特許 7280269 タンパク質の産生増加のための変異及び遺伝子改変バチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞、並びにその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-15

(45)【発行日】2023-05-23

(54)【発明の名称】タンパク質の産生増加のための変異及び遺伝子改変バチルス属（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）細胞、並びにその方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20230516BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230516BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230516BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230516BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20230516BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31

C12N1/21 ZNA

C12N15/63 Z

C12P21/02

C12N15/113 Z

【請求項の数】 25

(21)【出願番号】P 2020537013

(86)(22)【出願日】2018-12-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-04-15

(86)【国際出願番号】 US2018065150

(87)【国際公開番号】W WO2019135868

(87)【国際公開日】2019-07-11

【審査請求日】2021-11-18

(31)【優先権主張番号】62/613,339

(32)【優先日】2018-01-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509240479

【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク

(74)【代理人】

【識別番号】110003579

【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100173978

【弁理士】

【氏名又は名称】朴 志恩

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(74)【代理人】

【識別番号】100071010

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 行造

(72)【発明者】

【氏名】デル チェイス、シャノン

(72)【発明者】

【氏名】フィオレシ、キャロル マリー

(72)【発明者】

【氏名】フリッシュ、ライアン エル

(72)【発明者】

【氏名】マッソン、ヘレン オリヴィア

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン キンメネード、アニータ

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１５６７０５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１１２７３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】The Journal of Biological Chemistry，2003年，Vol.278, No.51，p.51108-51115

【文献】FEMS Microbiology Letters，2004年，Vol.236，p.145-151

【文献】Journal of Bacteriology，1998年，Vol.180, No.20，p.5319-5326

【文献】Acta Crystallographica Section F，2012年，Vol.F68，p.751-756

【文献】AMB Express，2017年，Vol.7，Article No.149

【文献】Appl. Microbiol. Biotechnol.，2008年，Vol.78，p.181-188

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／３１

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １５／６３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞の変異体。

【請求項2】

前記配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする前記遺伝子は、配列番号２２、配列番号８１又は配列番号５６と少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸配列を含む、請求項１に記載の変異細胞。

【請求項3】

目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の変異細胞。

【請求項4】

前記ＰＯＩをコードする前記導入ポリヌクレオチドは、前記ＰＯＩをコードする前記ポリヌクレオチドの上流（５’）に作動可能に連結された配列番号６３のｍｏｄ－５’－ＵＴＲ配列を含む、請求項３に記載の変異細胞。

【請求項5】

配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であって、配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５の６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含むＧｌｃＴタンパク質をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞。

【請求項6】

前記親細胞中の前記配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする前記野生型ｇｌｃＴ遺伝子は、ｇｌｃＴ－Ｃａｓ９ターゲティングベクターで改変されており、前記ｇｌｃＴ－Ｃａｓ９ターゲティングベクターは前記野生型ｇｌｃＴ遺伝子のコドン６７を改変し、改変されたｇｌｃＴ遺伝子は配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５の６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含むＧｌｃＴタンパク質をコードする、請求項５に記載の改変細胞。

【請求項7】

配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする導入ポリヌクレオチドを含む遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞。

【請求項8】

配列番号８２と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードする不活化内因性染色体ｇｌｃＴ遺伝子をさらに含む、請求項７に記載の改変細胞。

【請求項9】

配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）をさらに含む、請求項７に記載の改変細胞。

【請求項10】

ＰＯＩをコードする導入ポリヌクレオチドを含む、請求項７に記載の改変細胞。

【請求項11】

前記ＰＯＩをコードする導入ポリヌクレオチドは、前記ＰＯＩをコードする前記ポリヌクレオチドの上流（５’）に作動可能に連結された配列番号６３のｍｏｄ－５’－ＵＴＲ配列を含む、請求項１０に記載の改変細胞。

【請求項12】

配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であって、配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子を含み、目的タンパク質（ＰＯＩ）を、同じＰＯＩを産生する前記親細胞と比較して、より多く産生する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞。

【請求項13】

異種ＰＯＩをコードする導入ＤＮＡコンストラクトを含み、前記異種ＰＯＩを、同じ異種ＰＯＩを産生する前記親細胞と比較して、より多く産生する、請求項１２に記載の改変細胞。

【請求項14】

配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子をさらに含む、請求項１２に記載の改変細胞。

【請求項15】

前記ＰＯＩをコードする導入ＤＮＡコンストラクトは、前記ＤＮＡコンストラクトの上流（５’）に作動可能に連結された配列番号６３の改変５’－ＵＴＲ配列を含む、請求項１３に記載の改変細胞。

【請求項16】

変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＧｌｃＴ（抗終結）タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、前記変異ＧｌｃＴタンパク質は配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換（Ｌ６７Ｆ）を含むＯＲＦ。

【請求項17】

前記変異タンパク質は、配列番号５５と９５％以上の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）、請求項１６に記載のＯＲＦ。

【請求項18】

請求項１６に記載のポリヌクレオチドＯＲＦを含むベクター。

【請求項19】

前記ＯＲＦ配列に（５’）作動可能に連結された上流（５’）相同領域（５’－ＨＲ）、又は前記ＯＲＦ配列に（３’）作動可能に連結された下流（３’）相同領域（３’－ＨＲ）をさらに含み、前記５’－ＨＲ又は３’－ＨＲは、前記ベクターがコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞に形質転換される際、相同組み換えによって標的化ゲノム遺伝子座へ前記ベクターが組み込まれるのに十分なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞の前記標的化ゲノム遺伝子座との相同性を含む、請求項１８に記載のベクター。

【請求項20】

請求項１６に記載のＯＲＦを含む発現コンストラクトであって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞において機能的なプロモーター核酸配列をさらに含み、前記プロモーター配列は、前記ＯＲＦ配列の上流（５’）に作動可能に連結されている発現コンストラクト。

【請求項21】

配列番号６３の改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－非翻訳領域配列（５’－ＵＴＲ）をさらに含み、前記改変５’－ＵＴＲはプロモーター配列の下流（３’）に作動可能に連結され、且つ前記ＯＲＦ配列の上流（５’）に作動可能に連結されている、請求項２０に記載のコンストラクト。

【請求項22】

親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞の変異体において目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く生産する方法であって、
（ａ）配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞の変異体を得、前記変異細胞に異種ＰＯＩをコードするＤＮＡコンストラクトを導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）の前記変異細胞をＰＯＩの産生に適した培地中で培養する工程、及び
（ｃ）前記培養培地から前記ＰＯＩを回収する工程
を含み、
同じ条件下で培養された場合、前記変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は前記ＰＯＩを、同じＰＯＩを産生する前記親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、より多く産生する方法。

【請求項23】

非改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）親細胞由来の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く生産する方法であって、
（ａ）配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする内因性染色体ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を得、前記親細胞を（ｉ）配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドを導入することによって改変する工程、
（ｂ）工程（ａ）の前記改変細胞をＰＯＩの産生に適した培地中で培養する工程、及び
（ｃ）前記培養培地から前記ＰＯＩを回収する工程
を含み、
同じ条件下で培養された場合、前記改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は前記ＰＯＩを、同じＰＯＩを産生する前記親細胞と比較して、より多く産生する方法。

【請求項24】

前記ＧｌｃＴ変異タンパク質をコードする前記導入ポリヌクレオチドは、相同組み換えによって前記染色体ｇｌｃＴ遺伝子座に組み込まれ、それによって、配列番号８２の前記ＧｌｃＴタンパク質をコードする前記内因性染色体ｇｌｃＴ遺伝子を置換し排除する、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

非改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）親細胞由来の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く生産する方法であって、
（ａ）配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする内因性染色体ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の前記親細胞をＧｌｃＴ－Ｃａｓ９ターゲティングベクターで改変する工程（ここで、前記ｇｌｃＴ－Ｃａｓ９ターゲティングベクターは前記野生型ｇｌｃＴ遺伝子のコドン６７を改変し、改変ｇｌｃＴ遺伝子は配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、配列番号５５の６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含むｇｌｃＴタンパク質をコードする）、
（ｃ）工程（ｂ）の前記改変細胞をＰＯＩの産生に適した培地中で培養する工程、及び
（ｄ）前記培養培地から前記ＰＯＩを回収する工程
を含み、
同じ条件下で培養された場合、前記改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は前記ＰＯＩを、同じＰＯＩを産生する前記親細胞と比較して、より多く産生する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１月０３日に出願された米国仮特許出願第６２／６１３，３３９号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、一般に、細菌学、微生物学、遺伝学、分子生物学、酵素学、タンパク質の工業生産などの技術分野に関する。より詳細には、本開示の特定の実施形態は、工業に関連した目的タンパク質の産生量を増加させることができる新規なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種変異体に関する。本開示の他の実施形態は、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする導入ポリヌクレオチドを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の細胞に関する。他の実施形態は、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（娘）細胞において目的の内因性及び／又は異種タンパク質を産生するための方法及び組成物に関連する一方、特定の他の実施形態は、本開示の変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする核酸配列、特にポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列、そのベクター及びそのＤＮＡ発現コンストラクトを対象とする。

【0003】

配列表の参照
電子的に提出された「ＮＢ４１３０１＿ＷＯ＿ＰＣＴ＿ＳＥＱ．ｔｘｔ」という名称の配列表のテキストファイルの内容は、２０１８年１２月１１日に作成され、サイズは１３７ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などのグラム陽性菌は、それらの優れた発酵特性と高い収率（例えば、培養物１リットル当たり最大２５グラム；Ｖａｎ Ｄｉｊｌ ａｎｄ Ｈｅｃｋｅｒ，２０１３）から、工業関連タンパク質を生産するための微生物工場として頻繁に使用されている。例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、食品、繊維、洗濯、医療機器の洗浄、薬品工業などに必要なα－アミラーゼ（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｒａｕｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）及びプロテアーゼ（Ｂｒｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６）の生産でよく知られている（Ｗｅｓｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これらの非病原性グラム陽性菌は、有害な副生物（例えば、内毒素としても知られるリポ多糖類（ＬＰＳ））を全く含まないタンパク質を産生するので、欧州食品安全機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）の「安全性適格推定（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ）」（ＱＰＳ）の評価を得ており、それらの産生物の多くは、アメリカ食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から「安全食品認定（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ａｓ Ｓａｆｅ）」（ＧＲＡＳ）の評価を獲得した（Ｏｌｅｍｐｓｋａ－Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｅａｒｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0005】

したがって、微生物宿主細胞内でのタンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体など）の産生は、バイオテクノロジー分野において特に関心が高い。同様に、１種以上の目的タンパク質を産生及び分泌させるためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の最適化は、特に工業バイオテクノロジーの状況においては非常に重要であり、タンパク質が工業的に大量生産される場合は、タンパク質収量の小さな改善が極めて重要な意味を有する。より詳細には、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、工業的重要性の高いバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の宿主細胞の例であるので、したがって、タンパク質発現／産生の強化／増量のためにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の宿主細胞を遺伝的に改変し、且つ操作できることは、新規且つ改善されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種産生株の構築のために非常に望ましい。したがって、本明細書に記載される開示は、タンパク質産生能力が増強され、二次代謝産物の産生量が増加するなどしたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を入手し構築する、非常に望ましく、そして未だ対処されていない要求に関する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は一般に、増強されたタンパク質産生能力、増強された二次代謝産物産生能力などを備えたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（宿主）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を作製し、構築するための組成物及び方法に関する。

【0007】

より詳細には、本開示の特定の実施形態は、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞の変異体に関する。特定の実施形態では、配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２２、配列番号８１又は配列番号５６と少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸配列を含む。他の実施形態では、変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）をさらに含む。他の実施形態では、変異細胞は、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする導入ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＰＯＩはアミラーゼ又はプロテアーゼである。他の実施形態では、ＰＯＩをコードする導入ポリヌクレオチドは、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドの上流（５’）に作動可能に連結された配列番号６３のｍｏｄ－５’－ＵＴＲ配列を含む。

【0008】

他の実施形態では、本開示は、配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に関し、この改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５の６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含むＧｌｃＴタンパク質をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子を含む。特定の実施形態では、親細胞中の配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする野生型ｇｌｃＴ遺伝子は、ｇｌｃＴ－Ｃａｓ９ターゲティングベクターで改変されており、そのｇｌｃＴ－Ｃａｓ９ターゲティングベクターは野生型ｇｌｃＴ遺伝子のコドン６７を改変し、改変されたｇｌｃＴ遺伝子は配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５の６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含むＧｌｃＴタンパク質をコードする。

【0009】

したがって、他の実施形態では、本開示は、配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする導入ポリヌクレオチドを含む遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に関する。特定の実施形態では、改変細胞は、配列番号８２と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードする不活化内因性染色体ｇｌｃＴ遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞であり、この改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）は、配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）をさらに含む。関連する実施形態では、本開示の改変細胞は、異種ＰＯＩをコードする導入ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＰＯＩはアミラーゼ又はプロテアーゼである。別の実施形態において、導入ポリヌクレオチドは、標的化されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞染色体遺伝子座に組み込まれる。特定の他の実施形態では、ＰＯＩをコードする導入ポリヌクレオチドは、ＰＯＩをコードするポリヌクレオチド配列の上流（５’）に作動可能に連結された配列番号６３のｍｏｄ－５’－ＵＴＲ配列を含む。

【0010】

他の実施形態では、本開示は、配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に関し、この改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子を含み、この改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、目的タンパク質（ＰＯＩ）を、同じＰＯＩを産生する親細胞と比較して、より多く産生する。したがって、特定の実施形態では、改変細胞は、異種ＰＯＩをコードする導入ＤＮＡコンストラクトを含み、この改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、異種ＰＯＩを、同じ異種ＰＯＩを産生する親細胞と比較して、より多く産生する。他の実施形態では、改変細胞は、配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、ＰＯＩはアミラーゼ又はプロテアーゼである。特定の他の実施形態では、ＰＯＩをコードする導入ＤＮＡコンストラクトは、ＤＮＡコンストラクトの上流（５’）に作動可能に連結された配列番号６３の改変５’－ＵＴＲ配列を含む。

【0011】

他の実施形態では、本開示は、変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＧｌｃＴ（抗終結）タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に関し、変異ＧｌｃＴタンパク質は、配列番号５５のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）への置換（Ｌ６７Ｆ）を含む。特定の実施形態では、変異タンパク質は、配列番号５５と９５％以上の配列同一性を含み、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）。他の実施形態では、ＯＲＦは、配列番号５６と少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0012】

したがって、特定の実施形態は、配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。他の実施形態では、ベクターは、ＯＲＦ配列に（５’）作動可能に連結された上流（５’）相同領域（５’－ＨＲ）、及び／又はＯＲＦ配列に（３’）作動可能に連結された下流（３’）相同領域（３’－ＨＲ）を含み、この５’－ＨＲ及び／又は３’－ＨＲは、ベクターがコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞に形質転換された場合に、相同組み換えによって標的化ゲノム遺伝子座へベクターが組み込まれるのに十分なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞の標的化ゲノム遺伝子座との相同性を含む。

【0013】

他の実施形態では、本開示は、配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドＯＲＦを含む発現コンストラクトに関する。特定の実施形態では、コンストラクトはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞において機能的なプロモーター核酸配列を含み、このプロモーター配列は、ＯＲＦ配列の上流（５’）に作動可能に連結されている。他の実施形態では、コンストラクトは、配列番号６３の改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－非翻訳領域配列（５’－ＵＴＲ）をさらに含み、この改変５’－ＵＴＲはプロモーター配列の下流（３’）に作動可能に連結され、且つＯＲＦ配列の上流（５’）に作動可能に連結されている。特定の他の実施形態では、コンストラクトは、ＯＲＦ配列の下流（３’）に作動可能に連結されたターミネーター配列をさらに含む。

【0014】

他の実施形態では、本開示は、親バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞の変異体において目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く生産する方法であって、（ａ）配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞の変異体を得、この変異細胞に異種ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドコンストラクトを導入する工程、（ｂ）工程（ａ）の変異細胞をＰＯＩの産生に適した培地中で培養する工程、及び（ｃ）その培養培地からＰＯＩを回収する工程を含み、同じ条件下で培養された場合、変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞はＰＯＩを、同じＰＯＩを産生する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、より多く産生する、方法に関する。

【0015】

他の実施形態は、非改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）親細胞由来の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く生産する方法であって、（ａ）配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする内因性染色体ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を得、この親細胞を（ｉ）配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドを導入することによって改変する工程、（ｂ）工程（ａ）の改変細胞をＰＯＩの産生に適した培地中で培養する工程、並びに（ｃ）その培養培地からＰＯＩを回収する工程を含み、同じ条件下で培養された場合、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞はＰＯＩを、同じＰＯＩを産生する親細胞と比較して、より多く産生する、方法に関する。特定の他の実施形態では、ＧｌｃＴ変異タンパク質をコードする導入ポリヌクレオチドは、相同組み換えによって染色体ｇｌｃＴ遺伝子座に組み込まれ、それによって、配列番号８２のＧｌｃＴタンパク質をコードする内因性染色体ｇｌｃＴ遺伝子を置換し排除する。

