特許7281795膵炎および疼痛をデス受容体アゴニストで処置するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-18
(45)【発行日】2023-05-26
(54)【発明の名称】膵炎および疼痛をデス受容体アゴニストで処置するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/19 20060101AFI20230519BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20230519BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20230519BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230519BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20230519BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20230519BHJP
【ＦＩ】
A61K38/19 ZNA
A61K47/60 ZMD
A61P1/18
A61P29/00
C07K16/28
C07K16/46
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2018552212
(86)(22)【出願日】2017-04-07
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-04-25
(86)【国際出願番号】 US2017026617
(87)【国際公開番号】W WO2017177148
(87)【国際公開日】2017-10-12
【審査請求日】2020-03-24
(31)【優先権主張番号】62/319,454
(32)【優先日】2016-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】398076227
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(72)【発明者】
【氏名】リー， ソルキ
(72)【発明者】
【氏名】ポンパー， マーティン ジー．
(72)【発明者】
【氏名】パク， オギ
(72)【発明者】
【氏名】スヴィエルシェヴスキ， マグダレーナ
(72)【発明者】
【氏名】パスリチャ パンカジ ジェイ．
【審査官】菊池 美香
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／１６４２１７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】膵臓、２００８、Ｖｏｌ．２３，第１２４－１３１頁
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／１９
Ａ６１Ｋ ４７／６０
Ａ６１Ｐ １／１８
Ａ６１Ｐ ２９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
急性膵炎の１つまたは複数の症状を処置するための組成物であって、前記組成物は、デス受容体アゴニストを含み、前記処置は、急性膵炎の１つまたは複数の症状に罹患しているかまたは罹患する危険性がある対象に、前記組成物が、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とし、ここで、前記デス受容体アゴニストが、ＴＲＡＩＬまたはポリアルキレンオキシドで修飾されたＴＲＡＩＬである、組成物。
【請求項2】
前記ポリアルキレンオキシドが、５，０００～５０，０００ダルトンの間の分子量を有する、直鎖、分岐鎖、ダイマーまたはトリマーのポリエチレングリコールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記組成物が、注射を介して、鼻腔内、または肺に投与されることを特徴とする、請求項１から２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項4】
前記組成物が、膵組織を保護し、かつ／または疼痛を低減し、健康な膵組織を傷付けない、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
急性膵炎の１つまたは複数の症状を処置することが、疼痛を低減させることを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
急性膵炎の１つまたは複数の症状を処置することが、膵炎症を低減させることを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記組成物の前記有効量が、必要とする前記対象に、１日１回、１日２回、１日３回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回または１ヶ月に１回投与されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物が、０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記組成物が４ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
急性膵炎の１つまたは複数の症状の処置のための医薬の製造における、有効量のデス受容体アゴニストを含む、医薬組成物の使用であって、ここで、前記デス受容体アゴニストが、ＴＲＡＩＬまたはポリアルキレンオキシドで修飾されたＴＲＡＩＬである、使用。
【請求項11】
前記医薬組成物がさらに第２の治療剤、予防剤または診断剤を含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
急性膵炎の１つまたは複数の症状の処置において使用される場合の、デス受容体アゴニストを単独でまたは第２の治療剤と組み合わせて含む組成物の投薬単位を含む、急性膵炎の１つまたは複数の症状を処置するためのキットであって、ここで、前記デス受容体アゴニストが、ＴＲＡＩＬまたはポリアルキレンオキシドで修飾されたＴＲＡＩＬである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年４月７日に出願された米国仮出願番号第６２／３１９，４５４号の利益および優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に本明細書によって援用される。
本出願は、２０１６年４月７日に出願された米国仮出願番号第６２／３１９，４５４号の利益および優先権を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に本明細書によって援用される。
【0002】
連邦政府によって支援された研究または開発に関する陳述
本発明は、国防総省（ＤＯＤ）によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１５－１－０３０１およびＷ８１ＸＷＨ－１５－１－０３０２、ならびに国立衛生研究所によって授与されたＲ２１ＡＡ０２３８５５の下、政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有している。
本発明は、国防総省（ＤＯＤ）によって授与されたＷ８１ＸＷＨ－１５－１－０３０１およびＷ８１ＸＷＨ－１５－１－０３０２、ならびに国立衛生研究所によって授与されたＲ２１ＡＡ０２３８５５の下、政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有している。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合する能力によって特徴付けられる、一群のサイトカイン受容体である。神経成長因子（ＮＧＦ）を除いて、全てのＴＮＦは、原型ＴＮＦ－アルファと相同である。それらの活性形態では、ＴＮＦ受容体の大部分は、原形質膜中でトリマー性複合体を形成する。従って、ほとんどのＴＮＦ受容体は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含有するが、一部は、可溶性形態へと切断され得（例えば、ＴＮＦＲ１）、一部は、ＴＭＤを完全に欠く（例えば、ＤｃＲ３）。さらに、ほとんどのＴＮＦ受容体は、下流のシグナル伝達のために、特異的アダプタータンパク質、例えば、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ、ＲＩＰおよびＦＡＤＤを必要とする。ＴＮＦ受容体は主に、アポトーシスおよび炎症に関与するが、増殖、生存および分化などの他のシグナル伝達経路にも参加し得る。ＴＮＦ受容体は、哺乳動物中の広範な種々の組織、特に白血球において発現される。
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、細胞外システインリッチドメインを介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を結合する能力によって特徴付けられる、一群のサイトカイン受容体である。神経成長因子（ＮＧＦ）を除いて、全てのＴＮＦは、原型ＴＮＦ－アルファと相同である。それらの活性形態では、ＴＮＦ受容体の大部分は、原形質膜中でトリマー性複合体を形成する。従って、ほとんどのＴＮＦ受容体は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含有するが、一部は、可溶性形態へと切断され得（例えば、ＴＮＦＲ１）、一部は、ＴＭＤを完全に欠く（例えば、ＤｃＲ３）。さらに、ほとんどのＴＮＦ受容体は、下流のシグナル伝達のために、特異的アダプタータンパク質、例えば、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ、ＲＩＰおよびＦＡＤＤを必要とする。ＴＮＦ受容体は主に、アポトーシスおよび炎症に関与するが、増殖、生存および分化などの他のシグナル伝達経路にも参加し得る。ＴＮＦ受容体は、哺乳動物中の広範な種々の組織、特に白血球において発現される。
【0004】
用語デス受容体とは、デスドメインを含有するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー、例えば、ＴＮＦＲ１、Ｆａｓ受容体、ＤＲ４およびＤＲ５を指す。これらは、アポトーシス（プログラム細胞死）におけるそれらの役割にちなんで名づけられたが、他の機能を有することが現在公知である。
【0005】
用語ＴＮＦ受容体は、ＴＮＦ－アルファを認識するスーパーファミリーの原型メンバー、即ち、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を指すために使用される場合が多い。腫瘍壊死因子受容体１、腫瘍壊死因子受容体２、リンホトキシンベータ受容体、ＯＸ４０、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体、デコイ受容体３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、デス受容体４（ＤＲ４）、デス受容体５（ＤＲ５）、デコイ受容体１、デコイ受容体２、ＲＡＮＫ、オステオプロテジェリン、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ受容体、ヘルペスウイルス侵入メディエーター、神経成長因子受容体、Ｂ細胞成熟抗原、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連、ＴＲＯＹ、デス受容体６、デス受容体３およびエクトジスプラシンＡ２受容体を含む２７のファミリーメンバーが存在する。
【0006】
急性または慢性の膵炎は、いくつかの調査によれば、米国において「胃腸疾患の負担」への重要な寄与因子である。慢性膵炎（ＣＰ）は、アルコール乱用の重篤な結果であり、膵臓の構造および機能の進行性の不可逆的な破壊によって特徴付けられる。ＣＰは、膵線維症および絶え間ない腹部痛を伴う。ＣＰにおける疼痛は、処置が非常に困難である。根底にある生物学についての理解の欠如が、純粋に解剖学的な基礎に基づくことが多く、一般に高度に侵襲性である、種々の経験的アプローチをもたらしてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
従って、膵炎を処置する治療戦略の、実質的に満たされていない要求が存在する。
【0008】
本発明の目的は、膵炎、膵線維症および膵臓痛を処置するための組成物を提供することである。
【0009】
本発明の別の目的は、膵炎、膵線維症および膵臓痛を処置するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
発明の要旨
膵炎および関連の障害、例えば疼痛を、デス受容体アゴニスト、例えば、組換えヒトＴＲＡＩＬアナログまたは抗デス受容体５（ＤＲ５）アゴニスト抗体で処置する方法が開発された。組換えＴＮＦ（腫瘍壊死因子）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）アナログおよび抗ＤＲ５抗体は、それを必要とする個体において、活性化された膵星細胞を選択的に標的化し、炎症、線維化および疼痛を低減させ、急性および慢性の膵炎において膵機能を改善する。
膵炎および関連の障害、例えば疼痛を、デス受容体アゴニスト、例えば、組換えヒトＴＲＡＩＬアナログまたは抗デス受容体５（ＤＲ５）アゴニスト抗体で処置する方法が開発された。組換えＴＮＦ（腫瘍壊死因子）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）アナログおよび抗ＤＲ５抗体は、それを必要とする個体において、活性化された膵星細胞を選択的に標的化し、炎症、線維化および疼痛を低減させ、急性および慢性の膵炎において膵機能を改善する。
【0011】
膵炎または膵臓痛を処置し、膵機能を改善する方法は、膵炎、膵線維症もしくは障害、例えば、膵臓痛に罹患しているかまたは罹患する危険性がある対象に、有効量のデス受容体アゴニストを含有する医薬組成物を投与するステップを含む。適切なデス受容体アゴニストには、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２（デス受容体５）アゴニスト、例えば、組換えヒト（ｒｈ）ＴＲＡＩＬ、ｒｈＴＲＡＩＬアナログ、操作されたＴＲＡＩＬアナログ、例えば、ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）、コポリマーおよび分岐鎖アナログ、ならびにバイオポリマー、例えばヒアルロン酸で修飾された長時間作用性ＴＲＡＩＬタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。ＴＲＡＩＬベースの長時間作用性製剤は、ＴＲＡＩＬ融合タンパク質、アゴニスト抗ＴＲＡＩＬ－Ｒ２抗体、およびアゴニスト小分子またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２を結合するペプチド分子を含む。ＤＲ４ではなくＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）は、実施例３で実証されるように、活性化された膵星細胞において選択的アポトーシスを誘導する主要な受容体である。
【0012】
好ましい実施形態では、ＴＲＡＩＬは、ｒｈＴＲＡＩＬ（即ち、組換えヒトＴＲＡＩＬ）、またはその機能的断片もしくはバリアント、例えば、２８１アミノ酸のヒトＴＲＡＩＬの断片である。好ましい実施形態では、断片は、全長２８１アミノ酸のヒト形態の１１４～２８１または９５～２８１のアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、長時間作用性ｒｈＴＲＡＩＬは、ＰＥＧ化腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）タンパク質、ＰＥＧ化ＴＲＡＩＬ誘導体、またはそれらの任意の組合せである。好ましい実施形態では、抗デス受容体抗体は、抗デス受容体５アゴニスト抗体である。例示的な態様では、デス受容体アゴニストは、ＰＥＧ化ＴＲＡＩＬアナログおよび抗ＤＲ５アゴニスト抗体を含む。
【0013】
デス受容体アゴニストおよび１つもしくは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分またはその誘導体もまた、本明細書で提供される。一部の場合には、デス受容体アゴニストには、ＰＥＧ化ＴＲＡＩＬアナログまたはその誘導体が含まれる。
【0014】
一態様では、ＰＥＧ部分または誘導体は、直鎖ＰＥＧ、分岐鎖ＰＥＧ、星型ＰＥＧ、櫛型ＰＥＧ、デンドリマー性ＰＥＧ、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ＰＥＧ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、直鎖メトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ）、分岐鎖ｍＰＥＧ、星型ｍＰＥＧ、櫛型ｍＰＥＧ、デンドリマー性ｍＰＥＧ、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧプロピオンアルデヒドおよびｍＰＥＧマレイミドからなる群から選択される。一部の場合には、分岐鎖ＰＥＧ部分または誘導体には、モノマー性、ダイマー性および／もしくはトリマー性のＰＥＧ部分、またはそれらの誘導体が含まれる。一部の場合には、ＰＥＧ部分または誘導体は、トリマー性メトキシポリエチレングリコールマレイミドである。
【0015】
ＰＥＧ部分は、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量スペクトルによって測定した場合、少なくとも１，０００ダルトンの分子量を有する。一部の場合には、ＰＥＧ部分には、約１，０００～１，０００，０００ダルトンの間の平均分子量、約１０，０００～５００，０００ダルトンの間の平均分子量、約１，０００～１００，０００ダルトンの間、最も好ましくは５，０００～５０，０００ダルトンの間の平均分子量を有するＰＥＧ部分が含まれる。他の場合には、ＰＥＧ部分には、約２０，０００～２５０，０００ダルトンの間の平均分子量、約３０，０００～１００，０００ダルトンの間の平均分子量を有するＰＥＧ部分、または約４０，０００～８０，０００ダルトンの間の平均分子量を有するＰＥＧ部分が含まれる。
【0016】
コナツムマブ、ティガツズマブ、レクサツムマブ（lexatumuman）、ＨＧＳ－ＴＲ２Ｊ／ＫＭＴＲ－２、ＬＢＹ１３５、ドロジツマブ、ＴＡＳ２６６、ＤＳ－８２７３／ＤＳ－８２７３ａ、ＡＰＧ８８０またはＲＧ７３８６である抗ＤＲ５を含有する組成物もまた提供される。
【0017】
例示的な疾患または障害には、急性または慢性の膵炎、膵炎関連痛および膵線維症、ならびに線維症関連痛が含まれる。一部の場合には、膵線維症には、膵臓中の腫瘍微小環境における線維増生が含まれる。例示的な実施形態では、線維性障害は、線維症関連痛である。一部の場合には、方法は、線維症関連痛に罹患しているまたはそれを発症する危険性がある患者を同定するステップをさらに含む。
【0018】
適切な投与様式には、静脈内および皮下を含む注射によるもの、吸入、肺、経鼻、ならびにおそらくは眼内が含まれる。組成物は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。好ましくは、組成物は、０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの間の用量、または０．００１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される。製剤は、膵組織が保護され、線維形成が低減され、膵線維化が反転し、疼痛が低減され、健康な膵組織が無傷であるように、有効な投薬量および期間で投与される。一態様では、線維性疾患または障害を処置することは、炎症を低減させることを含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
膵炎または膵臓痛障害に罹患しているかまたは罹患する危険性がある対象に、デス受容体アゴニストを含む組成物の有効量を投与するステップを含む、膵炎または膵臓痛障害を処置する方法。
（項目２）
前記デス受容体アゴニストが、組換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）タンパク質、ＴＲＡＩＬアナログ、ＰＥＧ化ＴＲＡＩＬ、デス受容体（ＤＲ５）アゴニスト抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択されるアゴニストを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記デス受容体アゴニストが、レクサツムマブ、ティガツズマブ、コナツムマブ、ドロジツマブ、ＨＧＳＴＲ２Ｊ／ＫＭＴＲＳおよびＬＢＹ－１３５からなる群から選択されるＤＲ５アゴニストを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記デス受容体アゴニストが、ＴＡＳ２６６およびｓｃＴＲＡＩＬ－ＲＢＤからなる群から選択される多価ＤＲアゴニストを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記抗体が、全長抗体、結合機能性を保持するその機能的断片、ヒト化抗体、二機能性もしくはキメラ抗体、またはそれらの組合せである、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記アゴニストが、ＴＲＡＩＬまたはポリアルキレンオキシドで修飾されたＴＲＡＩＬである、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記ポリアルキレンオキシドが、５，０００～５０，０００ダルトンの間の分子量を有する、直鎖、分岐鎖、ダイマーまたはトリマーのポリエチレングリコールである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記膵炎または膵臓痛障害が、膵炎および膵線維症関連痛からなる群から選択される、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記膵炎が、急性膵炎および慢性膵炎からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記膵線維症関連痛が膵炎関連痛である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
