ非構造タンパク質５Ａ（ＮＳ５Ａ）阻害剤としては、ＢＭＳ－７９００５２、Ａ－６８９、Ａ－８３１、ＥＤＰ２３９、ＧＳ５８８５、及びＰＰ１４６１が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＣＶポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）阻害剤としては、ヌクレオシド類似体（例えばバロピシタビン、Ｒ１４７９、Ｒ１６２６、Ｒ７１２８）、ヌクレオチド類似体（例えばＩＤＸ１８４、ＰＳＩ－７８５１、ＰＳＩ－７９７７）、及び非ヌクレオシド類似体（例えばフィリブビル（ｆｉｌｉｂｕｖｉｒ）、ＨＣＶ－７
９６、ＶＣＨ－７５９、ＶＣＨ－９１６、ＡＮＡ５９８、ＶＣＨ－２２２ （ＶＸ－２２２）、ＢＩ－２０７１２７、ＭＫ－３２８１、ＡＢＴ－０７２、ＡＢＴ－３３３、ＧＳ９１９０、ＢＭＳ７９１３２５）が挙げられるが、これらに限定されない。また、リバビリン、またはタリバビリン（ビラミジン；ＩＣＮ ３１４２）等のリバビリン類似体、ミゾリビン、メリメポジブ（Ｍｅｒｉｍｅｐｏｄｉｂ）（ＶＸ－４９７）、ミコフェノール酸モフェチル、及びミコフェノレートを使用することもできる。
９６、ＶＣＨ－７５９、ＶＣＨ－９１６、ＡＮＡ５９８、ＶＣＨ－２２２ （ＶＸ－２２２）、ＢＩ－２０７１２７、ＭＫ－３２８１、ＡＢＴ－０７２、ＡＢＴ－３３３、ＧＳ９１９０、ＢＭＳ７９１３２５）が挙げられるが、これらに限定されない。また、リバビリン、またはタリバビリン（ビラミジン；ＩＣＮ ３１４２）等のリバビリン類似体、ミゾリビン、メリメポジブ（Ｍｅｒｉｍｅｐｏｄｉｂ）（ＶＸ－４９７）、ミコフェノール酸モフェチル、及びミコフェノレートを使用することもできる。
【0049】
ある種の実施形態において、一回分の本発明の抗体またはハイブリッドタンパク質を対象に、毎日、１日おき、数日おき、３日に１回、週に１回、週に２回、週に３回、または２週に１回投与する。他の実施形態では、２、３または４回分の投与量の化合物または組成物を毎日、数日おき、３日に１回、週に１回、または２週に１回、対象に投与する。幾つかの実施形態では、投与量の化合物または組成物を２日、３日、５日、７日、１４日、または２１日間投与する。ある種の実施形態において、投与量の化合物または組成物を１ヶ月、１．５ヶ月、２ヶ月、２．５ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月間またはそれ以上投与する。
【0050】
投与方法としては、非経口、皮内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経鼻、硬膜外、経口、舌下、経鼻、脳内、腟内、経皮、経粘膜、直腸、吸入、または局所（特に耳、鼻、目、もしくは皮膚）が挙げられるが、これらに限定されない。投与方法は施術者の裁量に委ねられる。ほとんどの場合、投与により化合物を血流中に放出する。眼疾患の治療には、生物学的作用物質の硝子体内投与が好ましい。
【0051】
特定の実施形態において、局所的に化合物を投与するのが望ましい場合がある。この投与は例えば、局所注入・局所適用により、注射により、カテ－テルにより、またはインプラント（このインプラントは多孔性・非多孔性、またはゲル状物質であり、シラスティック膜または繊維等が含まれる）により達成され得るが、これらに限定されない。かかる例において投与は、化合物を実質的に血流中に放出することなく、選択的に局部組織を標的としてよい。
【0052】
例えば、吸入器もしくはネブライザを使用、及びエアロゾル化剤を処方して、またはフルオロカーボンもしくは合成肺サーファクタント中での還流により、経肺投与もまた用いることができる。ある種の実施形態において、従来の結合剤及びトリグリセリド等の賦形剤を用いて化合物を座薬として配合してよい。
【0053】
別の実施形態において、化合物を小胞、特にリポソームとして送達する（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７－３２７；通常同上の箇所を参照のこと）。
【0054】
別の実施形態において、化合物を制御放出系にて送達する（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）を参照のこと）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３の説明にて考察されている制御放出系の例を使用してよい。一実施形態では、ポンプを使用してよい（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ
．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏ ｍｏ １．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと；また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照のこと）。
．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏ ｍｏ １．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと；また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照のこと）。
【0055】
上述の投与スケジュールは例示の目的のためだけに提供するものであり、これらに限定されるべきではない。当業者は速やかに、あらゆる投与が本発明の範囲内にあることを理解するであろう。
【0056】
本明細書において開示された発明原理の変形が当業者により行われ得ることが理解及び想定されるべきであり、また、このような変形は本発明の範囲に含まれるべきであることが意図される。
【0057】
本出願の至るところで、種々の出版物が参照されている。これらの出版物は、本発明が関係する現況技術をより完全に説明するために、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。以下の実施例において本発明を更に説明するが、決して本発明の適用範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【0058】