【0016】

別の実施形態では、本開示は、非改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）親細胞由来の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く生産する方法であって、（ａ）配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする内因性染色体ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を得る工程、（ｂ）工程（ａ）の親細胞をｇｌｃＴ－Ｃａｓ９ターゲティングベクターで改変する工程（ここで、ｇｌｃＴ－Ｃａｓ９ターゲティングベクターは野生型ｇｌｃＴ遺伝子のコドン６７を改変し、改変ｇｌｃＴ遺伝子は配列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を含み、配列番号５５の６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含むＧｌｃＴタンパク質をコードする）、（ｃ）工程（ｂ）の改変細胞をＰＯＩの産生に適した培地中で培養する工程、及び（ｃ）その培養培地からＰＯＩを回収する工程を含み、同じ条件下で培養された場合、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞はＰＯＩを、同じＰＯＩを産生する親細胞と比較して、より多く産生する、方法に関する。特定の実施形態では、ＰＯＩが内因性ＰＯＩ又は異種ＰＯＩである。特定の実施形態では、ＰＯＩは異種ＰＯＩである。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、ＧｌｃＴ野生型（配列番号８２）及びＧｌｃＴ変異体（配列番号５５）のタンパク質配列をそれぞれコードする、ｇｌｃＴ野生型（配列番号２２）及びｇｌｃＴ変異体（配列番号５６）核酸配列の核酸配列アラインメント（図１Ａ）及びアミノ酸配列アラインメント（図１Ｂ）を示す。より詳細には、図１Ａは、変異ＧｌｃＴタンパク質（配列番号５５）をコードする変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＯＲＦ（配列番号５６）と比較した、野生型ＧｌｃＴタンパク質（配列番号８２）をコードするＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＯＲＦ（配列番号２２）の核酸配列アラインメントを示す。例えば、図１Ａに示すように、２つのアラインしたＯＲＦ配列（配列番号２２対配列番号５６）は、ヌクレオチド１９９位の一塩基多型（ＳＮＰ）によって異なり、配列番号２２の１９９位はシトシン（Ｃ）を含み、配列番号５６の１９９位はチミン（Ｔ）を含む（例えば、図１Ａの黒の四角で囲んだ１９９位のヌクレオチド（Ｃ）及び（Ｔ）を参照）。同様に、図１Ｂは、コードされた野生型ＧｌｃＴタンパク質（配列番号８２）及びコードされた変異ＧｌｃＴタンパク質（配列番号５５）のアラインメントを示し、配列番号５６の１９９位における（Ｃ）から（Ｔ）へのＳＮＰ（図１Ａを参照）は、配列番号５５のアミノ酸残基６７位におけるロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換をもたらす（例えば、それぞれ、図１Ｂの配列番号２２及び配列番号５５の残基６７位の黒の四角で囲んだ（Ｌ）及び（Ｆ）アミノ酸を参照）。

【0018】

【図2】図２は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞ＢＦ１１７（ＷＴ ｇｌｃＴ＋ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）、ＢＦ１３４（ＷＴ ｇｌｃＴ＋ＷＴ－５’－ＵＴＲ）、ＨＭ１５０－１（変異ｇｌｃＴ１＋ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）及びＨＭ１５１（変異ｇｌｃＴ１＋ＷＴ－５’－ＵＴＲ）をスクリーニングした、マイクロタイタープレートにおける正規化α－アミラーゼセラルファ活性（図２Ａ）及びα－アミラーゼ比生産性（図２Ｂ）を示す。図２Ｂに示されるように、宿主細胞ＨＭ１５１（変異ｇｌｃＴ１＋ＷＴ－５’－ＵＴＲ）の正規化α－アミラーゼＱｐは、宿主細胞ＢＦ１３４（ＷＴｇｌｃＴ＋ＷＴ－５’－ＵＴＲ）又はＢＦ１１７（ＷＴｇｌｃＴ＋ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）のいずれかのα－アミラーゼＱｐと比較して約４～５％増加している。さらに、図２Ｂに示されるように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞ＨＭ１５０－１（変異ｇｌｃＴ１＋ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）のα－アミラーゼＱｐは、宿主細胞ＢＦ１３４（ＷＴｇｌｃＴ＋ＷＴ－５’－ＵＴＲ）又はＢＦ１１７（ＷＴｇｌｃＴ＋ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）のいずれかのα－アミラーゼＱｐと比較して約９％増加し、宿主細胞ＨＭ１５１（変異ｇｌｃＴ１＋ＷＴ－５’－ＵＴＲ）のα－アミラーゼＱｐと比較して約４～５％増加している。

【発明を実施するための形態】

【0019】

生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｃａｓ９タンパク質をコードする合成核酸配列である。

【0020】

配列番号２は、Ｎ末端核局在シグナル（ＮＬＳ）配列のアミノ酸配列である。

【0021】

配列番号３は、Ｃ末端ＮＬＳ配列のアミノ酸配列である。

【0022】

配列番号４は、デカ－ヒスチジン（１０－Ｈ）タグを含むアミノ酸配列である。

【0023】

配列番号５は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥプロモーターを含む核酸配列である。

【0024】

配列番号６は、Ｃａｓ９フォワードプライマー核酸配列である。

【0025】

配列番号７は、Ｃａｓ９リバースプライマー核酸配列である。

【0026】

配列番号８は、プラスミドｐＫＢ３２０骨格の核酸配列である。

【0027】

配列番号９は、プラスミドｐＫＢ３２０の核酸配列である。

【0028】

配列番号１０は、ｐＫＢ３２０フォワードプライマー核酸配列である。

【0029】

配列番号１１は、ｐＫＢ３２０リバースプライマー核酸配列である。

【0030】

配列番号１２は、Ｃａｓ９「リバースシーケンシングプライマー１」核酸配列である。

【0031】

配列番号１３は、Ｃａｓ９「リバースシーケンシングプライマー２」核酸配列である。

【0032】

配列番号１４は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー１」核酸配列である。

【0033】

配列番号１５は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー２」核酸配列である。

【0034】

配列番号１６は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー３」核酸配列である。

【0035】

配列番号１７は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー４」核酸配列である。

【0036】

配列番号１８は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー５」核酸配列である。

【0037】

配列番号１９は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー６」核酸配列である。

【0038】

配列番号２０は、Ｃａｓ９「フォワードシーケンシングプライマー７」核酸配列である。

【0039】

配列番号２１は、ｐＲＦ６９４の核酸配列である。

【0040】

配列番号２２は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）野生型ｇｌｃＴ ＯＲＦ配列である。

【0041】

配列番号２３は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｇｌｃＴ遺伝子標的部位の核酸配列である。

【0042】

配列番号２４は、ｇｌｃＴ ＶＴドメインをコードする合成核酸配列である。

【0043】

配列番号２５（ＡＧＧ）は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｇｌｃＴ標的部位の３ヌクレオチドＰＡＭ配列である。

【0044】

配列番号２６は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメインをコードする合成核酸配列である。

【0045】

配列番号２７は、ｇｌｃＴガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）核酸配列を含む合成ＲＮＡ配列である。

【0046】

配列番号２８は、ｇｌｃＴ ｇＲＮＡをコードする合成ＤＮＡ配列である。

【0047】

配列番号２９は、ｒｒｎＩｐ２プロモーター配列を含むバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）核酸配列である。

【0048】

配列番号３０は、ラムダファージｔ０ターミネーター核酸配列である。

【0049】

配列番号３１は、ｇｌｃＴｇＲＮＡ発現カセットを含む核酸配列である

【0050】

配列番号３２は、アミノ酸残基６７位のロイシン（Ｌ）（Ｌ６７）をコードするヌクレオチド１９９位の上流（５’）にある５００ｂｐ（相同アーム）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0051】

配列番号３３は、ｇｌｃＴ ５’フォワードプライマー核酸配列である。

【0052】

配列番号３４は、ｇｌｃＴ ５’リバースプライマー核酸配列である。

【0053】

配列番号３５は、アミノ酸残基６７位のロイシン（Ｌ）（Ｌ６７）をコードするヌクレオチド１９９位の下流（３’）にある５００ｂｐ（相同アーム）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0054】

配列番号３６は、ｇｌｃＴ ３’フォワードプライマー核酸配列である。

【0055】

配列番号３７は、ｇｌｃＴ ３’リバースプライマー核酸配列である。

【0056】

配列番号３８は、ｐＲＦ７３１の核酸配列である。

【0057】

配列番号３９は、ｐＲＦ７２４の核酸配列である。

【0058】

配列番号４０は、ｒｇｈＲ２遺伝子コドン２４～２９の重複を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0059】

配列番号４１は、重複を有するｒｇｈＲ２遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ２核酸配列である。

【0060】

配列番号４２は、ｐＲＦ６９４の８．３ｋｂ ＰＣＲ産物である。

【0061】

配列番号４３は、ｐＲＦ６９４フォワードプライマーである。

【0062】

配列番号４４は、ｐＲＦ６９４リバースプライマーである。

【0063】

配列番号４５は、合成ｒｇｈＲ２編集テンプレートｇＲＮＡカセットである。

【0064】

配列番号４６は、合成ｒｇｈＲ２核酸配列編集テンプレートである。

【0065】

配列番号４７は、ｒｇｈＲ２ ｇＲＮＡ発現カセットである。

【0066】

配列番号４８は、ｒｇｈＲ２カセットフォワードプライマーである。

【0067】

配列番号４９は、ｒｇｈＲ２カセットリバースプライマーである。

【0068】

配列番号５０は、プラスミドｐＢＬ．ｃｏｍＫ．を含む核酸配列である。

【0069】

配列番号５１は、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｇｌｃＴ遺伝子座である。

【0070】

配列番号５２は、合成ｇｌｃＴ遺伝子座フォワードプライマーである。

【0071】

配列番号５３は、合成ｇｌｃＴ遺伝子座リバースプライマーである。

【0072】

配列番号５４は、合成ｇｌｃＴ遺伝子座フォワードシーケンシングプライマーである。

【0073】

配列番号５５は、配列番号５６のｇｌｃＴ ＯＲＦによってコードされる変異ＧｌｃＴ（Ｌ６７Ｆ）タンパク質のアミノ酸配列である。

【0074】

配列番号５６は、配列番号５５の変異ＧｌｃＴ（Ｌ６７Ｆ）タンパク質をコードする変異ｇｌｃＴ ＯＲＦ（Ｃ１９９Ｔ）を含む合成核酸配列である。

【0075】

配列番号５７は、ｒｇｈｒ２遺伝子座を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0076】

配列番号５８は、合成ｒｇｈＲ２遺伝子座フォワードプライマーである。

【0077】

配列番号５９は、合成ｒｇｈＲ２遺伝子座リバースプライマーである。

【0078】

配列番号６０は、合成ｒｇｈＲ２遺伝子座シーケンシングプライマーである。

【0079】

配列番号６１は、ａｒｇｈＲ２回復遺伝子座を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0080】

配列番号６２は、ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲを含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）核酸配列である。

【0081】

配列番号６３は、改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（以下、「ａｐｒＥ ｍｏｄ－５’ＵＴＲ」と称する）を含む合成核酸配列である。

【0082】

配列番号６４は、野生型５’－ＵＴＲ（ＷＴ ５’－ＵＴＲ）発現コンストラクトを含む合成核酸配列である。

【0083】

配列番号６５は、改変５’－ＵＴＲ発現コンストラクトを含む合成核酸配列である。

【0084】

配列番号６６は、５’ｃａｔＨ相同アームを含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0085】

配列番号６７は、ｃａｔＨ遺伝子を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0086】

配列番号６８は、ｓｐｏＶＧｒｒｎＩｐハイブリッドプロモーターを含む合成核酸配列である。

【0087】

配列番号６９は、ｌａｔシグナル配列を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0088】

配列番号７０は、変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α－アミラーゼをコードするＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）核酸配列である。

【0089】

配列番号７１は、ｌａｔターミネーターを含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0090】

配列番号７２は、３’ｃａｔＨ相同アームを含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）核酸配列である。

【0091】

配列番号７３は、変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α－アミラーゼのアミノ酸配列である。

【0092】

配列番号７４は、野生型ｃａｔＨ遺伝子座コンストラクトを含む合成核酸配列である。

【0093】

配列番号７５は、改変５’－ＵＴＲ ｃａｔＨ遺伝子座コンストラクトを含む合成核酸配列である。

【0094】

配列番号７６は、合成ｃａｔＨ遺伝子座フォワードプライマーである。

【0095】

配列番号７７は、合成ｃａｔＨ遺伝子座リバースプライマーである。

【0096】

配列番号７８は、合成ｃａｔＨフォワードシーケンシングプライマー１である。

【0097】

配列番号７９は、合成ｃａｔＨフォワードシーケンシングプライマー２である。

【0098】

配列番号８０は、合成ｃａｔＨフォワードシーケンシングプライマー３である。

【0099】

配列番号８１は、配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードするＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む核酸配列である。

【0100】

配列番号８２は、配列番号２２のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｇｌｃＴ ＯＲＦ又は配列番号８１のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｇｌｃＴ遺伝子によってコードされる、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）野生型ＧｌｃＴタンパク質のアミノ酸配列である。

【0101】

配列番号８３は、６つのアミノ酸（ＡＡＡＩＳＲ）の反復（重複）：Ａ３２Ａ３３Ａ３４Ｉ３５Ｓ３６Ｒ３７－Ａ３８Ａ３９Ａ４０Ｉ４１Ｓ４２Ｒ４３を含む、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）変異ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列である。

【0102】

配列番号８４は、回復（天然）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸配列である。

【0103】

本開示は一般に、増強されたタンパク質産生能力、増強された二次代謝産物産生能力などを備えたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（宿主）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を作製し、構築するための組成物及び方法に関する。より詳細には、本開示の特定の実施形態は、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴ（転写抗終結）タンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞を対象とする。特定の他の実施形態は、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする導入ポリヌクレオチドを含む遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞に関する。

【0104】

本開示の他の実施形態は、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする編集（改変）ｇｌｃＴ遺伝子を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞を対象とする。例えば、本開示の特定の実施形態（実施例２）は、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするＣａｓ９編集（改変）ｇｌｃＴ遺伝子を含むｇｌｃＴ Ｃａｓ９ターゲティングベクター及びその改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に関する。

【0105】

特定の他の実施形態では、本開示は、不活化（内因性）天然染色体ｇｌｃＴ遺伝子（すなわち、配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする）を含み、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする導入ポリヌクレオチドを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞に関する。したがって、特定の実施形態では、本開示は、そのような改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（例えば、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子を含む）に関し、この改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は目的タンパク質（ＰＯＩ）を、それらが由来する（すなわち、同じＰＯＩを発現／産生する）親細胞と比較して、より多く産生する。

【0106】

特定の他の実施形態では、本開示は、変異バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＧｌｃＴ（抗終結）タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む単離ポリヌクレオチドに関し、変異ＧｌｃＴタンパク質は、配列番号５５のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）のフェニルアラニン（Ｆ）への置換（Ｌ６７Ｆ）を含む。関連する実施形態では、ポリヌクレオチドＯＲＦは、配列番号５５又は配列番号８２と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を含む変異ＧｌｃＴタンパク質をコードし、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２２、配列番号８１又は配列番号５６と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする。

【0107】

他の実施形態では、本開示は、本開示の変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ＤＮＡ発現コンストラクトなどに関する。例えば、特定の実施形態では、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするＯＲＦを含むベクターは、ＯＲＦ配列に作動可能に連結された（５’）上流（５’）相同領域（５’－ＨＲ）、及び／又はＯＲＦ配列に作動可能に連結された（３’）下流（３’）相同領域（３’－ＨＲ）をさらに含み、この５’－ＨＲ及び／又は３’－ＨＲは、ベクターが相同組み換えによって（すなわち、ベクターがコンピテントバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に形質転換された場合に）、標的化ゲノム遺伝子座へ組み込まれるのに十分なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞の標的化ゲノム遺伝子座との相同性を含む。例えば、特定の実施形態では、このようなベクターは、配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質（すなわち、配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７））をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に導入され、この導入ベクターは、相同組換えによってベクターの組み込み、それによって配列番号８２のＧｌｃＴタンパク質をコードするＯＲＦを欠失させ、配列番号５５のＧｌｃＴタンパク質をコードするＯＲＦを置換するのに十分な、ｇｌｃＴ遺伝子ＯＲＦ染色体遺伝子座のすぐ上流（５’）及び／又はすぐ下流（３’）の親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（内因性）核酸配列に対して相同性を含む５’－ＨＲ及び／又は３’－ＨＲによりフランキングされている配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質（すなわち、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７））をコードするＯＲＦを含む。

【0108】

したがって、上述したように、本開示の特定の実施形態は、１種以上の目的タンパク質をより多く産生する、そうした遺伝子改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞（すなわち、同じ目的タンパク質を産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）親細胞と比較して（ここで、娘細胞及び親細胞は、同様の条件下で培養される））に関する。より詳細には、本開示の実施例の項（例えば、実施例１を参照）に記載されるように、出願人は日常的なＮＴＧ変異誘発を実施して、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）変異体（すなわち、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）娘細胞）のプールを作製し、続いて、このＮＴＧ改変（変異）娘細胞をスクリーニングして、目的の工業関連タンパク質（例えば、アミラーゼ、プロテアーゼなど）の産生を増加させ得るＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（変異）娘細胞変異を同定した。実施例１に示すように、アミラーゼタンパク質をより多く産生することができる特定のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（変異）娘細胞を同定し、この（変異）娘細胞は、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）によってその親と異なっていた。より詳細には、親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞が配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質（配列番号８２の６７位にロイシン（Ｌ）アミノ酸を含む）をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含むのに対して、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（変異）娘細胞は配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質（配列番号５５の６７位にフェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸を含む）をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む。

【0109】

さらに、実施例２に示すように、本出願人はコドン６７の第１の位置をＣＴＣからＴＴＣ（すなわち、ｇｌｃＴ遺伝子のコドン６７）に変化させ、それによってコドン６７をロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）に変換する特定のｇｌｃＴ Ｃａｓ９ターゲティングベクターを構築した。実施例３に示し、説明するように、このようなｇｌｃＴ Ｃａｓ９ターゲティングベクターを、コンピテント（親）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に形質転換して、Ｃａｓ９編集ｇｌｃＴ遺伝子を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を生成及び選択した。この改変細胞は、したがって、Ｌ６７Ｆ置換を含む変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする。例えば、実施例３に記載するように、シーケンシングデータを野生型ｇｌｃＴ遺伝子座と比較する配列アラインメントにより、回収されたコロニーのいくつかが、ＧｌｃＴタンパク質においてＬ６７Ｆ変異（配列番号５５）を引き起こす所望のゲノム編集を含むことがわかった。より具体的には、Ｌ６７Ｆ ＧｌｃＴタンパク質（配列番号５５）をコードする改変／編集ｇｌｃＴ遺伝子（配列番号５６）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）コロニー（本明細書において、アレル「ｇｌｃＴ１」と称する）を、ＢＦ６３株（ｇｌｃＴ１ ｐＢＬ．ｃｏｍＫ）として保存した。