線維症関連痛に罹患しているかまたはそれを発症する危険性がある患者を同定するステップをさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記膵炎が慢性膵炎である、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記組成物が、注射を介して、鼻腔内、肺または眼内に投与される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
膵組織が保護され、線維形成が低減され、膵線維化が反転し、かつ／または疼痛が低減され、健康な膵組織が無傷である、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
膵炎または膵臓痛障害を処置することが、疼痛を低減させることを含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
膵炎または膵臓痛障害を処置することが、膵線維症を低減させることを含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
膵炎または膵臓痛障害を処置することが、膵炎症を低減させることを含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
組成物の前記有効量が、それを必要とする個体に、１日１回、１日２回、１日３回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回または１ヶ月に１回投与される、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
膵炎または膵臓痛障害を処置するための有効量のデス受容体アゴニストを含む、医薬組成物。
（項目２０）
第２の治療剤、予防剤または診断剤を含む、項目１９に記載の医薬組成物。
（項目２１）
デス受容体アゴニストを単独でまたは第２の治療剤と組み合わせて含む組成物の投薬単位を含む、キット。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
膵炎または膵臓痛障害に罹患しているかまたは罹患する危険性がある対象に、デス受容体アゴニストを含む組成物の有効量を投与するステップを含む、膵炎または膵臓痛障害を処置する方法。
（項目２）
前記デス受容体アゴニストが、組換えヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）タンパク質、ＴＲＡＩＬアナログ、ＰＥＧ化ＴＲＡＩＬ、デス受容体（ＤＲ５）アゴニスト抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択されるアゴニストを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記デス受容体アゴニストが、レクサツムマブ、ティガツズマブ、コナツムマブ、ドロジツマブ、ＨＧＳＴＲ２Ｊ／ＫＭＴＲＳおよびＬＢＹ－１３５からなる群から選択されるＤＲ５アゴニストを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記デス受容体アゴニストが、ＴＡＳ２６６およびｓｃＴＲＡＩＬ－ＲＢＤからなる群から選択される多価ＤＲアゴニストを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記抗体が、全長抗体、結合機能性を保持するその機能的断片、ヒト化抗体、二機能性もしくはキメラ抗体、またはそれらの組合せである、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記アゴニストが、ＴＲＡＩＬまたはポリアルキレンオキシドで修飾されたＴＲＡＩＬである、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記ポリアルキレンオキシドが、５，０００～５０，０００ダルトンの間の分子量を有する、直鎖、分岐鎖、ダイマーまたはトリマーのポリエチレングリコールである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記膵炎または膵臓痛障害が、膵炎および膵線維症関連痛からなる群から選択される、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記膵炎が、急性膵炎および慢性膵炎からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記膵線維症関連痛が膵炎関連痛である、項目８に記載の方法。
（項目１１）
線維症関連痛に罹患しているかまたはそれを発症する危険性がある患者を同定するステップをさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記膵炎が慢性膵炎である、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記組成物が、注射を介して、鼻腔内、肺または眼内に投与される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
膵組織が保護され、線維形成が低減され、膵線維化が反転し、かつ／または疼痛が低減され、健康な膵組織が無傷である、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
膵炎または膵臓痛障害を処置することが、疼痛を低減させることを含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
膵炎または膵臓痛障害を処置することが、膵線維症を低減させることを含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
膵炎または膵臓痛障害を処置することが、膵炎症を低減させることを含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
組成物の前記有効量が、それを必要とする個体に、１日１回、１日２回、１日３回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回または１ヶ月に１回投与される、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
膵炎または膵臓痛障害を処置するための有効量のデス受容体アゴニストを含む、医薬組成物。
（項目２０）
第２の治療剤、予防剤または診断剤を含む、項目１９に記載の医薬組成物。
（項目２１）
デス受容体アゴニストを単独でまたは第２の治療剤と組み合わせて含む組成物の投薬単位を含む、キット。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、膵炎モデルにおける、デス受容体（ＤＲ）アゴニスト、例えば、ＴＲＡＩＬアナログまたは抗ＤＲアゴニスト抗体の役割を示す模式図である。デス受容体アゴニストは、他の組織を無傷なままにしつつ、膵臓中の活性化された膵星細胞（ＰＳＣ）を選択的に標的化する。活性化されたＰＳＣは、膵線維症および疼痛の本元の１つである。ＰＳＣ活性化を選択的に遮断することおよび／または活性化されたＰＳＣを根絶することによって、デス受容体アゴニストは、線維症および疼痛を低減させ、膵組織の修復をもたらす。
【図2】図２は、初代ヒト島およびラット腺房細胞のパーセント細胞生存度（％）を示す棒グラフであり、このとき、細胞は、１０、１００、１，０００ｎｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬＰＥＧで処理される。初代ヒト島および膵腺房細胞を含む正常膵細胞に対する毒性は、検出されなかった。ＴＲＡＩＬＰＥＧ（１０、１００、１，０００ｎｇ／ｍＬ）を、種々の細胞と共に２４時間インキュベートし、細胞死をＭＴＴアッセイによって定量化した。
【図3】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅおよび３Ｆは、培養の２、４および７日目の、培養により活性化された初代ヒトＰＳＣによる示された遺伝子の相対的発現を示す棒グラフである。培養により活性化された初代ヒトＰＳＣは、Ａｃｔａ２（α－ＳＭＡ、活性化された星細胞のマーカー）、線維形成マーカーおよびＴＲＡＩＬ受容体（ＤＲ５／ＤＲ４）を上方調節し、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して高度に感受性になる。静止状態（２日目）および活性化されたＰＳＣ（４日目および７日目）のｑＰＣＲ分析。２日目に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5】図５は、培養により活性化されたＰＳＣを、示された濃度のマパツズマブ（抗ＤＲ４アゴニスト抗体、０～１０３ｎｇ／ｍＬ）またはコナツムマブ（抗ＤＲ５アゴニスト抗体、０～１０３ｎｇ／ｍＬ）で処理したときの、カスパーゼ３／７（アポトーシスマーカー）活性変化（倍）を示す棒グラフである。コナツムマブのみが、活性化されたＰＳＣにおいてアポトーシスを誘導する。これは、ＤＲ４ではなくＤＲ５が、活性化された星細胞におけるＴＲＡＩＬシグナル伝達において重要な役割を果たすことを示している。未処理のＰＳＣに対して＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図6】図６Ａおよび６Ｂは、ＰＥタグ化デス受容体抗体を使用するフローサイトメトリーによって測定した、静止状態ＰＳＣ（２日目）および活性化されたＰＳＣ（７日目）の細胞膜上でのＤＲ４またはＤＲ５の発現プロファイルを示すグラフである。ＤＲ５は、ＤＲ４と比較して、活性化されたＰＳＣの細胞表面上で優勢に発現される。
【図7】図７Ａ～７Ｅは、エタノール（ＥｔＯＨ）で活性化された初代ヒトＰＳＣが、Ａｃｔａ２（α－ＳＭＡ、活性化された星細胞のマーカー）、線維形成マーカーおよびＴＲＡＩＬ受容体（ＤＲ５／ＤＲ４）を上方調節することを示す棒グラフである。図３は、ＥｔＯＨ（３０および５０ｍＭ）によって活性化されたＰＳＣのｑＰＣＲ分析を示す。ＥｔＯＨで活性化されていないＰＳＣに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図8】図８Ａおよび８Ｂは、ＥｔＯＨ（５０ｍＭ）で活性化されたＰＳＣをＴＲＡＩＬＰＥＧ（１μｇ／ｍＬ）で処理した後の、ＭＴＴアッセイによって定量化した細胞生存度（％）、およびカスパーゼ３／７活性（アポトーシスマーカー）相対比を示す棒グラフである。アルコールで活性化されたＰＳＣのみが、ＴＲＡＩＬ誘導性細胞死に対して感受性である。ＥｔＯＨで活性化されていないＰＳＣに対して＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図9】図９は、ＥｔＯＨ（５０ｍＭ）で活性化されたＰＳＣを種々の濃度のＴＲＡＩＬＰＥＧ、コナツムマブ（抗ＤＲ５アゴニスト抗体）およびマパツズマブ（抗ＤＲ４アゴニスト抗体）で処理した後の、定量化されたカスパーゼ３／７活性（アポトーシスマーカー）を示す線グラフである。ＴＲＡＩＬＰＥＧおよびコナツムマブのみが、ＥｔＯＨで活性化されたＰＳＣにおいてアポトーシスを誘導する。
【図10A】図１０Ａ～１０Ｅは、ホールセルパッチクランプ記録によって実証した、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの後根神経節（ＤＲＧ）由来の感覚ニューロンの興奮性に対する、無血清条件にある活性化されたＰＳＣから得られた順化培地（ＣＭ）（ＰＳＣ－ＣＭ）との培養物中での４８時間のインキュベーションの効果を示す。図１０Ａは、ＰＳＣ－ＣＭと共に培養したニューロンにおける増加した自然電位および誘導された活動電位を示す代表的なトレーシングの図である。これには、基電流（活動電位を惹起するために必要な電流の量）における大幅な減少が伴う（図１０Ｂを参照のこと）。図１０Ｃは、誘発された活動電位の増強を示す。図１０Ｄは、増加した活動電位振幅を示す。図１０Ｅは、減少したＩＡ電流（興奮性を維持するために重要な一過性のＫｖ電流）を示す。
【図10B】図１０Ａ～１０Ｅは、ホールセルパッチクランプ記録によって実証した、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの後根神経節（ＤＲＧ）由来の感覚ニューロンの興奮性に対する、無血清条件にある活性化されたＰＳＣから得られた順化培地（ＣＭ）（ＰＳＣ－ＣＭ）との培養物中での４８時間のインキュベーションの効果を示す。図１０Ａは、ＰＳＣ－ＣＭと共に培養したニューロンにおける増加した自然電位および誘導された活動電位を示す代表的なトレーシングの図である。これには、基電流（活動電位を惹起するために必要な電流の量）における大幅な減少が伴う（図１０Ｂを参照のこと）。図１０Ｃは、誘発された活動電位の増強を示す。図１０Ｄは、増加した活動電位振幅を示す。図１０Ｅは、減少したＩＡ電流（興奮性を維持するために重要な一過性のＫｖ電流）を示す。
【図10C】図１０Ａ～１０Ｅは、ホールセルパッチクランプ記録によって実証した、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの後根神経節（ＤＲＧ）由来の感覚ニューロンの興奮性に対する、無血清条件にある活性化されたＰＳＣから得られた順化培地（ＣＭ）（ＰＳＣ－ＣＭ）との培養物中での４８時間のインキュベーションの効果を示す。図１０Ａは、ＰＳＣ－ＣＭと共に培養したニューロンにおける増加した自然電位および誘導された活動電位を示す代表的なトレーシングの図である。これには、基電流（活動電位を惹起するために必要な電流の量）における大幅な減少が伴う（図１０Ｂを参照のこと）。図１０Ｃは、誘発された活動電位の増強を示す。図１０Ｄは、増加した活動電位振幅を示す。図１０Ｅは、減少したＩＡ電流（興奮性を維持するために重要な一過性のＫｖ電流）を示す。
【図10D】図１０Ａ～１０Ｅは、ホールセルパッチクランプ記録によって実証した、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの後根神経節（ＤＲＧ）由来の感覚ニューロンの興奮性に対する、無血清条件にある活性化されたＰＳＣから得られた順化培地（ＣＭ）（ＰＳＣ－ＣＭ）との培養物中での４８時間のインキュベーションの効果を示す。図１０Ａは、ＰＳＣ－ＣＭと共に培養したニューロンにおける増加した自然電位および誘導された活動電位を示す代表的なトレーシングの図である。これには、基電流（活動電位を惹起するために必要な電流の量）における大幅な減少が伴う（図１０Ｂを参照のこと）。図１０Ｃは、誘発された活動電位の増強を示す。図１０Ｄは、増加した活動電位振幅を示す。図１０Ｅは、減少したＩＡ電流（興奮性を維持するために重要な一過性のＫｖ電流）を示す。
【図10E】図１０Ａ～１０Ｅは、ホールセルパッチクランプ記録によって実証した、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの後根神経節（ＤＲＧ）由来の感覚ニューロンの興奮性に対する、無血清条件にある活性化されたＰＳＣから得られた順化培地（ＣＭ）（ＰＳＣ－ＣＭ）との培養物中での４８時間のインキュベーションの効果を示す。図１０Ａは、ＰＳＣ－ＣＭと共に培養したニューロンにおける増加した自然電位および誘導された活動電位を示す代表的なトレーシングの図である。これには、基電流（活動電位を惹起するために必要な電流の量）における大幅な減少が伴う（図１０Ｂを参照のこと）。図１０Ｃは、誘発された活動電位の増強を示す。図１０Ｄは、増加した活動電位振幅を示す。図１０Ｅは、減少したＩＡ電流（興奮性を維持するために重要な一過性のＫｖ電流）を示す。
【図11】図１１は、ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置されたＡＰラットにおけるＭＰＯ＋（好中球マーカー）細胞数の低減を示す棒グラフである。ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置は、膵臓において、炎症、および浸潤したＭＰＯ＋細胞浸潤の数を大幅に低減させた。Ｃｅｒ－ＰＢＳ（未処置ＡＰラット）に対して＊Ｐ＜０．０５。
【図12】図１２は、慢性膵炎（ＣＰ）ラットモデルにおいてＴＲＡＩＬＰＥＧを試験するための研究設計のための予定表を示す図である。アルコール誘導性ＣＰのモデルを、ＳＤラットにエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ流動食を４３日間給餌し、セルレイン（２０μｇ／ｋｇ）の５回の毎週の注射によって確立した。エタノールを、１週間総カロリーの０～３６％食餌中に補充し、７日目に開始して研究の最後まで最終エタノール濃度で維持した。ラットを、１４、２１、２８、３５および４１日目にセルレイン（１時間に１回、４回のｉ．ｐ．注射）で処置した。ＴＲＡＩＬＰＥＧ（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ）またはＰＢＳ（対照）を、３６日目に始めて７日間毎日処置した。
【図14A】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図14B】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図14C】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図14D】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図14E】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図14F】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図14G】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図14H】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図14I】図１４Ａ～１４Ｉは、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置したセルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）における、ＧＡＰＤＨと比較した示された遺伝子の発現を示す棒グラフである。複数の線維形成マーカーに対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果が示される。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、セルレインおよびエタノール／Ｌｉｅｂｅｒ ＤｅＣａｒｌｉ食誘導性ＣＰラット（ＥｔＯＨ－ＣＰ）において、ｍＲＮＡ（遺伝子）レベルで、複数の線維症関連分子を下方調節する。ａ－ＳＭＡ、コラーゲン１、コラーゲン３、ＰＤＧＦｒ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、フィブロネクチン、ＰａｐおよびＴＧＦβを含む線維症関連マーカーの遺伝子発現レベルは全て、ＴＲＡＩＬＰＥＧによる処置後に低減された。Ａｃｔａ２は、アルファ－ＳＭＡのｍＲＮＡ名である。ＴＩＭＰは、ＭＭＰの阻害剤である（ＭＭＰはコラーゲンの分解を担う）。フィブロネクチンは、線維症マーカーである。ペア給餌（対照）に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１、ＥｔＯＨ－ＣＰ／ＰＢＳに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0020】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「寛解させる」とは、疾患の発症または進行を減少させるか、抑制するか、減弱するか、弱めるか、静止させるかまたは安定化することを意味する。
Ｉ．定義
「寛解させる」とは、疾患の発症または進行を減少させるか、抑制するか、減弱するか、弱めるか、静止させるかまたは安定化することを意味する。
【0021】
