特許 7281773 細胞外小胞を生産する流体システムおよびそれに関連する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-18

(45)【発行日】2023-05-26

(54)【発明の名称】細胞外小胞を生産する流体システムおよびそれに関連する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 1/00 20060101AFI20230519BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230519BHJP

   A61L 27/36 20060101ALI20230519BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20230519BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20230519BHJP

   C12M 1/02 20060101ALN20230519BHJP

【ＦＩ】

C12P1/00 Z

A61K35/12

A61L27/36 100

A61L27/38 300

C12N5/07

C12M1/02 A

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020522409

(86)(22)【出願日】2018-06-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-10-01

(86)【国際出願番号】 EP2018067704

(87)【国際公開番号】W WO2019002608

(87)【国際公開日】2019-01-03

【審査請求日】2021-05-28

(31)【優先権主張番号】1756183

(32)【優先日】2017-06-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】520053762

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】518369442

【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィック（シーエヌアールエス）

(73)【特許権者】

【識別番号】520000526

【氏名又は名称】ジェネソン

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ガゾー，フローレンス

(72)【発明者】

【氏名】シルバ，アマンダ カリーヌ アンドリオラ

(72)【発明者】

【氏名】メルテン，オット－ヴィルヘルム

(72)【発明者】

【氏名】ヴィルヘルム，クレール

(72)【発明者】

【氏名】ピフックス，マックス

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０７６９２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０３５５７７６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開昭６１－１０８３７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】色材, 2002, Vol.75, No.12, p.586-591

【文献】Nature Reviews Drug Discovery, 2013, Vol.12, p.347-357

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １／００

Ａ６１Ｋ ３５／１２

Ａ６１Ｌ ２７／３６

Ａ６１Ｌ ２７／３８

Ｃ１２Ｎ ５／０７

Ｃ１２Ｍ １／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｅｘ ｖｉｖｏで生産用細胞（６）から細胞外小胞（ＥＶ）を生産するための方法であって、
攪拌機（７）を制御して容器（４）内に液体培地（５）の乱流を生じさせるステップであって、前記容器が出口（９）を含み、前記液体培地（５）が、マイクロキャリア（３）の表面に付着している生産用細胞（６）を含み、前記マイクロキャリア（３）が前記液体培地（５）中に懸濁されており、前記攪拌機（７）が、前記液体培地（５）が流れるように制御され、前記流れのコルモゴロフ長さが７５μｍ以下である、ステップと、
前記容器（４）の前記出口（９）で細胞外小胞（ＥＶ）を含む液体培地（５）を収集するステップと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記液体培地（５）を３０分間よりも長く攪拌する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記流れのコルモゴロフ長さが５０μｍ以下である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

分離器が、前記容器（４）の前記出口で収集した前記液体培地（５）の一部から細胞外小胞（ＥＶ）を枯渇させ、前記液体培地（５）の前記一部が前記容器（４）内に再導入される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能な細胞外小胞（ＥＶ）。

【請求項6】

請求項５に記載の細胞外小胞（ＥＶ）を含む、医薬組成物。

【請求項7】

再生医療に使用するための、請求項６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生産用細胞から細胞外小胞を生産するシステム、このような小胞を生産および回収する方法ならびにこのようなシステムによって生産され、例えば細胞療法および再生医療に使用される小胞に関する。

【背景技術】

【0002】

（最新技術）
細胞は、その環境中に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで生物体の体液中に細胞外小胞を放出することが知られている。細胞外小胞はこれまで、個別化した方法で、または標的化した方法で、ヒト身体に薬物を送達するのに効率的な手段であることが明らかにされてきた。第一に、細胞外小胞には天然の生体適合性および免疫寛容がある。細胞外小胞はセラノスティクスナノ粒子を含むこともでき、この両者によって、身体の特定部分を撮像し、治療機能を有する有効成分を送達することが可能になる。細胞外小胞には細胞間コミュニケーション機能もあり、例えば、異なる細胞間で脂質、膜および細胞質タンパク質ならびに／あるいは細胞質内にあるヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたは長鎖非コードＲＮＡなどを輸送することを可能にする。

【0003】

特に、細胞外小胞の使用により、細胞を治療に使用するときの既知の問題、例えば細胞複製、分化、血管閉塞、拒絶のリスクならびに保管および凍結の困難などを解決することが可能になると思われる。したがって、特に細胞療法の代替法として、または細胞療法に加えて治療に使用するのに十分な量の細胞小胞を生産することが工業的に必要とされている。

【0004】

この目的に向けて、Ｐｉｆｆｏｕｘら（Ｐｉｆｆｏｕｘ，Ｍ．，Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｋ．，Ｌｕｇａｇｎｅ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｅｒｓｅｎ，Ｐ．，Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｃ．およびＧａｚｅａｕ，Ｆ．，２０１７，Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌｏａｄｅｄ ｗｉｔｈ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ ａ Ｔｒａｄｅ‐ｏｆｆ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｌｏａｄｉｎｇ，Ｙｉｅｌｄ ａｎｄ Ｐｕｒｉｔｙ：Ｔｏｗａｒｄｓ ａ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、細胞外小胞を生産する様々な方法の比較について記載している。

【0005】

第一の方法は、毛細血管内の生理的条件下または血管狭窄時の病的条件下でかかるストレスを模倣した流体力学的ストレスに臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を曝露することによって、その細胞から細胞外小胞を生産するものである。これらのストレスは、生産用細胞をマイクロ流体チャネルに４時間通すことによって引き起こされる。マイクロ流体チップは、細胞が層流によって運ばれる２００のチャネルを含み、並列化された方法で小胞を生産する。

【0006】

ただし、この方法には寸法上の問題、つまり、マイクロ流体チップによって生産される小胞の量が、上記の用途に必要とされる量に適合していないという問題がある。さらに、このようなチップに導入した細胞１個当たりに生産される細胞外小胞の収率（１細胞当たり約２×１０^４個）は、細胞によって生産される小胞の理論的最大収率、例えば、ＭＳＣ型細胞（間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の頭字語）の１細胞当たり約３．５×１０^６個よりはるかに少ない。最後に、この方法は、薬物の製造に必要なＧ．Ｍ．Ｐ．（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｓｅｓの頭字語）と呼ばれる基準に準拠している必要がある。

【0007】

文献で一般に用いられ、Ｐｉｆｆｏｕｘらによって記載されている第二の方法は、血清を含まないＤＭＥＭ型（ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）の頭字語）培地でＨＵＶＥＣを３日間培養するもの（飢餓法または血清飢餓法と呼ばれる）である。血清が存在しないことによって細胞ストレスが生じ、生産用細胞による小胞の放出が惹起される。この方法は、マイクロ流体チップを用いる方法よりも収率が高く、より多くの小胞（１生産用細胞当たり約４×１０^４個）の生産が可能である。ただし、このように計算された収率は、生産時間が先の方法の生産時間よりはるかに長いことと一致する。この方法では、上記の用途に十分な量の細胞外小胞を生産することはできない。最後に、この方法は細胞死を誘導するため、継続的に小胞を生産することはできない。