混合リンパ球反応：
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒト単核細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した全血からの陰性選択により、ＣＤ１４陽性単核細胞を単離した。１５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦと５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４を含む１０％ ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ中で、ＣＤ１４陽性細胞を６～７日間培養することにより、未成熟リンパ球由来の樹状細胞（ｍｏ－ＤＣ）を作製した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＤ４陽性細胞を全血から陰性単離した。次に、異なるドナーからのｍｏ－ＤＣ及びＣＤ４陽性細胞をそれぞれ、ＣＤ４細胞に対するｍｏ－ＤＣの比率を１～１０にして、共培養した。抗ＰＤＬ１抗体のブロック機能を評価するために、増量した抗ＰＤＬ１抗体を、共培養の初めに添加した。場合によっては、増量したＩＬ１５もまた、共培養の初めに添加した。６または７日目にて、ＥＬＩＳＡによる分泌ＩＬ－２及びＩＦＮγの測定のために、上清を収集した。ＣＤ４細胞の数、及び増殖マーカーであるＫｉ６７の発現を、フローサイトメトリーにより評価した。
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒト単核細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した全血からの陰性選択により、ＣＤ１４陽性単核細胞を単離した。１５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦと５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４を含む１０％ ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ中で、ＣＤ１４陽性細胞を６～７日間培養することにより、未成熟リンパ球由来の樹状細胞（ｍｏ－ＤＣ）を作製した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＣＤ４濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＤ４陽性細胞を全血から陰性単離した。次に、異なるドナーからのｍｏ－ＤＣ及びＣＤ４陽性細胞をそれぞれ、ＣＤ４細胞に対するｍｏ－ＤＣの比率を１～１０にして、共培養した。抗ＰＤＬ１抗体のブロック機能を評価するために、増量した抗ＰＤＬ１抗体を、共培養の初めに添加した。場合によっては、増量したＩＬ１５もまた、共培養の初めに添加した。６または７日目にて、ＥＬＩＳＡによる分泌ＩＬ－２及びＩＦＮγの測定のために、上清を収集した。ＣＤ４細胞の数、及び増殖マーカーであるＫｉ６７の発現を、フローサイトメトリーにより評価した。
【0059】
ＰＢＭＣの活性化
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ）を使用してＰＢＭＣを全血から単離し、１０％ ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ中で培養して、ＳＥＢ（０．１ｕｇ／ｍＬ）、ＰＨＡ（１ｕｇ／ｍＬ）または抗－ＣＤ３クローンＨｉＴ３ａ（１ｕｇ／ｍＬ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のいずれかにより、３～７日間活性化した。抗ＰＤＬ１抗体または抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５融合タンパク質のいずれかの結合を、活性化したＰＢＭＣ内でフローサイトメトリーにより３日後に評価した。抗ＰＤＬ１抗体の機能評価は、ＳＥＢによるＰＢＭＣ活性化の間に、増量した抗ＰＤＬ１抗体を添加することにより行った。２または３日目に
、ＩＬ－２及びＩＦＮγの測定のために上清を収集した。抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５融合タンパク質の場合、抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５または抗ＰＤＬ１抗体のいずれかの存在下で、他の活性化を行うことなくＰＢＭＣを培養した。６日目に細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＣＤ８及びグランザイムＢ、ＣＤ８及びパーフォリン、並びにＣＤ４細胞の数を測定した。
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ）を使用してＰＢＭＣを全血から単離し、１０％ ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ中で培養して、ＳＥＢ（０．１ｕｇ／ｍＬ）、ＰＨＡ（１ｕｇ／ｍＬ）または抗－ＣＤ３クローンＨｉＴ３ａ（１ｕｇ／ｍＬ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のいずれかにより、３～７日間活性化した。抗ＰＤＬ１抗体または抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５融合タンパク質のいずれかの結合を、活性化したＰＢＭＣ内でフローサイトメトリーにより３日後に評価した。抗ＰＤＬ１抗体の機能評価は、ＳＥＢによるＰＢＭＣ活性化の間に、増量した抗ＰＤＬ１抗体を添加することにより行った。２または３日目に