【0110】

特定の他の実施形態では、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子（例えば、アレルｇｌｃＴ１）を含む、本開示の改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞は、変異（ｍｕｔａｔｅｄ）／変異（ｖａｒｉａｎｔ）ｒｇｈｒ２遺伝子を回復する遺伝子改変をさらに含む。例えば、本出願人が２０１７年２月２４日に出願した係属中の米国仮特許出願第６２／４６３，２６８号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、そのような回復ｒｇｈ２遺伝子（以下、「ｒｇｈ２ｒｅｓｔ」）を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（宿主）細胞及びその作製方法について詳しく記述されている。より詳細には、上記参照仮出願に記載されるように、特定のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株／宿主細胞のゲノムの配列が決定され、これにより、これらの配列決定された株のｒｇｈｒ２遺伝子に１８ヌクレオチド（１８ｂｐ）の重複（すなわち、反復）が含まれ、この１８ヌクレオチド（反復）配列はアミノ酸「ＡＡＡＩＳＲ」をコードし、その結果、変異ＲｇｈＲ２タンパク質はＡＡＡＩＳＲアミノ酸配列の反復（すなわち、ＡＡＡＩＳＲ－ＡＡＡＩＳＲ）を含むことが明らかになった。さらに、上記参照出願に記載されるように、１８ｂｐ重複を除去するように遺伝子改変されたＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞（ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔと称する）は、１８ｂｐ重複を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（非回復ｒｇｈｒ２）と比較して（相対的に）工業関連タンパク質をより多く産生することができた。

【0111】

したがって、特定の実施形態では、本開示の改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子を含む。特定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、改変ｇｌｃＴ遺伝子及び改変ｒｇｈｒ２遺伝子（すなわち、ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ）を含む。より詳細には、本開示の実施例４～６に示すように、出願人はさらにｒｇｈｒ２ Ｃａｓ９ターゲティングベクター（実施例４）を構築し、回復ｒｇｈｒ２アレルを含む改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞（すなわち、ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ；実施例５、ＢＦ６２細胞）と、回復ｒｇｈｒ２アレル及び改変ｇｌｃＴアレルを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞（すなわち、ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ及び改変ｇｌｃＴアレル；実施例６、ＢＦ１６９細胞）を生成した。

【0112】

本開示の実施例７に記載されるように、異種α－アミラーゼ発現カセットを、親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞ＢＦ６２、ＢＦ６３及びＢＦ１６９に導入した（例えば、表１７を参照）。より具体的には、異種α－アミラーゼの発現／産生に対する、作動可能に連結された「野生型５’－ＵＴＲ配列」の効果、対、作動可能に連結された「改変５’－ＵＴＲ配列」の効果をさらに試験するため、実施例７に示すα－アミラーゼ発現カセットを構築した。したがって、α－アミラーゼ発現カセットは、上流（５’）プロモーター及びα－アミラーゼをコードする下流（３’）オープンリーディングフレームに作動可能に連結した、野生型Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号６２）又は改変５’－ＵＴＲ（配列番号６３）を含んだ。したがって、実施例７で構築された親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（異種α－アミラーゼ発現カセットを含み発現する）を、実施例８においてα－アミラーゼの産生についてスクリーニングした。

【0113】

実施例８（表１８）に示すように、以下のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞をα－アミラーゼ産生についてスクリーニングした：（ｉ）導入「ＷＴ－５’－ＵＴＲ α－アミラーゼ発現カセット」（配列番号６２）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（本明細書中、「ＢＦ１３４」株／細胞と称する）、（ｉｉ）導入「改変５’－ＵＴＲ α－アミラーゼ発現カセット」（配列番号６３）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（本明細書中、「ＢＦ１１７」株／細胞と称する）、（ｉｉｉ）アレルｇｌｃＴ１及び導入「ＷＴ－５’－ＵＴＲ α－アミラーゼ発現カセット」（配列番号６２）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（本明細書中、「ＨＭ１５１」株／細胞と称する）、並びに（ｉｖ）アレルｇｌｃＴ１及び導入「改変５’－ＵＴＲ α－アミラーゼ発現カセット」（配列番号６３）を含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（本明細書中、「ＨＭ１５０－１」株／細胞と称する）。さらに、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（すなわち、ＢＦ１１７及びＢＦ１３４細胞）と比較して、アレルｇｌｃＴ１を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（すなわち、ＨＭ１５０－１及びＨＭ１５１細胞）のα－アミラーゼ活性及び比生産性は有意に増加する。

【0114】

上記で簡単に述べたように、本開示の特定の他の実施形態は、アレルｇｌｃＴ１を含み、さらに回復ｒｇｈｒ２遺伝子（ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ）を含む改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。例えば、本開示の実施例９に示すように、改変Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞ＢＦ１１８（ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ＋ｍｏｄ－５’－ＵＴＲアミラーゼカセット）、ＢＦ１７１（ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ＋ｇｌｃＴ１＋ｍｏｄ－５’－ＵＴＲアミラーゼカセット）、ＢＦ１６９（ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ＋ＷＴ－５’－ＵＴＲアミラーゼカセット）及びＢＦ２６０（ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ＋ｇｌｃＴ１＋ＷＴ－５’－ＵＴＲアミラーゼカセット）を、小規模でのアミラーゼ産生についてスクリーニングし、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞ＢＦ１７１及びＢＦ２６０の相対的アミラーゼ産生は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞ＢＦ１１８及びＢＦ１６９のアミラーゼ産生と比較して有意に増加した。

【0115】

したがって、特定の他の実施形態では、本開示は、本開示のＯＲＦを含むＤＮＡ発現コンストラクトに関し、このＤＮＡコンストラクトはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞において機能的なプロモーター核酸配列をさらに含み、このプロモーター配列は、ＯＲＦ配列の上流（５’）に作動可能に連結されている。特定の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、配列番号６３の改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－非翻訳領域配列（ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）をさらに含み、このｍｏｄ－５’－ＵＴＲはプロモーター配列の下流（３’）に作動可能に連結され、且つＯＲＦ配列の上流（５’）に作動可能に連結されている。別の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、ＯＲＦ配列の下流（３’）に作動可能に連結されたターミネーター配列をさらに含んでいる。

【0116】

本開示の他の実施形態は、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞において、内因性の目的タンパク質（ＰＯＩ）及び／又は異種ＰＯＩをより多く生産するための組成物及び方法に関する。例えば、特定の実施形態では、本開示の改変されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞において、内因性の目的タンパク質（ＰＯＩ）をより多く生産するための方法は、（ａ）内因性ＰＯＩの産生に適した培地において、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞を培養する工程、及び（ｂ）その培養培地から内因性ＰＯＩを回収する工程を含み、同一の条件下で培養された場合、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は内因性ＰＯＩを、その同じ内因性ＰＯＩを産生する未改変（親）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較してより多く産生する。

【0117】

特定の他の実施形態では、本開示は、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞において異種ＰＯＩをより多く生産する方法であって、（ａ）異種ＰＯＩの産生に適した培地で、変異ＧｌｃＴタンパク質（すなわち、配列番号５５のアミノ酸６７位（Ｆ６７）にフェニルアラニン（Ｆ）を含む）をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞を培養する工程（ここで、改変細胞及び親細胞は異種ＰＯＩの合成を指示する導入ポリヌクレオチド配列を含む）、及び（ｂ）その培養培地から異種ＰＯＩを回収する工程を含み、同一の条件下で培養された場合、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（すなわち、配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む）と比較して異種ＰＯＩをより多く産生する方法に関する。

【0118】

したがって、本開示の特定の他の実施形態は、目的の異種及び／又は内因性タンパク質をより多く生産することができる、そのような改変バチルス細胞を構築するための組成物及び方法に関する。例えば、特定の組成物及び方法は、（ａ）配列番号８２と少なくとも９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードする内因性染色体野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を得る工程、（ｂ）配列番号５５と９０％の配列同一性を含み、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質の合成を指示するポリヌクレオチド配列を導入することによって、工程（ａ）の親細胞を改変する工程、及び（ｃ）ＰＯＩの産生に適した培地で、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を培養する工程を含む、未改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（親）細胞に由来する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞に関連し、娘細胞と親細胞が同一の条件下で培養された場合、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞はＰＯＩを、その同じＰＯＩを産生する親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、より多く産生する。したがって、特定の他の実施形態では、本発明の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞は未改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（親）細胞に由来し、その親細胞の内因性染色体野生型ｇｌｃＴ遺伝子（すなわち、配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７））は、Ｃａｓ９ターゲティングベクターによって改変され、この編集された（改変された）ｇｌｃＴ遺伝子は配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする。したがって、本開示の特定の実施形態は、Ｃａｓ９編集遺伝子、例えば、限定はされないが、Ｃａｓ９編集ｇｌｃＴ遺伝子、Ｃａｓ９編集ｒｇｈｒ２遺伝子、これらの組み合わせなどに関する。

【0119】

特定の実施形態では、ＰＯＩは異種ＰＯＩであり、この異種ＰＯＩの合成を指示するポリヌクレオチド配列が娘細胞及び親細胞に導入される。他の実施形態では、ＰＯＩが内因性又は異種酵素である。

【0120】

Ｉ．定義
本明細書中に記載される、目的の１種以上の異種及び／又は内因性タンパク質を産生する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞、並びにその方法を考慮して、以下の用語及び句が定義される。本明細書中で定義されていない用語には、当該技術分野で通常使用されている意味が与えられるべきである。

【0121】

他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本組成物及び本方法が属する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本組成物及び本方法を実施又は試験する際、本明細書に記載のものに類似した、又は同等の方法及び材料もまた使用することができるが、説明に役立つ代表的な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で引用する刊行物及び特許は全て、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【0122】

特許請求の範囲が、任意選択的な要素を排除するように記載され得ることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「～のみ（ｏｎｌｙ）」、「～を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含まない（ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語の使用、又はその「否定的な」限定若しくは条件の使用のための先行文として機能することを意図している。

【0123】

本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離又はそれと組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法はいずれも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。

【0124】

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、新たに導入されるＤＮＡ配列のための宿主又は発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。したがって、本開示の特定の実施形態では、宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。

【0125】

本明細書で定義されるように、「親細胞」又は「親（宿主）細胞」は、互換的に使用され得、「未改変（の）」親細胞を指す。例えば、「親」細胞は、「親」細胞のゲノムが（例えば親細胞に導入された１つ以上の変異／改変によって）変更されて、その改変「娘」細胞を生成する微生物の任意の細胞又は株を指す。

【0126】

本明細書中で使用される場合、「改変細胞」又は「改変（宿主）細胞」は、互換的に使用され得、改変細胞が由来する「親」宿主細胞中に存在しない少なくとも１つの遺伝子改変を含む組み換え（宿主）細胞を指す。

【0127】

特定の実施形態では、「未改変」（親）細胞は、特に、「改変」バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞と比較した場合、又はそれに対して、「対照細胞」と称し得る。本明細書で使用される場合、「未改変」（親）細胞（すなわち、対照細胞）における目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現及び／又は産生が、「改変」（娘）細胞における同一ＰＯＩの発現及び／又は産生と比較される場合、「改変」及び「未改変」細胞は、同一条件（すなわち、培地、温度、ｐＨなどの同一条件）下で増殖／培養／発酵されることは理解されるであろう。

【0128】

本明細書で使用される場合、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種」細胞には、当業者に知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての種、例えば、以下に限定されないが、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、この属には、再分類されている種、例えば、以下に限定されないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」という名称のＢ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの生物が含まれることが意図されている。

【0129】

本明細書で使用される場合、配列番号２２のポリヌクレオチド配列は配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードし、配列番号５６のポリヌクレオチド配列は、配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする。例えば、本開示の図１Ａに示すように、２つのアラインしたポリヌクレオチド（ＯＲＦ）配列（配列番号２２対配列番号５６）は、ヌクレオチド１９９位のＳＮＰによって異なり、配列番号２２の１９９位はシトシン（Ｃ）を含み、配列番号５６の１９９位はチミン（Ｔ）を含む（例えば、図１Ａの黒の四角で囲んだ１９９位のヌクレオチド（Ｃ）及び（Ｔ）を参照）。同様に、図１Ｂは、コードされた野生型ＧｌｃＴタンパク質（配列番号８２）及びコードされた変異ＧｌｃＴタンパク質（配列番号５５）のアラインメントを示し、配列番号５６の１９９位における（Ｃ）から（Ｔ）へのＳＮＰ（図１Ａを参照）は、配列番号５５のアミノ酸残基６７位におけるロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換をもたらす（例えば、それぞれ、図１Ｂの配列番号２２及び配列番号５５の残基６７位の黒の四角で囲んだ（Ｌ）及び（Ｆ）アミノ酸を参照）。

【0130】

本明細書で使用される場合、用語「ｇｌｃＴ１」又は「アレルｇｌｃＴ１」は特に、配列番号５５のＬ６７Ｆ ＧｌｃＴタンパク質をコードする、変異、改変、編集又は導入されたｇｌｃＴ遺伝子（すなわち、アレルｇｌｃＴ１；配列番号５６）を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞を指す。特定の実施形態では、アレルｇｌｃＴ１は、配列番号５５と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＧｌｃＴタンパク質をコードし、且つ配列番号５５のアミノ酸６７位でのＬ６７Ｆ置換を含む。

【0131】

本明細書で使用される場合、「野生型Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ」（以下、「ＷＴ－５’－ＵＴＲ」と略す）は配列番号６２を含み、「改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ」（以下、「ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ」と略す）は配列番号６３を含む。例えば、実施例７に記載のα－アミラーゼ発現カセット（すなわち、配列番号６４及び配列番号６５）は、異種α－アミラーゼの発現／産生に対する、作動可能に連結された「ＷＴ－５’－ＵＴＲ配列」対作動可能に連結された「ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ配列」の効果をさらに試験するために構築された。したがって、α－アミラーゼ発現カセットは、上流（５’）プロモーター及びα－アミラーゼをコードする下流（３’）オープンリーディングフレームに作動可能に連結した、ＷＴ－５’－ＵＴＲ配列（配列番号６２）又はｍｏｄ－５’－ＵＴＲ配列（配列番号６３）のいずれかを含んだ。

【0132】

本明細書で使用される場合、「ＢＦ１３４」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、配列番号６４の導入アミラーゼ発現コンストラクトを含む。

【0133】

本明細書で使用される場合、「ＢＦ１１７」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、配列番号６５の導入アミラーゼ発現コンストラクトを含む。

【0134】

本明細書で使用される場合、「ＢＦ６３」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、配列番号５５のＬ６７Ｆ ＧｌｃＴタンパク質をコードするアレルｇｌｃＴ１（ｇｌｃＴ１（Ｌ６７Ｆ）／ｐＢＬ．ｃｏｍＫ）、及びＣｏｍＫタンパク質をコードする／発現するプラスミドｐＢＬ．ｃｏｍＫを含む。

【0135】

本明細書で使用される場合、「ＨＭ１５１」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、アレルｇｌｃＴ１及び配列番号６４の導入アミラーゼ発現コンストラクトを含む。

【0136】

本明細書で使用される場合、「ＨＭ１５０－１」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、アレルｇｌｃＴ１及び配列番号６５の導入アミラーゼ発現コンストラクトを含む。

【0137】

本明細書で使用される場合、「ＢＦ６２」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、回復ｒｇｈｒ２遺伝子（以下、「ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ」）を含む。ｒｇｈｒ２遺伝子及びその回復形態「ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ」を以下でさらに説明する。

【0138】

本明細書で使用される場合、「ＢＦ１６５」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ及び配列番号６４の導入アミラーゼ発現コンストラクトを含む。

【0139】

本明細書で使用される場合、「ＢＦ１１８」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ及び配列番号６５の導入アミラーゼ発現コンストラクトを含む。

【0140】

本明細書で使用される場合、「ＢＦ２６０」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、アレルｇｌｃＴ１及びｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ、並びに配列番号６４の導入アミラーゼ発現コンストラクトを含む。

【0141】

本明細書で使用される場合、「ＢＦ１７１」と名付けた「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞／株」は、アレルｇｌｃＴ１及びｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ、並びに配列番号６５の導入アミラーゼ発現コンストラクトを含む。

【0142】

本明細書で使用される場合、配列番号４１「変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」は、「Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ」（以下、「ＡＡＡＩＳＲ」）である６アミノ酸の連続反復をコードする１８ヌクレオチド（１８ｂｐ）重複を含み、コードされた配列番号８３の変異ＲｇｈＲ２タンパク質の一次（１°）アミノ酸配列は、以下のように、これら６アミノ酸の直鎖状（連続）反復を含む：「Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ」（以下「ＡＡＡＩＳＲＡＡＡＩＳＲ」）。例えば、配列番号８３のＲｇｈＲ２タンパク質中に存在する６アミノ酸反復は下の表１に記載されており、この１４０アミノ酸タンパク質の反復アミノ酸残基は、配列番号８３の３８～４３位に太字テキストで表示のアミノ酸を含む。

【0143】

対照的に、本開示の「回復Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）染色体ｒｇｈＲ２遺伝子」（配列番号６１）は、この１８ヌクレオチド（１８ｂｐ）重複を含んでいない。したがって、配列番号６１の回復ｒｇｈＲ２遺伝子は、配列番号８４の天然ＲｇｈＲ２タンパク質（すなわち、連続反復「ＡＡＡＩＳＲ」を含まない）をコードする。

【表1】

【0144】

したがって、本明細書で使用される場合、「１８ヌクレオチド重複を欠失させる」又は「１８ｂｐ重複を欠失させる」又は「１８ヌクレオチド重複を欠失させることにより細胞を改変する」という句は、特に、１８ヌクレオチド重複を含む変異ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の遺伝子改変を意味しており、その重複は、変異ＲｇｈＲ２タンパク質のアミノ酸「ＡＡＡＩＳＲ」の反復をコードする（例えば、表１；配列番号８３を参照；配列番号８３の３２～３７位のアミノ酸「ＡＡＡＩＳＲ」は、配列番号８３の３８～４３位で連続的に反復される）。したがって、特定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、「ＡＡＡＩＳＲ」反復配列をコードする１８ヌクレオチド重複を含む変異染色体ｒｇｈＲ２遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来し、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は「１８ヌクレオチド重複を欠失させる」ことによって改変され、それによって、配列番号８４の天然ｒｇｈＲ２タンパク質をコードする「回復（された）」ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）配列を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を生じる。ｒｇｈＲ２遺伝子、その（１８ｂｐ重複）ｒｇｈＲ２変異体（配列番号８３）、及びｒｇｈＲ２変異体の天然ｒｇｈＲ２遺伝子への回復（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ；配列番号８４）のより詳細な説明については、出願人の米国仮特許出願第６２／４６３，２６８号明細書（２０１７年２月２４日出願、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0145】