【0008】

Ｗａｔｓｏｎら（Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｂａｙｉｋ，Ｄ．，Ｓｒｉｖａｔｓａｎ，Ａ．，Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ，Ｃ．，Ｖａｌｅｎｔｉｎ，Ａ．，Ｎｉｕ，Ｇ．，．．．およびＪｏｎｅｓ，Ｊ．Ｃ．，２０１６，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１０５，１９５－２０５）は、生産される小胞の量を増やすことが可能な小胞生産法について記載している。この方法は、ＨＥＫ２９３型細胞を培養フラスコ、次いで中空繊維膜で培養するものである。中空繊維の中央通路によって培地が生産用細胞まで運ばれる。最初に生産用細胞をこの通路の周囲に播き、そこで細胞が繊維間の空隙に小胞を生産する。繊維間の空隙に含まれる液体培地を週３回収集することにより、播種した極めて大量の細胞、例えば約５×１０^８個の細胞から数週間で約３×１０^１２個の小胞が生産され、細胞外小胞の収率は１細胞当たり約６０００個になり、純度比は極めて小さい（例えば、タンパク質１マイクログラム当たり１．０９×１０^９個の小胞）。ただし、この生産量は、上記の用途に関して言えば十分なものではなく、時間もかかりすぎる。さらに、この方法は、無血清培地での培地に特に耐性のある細胞系に相当する生産用細胞を用いて記載されているものであり、つまり、この方法は、耐性が低く、特に標的化治療への適用に適した幹細胞、例えばヒト幹細胞などの生産用細胞による小胞の生産に置き換えることができない。

【発明の概要】

【0009】

本発明の目的は、Ｇ．Ｍ．Ｐ基準に準拠する条件下、既知の方法を用いるよりも速く生産用細胞から大量の細胞外小胞を生産するための解決方法を提案することである。本発明のまた別の目的は、小胞生産システムの収率、つまり、生産される小胞の数と生産システムに導入する生産用細胞との間の比を増大させることが可能な解決方法を提案することである。本発明のまた別の目的は、生産システムに導入する細胞型の耐性にも、血清飢餓に対する耐性の有無にも関係なく、様々な付着生産用細胞から細胞外小胞を生産するのに適合したシステムを提案することである。本発明のまた別の目的は、継続的に細胞外小胞を生産および回収するための解決方法を提案することである。最後に、本発明のまた別の目的は、小胞を生産する流体システムの構造を簡略化すること、およびその製造コストを削減することである。

【0010】

具体的には、本発明の目的は、生産用細胞から細胞外小胞を生産する流体システムであって、少なくとも１つの容器と、容器に入れる液体培地と、生産用細胞とを含み、液体培地中に懸濁し表面に生産用細胞の大部分が付着したマイクロキャリアおよび液体培地の攪拌機も含み、攪拌機ならびに容器の形状および寸法が、容器内に液体培地の乱流を発生させることに適合していることを特徴とする、流体システムである。

【0011】

このようなシステムを用いれば、小胞を大量に、Ｇ．Ｍ．Ｐ基準に適合したシステムで生産することが可能であることが理解される。また、このようなシステムが細胞外小胞を生産する既知のシステムよりも単純であり、製造にかかる費用が少なくて済むことも理解される。

【0012】

本発明は、個々に、または技術的に可能な組合せのうちいずれか１つの形で取り入れられる以下の特徴によって補われるのが有利である：
液体培地の攪拌機および容器の寸法は、液体培地の流れを制御するのに適合しており、流れのコルモゴロフ長さが７５μｍ以下、好ましくは５０μｍである；
流体システムは、出口と、出口と連結されたコネクタとを含み、コネクタが、液体培地と細胞外小胞とを含むことが可能である；
攪拌機は、回転速度（１つまたは複数）、形状、大きさが容器の形状および寸法とともに容器内での液体培地の乱流の発生に適合した回転式攪拌機である；
マイクロキャリアはマイクロビーズであり、マイクロビーズの直径が１００μｍ～３００μｍである；
流体システムは、小胞が枯渇した液体培地を容器内に再導入することができるよう容器と流体連結されている細胞外小胞分離器を含む。

【0013】

本発明のまた別の目的は、ｅｘ ｖｉｖｏで生産用細胞から細胞外小胞を生産する方法であって、
攪拌機を制御して容器内に液体培地の乱流を生じさせ、容器が出口を含み、液体培地が、マイクロキャリアの表面に付着している生産用細胞を含み、マイクロキャリアが液体培地中に懸濁していることと、
容器の出口で細胞外小胞を含む液体培地を収集することと
を含む、方法である。

【0014】

この方法は、個々に、または技術的に可能な組合せのうちいずれか１つの形で取り入れられる以下の特徴によって補われるのが有利である：
液体培地を３０分間よりも長く攪拌する；
液体培地が流れるよう攪拌機を制御し、流れのコルモゴロフ長さが７５μｍ以下、好ましくは５０μｍである；
分離器が、容器の出口で収集した液体培地の一部から細胞外小胞を枯渇させ、液体培地の一部が容器内に再導入される。

【0015】

本発明のまた別の目的は、本発明の細胞外小胞生産方法によって得ることが可能な細胞外小胞でもある。

【0016】

本発明のまた別の目的は、本発明の細胞外小胞生産方法によって得ることが可能な細胞外小胞を含む、医薬組成物でもある。

【0017】

細胞外小胞を含む医薬組成物は、再生医療に使用することができる点で有利である。

【0018】

定義
「細胞外小胞」という用語は一般に、生産用細胞によって内因性に放出され、直径が３０ｎｍ～５０００ｎｍである小胞を指す。細胞外小胞は具体的には、エキソソームおよび／または微小胞および／または細胞アポトーシス小体に対応する。

【0019】

「マイクロキャリア」および「微小支持体」という用語は、表面または内側に付着している生産用細胞を増殖させ、最大径が５０μｍ～５００μｍ、好ましくは１００μｍ～３００μｍである、球状の基質を指す。マイクロキャリアは一般に、密度が実質的に生産用細胞の液体培地の密度に近くなるよう選択されたビーズである。このため、穏やかにかき混ぜることにより、ビーズを液体培地中に懸濁させておくことができる。

【0020】

図面の説明
以下の説明から他の特徴と利点も明らかになるが、この説明は単に例示的で非限定的なものであって、添付の図面を参照しながら読むべきである。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、細胞外小胞を生産する流体システムを模式的に示す図である。

【図2】図２は、流体システムにおいて様々な攪拌でＨＵＶＥＣ細胞によって生産された細胞外小胞の数を示す図である。

【図3】図３は、流体システムにおいて様々な攪拌でＨＵＶＥＣ細胞によって生産された細胞外小胞の数を示す図である。

【図4】図４は、流体システムにおいて様々な攪拌でＭＳＣ細胞によって生産された細胞外小胞の数を示す図である。

【図5】図５は、コルモゴロフ長さが、ＨＵＶＥＣ細胞およびＭＳＣ細胞によって生産される細胞外小胞の数に及ぼす影響を示す図である。

【図6】図６は、マイクロキャリアの表面に付着している生産用細胞を示す図である。

【図7】図７は、マイクロキャリアの表面に付着している生産用細胞を示す図である。

【図8】図８は、様々な攪拌持続時間、様々な生産用細胞および様々な攪拌条件での細胞外小胞の生産収率を示す図である。

【図9】図９は、様々な生産用細胞および様々な攪拌条件での２４０分間の攪拌後の細胞外小胞の生産収率を７２時間の血清除去法と比較して示す図である。

【図10】図１０は、攪拌前および攪拌後にマイクロキャリア上に付着していた生産用細胞の濃度を様々な攪拌条件について示す図である。

【図11】図１１は、細胞外小胞を生産する攪拌条件下でのＨＵＶＥＣ型生産用細胞の代謝を示す図である。

【図12】図１２は、細胞外小胞を生産する攪拌条件下でのＨＵＶＥＣ型生産用細胞の代謝を示す図である。

【図13】図１３は、細胞外小胞ＥＶを生産する攪拌条件下でのマウスＭＳＣ型生産用細胞の代謝を示す図である。

【図14】図１４は、細胞外小胞を生産する攪拌条件下でのマウスＭＳＣ型生産用細胞の代謝を示す図である。

【図15】図１５は、流体システムによって生産した細胞外小胞のクライオ電子顕微鏡法による顕微鏡写真である。

【図16】図１６は、流体システムによって生産した細胞外小胞の直径の分布を示す図である。

【図17】図１７は、液体培地中で流体システムによって生産した細胞外小胞の粒子の数とタンパク質の質量との間の比によって得られた純度を７２時間の血清除去法と比較して示す図である。