「対照」または「参照」とは、比較の標準を意味する。本明細書で使用する場合、「対照」試料または対象「と比較して変化した」は、正常、未処理／未処置または対照試料由来の試料とは統計的に異なるレベルを有することと理解される。対照試料には、例えば、培養物中の細胞、１匹もしくは複数の臨床検査動物、または１人もしくは複数のヒト対象が含まれる。対照試料を選択および試験する方法は、当業者の技術範囲内である。分析物は、細胞もしくは生物によって特徴的に発現もしくは産生される天然に存在する物質（例えば、抗体、タンパク質）、またはレポーター構築物によって産生される物質（例えば、β－ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ）であり得る。検出のために使用される方法に依存して、変化の量および測定値は変動し得る。統計的有意性の決定は、陽性結果を構成する平均からの標準偏差の数など、当業者の技術範囲内である。
【0022】
「検出する」とは、検出される分析物の存在、非存在または量を同定することを指す。
【0023】
本明細書で使用する場合、用語「診断すること」とは、病態もしくは症状を分類すること、病態の重症度（例えば、グレードまたはステージ）を決定すること、病態進行をモニタリングすること、病態の転帰を予測すること、および／または回復の見込みを決定することを指す。
【0024】
製剤または製剤成分の用語「有効量」および「治療有効量」とは、所望の効果を提供するのに十分な、単独のまたは組み合わせた、製剤または成分の量を意味する。例えば、「有効量」とは、未処置の患者と比較して、疾患または障害の症状のうち１つまたは複数を寛解させるのに必要とされる、単独のまたは組み合わせた、化合物の量を意味する。疾患の治療的処置のための有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重および総体的健康に依存して変動する。最終的に、担当医または獣医が、適切な量および投薬レジメンを決定する。
【0025】
「モジュレートする」とは、変更すること（増加または減少させること）を意味する。かかる変更は、本明細書に記載される方法などの、標準的な当該分野で公知の方法によって検出される。
【0026】
「線維性疾患または障害」は、修復または反応性プロセスにおける、臓器または組織中での過剰な繊維状結合組織の進行性の形成に関する一般的な用語である。線維症は、典型的には炎症または損傷の結果として、身体の多くの組織において生じ得る。線維症になりやすい臓器または組織の例には、肺、膵臓、心臓、肝臓、皮膚、指、関節、脳、骨髄、陰茎および腸が含まれるがこれらに限定されない。
【0027】
用語「正常な量」とは、疾患または障害と診断されないことが既知の個体における複合体の正常な量を指す。分子の量は、試験試料において測定され、参照限界、識別限界、またはカットオフポイントおよび異常値（例えば、膵炎について）を規定するためのリスク定義閾値などの技術を利用して、「正常な対照レベル」と比較され得る。「正常な対照レベル」とは、前立腺がんに罹患していないことが既知の対象において典型的には見出される１つもしくは複数のタンパク質（または核酸）または組み合わされたタンパク質指数（または組み合わされた核酸指数）のレベルを意味する。かかる正常な対照レベルおよびカットオフポイントは、分子が単独で使用されるか、他のタンパク質を指数へと組み合わせる式中で使用されるかに基づいて変動し得る。あるいは、正常な対照レベルは、臨床的に適切な計画対象期間にわたって疾患または障害へと転換しなかった以前に試験した対象由来のタンパク質パターンのデータベースであり得る。
【0028】
決定されるレベルは、対照レベルもしくはカットオフレベルもしくは閾値レベルと同じであり得る、または対照レベルもしくはカットオフレベルもしくは閾値レベルと比較して増加もしくは減少され得る。一部の態様では、対照対象は、同じ種、性別、民族性、年齢群、喫煙状況、肥満度指数（ＢＭＩ）、現行の治療レジメン状況、病歴、またはそれらの組合せが一致した対照であるが、対照が、問題の疾患に罹患していないまたは疾患の危険性がないという点で、診断されている対象とは異なる。
【0029】
語句「薬学的に許容される担体」は、当該分野で認識されており、これには、それを必要とする個体に化合物を投与するのに適切な、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルが含まれる。
【0030】
用語「ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体アゴニスト」とは、本明細書で使用する場合、デス受容体（ＤＲ）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）に結合しそれらを活性化する薬剤を指す。ＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト即ちＴＲＡには、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１および／またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２に結合する、組換えＴＲＡＩＬ、組換えＴＲＡＩＬバリアント、ＴＲＡＩＬ誘導体および抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体、ならびにＴＲＡＩＬ－Ｒ１および／またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２を結合するアゴニスト小分子またはペプチド分子が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体には、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）に対する抗体が含まれる。
【0031】
一部の実施形態では、ＴＲＡＩＬ抗体には、がん治療のために当初開発されたＤＲ５抗体、コナツムマブ、ティガツズマブ、レクサツムマブ、ＨＧＳ－ＴＲ２Ｊ／ＫＭＴＲ－２、ＬＢＹ１３５、ドロジツマブ、ＴＡＳ２６６、ＤＳ－８２７３／ＤＳ－８２７３ａ、ＡＰＧ８８０、ＲＧ７３８６が含まれるがこれらに限定されない。
【0032】
用語「ＰＥＧ化」とは、分子およびマクロ構造、例えば、薬物、治療タンパク質または小胞への、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖の共有結合もしくは非共有結合的付着またはアマルガム化（amalgamation）のプロセスを指す。
【0033】
用語「予防する」、「予防すること」、「予防」および「予防的処置」とは、特に有害な状態、障害または疾患を発症する危険性がある、それに対して感受性の、またはその素因を有する臨床的に無症候の個体への薬剤または組成物の投与を指し、従って、症状の発生および／またはそれらの根底にある原因の予防に関する。
【0034】
医薬組成物は、急速に分裂している細胞、例えば、がん細胞において細胞周期を静止させる際に使用されるキットまたは医薬品系へとアセンブルされ得る。キットまたは医薬品系は、１つまたは複数の容器手段、例えば、バイアル、チューブ、アンプル、ビン、シリンジまたはバッグをその中に密に閉じ込めて有する、担体手段、例えば、箱、段ボール箱またはチューブを含み得る。本開示のキットまたは医薬品システムは、キットを使用するための付随する指示書もまた含み得る。
【0035】
ＩＩ．組成物
有用な組成物は、デス受容体（ＴＲＡＩＬ受容体）アゴニストを含む。デス受容体アゴニストの例には、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１および／またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２に結合する、精製されたＴＲＡＩＬ、単離されたＴＲＡＩＬ、組換えＴＲＡＩＬ、組換えＴＲＡＩＬバリアント、ＴＲＡＩＬ誘導体および抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体、ならびにＴＲＡＩＬ－Ｒ１および／またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２を結合するアゴニスト小分子またはペプチド分子が含まれる。一部の実施形態では、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体には、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）に対する抗体が含まれる。
有用な組成物は、デス受容体（ＴＲＡＩＬ受容体）アゴニストを含む。デス受容体アゴニストの例には、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１および／またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２に結合する、精製されたＴＲＡＩＬ、単離されたＴＲＡＩＬ、組換えＴＲＡＩＬ、組換えＴＲＡＩＬバリアント、ＴＲＡＩＬ誘導体および抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体、ならびにＴＲＡＩＬ－Ｒ１および／またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２を結合するアゴニスト小分子またはペプチド分子が含まれる。一部の実施形態では、抗ＴＲＡＩＬ受容体抗体には、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）に対する抗体が含まれる。
【0036】
Ａ．デス受容体アゴニスト
組成物は、炎症、線維化および疼痛を低減させるため、ならびに膵臓および膵炎において膵機能を改善するために、膵炎ならびに膵臓の線維性疾患および障害を、デス受容体ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）アゴニスト、例えば、ＰＥＧ化ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）アナログおよび抗ＤＲ５アゴニスト抗体で処置する方法において使用される。これらのＰＥＧ化タンパク質ベースの薬物および抗ＤＲ５抗体は、膵炎および膵線維症ならびに疼痛において疾患修飾効果を有する。これらは、安全で高度に安定で強力であり、延長された半減期を有する。
組成物は、炎症、線維化および疼痛を低減させるため、ならびに膵臓および膵炎において膵機能を改善するために、膵炎ならびに膵臓の線維性疾患および障害を、デス受容体ＴＲＡＩＬ－Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ－Ｒ２（ＤＲ５）アゴニスト、例えば、ＰＥＧ化ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）アナログおよび抗ＤＲ５アゴニスト抗体で処置する方法において使用される。これらのＰＥＧ化タンパク質ベースの薬物および抗ＤＲ５抗体は、膵炎および膵線維症ならびに疼痛において疾患修飾効果を有する。これらは、安全で高度に安定で強力であり、延長された半減期を有する。
【0037】
１．ＴＲＡＩＬ
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、アポトーシスと呼ばれる細胞死のプロセスを誘導するリガンドとして機能するタンパク質である。ＴＲＡＩＬは、ほとんどの正常組織細胞によって産生および分泌されるサイトカインである。これは、ある特定のデス受容体に結合することによって、主に腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす。ＴＲＡＩＬは、ＣＤ２５３（表面抗原分類２５３）およびＴＮＦＳＦ１０（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１０）とも呼ばれている。
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、アポトーシスと呼ばれる細胞死のプロセスを誘導するリガンドとして機能するタンパク質である。ＴＲＡＩＬは、ほとんどの正常組織細胞によって産生および分泌されるサイトカインである。これは、ある特定のデス受容体に結合することによって、主に腫瘍細胞においてアポトーシスを引き起こす。ＴＲＡＩＬは、ＣＤ２５３（表面抗原分類２５３）およびＴＮＦＳＦ１０（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１０）とも呼ばれている。
【0038】
ヒトでは、ＴＲＡＩＬをコードする遺伝子は、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なって、染色体３ｑ２６に位置する。ＴＲＡＩＬ遺伝子のゲノム構造は、およそ２０ｋｂにわたり、２２２、１３８、４２、１０６および１２４５ヌクレオチドの５つのエクソンセグメント、ならびにおよそ８．２、３．２、２．３および２．３ｋｂの４つのイントロンから構成される。ＴＲＡＩＬ遺伝子は、ＴＡＴＡおよびＣＡＡＴボックスを欠き、プロモーター領域は、ＧＡＴＡ、ＡＰ－１、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ－１、ＯＣＴ－１、ＡＰ３、ＰＥＡ３、ＣＦ－１およびＩＳＲＥに対する推定応答エレメントを含有する。
【0039】
ＴＲＡＩＬは、腫瘍壊死因子スーパーファミリーの他のメンバーに対して相同性を示す。これは、２８１アミノ酸から構成され、ＩＩ型膜貫通タンパク質（即ち、リーダー配列なし、１つの内部膜貫通ドメイン）の特徴を有する。Ｎ末端細胞質ドメインは、ファミリーメンバー間で保存されていないが、Ｃ末端細胞外ドメインは保存され、細胞表面からタンパク質分解的に切断され得る。ＴＲＡＩＬは、３つの受容体分子を結合するホモトリマーを形成する。
【0040】
ＴＲＡＩＬは、デス受容体ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）およびＤＲ５（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）に結合する。アポトーシスのプロセスは、カスパーゼ－８依存的である。カスパーゼ－８は、プロカスパーゼ－３、－６および－７を含む下流のエフェクターカスパーゼを活性化し、特異的キナーゼの活性化をもたらす。ＴＲＡＩＬは、受容体ＤｃＲ１およびＤｃＲ２もまた結合し、これらは、細胞質ドメインを含有しない（ＤｃＲ１）またはトランケート型デスドメインを含有する（ＤｃＲ２）。ＤｃＲ１は、ＴＲＡＩＬ中和性デコイ受容体として機能する。ＤｃＲ２の細胞質ドメインは、機能的であり、ＮＦカッパＢを活性化する。従って、ＤｃＲ２を発現する細胞では、ＴＲＡＩＬ結合は、ＮＦカッパＢを活性化し、デスシグナル伝達経路と拮抗することおよび／または炎症を促進することが公知の遺伝子の転写をもたらす。ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂと相互作用することが示されている。
【0041】
ＴＲＡＩＬは、ネイティブまたは遺伝子操作された（組換え）形態で得られ得る。ＴＲＡＩＬは、トリマー形成を好むジッパーアミノ酸モチーフならびに／またはその単離および精製を促進する末端基を含み得る。
【0042】
適切なＴＲＡＩＬタンパク質は、ヒト形態のＴＲＡＩＬを含み、これは、２８１アミノ酸長、配列番号１：
MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
のアミノ酸配列を有する。
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のアミノ酸配列を有する。
【0043】
好ましい実施形態では、ＴＲＡＩＬは、全長ヒト形態（１～２８１）のアルギニン－１１４（Ａｒｇ、Ｒ）からグリシン－２８１（Ｇｌｙ、Ｇ）までのアミノ酸配列を有し、配列番号２：
RERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
のアミノ酸配列を有する。
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のアミノ酸配列を有する。
【0044】
典型的には、ＴＲＡＩＬは、Ｎ末端アミノ酸残基において、エチレングリコール（ＥＧ）単位、より好ましくは２つまたはそれよりも多いＥＧ単位（即ち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））で修飾される。Ｎ末端アミノ酸残基には、リシン、システイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニンまたはアルギニンが含まれるがこれらに限定されない。
【0045】
典型的には、任意のＴＲＡＩＬアナログが、ＰＥＧ化に適切であり得る。アナログには、３つのモノマーのうち少なくとも１つが、１つまたは複数のアミノ酸置換または欠失を伴った、配列番号１または２のアミノ酸配列を有する、トリマー性ＴＲＡＩＬが含まれる。ＴＲＡＩＬアナログは、慣用的な分子生物学の技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得る。
【0046】
ＴＲＡＩＬは、そのＮ末端において、ロイシンまたはイソロイシンジッパー（ＩＬＺ）に付着され得る。好ましい実施形態では、ジッパーモチーフは、イソロイシンジッパーである（Kimら、BBRC、３２１巻：９３０～９３５頁（２００４年））。
【0047】
２．デス受容体アゴニスト抗体
一部の実施形態では、デス受容体アゴニスト抗体には、単一、二重または多重抗原またはエピトープ特異性を有する、ＤＲ５抗体コナツムマブ、ティガツズマブ、レクサツムマブ、ＨＧＳ－ＴＲ２Ｊ／ＫＭＴＲ－２、ＬＢＹ１３５、ドロジツマブ、ＴＡＳ２６６、ＤＳ－８２７３／ＤＳ－８２７３ａ、ＡＰＧ８８０、ＲＧ７３８６またはキメラ抗体、およびハイブリッド断片を含む断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２などが含まれるがこれらに限定されない。かかる抗体および断片は、当該分野で公知の技術によって作製され得、抗体を産生し、特異性および活性について抗体をスクリーニングするための一般的な方法に従って特異性および活性についてスクリーニングされ得る（例えば、HarlowおよびLane. Antibodies、A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications、New York、（１９８８年）を参照のこと）。
一部の実施形態では、デス受容体アゴニスト抗体には、単一、二重または多重抗原またはエピトープ特異性を有する、ＤＲ５抗体コナツムマブ、ティガツズマブ、レクサツムマブ、ＨＧＳ－ＴＲ２Ｊ／ＫＭＴＲ－２、ＬＢＹ１３５、ドロジツマブ、ＴＡＳ２６６、ＤＳ－８２７３／ＤＳ－８２７３ａ、ＡＰＧ８８０、ＲＧ７３８６またはキメラ抗体、およびハイブリッド断片を含む断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２などが含まれるがこれらに限定されない。かかる抗体および断片は、当該分野で公知の技術によって作製され得、抗体を産生し、特異性および活性について抗体をスクリーニングするための一般的な方法に従って特異性および活性についてスクリーニングされ得る（例えば、HarlowおよびLane. Antibodies、A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications、New York、（１９８８年）を参照のこと）。
【0048】
多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラットまたはウサギに由来するもの）は、ヒトにおいて必然的に抗原性であり、従って、ヒトに投与した場合に望ましくない免疫応答を生じさせ得る。従って、本明細書に記載される方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を誘発する可能性を低下させるように機能する。ヒト化またはキメラデス受容体アゴニスト抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうち実質的に全てを含み得、ここで、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリン（即ち、ドナー抗体）のものに対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。好ましくは、デス受容体アゴニスト抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものもまた含む。デス受容体アゴニスト抗体の定常ドメインは、抗体の提唱された機能、特に、必要とされ得るエフェクター機能に関して、選択され得る。一部の実施形態では、デス受容体アゴニスト抗体の定常ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭドメインである（またはこれらを含む）。
【0049】