、ＩＬ－２及びＩＦＮγの測定のために上清を収集した。抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５融合タンパク質の場合、抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５または抗ＰＤＬ１抗体のいずれかの存在下で、他の活性化を行うことなくＰＢＭＣを培養した。６日目に細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＣＤ８及びグランザイムＢ、ＣＤ８及びパーフォリン、並びにＣＤ４細胞の数を測定した。
【0060】
ＣＤ４及びＣＤ８細胞の活性化：
ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全血から陰性単離した。ＣＤ４細胞を、抗ＣＤ３、または抗ＣＤ３及びＰＤＬ１ Ｆｃでコーティングしたビーズのいずれかにより、抗ＰＤＬ１抗体の存在下にてＩＭＤＭ、１０％ ＦＢＳ中で活性化した。５日目に、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ測定のために上清を収集し、フローサイトメトリーを使用して、増殖マーカーであるＫｉ６７の細胞での発現を評価した。抗ＣＤ３でコーティングされたビーズ、及びＩＬ１５または抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５融合タンパク質のいずれかにより、ＣＤ８細胞を活性化した。場合によっては、抗ＣＤ３でコーティングしたビーズの代わりに、抗ＣＤ３及びＰＤＬ１ Ｆｃを使用した。６または７日目にて、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ及びＴＮＦα分泌の測定のために上清を収集した。フローサイトメトリーを使用して、グランザイムＢ及びパーフォリンマーカーによるＣＤ８の活性化の測定を行うために、細胞を収集した。
ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全血から陰性単離した。ＣＤ４細胞を、抗ＣＤ３、または抗ＣＤ３及びＰＤＬ１ Ｆｃでコーティングしたビーズのいずれかにより、抗ＰＤＬ１抗体の存在下にてＩＭＤＭ、１０％ ＦＢＳ中で活性化した。５日目に、ＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ測定のために上清を収集し、フローサイトメトリーを使用して、増殖マーカーであるＫｉ６７の細胞での発現を評価した。抗ＣＤ３でコーティングされたビーズ、及びＩＬ１５または抗ＰＤＬ１－ＳＤ１５融合タンパク質のいずれかにより、ＣＤ８細胞を活性化した。場合によっては、抗ＣＤ３でコーティングしたビーズの代わりに、抗ＣＤ３及びＰＤＬ１ Ｆｃを使用した。６または７日目にて、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ及びＴＮＦα分泌の測定のために上清を収集した。フローサイトメトリーを使用して、グランザイムＢ及びパーフォリンマーカーによるＣＤ８の活性化の測定を行うために、細胞を収集した。
【0061】
抗体融合タンパク質の命名法：
抗ＰＤ－Ｌ１ ＩＬ１５融合タンパク質を用いる実験においては、融合タンパク質に関してはより短い名称を説明で識別する。融合タンパク質ｔｃｃｌＤ７ＨＣ－ＳＤ１５は、図の説明ではｃＤ７－ＳＤ１５と識別する。融合タンパク質ｔｃｃｌＦ８ＨＣ－ＳＤ１５は、図の説明ではＦ８－ＳＤ１５と識別する。
抗ＰＤ－Ｌ１ ＩＬ１５融合タンパク質を用いる実験においては、融合タンパク質に関してはより短い名称を説明で識別する。融合タンパク質ｔｃｃｌＤ７ＨＣ－ＳＤ１５は、図の説明ではｃＤ７－ＳＤ１５と識別する。融合タンパク質ｔｃｃｌＦ８ＨＣ－ＳＤ１５は、図の説明ではＦ８－ＳＤ１５と識別する。
【0062】
ファージディスプレイライブラリーからの、ＰＤ－Ｌ１に対する特異的高親和性抗体
高親和性を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、ファージディスプレイライブラリーを使用して入手した。一手順では、Ｄｙａｘライブラリーから増幅したファージＦａｂを３ラウンド分、免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｅ－ｔｕｂｅ）に固定化した、組み換えヒトＰＤＬ１－Ｆｃ（ＰＤＬ１ ＥＣＤ及びヒトＦｃ融合タンパク質、Ｑ９ＮＺＱ７）、またはマウスＰＤＬ１－Ｆｃ（Ｑ９ＥＰ７３）のいずれかの上でパンニングした。ラウンド２（Ｒ２）及びラウンド３（Ｒ３）からのＥＬＩＳＡ陽性クローンをシークエンシングした。
高親和性を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、ファージディスプレイライブラリーを使用して入手した。一手順では、Ｄｙａｘライブラリーから増幅したファージＦａｂを３ラウンド分、免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｅ－ｔｕｂｅ）に固定化した、組み換えヒトＰＤＬ１－Ｆｃ（ＰＤＬ１ ＥＣＤ及びヒトＦｃ融合タンパク質、Ｑ９ＮＺＱ７）、またはマウスＰＤＬ１－Ｆｃ（Ｑ９ＥＰ７３）のいずれかの上でパンニングした。ラウンド２（Ｒ２）及びラウンド３（Ｒ３）からのＥＬＩＳＡ陽性クローンをシークエンシングした。
【0063】
第２の手順では、Ｄｙａｘライブラリーから増幅したファージＦａｂを、第１ラウンドでは組み換えヒトＰＤＬ１－Ｆｃ（ＰＤＬ１ ＥＣＤ及びヒトＦｃ融合タンパク質、Ｑ９ＮＺＱ７）上でパニングし、次いで、第２ラウンドでは活性化Ｔ細胞上でパニングした。第３ラウンドについては、活性化Ｔ細胞または組み換えヒトＰＤＬ１－Ｆｃのいずれかを、パニングに使用した。可溶性ＰＤＬ１－Ｆｃ、及びＰＤＬ１－Ｆｃを発現する細胞の両方に結合可能なクローンをシークエンシングした。これらの抗体のＶH及びＶL可変領域配列を、図１３、及び表１の１～２６列に示す。
【0064】
更なる性質決定のため、固有のクローンをＩｇＧに転換した。可変領域をＤｙａｘ発現ベクターｐＢｈ１に挿入した。野生型ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３領域、並びに変異ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、本明細書ではＬＡＬＡ変異体とも称する）の両方を、ＩｇＧフォーマットに調製した。