【図18】図１８は、流体システムによって生産した細胞外小胞を含む液体培地の血管新生促進特性を示す図である。

【図19】図１９は、流体システム、血清除去法または自発的小胞放出によって生産した細胞外小胞を含む液体培地の血管新生促進特性を示す図である。

【図20】図２０は、流体システムによって生産した細胞外小胞を含む培地中で１日間インキュベートした後の心筋細胞（Ｈ９Ｃ２系）の代謝活性を示す図である。

【図21】図２１は、流体システムによって生産した細胞外小胞を含む様々な培地中で２日間インキュベートした後の心筋細胞（Ｈ９Ｃ２系）の代謝活性を示す図である。

【図22】図２２は、流体システムによって生産した細胞外小胞を異なる濃度で含む液体培地でのインキュベーションについて、投与量が心筋細胞の増殖に及ぼす効果を示す図である。

【図23】図２３は、細胞外小胞を含む液体培地の存在下で２日間インキュベートした後の心筋細胞（Ｈ９Ｃ２系）の増殖を示す図である。

【図24】図２４は、流体システムによって生産した細胞外小胞のラットの缶と盲腸の間の瘻の治療へのポロキサマーゲルの医薬組成物としての使用を示す図である。

【図25】図２５は、流体システムによって生産した細胞外小胞のラットの缶と盲腸の間の瘻の治療へのポロキサマーゲルの医薬組成物としての使用を示す図である。

【図26】図２６は、本発明による方法によって生産した細胞外小胞のプロテオミクスプロファイルと、先行技術による従来の生産方法によって生産した細胞外小胞のプロファイルとを比較して示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

（詳細な説明）
理論的要素
コルモゴロフ長さ（またはコルモゴロフ寸法または乱流長さ）とは、流体の粘度がこの流体の流れの運動エネルギーを消失させる長さのことである。実際には、コルモゴロフ長さは乱流の最も小さい渦の大きさに対応する。この長さＬ_Ｋは、コルモゴロフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ，Ａ．Ｎ．，１９４１，Ｊａｎｕａｒｙ，Ｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ｉｎｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｖｉｓｃｏｕｓ ｆｌｕｉｄ ｆｏｒ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｎｕｍｂｅｒｓ，Ｉｎ Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ，ＳＳＳＲ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．４，ｐｐ．３０１－３０５）の刊行物で算出されており、以下の式（１）：
Ｌ_Ｋ＝ν^３／４・ε^－１／４（１）
によって記述され、式中、νは流動している液体培地の動粘性率であり、εは流体の質量単位当たりに消失するエネルギー（または流体へのエネルギー注入率）である。

【0023】

Ｚｈｏｕら（Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｋｒｅｓｔａ，Ｓ．Ｍ．，１９９６，Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔａｎｋ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｆｏｒ ｉｍｐｅｌｌｅｒｓ，ＡＩＣｈＥ ｊｏｕｒｎａｌ，４２（９），２４７６－２４９０）は、羽根型攪拌翼型攪拌機によって液体培地を攪拌した場合のεと容器の形状との間の関係について記載している。この関係は以下の式（２）：

【数1】

で与えられ、式中、Ｎ_ｐは液体培地中での攪拌機の無次元動力数（またはニュートン数）であり、Ｄは攪拌機の直径（メートル）であり、Ｎは回転速度（毎秒回転数）であり、Ｖは液体培地の体積（立方メートル）である。この関係は、本発明を実施するのに使用する容器および攪拌機の形状に対応するεを算出するのに用いられる。動力数Ｎ_ｐは以下の式（３）：

【数2】

により既知の方法で与えられ、式中、Ｐは攪拌機によって与えられる力であり、ρは液体培地の密度である。式（３）は、液体培地の流れのレイノルズ数に応じて、Ｎｉｅｎｏｗら（Ｎｉｅｎｏｗ，Ａ．Ｗ．およびＭｉｌｅｓ，Ｄ．，１９７１，Ｉｍｐｅｌｌｅｒ ｐｏｗｅｒ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ｃｌｏｓｅｄ ｖｅｓｓｅｌｓ，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０（１），４１－４３）またはＺｈｏｕら（Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｋｒｅｓｔａ，Ｓ．Ｍ．，１９９６，Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｔａｎｋ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｏｎ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｆｏｒ ｉｍｐｅｌｌｅｒｓ，ＡＩＣｈＥ ｊｏｕｒｎａｌ，４２（９），２４７６－２４９０）に記載されている通りに調整することができる。以下の式（４）：

【数3】

によりシステムのレイノルズ数を算出することも可能である。

【0024】

流体システムの一般的構造
図１に、細胞外小胞ＥＶを生産する流体システム１を模式的に示す。細胞外小胞ＥＶを生産する流体システム１は、容器４中で細胞外小胞ＥＶを大量に生産することを目的とするものである。ただし、本発明は、この実施形態に限定されるわけではなく、並列に、または直列に流体連結されている一連の容器４を含み得る。

【0025】

容器４には液体培地５が含まれている。容器４は、例えばガラスもしくはプラスチック材料でできた器、フラスコまたは液体培地５を含むのに適合した任意の他の容器であり得る。容器４の体積は、細胞外小胞ＥＶを大量に生産するのを可能にする因子の１つであり、この体積は５０ｍＬ～５００Ｌ、好ましくは１００ｍＬ～１００Ｌ、好ましくは５００ｍＬ～１０Ｌであり得る。図１に模式的に示される容器４の体積は１Ｌである。容器４は通常、ガスの入り口とガスの出口とを含み、そこを細胞培養に適合した濃度のＯ_２およびＣＯ_２を含む、例えば５％のＣＯ_２を含む空気が流れることができる。この空気は、適合したガス注入器／混合器から、またはＣＯ_２制御空気オーブンから来るものであり得る。第二のポンプ１７によって容器４内のこの空気の流れを制御することができる。容器４は、液体培地５と細胞外小胞ＥＶとを含むことが可能な出口９も含む。この出口は、マイクロキャリア３を分離および／またはろ過し、マイクロキャリア３が容器４の外に回収されないようにする手段によって完成する。この出口９によって、生産された細胞外小胞ＥＶを容器４から取りだすことができる。容器４は、液体培地５を容器４に導入するのに適合した少なくとも１つの入り口８も含み得る。