本明細書で定義される場合、「発現の増加」、「発現の強化」、「ＰＯＩの発現の増加」、「産生の増加」、「ＰＯＩの産生の増加」などの用語は、「改変」バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞を指し、ここで、「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」は、常に同じＰＯＩを発現／産生する「未改変」バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（親）細胞と比較して（相対的に）である。

【0146】

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことがある。したがって、用語「発現」には、ポリペプチドの産生、例えば、以下に限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌などに関与する任意の工程が含まれる。

【0147】

本明細書で定義する場合、「改変宿主細胞は（未改変）親宿主細胞と比較して目的タンパク質をより多く発現／産生する」などの句で使用する複合語「発現／産生する」は、本開示の宿主細胞における目的タンパク質の発現及び産生に関与する任意の工程を含むことが意図されている。

【0148】

同様に、本明細書で使用される場合、「改変宿主細胞が（未改変）親宿主細胞に比較して１種以上の目的タンパク質を「より多く発現／産生する」」などの句で使用した場合の「より多く」は、特に、改変宿主細胞内で発現／産生した任意の目的タンパク質（ＰＯＩ）の「より多く」を指すが、この「より多く」は常に同じＰＯＩを発現／産生する（未改変）親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較してであり、改変及び未改変細胞は、実質的に同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨなどの同一条件）下で増殖／培養／発酵される。例えば、より多くのＰＯＩは、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において発現した内因性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＰＯＩであっても異種ＰＯＩであってもよい。

【0149】

したがって、本明細書で使用される場合、タンパク質の産生を「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、又は「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」タンパク質の産生は、産生されるタンパク質（例えば、目的タンパク質）の量の増加を意味する。タンパク質は、宿主細胞の内部で産生されても、培養培地中へ分泌（又は、輸送）されてもよい。特定の実施形態では、目的タンパク質は、培養培地中へ産生（分泌）される。増加したタンパク質の産生は、例えば、親宿主細胞と比較して、より高いタンパク質の最大レベル、若しくはより高い酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、セルラーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性など）、又は産生される総細胞外タンパク質として検出され得る。

【0150】

本明細書で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列、及びその断片又は部分、並びに、センス鎖であるか又はアンチセンス鎖であるかにかかわらず、二本鎖であっても一本鎖であってもよい、ゲノム又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指す。遺伝子コードの縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることが理解されよう。

【0151】

本明細書に記載したポリヌクレオチド（又は核酸分子）には、「遺伝子」、「ベクター」及び「プラスミド」が含まれることは理解されている。

【0152】

したがって、用語「遺伝子」は、あるタンパク質のコード配列の全て又は一部を含む、ある特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現される条件を決定する、プロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’－ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びにコード配列を含み得る。

【0153】

本明細書で使用される場合、「コード配列」という用語は、その（コードする）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレーム（以下「ＯＲＦ」）によって決定され、それは、通常、ＡＴＧ開始コドンで開始する。コード配列は通常、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組み換えヌクレオチド配列を含む。

【0154】

本明細書で定義する場合、用語「オープンリーディングフレーム」（以下「ＯＲＦ」）は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を示す一連の２つ以上のコドン、及び（ｉｉｉ）終止コドンからなる中断されていないリーディングフレームを含む核酸又は核酸配列（天然に存在するか、天然に存在しないか、又は合成であるかにかかわらず）を意味し、ＯＲＦは、５’から３’の方向に読まれる（又は、翻訳される）。

【0155】

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側（下流）に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来してもよく、又は天然に存在する種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されていてもよく、又は合成核酸セグメントを含んでいてさえよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、又は種々の生育段階で、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解されている。ほとんどの場合にほとんどの細胞型で遺伝子の発現をもたらすプロモーターは一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。

【0156】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列（例えばＯＲＦ）に作動可能に連結している。コード配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。

【0157】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結され」ている。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結しており；プロモーター若しくはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコード配列に作動可能に連結しており、又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合、隣接し、且つリーディング期にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによってなされる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。

【0158】

本明細書で使用される場合、「目的タンパク質のコード配列の遺伝子に連結した目的遺伝子（又はそのオープンリーディングフレーム）の発現を制御する機能的プロモーター配列」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）におけるコード配列の転写及び翻訳を制御するプロモーター配列を指す。例えば、特定の実施形態では、本開示は、５’プロモーター（又は、５’プロモーター領域若しくはタンデム５’プロモーターなど）を含むポリヌクレオチドであって、そのプロモーター領域が目的タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結しているポリヌクレオチドを対象としている。したがって、特定の実施形態では、機能的プロモーター配列は、目的タンパク質をコードする目的遺伝子の発現を制御する。他の実施形態では、機能的プロモーター配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における目的タンパク質をコードする異種遺伝子又は内因性遺伝子の発現を制御する。

【0159】

本明細書で定義する場合、「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、又は下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を与える。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が含まれ得る。

【0160】

本明細書で定義する場合、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターを、「細菌細胞内に導入する」又は「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内に導入する」などの句で使用される「導入する」という用語には、ポリヌクレオチドを細胞内に導入するための当該技術分野で知られた方法、例えば、以下に限定されないが、プロトプラスト融合法、天然若しくは人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）法、形質導入法、トランスフェクション法、共役法などが含まれる（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照）。

【0161】

本明細書で使用される場合、「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組み換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを意味する。形質転換は通常、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド、ＯＲＦ又は遺伝子）の細胞内への挿入によって発生する。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されることになる細胞では天然に存在しない配列）であってもよい。本明細書で使用される場合、「形質転換」は、外来性ＤＮＡを宿主細胞内へ、そのＤＮＡが染色体組み込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、導入することを指す。本明細書で使用される場合、「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」、及び「ＤＮＡコンストラクト」は、配列を宿主細胞又は生物内に導入するために使用されるＤＮＡを指す。形質転換ＤＮＡは、配列を宿主細胞又は生物内に導入するために使用されるＤＮＡである。このＤＮＡは、インビトロでＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によって生成され得る。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡは入来配列を含むが、他の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、相同ボックスによってフランキングされた入来配列をさらに含む。さらに別の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、末端に付加された、他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクター内への挿入など、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる。

【0162】

本明細書で使用される場合、「入来配列」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内に導入されるＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、入来配列は、ＤＮＡコンストラクトの一部である。他の実施形態では、入来配列は、１種以上の目的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在していても存在していなくてもよい（すなわち、相同配列であっても非相同配列であってもよい）配列を含む。いくつかの実施形態では、入来配列は、１種以上の目的タンパク質、遺伝子及び／又は変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替の実施形態では、入来配列は、機能的な野生型遺伝子若しくはオペロン、機能的な変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。いくつかの実施形態では、非機能的配列は、遺伝子の機能を崩壊させるために遺伝子内に挿入され得る。別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。さらなる実施形態では、入来配列は、２つの相同ボックス（例えば、上流及び下流の相同アーム）を含む。

【0163】

本明細書で使用される場合、「相同ボックス」は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である核酸配列を指す。より詳細には、相同ボックスは、本発明にしたがって、欠失される、破壊される、不活化される、下方制御されるなどの遺伝子又は遺伝子の一部の直接的フランキングコード領域と約８０～１００％の配列同一性、約９０～１００％の配列同一性、又は約９５～１００％の配列同一性を有する上流又は下流領域である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内にＤＮＡコンストラクトが組み込まれる場所を指示し、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分を入来配列で置換するかを指示する。本開示を限定することを意図するものではないが、相同ボックスには、約１塩基対（ｂｐ）～２００キロ塩基（ｋｂ）が含まれ得る。好ましくは、相同ボックスは、約１ｂｐ～１０．０ｋｂ；１ｂｐ～５．０ｋｂ；１ｂｐ～２．５ｋｂ；１ｂｐ～１．０ｋｂ、及び０．２５ｋｂ～２．５ｋｂを含む。相同ボックスはまた、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含み得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーの５’側及び３’側末端は、相同ボックス（相同アーム）によってフランキングされ、この相同ボックスは、遺伝子のコード領域を直接的にフランキングする核酸配列を含む。

【0164】

本開示のさらにまた別の実施形態では、ＤＮＡアレイ解析（例えば、本明細書に記載するようなトランスクリプトーム解析）によって決定される不適切なときに活性である遺伝子の欠失、破壊、不活化又は下方制御は、目的タンパク質の発現の強化を提供する。本明細書で使用される場合、「トランスクリプトーム解析」は、遺伝子転写の解析を指す。

【0165】

本明細書で使用される場合、「選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列」という用語は、宿主細胞中で発現可能であり、選択可能マーカーの発現が、発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与する、ヌクレオチド配列を指す。

【0166】

本明細書で使用される場合、「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」という用語は、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にさせる、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指す。このような選択可能マーカーの例としては抗微生物剤が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、「選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞が目的の入来ＤＮＡを取り込んだか、又は何らかの他の反応が起こったことを示す遺伝子を指す。通常、選択可能マーカーは、形質転換中に外来性の配列を受け取っていない細胞から外来性ＤＮＡを含む細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。

【0167】

「存在する選択可能マーカー」は、形質転換対象の微生物の染色体に位置する選択マーカーである。存在する選択可能マーカーは、形質転換ＤＮＡコンストラクト上の選択可能マーカーとは異なる遺伝子をコードする。選択マーカーは、当業者にはよく知られている。上記で示したように、マーカーは、抗微生物耐性マーカー（例えば、ａｍｐＲ、ｐｈｌｅｏＲ、ｓｐｅｃＲ、ｋａｎＲ、ｅｒｙＲ、ｔｅｔＲ、ｃｍｐＲ及びｎｅｏＲ（例えば、Ｇｕｅｒｏｔ－Ｆｌｅｕｒｙ，１９９５；Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；及びＴｒｉｅｕ－Ｃｕｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９８３を参照）であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、クロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子、並びにバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のゲノム内に存在する耐性遺伝子）を提供する。この耐性遺伝子は、本発明において、並びに染色体に組み込まれたカセット及び統合的プラスミドの染色体増幅を包含する実施形態において、特に有用である（例えば、Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ ａｎｄ Ｇａｌｉｚｚｉ，１９８５；Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｆｅｒｒａｒｉ，１９８４を参照）。本発明にしたがって有用な他のマーカーとしては、セリン、リシン、トリプトファンなどの栄養要求性マーカー、及びβ－ガラクトシダーゼなどの検出マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0168】

本明細書で定義する場合、宿主細胞「ゲノム」、細菌（宿主）細胞「ゲノム」、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞「ゲノム」には、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子が含まれる。

【0169】

本明細書で使用される場合、「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」という用語は、多くは、細胞の中心的な代謝には通常関与しない遺伝子を持ち、通常、環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態の染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、任意のソースに由来する、直鎖状又は環状で、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡからなる自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であり得、それらにおいては、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる固有の構成に、多くのヌクレオチド配列が結合又は再結合している。

【0170】

本明細書で使用される場合、「形質転換カセット」は、遺伝子（又は、そのＯＲＦ）を含み、外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有する特異的ベクターを指す。

【0171】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新たな遺伝子又はＤＮＡセグメントを細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。したがって、この用語は、様々な宿主細胞間で移動するために設計された核酸コンストラクトを指す。ベクターとしては、「エピソーム」（すなわち、自律的に複製するか、又は宿主生物の染色体に組み込むことができる）である、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン、及びＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）などの人工染色体が挙げられる。

【0172】

「発現ベクター」は、細胞内で異種ＤＮＡを組み込み、発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターが市販されており、当業者に知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。

【0173】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「発現ベクター」という用語は、標的細胞中の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組み換えにより、又は合成的に生成される核酸コンストラクトを指す（すなわち、これらは、上述したベクター又はベクター要素である）。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片内に組み込むことができる。通常、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写されることになる核酸配列及びプロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトには、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントも含まれる。特定の実施形態では、本開示のＤＮＡコンストラクトは、本明細書で定義する選択マーカー及び不活化染色体セグメント又は遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。

【0174】

本明細書で使用される場合、「ターゲティングベクター」は、ターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを駆動できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組み換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入するのに使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加された他の非相同配列（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）を含む。末端は、例えば、ベクター内への挿入など、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。適切なベクターの選択及び／又は構成は、十分に当業者の知識の範囲内である。

【0175】

本明細書で使用される場合、用語「プラスミド」は、クローニングベクターとして使用され、多くの細菌及び一部の真核生物において染色体外の自己複製遺伝要素を形成する、環状の二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡコンストラクトを指す。いくつかの実施形態では、プラスミドは、宿主細胞のゲノム内に組み込まれる。

【0176】

本明細書で使用される場合、「目的タンパク質」又は「ＰＯＩ」という用語は、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞中で発現することが望まれる目的ポリペプチドを指し、このＰＯＩは、より高いレベル（すなわち、「未改変」（親）細胞と比較して）で発現することが好ましい。したがって、本明細書で使用される場合、ＰＯＩは、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質、受容体タンパク質、抗体などであり得る。

【0177】

同様に、本明細書で定義する場合、「目的遺伝子」又は「ＧＯＩ」は、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子又はＯＲＦ）を指す。「目的タンパク質」をコードする「目的遺伝子」は、天然に存在する遺伝子であっても、変異遺伝子であっても、合成遺伝子であってもよい。

【0178】

特定の実施形態では、本開示の改変細胞は、親細胞に比較して異種ＰＯＩ又は内因性ＰＯＩをより多く産生する。特定の実施形態では、本開示の改変細胞によって産生されたＰＯＩの増加した量は、親細胞と比較して、少なくとも０．０５％の増加、少なくとも０．１０％、少なくとも１．０％の増加、少なくとも５．０％の増加、又は５．０％超の増加である。非限定的な例として、特定の実施形態では、ＰＯＩは酵素（例えば、アミラーゼ、プロテアーゼなど）であり、改変細胞によって産生されるＰＯＩのレベルの増加（すなわち、その非改変親と比較して）は、酵素活性の増加及び／又は比生産性（Ｑｐ）の増加として検出又は測定される。

【0179】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対し、従来の１文字又は３文字コードを使用する。ポリペプチドは、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、また、非アミノ酸によって分断されていてもよい。ポリポチペプチドという用語はまた、自然に、或いは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識化成分との結合などの任意の他の操作若しくは改変によって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド、及び当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。

【0180】

特定の実施形態では、本開示の遺伝子は、酵素（例えば、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、及びこれらの組み合わせなど）などの商業に関連した工業用の目的タンパク質をコードする。

【0181】

本明細書で使用される場合、「変異」ポリペプチドは、一般的には組み換えＤＮＡ技術による１つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失による親（又は参照）ポリペプチドに由来するポリペプチドを指す。変異ポリペプチドは、少数のアミノ酸残基によって親ポリペプチドと異なる可能性があり、親（参照）ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義され得る。

【0182】

好ましくは、変異ポリペプチドは、親（参照）ポリペプチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。本明細書で使用される場合、「変異」ポリヌクレオチドは、変異ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指し、この「変異ポリヌクレオチド」は、親ポリヌクレオチドと特定の程度の配列相同性／同一性を有するか、又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で親ポリヌクレオチド（又はその相補体）とハイブリダイズする。好ましくは、変異ポリヌクレオチドは、親（参照）ポリヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。

【0183】

本明細書で使用される場合、「変異」は、核酸配列内の任意の変化又は変更を指す。点変異、欠失変異、サイレント変異、フレームシフト変異、スプライシング変異などを含む数種類の変異が存在する。変異は、特異的に（例えば、部位特異的変異誘発によって）、又はランダムに（例えば、化学薬品、修復マイナス細菌株による継代によって）行われ得る。

【0184】

本明細書で使用される場合、ポリペプチド又はその配列に関連した用語「置換」は、１つのアミノ酸と別のアミノ酸との置き換え（すなわち、置換）を意味する。

【0185】

本明細書で定義する場合、「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置にある遺伝子を指す。

【0186】

本明細書で定義する場合、「異種」遺伝子、「非内因性」遺伝子、又は「外来」遺伝子は、通常は宿主生物に見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子（又はＯＲＦ）を指す。本明細書で使用される場合、「外来」遺伝子という用語は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子（若しくはＯＲＦ）及び／又は天然若しくは非天然生物中に挿入されたキメラ遺伝子を含む。

【0187】

本明細書で定義する場合、「異種」核酸コンストラクト又は「異種」核酸配列は、それが発現する細胞から生じたものではない配列の部分を有する。

【0188】

本明細書で定義する場合、「異種制御配列」は、天然では目的遺伝子の発現を調節（制御）するように機能しない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、細胞、又はそれらの配列が存在するゲノムの一部に対して内因性（天然）ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に付加されている。「異種」核酸コンストラクトは、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一、又は異なる制御配列／ＤＮＡコード（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。

【0189】

本明細書で使用される場合、「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」という用語は、成熟タンパク質又はタンパク質の前駆体形態の分泌又は直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、一般的には、前駆体又は成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内因性であっても外来性であってもよい。シグナル配列は、通常は、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、一般的には、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。

【0190】

用語「由来する」は、「～に起源を持つ」、「～から得られた」、「入手可能な」及び「作製された」という用語を包含し、一般に、１つの特定の材料若しくは組成物が、別の特定の材料若しくは組成物にその起源があるか、又は別の特定の材料若しくは組成物に関連して記載できる特徴を有することを示している。