【表1-1】
【表1-2】
【0065】
これらの抗体は、固相ＥＬＩＳＡによりＰＤ－Ｌ１に（図１～４）、及びＨＥＫ－２９３細胞（図５）に特異的結合を有することが確認された。これらの抗体の存在下におけるＰＤ－１のブロック：ＰＤ－Ｌ１の相互作用のブロックは、固相ＥＬＩＳＡにより、及びＰＤ－Ｌ１を発現するＨＥＫ－２９３細胞により測定した。Ｂｉａｃｏｒｅを使用して、各抗体の親和定数を計算した。
【表2】
【表3】
【0066】
これらの抗体はまた、未成熟単核細胞由来の樹状細胞（図６Ａ）、ヒトＰＤ－Ｌ１発現乳癌株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図６Ｂ）、マウスＰＤ－Ｌ１発現腫瘍株Ｂ１６－Ｆ１０細胞（図６Ｃ）、並びにヒト活性化ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞への結合により、ＰＤ－Ｌ１を発現する体内細胞への結合を確認した。
【0067】
機能的活性抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックし、Ｔ細胞増殖及び活性化を増加させる。
高親和性結合抗ＰＤ－Ｌ１抗体において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックしてＴ細胞増殖を増加させる機能について測定した。陰性精製したＣＤ４Ｔ細胞を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の存在下にて、αＣＤ３、またはαＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズのいずれかによりｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化した。αＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズで刺激したＣＤ４細胞は、αＣＤ３のみでコーティングしたビーズで刺激したＣＤ４と比較して、少ない増殖、並びにＩＦＮγ及びＩＬ－２の分泌を示した。αＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズで刺激したＣＤ４培養液に、機能的活性抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加することにより、抗体を添加しない培養液と比較して、ＣＤ４の増殖が増加する（ＣＤ４の総数、または増殖マーカーＫｉ６７の割合のいずれかにより測定）（図７Ａ）。αＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズを有するＣＤ４培養液に、機能的活性遮断抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加することで、ＣＤ４によるサイトカイン分泌も増加する（上清に蓄積したＩＦＮγ及びＩＬ－２をＥＬＩＳＡにより測定）。
高親和性結合抗ＰＤ－Ｌ１抗体において、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用をブロックしてＴ細胞増殖を増加させる機能について測定した。陰性精製したＣＤ４Ｔ細胞を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の存在下にて、αＣＤ３、またはαＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズのいずれかによりｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化した。αＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズで刺激したＣＤ４細胞は、αＣＤ３のみでコーティングしたビーズで刺激したＣＤ４と比較して、少ない増殖、並びにＩＦＮγ及びＩＬ－２の分泌を示した。αＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズで刺激したＣＤ４培養液に、機能的活性抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加することにより、抗体を添加しない培養液と比較して、ＣＤ４の増殖が増加する（ＣＤ４の総数、または増殖マーカーＫｉ６７の割合のいずれかにより測定）（図７Ａ）。αＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズを有するＣＤ４培養液に、機能的活性遮断抗ＰＤ－Ｌ１抗体を添加することで、ＣＤ４によるサイトカイン分泌も増加する（上清に蓄積したＩＦＮγ及びＩＬ－２をＥＬＩＳＡにより測定）。
【0068】
全血から単離したＰＢＭＣを、抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体の存在下にてスーパー抗原であるブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）により刺激した場合、サイトカイン分泌の増加が観察される。ＳＥＢで４８時間培養したＰＢＭＣの上清（予め冷凍）を収集し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ及びＩＬ－２を測定した。抗体を添加しなかった対照と比較した場合、複数の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の培養液の中で、Ｔ細胞数の増加は観察されなかったが、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の量の著しい増加が観察された（図７Ｂ）。
【0069】