【0026】

液体培地５は一般に、生理食塩水、例えば等張液であり得る。好ましくは、液体培地５は、目的とする細胞の培養を可能にする化合物を含む、もしくはこれを加えた液体培地、または予め細胞外小胞から精製した血清を添加した培地、または血清を含まず、流体システム１によって生産された細胞外小胞ＥＶを血清由来のタンパク質もしくはその他の小胞によって汚染しないようにした培地である。血清を含まないＤＭＥＭ型液体培地５を使用することができる。液体培地５の最大体積は部分的には、容器４によって決まる。この最大体積は、５０ｍＬ～５００Ｌ、好ましくは１００ｍＬ～１００Ｌ、より好ましくは５００ｍＬ～１０Ｌであってもよい。容器４に含まれる液体培地５の最小体積は部分的には、液体培地５を攪拌する攪拌機７の選択によって決まる。

【0027】

流体システム１は、液体培地５中に懸濁したマイクロキャリア３も含む。マイクロキャリア３は、例えばデキストランでできたマイクロビーズ１４であってよく、各マイクロビーズ１４を細胞の培養に必要なコラーゲンまたはその他の材料の層で覆うことができる。マイクロキャリア３の製造には、ガラス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、コラーゲンおよび／またはアルギン酸塩などの他の材料も使用することができる。一般的な方法では、細胞培養に適合した一式のマイクロキャリアは、細胞外小胞ＥＶの生産に適合したものである。例えば、マイクロキャリア３の密度は、液体培地５の密度よりわずかに大きいものであり得る。デキストランでできたマイクロビーズ１４の密度は、例えば１．０４である。この程度の密度であれば、液体培地５をわずかに攪拌することによってマイクロビーズ１４を液体培地５中に懸濁させることが可能であり、液体培地５中での各マイクロキャリア３の抗力はマイクロキャリア３の密度に左右される。マイクロキャリア３の最大径は５０μｍ～５００μｍ、好ましくは１００μｍ～３００μｍ、好ましくは１３０μｍ～２１０μｍであり得る。

【0028】

例えば、マイクロキャリア３は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（登録商標）型のマイクロビーズ１４であり得る。このマイクロビーズ１４によって形成された粉末を使用前に水で戻し、滅菌することができる。次いで使用前、４℃で、血清を含まない培地（例えば、ＤＭＥＭ）中５ｇのＰＢＳを使用することができる。

【0029】

流体システム１は生産用細胞６も含む。細胞外小胞ＥＶは、流体システム１によってこの生産用細胞６から生産される。流体システム１によって細胞外小胞ＥＶを生産する前に、適合した細胞培地中、生産用細胞６をマイクロキャリア３の表面で培養することができる。したがって、生産用細胞６の培養と細胞外小胞ＥＶの生産の間に細胞を移動させる必要はなく、これにより、いかなる汚染も回避し、方法全体を簡略化することが可能になる。生産用細胞６の一部が例えば液体培地５の攪拌によって剥離することがあるとしても、生産用細胞６の大部分はマイクロキャリア３の表面に対して付着性を示す。次いで、他の生産用細胞が液体培地５中に懸濁するか、容器４の底に沈降する。一般的な方法では、非付着性の生産用細胞、好ましくは付着性の生産用細胞６を含めた任意の種類の生産用細胞６を使用することができる。例えば、生産用細胞６は多分化能性細胞または人工多能性幹細胞（ＩＰＳまたはＩＰＳＣ）であり得る。これらは遺伝子改変細胞および／または腫瘍系であってもよい。

【0030】

容器４は、液体培地５を攪拌する攪拌機７も含む。攪拌機７は羽根型攪拌翼であってよく、その羽根は少なくとも一部が液体培地５に浸かっており、磁力の伝達によって動く。攪拌機７は、容器に含まれる液体培地５を攪拌するのに十分な流速の液体培地５の灌流システムまたは（例えば、ローラ上に配置された）回転壁を有するシステムであってもよい。攪拌機７および容器４の寸法は、容器４内の液体培地５の乱流を制御するのに適合している。乱流は、レイノルズ数が２０００より大きい流れを意味する。例えば、レイノルズ数を式（４）により算出することができる。好ましくは、液体培地５の流れのレイノルズ数Ｒｅは、７０００超、好ましくは１００００超、好ましくは１２０００超である。

【0031】

本発明の例示的実施形態に使用される攪拌機７は、容器４内に配置され磁力伝達システムによって動く羽根型攪拌翼を含む。液体培地５中の羽根型攪拌翼の速度によって液体培地５が流れる。攪拌機は、容器４の寸法を考慮に入れ、乱れた流れを制御するのに適合している。図１に示される攪拌機７の場合、複数のパラメータによって、液体培地５の乱流、特に液体培地５の動粘性率ｖ、容器４の寸法、特に容器４に含まれる液体培地５の体積Ｖ、羽根型攪拌翼の浸かった部分に対応する動力数Ｎ_ｐ、攪拌機、特に攪拌翼の直径Ｄ、攪拌翼の回転速度Ｎの代表的な値を算出することが可能である。したがって、使用者は、これらのパラメータに従って、流れの乱流、特に、（１）、（２）および（３）の式によって与えられるコルモゴロフ長さＬ_Ｋの代表的な値を算出することができる。具体的には、攪拌機７は、長さＬ_Ｋが７５μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下である流れを制御するのに適合している。

【0032】

流体システム１の例示的実施形態では、攪拌機７の回転速度は１００ｒｐｍ（毎分回転数）に制御することが可能であり、羽根型攪拌翼の直径は１０．８ｃｍであり、容器４に含まれる液体培地の体積は４００ｍＬである。式（３）によって測定される液体培地５中での羽根型攪拌翼の動力数Ｎ_Ｐは実質的に３．２に等しい。式（２）によって算出される質量単位当たりに消失するエネルギーεは５．４４×１０^－１Ｊ・ｋｇ^－１に等しい。したがって、式（１）によって算出されるコルモゴロフ長さＬ_Ｋは４１．８μｍに等しい。

【0033】

マイクロキャリアおよび生産用細胞の調製
容器４は、使い捨ての容器であっても、液体培地５、マイクロキャリア３および生産用細胞６を導入する前に滅菌してもよい。マイクロキャリア３、この場合、マイクロビーズ１４も滅菌する。マイクロビーズ１４を容器４内で、血清を含む生産用細胞６の培地中でインキュベートする。このインキュベーションによって、培地に酸素が送り込まれ、マイクロビーズ１４の表面が、マイクロビーズ１４の表面への生産用細胞６の付着を促進するタンパク質の少なくとも部分的な層で覆われる。

【0034】

生産用細胞６を流体システム１に導入する前に、トリプシンを含む培地によって生産用細胞６を懸濁させる。次いで、それを３００Ｇで５分間遠心分離してチューブの底に濃縮し、トリプシンを含む培地をＤＭＥＭ培地に置き換えることができる。次いで、実質的に１個のマイクロビーズ１４当たり５～２０個の生産用細胞６に対応する量で培地とマイクロビーズ１４とを含む容器５に生産用細胞６を導入する。そののち、生産用細胞６とマイクロビーズ１４を攪拌した後、沈降させてマイクロビーズ１４と生産用細胞６とを接触させ、マイクロビーズ１４の表面への生産用細胞６の付着を促進する。攪拌を周期的に、例えば５～２４時間にわたって４５分毎に再開して、マイクロビーズ１４の表面への生産用細胞６の付着の均一性を促進することができる。そののち、培地を弱く攪拌する（例えば、羽根型攪拌翼を２０ｒｐｍの速度で回転させる）とともに、培地も定期的に交換しながら（例えば、毎日培地の５％～４０％を交換しながら）、生産用細胞の培養を実施する。