【0191】

本明細書で使用される場合、用語「相同性」は、相同ポリヌクレオチド又は相同ポリペプチドに関連する。２つ以上のポリヌクレオチド又は２つ以上のポリペプチドが相同である場合、これは、相同のポリヌクレオチド又はポリペプチドが、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、及び最も好ましくは少なくとも９８％の「同一性度」を有することを意味する。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が、本明細書で定義するような相同であるほどの十分に高い同一性度を有するか否かは、当該技術分野で知られるコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供される「ＧＡＰ」（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）を使用して２つの配列をアラインすることにより適切に調べることができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０））。ＤＮＡ配列比較のために以下の設定でＧＡＰを使用：ＧＡＰ作成ペナルティ（ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）５．０及びＧＡＰ伸長ペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）０．３。

【0192】

本明細書で使用される場合、用語「同一性パーセント（％）」は、配列アライメントプログラムを使用してアラインさせたときの、ポリペプチドをコードする核酸配列間又はポリペプチドのアミノ酸配列間の核酸又はアミノ酸の配列同一性のレベルを指す。

【0193】

本明細書で使用される場合、「比生産性」は、所定の期間にわたって、細胞１個当たり、単位時間当たりに産生されるタンパク質の総量である。

【0194】

本明細書で定義する場合、「精製された」、「単離された」又は「濃縮された」という用語は、生体分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）が、それが本来関連している、天然に存在する構成要素の一部又は全てから分離することによって、その天然状態から変えられていることを意味する。このような単離又は精製は、最終組成物中において望ましくない全細胞、細胞片、不純物、外来タンパク質又は酵素を除く、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈澱若しくは他のタンパク質塩析、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、精密濾過、ゲル電気泳動、又は勾配による分離などの当該技術分野で認められている分離技術によって実施され得る。精製又は単離した生体分子組成物には、その後さらに、追加の便益を付与する構成要素、例えば、活性化剤、抗阻害剤、望ましいイオン、ｐＨを制御する化合物又は他の酵素若しくは化学物質を添加することができる。

【0195】

本明細書で使用される場合、「変異ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ」は、国際公開第２００９／１４９１３０号パンフレットに開示された変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α－アミラーゼである。

【0196】

本明細書で使用される場合、用語「ＣｏｍＫポリペプチド」は、ｃｏｍＫ遺伝子の産物；コンピテンスの発達の前の最終自己調節制御スイッチとして作用する転写因子として定義され；ＤＮＡ結合及び取込み並びに組み換えに関与する後期コンピテンス遺伝子の発現の活性化に関与する（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｚｕｂｅｒ，１９９８，Ｈａｍｏｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ｃｏｍＫ核酸配列を含み、発現するプラスミド（ｐＢＬ．ｃｏｍＫ）を配列番号５０に示す。

【0197】

本明細書で使用される場合、「相同遺伝子」は、異なるが通常は関連する種に由来する、相互に対応し、且つ相互に同一であるか又は極めて類似する１対の遺伝子を指す。この用語は、種分化（すなわち、新規な種の発生）によって分離された遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、及び遺伝子重複によって分離されてきた遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。

【0198】

本明細書で使用される場合、「オルソログ」及び「オルソロガス遺伝子」は、種分化によって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から生じた異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新しく配列が決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測に使用される。

【0199】

本明細書で使用される場合、「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」は、ゲノム内での重複に関係する遺伝子を指す。オルソログは進化の過程を通して同じ機能を保持し、一方、パラログはいくつかの機能は多くは元の機能に関連するものの新しい機能を生じる。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビン（これらはいずれも、セリンプロテイナーゼであり、同じ種において同時に発生する）をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0200】

本明細書で使用される場合、「相同性」は、配列の類似性又は同一性を指し、好ましくは同一性である。この相同性は、当該技術分野で知られる標準技術を使用して決定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照）。

【0201】

本明細書で使用する「アナログ配列」は、遺伝子の機能がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する遺伝子と実質的に同一である配列である。さらに、アナログ遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞の配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。アナログ配列は、既知の配列アラインメント法によって決定される。一般に使用されるアラインメント法はＢＬＡＳＴであるが、配列をアラインさせる際には他の方法もまた使用される。

【0202】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られた塩基対合により、核酸鎖を相補鎖と接合させるプロセスを指す。核酸配列は、２つの配列が中程度～高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズするなら、参照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常、約Ｔｍ－５℃（プローブのＴｍを５°下回る）で；「高ストリンジェンシー」はＴｍを約５～１０℃下回り；「中程度ストリンジェンシー」はプローブのＴｍを約１０～２０℃下回り；且つ「低ストリンジェンシー」はＴｍを約２０～２５℃下回って生じる。機能上、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ；一方、中程度又は低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド配列ホモログを同定又は検出するために用いることができる。中程度及び高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当該技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｐｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ中における約４２℃でのハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中における室温（ＲＴ）での２回の洗浄、並びに０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中における４２℃でのさらなる２回の洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェント条件の例としては、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０ｍｇ／ｍｌ変性断片処理済みサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で終夜インキュベートし、続いて１×ＳＳＣ中、約３７～５０℃でフィルターを洗浄することが挙げられる。当業者は、プローブ長などの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などを調整する方法を知っている。

【0203】

本明細書で使用される場合、「組み換え」は、異種核酸配列の導入によって改変されているか、又は細胞がそのように改変された細胞に由来する細胞又はベクターへの言及を含む。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞の天然（非組み換え）形態内の同一形態においては見出されない遺伝子を発現するか、又はヒトが意図的に介入した結果として、さもなければ異常に発現する、過少発現する、若しくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。「組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」、「組み換える」、又は「組み換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ）」核酸を生成することは、一般に、２つ以上の核酸断片の集合体であり、この集合体は、キメラ遺伝子を発生させる。

【0204】

本明細書で使用される場合、「フランキング配列」は、対象配列の上流又は下流のいずれかにある任意の配列を指す（例えば、遺伝子Ａ－Ｂ－Ｃでは、遺伝子ＢはＡ及びＣ遺伝子配列にフランキングされている）。特定の実施形態では、入来配列は両側で相同ボックスにフランキングされている。別の実施形態では、入来配列及び相同ボックスは両側にスタッファー配列がフランキングしている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’又は５’のいずれか）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体内の配列と相同である。これらの配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどこに新規なコンストラクトが組み込まれ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体のどの部分が入来配列により置換されるかを指示する。他の実施形態では、選択マーカーの５’側及び３’側末端は、不活化染色体セグメントの一部を含むポリヌクレオチド配列によってフランキングされている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’又は５’のいずれか）にのみ存在するが、他の実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。

【0205】

本明細書で使用される場合、用語「スタッファー配列」は、相同ボックス（一般的には、ベクター配列）にフランキングしている任意のエクストラＤＮＡを指す。しかし、この用語は、任意の非相同ＤＮＡ配列を包含する。いかなる理論によっても限定されるものではないが、スタッファー配列は細胞がＤＮＡ取込みを開始するために重要ではない標的を提供する。

【0206】

ＩＩ．ＧｌｃＴ抗終結タンパク質
以下の実施例の項で記載されるように、出願人は、定型の全宿主変異誘発（ＮＴＧ）を実施して、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）変異体（すなわち、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）娘細胞）のプールを作製し、定型のスクリーニング手順を使用して、目的の工業関連タンパク質（例えば、異種酵素、内因性酵素）をより多く産生し得るそのような改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）娘細胞を同定した。より詳細には、出願人は、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を同定した。この改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞はアミラーゼタンパク質を、野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して（すなわち、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を同様の条件下で培養した場合）、より多く産生することができた。

【0207】

Ｓｃｈｍａｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２００３）に一般的に記されているように、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＧｌｃＴタンパク質は転写抗ターミネーターのＢｇｌＧファミリーのメンバーであり、この抗ターミネーターは、Ｎ末端ＲＮＡ結合ドメイン（約６０アミノ酸）と、インデューサーの利用可能性に応答してタンパク質の調節出力を調節する、２つの反復ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）調節ドメイン（ＰＲＤ；ＰＲＤ－Ｉ及びＰＲＤ－ＩＩ）を含む（Ｍａｎｉｖａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｓｔｕｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他のいくつかの細菌では、グルコースが取り込まれると同時にホスホエノールピルビン酸塩によってリン酸化される：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）（Ｐｏｓｔｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）は、２つの一般的なエネルギーカップリングタンパク質、酵素Ｉ（ＥＩ）及びＨＰｒと、いくつかのマルチドメイン糖特異的パーミアーゼ（例えば、酵素ＩＩ（ＥＩＩ））から構成され、これらは、個々のタンパク質として存在するか、又は単一のポリペプチドに融合され得る。

【0208】

例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、グルコースパーミアーゼ（ＥＩＩ）の全てのドメインが融合されて、ドメイン配置（ＥＩＩＣ）（ＥＩＩＢ）－（ＥＩＩＡ）を有する単一のポリペプチドを形成する（例えば、Ｐｏｓｔｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｔｕｌｋｅ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎ，２０００を参照）。さらに、グルコースＰＴＳの構成要素をコードする遺伝子は細菌で構成的に発現していると長い間考えられていた。これは一般的なタンパク質をコードするｐｔｓＩ及びｐｔｓＨ遺伝子についての事例であるが、グルコース特異的パーミアーゼ（ＥＩＩＧｌｃ）をコードするｐｔｓＧ遺伝子は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の両方においてグルコースにより誘導される（Ｐｏｓｔｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｔｕｌｋｅａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎ，２０００；Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ，２００２．）。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）では、ｐｔｓＧ発現のグルコース誘導は転写抗終結によって媒介される。例えば、グルコースがないと、ｐｔｓＧプロモーターで開始された転写はｍＲＮＡのリーダー領域で終結する。グルコースが存在すれば、ＧｌｃＴ抗終結タンパク質は活性であり（すなわち、二量体）、ターミネーターと重なるＲＮＡ抗ターミネーター（ＲＡＴ）配列に結合することによって転写終結を妨げる。ＧｌｃＴのＲＡＴへの結合はＲＡＴ構造を安定化し、ターミネーターの形成を妨げると考えられる（Ｓｔｕｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｌａｎｇｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。

【0209】

特定の理論、機構、又は作用様式に拘束されることを望むものではないが、出願人は驚くべきことに、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子又はそのＯＲＦを含む、本開示の改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞が、目的の工業関連タンパク質をより多く産生し得ることを発見した。より詳細には、出願人は、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を同定した。この改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞はアミラーゼタンパク質を、野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して（すなわち、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を同様の条件下で培養した場合）、より多く産生することができた。

【0210】

例えば、図１Ａは、変異ＧｌｃＴタンパク質（配列番号５５）をコードする改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＯＲＦ（配列番号５６）と比較した、野生型ＧｌｃＴタンパク質（配列番号８２）をコードする親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＯＲＦ（配列番号２２）の核酸配列アラインメントを示す。図１Ａに示すように、２つのアラインしたＯＲＦ配列（配列番号２２対配列番号５６）は、ヌクレオチド１９９位のＳＮＰによって異なり、配列番号２２の１９９位はシトシン（Ｃ）を含み、配列番号５６の１９９位はチミン（Ｔ）を含む（例えば、図１Ａの黒の四角で囲んだ１９９位のヌクレオチド（Ｃ）及び（Ｔ）を参照）。同様に、図１Ｂは、コードされた野生型ＧｌｃＴタンパク質（配列番号８２）及びコードされた変異ＧｌｃＴタンパク質（配列番号５５）のアラインメントを示し、配列番号５６の１９９位における（Ｃ）から（Ｔ）へのＳＮＰ（図１Ａを参照）は、配列番号５５のアミノ酸残基６７位におけるロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換をもたらす（例えば、それぞれ、図１Ｂの配列番号２２及び配列番号５５の残基６７位の黒の四角で囲んだ（Ｌ）及び（Ｆ）アミノ酸を参照）。

【0211】

出願人は、配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質配列を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質配列の検索、アラインメント、及びその分析をさらに行い、この分析により、配列番号８２の６７位のロイシン（Ｌ）アミノ酸がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞の間で高度に保存されていることが明らかになった。同様に、完全長ＧｌｃＴタンパク質配列の配列同一性はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞間で高度に保存されている（例えば、８０～１００％のアミノ酸配列同一性）。したがって、特定の実施形態では、アレルｇｌｃＴ１は、配列番号５５と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＧｌｃＴタンパク質をコードし、且つ配列番号５５のアミノ酸残基６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む。

【0212】

ＩＩＩ．ＲｇｈＲ２ｒｅｓｔ Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞
上記のセクションＩＩで一般的に記載したように、本開示の特定の実施形態は、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞（すなわち、例えば、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする改変ｇｌｃＴ遺伝子を含む）に関連し、この改変細胞は目的タンパク質（ＰＯＩ）を、同じＰＯＩを産生する親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、より多く産生する。特定の関連する実施形態において、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、米国仮特許出願第６２／４６３，２６８号明細書に記載され、説明されている回復ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）を含む、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。

【0213】

例えば、本開示の特定の実施形態では、改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号６１のｒｇｈＲ２遺伝子に対して９０％の配列同一性を含む回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号６１のｒｇｈＲ２遺伝子に対して９５％の配列同一性を含む、回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。さらに他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号６１の回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。

【0214】

他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質に対して９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。特定の他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質に対して９５％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。さらに他の実施形態では、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。したがって、本開示の特定の実施形態は、回復ｒｇｈＲ２（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）遺伝子及びアレルｇｌｃＴ１を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関する。

【0215】

ＩＶ．改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＰＲＥ ５’－ＵＴＲ核酸配列
上で一般的に記載したように、本発明の特定の実施形態は、アレルｇｌｃＴ１を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞に関し、この改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、天然／野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、目的の内因性及び／又は異種タンパク質をより多く産生することができる。したがって、特定の関連する実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）親細胞及びその改変娘細胞（例えば、アレルｇｌｃＴ１を含む）は、目的タンパク質をコードする発現コンストラクトで形質転換される。例えば、特定の実施形態では、親及び改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ＰＯＩ（例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼなど）をコードする発現コンストラクトで形質転換される。

【0216】

したがって、特定の関連する実施形態では、ＰＯＩをコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）は、改変Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－非翻訳領域（ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）配列（配列番号６３）に作動可能に連結されている。例えば、出願人が２０１７年９月１３日に出願した米国仮特許出願第６２／５５８，３０４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）では、そのようなｍｏｄ－５’－ＵＴＲ配列、そのベクター、その改変宿主細胞などを開示し、十分に説明している。

【0217】

より詳細には、本開示の実施例７に示すように、出願人は、改変ａｐｒＥ ５’非翻訳領域（ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）配列の、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における目的タンパク質をコードする遺伝子の発現に対する効果を（例えば、野生型Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ５’－ＵＴＲ（配列番号６２）又は改変ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号６３）のいずれかを含むα－アミラーゼ発現カセットを構築することによって）試験した。したがって、実施例７では、様々な（改変）５’－ＵＴＲコンストラクトの評価のためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の作製、並びにそのような改変５’ＵＴＲコンストラクトが上流（５’）プロモーター及び目的タンパク質をコードする下流（３’）オープンリーディングフレームに作動可能に連結されているときの目的タンパク質の産生に与えるそれらの影響／作用を記載している。

【0218】

例えば、キシロース誘導性ｃｏｍＫ発現カセット（配列番号５０）を有するプラスミド（ｐＢＬ．ＣｏｍＫ）を含む、親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞ＢＦ６３、ＢＦ６２、及びＢＦ１６９（表１７及び表１８を参照）を構築した。より詳細には、以下の実施例の項に記載されるように、野生型（ＷＴ）５’－ＵＴＲ発現コンストラクト（配列番号６４）又は改変５’－ＵＴＲ発現コンストラクト（配列番号６５）のいずれかを構築し、試験した。ここで、各発現カセット（すなわち、配列番号６４又は配列番号６５）は、ＷＴ－５’－ＵＴＲ（配列番号６２）又はｍｏｄ－５’－ＵＴＲ（配列番号６３）のいずれかに作動可能に連結された、同じ５’ｃａｔＨ相同アーム（配列番号６６）、ｃａｔＨ遺伝子（配列番号６７）及びｓｐｏＶＧｒｒｎＩｐハイブリッドプロモーター（配列番号６８）を（５’－３’方向に）含んだ。さらに、５’－ＵＴＲは、ｌａｔシグナル配列をコードするＤＮＡ（配列番号６９）、続いて変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α－アミラーゼをコードするＤＮＡ（ＯＲＦ）（配列番号７０）に作動可能に連結された。変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα－アミラーゼをコードするＤＮＡ（ＯＲＦ）（配列番号７０）の３’側末端は、３’側ｃａｔＨ相同アーム（配列番号７２）に作動可能に連結されたｌａｔターミネーター（配列番号７１）に作動可能に連結された。

【0219】

Ｖ．分子生物学
上で一般的に述べたように、本開示の特定の実施形態は、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞に関する。より詳細には、本開示の特定の実施形態は、タンパク質産生能力、二次代謝産物産生能力などが増大したそのような改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞（例えば、タンパク質産生宿主細胞、細胞工場）を生成及び構築するための、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞、及びその方法に関する。

【0220】

より具体的には、本開示の特定の実施形態は、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の変異体を対象とする。本開示の特定の他の実施形態は、配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｆ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードする野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に関し、この改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする編集（改変）ｇｌｃＴ遺伝子を含む。特定の他の実施形態は、配列番号５５のアミノ酸６７位にフェニルアラニン（Ｆ）を含む（Ｆ６７）、配列番号５５からなる、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする導入ポリヌクレオチドを含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞に関する。他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、不活化（内因性）天然染色体ｇｌｃＴ遺伝子（すなわち、配列番号８２と少なくとも９５％の配列同一性を含み、配列番号５５のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む（Ｌ６７）ＧｌｃＴタンパク質をコードする）を含む。

【0221】

特定の他の実施形態では、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、発現する本開示の改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、配列番号８４と９０％の配列同一性を含むＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子の改変をさらに含む。他の実施形態では、本開示は、配列番号８３のＲｇｈＲ２タンパク質をコードするｒｇｈＲ２遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に由来する改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に関し、この改変細胞は、配列番号８４のＲｇｈＲ２タンパク質をコードする回復ｒｇｈＲ２遺伝子を含む。