加えて、抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体の存在下において培養したＣＤ４ Ｔ細胞及びｍｏ－ＤＣの混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、ＣＤ４増殖及び活性化の増加もまた、観察された。抗体を添加しなかった培養液と比較した場合、複数の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＬＲ中でＣＤ４増殖を増加させた（図７Ｃ）。これらの抗体はまた、ＥＬＩＳＡにより測定したとおり、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の分泌も増加させた。
【0070】
ＩＬ１５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞増殖及び活性化に対する、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を増加させる。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみを含む、ＣＤ４及びｍｏ－ＤＣの培養液と比較した場合、抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体及びサイトカインＩＬ１５の両方の存在下での、ＣＤ４Ｔ細胞とｍｏ－ＤＣとのＭＬＲは、ＣＤ４増殖（図８Ａ）、ＩＦＮγ及びＩＬ－２分泌の著しい増加をもたらした。これらのアッセイでは、ＩＬ１５は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と等モル濃度で添加した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＩＬ１５が低濃度の場合（０．５ｎＭ、図８Ａ）、ＣＤ４増殖への幾らかの相乗効果が観察された。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみを含む、ＣＤ４及びｍｏ－ＤＣの培養液と比較した場合、抗ＰＤ－Ｌ１遮断抗体及びサイトカインＩＬ１５の両方の存在下での、ＣＤ４Ｔ細胞とｍｏ－ＤＣとのＭＬＲは、ＣＤ４増殖（図８Ａ）、ＩＦＮγ及びＩＬ－２分泌の著しい増加をもたらした。これらのアッセイでは、ＩＬ１５は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と等モル濃度で添加した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＩＬ１５が低濃度の場合（０．５ｎＭ、図８Ａ）、ＣＤ４増殖への幾らかの相乗効果が観察された。
【0071】
ａＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズによりｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した全血から陰性精製したＣＤ８もまた、用量に依存してＩＬ１５に応答する。αＣＤ３及びＰＤ－Ｌ１ Ｆｃでコーティングしたビーズ、並びに抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含むＣＤ８の培養液にＩＬ１５を添加することにより、ＣＤ８増殖は大きく増加した（図８Ｂ）。
【0072】
抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５融合タンパク質は、ＩＬ１５をＰＤ－Ｌ１発現抗原提示細胞に対して標的化し、応答するＣＤ８細胞の増殖及び活性化を増加させる。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＩＬ１５融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域を、ＩＬ１５Ｒのｓｕｓｈｉドメイン及びＩＬ１５分子そのものに結合させることにより構築した。ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン、ＩＲＤ－１１ エクソン３（ｅｘｏｎｅ３）、リンカー及びＩＬ１５の融合（「ＳＤ１５」として設計）を、配列番号：２６１として提供する。ＳＤ１５は、従来のＩｇＧの重鎖ｃ末端に取り付けた。ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン、ＩＲＤ－１１エクソン３、リンカー及びＩＬ１５を有する融合タンパク質を、ｔｃｃλＤ７可変領域及びＩｇＧ１ ＣH１－ＣH２－ＣH３可変領域（配列番号：２６２）の重鎖ｃ末端に取り付けた。この構築物はまた、ＩｇＧ１重鎖の末端において、（１）「Ｇ－Ｋ」開裂の可能性を低下させ、（２）ベクターにクローニング部位（ＢａｍＨＩ）を加えるため、に、ＫのＳへの置換を含んだ。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＩＬ１５融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域を、ＩＬ１５Ｒのｓｕｓｈｉドメイン及びＩＬ１５分子そのものに結合させることにより構築した。ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン、ＩＲＤ－１１ エクソン３（ｅｘｏｎｅ３）、リンカー及びＩＬ１５の融合（「ＳＤ１５」として設計）を、配列番号：２６１として提供する。ＳＤ１５は、従来のＩｇＧの重鎖ｃ末端に取り付けた。ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン、ＩＲＤ－１１エクソン３、リンカー及びＩＬ１５を有する融合タンパク質を、ｔｃｃλＤ７可変領域及びＩｇＧ１ ＣH１－ＣH２－ＣH３可変領域（配列番号：２６２）の重鎖ｃ末端に取り付けた。この構築物はまた、ＩｇＧ１重鎖の末端において、（１）「Ｇ－Ｋ」開裂の可能性を低下させ、（２）ベクターにクローニング部位（ＢａｍＨＩ）を加えるため、に、ＫのＳへの置換を含んだ。
【0073】
この軽鎖は従来の抗体のものである。軽鎖、及びＬＡＬＡ変異体を有するかまたは有しない融合重鎖の両方を、発現のためにＤｙａｘ ｐＢｈ１ベクターに挿入した。
【0074】