【0035】

細胞外小胞ＥＶの生産例
例えば血清を含まない液体培地５、マイクロキャリア３およびマイクロキャリア３の表面に付着した生産用細胞６を含む容器４内で細胞外小胞ＥＶを生産する。マイクロキャリア３上で生産用細胞６を培養するために生産前に使用し、血清を含む培地、容器４を血清を含まないＤＭＥＭ液体培地５で３～４回洗浄し、各洗浄は例えば約４００ｍＬの体積に相当する。次いで、液体培地５の攪拌を攪拌機７により制御して容器４内に乱流を発生させる。好ましくは、コルモゴロフ長さＬ_Ｋが７５μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下である液体培地５の流れを制御するよう攪拌を調節する。液体培地５の攪拌は、少なくとも３０分間、好ましくは１時間超、好ましくは２時間超制御する。生産中に細胞外小胞ＥＶの生産量を測定する。この目的に向けて、攪拌を一時的に中断することができる。マイクロビーズ１４を容器４の底に沈降させ、次いで、細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５の試料を採取する。試料を２０００Ｇで１０分間遠心分離して細胞残屑を除去する。個々の粒子を追跡する方法（またはＮＴＡ、ナノ粒子トラッキング解析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ）の頭字語）により上清を解析して、細胞外小胞ＥＶの数をカウントし、試料の細胞外小胞ＥＶの濃度を推定する。攪拌開始時の細胞外小胞ＥＶの濃度がゼロに近い、またはごくわずかであることを確認することができる。

【0036】

生産された細胞外小胞ＥＶを透過型電子クライオ顕微鏡法により観察および／またはカウントすることもできる。この目的に向けて、細胞外小胞ＥＶを含む溶液２．７μＬの滴をクライオ顕微鏡法に適合したグリッド上に置き、次いで、液体エタンに浸漬して前記滴をほぼ瞬時に凍結させ、氷晶が形成されないようにする。細胞外小胞ＥＶを載せたグリッドを顕微鏡に導入し、約－１７０℃の温度で細胞外小胞ＥＶを観察する。

【0037】

細胞外小胞の分離
容器４内で生産された細胞外小胞ＥＶを容器４の出口９を通して容器４から取り出し、液体培地５中に懸濁させることができる。出口９にフィルタ１８を配置して、容器４から細胞外小胞ＥＶを取り出す過程でマイクロキャリア３およびマイクロキャリア３に付着した生産用細胞６をろ過することができる。出口９にはコネクタ１３が流体連結されており、生産された細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５の輸送が可能である。

【0038】

流体システム１は細胞外小胞ＥＶの分離器１５を含み得る。分離器１５は分離器入口１０を含み、容器４の細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５を直接的に、または間接的に運搬することができる。分離器１５は第一の分離器出口１１を含んでもよく、液体培地５はそれを通って、細胞外小胞ＥＶの濃度が分離器１５の入口１０よりも低いか、場合によっては実質的にゼロである状態で分離器１５から出ることが可能である。分離器１５は第二の分離器１５の出口１２を含んでもよく、液体培地５はそこから、細胞外小胞ＥＶの濃度が分離器１５の入口１０よりも高い状態で分離器１５から出ることが可能である。

【0039】

一般的な方法では、小胞ＥＶが枯渇した液体培地５を例えば容器４の入口８から容器４内に再導入することができるように、細胞外小胞ＥＶの分離器１５を容器４と流体連結することができる。したがって、容器４内の液体培地５の体積を実質的に一定にして、細胞外小胞ＥＶの生産および／または取出しを連続的に実施することができる。

【0040】

図１に示される流体システム１の例示的実施形態では、液体培地５を第一のポンプ１６によりコネクタ１３を介して容器４から取り出して、液体培地５を収集器１９内に輸送することができる。第一のポンプ１６がもう１つあれば、もう１つのコネクタを介して、収集器１９に含まれる液体培地５を分離器１５の入口１０まで運搬することが可能になる。第一の分離器１５の出口１１は、細胞外小胞ＥＶが枯渇した液体培地５を容器４内に再導入するようコネクタを介して容器４と連結されている。第二の分離器１５の出口１２は、収集器１９に含まれる液体培地５の細胞外小胞ＥＶを増やすようコネクタを介して収集器１９と連結されている。あるいは、分離器１５の入口１０が容器４の出口９と直接（または第一のポンプ１６を介して）連結されていてもよい。第一の分離器１５の出口１１は容器４と連結され、第二の分離器１５の出口１２は収集器１９と連結されている。複数の分離器を直列に配置して液体培地５の細胞外小胞ＥＶ分離の程度を変化させ、かつ／または並列に配置して各分離器１５内の液体培地５の流速を第一のポンプ１６の流速に適合させてもよい。

【0041】

細胞外小胞ＥＶの生産に対する攪拌の影響
図２に、流体システム１において攪拌機７によって制御された様々な攪拌で生産された細胞外小胞ＥＶの数を示す。左側の縦軸は、容器４内で生産された細胞外小胞ＥＶの数に対応する。棒はそれぞれ、容器４内の攪拌機７の様々な回転速度での細胞外小胞ＥＶ生産量に対応する。右側の縦軸は、細胞外小胞ＥＶの生産時に攪拌機７によって生じ、式（１）、（２）および（３）によって算出された長さＬ_Ｋに対応する。容器４内で、１００ｍｌスピナフラスコに入れた５０ｍＬの液体培地５中３ｇ・Ｌ^－１の濃度のマイクロキャリア３を用いてＨＵＶＥＣ型生産用細胞６から細胞外小胞ＥＶを生産する。液体培地５の流れを制御することによって長さＬ_Ｋを３５μｍに等しくした場合（３００ＲＰＭの棒に対応する生産量）、細胞外小胞ＥＶの生産量が、これより攪拌が弱く、長さＬ_Ｋが７５μｍ、好ましくは５０μｍに等しい条件下での細胞外小胞ＥＶの生産量（１５０ＲＰＭの棒に対応する生産量）と比較して有意に高いことが観察される。

【0042】

図３に、流体システム１において攪拌機７によって制御された様々な攪拌で生産された細胞外小胞ＥＶの数を示す。ＨＵＶＥＣ型生産用細胞６が２０００万個使用され、１０００ｍＬスピナフラスコに入れた３５０ｍＬの液体培地５中３ｇ・Ｌ^－１の濃度のマイクロキャリア３が用いられている。左側の縦軸は、容器４内で生産された細胞外小胞ＥＶの数に対応する。棒はそれぞれ、容器４内の攪拌機７の様々な回転速度での細胞外小胞ＥＶ生産量に対応する。右側の縦軸は、細胞外小胞ＥＶの生産時に生じ、式（１）、（２）および（３）によって算出された長さＬ_Ｋに対応する。液体培地５の流れを制御することによって長さＬ_Ｋを４０μｍ未満にした場合、細胞外小胞ＥＶの生産量が、これより弱い攪拌条件下での細胞外小胞ＥＶの生産量（１２５ＲＰＭ、１５０ＲＰＭおよび１７５ＲＰＭの棒に対応する生産量）と比較して有意に高いことが観察される。