【0222】

したがって、本開示の特定の実施形態は、本開示の親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の遺伝子を改変（変更）して、その改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞、より詳細には（非改変）親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、目的の内因性及び／又は異種タンパク質をより多く産生する改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を生成するための組成物及び方法を提供する。

【0223】

したがって、本開示の特定の実施形態は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を遺伝子改変する方法を対象とし、その改変は、（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子の下方制御、（ｆ）部位特異的変異誘発、及び／或いは（ｇ）ランダム変異誘発を含む。

【0224】

特定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、当該技術分野において周知である方法、例えば、挿入、破壊、置換又は欠失を使用して、上記に規定した遺伝子の発現を減少させる、又は排除することによって構築される。改変又は不活化対象の遺伝子部分は、例えば、コード領域、又はコード領域を発現させるために必要とされる調節エレメントであってよい。そのような調節配列又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分（すなわち、核酸配列の発現に十分に影響を及ぼす部分）であり得る。改変のための他の制御配列としては、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子などが挙げられるがこれらに限定されない。

【0225】

特定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、上述した本開示の遺伝子の少なくとも１つの発現を排除又は減少させる遺伝子欠失によって構築される。遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的又は完全な除去を可能にし、それによりそれらの発現を排除する、又は非機能的（若しくは活性が減少した）タンパク質産物を発現させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子をフランキングする５’及び３’領域を隣接して含有するために構築されているプラスミドを使用する相同組み換えによって遂行され得る。隣接する５’及び３’領域は、例えば、プラスミドが細胞内で樹立されることを可能にする許容温度で第２の選択可能マーカーと会合しているｐＥ１９４などの感温性プラスミドでバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内に導入され得る。細胞はその後、相同フランキング領域の１つで染色体内に組み込まれたプラスミドを有する細胞を選択するために非許容温度へシフトされる。プラスミドを組み込むための選択は、第２の選択可能マーカーの選択によって実施される。組み込み後、第２の相同フランキング領域での組み換え事象が、選択せずに細胞を数世代にわたり許容温度へシフトすることによって刺激される。細胞は、単一コロニーを得るためにプレーティングされ、コロニーは両方の選択可能マーカーの消失について試験される（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３を参照）。したがって、当業者は、完全又は部分的欠失に好適な遺伝子のコード配列及び／又は遺伝子の非コード配列中のヌクレオチド領域を容易に同定し得る。

【0226】

他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、それらの転写又は翻訳に必要な遺伝子又は調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドを導入するか、置換するか、又は除去することによって構築される。例えば、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームのフレームシフトを生じさせるように、ヌクレオチドを挿入又は除去し得る。そのような改変は、当該技術分野で知られる方法にしたがって、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ生成変異誘発によって行われ得る（例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔｌｅ，１９８５；Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９、及びＳａｒｋａｒ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０を参照）。したがって、特定の実施形態では、本開示の遺伝子は、完全又は部分的欠失によって不活化される。

【0227】

別の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子変換のプロセスによって構築される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ ａｎｄ Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照）。例えば、遺伝子変換法では、遺伝子に対応する核酸配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで変異させて欠陥のある核酸配列を生成し、次いで、この核酸配列を親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に形質転換して欠陥のある遺伝子を生成する。相同組み換えによって、欠陥のある核酸配列が内因性遺伝子に取って代わる。欠陥のある遺伝子又は遺伝子断片がまた、欠陥のある遺伝子を含有する形質転換体の選択に使用され得るマーカーをコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥のある遺伝子は、選択可能マーカーと会合している非複製プラスミド若しくは感温性プラスミドで導入され得る。プラスミドを組み込むための選択は、プラスミド複製を許容しない条件下でそのマーカーを選択することによって実施される。遺伝子置換をもたらす第２の組み換え事象の選択は、選択可能マーカーの消失及び変異遺伝子の獲得についてコロニーを調査することによって実施される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。或いは、欠陥のある核酸配列は、下に記載するように、遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換又は欠失を含有し得る。

【0228】

他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子の核酸配列と相補的なヌクレオチド配列を使用する確立されたアンチセンス技術によって構築される（Ｐａｒｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔｏｋｅｒ，１９９７）。より具体的には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞による遺伝子の発現は、この遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することにより低減（下方制御）又は排除することができ、それは細胞内で転写され得、細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。相補的アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズすることをできる条件下では、したがって、翻訳されるタンパク質の量は低減又は排除される。このようなアンチセンス法としては、以下に限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられ、これらの全てが当業者によく知られている。

【0229】

他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集によって作製／構築される。例えば、ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子を、ＤＮＡの標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）及びＣｐｆ１又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）のいずれかに結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって編集若しくは破壊（又は欠失若しくは下方制御）してもよい（ここで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる）。この標的化ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、遺伝子を破壊又は欠失させるための提供された編集テンプレートと再結合し得る。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（この目的のためには、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９）、又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これによりバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｃａｓ９発現カセットを生成する。同様に、目的の遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者により容易に同定される。例えば、目的遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡコンストラクトを構築するためには、可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）をコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’側である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組み合わせによって、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。したがって、ｇＲＮＡのためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現カセットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なプロモーター及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結させることによって作製される。

【0230】

特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列によって修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集テンプレートを利用できるように、ヌクレオチド編集テンプレートが提供される。例えば、標的化遺伝子の約５００ｂｐの５’側は、編集テンプレートを生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの３’側に融合させることができ、そのテンプレートは、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するためにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主の機構によって使用される。

【0231】

Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集テンプレートは、多数の様々な方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、天然コンピテンス又は誘導コンピテンス）を使用して糸状菌細胞に共送達することができる。形質転換細胞は、遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることによる、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅させることによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。次いで、これらの断片は、編集されたコロニーを同定するために、シーケンシングプライマーを使用して配列決定される。

【0232】

さらに他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、当該技術分野においてよく知られる方法、例えば、以下に限定されないが、化学的変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９７０を参照）及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３を参照）を使用して、ランダム変異誘発又は特異的変異誘発によって構築される。遺伝子の改変は、親細胞に変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が減少又は排除される変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。特異的であってもランダムであってもよい変異誘発は、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることによって実施され得る。さらに、変異誘発は、これらの変異誘発法を任意に組み合わせることにより実施され得る。

【0233】

本目的に好適な物理的又は化学的変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ－メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。このような薬剤を使用する場合、変異誘発は通常、好適な条件下、最適な変異誘発剤の存在下で、変異誘発対象の親細胞をインキュベートする工程、及び遺伝子の発現の減少を示すか、又は発現を示さない変異体細胞を選択する工程によって実施される。

【0234】

特定の他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、内因性遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、内在性遺伝子の破壊を含む。特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド破壊カセットは、マーカー遺伝子を含む。

【0235】

他の実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、下方制御された内因性遺伝子を含む。例えば、特定の実施形態では、上述した１つ以上の遺伝子を下方制御する工程は、その遺伝子の上流又は下流の調節エレメントを欠失又は破壊させる工程を含む。

【0236】

国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレットには、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の改変方法、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）をバイパスするためにＰＣＲ融合を使用するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失株及びＤＮＡコンストラクトの作製が開示されている。

【0237】

国際公開第２００２／１４４９０号パンフレットには、（１）組み込みプラスミド（ｐＣｏｍＫ）の構築及び形質転換、（２）コード配列、シグナル配列及びプロペプチド配列のランダム変異誘発、（３）相同組み換え、（４）形質転換ＤＮＡに非相同フランクを付加することにより形質転換効率を増大させること、（５）二重交差組み込みの最適化、（６）部位特異的変異誘発、及び（７）マーカーレス欠失を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の改変方法が開示されている。

【0238】

当業者は、細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）にポリヌクレオチド配列を導入するために好適な方法をよく知っている（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９６７；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，１９８５；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ．ａｌ．，１９８１及びＭｃＤｏｎａｌｄ，１９８４）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合、形質導入、並びにプロトプラスト融合を含む形質転換などの方法が知られており、本開示における使用に適している。形質転換法は、本開示のＤＮＡコンストラクトを宿主細胞に導入するのに特に好ましい。

【0239】

一般に使用されている方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞を直接、形質転換する（すなわち、宿主細胞内に導入する前に、ＤＮＡコンストラクトを増幅させるために、又はさもなければプロセシングするために、中間細胞を使用しない）。ＤＮＡコンストラクトの宿主細胞内への導入には、プラスミド又はベクター内へ挿入することなくＤＮＡを宿主細胞内に導入するために当該技術分野において知られている物理的及び化学的方法が含まれる。このような方法としては、塩化カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、裸ＤＮＡ、リポソームなどが挙げられるが、これらに限定されない。追加の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、プラスミドに挿入することなく、プラスミドと共に同時形質転換される。さらなる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において知られる方法によって改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株から欠失されるか、又は実質的に切除される（例えば、Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４及びＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。いくつかの実施形態では、宿主染色体由来のベクターの分解は、染色体内のフランキング領域を残すが、一方、固有の染色体領域を除去する。

【0240】

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での遺伝子、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又はその変異配列の発現に使用するプロモーター及びプロモーター配列領域は、当業者に一般に知られている。本開示の本開示のプロモーター配列は、一般に、それらがバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞など）内で機能的であるように選択される。特定の例示的なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーター配列を、表６に示す。同様に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞内での遺伝子発現を駆動するために有用なプロモーターとしては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）プロモーター（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα－アミラーゼプロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα－アミラーゼプロモーター（Ｔａｒｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）プロモーター（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、変異ａｐｒＥプロモーター（国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット）、又はＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）若しくは他の関連バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の任意の他のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の他の実施形態では、プロモーターは、米国特許出願公開第２０１４／０３２９３０９号明細書に開示されたリボソームタンパク質プロモーター又はリボソームＲＮＡプロモーター（例えば、ｒｒｎＩプロモーター）である。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において広範囲の活性（プロモーター強度）を有するプロモーターライブラリーをスクリーニング及び作製する方法は、国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレットに記載されている。

【0241】

ＶＩ．目的タンパク質の産生ためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞の培養
他の実施形態では、本開示は、非改変（親）細胞と比較して（すなわち、それに対して）改変細菌細胞のタンパク質生産性を増加させる方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、改変細菌細胞を発酵させる／培養する工程を含む目的タンパク質（ＰＯＩ）の産生方法を対象とし、この改変細胞は、ＰＯＩを培養培地中に分泌する。本開示の改変及び未改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を発酵させるために、当該技術分野でよく知られた発酵方法を適用することができる。

【0242】

いくつかの実施形態では、細胞は、バッチ又は連続発酵条件下で培養される。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵中には変更されない閉鎖系である。発酵の開始時に、培地には所望の生物が接種される。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく醗酵を行うことができる。一般には、バッチ発酵は炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子を制御することが頻繁に行われる。バッチシステムの代謝産物及びバイオマス組成は、発酵が停止されるときまで絶えず変化する。一般的なバッチ培養では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が減少又は停止する静止期に進み得る。処理しない場合、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞は、生成物の大部分の産生を担っている。

【0243】

標準的なバッチシステムの好適なバリエーションは、「フェドバッチ発酵」システムである。一般的なバッチシステムのこのバリエーションでは、発酵が進行するにつれて基質が少しずつ添加される。フェドバッチシステムは、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、及び培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステムでは、実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、知られている。

【0244】

連続発酵は、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、培養物を一定の高密度に維持し、細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響する１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源などの制限栄養素は一定比率で維持され、他の全てのパラメータは調節することができる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化させることができる。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵プロセスで栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の技術分野においてはよく知られている。

【0245】

したがって、特定の実施形態では、形質転換（改変）宿主細胞によって産生されたＰＯＩは、従来の手順、例えば、宿主細胞を培地から遠心分離若しくは濾過によって分離する、又は必要であれば、細胞を破壊し、上清を細胞破砕物及び細胞片から取り除くことによって、培養培地から回収することができる。一般的には、清浄化後、上清又は濾液のタンパク質成分を、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって沈澱させる。次いで、沈澱したタンパク質を可溶化させ、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過などの様々なクロマトグラフィー法により精製してもよい。

【0246】

ＶＩＩ．改変（宿主）細胞により産生される目的タンパク質
本開示の目的タンパク質（ＰＯＩ）は、内因性タンパク質であっても異種タンパク質であってもよく、そのようなＰＯＩの変異体であってもよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得るか、又はその機能的形態が単量体又は多量体であるタンパク質であり、すなわち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同）又は同一でない（異種）サブユニットから構成され、このＰＯＩ又はその変異ＰＯＩは、好ましくは目的の特性を有するものである。

【0247】

例えば、以下の実施例に記載されるように、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、目的の内因性及び／又は異種タンパク質をより多く産生する。したがって、特定の実施形態では、本開示の改変細胞は、内因性ＰＯＩ、異種ＰＯＩ、又はそのようなＰＯＩの１つ以上の組み合わせを発現する。例えば、特定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞は、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、より多くの内因性ＰＯＩを産生する。他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞は、親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、より多くの異種ＰＯＩを産生する。

【0248】

したがって、特定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞は親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（対照）細胞と比較してより多くのＰＯＩを産生し、そのＰＯＩの増加量は、少なくとも約０．０１％の増加、少なくとも約０．１０％の増加、少なくとも約０．５０％の増加、少なくとも約１．０％の増加、少なくとも約２．０％の増加、少なくとも約３．０％の増加、少なくとも約４．０％の増加、少なくとも約５．０％の増加、又は５．０％を超える増加である。特定の実施形態では、ＰＯＩの増加量は、酵素活性を試験することによって、及び／又はその比生産性（Ｑｐ）を試験／定量することによって決定される。同様に、当業者は、目的の１種以上の目的タンパク質の発現又は産生を検出、試験、測定するなどのために、当該技術分野で知られる他の定型の方法及び技術を利用し得る。

【0249】

特定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、（非改変）親バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、ＰＯＩの比生産性（Ｑｐ）の増加を示す。例えば、比生産性（Ｑｐ）の検出は、タンパク質の産生を評価するために好適な方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式によって決定できる：
「Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ」
（式中、「ｇＰ」は、タンク中で産生されるタンパク質のグラムであり；「ｇＤＣＷ」は、タンク中の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラムであり、「ｈｒ」は、接種時点からの発酵時間であり、これには、産生時間及び増殖時間が含まれる）。

【0250】

したがって、特定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、未改変（親）細胞と比較して、少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の比生産性（Ｑｐ）の増加を含む。

【0251】

特定の実施形態では、ＰＯＩ又はその変異ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ－ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0252】

したがって、特定の実施形態では、ＰＯＩ又はその変異ＰＯＩは、酵素番号（ＥＣ）のＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５又はＥＣ６から選択される酵素である。

【0253】

例えば、特定の実施形態では、ＰＯＩは、酸化還元酵素、例えば、以下に限定されないが、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ－アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ－乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１－脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸１３Ｓ－リポキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前のＥＣ１．１．９９．１０、例えば、グルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．１．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．１．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１（酸化還元酵素）酵素である。

【0254】

特定の実施形態では、ＰＯＩは、トランスフェラーゼ酵素、例えば、以下に限定されないが、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．１．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテルナスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｓｕｃｒａｓｅ）、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４－アルファ－グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４－アルファ－グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２－ベータ－オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２－アルファ－Ｌ－フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前のＥＣ３．１．４．１５、例えば、［グルタミンシンテターゼ］－アデニリル－Ｌ－チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、アルファ－グルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素である。

【0255】

他の実施形態では、ＰＯＩは、ヒドロラーゼ酵素、例えば、以下に限定されないが、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロール－エステルアシルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸加水分解酵素）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セルチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３－フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピル－フルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴ－１，６－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド－１，６－アルファ－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、アルファ－１，６－グルカン－６－グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランアルファ－１，２－グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ－アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、アルファ－グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン特異的エンド－ベータ－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン特異的エキソ－ベータ－１，４－グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド－１，６－ベータ－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、ベータ－アミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、アルファ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、アルファ－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、ベータ－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、ベータ－フルクトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４－ベータ－キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド－１，３－ベータ－Ｄ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、アルファ－Ｌ－ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、ベータ－Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、アルファ－Ｎ－アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３－ベータ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド－１，３－アルファ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４－アルファ－ガラクツロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１－ベータ－Ｄ－フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４－β－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド－１，６－ベータ－グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２－（１，３）－アルファ－マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンベータ－フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソ－ポリ－アルファ－ガラクツロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、カッパ－カラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド－１，４－ベータ－ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４－ベータ－セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル－グリコプロテインエンド－ベータ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド－１，５－アルファ－Ｌ－アラビナナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジル－ペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリン型カルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミル－ペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、テルモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカイン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、ステムブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、フルーツブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ムコールペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリクシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、ドイテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ－アシル－脂肪族－Ｌ－アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ－アセチルムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、タンパク質－Ｌ－グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド－Ｎ（４）－（Ｎ－アセチル－ベータ－グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ－アシル－Ｄ－アミノ酸デアシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例えば、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素である。

【0256】

他の実施形態では、ＰＯＩは、リアーゼ酵素、例えば、以下に限定されないが、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．－（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素である。

【0257】

特定の他の実施形態では、ＰＯＩは、イソメラーゼ酵素、例えば、以下に限定されないが、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１－エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１→４）－α－Ｄ－グルカン１－α－Ｄ－グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素である。

【0258】

さらに他の実施形態では、ＰＯＩは、リガーゼ酵素、例えば、以下に限定されないが、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４－クマリン酸塩：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ－アミノ酸アルファ－リガーゼ）９から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素である。

【0259】

したがって、特定の実施形態では、工業用プロテアーゼを産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、特に好ましい発現宿主を提供する。同様に、特定の他の実施形態では、工業用アミラーゼを産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、特に好ましい発現宿主を提供する。