抗体断片は、抗体の結合および結合特異性、例えば、デス受容体に特異的な結合性断片を含む（抗体定常領域の特定の生物学的機能を必要としない）。標的デス受容体に対する二重特異的結合および結合特異性が保持されることを期待して、他の抗体領域は、任意の重鎖および軽鎖もしくはそれらの部分によって、または任意の重鎖および軽鎖もしくはそれらの部分から、置換、変更またはその両方がされ得る。抗体断片およびペプチド形態について、デス受容体に特異的な結合性断片は、多数の結合性断片形態のいずれかによって具体化され得、抗体結合性断片に使用される多価および多重特異的な方法のいずれかを含む、任意の適切な方法で連結され得る。開示された抗体、抗体断片およびポリペプチドの場合、かかる形態は、多価の代わりに（または多価に加えて）二重特異性である。結合性断片形態の例には、Ｆ（ａｂ’）２、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、半抗体（half antibody）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＶｈＨドメイン、Ｖ－ＮＡＲドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆ（ａｂ）３、ビス－ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびミニボディが含まれる。これらの形態のいずれかは、デス受容体に特異的な結合性断片を具体化するために独立して使用され得、次いで、任意の適切なリンカーまたはカップリングを使用して、組み合わせまたは接合され得る。デス受容体に特異的な結合性断片は、多価および／または多重特異性形態の抗体断片の結合性断片部分としても各々使用され得る。例には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、ビス－ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびミニボディが含まれる。
【0050】
３．デス受容体アゴニストのアナログ
デス受容体アゴニストは、さらなる部分を含むように修飾され得、従って、アナログを形成する。部分は、ポリマー性部分、ポリペプチド、多糖、標識されたトレーサーなどであり得る。部分は、デス受容体アゴニストに非共有結合または共有結合的に付着され得る。
デス受容体アゴニストは、さらなる部分を含むように修飾され得、従って、アナログを形成する。部分は、ポリマー性部分、ポリペプチド、多糖、標識されたトレーサーなどであり得る。部分は、デス受容体アゴニストに非共有結合または共有結合的に付着され得る。
【0051】
一部の実施形態では、部分は、ポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene gycol）（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、工業生産から医学までの多くの適用を有するポリエーテル化合物である。ＰＥＧの構造は、Ｈ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨである（括弧内は反復要素であることに留意されたい）。ＰＥＧは、その分子量に依存して、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても公知である。ＰＥＧ、ＰＥＯまたはＰＯＥは、エチレンオキシドのオリゴマーまたはポリマーを指す。３つの名称は、化学的には同義であるが、歴史的には、ＰＥＧは、生物医学の分野において好まれ、一方でＰＥＯは、ポリマー化学の分野においてより普及している。異なる適用は、異なるポリマー鎖の長さを要求するので、ＰＥＧは、典型的には、２０，０００ｇ／ｍｏｌを下回る分子質量で、ＰＥＯは、２０，０００ｇ／ｍｏｌを上回る分子質量を有するポリマーに、ＰＯＥは、任意の分子質量のポリマーに使用される。ＰＥＧおよびＰＥＯは、それらの分子量に依存して、液体または低融点固体である。ＰＥＧは、エチレンオキシドの重合によって調製され、３００ｇ／ｍｏｌ～１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌの広い範囲の分子量にわたって市販されている。異なる分子量を有するＰＥＧおよびＰＥＯは、異なる適用において使用を見出し、鎖長効果に起因して異なる物理的特性（例えば、粘度）を有するが、それらの化学的特性はほぼ同一である。異なる形態のＰＥＧもまた、重合プロセスに使用されるイニシエーターに依存して利用可能である－最も一般的なイニシエーターは、ｍＰＥＧと略称される、単官能性メチルエーテルＰＥＧまたはメトキシポリ（エチレングリコール）である。より低い分子量のＰＥＧもまた、単分散、均一または離散（discrete）と呼ばれる、より純粋なオリゴマーとして利用可能である。非常に高純度のＰＥＧは、結晶性であることが最近示されており、Ｘ線回折による結晶構造の決定を可能にする。純粋なオリゴマーの精製および分離は困難であるので、このタイプの品質の価格は、多分散ＰＥＧの価格の１０～１０００倍である場合が多い。
【0052】
異なる幾何学を有するＰＥＧもまた利用可能である。分岐鎖ＰＥＧは、中心コア基から発散する３～１０個のＰＥＧ鎖を有する。星型ＰＥＧは、中心コア基から発散する１０～１００個のＰＥＧ鎖を有する。櫛型ＰＥＧは、ポリマー骨格上に垂直方向にグラフトされた複数のＰＥＧ鎖を有する。ＰＥＧの名称中にしばしば含まれる数字は、それらの平均分子量を示す（例えば、ｎ＝９を有するＰＥＧは、およそ４００ダルトンの平均分子量を有し、ＰＥＧ４００と標識される）。ほとんどのＰＥＧは、分子量の分布を伴った分子を含む（即ち、これらは多分散である）。サイズ分布は、その重量平均分子量（Ｍｗ）およびその数平均分子量（Ｍｎ）によって統計的に特徴付けられ得、それらの比率は、多分散指数（Ｍｗ／Ｍｎ）と呼ばれる。ＭＷおよびＭｎは、質量分析によって測定され得る。
【0053】
ＰＥＧ化は、別のより大きい分子、例えば、治療タンパク質へとＰＥＧ構造を共有結合的にカップリングする作用であり、このタンパク質は次いでＰＥＧ化タンパク質と呼ばれる。ＰＥＧ化インターフェロンアルファ－２ａまたは－２ｂは、Ｃ型肝炎感染の処置のための一般に使用される注射可能な処置である。ＰＥＧは、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ベンゼンおよびジクロロメタン中で可溶性であり、ジエチルエーテルおよびヘキサン中で不溶性である。ＰＥＧは、非イオン性界面活性剤を生成するために、疎水性分子にカップリングされる。ＰＥＧは、潜在的に毒性の不純物、例えば、エチレンオキシドおよび１，４－ジオキサンを含有する。エチレングリコールおよびそのエーテルは、損傷した皮膚に適用された場合、腎毒性である。
【0054】
ポリエチレングリコールは、エチレンオキシドと水、エチレングリコールまたはエチレングリコールオリゴマーとの相互作用によって産生される。反応は、酸性または塩基性触媒によって触媒される。エチレングリコールおよびそのオリゴマーは、水の代わりに出発材料として好ましいが、それは、これらが、低い多分散性（狭い分子量分布）を有するポリマーの創出を可能にするからである。ポリマー鎖長は、反応物の比率に依存する。
ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ＋ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）→ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＋１Ｈ
触媒の型に依存して、重合の機構は、カチオン性またはアニオン性であり得る。エチレンオキシドの重合は、発熱プロセスである。
ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ＋ｎ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）→ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＋１Ｈ
触媒の型に依存して、重合の機構は、カチオン性またはアニオン性であり得る。エチレンオキシドの重合は、発熱プロセスである。
【0055】
ＰＥＧ化（ペグ化と表記される場合も多い）は、分子およびマクロ構造、例えば、薬物、治療タンパク質または小胞への、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖の共有結合および非共有結合的付着の両方またはアマルガム化のプロセスであり、これは次いでＰＥＧ化（ペグ化）されたと記載される。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体と標的分子とのインキュベーションによって慣用的に達成される。薬物または治療タンパク質へのＰＥＧの共有結合的付着は、宿主の免疫系から薬剤を「マスク」し（低減された免疫原性および抗原性）、薬剤の水力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させ得、これは、腎クリアランスを低減させることによってその循環時間を延長させる。ＰＥＧ化はまた、疎水性薬物およびタンパク質に水溶性を提供できる。
【0056】
ＰＥＧ化は、分子、最も典型的にはペプチド、タンパク質および抗体断片へとポリマーＰＥＧの鎖を付着させるプロセスであり、多くの治療薬の安全性および効率を改善し得る。これは、コンフォメーション、静電結合、疎水性などにおける変化を含む、生理化学的特性における変更を生じる。これらの物理的および化学的変化は、治療剤の全身保持を増加させる。また、これは、細胞受容体に対する治療的部分の結合親和性に影響し得、吸収および分布のパターンを変更させ得る。
【0057】
ＰＥＧは、コンジュゲーションのための特に魅力的なポリマーである。医薬品適用に適切なＰＥＧ部分の具体的な特徴は、水溶性、溶液中での高い移動度、毒性の欠如および低い免疫原性、身体からの迅速なクリアランス、ならびに身体中での変更された分布である。
【0058】
ＴＲＡＩＬ誘導体の生物学的活性は、選択的ＰＥＧ化を介して増加され得る。薬物適用の処置効果もまた、ＰＥＧ化プロセスを介して増加され得る。ＰＥＧ化の適用は、分子量、代謝部位の防御および免疫原性部位の阻害を増加させ、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期および安定性を増加させ、免疫原性を低減させる。さらに、ＰＥＧに結合したペプチドおよびタンパク質の腎臓排泄は、ＰＥＧによるペプチドおよびタンパク質の分子量の増加に起因して低減され、その結果、ＰＥＧ化は、薬物動態学的かつ薬力学的に、効果を増加させる利点を有する。
【0059】
好ましくは、ポリエチレングリコールまたはその誘導体は、直鎖もしくは分岐鎖であり、またはＴＲＡＩＬおよび／もしくは他のＰＥＧ分子へのリンカーを伴わずにもしくは伴って、ダイマーもしくはトリマーの形態であり得る。代表的なポリエチレングリコール誘導体には、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオネート、メトキシポリエチレングリコールＮ－ヒドロキシスクシンイミド、メトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、メトキシポリエチレングリコールマレイミド、またはこれらの誘導体の複数の分岐鎖型が含まれる。好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体は、直鎖メトキシポリエチレングリコールマレイミド、分岐型メトキシポリエチレングリコールマレイミドまたはトリマー性メトキシポリエチレングリコールマレイミドであり、より好ましくは、トリマー性メトキシポリエチレングリコールマレイミドである。
【0060】
ＴＲＡＩＬ誘導体をポリエチレングリコールでＰＥＧ化し、またはその誘導体を調製した後、アナログの分子構造は、質量分析装置、液体クロマトグラフィー、Ｘ線回折分析、旋光分析、およびＰＥＧ化ＴＲＡＩＬを構成する代表的要素の計算値と測定値との間の比較によって確認され得る。
【0061】
４．賦形剤
ＴＲＡＩＬ、抗体または誘導体は、投与のために製剤化され得る。典型的には注射、吸入、肺投与または眼内投与のために、これは、凍結乾燥またはスプレー乾燥された粉末の形態であり、これは、無菌水、緩衝液、またはGoodman and Gilman'sに列挙されるものなどの他の賦形剤を用いて、投与のために溶解され得る。
ＴＲＡＩＬ、抗体または誘導体は、投与のために製剤化され得る。典型的には注射、吸入、肺投与または眼内投与のために、これは、凍結乾燥またはスプレー乾燥された粉末の形態であり、これは、無菌水、緩衝液、またはGoodman and Gilman'sに列挙されるものなどの他の賦形剤を用いて、投与のために溶解され得る。
【0062】
ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化したＴＲＡＩＬ誘導体は、緩衝剤、懸濁化剤、静菌剤を任意選択で含む液剤もしくは懸濁剤として調製され、または粘度改変され、次いで、アンプルもしくはバイアルの単位投与形態へと包装され得る。組成物は、濾過、照射またはエチレンオキシドなどのガスによって無菌化される。
【0063】
ＩＩＩ．組成物を作製する方法
Ａ．ＴＲＡＩＬおよびＰＥＧ化ＴＲＡＩＬを作製する方法
ＰＥＧ化の最初のステップは、一方または両方の末端におけるＰＥＧポリマーの官能化である。各末端において同じ反応性部分で活性化されたＰＥＧは、「ホモ二官能性」として公知であり、存在する官能基が異なる場合には、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼ばれる。ＰＥＧポリマーの化学的に活性なまたは活性化された誘導体は、所望の分子にＰＥＧを付着させるために調製される。
Ａ．ＴＲＡＩＬおよびＰＥＧ化ＴＲＡＩＬを作製する方法
ＰＥＧ化の最初のステップは、一方または両方の末端におけるＰＥＧポリマーの官能化である。各末端において同じ反応性部分で活性化されたＰＥＧは、「ホモ二官能性」として公知であり、存在する官能基が異なる場合には、ＰＥＧ誘導体は「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼ばれる。ＰＥＧポリマーの化学的に活性なまたは活性化された誘導体は、所望の分子にＰＥＧを付着させるために調製される。
【0064】
タンパク質コンジュゲーションのための全体的なＰＥＧ化プロセスは、２つの型、即ち、溶液相バッチプロセスおよびオンカラムフェドバッチ（on-column fed-batch）プロセスにおおまかに分類され得る。単純であり一般に採用されるバッチプロセスは、好ましくは４℃～６℃の間の温度で、適切な緩衝溶液中で試薬を一緒に混合し、その後、その物理化学的特性に基づいて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）およびメンブレンまたは水性二相系を含む適切な技術を使用して、所望の産物を分離および精製することを含む。
【0065】
ＰＥＧ誘導体に適切な官能基の選択は、ＰＥＧにカップリングされる分子上の利用可能な反応性基の型に基づく。タンパク質について、典型的な反応性アミノ酸には、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンが含まれる。Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸もまた、アルデヒド官能性ポリマーとのコンジュゲーションによって、部位特異的部位として使用され得る。第１世代ＰＥＧ誘導体を形成するために使用される技術は一般に、ＰＥＧポリマーを、ヒドロキシル基と反応性の基、典型的には、無水物、酸塩化物、クロロホルメートおよびカーボネートと反応させることである。第２世代ＰＥＧ化化学では、より効率的な官能基、例えば、アルデヒド、エステル、アミドなどが、コンジュゲーションに利用可能になる。
【0066】
これらのヘテロ二官能性ＰＥＧは、２つの実体を連結する際に非常に有用であり、このとき、親水性、可撓性かつ生体適合性のスペーサーが必要である。ヘテロ二官能性ＰＥＧに好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸およびＮＨＳエステルである。低減された粘度および臓器蓄積の欠如を示す、ポリマーの形状が分岐鎖、Ｙ型または櫛形である第３世代ペグ化剤が利用可能である。ＰＥＧ化化合物のクリアランス時間における予測不能性は、公知の毒物学的結果を伴わずに、封入体をもたらす肝臓における大きい分子量の化合物の蓄積をもたらし得る。さらに、鎖長における変更は、ｉｎ ｖｉｖｏでの予想外のクリアランス時間をもたらし得る。
【0067】
Ｂ．デス受容体アゴニストを作製する方法
抗体および抗体断片は、ポリペプチドの産生に有用な、当該分野で公知の任意の方法、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成、組換えＤＮＡ産生などによって産生され得る。抗体は、組換えＤＮＡテクノロジーによって産生され得る。抗ＤＲ５アゴニスト抗体は、組換え免疫グロブリン発現テクノロジーを使用して産生され得る。ヒト化抗体を含む免疫グロブリン分子の組換え産生は、米国特許第４，８１６，３９７号（Ｂｏｓｓら）、米国特許第６，３３１，４１５号および同第４，８１６，５６７号（共にＣａｂｉｌｌｙら）、英国特許ＧＢ２，１８８，６３８号（Ｗｉｎｔｅｒら）ならびに英国特許ＧＢ２，２０９，７５７号に記載されている。ヒト化免疫グロブリンを含む免疫グロブリンの組換え発現のための技術は、Goeddelら、Gene Expression Technology Methods in Enzymology 第１８５巻 Academic Press（１９９１年）およびBorreback、Antibody Engineering、W. H. Freeman（１９９２年）にも見出され得る。組換え抗体の生成、設計および発現に関するさらなる情報は、Mayforth、Designing Antibodies、Academic Press、San Diego（１９９３年）に見出され得る。
抗体および抗体断片は、ポリペプチドの産生に有用な、当該分野で公知の任意の方法、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成、組換えＤＮＡ産生などによって産生され得る。抗体は、組換えＤＮＡテクノロジーによって産生され得る。抗ＤＲ５アゴニスト抗体は、組換え免疫グロブリン発現テクノロジーを使用して産生され得る。ヒト化抗体を含む免疫グロブリン分子の組換え産生は、米国特許第４，８１６，３９７号（Ｂｏｓｓら）、米国特許第６，３３１，４１５号および同第４，８１６，５６７号（共にＣａｂｉｌｌｙら）、英国特許ＧＢ２，１８８，６３８号（Ｗｉｎｔｅｒら）ならびに英国特許ＧＢ２，２０９，７５７号に記載されている。ヒト化免疫グロブリンを含む免疫グロブリンの組換え発現のための技術は、Goeddelら、Gene Expression Technology Methods in Enzymology 第１８５巻 Academic Press（１９９１年）およびBorreback、Antibody Engineering、W. H. Freeman（１９９２年）にも見出され得る。組換え抗体の生成、設計および発現に関するさらなる情報は、Mayforth、Designing Antibodies、Academic Press、San Diego（１９９３年）に見出され得る。
【0068】
抗体は、動物を、合成または精製されたモノマー性、ホモマー性またはヘテロマー性ＤＲ５で免疫化することによっても産生され得る。免疫血清は、高度に特異的な免疫試薬（immunoreagent）を生成するために、ペプチド親和性カラムに適用される。
【0069】
本明細書に記載されるヒト抗体およびヒト化抗体は、任意の公知の技術によって調製され得る。ヒトモノクローナル抗体産生のための技術の例には、Boernerら、J. Immunol.、１４７巻（１号）、８６～９５頁（１９９１年）に記載されるものが含まれる。本明細書に記載されるヒト抗体（およびその断片）は、ファージディスプレイライブラリーを使用しても産生され得る（例えば、Marksら、J. Mol. Biol.、２２２巻、５８１～５９７頁（１９９１年）を参照のこと）。本明細書に記載されるヒト抗体は、トランスジェニック動物からも得られ得る。例えば、免疫化に応答してヒト抗体の完全レパートリーを産生することが可能なトランスジェニック変異体マウスが記載されている（例えば、Jakobovitsら、PNAS、９０巻、２５５１～２５５頁（１９９３年）；およびJakobovitsら、Nature、３６２巻、２５５～２５８頁（１９９３年）を参照のこと）。
【0070】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、げっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲ配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって生成され得る。詳細な手順は、Jonesら、Nature、３２１巻、５２２～５２５頁（１９８６年）；Riechmannら、Nature、３３２巻、３２３～３２７頁（１９８８年）；Verhoeyenら、Science、２３９巻、１５３４～１５３６頁（１９８８年）に開示されている。
【0071】
ヒト化抗体を産生するために使用され得る方法は、米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，７２１，３６７号；米国特許第５，８３７，２４３号；米国特許第５，９３９，５９８号；米国特許第６，１３０，３６４号；および米国特許第６，１８０，３７７号にも記載されている。
【0072】
ＩＶ．使用の方法
デス受容体アゴニストは、膵炎、膵線維症、膵臓痛、またはそれらの任意の組合せを処置するために使用され得る。デス受容体アゴニストは、炎症プロセスの初期段階において膵炎症を低減、停止または反転させる際、膵線維症を低減、停止または反転させる際、および膵臓痛を低減または停止する際に有用である。
デス受容体アゴニストは、膵炎、膵線維症、膵臓痛、またはそれらの任意の組合せを処置するために使用され得る。デス受容体アゴニストは、炎症プロセスの初期段階において膵炎症を低減、停止または反転させる際、膵線維症を低減、停止または反転させる際、および膵臓痛を低減または停止する際に有用である。
【0073】