【0043】

図４に、流体システム１において攪拌機７によって制御された様々な攪拌で生産された細胞外小胞ＥＶの数を示す。ＭＳＣ型（間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）の頭字語）の生産用細胞６を使用し、５００ｍＬスピナフラスコに入れた２００ｍＬの液体培地５中３ｇ・Ｌ^－１の濃度でマイクロキャリア３を導入する。左側の縦軸は、容器４内で生産された細胞外小胞ＥＶの数に対応する。棒はそれぞれ、容器４内の攪拌機７の様々な回転速度での細胞外小胞ＥＶ生産量に対応する。右側の縦軸は、細胞外小胞ＥＶの生産時に生じ、式（１）、（２）および（３）によって算出された長さＬ_Ｋに対応する。液体培地５の流れを制御することによって長さＬ_Ｋを３５μｍに等しくした場合（１７５ＲＰＭの棒に対応する生産量）、細胞外小胞ＥＶの生産量が、これより攪拌が弱く、長さＬ_Ｋが５０μｍに等しい条件下での細胞外小胞ＥＶの生産量と比較して有意に高いことが観察される。

【0044】

図５に、コルモゴロフ長さＬ_Ｋが生産される細胞外小胞ＥＶの数に及ぼす影響を示す。長さＬ_Ｋは、細胞外小胞ＥＶの生産量に関する尺度母数である。四角形（ａ）は、様々な長さＬ_Ｋについて図２に示される細胞外小胞ＥＶの生産量に対応し、菱形（ｂ）は、様々な長さＬ_Ｋについて図３に示される細胞外小胞ＥＶの生産量に対応し、三角形（ｃ）は、様々な長さＬ_Ｋについて図４に示される細胞外小胞ＥＶの生産量に対応する。図５の図表から、Ｌ_Ｋに応じた細胞外小胞ＥＶ生産量の傾きの変化を特徴付け、実質的にＬ_Ｋ＝５０μｍに等しいＬ_Ｋの特性値が抽出される。したがって、５０μｍ以下のＬ_Ｋ値で細胞外小胞ＥＶの生産量が有意に増加する。

【0045】

図６に、細胞外小胞ＥＶの生産に相当する攪拌の前に液体培地５中に懸濁させたマイクロキャリア３、この場合はマイクロビーズ１４の表面に付着している生産用細胞６を示す。マイクロキャリア３の表面に付着している生産用細胞６が目で確認でき、定量化できる。

【0046】

図７に、細胞外小胞ＥＶの生産に相当する攪拌の後に液体培地５中に懸濁させたマイクロキャリア３、この場合はマイクロビーズ１４の表面に付着している生産用細胞６を示す。マイクロキャリア３の表面に付着している生産用細胞６が目で確認でき、定量化できる。細胞外小胞ＥＶを生産する攪拌の前と後でマイクロキャリア３の表面に付着している生産用細胞の数を比較することにより、既に記載した攪拌条件、例えば、長さＬ_Ｋが７５μｍ未満、好ましくは５０μｍ未満となる流れを生じさせる攪拌がマイクロキャリア３からの生産用細胞６の剥離を引き起こすことはないことを確認することができる。

【0047】

図８に、様々な攪拌持続時間、様々な生産用細胞および攪拌機７によって制御された流れの様々な長さＬ_Ｋに対応する様々な攪拌条件での細胞外小胞ＥＶの生産収率を示す。曲線（ａ）は、攪拌中の生産された粒子（細胞外小胞ＥＶを含む）の数の間および容器４内に導入された生産用細胞６の数の間の比の展開を示したものであり、生産用細胞６はマウスＭＳＣ型のものであり、液体培地５の流れは実質的に３５μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とするものである。曲線（ｂ）は、同じ展開を示したものであり、生産用細胞６はヒトＭＳＣ型のものであり、液体培地５の流れは実質的に３３μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とするものである。曲線（ｃ）は、同じ展開を示したものであり、生産用細胞６はＨＵＶＥＣ型のものであり、液体培地５の流れは実質的に３５μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とするものである。曲線（ｄ）は、同じ展開を示したものであり、生産用細胞６はヒトＭＳＣ型のものであり、液体培地５の流れは実質的に３５μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とするものである。曲線（ｅ）は、同じ展開を示したものであり、生産用細胞はＨＵＶＥＣ型のものであり、液体培地５の流れは実質的に５０μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とするものである。曲線（ｆ）は、同じ展開を示したものであり、生産用細胞はマウスＭＳＣ型のものであり、液体培地５の流れは実質的に５０μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とするものである。曲線（ｇ）は、同じ展開を示したものであり、生産用細胞６はヒトＭＳＣ型のものであり、液体培地５の流れは実質的に５０μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とするものである。曲線（ｈ）は、同じ展開を示したものであり、生産用細胞はマウスＭＳＣ型のものであり、液体培地５の流れは実質的に５３μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とするものである。このように、３０分より長い攪拌持続時間では、細胞外小胞ＥＶが既知のものより高い収率で生産される。

【0048】

図９に、様々な生産用細胞６および様々な攪拌条件での２４０分間の攪拌後の細胞外小胞ＥＶの生産収率を示す。左の４つの棒は、マウスＭＳＣ型生産用細胞６を用いた細胞外小胞ＥＶの生産収率を示す。５０μｍ（１番目の棒）、４７μｍ（２番目の棒）および３５μｍ（３番目の棒）の長さＬ_Ｋが得られる攪拌に対応する３種類の攪拌条件の生産収率が血清飢餓法（または血清除去法）による生産収率と比較されている。Ｌ_Ｋ＝４７μｍおよびＬ_Ｋ＝３５μｍの条件下の方が、Ｌ_Ｋ＝５０μｍの条件下および血清飢餓条件下よりも細胞外小胞ＥＶの生産収率が有意に高い。３つの棒は、ＨＵＶＥＣ型生産用細胞６を用いた細胞外小胞ＥＶの生産収率を示す。５０μｍ（４番目の棒）および４７μｍ（５番目の棒）の長さＬ_Ｋが得られる攪拌に対応する２種類の攪拌条件の生産収率が血清飢餓法による生産収率と比較されている。Ｌ_Ｋ＝３５μｍの条件下の方が、Ｌ_Ｋ＝５０μｍの条件下および血清飢餓条件下よりも細胞外小胞ＥＶの生産収率が高い。図の最も右側にある４つの棒は、ヒトＭＳＣ型生産用細胞６を用いた細胞外小胞ＥＶの生産収率を示す。５０μｍ（８番目の棒）、３５μｍ（９番目の棒）および３３μｍ（１０番目の棒）の長さＬ_Ｋが得られる攪拌に対応する３種類の条件の生産収率が血清飢餓法による生産収率と比較されている。Ｌ_Ｋ＝３５μｍおよびＬ_Ｋ＝３３μｍの条件下の方が、Ｌ_Ｋ＝５０μｍの条件下および血清飢餓条件下よりも細胞外小胞ＥＶの生産収率が有意に高い。

【0049】

図１０に、攪拌前および攪拌後にマイクロキャリア３上に付着していた生産用細胞６の濃度を様々な攪拌条件について示す。棒（ａ）は、細胞外小胞ＥＶを生産する攪拌の前（Ｊ０）および「強い」攪拌条件と呼ぶ攪拌条件下での、すなわち、長さＬ_Ｋ＝３５μｍを特徴とする流れが生じるよう攪拌機７を制御したときの攪拌の１日後（Ｊ１）の生産用細胞６の濃度に対応する。棒（ｂ）は、細胞外小胞ＥＶを生産する攪拌の前（Ｊ０）および「弱い」攪拌条件と呼ぶ攪拌条件下での、すなわち、長さＬ_Ｋ＝５０μｍを特徴とする流れが生じるよう攪拌機７を制御したときの攪拌の１日後（Ｊ１）の生産用細胞６の濃度に対応する。細胞外小胞ＥＶを生産するのに液体培地５を攪拌した後にも生産用細胞６の濃度の有意な低下はみられない。