【0260】

例えば、典型的にはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種によって分泌されるプロテアーゼには、２つの一般型、すなわち、中性（又は「金属プロテアーゼ」）及びアルカリ性（又は「セリン」）プロテアーゼがある。例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）サブチリシンタンパク質（酵素）は、本開示において使用される典型的なセリンプロテアーゼである。多種多様なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）サブチリシン、例えば、サブチリシン１６８、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン１４７及びサブチリシン３０９が同定及び配列決定されている（例えば、国際公開第１９８９／０６２７９号パンフレット及びＳｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。本開示のいくつかの実施形態では、改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、変異（ｍｕｔａｎｔ）（すなわち、変異（ｖａｒｉａｎｔ））プロテアーゼを産生する。数多くの参考文献、例えば、国際公開第１９９９／２０７７０号パンフレット；同第１９９９／２０７２６号パンフレット；同第１９９９／２０７６９号パンフレット；同第１９８９／０６２７９号パンフレット；米国再発行特許第３４，６０６号明細書；米国特許第４，９１４，０３１号明細書；同第４，９８０，２８８号明細書；同第５，２０８，１５８号明細書；同第５，３１０，６７５号明細書；同第５，３３６，６１１号明細書；同第５，３９９，２８３号明細書；同第５，４４１，８８２号明細書；同第５，４８２，８４９号明細書；同第５，６３１，２１７号明細書；同第５，６６５，５８７号明細書；同第５，７００，６７６号明細書；同第５，７４１，６９４号明細書；同第５，８５８，７５７号明細書；同第５，８８０，０８０号明細書；同第６，１９７，５６７号明細書及び同第６，２１８，１６５号明細書が、変異プロテアーゼの例を提供している。したがって、特定の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、プロテアーゼをコードする発現コンストラクトを含む。

【0261】

特定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、アミラーゼをコードする発現コンストラクトを含む。多種多様なアミラーゼ酵素及びその変異体が、当業者に知られている。例えば、国際公開第２００６／０３７４８４号パンフレット及び同第２００６／０３７４８３号パンフレットは、溶媒安定性が改善された変異α－アミラーゼを記載しており、国際公開第１９９４／１８３１４号パンフレットは、酸化的に安定なα－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第１９９９／１９４６７号パンフレット、同第２０００／２９５６０号パンフレット及び同第２０００／６００５９号パンフレットは、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第２００８／１１２４５９号パンフレットは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種７０７番に由来するα－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第１９９９／４３７９４号パンフレットは、マルトジェニックα－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第１９９０／１１３５２号パンフレットは、超耐熱性α－アミラーゼ変異体を開示しており、国際公開第２００６／０８９１０７号パンフレットは、粒状デンプン加水分解活性を有するα－アミラーゼ変異体を開示している。

【0262】

他の実施形態では、本開示の改変細胞内で発現し産生されるＰＯＩ又は変異ＰＯＩは、ペプチド、ペプチドホルモン、増殖因子、凝固因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子、微生物抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原、ＨＰＶ Ｅ７など）、それらの変異体、それらの断片などである。他のタイプの目的タンパク質（又はその変異体）は、食品又は作物に栄養価を提供することのできるタンパク質であり得る。非限定的な例としては、抗栄養因子の形成を阻害できる植物タンパク質、及びより望ましいアミノ酸組成（例えば、非トランスジェニック植物より高いリジン含量）を有する植物タンパク質が挙げられる。

【0263】

細胞内及び細胞外で発現したタンパク質の活性を検出及び測定するための当業者に知られる様々なアッセイがある。特に、プロテアーゼについては、２８０ｎｍでの吸光度として測定される、又はフォリン法を使用して比色定量により測定されるカゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイがある（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。他のアッセイには、発色性基質の可溶化が包含される（例えば、Ｗａｒｄ，１９８３を参照）。他の典型的なアッセイとしては、スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－パラ－ニトロアニリドアッセイ（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）及び２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当業者に知られる多数の追加の文献が、好適な方法を提供する（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８３；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４及びＨｓｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照）。

【0264】

国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットは、本明細書に記載されるアミラーゼ活性に有用なセラルファα－アミラーゼ活性アッセイを開示している。

【0265】

宿主細胞中の目的タンパク質の分泌レベルを決定し、発現したタンパク質を検出するための手段としては、タンパク質に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを用いるイムノアッセイの使用が挙げられる。その例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。

【実施例】

【0266】

本発明の特定の態様は、以下の実施例に照らせばさらに理解することができるが、それらの実施例は限定するものと解釈すべきでない。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。

【0267】

実施例１
変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む変異バチルス・リケニフォルミス（ＢＡＣＩＬＬＵＳ ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）娘細胞
上記の発明を実施するための形態において簡潔に記載したように、本開示の出願人は、定型的なＮＴＧ（Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン）変異誘発を実施してＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）変異体（すなわち、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）娘細胞）のプールを作製し、続いて、このＮＴＧ改変娘細胞をスクリーニングして、目的の工業関連タンパク質（例えば、アミラーゼ、プロテアーゼなど）の産生を増加させ得るＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）娘細胞を同定した。より具体的には、定型的なセラルファα－アミラーゼアッセイによって、本出願人は変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子（すなわち、アレルｇｌｃＴ１；配列番号５６）中にＳＮＰを含む変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を同定した。この変異Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は野生型ＧｌｃＴタンパク質をコードする遺伝子を含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と比較して、異種アミラーゼタンパク質をより多く産生することができた（例えば、以下の実施例８を参照）（ここで、変異細胞及び親細胞は同一の条件下で培養される）。以下の実施例８でさらに記載するセラルファα－アミラーゼアッセイは一般に、所定の条件下で、全培養ブロスを基質混合物と共にインキュベートすることを含み、この反応は塩基溶液の添加によって終了（し、且つ発色）する（例えば、国際公開第２０１４／１６４７７７号パンフレットに記載されるように）。

【0268】

したがって、上記の発明を実施するための形態において一般的に記載したように、野生型Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｇｌｃＴ遺伝子は、配列番号８２の野生型ＧｌｃＴタンパク質（配列番号８２のアミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）を含む）をコードし、この野生型ＧｌｃＴタンパク質は転写抗ターミネータータンパク質である（例えば、Ｓｃｈｍａｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍａｎｉｖａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｓｔｕｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｐｏｓｔｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｓｔｕｌｋｅ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎ，２０００；Ｐｌｕｍｂｒｉｄｇｅ，２００２；Ｓｔｕｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７及びＬａｎｇｂｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照）。変異ｇｌｃＴ遺伝子（すなわち、アレルｇｌｃＴ１；配列番号５６）は、アミノ酸６７位にロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）へのアミノ酸置換を含む、配列番号５５の変異ＧｌｃＴタンパク質（Ｆ６７；配列番号５５；例えば、図１Ａ及び図１Ｂを参照）をコードする。

【0269】

実施例２
ｇｌｃＴ Ｃａｓ９ターゲティングベクターの構築
Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ；「ＡＰＫＫＫＲＫＶ」；配列番号２）、Ｃ末端ＮＬＳ（「ＫＫＫＫＬＫ」；配列番号３）及びデカ－ヒスチジンタグ（「ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ」；配列番号４）を含むＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド（配列番号１）を、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥプロモーター（配列番号５）に作動可能に連結し、製造業者の使用説明書にしたがってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、以下の表２に示すフォワード（配列番号６）及びリバース（配列番号７）プライマー対を用いて増幅した。

【表2】

【0270】

プラスミドｐＫＢ３２０（配列番号９）の骨格（配列番号８）を、製造業者の使用説明書にしたがってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、以下の表３に示すフォワード（配列番号１０）及びリバース（配列番号１１）プライマー対を用いて増幅した。

【表3】

【0271】

ＰＣＲ産物を、Ｚｙｍｏ ｃｌｅａｎ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ５カラムを製造業者の使用説明書にしたがって使用して精製した。続いて、２つの断片を等モル比で混合するＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて、長時間オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＰＯＥ－ＰＣＲ）により、ＰＣＲ産物を組み立てた。以下のＰＯＥ－ＰＣＲ反応サイクルを実行した：９８℃で５秒間、６４℃で１０秒間、７２℃で４分１５秒間を３０サイクル。５μｌのＰＯＥ－ＰＣＲ（ＤＮＡ）を、製造業者の説明書にしたがってＴｏｐ１０ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含有し、１．５％寒天で固化させた溶原（Ｌ）培地（Ｍｉｌｌｅｒ処方；１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％酵母抽出物（ｗ／ｖ）、１％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ））で選択した。コロニーを３７℃で１８時間増殖させた。コロニーを採取し、Ｑｉａｐｒｅｐ ＤＮＡミニプレップキットを製造業者の説明書にしたがって使用してプラスミドＤＮＡを調製し、５５μｌのｄｄＨ２Ｏ中に溶出した。このプラスミドＤＮＡについてサンガーシーケンシングを行い、以下の表４に示すシーケンシングプライマー（配列番号１２～２０）を使用して、正しい組み立てを確認した。

【表4】

【0272】

正しく組み立てたプラスミドｐＲＦ６９４（配列番号２１）を使用して、Ｌ６７Ｆ ｇｌｃＴ変異を導入するためのプラスミドを組み立てた。より詳細には、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｇｌｃＴ遺伝子（配列番号２２）はＬ６７コドンを覆うＣａｓ９標的部位（配列番号２３）を含む。標的部位は、ＰＡＭ配列（配列番号２５）を除去することによって、可変標的化（ＶＴ）ドメイン（配列番号２４）をコードするＤＮＡ配列に変換され得る。ＶＴドメイン（配列番号２４）をコードするＤＮＡ配列は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによって転写された場合に機能性ｇＲＮＡ（配列番号２７）を産生するように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ；配列番号２６）をコードするＤＮＡ配列に作動可能に融合され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号２８）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞において作動可能なプロモーター（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｒｒｎＩｐ２プロモーター；配列番号２９）、及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種細胞において作動可能なターミネーター（例えば、ラムダファージのｔ０ターミネーター；配列番号３０）に作動可能に連結され得、その結果、プロモーターはｇＲＮＡをコードするＤＮＡの５’側に位置し、ターミネーターはｇＲＮＡをコードするＤＮＡの３’側に位置し、ｇＲＮＡ発現カセット（配列番号３１）が作製される。

【0273】

ｇｌｃＴにおけるＬ６７Ｆ変異を作製するための編集テンプレートは、２つの断片を作製することによってＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から増幅することができる。最初に、ｇｌｃＴのコドン６７の第１の位置の上流（５’）５００ｂｐ（配列番号３２）を、製造業者の使用説明書にしたがってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに以下の表５に記載のフォワード（配列番号３３）及びリバース（配列番号３４）プライマー対を使用して増幅した。この場合のリバースプライマーは、コドン６７をロイシンからフェニルアラニンへ変換させる、コドン６７の第１の位置に対するＣＴＣからＴＴＣへの変化を含む。

【表5】

【0274】

ｇｌｃＴのコドン６７の第１の位置の下流（３’）５００ｂｐを含有する第２の断片（配列番号３５）を、製造業者の使用説明書にしたがってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ、並びに以下の表６に記載のフォワード（配列番号３６）及びリバース（配列番号３７）プライマー対を使用して、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｇＤＮＡから増幅した。

【表6】

【0275】

ｇＲＮＡ発現カセット及び２つの相同アームを含むＤＮＡ断片を、標準的な分子生物学技術を使用してｐＲＦ６９４に組み立て、プラスミドｐＲＦ７３１（配列番号３８）を生成し、Ｃａｓ９発現カセット、ｇｌｃＴを標的とするｇＲＮＡをコードするｇＲＮＡ発現カセット、及びｇｌｃＴ遺伝子にＬ６７Ｆ突然変異を作製し、ｇｌｃＴｔｓ１を除去し、標的部位のＣａｓ９媒介切断を緩和する１００１ｂｐ ｇｌｃＴ編集テンプレートを含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）シャトルプラスミドを生成する。

【0276】

実施例３
ｇｌｃＴＬ６７Ｆ変異を含むバチルス・リケニフォルミス（ＢＡＣＩＬＬＵＳ ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）細胞の生成
本実施例では、上記のｐＲＦ７３１プラスミド（配列番号３８）を、製造業者の説明書にしたがってローリングサークル増幅（Ｓｙｇｎｉｓ）を用いて１８時間増幅した。ローリングサークル増幅したｐＲＦ７３１（配列番号３８）を、国際公開ＰＣＴ第２０１７／０７５１９５号パンフレット、同第２００２／１４４９０号パンフレット、及び同第２００８／７９８９号パンフレットに一般的に記載されているように、ｐＢＬ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号５０）を含む（保有する）コンピテント（親）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に形質転換した。細胞／ＤＮＡ形質転換混合物を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有し、１．５％の寒天で固化させたＬ培地（Ｍｉｌｌｅｒ処方）にプレーティングした。３７℃でコロニーを形成させた。カナマイシンを含有するＬ寒天プレート上で増殖したコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬ寒天プレート上にストリークして、ｐＢＬ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号５０）を選択した。ｇｌｃＴ遺伝子座（配列番号５１）を、Ｑ５（ＮＥＢ）ＤＮＡポリメラーゼ及び標準的なＰＣＲ反応を用い、以下の表７に記載のリバース（配列番号５２）及びフォワード（配列番号５３）プライマー対を用いて形質転換細胞から増幅した。

【表7】

【0277】

以下の工程によりコロニーＰＣＲを行った：（１）９８℃で３分間、（２）９８℃で５秒間、（３）６３℃で１０秒間、（４）７２℃で３０秒間、及び（５）工程２～４を２９回繰り返し、７２℃で３分間。ＰＣＲが首尾よく行われたなら、ｇｌｃＴ遺伝子座から１，０６９ｂｐポリヌクレオチド（配列番号５０）を増幅する。２μｌのＰＣＲを、５μｌのＥｘｏ－ＳＡＰ－ＩＴと混合することによって精製し、３７℃で１５分間、続いて８０℃で１５分間インキュベートした。精製したＰＣＲ反応物を４０μｌのｄｄＨ２Ｏで希釈し、フォワードプライマー「ＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣ」（配列番号５４）でサンガーシーケンシングを行った。

【0278】

シーケンスデータをＷＴ ｇｌｃＴ遺伝子座（配列番号５１）と比較するシーケンスアラインメントにより、回収したコロニーのいくつかが、ＧｌｃＴタンパク質においてＬ６７Ｆ変異を引き起こす所望のゲノム編集（配列番号５５）を含むことがわかった。Ｌ６７Ｆ ＧｌｃＴタンパク質（配列番号５５）をコードするｇｌｃＴ遺伝子（配列番号５６）（現在、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンに対して依然として耐性であるアレルｇｌｃＴ１（ｐＢＬ．ｃｏｍＫを含む）と命名されている）を含有するコロニーを、ＢＦ６３株（ｇｌｃＴ１ ｐＢＬ．ｃｏｍＫ）として保存した。

【0279】

実施例４
ｒｇｈＲ２ Ｃａｓ９ターゲティングベクターの構築
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｒｇｈＲ２遺伝子（配列番号４１）のコドン２４～２９の重複（配列番号４０）を標的とするプラスミドｐＲＦ７２４（配列番号３９）を、製造業者の説明書にしたがってＱ５を用い、且つ表８に記載のフォワード（配列番号４３）及びリバース（配列番号４４）プライマー対を用いて、プラスミドｐＲＦ６９４から８．３ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号４２）を増幅することによって作製した。

【表8】

【0280】

ｒｇｈＲ２編集テンプレート（配列番号４６）を含有する合成ＤＮＡ断片（配列番号４５）、ｒｒｎＩｐ２－ｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４７）を、ＩＤＴから発注し、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ及び標準ＰＣＲ技術を用い、表９に示すフォワード（配列番号４８）及びリバース（配列番号４９）プライマー対を用いて増幅した。

【表9】

【0281】

編集テンプレートｇＲＮＡ発現カセット断片（配列番号４７）は、ｐＲＦ６９４（配列番号４２）から増幅された断片に対して５’及び３’相同を含んでいた。２つの部分を長時間オーバーラップエクステンションＰＣＲを用いて組み立て、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。配列が確認された単離物をプラスミドｐＲＦ７２４（配列番号３９）として保存した。

【0282】

実施例５
ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔアレルを含むバチルス・リケニフォルミス（ＢＡＣＩＬＬＵＳ ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）細胞の生成
プラスミドｐＲＦ７２４（配列番号３９）を、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｓｙｇｎｉｓ）を用い、製造業者の説明書にしたがって１８時間増幅した。ローリングサークル増幅したｐＲＦ７２４（配列番号３９）を、国際公開ＰＣＴ第２０１７／０７５１９５号パンフレット、同第２００２／１４４９０号パンフレット、及び同第２００８／７９８９号パンフレットに一般的に記載されているように、ｐＢＬ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号５０）を含む（保有する）コンピテント（親）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に形質転換した。細胞／ＤＮＡ形質転換混合物を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有し、１．５％（ｗ／ｖ）の寒天で固化させたＬ培地（ｍｉｌｌｅｒ）にプレーティングした。３７℃でコロニーを形成させた。

【0283】

カナマイシンを含有するＬ寒天上で増殖したコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する寒天プレート上にストリークして、プラスミドｐＢＬ．ｃｏｍＫ（配列番号５０）を選択した。ｒｇｈＲ２遺伝子座（配列番号５７）を、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）及び標準的なＰＣＲ反応を用い、表１０に記載のフォワード（配列番号５８）及びリバース（配列番号５９）プライマー対を用いて形質転換体から増幅した。

【表10】

【0284】

ＰＣＲサイクルを実施例４に記載のように実施し、ＰＣＲ反応によりｒｇｈＲ２遺伝子座（配列番号５７）を増幅させた。ＰＣＲ産物を実施例４に記載のように精製し、表１１に記載のシーケンシングプライマー（配列番号６０）を用いてサンガー法により配列を決定した。