ポリエチレングリコールまたはその誘導体でＰＥＧ化されたＴＲＡＩＬ誘導体を含有する医薬組成物のヒト身体用量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患のレベルに依存して変動し得、好ましくは０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、医師または薬剤師の決定に従って投与され得る。
【0074】
実施例に記載されるように、初代ヒトＰＳＣにおけるＴＲＡＩＬＰＥＧの効果を調査した。特に、セルレイン誘導性急性膵炎（ＡＰ）およびエタノール／セルレイン／Ｌｉｅｂｅｒ－Ｄｅｃａｒｌｉ（ＬＤ）食誘導性慢性膵炎（ＣＰ）を含む異なる膵炎ラットモデルにおいて、静脈内投与したＴＲＡＩＬＰＥＧの抗線維化および抗疼痛効力を試験した。本明細書に記載されるように、ＴＲＡＩＬシグナル伝達は、膵線維化ならびにＴＧＦβ調節において重要な役割を果たし、ＴＧＦβは、侵害受容器を直接過敏化し、膵痛覚過敏を誘導し得る。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、急性相および慢性相の両方において、膵炎の進行を寛解させた。驚くべきことに、ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置は、ＣＰラットモデルにおいて疼痛を大幅に低減させた。
【0075】
以下に詳細に記載されるように、ＴＲＡＩＬＰＥＧは、ＰＳＣ活性化を選択的に遮断し、ＣＰの本元である活性化されたＰＳＣを根絶して、ＣＰの反転を生じる。さらに、ＴＧＦβの上方調節によって侵害受容器を過敏化するＰＳＣを標的化することによって、ＴＲＡＩＬＰＥＧは、全身毒性なしにＣＰ関連の重症疼痛を低減させる。
【0076】
膵線維化および膵臓痛におけるＴＲＡＩＬシグナル伝達の役割を試験して、クリニックでの膵炎治療のためにデス受容体アゴニスト（例えば、ＴＲＡＩＬＰＥＧおよび抗ＤＲ５抗体）を利用することの実現可能性を決定した。膵炎治療に向かうＴＲＡＩＬシグナル伝達における新たな方向および新規ＴＲＡＩＬベースのレジメンが提案される。
【0077】
Ａ．処置される状態
膵炎は、膵臓の炎症である。膵臓は、消化酵素を産生する、胃の後ろにある大きい臓器である。２つの主要な型、急性膵炎および慢性膵炎が存在する。膵炎の徴候および症状には、上腹部における疼痛、悪心および嘔吐が含まれる。疼痛は、背部に回ることが多く、通常は重症である。急性膵炎では、発熱が生じ得、症状は、典型的には数日間で消散する。慢性膵炎では、体重減少、脂肪便および下痢が生じ得る。合併症には、感染症、出血、真性糖尿病、または他の臓器の問題が含まれ得る。
膵炎は、膵臓の炎症である。膵臓は、消化酵素を産生する、胃の後ろにある大きい臓器である。２つの主要な型、急性膵炎および慢性膵炎が存在する。膵炎の徴候および症状には、上腹部における疼痛、悪心および嘔吐が含まれる。疼痛は、背部に回ることが多く、通常は重症である。急性膵炎では、発熱が生じ得、症状は、典型的には数日間で消散する。慢性膵炎では、体重減少、脂肪便および下痢が生じ得る。合併症には、感染症、出血、真性糖尿病、または他の臓器の問題が含まれ得る。
【0078】
急性膵炎の最も一般的な原因は、胆石およびアルコールの多量摂取である。他の原因には、とりわけ、直接的外傷、ある特定の薬物適用、流行性耳下腺炎などの感染症、および腫瘍が含まれる。慢性膵炎は、急性膵炎の結果として発症し得る。これは、多年のアルコールの多量摂取に起因することが最も一般的である。他の原因には、とりわけ、高レベルの血中脂質、高い血中カルシウム、一部の薬物適用、およびある特定の遺伝性障害、例えば、嚢胞性線維症が含まれる。喫煙は、急性および慢性の両方の膵炎の危険性を増加させる。急性膵炎の診断は、アミラーゼまたはリパーゼのいずれかの、血液中での３倍の増加に基づく。慢性膵炎では、これらの試験は正常であり得る。超音波およびＣＴスキャンなどの医用画像化もまた有用であり得る。
【0079】
１．急性膵炎
急性膵炎は、通常は静脈内輸液、疼痛薬物適用で、ときおりは抗生物質で処置される。典型的には、飲食は許容されず、チューブが胃中に配置され得る。内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）として公知の手順は、遮断されている場合に膵管を開放するために実施され得る。胆石を有する場合、胆嚢も除去される場合が多い。慢性膵炎では、上記に加えて、鼻腔胃チューブを介した一時的栄養補給が、適切な栄養を提供するために使用され得る。長期の食変化および膵酵素補充が必要とされ得、時々、手術が、膵臓の一部を除去するために実施される。
急性膵炎は、通常は静脈内輸液、疼痛薬物適用で、ときおりは抗生物質で処置される。典型的には、飲食は許容されず、チューブが胃中に配置され得る。内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）として公知の手順は、遮断されている場合に膵管を開放するために実施され得る。胆石を有する場合、胆嚢も除去される場合が多い。慢性膵炎では、上記に加えて、鼻腔胃チューブを介した一時的栄養補給が、適切な栄養を提供するために使用され得る。長期の食変化および膵酵素補充が必要とされ得、時々、手術が、膵臓の一部を除去するために実施される。
【0080】
急性膵炎は、１年に１００，０００人当たり約３０人で生じる。慢性膵炎の新たな症例は、１年に１００，０００人当たり約８人で発症し、現在、米国で１００，０００人当たり約５０人が冒されている。全世界では、２０１３年に、膵炎は、１９９０年の８３，０００人の死亡から上昇して、１２３，０００人の死亡を生じた。これは、女性よりも男性においてより一般的である。慢性膵炎は、３０～４０の間の年齢で始まる場合が多いが、小児では稀である。急性膵炎は、１８８２年に死体解剖において最初に記載されたが、慢性膵炎は、１９４６年に最初に記載された。
【0081】
膵炎の最も一般的な症状は、背部へ放散する重症上腹部または左上腹部の灼熱痛、悪心、および摂食に伴い悪化する嘔吐である。身体検査は、内出血の重症度および存在に依存して変動する。血圧は、疼痛によって上昇、または脱水もしくは出血によって減少し得る。心拍数および呼吸数は、上昇する場合が多い。腹部は通常、疼痛自体よりも低い程度までではあるが、圧痛がある。腹部疾患においては一般的であるが、反射性腸麻痺から、腸雑音が低減され得る。発熱または黄疸が存在し得る。慢性膵炎は、糖尿病または膵がんをもたらし得る。未解明の体重減少が、消化を邪魔する、膵酵素の欠如から生じ得る。
【0082】
膵炎の症例のうち８０パーセントは、アルコールまたは胆石によって引き起こされる。胆石は、急性膵炎の単一の最も一般的な原因である。アルコールは、慢性膵炎の単一の最も一般的な原因である。
【0083】
最も一般的にはプレドニゾロンなどのコルチコステロイドであるが、ＨＩＶ薬物ジダノシンおよびペンタミジン、利尿薬、抗痙攣薬バルプロ酸、化学療法剤Ｌ－アスパラギナーゼおよびアザチオプリン、増加した血中トリグリセリドとしてエストロゲン、ならびに抗高血糖剤、例えば、メトホルミン、ビルダグリプチンおよびシタグリプチンもまた含まれる一部の薬物適用が一般に、膵炎と関連する。膵炎の増加した事象とそれ自体関連する状態を処置するために使用される薬物もまた、膵炎に偶発的に関連し得る。例には、脂質異常症の処置におけるスタチンおよび糖尿病の処置におけるグリプチン（gliptin）が含まれる。米国食品医薬品局のMedWatch Surveillance System and Published Reports Atypicalによれば、非定型抗精神病薬、例えば、クロザピン、リスペリドンおよびオランザピンもまた、膵炎を引き起こすことを担い得る。
【0084】
他の一般的な原因には、外傷、流行性耳下腺炎、自己免疫疾患、高い血中カルシウム、低体温および内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）が含まれる。膵管癒合不全は、一部の再発性症例の根底にあり得る、膵臓の一般的な先天性形成異常である。２型真性糖尿病は、２．８倍高い危険性と関連する。
【0085】
あまり一般的でない原因には、膵がん、膵管結石、血管炎（膵臓中の小さい血管の炎症）、コクサッキーウイルス感染、ならびにポルフィリン症－特に急性間欠性ポルフィリン症および赤血球生成性プロトポルフィリン症が含まれる。
【0086】
自己消化をもたらす、膵臓内のトリプシノーゲンの活性化を生じる遺伝性形態が存在する。関与する遺伝子には、トリプシノーゲンをコードするトリプシン１、トリプシン阻害剤をコードするＳＰＩＮＫ１、または嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子が含まれ得る。
【0087】
膵炎の一般的な原因には、アルコール／エタノール、胆石、ステロイド、外傷、自己免疫性膵炎、流行性耳下腺炎、高脂血症、低体温、副甲状腺機能亢進症、サソリ刺傷、内視鏡的逆行性膵胆管造影および薬物（典型的にはアザチオプリンおよびバルプロ酸）が含まれる。
【0088】
流行性耳下腺炎、コクサッキーウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスを含むいくつかの感染性因子が、膵炎の原因として認識されている。
【0089】
膵炎のための鑑別診断には、胆嚢炎、総胆管結石症、穿孔性消化性潰瘍、腸梗塞、小腸閉塞症、肝炎および腸間膜虚血が含まれるがこれらに限定されない。診断は、以下の３つの基準のうち２つを要求する：背部に放散し得る心窩部痛または漠然とした腹部痛の特徴的な急性発生（上記徴候および症状を参照のこと）、血清アミラーゼまたはリパーゼレベル＞正常の上限の３倍、および特徴的変化に関する画像化研究。ＣＴ、ＭＲＩ、腹部超音波または超音波内視鏡が、診断に使用され得る。アミラーゼおよびリパーゼは、膵臓によって産生される２種の酵素である。リパーゼは、より高い特異性を有し、より長い半減期を有するので、リパーゼおける上昇は一般に、膵炎のより良い指標とみなされる。画像化のために、腹部超音波は、簡便、単純、非侵襲性かつ安価である。これは、他の画像化モダリティよりも感受性が高く、胆石からの膵炎に対して特異的である。しかし、患者のうち２５～３５％では、膵臓の視像は、腸内ガスによって閉塞されて、評価が困難になる。造影ＣＴスキャンは通常、膵壊死および余分な膵液について評価するため、ならびに疾患の重症度を予測するために、疼痛の発生後４８時間よりも後に実施される。早期のＣＴスキャンは、誤って安心感を与え得る。ＥＲＣＰまたは超音波内視鏡は、膵炎について胆汁性の原因が疑われる場合にも使用され得る。
【0090】
膵炎の処置は、対症的であり、重症度に依存する。モルヒネは一般に、疼痛制御に適切である。モルヒネは、オディ括約筋を収縮させ得るという主張があるが、これは議論の余地がある。モルヒネが膵炎または胆嚢炎を増悪し得るまたは引き起こし得るということを示唆する臨床研究は存在しない。急性膵炎に対して受けられる処置は、診断が、合併症を引き起こさない状態の軽症形態についてであるか重篤な合併症を引き起こし得る重症形態についてであるかに依存する。軽症急性膵炎の処置は、一般病棟への入院によって首尾よく実施される。伝統的に、炎症が消散するまで摂食は許されなかったが、より最近の証拠は、早期の栄養補給が安全であり転帰を改善することを示唆している。膵炎は、肺損傷を引き起こし、正常な肺機能に影響を与え得るので、酸素が、鼻を介して接続された呼吸用チューブを介して時折送達される。次いで、チューブは、状態が改善していることが明らかになったら、数日後に除去され得る。脱水が急性膵炎のエピソードの間に生じ得、従って、体液が静脈内提供される。急性膵炎の軽症または中等症の症例とさえ関連する疼痛は、重症であり得、これは、麻薬性痛み止めが必要とされ得ることを意味している。
【0091】
重症膵炎は、臓器不全、壊死、感染性壊死、仮性嚢胞および膿瘍と関連する。重症急性膵炎と診断された場合、その人は、高度治療室（high dependency unit）または集中治療室に入れる必要がある。身体の内側の体液のレベルは、膵臓を修復する試みにおいて体液および栄養素を転用するときに、顕著に低下する可能性が高い。体液レベルにおける低下は、循環血液量減少性ショックとして公知の、体内の血液の体積における低減をもたらし得る。循環血液量減少性ショックは、生存に必要な酸素に富んだ血液を体内から非常に急速に欠乏させ得るので、命にかかわり得る。循環血液量減少性ショックになるのを回避するために、体液は、静脈内に送り込まれる。酸素は、鼻に取り付けられたチューブを介して供給され、呼吸を補助するために換気装置が使用され得る。栄養チューブが、適切な鎮痛と組み合わせて、栄養素を提供するために使用され得る。
【0092】
軽症急性膵炎の場合、根底にある原因－胆石を処置すること、薬物適用の中断、アルコールの休止などが必要である。原因が胆石である場合、胆嚢のＥＲＣＰ手順または除去が推奨される可能性が高い。胆嚢は、再発性膵炎の危険性を限定するために、同じ入院の間、または膵炎の２週間以内に除去すべきである。膵炎の原因がアルコールである場合、アルコール摂取の休止およびアルコール依存症の処置が、膵炎を改善し得る。根底にある原因がアルコール摂取と無関係な場合であっても、これは、回復プロセスの間に膵臓へのさらなる損傷を引き起こし得るので、医師は、少なくとも６ヶ月間アルコール摂取を回避することを勧告する。経口摂取、特に脂肪は一般に、最初は制限されるが、４８時間以内の早期経腸栄養は、臨床転帰を改善することが示されている。体液および電解質は、静脈内で置き換えられる。処置の最初の７２～９６時間で改善が見られない場合、栄養サポートが、分泌された膵酵素によって最も影響される消化管の部分を超えるために、チューブ栄養法を介して開始される。
【0093】
早期合併症には、ショック、感染症、全身性炎症反応症候群、低い血中カルシウム、高い血中グルコースおよび脱水が含まれる。失血、脱水、および腹腔中への体液漏出（腹水症）は、腎不全をもたらし得る。呼吸器合併症は、重症の場合が多い。胸水貯留が通常存在する。疼痛からの浅呼吸は、肺虚脱をもたらし得る。膵酵素は、肺を攻撃して、炎症を引き起こし得る。重症炎症は、腹部内圧上昇および腹部コンパートメント症候群をもたらし得、さらに、腎および呼吸機能を損ない、圧力を解放するために、腹部開放（open abdomen）による管理を潜在的に必要とする。
【0094】
後期合併症には、再発性膵炎および膵仮性嚢胞－瘢痕組織によって囲まれた膵分泌物の収集－の発症が含まれる。これらは、疼痛を引き起こし、感染し、破裂および出血し、胆管を遮断し黄疸を引き起こし、または腹部周囲を移動し得る。急性壊死性膵炎は、壊死、液化および感染症によって引き起こされる膿汁の収集である膵膿瘍をもたらし得る。これは、症例のうちおよそ３％において起こり、または症例のうちほぼ６０％は、膵臓中に２つよりも多い仮性嚢胞およびガスを含む。
【0095】
２．慢性膵炎
慢性膵炎は、臓器の正常な構造および機能を変更する、膵臓の長期にわたる炎症である。これは、以前に傷害された膵臓における急性炎症のエピソードとして、または持続性の疼痛もしくは吸収不良を伴う慢性損傷として、存在し得る。これは、急性膵炎における可逆的変化とは異なり、膵臓に対する不可逆的損傷によって特徴付けられる疾患プロセスである。慢性膵炎の年間発生率は、１００，０００人当たり５～１２人であり、有病率は、１００，０００人当たり５０人である。これは、女性よりも男性においてより一般的である。
慢性膵炎は、臓器の正常な構造および機能を変更する、膵臓の長期にわたる炎症である。これは、以前に傷害された膵臓における急性炎症のエピソードとして、または持続性の疼痛もしくは吸収不良を伴う慢性損傷として、存在し得る。これは、急性膵炎における可逆的変化とは異なり、膵臓に対する不可逆的損傷によって特徴付けられる疾患プロセスである。慢性膵炎の年間発生率は、１００，０００人当たり５～１２人であり、有病率は、１００，０００人当たり５０人である。これは、女性よりも男性においてより一般的である。
【0096】
慢性膵炎と一致する症状は、通常、食品中の脂肪の吸収不良から生じる持続性腹部痛または脂肪性下痢を呈する。顕著な体重減少が、吸収不良に起因してしばしば生じ、状態が進行する際に健康問題であり続け得る。患者は、食品摂取、特に、高い百分率の脂肪およびタンパク質を含有する食事に関連する疼痛についても症状を訴える場合がある。
【0097】
慢性膵炎の原因には、以下がある：アルコール、自己免疫障害、管内閉塞、特発性膵炎、腫瘍、虚血および石灰沈着性の石。病原因子、遺伝的素因、および疾患進行のペース間の関係は、さらなる解明が必要であるが、最近の研究は、喫煙が、慢性膵炎を発症する高危険因子であり得ることを示している。患者の小さい群において、慢性膵炎が遺伝性であることが示されている。嚢胞性線維症を有するほぼ全ての患者は、通常は誕生時から、確立された慢性膵炎を有する。嚢胞性線維症遺伝子の変異がまた、慢性膵炎を有するが、嚢胞性線維症の他の症状発現が存在しなかった患者において同定されている。膵管の閉塞は、良性または悪性のいずれかのプロセスに起因して、慢性膵炎を生じ得る。
【0098】
遺伝的観点から見た慢性膵炎の機構は、小児期に始まる重症心窩部疼痛の早期発生を示す。これは、常染色体優性疾患であり、慢性膵炎疾患は、カチオン性トリプシノーゲン遺伝子ＰＲＳＳ１および変異Ｒ１２２Ｈにおいて同定される。Ｒ１２２Ｈは、トリプシノーゲンタンパク質のアミノ酸１２２位におけるヒスチジンによるアルギニンの置き換えを伴う、遺伝性慢性膵炎の最も一般的な変異である。当然、各々が膵臓に対してその独自の効果を示す他の機構－アルコール、栄養不良および喫煙－が存在する。
【0099】
慢性膵炎の診断は、膵臓の構造および機能に対する試験に基づく。血清アミラーゼおよびリパーゼは、慢性膵炎の症例において中程度に上昇し得、急性状態では、上昇したアミラーゼおよびリパーゼが、ほぼ常に見出される。セクレチン刺激試験は、慢性膵炎の診断のための最良の試験であるとみなされている。慢性膵炎を決定するために使用される他の試験は、血清トリプシノーゲン、コンピュータ断層撮影、超音波および生検である。慢性膵炎が遺伝的要因によって引き起こされる場合、ＥＳＲ、ＩｇＧ４、リウマトイド因子、ＡＮＡおよび抗平滑筋抗体における上昇が検出され得る。
【0100】
慢性膵炎の管理のための異なる処置選択肢は、医療措置、内視鏡治療および手術である。処置は、可能であれば、根底にある原因に、ならびに疼痛および吸収不良を軽減することを対象とする。インスリン依存型真性糖尿病が生じ、長期インスリン治療を必要とし得る。腹部痛は、非常に重症であり、オピエートを時として含む、高用量の鎮痛薬を必要とし得る。アルコール休止および食生活改善（低脂肪食）が、疼痛を管理し、石灰沈着プロセスを緩徐化するために重要である。抗酸化剤は助けになり得るが、利益が有意義かどうかは不明である。膵酵素補充は、慢性膵炎と関連する吸収不良および脂肪性下痢を処置する際に有効な場合が多い。ＣＰの処置は、食事と共に膵酵素の溶液を投与することからなる。一部の患者は、酵素補充による疼痛低減を有し、これらは比較的安全であるので、慢性膵炎患者に酵素補充を与えることは、ほとんどの患者について、処置における許容可能なステップである。処置は、大きい管の関与を伴わない者および特発性膵炎を有する者において、成功する可能性がより高い場合がある。慢性膵炎を処置するための手術は、２つのエリア－摘出およびドレナージ手順－に分けられる傾向がある。手術のほうを選ぶ理由には、仮性嚢胞、瘻孔、腹水症または固定された閉塞が存在するかどうかがある。
【0101】
３．膵線維症
線維症は、修復または反応性プロセスにおける、臓器または組織中での過剰な繊維状結合組織の形成である。これは、反応性、良性または病理学的状態であり得る。傷害に応答する場合、これは瘢痕化と呼ばれ、線維症が単一の細胞株から生じる場合、これは線維腫と呼ばれる。生理学的に、線維症は、結合組織を沈着させるように作用し、これは、根底にある臓器または組織の構造および機能を抹消することができる。線維症は、繊維状組織の過剰な沈着の病理学的状態、ならびに治癒における結合組織沈着のプロセスを記述するために使用され得る。
線維症は、修復または反応性プロセスにおける、臓器または組織中での過剰な繊維状結合組織の形成である。これは、反応性、良性または病理学的状態であり得る。傷害に応答する場合、これは瘢痕化と呼ばれ、線維症が単一の細胞株から生じる場合、これは線維腫と呼ばれる。生理学的に、線維症は、結合組織を沈着させるように作用し、これは、根底にある臓器または組織の構造および機能を抹消することができる。線維症は、繊維状組織の過剰な沈着の病理学的状態、ならびに治癒における結合組織沈着のプロセスを記述するために使用され得る。
【0102】
両方とも、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含む、結合組織を築く刺激された細胞が関与するという点で、線維症は、瘢痕化のプロセスと類似である。マクロファージと呼ばれる免疫細胞、ならびに間質と呼ばれる表面間の任意の損傷組織は、ＴＧＦβを放出する。これには、増加した循環メディエーターを伴う、近傍組織の炎症、または全身性の炎症状態を含む、多数の理由がある。ＴＧＦβは、線維芽細胞の増殖および活性化を刺激し、結合組織を沈着させる。線維症は、典型的には炎症または損傷の結果として、身体内の多くの組織で生じ得、例には、膵臓（慢性膵炎）、肝臓（硬変）、肺（肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症）、心臓（心房線維症、心内膜心筋線維症、陳旧性心筋梗塞）、脳（グリア瘢痕）、関節線維症（膝、肩、他の関節）、クローン病（腸）、デュピュイトラン拘縮（手、指）、ケロイド（皮膚）、縦隔線維症（縦隔の軟組織）、骨髄線維症（骨髄）、ペロニー病（陰茎）、腎性全身性線維症（皮膚）、進行性塊状線維症（肺）；炭坑夫塵肺の合併症、後腹膜線維症（後腹膜の軟組織）、強皮症／全身性硬化症（皮膚、肺）、および癒着性関節包炎（肩）の一部の形態が含まれる。