【0050】

図１１に、細胞外小胞ＥＶを生産する攪拌条件下でのＨＵＶＥＣ型生産用細胞６の代謝活性を示す。１Ｌスピナフラスコ内で７５ＲＰＭで回転する攪拌機７によって液体培地５の攪拌を制御し、実質的に５０μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とする流れを２４０分間生じさせる。液体培地５中のアラマーブルー試薬が発光する波長の変化を観察することによって代謝を測定する。上記の攪拌条件下では、生産用細胞６の代謝の有意な低下はみられない。

【0051】

図１２に、細胞外小胞ＥＶを生産する攪拌条件下でのＨＵＶＥＣ型生産用細胞６の代謝を示す。１Ｌスピナフラスコ内で１２５ＲＰＭで回転する攪拌機７によって液体培地５の攪拌を制御し、実質的に３５μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とする流れを２４０分間生じさせる。液体培地５中のアラマーブルー試薬が発光する波長の変化を観察することによって代謝を測定する。２５０分間の攪拌後、生産用細胞６の代謝の低下または場合によっては消失さえみられる。しかし、この細胞代謝の低下は、攪拌時の細胞外小胞ＥＶの生産を妨げるものではない。

【0052】

図１３に、細胞外小胞ＥＶを生産する攪拌条件下でのＭＳＣ型生産用細胞６の代謝を示す。１Ｌスピナフラスコ内で７５ＲＰＭで回転する攪拌機７によって液体培地５の攪拌を制御し、実質的に５０μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とする流れを２４０分間生じさせる。液体培地５中のアラマーブルー試薬が発光する波長の変化を観察することによって代謝を測定する。上記の攪拌条件下では、生産用細胞６の代謝の有意な低下はみられない。

【0053】

図１４に、細胞外小胞ＥＶを生産する攪拌条件下でのＭＳＣ型生産用細胞６の代謝を示す。１Ｌスピナフラスコ内で１２５ＲＰＭで回転する攪拌機７によって液体培地５の攪拌を制御し、実質的に３５μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とする流れを２４０分間生じさせる。液体培地５中のアラマーブルー試薬が発光する波長の変化を観察することによって代謝を測定する。上記の攪拌条件下では、生産用細胞６の代謝の有意な低下はみられない。

【0054】

このように、実質的に５０μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とする流れを生じさせる攪拌に対応する弱い攪拌条件では、生産用細胞６を次の細胞外小胞ＥＶの生産に再利用することができる。

【0055】

図１５は、流体システム１によってマウスＭＳＣ細胞により生産した細胞外小胞ＥＶの顕微鏡写真である。スケールバーは２００ｎｍの長さに対応する。透過型電子クライオ顕微鏡法（クライオ－ＴＥＭ）の技術を用いて顕微鏡写真法を実施する。

【0056】

図１６に、流体システム１によって生産した細胞外小胞ＥＶのクライオ－ＴＥＭにより測定した直径の分布を示す。分布（ａ）は、実質的に３５μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とする流れを生じさせる攪拌（強い攪拌条件）を用い、マウスＭＳＣ細胞により生産した細胞外小胞ＥＶに対応する。分布（ｂ）は、実質的に５０μｍに等しい長さＬ_Ｋを特徴とする流れを生じさせる攪拌（弱い攪拌条件）を用いて生産した細胞外小胞ＥＶに対応する。弱い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶの直径中央値の方が、強い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶの直径中央値よりも大きい。細胞外小胞ＥＶの大きさは、実質的に３０～５００ｎｍであると思われる。

【0057】

図１７に、粒子の数とマイクログラムで表したタンパク質の質量との間の比によって示される、液体培地５中で流体システム１によって生産した細胞外小胞ＥＶの純度を示す。細胞外小胞ＥＶの生産過程では、生産用細胞６によって様々な物質、この場合は細胞外小胞ＥＶのほかにタンパク質凝集体も生産され得る。個々の粒子を追跡する解析（またはナノ粒子トラッキング解析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を表すＮＴＡ）により粒子を定量化しても、これらの様々な物質を識別することは不可能であり、また、ＮＴＡによって測定した粒子の数と生産されたタンパク質の質量との間の比を定量化して細胞外小胞ＥＶの純度を定めるのが有利である。図１７に示される棒（ａ）は、マウスＭＳＣ型生産用細胞６による細胞外小胞ＥＶの生産に対応し、棒（ｂ）は、ヒトＭＳＣ型生産用細胞６による細胞外小胞ＥＶの生産に対応する。左の２つの棒は強い攪拌条件下での細胞外小胞ＥＶの生産に対応し、右の２つの棒は血清飢餓法による細胞外小胞ＥＶの生産に対応する。生産後に得られた培地の細胞外小胞ＥＶの純度は２つの方法で同程度であった。

【0058】

図１８に、流体システム１によってマウスＭＳＣ細胞により生産した細胞外小胞ＥＶを含み、血清を含まない液体培地５の血管新生促進特性を示す。図１８のパネルＡは、ＨＵＶＥＣ型細胞が付着している表面の写真である。表面の一部分（写真中央の細胞のない領域）から細胞が除去されている。この写真は実験開始時に撮影したものであり、この時間ｔ＝０時間では、細胞が流体システム１によって生産された細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５で覆われている。図１８のパネルＢは、細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中で４時間インキュベートした後の同じ表面の写真である。図１８のパネルＣは、細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中で９時間インキュベートした後の同じ表面の写真である。実験の過程で、ＨＵＶＥＣ型細胞が、表面の実験開始時に細胞が存在しなかった部分を覆っている。したがって、細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５には、血管新生促進特性および／または増殖促進特性がある。

【0059】

図１９に、流体システム１によって様々な条件下でマウスＭＳＣ細胞により生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５の血管新生促進特性を示す。各棒は、各インキュベーション条件について０時間（図１８のパネルＡに対応する）～９時間（図１８のパネルＣに対応する）の周縁部の閉鎖の割合を正規化したものを示す。１番目の棒（「完全培地」）は、ＨＵＶＥＣ細胞培地中でのインキュベーションに対応する（陽性対照に対応する）。２番目の棒（「陰性対照」）は、細胞外小胞ＥＶも血清も含まず、所与の体積のＰＢＳを加えた液体培地５（培地）中でのインキュベーションに対応する。３番目の棒（「強い攪拌１０／１」）は、流体システム１によって強い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含み、同じ所与の体積のＰＢＳを加えた液体培地５中でのインキュベーションに対応し、導入した生産用細胞６の量は、１個の受容ＨＵＶＥＣ細胞に対し１０個のマウスＭＳＣ生産用細胞６に相当する。４番目の棒（「弱い攪拌１０／１」）は、流体システム１によって弱い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含み、同じ所与の体積のＰＢＳを加えた培地５中でのインキュベーションに対応し、導入した生産用細胞６の量は、１個の受容ＨＵＶＥＣ細胞に対し１０個のマウスＭＳＣ生産用細胞６に相当する。５番目の棒（「ｌｉｂ １０／１」）は、エキソソームが枯渇したＨＵＶＥＣ細胞培地中でのインキュベーションに対応し、導入した生産用細胞６の量は、１個の受容ＨＵＶＥＣ細胞に対し１０個の生産用細胞６に相当する。６番目の棒（「ストレス１０／１」）は、血清飢餓法によって生産した細胞外小胞ＥＶを含み、同じ所与の体積のＰＢＳを加えた液体培地５中でのインキュベーションに対応し、導入した生産用細胞６の量は、１個の受容ＨＵＶＥＣ細胞に対し１０個のマウスＭＳＣ生産用細胞６に相当する。強い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中でのインキュベーション（「強い攪拌１０／１」）により、最初は細胞がなかった部分を有意に覆うことが可能である。