この融合分子は抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｕｓｈｉドメイン－ＩＬ１５または抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５を指定する。ＩＬ１５がｓｕｓｈｉドメインの代わりにＦｃに結合した、異なる型の融合タンパク質もまた構築し、この融合タンパク質はＩＬ１５機能活性を有しなかったため、我々は、このタンパク質をアッセイによっては陰性対照として使用した（抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５ｎｅｇと称する）。
【0075】
固相ＰＤ－Ｌ１ Ｆｃ結合ＥＬＩＳＡアッセイで、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質の結合を抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較した際、著しい変化は観察されなかった（図９Ａ）。抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５タンパク質の結合を、これらそれぞれの元の抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較した際に、ＰＤ－Ｌ１を発現する活性化ＣＤ４細胞に対する結合親和性の幾らかの変化が観察された（図９Ｂ）。これらそれぞれの抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比較した際、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞に対して低い親和性を有する。しかし、細胞表面上で結合した抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５と、結合した抗ＰＤ－Ｌ１に対
する二次抗体の結合に差異が存在し得る。
する二次抗体の結合に差異が存在し得る。
【0076】
抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質のＩＬ１５の融合を測定するために、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質またはＩＬ１５のいずれかの存在下で、全血から単離したＰＢＭＣを培養した。他の刺激は培養液に加えなかった。ＩＬ１５と同様に、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質はＮＫ細胞数を増加させ（図１０Ａ）、ＣＤ８増殖（図１０Ｂ）及び活性化（グランザイムＢ陽性ＣＤ８の割合（％）で測定、図１０Ｃ）を増加させた。全ての培養液で、ＣＤ４の数の著しい増加は見られなかった（図１０Ｄ）。
【0077】
ＣＤ８での抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５活性を評価するために、αＣＤ３、またはαＣＤ３及びＰＤＬ１ Ｆｃでコーティングしたビーズのいずれかの存在下で、これらの融合タンパク質をＣＤ８培養液に添加した。この場合、ＰＤＬ１ Ｆｃが抗原提示細胞、αＣＤ３及びＰＤＬ１ Ｆｃでコーティングしたビーズ上に存在するとき、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５はＣＤ８増殖を著しく増加させた（図１１Ａ、ＰＤＬ１ Ｆｃなしと、図１１Ｂ、ビーズ上にＰＤ－Ｌ１ Ｆｃあり）。更に、ＣＤ８活性化の著しい増加も観察された。グランザイムＢ陽性ＣＤ８細胞（図１２Ａ）、及びＩＦＮγ分泌（図１２Ｂ）の割合（％）が約１０倍増加したことが測定されたとおり、ｃＤ７－ＳＤ１５はＣＤ８を活性化するのに必要な有効用量を低下させる。ｃＤ７－ＳＤ１５はまた、ＩＬ１５と比較した場合に、ＣＤ８活性化の最大量を増加させる（図１２Ａ及びＢ）。抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び遊離ＩＬ１５を添加した場合と比較すると、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質は、これらの組み合わせを別々に添加した場合より、ＣＤ８増殖をより高い水準まで増加させた（図１２Ｃ）。低用量の抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質を用いて、より高い水準のＣＤ８活性化及び増殖を達成することができるため、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質のこれらの性質は、免疫療法の設定において有益となるであろう。抗原提示細胞がＰＤ－Ｌ１を発現する場合に、ＣＤ８が抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質に対して増幅して応答することは、選択的ＣＤ８活性化を達成するのに有利となるであろう。
【0078】
抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５融合タンパク質の細胞毒性
抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に対するＣＤ８ Ｔ細胞の、ＩＬ１５により誘発される細胞毒性を増加させるかどうかを測定するために、腫瘍細胞死の測定前の７日間、ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に対して結合活性を有しない抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質または抗ＫＬＨ－ＳＤ１５の存在下において、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＡＤ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞と共培養した。ヒトＣＤ８ Ｔ細胞及び腫瘍細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ内で７日間共培養した。