【0103】
４．膵炎または膵臓痛障害を処置する方法
ａ．ＰＳＣを標的化する
病理学的に、ＣＰは、顕著な線維症によって認識される。膵線維化は主に、膵星細胞（ＰＳＣ）によって組織化される（Erkan, M.ら、Gut、２０１２年．６１巻（２号）：１７２～１７８頁；Omary, M.B.ら、J Clin Invest、２００７年．１１７巻（１号）：５０～５９頁；Pinzani, M.、Gut、２００６年．５５巻（１号）：１２～１４頁）。膵損傷または疾患の間に、静止状態ＰＳＣ（ｑＰＳＣ）は、活性化を受け、コラーゲン沈着を促進し、線維性組織をもたらす、増殖性、線維形成性かつ収縮性の筋線維芽細胞へと形質転換する。生来、活性化されたＰＳＣ（ａＰＳＣ）は、膵臓を標的化する抗線維化治療のための主要な標的である（Omary, M.B.ら、J Clin Invest、２００７年．１１７巻（１号）：５０～５９頁；Apte, M.V.ら、J Gastroenterol Hepatol、２００６年．２１巻補遺３：Ｓ９７～Ｓ１０１頁）。従って、ａＰＳＣの根絶は、線維化およびその合併症である疼痛を防止、停止および／または反転させるための論理的戦略である。ａＰＳＣへのｑＰＳＣ活性化を遮断し、ｑＰＳＣではなくａＰＳＣのアポトーシスを選択的に誘導できる分子的に標的化された薬剤を導入することは、膵線維化の本元が枯渇されるので、ＣＰにおいてロバストな抗線維化効果を提供する。膵線維症を反転させることは、ＣＰの進行を停止／反転させ、従って結果的に、ＣＰ関連疼痛を弱め、膵機能を改善する（図１）。
ａ．ＰＳＣを標的化する
病理学的に、ＣＰは、顕著な線維症によって認識される。膵線維化は主に、膵星細胞（ＰＳＣ）によって組織化される（Erkan, M.ら、Gut、２０１２年．６１巻（２号）：１７２～１７８頁；Omary, M.B.ら、J Clin Invest、２００７年．１１７巻（１号）：５０～５９頁；Pinzani, M.、Gut、２００６年．５５巻（１号）：１２～１４頁）。膵損傷または疾患の間に、静止状態ＰＳＣ（ｑＰＳＣ）は、活性化を受け、コラーゲン沈着を促進し、線維性組織をもたらす、増殖性、線維形成性かつ収縮性の筋線維芽細胞へと形質転換する。生来、活性化されたＰＳＣ（ａＰＳＣ）は、膵臓を標的化する抗線維化治療のための主要な標的である（Omary, M.B.ら、J Clin Invest、２００７年．１１７巻（１号）：５０～５９頁；Apte, M.V.ら、J Gastroenterol Hepatol、２００６年．２１巻補遺３：Ｓ９７～Ｓ１０１頁）。従って、ａＰＳＣの根絶は、線維化およびその合併症である疼痛を防止、停止および／または反転させるための論理的戦略である。ａＰＳＣへのｑＰＳＣ活性化を遮断し、ｑＰＳＣではなくａＰＳＣのアポトーシスを選択的に誘導できる分子的に標的化された薬剤を導入することは、膵線維化の本元が枯渇されるので、ＣＰにおいてロバストな抗線維化効果を提供する。膵線維症を反転させることは、ＣＰの進行を停止／反転させ、従って結果的に、ＣＰ関連疼痛を弱め、膵機能を改善する（図１）。
【0104】
ｂ．疼痛を処置するためにデス受容体アゴニストを用いてＰＳＣ－ＴＧＦβ軸を標的化する。
急性疼痛から慢性疼痛への移行は、活発に調査されているエリアである（Reichling, D.B.およびLevine, J.D.、Trends Neurosci、２００９年．３２巻（１２号）：６１１～６１８頁）。組織炎症は、末梢過敏化、即ち、その本体が後根神経節（ＤＲＧ）中に収容され、その中枢が脊髄中の二次ニューロンでシナプスを終える一次求心性ニューロン（侵害受容器）の応答性の増強を生じる事象のカスケードを開始する。しかし、組織線維症が顕著である場合、炎症における後期の駆動因子についてはほとんど知られていない。本明細書に記載されるように、ＴＧＦβによるＤＲＧニューロンの処理は、興奮性における変化を誘導し、特異的電位依存性カリウム電流（ＩＡ）を抑制したが、これは、慢性膵炎における侵害受容性興奮性の特徴である（Zhu, Y.ら、Mol Pain、２０１２年．８巻：６５頁）。ＴＧＦβは、侵害受容器をそれ自体過敏化し、膵痛覚過敏を誘導し、ＣＰに伴う増強された行動応答に寄与し得る。本明細書に記載されるように、ＰＳＣは、活性化プロセスの間にＴＧＦβを上方調節し、ＤＲＧニューロンの興奮性に影響する。侵害受容におけるＴＲＡＩＬおよびＴＧＦβの役割についての新たな知識は、炎症および慢性疼痛によって特徴付けられる他の状態に対しても影響を有する－実際、「急性疼痛状態から慢性疼痛状態への移行は、疼痛を弱める臨床処置を改善するための研究において、最も重要な課題であり得る」と述べられている（Reichling, D.B.およびLevine, J.D.、Trends Neurosci、２００９年．３２巻（１２号）：６１１～６１８頁）。
急性疼痛から慢性疼痛への移行は、活発に調査されているエリアである（Reichling, D.B.およびLevine, J.D.、Trends Neurosci、２００９年．３２巻（１２号）：６１１～６１８頁）。組織炎症は、末梢過敏化、即ち、その本体が後根神経節（ＤＲＧ）中に収容され、その中枢が脊髄中の二次ニューロンでシナプスを終える一次求心性ニューロン（侵害受容器）の応答性の増強を生じる事象のカスケードを開始する。しかし、組織線維症が顕著である場合、炎症における後期の駆動因子についてはほとんど知られていない。本明細書に記載されるように、ＴＧＦβによるＤＲＧニューロンの処理は、興奮性における変化を誘導し、特異的電位依存性カリウム電流（ＩＡ）を抑制したが、これは、慢性膵炎における侵害受容性興奮性の特徴である（Zhu, Y.ら、Mol Pain、２０１２年．８巻：６５頁）。ＴＧＦβは、侵害受容器をそれ自体過敏化し、膵痛覚過敏を誘導し、ＣＰに伴う増強された行動応答に寄与し得る。本明細書に記載されるように、ＰＳＣは、活性化プロセスの間にＴＧＦβを上方調節し、ＤＲＧニューロンの興奮性に影響する。侵害受容におけるＴＲＡＩＬおよびＴＧＦβの役割についての新たな知識は、炎症および慢性疼痛によって特徴付けられる他の状態に対しても影響を有する－実際、「急性疼痛状態から慢性疼痛状態への移行は、疼痛を弱める臨床処置を改善するための研究において、最も重要な課題であり得る」と述べられている（Reichling, D.B.およびLevine, J.D.、Trends Neurosci、２００９年．３２巻（１２号）：６１１～６１８頁）。
【0105】
Ｃ．処置される対象
典型的には、処置される対象には、膵炎、膵線維症および／もしくは膵臓痛に罹患しているまたは罹患する危険性がある対象が含まれる。
典型的には、処置される対象には、膵炎、膵線維症および／もしくは膵臓痛に罹患しているまたは罹患する危険性がある対象が含まれる。
【0106】
一部の実施形態では、処置される対象には、他の慢性または急性状態、例えば、２型糖尿病、肝臓線維症、肝硬変、肝臓がん、肺線維症、皮膚線維症、膵がん、転移がん、１型糖尿病および関節リウマチを含む自己免疫状態にも罹患する、膵炎、膵線維症および／もしくは膵臓痛に罹患しているまたは罹患する危険性がある対象が含まれる。
【0107】
他の実施形態では、処置される対象には、さらなる慢性または急性状態、例えば、２型糖尿病、肝臓線維症、肝硬変、肝臓がん、肺線維症、皮膚線維症、膵がん、転移がん、１型糖尿病および関節リウマチを含む自己免疫状態には罹患しない、膵炎、膵線維症および／もしくは膵臓痛に罹患しているまたは罹患する危険性がある対象が含まれる。
【0108】
Ｄ．ＤＲ５アゴニストの有効量
組成物は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、組成物は、０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの間の用量、または０．００１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される。
組成物は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、組成物は、０．２ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの間の用量、または０．００１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される。
【0109】
一部の態様では、膵組織は保護され、線維形成は低減され、膵線維化は反転し、疼痛は低減され、健康な膵組織は無傷である。一態様では、線維性疾患または障害を処置することは、疼痛を低減させることを含む。疼痛は、対象において、１～１００％、例えば、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および１００％低減される。
【0110】
一態様では、線維性疾患または障害を処置することは、膵線維症を低減させることを含む。膵線維症は、対象において、１～１００％、例えば、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および１００％低減される。
【0111】
一態様では、線維性疾患または障害を処置することは、膵炎症を低減させることを含む。膵炎症は、１～１００％、例えば、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および１００％低減される。
【0112】
１．組合せ治療のための投薬および処置レジメン
処置の方法には、典型的には、疾患もしくはその症状の処置、または所望の生理学的変化を達成するための方法が含まれ、これらの方法は、哺乳動物、特にヒトに、有効量のアポトーシス促進剤を投与して、膵炎もしくはその症状を処置する、または生理学的変化を生じさせるステップを含む。
処置の方法には、典型的には、疾患もしくはその症状の処置、または所望の生理学的変化を達成するための方法が含まれ、これらの方法は、哺乳動物、特にヒトに、有効量のアポトーシス促進剤を投与して、膵炎もしくはその症状を処置する、または生理学的変化を生じさせるステップを含む。
【0113】
有効量のデス受容体アゴニストは、対象に、単一用量として１回、または複数回投与され得る。投与は、１日１回、１日２回、１日３回、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回または１ヶ月に１回であり得る。
【0114】
有効量のデス受容体アゴニストは、単一の単位投薬量として（例えば、投薬単位として）、または有限の時間間隔にわたって投与される治療量以下の用量として、投与され得る。かかる単位用量は、有限の期間、例えば、最大で３日間、または最大で５日間、または最大で７日間、または最大で１０日間、または最大で１５日間または最大で２０日間または最大で２５日間、毎日投与され得る。
【0115】
一部の実施形態では、単位投薬量は、主要な治療として投与される。他の実施形態では、単位投薬量は、組合せ治療において第２の薬剤と一緒に投与される。
【0116】
ａ．組合せ治療
一部の実施形態では、デス受容体アゴニストは、さらなる活性薬剤と組み合わされる。デス受容体アゴニストおよびさらなる活性薬剤は、一緒に、例えば、同じ組成物の一部として投与され、または同時にもしくは異なる時点で、別々に独立して投与され得る（即ち、リガンドまたはアゴニストおよび第２の活性薬剤の投与は、互いに有限の期間で分離される）。従って、用語「組合せ」または「組み合わせた」は、リガンドまたはアゴニストおよび第２の活性薬剤の同時（concomitant）、同時（simultaneous）または逐次のいずれかの投与を指すために使用される。組合せは、同時に（concomitantly）（例えば、混合物として）、別々にではあるが同時に（simultaneously）（例えば、同じ対象中へ別々の静脈内ラインを介して；一方の薬剤は、経口で与えられるが、他方の薬剤は、注入または注射によって与えられる、など）、または逐次的に（例えば、一方の薬剤が最初に与えられ、第２の薬剤がその後に与えられる）のいずれかで投与され得る。
一部の実施形態では、デス受容体アゴニストは、さらなる活性薬剤と組み合わされる。デス受容体アゴニストおよびさらなる活性薬剤は、一緒に、例えば、同じ組成物の一部として投与され、または同時にもしくは異なる時点で、別々に独立して投与され得る（即ち、リガンドまたはアゴニストおよび第２の活性薬剤の投与は、互いに有限の期間で分離される）。従って、用語「組合せ」または「組み合わせた」は、リガンドまたはアゴニストおよび第２の活性薬剤の同時（concomitant）、同時（simultaneous）または逐次のいずれかの投与を指すために使用される。組合せは、同時に（concomitantly）（例えば、混合物として）、別々にではあるが同時に（simultaneously）（例えば、同じ対象中へ別々の静脈内ラインを介して；一方の薬剤は、経口で与えられるが、他方の薬剤は、注入または注射によって与えられる、など）、または逐次的に（例えば、一方の薬剤が最初に与えられ、第２の薬剤がその後に与えられる）のいずれかで投与され得る。
【0117】
一部の実施形態では、第２の活性薬剤と組み合わせたデス受容体アゴニストの投与は、アポトーシス促進剤および第２の活性薬剤が単独でまたは孤立して投与される場合よりも良い結果を達成する（即ち、組合せによって達成される結果は、個々の成分単独によって達成される結果の相加を上回る）。一部の実施形態では、組合せにおいて使用される一方または両方の薬剤の有効量は、別々に投与した場合の各薬剤の有効量よりも低い。一部の実施形態では、組合せ治療において使用される場合の一方または両方の薬剤の量は、単独で使用される場合には、治療量以下である。
【0118】
組合せ治療の処置レジメンは、リガンドまたはアゴニストの１回または複数の投与を含み得る。組合せ治療の処置レジメンは、第２の活性薬剤の１回または複数の投与を含み得る。
【0119】
一部の実施形態では、アポトーシス促進剤は、第２の活性薬剤の最初の投与の前に投与される。他の実施形態では、リガンドまたはアゴニストは、第２の活性薬剤の最初の投与の後に投与される。
【0120】
リガンドまたはアゴニストは、第２の活性薬剤の投与の少なくとも１、２、３、５、１０、１５、２０、２４もしくは３０時間または１、２、３、５、１０、１５、２０、２４もしくは３０日前または後に、投与され得る。
【0121】
薬剤の投薬レジメンまたはサイクルは、完全にもしくは部分的に重複していてもよく、または逐次的であり得る。例えば、一部の実施形態では、アポトーシス促進剤の全てのかかる投与（複数可）は、第２の活性薬剤の投与の前または後に行われる。あるいは、アポトーシス促進剤の１つまたは複数の用量の投与は、処置の一様または非一様な過程を形成するために、第２の治療剤の投与と時間的に交互にされ得、それによって、アポトーシス促進剤の１つもしくは複数の用量、その後、第２の活性薬剤の１つもしくは複数の用量、その後、デス受容体アゴニストの１つもしくは複数の用量が投与される；または第２の活性薬剤の１つもしくは複数の用量、その後、アポトーシス促進剤の１つもしくは複数の用量、その後、第２の活性薬剤の１つもしくは複数の用量が投与される；など、全て、治療を施す研究者または臨床医によって選択または所望されるスケジュールに従う。
【0122】
Ｖ．キット
医療用キットもまた開示される。医療用キットは、例えば、単独のまたは第２の治療剤と組み合わせた、アポトーシス促進剤、好ましくは、アゴニストＴＲＡＩＬ受容体に対するリガンドまたはアゴニストの投薬量供給を含み得る。第２の治療剤と組み合わされる場合、活性薬剤は、単独で（例えば、凍結乾燥されて）、または医薬組成物（例えば、混合物）中で供給され得る。活性薬剤は、単位投薬量中、または投与前に希釈すべきストック中にあり得る。一部の実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体の供給を含む。キットは、活性薬剤または組成物の投与のためのデバイス、例えば、シリンジもまた含み得る。キットは、上記のような使用において化合物を投与するための印刷された指示書を含み得る。
医療用キットもまた開示される。医療用キットは、例えば、単独のまたは第２の治療剤と組み合わせた、アポトーシス促進剤、好ましくは、アゴニストＴＲＡＩＬ受容体に対するリガンドまたはアゴニストの投薬量供給を含み得る。第２の治療剤と組み合わされる場合、活性薬剤は、単独で（例えば、凍結乾燥されて）、または医薬組成物（例えば、混合物）中で供給され得る。活性薬剤は、単位投薬量中、または投与前に希釈すべきストック中にあり得る。一部の実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体の供給を含む。キットは、活性薬剤または組成物の投与のためのデバイス、例えば、シリンジもまた含み得る。キットは、上記のような使用において化合物を投与するための印刷された指示書を含み得る。
【0123】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解される。本出願を通じて引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願、ならびに図面の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0124】
一般的方法
ＴＲＡＩＬＰＥＧの効力をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、生物学的試料を以下のように分析した。
ＴＲＡＩＬＰＥＧの効力をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、生物学的試料を以下のように分析した。
【0125】
血液化学および肝脂質レベル：
血清アミラーゼ、リピダーゼ（lipidase）、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ナトリウム、コレステロール、トリグリセリド、グルコース、アルブミン、タンパク質および尿素窒素レベルを、ＩＤＥＸＸ分析器を使用して決定する。
血清アミラーゼ、リピダーゼ（lipidase）、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ナトリウム、コレステロール、トリグリセリド、グルコース、アルブミン、タンパク質および尿素窒素レベルを、ＩＤＥＸＸ分析器を使用して決定する。
【0126】
組織学およびＩＨＣ：
固定した膵試料を、Ｈ＆Ｅ、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ、α－ＳＭＡで染色し、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。免疫蛍光（ＩＦ）二重染色を、α－ＳＭＡ、活性カスパーゼ－３に対する適切な抗体を使用して実施し、核をＤＡＰＩで染色した。膵組織に対するＴＵＮＥＬアッセイもまた実施して、アポトーシスシグナル伝達カスケードからのＤＮＡ損傷を決定した。
リアルタイムＰＣＲ：
固定した膵試料を、Ｈ＆Ｅ、Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ、α－ＳＭＡで染色し、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。免疫蛍光（ＩＦ）二重染色を、α－ＳＭＡ、活性カスパーゼ－３に対する適切な抗体を使用して実施し、核をＤＡＰＩで染色した。膵組織に対するＴＵＮＥＬアッセイもまた実施して、アポトーシスシグナル伝達カスケードからのＤＮＡ損傷を決定した。
リアルタイムＰＣＲ：
【0127】
遺伝子の発現レベルを、ＤＲ５、α－ＳＭＡ、Ｐｄｇｆ－ｒ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ１ａ３、Ｔｇｆ－ｂ１、Ｔｇｆ－ｂｒ２、Ｔｇｆ－ｂｒ３、Ｂｍｐ７、Ｔｉｍｐ１／３、Ｍｍｐ２／３／７／９／１３ならびにＢｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘｌ、Ｍｃｌ－１、ＦＬＩＰおよびｃＩＡＰに対する適切なプライマーを使用して、ＲＴ－ＰＣＲ（ＡＢＩ７５００）によって測定した。
【0128】
ウエスタンブロッティング：
ウエスタンブロット分析を、ＤＲ５、α－ＳＭＡ、コラーゲン、Ｔｉｍｐ、Ｔｇｆβ、Ｍｍｐ、カスパーゼ－８／－９／－３、切断されたＰＡＲＰ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘｌ、Ｍｃｌ－１、ＦＬＩＰ、ＦＡＤＤおよびｔ－Ｂｉｄが含まれるがこれらに限定されない重要なマーカーについて、膵臓ホモジネート由来のタンパク質抽出物に対して実施した。
ウエスタンブロット分析を、ＤＲ５、α－ＳＭＡ、コラーゲン、Ｔｉｍｐ、Ｔｇｆβ、Ｍｍｐ、カスパーゼ－８／－９／－３、切断されたＰＡＲＰ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘｌ、Ｍｃｌ－１、ＦＬＩＰ、ＦＡＤＤおよびｔ－Ｂｉｄが含まれるがこれらに限定されない重要なマーカーについて、膵臓ホモジネート由来のタンパク質抽出物に対して実施した。
【0129】
ＶＦＦ試験および電気刺激を使用した疼痛行動：
ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置後、各ＥｔＯＨ／セルレイン／ＬＤ食誘導性ＣＰ群からの４匹のラットを、ＶＦＦ試験および電気刺激研究のために使用した。
ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置後、各ＥｔＯＨ／セルレイン／ＬＤ食誘導性ＣＰ群からの４匹のラットを、ＶＦＦ試験および電気刺激研究のために使用した。