【0060】

図２０に、様々な液体培地中で１日間インキュベートした後、インキュベーション培地に含まれるアラマーブルーにより測定した心筋細胞の増殖を示す。１番目の棒は、Ｈ９Ｃ２心筋細胞の培養に適合した培地（「完全培地」、陽性対照）中でのインキュベーションに対応する。２番目の棒は、ＰＢＳ中でのインキュベーションに対応する。３番目の棒は、流体システム１によって強い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中でのインキュベーションに対応し（「強い攪拌１０／１」）、導入した生産用細胞６の量は、１個の受容細胞に対し１０個の生産用細胞６に相当する。４番目の棒は、流体システム１によって弱い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中でのインキュベーションに対応し（「弱い攪拌１０／１」）、導入した生産用細胞６の量は、１個の受容細胞に対し１０個の生産用細胞６に相当する。５番目の棒は、エキソソームが枯渇した心筋細胞培地中でのインキュベーションに対応し（「ｌｉｂ １０／１」）、導入した生産用細胞６の量は、１個の受容細胞に対し１０個の生産用細胞６に相当する。６番目の棒は、血清を含まない培地での生産方法によって生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中でのインキュベーション「ストレス」に対応し、導入した生産用細胞６の量は、１個の受容細胞に対し１０個の生産用細胞６に相当する。流体システム１によって強い攪拌条件下および／または弱い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５でのインキュベーション条件では、心筋細胞の増殖がＰＢＳでのインキュベーション条件ならびに「エキソ」条件下および「ストレス」条件下よりも有意に高くなる。

【0061】

図２１に、２日間インキュベートした後のＨ９Ｃ２心筋細胞の増殖を示す。弱い攪拌条件下、強い攪拌条件下で流体システム１によって、およびエキソソームが枯渇した完全培地中での自発的放出によってマウスＭＳＣ型生産用細胞６から生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中でインキュベートした心筋細胞の方が、血清飢餓状態の培地でインキュベートした心筋細胞よりも有意に多く増殖する。弱い攪拌条件下および強い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中でインキュベートした心筋細胞の方が、血清飢餓状態の培地中でインキュベートした心筋細胞よりも有意に多く増殖する。

【0062】

図２２に、流体システム１によって生産した細胞外小胞ＥＶを異なる濃度で含む液体培地５でのインキュベーションについて、投与量がＨ９Ｃ２心筋細胞の増殖に及ぼす効果を示す。液体培地中で２日間インキュベートした後の心筋細胞代謝活性をアラマーブルーにより測定する。３種類のインキュベーション条件、すなわち、（ａ）の弱い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中、（ｂ）の弱い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含む液体培地５中および（ｃ）の血清飢餓状態の液体培地中という条件について心筋細胞の代謝を測定する。曲線（ａ）および（ｂ）の心筋細胞の代謝の測定は、横軸に示される細胞外小胞ＥＶの濃度と心筋細胞の濃度との間の比を変えて実施する。曲線（ａ）は、細胞外小胞ＥＶの存在下で投与量が増殖に及ぼす効果を示しており、細胞外小胞ＥＶと心筋細胞との間の濃度比が増大すると心筋細胞の代謝が増大する。

【0063】

図２３に、マウスＭＳＣ細胞の細胞外小胞ＥＶを心筋細胞１個当たり細胞外小胞ＥＶ １０００００個の濃度で含む液体培地５の存在下で２日間インキュベートした後の心筋細胞の増殖を示す。２日後の心筋細胞の増殖は、液体インキュベーション培地５が流体システム１によって強い攪拌条件下または弱い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含む場合の方が、血清飢餓によって得た細胞外小胞ＥＶを含む液体培地および／またはエキソソームが枯渇した完全培地での自発的放出によって得た細胞外小胞ＥＶを含有する心筋細胞培地よりも有意に高い。

【0064】

図２４に、流体システム１によって生産した細胞外小胞ＥＶの組成物の医薬組成物としての使用を示す。１群のラットの各個体に盲腸瘻造設術を施術する。３種類の条件下、すなわち、対照条件下、各マウスの瘻開口部にポロキサマー４０７を含むゲルを塗布することによる治療に対応する条件下（「ゲル」）および本発明の方法による流体システム１によって、例えば強い攪拌条件下で生産した細胞外小胞ＥＶを含むこのゲルを塗布することに対応する条件下（「ゲル＋小胞」）で、盲腸瘻造設術によって形成された瘻の開口部の糞便の存在を観察する。明灰色の棒は、糞便がみられた瘻開口部に対応し、暗灰色の棒は、糞便がみられなかった瘻開口部に対応する。細胞外小胞ＥＶを含むゲルの塗布によって、上記の条件下での瘻開口部の糞便の存在を有意に減少させることができ、（腸分泌物を放出する）産生量の多い瘻の場合、対照および小胞を含まないゲルのグループよりも減少する。したがって、流体システム１によって生産した細胞外小胞ＥＶの組成物を再生医療に使用することができる。

【0065】

図２５に、流体システム１によって生産した細胞外小胞ＥＶの組成物の医薬組成物としての使用を示す。図２４に示される観察結果からスコアを算出する。瘻開口部に糞便がある場合、１に等しいスコアを割り当て、瘻開口部に糞便がない場合、０に等しいスコアを割り当てる。図２５には、全盲腸瘻造設術ならびに対照、「ゲル」および「ゲル＋小胞」の各条件について平均スコアが示されている。細胞外小胞ＥＶを含むゲルの塗布により、瘻の平均産生能スコアが対照および小胞を含まないゲルのグループと比較して減少し、上記の条件での瘻開口部の糞便の存在が有意に減少する。したがって、流体システム１によって生産した細胞外小胞ＥＶの組成物を再生医療に使用することができる。

【0066】

図２６に、本発明による方法によって生産した細胞外小胞のプロテオミクスプロファイルを先行技術による従来の生産方法によって生産した細胞外小胞と比較したもの、より具体的には、細胞外小胞の特徴付けに従来用いられているマーカーのプロテオミクスプロファイルを示す。４種類の異なる生産方法によって得た細胞外小胞のプロテオミクスプロファイルを比較した。フラスコで７２時間わたって血清除去により生産する方法（２Ｄ）、バイオリアクタで７２時間にわたって血清除去により生産する方法（３Ｄ）、５０μｍに等しいコルモゴロフ長さを特徴とする中速バイオリアクタで４時間にわたって生産する方法（ＭＳ）および３５μｍに等しいコルモゴロフ長さを特徴とする高速バイオリアクタで４時間にわたって生産する方法（ＨＳ）。

【0067】

このように、細胞外小胞の特徴付けに従来用いられている生物学的マーカーの存在が観察された。本発明の方法または従来の生産方法によって生産した細胞外小胞の間で共通するマーカー（ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、ｌａｍｐ２およびＴＳＧ１０１）の有無および量はほぼ同じである。結論として、本発明による方法によって生産される細胞外小胞は、先行技術の方法によって生産される細胞外小胞とほぼ同じプロテオミクスプロファイルを有する。細胞外小胞の特徴付けに従来用いられているマーカーの有無および量によって特徴付けられるプロテオミクスプロファイルはほぼ同じプロテオミクスプロファイルであると考えられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】