腫瘍細胞殺活性は、ＦＡＣＳ内でＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０により染色した、死滅腫瘍細胞の数を測定することにより評価した。ＣＤ８ Ｔ細胞が仲立ちするＭＤＡ－ＭＢ－２３１の細胞毒性は、共培養中の抗ＫＬＨ－ＳＤ１５による治療と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質により著しく向上した（図１５）。更に、ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質であるｃＤ７－ＳＤ１５は、マウスＰＤ－Ｌ１に対する結合活性を有しないビヒクルまたはＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質ｓＤ７－ＳＤ１５で治療したマウスと比較して、マウスＣＴ２６結腸腫瘍細胞を静脈注射したマウスの腫瘍モデルにおいて、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞を有するマウスの生残率を著しく増加させた（図１６）。これらの結果は、二機能性抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質により、ＩＬ１５により刺激された免疫エフェクター細胞を、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する主要部位に標的化することが、副作用を最小限にしつつ、抗腫瘍免疫を向上させる利点を有することを示している。このタイプの二機能性抗体サイトカイン融合タンパク質は、新規の免疫調節治療薬としての可能性を有し、腫瘍進行の制御においてより大きな抗腫瘍効果を達成する。
抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質が、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に対するＣＤ８ Ｔ細胞の、ＩＬ１５により誘発される細胞毒性を増加させるかどうかを測定するために、腫瘍細胞死の測定前の７日間、ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞に対して結合活性を有しない抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質または抗ＫＬＨ－ＳＤ１５の存在下において、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＡＤ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞と共培養した。ヒトＣＤ８ Ｔ細胞及び腫瘍細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ内で７日間共培養した。腫瘍細胞殺活性は、ＦＡＣＳ内でＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０により染色した、死滅腫瘍細胞の数を測定することにより評価した。ＣＤ８ Ｔ細胞が仲立ちするＭＤＡ－ＭＢ－２３１の細胞毒性は、共培養中の抗ＫＬＨ－ＳＤ１５による治療と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質により著しく向上した（図１５）。更に、ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質であるｃＤ７－ＳＤ１５は、マウスＰＤ－Ｌ１に対する結合活性を有しないビヒクルまたはＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質ｓＤ７－ＳＤ１５で治療したマウスと比較して、マウスＣＴ２６結腸腫瘍細胞を静脈注射したマウスの腫瘍モデルにおいて、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞を有するマウスの生残率を著しく増加させた（図１６）。これらの結果は、二機能性抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質により、ＩＬ１５により刺激された免疫エフェクター細胞を、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する主要部位に標的化することが、副作用を最小限にしつつ、抗腫瘍免疫を向上させる利点を有することを示している。このタイプの二機能性抗体サイトカイン融合タンパク質は、新規の免疫調節治療薬としての可能性を有し、腫瘍進行の制御においてより大きな抗腫瘍効果を達成する。
【0079】
親和性成熟
ＣＤＲ－１Ｈのメチオニン位の３つにアミノ酸置換基を導入し、向上した親和性をスクリーニングすることにより、ｔｃｃλＤ７重鎖の変異体を作製した。より詳細には、第１、第２及び第４のメチオニン位を同時に変化させたｔｃｃλＤ７の変異体（約１×１０8個）を含有するライブラリーを作製した。免疫チューブ上に固定化した組み換えヒトＰＤＬ１－Ｆｃ（ＰＤＬ１ ＥＣＤ及びヒトＦｃ融合タンパク質、Ｑ９ＮＺＱ７）、またはマウスＰＤＬ１－Ｆｃ（Ｑ９ＥＰ７３）上で、ライブラリーをパニングした（４ラウンド）。ラウンド３及びラウンド４のＥＬＩＳＡ陽性クローンをシークエンシングした。固有のクローンを競合ＥＬＩＳＡにより比較した。表４は、スクリーンから入手した２５個の変異体で観察した、親和性成熟したＣＤＲ－１Ｈ配列、及びＣＤＲを含有する重鎖可変領域に対するアミノ酸置換基を、配列番号と共に示す。これらの変異体のアミノ酸配列はまた、表１に一覧で示した配列に記述されている。