【0130】
データおよび統計分析：
抗線維化治療について１群当たり６～１０匹の動物、および抗疼痛治療について１群当たり４匹の動物が、５％有意水準および９０％検出力について、処置群の平均値と対照群の平均値と間の差異を観察するために必要であった。組織スライドを、試料についての事前の知識なしに病理学者が分析した。染色の強度および程度を、受容されたスコアリングシステムで、０～４の間でグレード分けした。免疫組織化学（ＩＨＣ）画像を、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊによって分析した。対照と上方／下方調節された受容体との間、バイオマーカー、ならびにＴＲＡＩＬＰＥＧ処置ありおよびなしの群間での比較を、必要に応じて、両側フィッシャー正確確率検定、一元配置ＡＮＯＶＡまたはカイ二乗検定によって実施した。全てのデータセットを、種々の処置群間での複数の比較によって分析した。全ての分析を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して実施する。０．０５未満のＰ値を、全ての分析において統計的に有意とみなす。
抗線維化治療について１群当たり６～１０匹の動物、および抗疼痛治療について１群当たり４匹の動物が、５％有意水準および９０％検出力について、処置群の平均値と対照群の平均値と間の差異を観察するために必要であった。組織スライドを、試料についての事前の知識なしに病理学者が分析した。染色の強度および程度を、受容されたスコアリングシステムで、０～４の間でグレード分けした。免疫組織化学（ＩＨＣ）画像を、ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊによって分析した。対照と上方／下方調節された受容体との間、バイオマーカー、ならびにＴＲＡＩＬＰＥＧ処置ありおよびなしの群間での比較を、必要に応じて、両側フィッシャー正確確率検定、一元配置ＡＮＯＶＡまたはカイ二乗検定によって実施した。全てのデータセットを、種々の処置群間での複数の比較によって分析した。全ての分析を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して実施する。０．０５未満のＰ値を、全ての分析において統計的に有意とみなす。
【0131】
（実施例１）
膵細胞に対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果。
ＰＥＧ化は、タンパク質薬物の半減期（ｔ１／２）を延長させるための究極的な方法であり、高度に効率的な商業的戦略である（Harrisら、Nat Rev Drug Discov、２巻（３号）：２１４～２２１頁（２００３年））。１０種よりも多いＰＥＧ化生物製剤がＦＤＡ承認されており、ＰＥＧ化タンパク質は、免疫原性が低いと一般にみなされている（Alconcelら、Polymer Chemistry、２巻（７号）：１４４２～１４４８頁（２０１１年））。ＴＲＡＩＬの極端に短いｔ１／２（げっ歯類では５分未満、ヒトでは３０分）（Kelleyら、J Pharmacol Exp Ther、２９９巻（１号）：３１～３８頁（２００１年）；Ashkenaziら、J Clin Oncol、２６巻（２１号）：３６２１～３６３０頁（２００８年））により、特にｉｎ ｖｉｖｏでＴＲＡＩＬ機能を研究し、薬物の効力を検証することは困難である。ＰＥＧ化ＴＲＡＩＬを、５ｋＤａのＰＥＧ分子と共に、Ｎ末端でトリマー形成に有利に働くイソロイシン－ジッパーアミノ酸モチーフ（ｉＬＺ）を各モノマーの末端に含めてトリマー性ＴＲＡＩＬを安定化することによって産生した（ＴＲＡＩＬＰＥＧ）（ＷＯ２００７／１４５４５７）。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、クリニックにおいて調査され、効力は低いが良好な安全性プロファイルを示したＤｕｌａｎｅｒｍｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの組換えＴＲＡＩＬに対して、ラットおよびサルにおける安定性を顕著に改善し、循環半減期を延長させた（Lemke, J.ら、Cell Death Differ、２０１４年．２１巻（９号）：１３５０～１３６４頁）。
膵細胞に対するＴＲＡＩＬＰＥＧの効果。
ＰＥＧ化は、タンパク質薬物の半減期（ｔ１／２）を延長させるための究極的な方法であり、高度に効率的な商業的戦略である（Harrisら、Nat Rev Drug Discov、２巻（３号）：２１４～２２１頁（２００３年））。１０種よりも多いＰＥＧ化生物製剤がＦＤＡ承認されており、ＰＥＧ化タンパク質は、免疫原性が低いと一般にみなされている（Alconcelら、Polymer Chemistry、２巻（７号）：１４４２～１４４８頁（２０１１年））。ＴＲＡＩＬの極端に短いｔ１／２（げっ歯類では５分未満、ヒトでは３０分）（Kelleyら、J Pharmacol Exp Ther、２９９巻（１号）：３１～３８頁（２００１年）；Ashkenaziら、J Clin Oncol、２６巻（２１号）：３６２１～３６３０頁（２００８年））により、特にｉｎ ｖｉｖｏでＴＲＡＩＬ機能を研究し、薬物の効力を検証することは困難である。ＰＥＧ化ＴＲＡＩＬを、５ｋＤａのＰＥＧ分子と共に、Ｎ末端でトリマー形成に有利に働くイソロイシン－ジッパーアミノ酸モチーフ（ｉＬＺ）を各モノマーの末端に含めてトリマー性ＴＲＡＩＬを安定化することによって産生した（ＴＲＡＩＬＰＥＧ）（ＷＯ２００７／１４５４５７）。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、クリニックにおいて調査され、効力は低いが良好な安全性プロファイルを示したＤｕｌａｎｅｒｍｉｎ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）などの組換えＴＲＡＩＬに対して、ラットおよびサルにおける安定性を顕著に改善し、循環半減期を延長させた（Lemke, J.ら、Cell Death Differ、２０１４年．２１巻（９号）：１３５０～１３６４頁）。
【0132】
材料および方法
膵臓毒性の可能性を調査するために、ＴＲＩＡＬＰＥＧを、膵腺房細胞（ＡＲ４２Ｊ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４９２）（ＡＴＣＣ）および初代ヒト島（膵臓）（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）において試験した。ＡＲ４２Ｊ細胞（ＡＴＣＣ）は、２０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）中で維持した。ヒト膵ランゲルハンス島細胞（＃３５００２－０４、Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を、ヒト膵ランゲルハンス島初代細胞培養完全細胞外マトリックス（＃Ｅ３５００２－０４、Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ）、および血清を含む培地（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ ＃Ｍ３５００２－０４Ｓ）中で維持した。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃で培養した。簡潔に述べると、２×１０４の細胞を、９６ウェルプレート中で２４時間培養し、次いで、ＴＲＡＩＬＰＥＧ（０、１０１、１０２、１０３ｎｇ／ｍＬ）で３時間処理し、細胞生存度を細胞死ＭＴＴアッセイによって分析した。インキュベーション後、ＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。４３０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して決定した。
膵臓毒性の可能性を調査するために、ＴＲＩＡＬＰＥＧを、膵腺房細胞（ＡＲ４２Ｊ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４９２）（ＡＴＣＣ）および初代ヒト島（膵臓）（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）において試験した。ＡＲ４２Ｊ細胞（ＡＴＣＣ）は、２０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）中で維持した。ヒト膵ランゲルハンス島細胞（＃３５００２－０４、Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を、ヒト膵ランゲルハンス島初代細胞培養完全細胞外マトリックス（＃Ｅ３５００２－０４、Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ）、および血清を含む培地（Ｃｅｌｐｒｏｇｅｎ ＃Ｍ３５００２－０４Ｓ）中で維持した。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３７℃で培養した。簡潔に述べると、２×１０４の細胞を、９６ウェルプレート中で２４時間培養し、次いで、ＴＲＡＩＬＰＥＧ（０、１０１、１０２、１０３ｎｇ／ｍＬ）で３時間処理し、細胞生存度を細胞死ＭＴＴアッセイによって分析した。インキュベーション後、ＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。４３０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して決定した。
【0133】
結果
図２に示すように、ＴＲＡＩＬＰＥＧは、腺房細胞（ＡＲ４２Ｊ）および初代ヒト島に対して毒性を全く示さなかった。
図２に示すように、ＴＲＡＩＬＰＥＧは、腺房細胞（ＡＲ４２Ｊ）および初代ヒト島に対して毒性を全く示さなかった。
【0134】
（実施例２）
培養により活性化された膵星細胞は、ＴＲＩＡＬ誘導性アポトーシスに対して感受性になる。
結果は、初代ヒトＰＳＣを培養により活性化した場合に、ＰＳＣが、筋線維芽細胞様細胞に形質転換し、ＤＲ４およびＤＲ５ならびに他の線維形成マーカーを上方調節し、上方調節されたＤＲ５／ＤＲ４を介してＴＲＡＩＬＰＥＧに対して高度に感受性になることを示している。
培養により活性化された膵星細胞は、ＴＲＩＡＬ誘導性アポトーシスに対して感受性になる。
結果は、初代ヒトＰＳＣを培養により活性化した場合に、ＰＳＣが、筋線維芽細胞様細胞に形質転換し、ＤＲ４およびＤＲ５ならびに他の線維形成マーカーを上方調節し、上方調節されたＤＲ５／ＤＲ４を介してＴＲＡＩＬＰＥＧに対して高度に感受性になることを示している。
【0135】
静止状態ＰＳＣ（ｑＰＳＣ）ではなく活性化された初代ヒトＰＳＣ（ａＰＳＣ）は、ＤＲを上方調節し、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対して感受性になる。
材料および方法
初代ヒトＰＳＣにおけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを試験した。ヒトＰＳＣ（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を、製造業者の指示に従って、２％のＦＢＳ、１％の星細胞成長サプリメントおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充したＳｔｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ）中で成長させた。２×１０５のＰＳＣを、ポリ－Ｌ－リシンでコーティングした６ウェルプレート中で培養し、２日間（静止状態）および７日間（活性化された）培養して、分析のために回収した。他の細胞とは異なり、肝星細胞（ＨＳＣ）および膵星細胞（ＰＳＣ）を含む星細胞は、連続世代の培養（例えば、５日間にわたる培養）によって、活性化され、活性化された星細胞へと分化し得る。ＤＲ５およびＤＲ４、α－ＳＭＡ、コラーゲンおよびＴＧＦβならびにＰＤＧＦＲおよびＴＧＦβの発現を、静止状態および活性化された細胞の状態で、ウエスタンブロッティングによって分析した。７日間培養しただけで、活性化が誘導される。
材料および方法
初代ヒトＰＳＣにおけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを試験した。ヒトＰＳＣ（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）を、製造業者の指示に従って、２％のＦＢＳ、１％の星細胞成長サプリメントおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を補充したＳｔｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ）中で成長させた。２×１０５のＰＳＣを、ポリ－Ｌ－リシンでコーティングした６ウェルプレート中で培養し、２日間（静止状態）および７日間（活性化された）培養して、分析のために回収した。他の細胞とは異なり、肝星細胞（ＨＳＣ）および膵星細胞（ＰＳＣ）を含む星細胞は、連続世代の培養（例えば、５日間にわたる培養）によって、活性化され、活性化された星細胞へと分化し得る。ＤＲ５およびＤＲ４、α－ＳＭＡ、コラーゲンおよびＴＧＦβならびにＰＤＧＦＲおよびＴＧＦβの発現を、静止状態および活性化された細胞の状態で、ウエスタンブロッティングによって分析した。７日間培養しただけで、活性化が誘導される。
【0136】
結果
活性化は、ＰＳＣの形態学的変化を誘導し、線維形成マーカー、ならびに重要なことにＤＲ４およびＤＲ５を大幅に上方調節した（図３Ａ～３Ｆ）。細胞を、静止状態または活性化された状態で３時間ＴＲＡＩＬＰＥＧ（１μｇ／ｍＬ）で処理した場合、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスが、細胞アポトーシス特色およびＭＴＴアッセイによって測定される定量化された細胞死によって証明されるように、ｑＰＳＣではなくａＰＳＣにおいて明らかに観察された（図４）。
活性化は、ＰＳＣの形態学的変化を誘導し、線維形成マーカー、ならびに重要なことにＤＲ４およびＤＲ５を大幅に上方調節した（図３Ａ～３Ｆ）。細胞を、静止状態または活性化された状態で３時間ＴＲＡＩＬＰＥＧ（１μｇ／ｍＬ）で処理した場合、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスが、細胞アポトーシス特色およびＭＴＴアッセイによって測定される定量化された細胞死によって証明されるように、ｑＰＳＣではなくａＰＳＣにおいて明らかに観察された（図４）。
【0137】
ＴＲＡＩＬシグナル伝達分子、線維症マーカーおよびアポトーシスマーカーの調節をモニタリングする。
ＴＲＡＩＬシグナル伝達分子、線維症マーカーおよびアポトーシスマーカーの調節を、活性化の間、初代ヒトＰＳＣにおいてモニタリングした。安全性を、初代ヒト島および膵腺房細胞において確認した。
ＴＲＡＩＬシグナル伝達分子、線維症マーカーおよびアポトーシスマーカーの調節を、活性化の間、初代ヒトＰＳＣにおいてモニタリングした。安全性を、初代ヒト島および膵腺房細胞において確認した。
【0138】
材料および方法
代表的なＴＲＡＩＬシグナル伝達および線維症関連分子を、初代ヒトＰＳＣ（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ）においてタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルでスクリーニングした。ＰＳＣを、ＳｔｅＣＭ培地中で２、４および７日間培養により活性化し、回収した。ＴＲＡＩＬシグナル伝達分子ＤＲ５、ＤＲ４およびＦＬＩＰならびに線維症マーカーα－ＳＭＡ、Ｐｄｇｆ－ｒ、１／２／３型コラーゲン、Ｍｍｐ、Ｔｉｍｐ、コラーゲンおよびＴＧＦβ、ならびにカスパーゼ－８、－９、－３、切断されたＰＡＲＰ－１、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＦＬＰＩおよびｃＩＡＰを含むアポトーシスおよび抗アポトーシスマーカーの発現を、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロッティングによって分析した。ＰＳＣの形態学における変化を、顕微鏡によって観察した。ＴＲＡＩＬシグナル伝達分子の発現パターンを確認したところで、ＰＳＣ活性化の間のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスの効果を調査した。分子研究のために、静止状態および培養により活性化されたＰＳＣ（２～７日間）を、１μｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬＰＥＧで処理した。活性化されたＰＳＣを、ＴＲＡＩＬＰＥＧ（１μｇ／ｍＬ）で３時間処理しまたは処理せず、ｑＰＣＲによって分析した。
代表的なＴＲＡＩＬシグナル伝達および線維症関連分子を、初代ヒトＰＳＣ（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ）においてタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルでスクリーニングした。ＰＳＣを、ＳｔｅＣＭ培地中で２、４および７日間培養により活性化し、回収した。ＴＲＡＩＬシグナル伝達分子ＤＲ５、ＤＲ４およびＦＬＩＰならびに線維症マーカーα－ＳＭＡ、Ｐｄｇｆ－ｒ、１／２／３型コラーゲン、Ｍｍｐ、Ｔｉｍｐ、コラーゲンおよびＴＧＦβ、ならびにカスパーゼ－８、－９、－３、切断されたＰＡＲＰ－１、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、ＦＬＰＩおよびｃＩＡＰを含むアポトーシスおよび抗アポトーシスマーカーの発現を、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロッティングによって分析した。ＰＳＣの形態学における変化を、顕微鏡によって観察した。ＴＲＡＩＬシグナル伝達分子の発現パターンを確認したところで、ＰＳＣ活性化の間のＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスの効果を調査した。分子研究のために、静止状態および培養により活性化されたＰＳＣ（２～７日間）を、１μｇ／ｍＬのＴＲＡＩＬＰＥＧで処理した。活性化されたＰＳＣを、ＴＲＡＩＬＰＥＧ（１μｇ／ｍＬ）で３時間処理しまたは処理せず、ｑＰＣＲによって分析した。
【0139】
結果
活性化されたＰＳＣは、複数の抗アポトーシスタンパク質、例えば、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、Ｘ－ＩＡＰを上方調節したが、細胞は、上方調節された切断された（Ｃｌ）ＰＡＲＰ－１、Ｃｌ Ｃａｓｅｐ－８およびＣｌ Ｃａｓｐ－３によって証明されるように、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して感受性のままであった。ほとんどの初代がん細胞の場合、かかる上方調節された抗アポトーシスタンパク質は、ＴＲＡＩＬ誘導性細胞死を強く阻害し、ＴＲＡＩＬ耐性を引き起こす。活性化されたＰＳＣは、がん薬物、例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ、１００ｎＭ）、シスプラチン（ＣＩＳ、１０μＭ）または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、１０μＭ）を含む従来の毒性薬剤と共にインキュベートした場合、死滅させるのが困難であることもまた示された。活性化されたＰＳＣを、ＴＲＡＩＬＰＥＧ（１μｇ／ｍＬ）と共に３時間、毒性薬剤と共に４８時間インキュベートした場合、ＴＲＡＩＬＰＥＧ処理された細胞は、Ｃｌ ＰＡＲＰ－１、Ｃｌ Ｃａｓｐ－８、Ｃｌ Ｃａｓｐ－３およびＣｌ Ｃａｓｐ－９を上方調節したので、ＴＲＡＩＬＰＥＧのみが強いアポトーシスを誘導した。
活性化されたＰＳＣは、複数の抗アポトーシスタンパク質、例えば、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、Ｘ－ＩＡＰを上方調節したが、細胞は、上方調節された切断された（Ｃｌ）ＰＡＲＰ－１、Ｃｌ Ｃａｓｅｐ－８およびＣｌ Ｃａｓｐ－３によって証明されるように、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して感受性のままであった。ほとんどの初代がん細胞の場合、かかる上方調節された抗アポトーシスタンパク質は、ＴＲＡＩＬ誘導性細胞死を強く阻害し、ＴＲＡＩＬ耐性を引き起こす。活性化されたＰＳＣは、がん薬物、例えば、ドキソルビシン（ＤＯＸ、１００ｎＭ）、シスプラチン（ＣＩＳ、１０μＭ）または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、１０μＭ）を含む従来の毒性薬剤と共にインキュベートした場合、死滅させるのが困難であることもまた示された。活性化されたＰＳＣを、ＴＲＡＩＬＰＥＧ（１μｇ／ｍＬ）と共に３時間、毒性薬剤と共に４８時間インキュベートした場合、ＴＲＡＩＬＰＥＧ処理された細胞は、Ｃｌ ＰＡＲＰ－１、Ｃｌ Ｃａｓｐ－８、Ｃｌ Ｃａｓｐ－３およびＣｌ Ｃａｓｐ－９を上方調節したので、ＴＲＡＩＬＰＥＧのみが強いアポトーシスを誘導した。
【0140】