【表11】

【0285】

データを親ｒｇｈＲ２遺伝子座（配列番号５７）と比較するシーケンスアラインメントにより、回収したコロニーの大部分がコドン２４～２９のタンデム重複（配列番号４０）の欠失を含むｒｇｈＲ２ｒｅｓｔアレル（配列番号６１）を含むことがわかった。１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンに対して依然として耐性であるｒｇｈＲ２ｒｅｓｔアレル（ｐＢＬ．ｃｏｍＫを含む）を含有するコロニーを、ＢＦ６２株（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔｐＢＬ．ｃｏｍＫ）として保存した。

【0286】

実施例６
ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔアレル及びｇｌｃＴ１アレルを含むＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）細胞の生成
プラスミドｐＲＦ７２４（配列番号３９）を、ＲＣＡ（Ｓｙｇｎｉｓ）を用い、製造業者の説明書にしたがって１８時間増幅した。ローリングサークル増幅されたｐＲＦ７２４（配列番号３９）を、ｐＢＬ．ｃｏｍＫ（配列番号５０）プラスミドを含む（保有する）コンピテントＢＦ６３（ｇｌｃＴ１）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞（実施例３を参照）に形質転換した。細胞／ＤＮＡ形質転換混合物を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有し、１．５％（ｗ／ｖ）の寒天で固化させたＬ培地（ｍｉｌｌｅｒ）にプレーティングした。３７℃でコロニーを形成させた。

【0287】

カナマイシンを含有するＬ寒天上で増殖したコロニーを採取し、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有する寒天プレート上にストリークした。ｒｇｈＲ２遺伝子座（配列番号５７）を、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）及び標準的なＰＣＲ反応を用い、以下の表１２に記載のフォワード（配列番号５８）及びリバース（配列番号５９）プライマー対を用いて形質転換体から増幅した。

【表12】

【0288】

ＰＣＲサイクルを実施例４に記載のように実施し、ＰＣＲ反応によりｒｇｈＲ２遺伝子座（配列番号５７）を増幅させた。ＰＣＲ産物を実施例４に記載のように精製し、表１３に記載のシーケンシングプライマー（配列番号６０）を用いてサンガー法により配列を決定した。

【表13】

【0289】

データを親ｒｇｈＲ２遺伝子座（配列番号５７）と比較するシーケンスアラインメントにより、回収したコロニーの大部分がコドン２４～２９のタンデム重複（配列番号４０）の欠失を含むｒｇｈＲ２ｒｅｓｔアレル（配列番号６１）を含むことがわかった。１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンに対して依然として耐性であるｒｇｈＲ２ｒｅｓｔアレル（配列番号６１）（ｐＢＬ．ｃｏｍＫを含む）を含有するコロニーを、ＢＦ１６９株（宿主ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔｇｌｃＴ１ ｐＢＬ．ｃｏｍＫ）として保存した。

【0290】

実施例７
異種アミラーゼ発現カセットの親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）細胞ＢＦ６２、ＢＦ６３及びＢＦ１６９への挿入
本実施例では、出願人は、異種α－アミラーゼ発現カセットを、親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞ＢＦ６２、ＢＦ６３及びＢＦ１６９に導入した。より具体的には、以下に記載のα－アミラーゼ発現カセットを、親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞ＢＦ６３、ＢＦ６２及びＢＦ１６９に導入し、以下の表１４に示すように、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞「ＢＦ６３」は導入されたアレル「ｇｌｃＴ１」（すなわち、変異ＧｌｃＴタンパク質をコードする）を含み、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞「ＢＦ６２」は回復ｒｇｈｒ２遺伝子（ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ）を含み、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞「ＢＦ１６９」は導入されたアレルｇｌｃＴ１及び回復（ｒｇｈｒ２ｒｅｓｔ）遺伝子の両方を含む。

【表14】

【0291】

より詳細には、異種α－アミラーゼ発現カセットに関して、本出願人は、野生型Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（ＷＴ－５’－ＵＴＲ；配列番号６２）又は改変５’－ＵＴＲ（ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ；配列番号６３）を含むα－アミラーゼ発現カセットを作製することによって、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における目的タンパク質をコードする遺伝子の発現に対する改変５’非翻訳領域（ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）配列の効果をさらに試験した。したがって、本実施例では、様々な（改変）５’－ＵＴＲコンストラクトの評価のためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の作製、並びにそのような改変５’－ＵＴＲコンストラクトが上流（５’）プロモーター及び目的タンパク質をコードする下流（３’）オープンリーディングフレームに作動可能に連結されているときの目的タンパク質の産生に与えるそれらの影響／作用を記載する。

【0292】

したがって、本実施例では、キシロース誘導性ｃｏｍＫ発現カセット（配列番号５０）を運ぶプラスミドを含む親Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞と、改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞のＢＦ６２、ＢＦ６３及びＢＦ１６９（表１４）を、１２５ｍｌのバッフル付きフラスコ内の１００μｇ／ｍｌの二塩酸スペクチノマイシンを含有する１５ｍｌのＬ培地（１％（ｗ／ｖ）のトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物、１％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ）中、３７℃及び２５０ＲＰＭで終夜増殖させた。終夜培養物を、２５０ｍｌのバッフル付きフラスコ内の１００μｇ／ｍｌの二塩酸スペクチノマイシンを含有する２５ｍｌの新鮮なＬ培地で０．７（ＯＤ６００単位）に希釈した。細胞を３７℃（２５０ＲＰＭ）で１時間増殖させた。Ｄ－キシロースを、５０％（ｗ／ｖ）のストックからの０．１％（ｗ／ｖ）に加えた。細胞を３７℃（２５０ＲＰＭ）でさらに４時間増殖させ、７分間にわたり１７００×ｇでペレット化した。

【0293】

細胞を、使用済み培地を使用して元の培養の４分の１量に再懸濁させた。１００μｌの濃縮細胞を、約１μｇの野生型（ＷＴ）５’－ＵＴＲ発現コンストラクト（ＷＴ－５’－ＵＴＲ；配列番号６４）又は改変５’－ＵＴＲ発現コンストラクト（ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ；配列番号６５）のいずれかと混合した。例えば、各発現カセットは、野生型Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ ５’－ＵＴＲ（配列番号６２）又は修飾ａｐｒＥ５’－ＵＴＲ（配列番号６３）に作動可能に連結された、同じ５’ｃａｔＨ相同アーム（配列番号６６）、ｃａｔＨ遺伝子（配列番号６７）及びｓｐｏＶＧｒｒｎＩｐハイブリッドプロモーター（配列番号６８）を（５’から３’方向に）含んだ。さらに、５’－ＵＴＲは、ｌａｔシグナル配列をコードするＤＮＡ（配列番号６９）、続いて変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α－アミラーゼをコードするＤＮＡ（ＯＲＦ）（配列番号７０）に作動可能に連結された。変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα－アミラーゼをコードするＤＮＡ（ＯＲＦ）（配列番号７０）の３’側末端は、３’側ｃａｔＨ相同アーム（配列番号７２）に作動可能に連結されたｌａｔターミネーター（配列番号７１）に作動可能に連結された。形質転換反応物を、３７℃、１０００ＲＰＭで、約９０分間インキュベートした。

【0294】

１．５％（ｗ／ｖ）寒天で固化した１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬ培地を充填したペトリ皿に形質転換混合物をプレーティングした。プレートを３７℃で２日間にわたりインキュベートした。１．５％（ｗ／ｖ）寒天で固化した１％（ｗ／ｖ）の不溶性コーンスターチを含有するＬ培地を充填したペトリ皿上でコロニーをストリーク精製した。コロニーが形成されるまでプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。ハローを形成しているコロニーを取り囲んでいる不溶性デンプンが除去されることによってデンプンの加水分解が示され、これを使用して変異Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のα－アミラーゼタンパク質（配列番号７３）を発現する形質転換体を選択した。コロニーＰＣＲを用いて、標準的な技術と、表１５に記載のフォワード（配列番号７６）及びリバース（配列番号７７）プライマー対とを用いてハロー生成コロニーからｃａｔＨ遺伝子座（ＷＴコンストラクト、配列番号７４；改変コンストラクト、配列番号７５）を増幅した。

【表15】

【0295】

ＰＣＲ産物を、標準的な技術を使用して過剰のプライマー及びヌクレオチドから精製し、サンガー法及び表１６に記載のシーケンシングプライマーを使用して配列を決定した。

【表16】

【0296】

ＷＴ－５’－ＵＴＲ発現カセット（配列番号６４）を含む配列確認済のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞、又は改変５’－ＵＴＲ（ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ）発現カセット（配列番号６５）を含む配列確認済のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を、表１７に示すように保存した。

【表17】

【0297】

実施例８
改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ＬＩＣＨＥＮＩＦＯＲＭＩＳ）細胞におけるアミラーゼ酵素の産生
本実施例では、変異ＧｌｃＴタンパク質（すなわち、Ｌ６７Ｆ置換）をコードする（変異）アレルｇｌｃＴ１（ＳＮＰ Ｃ１９９Ｔ）を含む改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞、及び野生型（親）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞を、１％不溶性デンプンを補充したルリア寒天プレート上にストリークした。より詳細には、表１８に示す親及び改変Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（娘）細胞を、上記の実施例７、表１７に記載のアミラーゼコンストラクト（すなわち、ＷＴ－５’－ＵＴＲ発現カセット 配列番号６４、又はｍｏｄ－５’－ＵＴＲ発現カセット 配列番号６５）で形質転換し、試験し、表１８に示すように保存した。

【表18】

【0298】

より具体的には、デンプン分解活性を示すクリアリングゾーンが、組み込まれたアミラーゼ発現カセットを含むコロニーの周りに明瞭に視認された。したがって、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞によるアミラーゼの産生を、ＮＨ４Ｃｌ２、ＦｅＳＯ４、及びＣａＣｌ２を基礎培地から除き、３ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４を使用し、基礎培地に６０ｍＭ尿素、７５ｇ／Ｌグルコース、及び１パーセント（１％）ソイトンを補充したことを除いて、実質的に当該技術分野で知られるように調製したＭＯＰＳ基礎培地ＭＢＤ培地（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９７４を参照）を使用して、マイクロタイタープレート中で細胞を増殖させることによって実験的に試験した。１リットル中、４００ｍｇのＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｕＣｌ２２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＣｏＣｌ２６Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａＭｏＯ４２Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７１０Ｈ２Ｏ、１０ｍｌの１Ｍ ＣａＣｌ２、及び１０ｍｌの０．５Ｍクエン酸ナトリウムの１００×ストック溶液として、微量栄養素を調製した。ＣａＣｌ２を５ｍＭまで添加し、ｐＨを６．８に調節した。

【0299】

Ｉｎｆｏｒｓインキュベーター（３７℃、２７０ｒｐｍ）内で７０時間増殖させた後、α－Ａｍｙｌａｓｅ Ｃｅｒａｌｐｈａ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて、全細胞ブロス中のアミラーゼ－酵素濃度を決定した。セラルファα－アミラーゼアッセイは、規定条件下で基質混合物と共に全培養ブロスをインキュベートする工程を含み、塩基溶液の添加により反応を停止させる（これに続き、発色が起こる）。基質は、規定のオリゴ糖「非還元末端遮断ｐ－ニトロフェニルマルトヘプタオシド」（ＢＰＮＰＧ７基質）と過剰レベルのグルコアミラーゼ及びβ－グルコシダーゼ（これらは、「遮断基」の存在のためにネイティブ基質に作用をもたらさない）の混合物である。エンド活性α－アミラーゼ（又はＣ６アミラーゼ）によるオリゴ糖の加水分解時に、混合物中に存在する過剰量のα－グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼが、ｐ－ニトロフェニルマルトサッカライド断片の即時及び定量的加水分解を起こし、グルコース及び遊離ｐ－ニトロフェノールをもたらす。４０５ｎｍでの吸光度を測定し、これは、分析した試料中のアミラーゼレベルに直接関係する。この一連のアッセイのために使用される装置には、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）；ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ＭＴＰ Ｒｅａｄｅｒ（３４０型－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれる。このアッセイシステムでは、以下の試薬及び溶液を用いた：（１）ｐ－ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）基質（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｃｅｒａｌｐｈａキット）；（２）希釈緩衝液：５０ｍＭ ＭＯＰＳ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０緩衝液、ｐＨ７．１５；及び（３）２００ｍＭホウ酸／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．２（停止緩衝液）。

【0300】

したがって、５４．５ｍｇのＢＰＮＰＧ７基質を含有するバイアルを１０ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水に溶解させた。アミラーゼ試料（全細胞ブロス）を希釈バッファーで１６００×希釈した。アッセイは２５μｌの希釈アミラーゼ溶液をＭＴＰのウェルに添加し、続いて３５μｌの５．４５ｍｇ／ｍｌのＢＰＮＰＧ７基質溶液を添加することによって行った。溶液を混合し、ＭＴＰをプレートシールで密封し、インキュベーター／シェーカー（ｉＥＭＳ－Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内に２５℃で８分間置いた。１００μｌの停止緩衝液を添加することによって反応を停止させ、ＭＴＰリーダーにおいて４０５ｎｍで吸光度を読み取った。非酵素対照を使用して、バックグラウンド吸光度値を補正した。変異アミラーゼ酵素濃度（ｍｇ／Ｌ）を算出するために、精製済変異アミラーゼ酵素標準対照試料の希釈シリーズを実験に組み込んだ。

【0301】

アミラーゼ活性及びアミラーゼの比生産性を、それぞれ図２Ａ及び図２Ｂに示す。例えば、図２Ｂに示すように、ＢＦ１１７細胞（ＢＦ１１７：ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ及びＷＴ－ＧｌｃＴ）に対するＢＦ１３４細胞（ＢＦ１３４：ＷＴ－５’－ＵＴＲ及びＷＴ－ＧｌｃＴ）の正規化比生産性は、同様のアミラーゼ生産性を示す。対照的に、図２Ｂに示すように、ＢＦ１３４細胞又はＢＦ１１７細胞（すなわち、ＢＦ１３４細胞及びＢＦ１１７細胞はいずれも野生型ＧｌｃＴ遺伝子を含む）に対するＨＭ１５１細胞（ＨＭ１５１：ＷＴ－５’－ＵＴＲ及びアレルＧｌｃＴ１）の正規化比生産性は、ＨＭ１５１細胞が約５％の比生産性の増加を示し、これによって、アレルｇｌｃＴ１を含む改変されたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞が、天然の野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、より多くの目的タンパク質を産生し得ることを実証する。

【0302】

さらに、図２Ｂに示すように、ＢＦ１３４細胞又はＢＦ１１７細胞（すなわち、野生型ＧｌｃＴ遺伝子を含む）に対するＨＭ１５０－１細胞（ＨＭ１５０－１：ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ及びアレルＧｌｃＴ１）の正規化比生産性は、ＨＭ１５０－１細胞の比生産性が約９％の増加を示し、さらに、アレルｇｌｃＴ１を含む改変バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞が、天然の野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞と比較して、より多くの目的タンパク質を産生し得ることを示している。同様に、ＨＭ１５１細胞（ＨＭ１５１：ＷＴ－５’－ＵＴＲ及びアレルＧｌｃＴ１）に対するＨＭ１５０－１細胞（ＨＭ１５０－１：ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ及びアレルＧｌｃＴ１）の正規化比生産性は、ＨＭ１５１細胞に対してＨＭ１５０－１の比生産性が約４％増加していることを示し、これは、アミラーゼコンストラクト中に存在する「ｍｏｄ－５’－ＵＴＲ」配列が、観察されたＨＭ１５０－１細胞の比生産性の増加にさらに寄与していることを示している。

【0303】

実施例９
アルファ－アミラーゼの小規模生産
本実施例では、ＷＴ－５’－ＵＴＲ（配列番号６４）又はｍｏｄ－５’ＵＴＲ（配列番号６５）のいずれかを有するα－アミラーゼ発現カセットを含む、ＢＦ１１８、ＢＦ１６５、ＢＦ１７１及びＢＦ２６０と名付けた４つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主株を、小規模条件下でのα－アミラーゼ産生について評価した。これらの４つの株を、１％（ｗ・ｖ－１）の不溶性デンプンを含有するＬ寒天プレート上でストリーク精製し、約２４時間にわたり３７℃で増殖させた。単一ハロー陽性コロニーを、１５ｍｌのトリプティックソイブロス（１．７％（ｗ・ｖ－１のトリプトン、０．３％（ｗ・ｖ）－１）のソイトン、０．２５％（ｗ・ｖ－１）のグルコース、０．５％（ｗ・ｖ－１）の塩化ナトリウム、０．２５％（ｗ・ｖ－１）のリン酸二カリウム）中に接種し、６時間にわたり３７℃（２５０ＲＰＭ）で増殖させた。続いて、この０．０２５ｍｌの種培養物を、２５ｍｌのフラスコ増殖培地（水酸化アンモニウムと共に、微量金属を含有する４％（ｗ・ｖ－１）のＭＥＳ、０．１％（ｗ・ｖ－１）のリン酸一カリウム、０．０５％（ｗ・ｖ－１）の塩化ナトリウム、０．０３％（ｗ・ｖ－１）のソイトン、ｐＨ６．８）中に接種した。単一高グルコース放出性フィードビーズ（Ｋｕｈｎｅｒ）を添加した（供給速度５７ｍｇ／Ｌ．時間）。培養物を４２℃（２５０ＲＰＭ）で９０時間にわたり増殖させた。総分泌タンパク質産生量を、ＢＳＡ標準物質を用いるブラッドフォード法を使用して決定した。各株についての少なくとも２本の独立フラスコの反復測定から平均化した相対α－アミラーゼ産生量を、下の表１９に示す。

【表19】

【0304】

したがって、表１９に示すように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞ＢＦ１７１及びＢＦ２６０（回復ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）及びアレルｇｌｃＴ１を含む）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞ＢＦ１１８及びＢＦ１６９（回復ｒｇｈＲ２遺伝子（ｒｇｈＲ２ｒｅｓｔ）及び野生型ｇｌｃＴ遺伝子を含む）と比較して（相対的に）、相対的α－アミラーゼ産生量の約９％の増加を示す。

【0305】

参照文献
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国際公開第１９９９／２０７２６号パンフレット
国際公開第１９９９／２０７６９号パンフレット
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国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレット
国際公開第２００８／０２４３７２号パンフレット
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【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【配列表】

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