ＣＤＲ－１Ｈのメチオニン位の３つにアミノ酸置換基を導入し、向上した親和性をスクリーニングすることにより、ｔｃｃλＤ７重鎖の変異体を作製した。より詳細には、第１、第２及び第４のメチオニン位を同時に変化させたｔｃｃλＤ７の変異体（約１×１０8個）を含有するライブラリーを作製した。免疫チューブ上に固定化した組み換えヒトＰＤＬ１－Ｆｃ（ＰＤＬ１ ＥＣＤ及びヒトＦｃ融合タンパク質、Ｑ９ＮＺＱ７）、またはマウスＰＤＬ１－Ｆｃ（Ｑ９ＥＰ７３）上で、ライブラリーをパニングした（４ラウンド）。ラウンド３及びラウンド４のＥＬＩＳＡ陽性クローンをシークエンシングした。固有のクローンを競合ＥＬＩＳＡにより比較した。表４は、スクリーンから入手した２５個の変異体で観察した、親和性成熟したＣＤＲ－１Ｈ配列、及びＣＤＲを含有する重鎖可変領域に対するアミノ酸置換基を、配列番号と共に示す。これらの変異体のアミノ酸配列はまた、表１に一覧で示した配列に記述されている。
【表4】
【0080】
ｔｃｃＤ７＿＃１１４及びｔｃｃＤ７＿＃１０２（それぞれ、本明細書においてはｔｃ
ｃＤ７＿＃１及びｔｃｃＤ７＿＃２とも～と称する）の２つの変異体を、本明細書の他の場所に記載されているように、ＩｇＧ、及びＡＤＣＣの減少のためにヒンジ領域にＬｅｕ－Ａｌａ置換を含有するＩｇＧ形態に転換した。抗体を発現させ、更なる性質決定のために精製した。２つの親和性成熟変異体に対する可溶性ＰＤＬ１に対する結合の向上を、図１７に示す。図１８は、ヒトＰＤ１のヒトＰＤＬ１に対する結合をブロックした（左パネル）、及びマウスＰＤ１のマウスＰＤＬ１に対する結合をブロックした（右パネル）２つの変異体を示す。親と比較して、変異体はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対してより高い結合活性を示した（図１９）。
ｃＤ７＿＃１及びｔｃｃＤ７＿＃２とも～と称する）の２つの変異体を、本明細書の他の場所に記載されているように、ＩｇＧ、及びＡＤＣＣの減少のためにヒンジ領域にＬｅｕ－Ａｌａ置換を含有するＩｇＧ形態に転換した。抗体を発現させ、更なる性質決定のために精製した。２つの親和性成熟変異体に対する可溶性ＰＤＬ１に対する結合の向上を、図１７に示す。図１８は、ヒトＰＤ１のヒトＰＤＬ１に対する結合をブロックした（左パネル）、及びマウスＰＤ１のマウスＰＤＬ１に対する結合をブロックした（右パネル）２つの変異体を示す。親と比較して、変異体はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対してより高い結合活性を示した（図１９）。
【0081】
親和性成熟変異体を、Ｔｈ１サイトカインＩＬ２及びＩＦＮγの産生を促進する能力に関して試験した。全血から単離したＰＢＭＣを、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の存在下において、スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、０．１μｇ／ｍＬ）で刺激した。ＳＥＢと共に７日間培養したＰＢＭＣの上清を収集し、ＩＦＮγ及びＩＬ－２をＥＬＩＳＡにより測定した。ｃＤ７と比較した場合、ＩＦＮγ及びＩＬ－２の量の著しい増加が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ｃＤ７＃１及び＃２の変異体を含む培養液で観察された（図２０）。
【0082】
ＰＤ－Ｌ１結合領域、ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメイン及びＩＬ１５を含有する幾つかの融合タンパク質変異体を構築した。ある種の構築物は、ＩＬ１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインとＩＬ１５部分との間にリンカーを含む。一構築物において、ＩＬ１５受容体α ｓｕｓｈｉドメインのｃ末端に存在する、エクソン３の１１個のアミノ酸を、種々の長さの「ＧＳ」リンカーで置換した。ＧＳリンカーは、配列番号：３２５、３１５、３１７、３１９、３２１、及び３２３をそれぞれ有する構築物において、ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：３２４；１８個のアミノ酸）、ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ（配列番号：３１４；２０個のアミノ酸）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：３１６；２５個のアミノ酸）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：３１８；３０個のアミノ酸）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：３２０；４０個のアミノ酸）、及びＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：３２２；５０個のアミノ酸）を含む。
【0083】
融合タンパク質はＨＥＫ２９３細胞内に一時的に、または安定して発現し、これを、メーカーの説明書に従ってプロテインＡカラムクロマトグラフィーにより精製した。ある種の実験において、分子の抗ＰＤ－Ｌ１部分のＩｇ重鎖と軽鎖定常領域間の会合を安定させるために、λ軽鎖のＣ末端セリンを欠失した（本明細書では「ｄｓ」と表す）。
【0084】
ｓｕｓｈｉドメイン及びＩＬ１５（配列番号：３２５）を有するｔｃｃλＤ７親和性成熟変異体＃１０２を含有する融合タンパク質に関し、フローサイトメトリーによりＭＤＡ－ＭＢ－２３１への結合を試験した。ｔｃｃλＤ７を含有する融合タンパク質と比較して、全てが向上した結合を示した（図２１）。ｔｃｃλＤ７親和力成熟変異体＃１０２を含有する融合タンパク質はまた、ＩＬ１５応答性ヒト巨核芽球性白血病細胞上で刺激活性を有することが確認された。１０％ ＦＢＳ、及びヒト膀胱癌５６３７細胞の２０％馴化培地を補充した、ＲＰＭＩ１６４０中の抗ＰＤ－Ｌ１－ＳＤ１５融合タンパク質により、細胞を４８時間培養した。細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存アッセイによる相対発光量（ＲＬＵ）として測定した（図２２）。
【0085】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A1】
【図13A2】
【図13A3】
【図13B1】
【図13B2】
【図13B3】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】