培養により活性化された初代ヒトＰＳＣは、複数の抗アポトーシスタンパク質（ＢＣＬ－ＸＬ、ＢＣＬ－２、Ｘ－ＩＡＰ）を上方調節するが、上方調節された切断された（Ｃｌ）ＰＡＲＰ－１、Ｃｌ Ｃａｓｐ－８（カスパーゼ－８）およびＣｌ Ｃａｓｐ－３（カスパーゼ－３）によって証明されるように、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して感受性のままである。
【0141】
（実施例３）
抗ＤＲ４抗体ではなく抗ＤＲ５抗体は、活性化された膵星細胞において選択的アポトーシスを誘導する。
ＴＲＡＩＬは、その認知受容体（cognitive receptor）ＤＲ４およびＤＲ５に結合することによって、アポトーシスを誘導する。両方のＴＲＡＩＬ受容体が活性化されたＰＳＣにおいてアポトーシスを誘導することが必要かどうかを調査するために、カスパーゼ３／７活性（アポトーシスマーカー）を、活性化されたＰＳＣをヒト抗ＤＲ４アゴニスト抗体（マパツズマブ）または抗ＤＲ５アゴニスト抗体（コナツムマブ）のいずれかで処理することによって測定した。ＤＲ４またはＤＲ５特異的抗体処理について、ＰＳＣを、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で７日間培養により活性化し、逐次濃度（０、１０１、１０２、１０３ｎｇ／ｍＬ）のマパツズマブ（ヒト抗ＤＲ４抗体、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはコナツムマブ（ヒト抗ＤＲ５抗体、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、プロテインＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ＃２１１９３）と共に添加し、３時間インキュベートし、細胞をカスパーゼ活性について試験した。カスパーゼ３／７活性を、製造業者のプロトコールに従って、カスパーゼ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。各試料の発光を、１分の遅延時間および０．５秒／ウェルの読み出し時間のパラメーターを用いて、プレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ）で測定した（ｎ＝４）。
抗ＤＲ４抗体ではなく抗ＤＲ５抗体は、活性化された膵星細胞において選択的アポトーシスを誘導する。
ＴＲＡＩＬは、その認知受容体（cognitive receptor）ＤＲ４およびＤＲ５に結合することによって、アポトーシスを誘導する。両方のＴＲＡＩＬ受容体が活性化されたＰＳＣにおいてアポトーシスを誘導することが必要かどうかを調査するために、カスパーゼ３／７活性（アポトーシスマーカー）を、活性化されたＰＳＣをヒト抗ＤＲ４アゴニスト抗体（マパツズマブ）または抗ＤＲ５アゴニスト抗体（コナツムマブ）のいずれかで処理することによって測定した。ＤＲ４またはＤＲ５特異的抗体処理について、ＰＳＣを、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で７日間培養により活性化し、逐次濃度（０、１０１、１０２、１０３ｎｇ／ｍＬ）のマパツズマブ（ヒト抗ＤＲ４抗体、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）またはコナツムマブ（ヒト抗ＤＲ５抗体、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、プロテインＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ＃２１１９３）と共に添加し、３時間インキュベートし、細胞をカスパーゼ活性について試験した。カスパーゼ３／７活性を、製造業者のプロトコールに従って、カスパーゼ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。各試料の発光を、１分の遅延時間および０．５秒／ウェルの読み出し時間のパラメーターを用いて、プレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ）で測定した（ｎ＝４）。
【0142】
活性化されたＰＳＣの細胞膜上のＤＲ４およびＤＲ５発現プロファイルを調査するために、ヒト初代ＰＳＣを、２および７日間培養により活性化し、細胞を回収し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、抗ヒトＣＤ２６１（ＤＲ４）－ＰＥまたは抗ヒトＣＤ２６２（ＤＲ５）－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共に３０分間インキュベートした。マウスＩｇＧ１ Ｋアイソタイプ対照ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、アイソタイプ対照として使用した。ＴＲＡＩＬ受容体の細胞表面発現を、フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって分析した。組織グラフィカル（histographical）および平均蛍光強度（ＭＦＩ）データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用することによって分析した。
【0143】
結果
図５に示すように、活性化されたＰＳＣを、コナツムマブ（ＤＲ５抗体、１０３ｎｇ／ｍＬ）で処理した場合、カスパーゼ－３／７活性は、１０．７９±１．４２倍増加した。対照的に、マパツズマブ（１０３ｎｇ／ｍＬ）は、カスパーゼ－３／７活性を増加させなかった（１．２７±０．０３倍）。次に、ＰＳＣの細胞膜上のＤＲ４およびＤＲ５の発現を、静止状態（２日目）および活性化されたＰＳＣ（７日目）において、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＤＲ４またはＤＲ５特異的抗体を使用するフローサイトメトリー分析によって調査した。予想外に、平均蛍光強度（ＭＦＩ）における大きなシフトが、ＤＲ４抗体のものと比較して、ＤＲ５抗体処理した活性化されたＰＳＣにおいてのみ観察された（図６Ａおよび６Ｂ）。この結果は、ＤＲ５が、活性化されたＰＳＣの細胞表面上で優勢に発現されることを示した。併せて考えると、活性化されたＰＳＣにおけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスは、ＤＲ４によってではなくＤＲ５によって優勢に媒介されることが示される。
図５に示すように、活性化されたＰＳＣを、コナツムマブ（ＤＲ５抗体、１０３ｎｇ／ｍＬ）で処理した場合、カスパーゼ－３／７活性は、１０．７９±１．４２倍増加した。対照的に、マパツズマブ（１０３ｎｇ／ｍＬ）は、カスパーゼ－３／７活性を増加させなかった（１．２７±０．０３倍）。次に、ＰＳＣの細胞膜上のＤＲ４およびＤＲ５の発現を、静止状態（２日目）および活性化されたＰＳＣ（７日目）において、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識したＤＲ４またはＤＲ５特異的抗体を使用するフローサイトメトリー分析によって調査した。予想外に、平均蛍光強度（ＭＦＩ）における大きなシフトが、ＤＲ４抗体のものと比較して、ＤＲ５抗体処理した活性化されたＰＳＣにおいてのみ観察された（図６Ａおよび６Ｂ）。この結果は、ＤＲ５が、活性化されたＰＳＣの細胞表面上で優勢に発現されることを示した。併せて考えると、活性化されたＰＳＣにおけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスは、ＤＲ４によってではなくＤＲ５によって優勢に媒介されることが示される。
【0144】
（実施例４）
アルコールで活性化された膵星細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性および抗ＤＲ５抗体誘導性アポトーシスに対して感受性になる。
慢性膵炎の主要な原因（全ての症例のうちおよそ７０％における）は、アルコール乱用である。アルコールであるエタノール（ＥｔＯＨ）によって活性化した場合、静止状態ＰＳＣは、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４およびＤＲ５を大幅に上方調節し、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して感受性になることが示される。
アルコールで活性化された膵星細胞は、ＴＲＡＩＬ誘導性および抗ＤＲ５抗体誘導性アポトーシスに対して感受性になる。
慢性膵炎の主要な原因（全ての症例のうちおよそ７０％における）は、アルコール乱用である。アルコールであるエタノール（ＥｔＯＨ）によって活性化した場合、静止状態ＰＳＣは、ＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４およびＤＲ５を大幅に上方調節し、ＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスに対して感受性になることが示される。
【0145】
材料および方法
ＰＳＣ活性化に対するアルコールの効果を調査するために、２×１０５のヒト初代ＰＳＣを、ポリ－Ｌ－リシンでコーティングした６ウェルプレート中で培養し、２４時間培養し、エタノール（ＥｔＯＨ）（０、３０、５０ｍＭ）で４８時間処理した。アルコール刺激後、細胞を、リアルタイムｑＰＣＲ分析およびウエスタンブロッティングのために回収した。ＤＲ４、ＤＲ５を含むＴＲＡＩＬシグナル伝達分子、ならびにａ－ＳＭＡ（Ａｃｔａ２）、コラーゲンを含む線維形成性因子の発現を分析する。アルコールで活性化されたＰＳＣにおけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを調査するために、２×１０４の細胞を、９６ウェルプレート中で一晩培養し、次いで、５０ｍＭ ＥｔＯＨで４８時間活性化した。ＥｔＯＨで活性化されたＰＳＣを、種々の濃度（０、１０１、１０２、１０３ｎｇ／ｍＬ）のＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬＰＥＧ、マパツズマブ（ヒト抗ＤＲ４抗体）またはコナツムマブ（ヒト抗ＤＲ５抗体）で処理し、３時間インキュベートした。アポトーシスを、上記のようにＭＴＴ細胞死アッセイおよびカスパーゼ３／７アッセイによって測定した。
ＰＳＣ活性化に対するアルコールの効果を調査するために、２×１０５のヒト初代ＰＳＣを、ポリ－Ｌ－リシンでコーティングした６ウェルプレート中で培養し、２４時間培養し、エタノール（ＥｔＯＨ）（０、３０、５０ｍＭ）で４８時間処理した。アルコール刺激後、細胞を、リアルタイムｑＰＣＲ分析およびウエスタンブロッティングのために回収した。ＤＲ４、ＤＲ５を含むＴＲＡＩＬシグナル伝達分子、ならびにａ－ＳＭＡ（Ａｃｔａ２）、コラーゲンを含む線維形成性因子の発現を分析する。アルコールで活性化されたＰＳＣにおけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを調査するために、２×１０４の細胞を、９６ウェルプレート中で一晩培養し、次いで、５０ｍＭ ＥｔＯＨで４８時間活性化した。ＥｔＯＨで活性化されたＰＳＣを、種々の濃度（０、１０１、１０２、１０３ｎｇ／ｍＬ）のＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬＰＥＧ、マパツズマブ（ヒト抗ＤＲ４抗体）またはコナツムマブ（ヒト抗ＤＲ５抗体）で処理し、３時間インキュベートした。アポトーシスを、上記のようにＭＴＴ細胞死アッセイおよびカスパーゼ３／７アッセイによって測定した。
【0146】
結果
図７Ａ～７Ｅに示すように、ＥｔＯＨ（５０ｍＭ）で４８時間処理した静止状態ＰＳＣは、活性化されていないＰＳＣと比較して、α－ＳＭＡ（Ａｃｔａ２、３．７．５±０．２９倍）、コラーゲン（Ｃｏｌ１α２、４．０±０．４３倍）、ＰＤＧＦ受容体（Ｐｄｇｆ－ｒ、１．９±０．２５倍）ならびにＴＲＡＩＬ受容体（ＤＲ４；２．１±０．１２、ＤＲ５、１．８±０．０．０９倍）のｍＲＮＡレベルを、持続的に上方調節した。さらに、ＥｔＯＨ（５０ｍＭ）によって活性化されたＰＳＣは、活性化されていないＰＳＣと比較して大幅に増加した、ＴＲＡＩＬＰＥＧに対する細胞死（５９．９５±６．３７％細胞死）およびカスパーゼ３／７活性（アポトーシスマーカー、１０．４５±１．６０倍）を実証した（図８Ａおよび８Ｂ）。
図７Ａ～７Ｅに示すように、ＥｔＯＨ（５０ｍＭ）で４８時間処理した静止状態ＰＳＣは、活性化されていないＰＳＣと比較して、α－ＳＭＡ（Ａｃｔａ２、３．７．５±０．２９倍）、コラーゲン（Ｃｏｌ１α２、４．０±０．４３倍）、ＰＤＧＦ受容体（Ｐｄｇｆ－ｒ、１．９±０．２５倍）ならびにＴＲＡＩＬ受容体（ＤＲ４；２．１±０．１２、ＤＲ５、１．８±０．０．０９倍）のｍＲＮＡレベルを、持続的に上方調節した。さらに、ＥｔＯＨ（５０ｍＭ）によって活性化されたＰＳＣは、活性化されていないＰＳＣと比較して大幅に増加した、ＴＲＡＩＬＰＥＧに対する細胞死（５９．９５±６．３７％細胞死）およびカスパーゼ３／７活性（アポトーシスマーカー、１０．４５±１．６０倍）を実証した（図８Ａおよび８Ｂ）。
【0147】
アルコールが培養物中になおも存在したままで、アルコールで活性化されたＰＳＣを異なる濃度のＴＲＡＩＬＰＥＧ、コナツムマブ（contumumab）（抗ＤＲ５アゴニスト抗体）およびマパツズマブ（maptumumab）（抗ＤＲ４アゴニスト抗体）で処理した場合、ＴＲＡＩＬＰＥＧおよびコナツムマブのみが、強いアポトーシスを用量依存的に誘導した（図９）。実施例３に記載したように、抗ＤＲ４抗体マパツズマブは、アルコールで活性化されたＰＳＣにおいて毒性を全く誘導しなかった。研究は、抗ＤＲ５アゴニスト抗体のみが、活性化された膵星細胞においてアポトーシスを誘導することを実証している。ヒトＴＲＡＩＬおよびＴＲＩＡＬＰＥＧは、ＤＲ４およびＤＲ５の両方に結合するが、抗体は、ＤＲ４またはＤＲ５のいずれかにのみ結合する。これらの結果は、ヒトＴＲＡＩＬアナログおよび抗ＤＲ５アゴニスト抗体が、膵臓中の上方調節されたＤＲ５を標的化することによって、膵線維症、疼痛および膵炎を処置するために有用であることを確認する。
【0148】
（実施例５）
ＰＳＣ－侵害受容器－ＴＧＦβ軸に対するＴＲＡＩＬシグナル伝達の抗侵害受容的役割。
活性化されたＰＳＣは、ＴＧＦβを上方調節することが示されている（図３Ｂ）。従って、活性化されたＰＳＣは、ＴＧＦβの支配的な細胞供給源であり、疼痛の侵害受容性過敏化において役割を果たし得る。
ＰＳＣ－侵害受容器－ＴＧＦβ軸に対するＴＲＡＩＬシグナル伝達の抗侵害受容的役割。
活性化されたＰＳＣは、ＴＧＦβを上方調節することが示されている（図３Ｂ）。従って、活性化されたＰＳＣは、ＴＧＦβの支配的な細胞供給源であり、疼痛の侵害受容性過敏化において役割を果たし得る。
【0149】
材料および方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＲＧ（後根神経節）由来の感覚ニューロンの興奮性に対する、活性化されたＰＳＣの効果を、単離されたラットＤＲＧを、無血清順化培地中の培養により活性化されたＰＳＣ（７日間）から得られた順化培地（ＰＳＣ－ＣＭ）と共にインキュベートすることによって試験した。興奮性を、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器を用いたホールセルパッチクランプ電気生理学的記録によって評価し、Ｄｉｇｉｄａｔａ １２００でデジタル化した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＲＧ（後根神経節）由来の感覚ニューロンの興奮性に対する、活性化されたＰＳＣの効果を、単離されたラットＤＲＧを、無血清順化培地中の培養により活性化されたＰＳＣ（７日間）から得られた順化培地（ＰＳＣ－ＣＭ）と共にインキュベートすることによって試験した。興奮性を、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器を用いたホールセルパッチクランプ電気生理学的記録によって評価し、Ｄｉｇｉｄａｔａ １２００でデジタル化した。
【0150】
結果
図１０Ａ～１０Ｅで実証されるように、ＰＳＣ－ＣＭは、ＤＲＧからの大幅な匹敵する応答を引き起こし、これは、ＰＳＣ活性化が、侵害受容器過敏化において重要な役割を果たすことを示している。ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置は、慢性膵炎モデルにおいて実証されるように、疼痛を反転させた（図１６、実施例６）。従って、活性化されたＰＳＣは、ＴＧＦβの産生を介して侵害受容器を過敏化し、痛覚過敏を促進したが、これは、ＴＲＡＩＬＰＥＧによって遮断された。
図１０Ａ～１０Ｅで実証されるように、ＰＳＣ－ＣＭは、ＤＲＧからの大幅な匹敵する応答を引き起こし、これは、ＰＳＣ活性化が、侵害受容器過敏化において重要な役割を果たすことを示している。ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置は、慢性膵炎モデルにおいて実証されるように、疼痛を反転させた（図１６、実施例６）。従って、活性化されたＰＳＣは、ＴＧＦβの産生を介して侵害受容器を過敏化し、痛覚過敏を促進したが、これは、ＴＲＡＩＬＰＥＧによって遮断された。
【0151】
（実施例６）
抗線維化および抗疼痛ＣＰ治療のためにＴＲＡＩＬＰＥＧを利用する。
デス受容体が抗線維化および抗疼痛治療および診断のための有益な標的であることを確認するために、強力な抗線維化、抗疼痛薬物としてのＴＲＡＩＬＰＥＧの効力を調査した。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、急性膵炎（図１１）および慢性膵炎（図１３Ａ～１５）の両方において、強い抗線維化効力を示した。その抗疼痛効力を、ラットＣＰモデルにおいて実証した（図１６）。研究は、全身投与されたＴＲＡＩＬＰＥＧが、動物モデルにおいて急性膵炎（ＡＰ）および慢性膵炎（ＣＰ）の両方を寛解させ、ＣＰモデルにおいて、痛覚過敏と呼ばれる身体における減退を引き起こすことを実証している。
抗線維化および抗疼痛ＣＰ治療のためにＴＲＡＩＬＰＥＧを利用する。
デス受容体が抗線維化および抗疼痛治療および診断のための有益な標的であることを確認するために、強力な抗線維化、抗疼痛薬物としてのＴＲＡＩＬＰＥＧの効力を調査した。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、急性膵炎（図１１）および慢性膵炎（図１３Ａ～１５）の両方において、強い抗線維化効力を示した。その抗疼痛効力を、ラットＣＰモデルにおいて実証した（図１６）。研究は、全身投与されたＴＲＡＩＬＰＥＧが、動物モデルにおいて急性膵炎（ＡＰ）および慢性膵炎（ＣＰ）の両方を寛解させ、ＣＰモデルにおいて、痛覚過敏と呼ばれる身体における減退を引き起こすことを実証している。
【0152】
材料および方法
急性膵炎（ＡＰ）を、ラット（２２０～２４０ｇ）における２０μｇ／ｋｇセルレインの１時間に１回の腹腔内注射４回によって誘導し、セルレインの最後の注射の２時間後に、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧ（ｉ．ｖ．、４ｍｇ／ｋｇ、単回注射）で処置した。２つの対照群を、セルレインで処置せずにＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置した。ＡＰラットを、ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置の２４時間後に屠殺した。
急性膵炎（ＡＰ）を、ラット（２２０～２４０ｇ）における２０μｇ／ｋｇセルレインの１時間に１回の腹腔内注射４回によって誘導し、セルレインの最後の注射の２時間後に、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧ（ｉ．ｖ．、４ｍｇ／ｋｇ、単回注射）で処置した。２つの対照群を、セルレインで処置せずにＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで処置した。ＡＰラットを、ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置の２４時間後に屠殺した。
【0153】
実験的アルコール誘導性慢性膵炎（ＣＰ）のモデルを、ラットにおいて誘導した（Bertola, A.ら、Nat Protoc、２０１３年．８巻（３号）：６２７～６３７頁；Deng, X.ら、Am J Pathol、２００５年．１６６巻（１号）：９３～１０６頁）。図１２に示されるように、４つの群のラット（ｎ＝８、各群）に、７日間０から３６％まで段階的に増加させたＥｔＯＨ濃度と共に、Ｌｉｅｂｅｒ－Ｄｅｃａｒｌｉ（ＬＤ）流動食を給餌し、次いで、最大で６週間３６％のＥｔＯＨを給餌した。ラットを、１４、２１、２８、３５および４１日目にセルレイン（１時間に１回、４回のｉ．ｐ．注射）で処置した。ＴＲＡＩＬＰＥＧ（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）またはＰＢＳ（対照）を、３６日目に開始して７日間毎日注射した。食餌中にアルコールを含まない２つの対照群を、ＰＢＳまたはＴＲＡＩＬＰＥＧで静脈内処置した。
【0154】
Ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（ＶＦＦ）法は、げっ歯類における疼痛の機構の研究のための重要なツールである（Zhuら、Mol Pain、８巻：６５頁（２０１２年））。４３日目の処置後、ＶＦＦ試験を使用して、侵害受容を研究した。ＶＦＦ研究後、動物を屠殺し、膵臓標本を回収し、ＩＨＣ、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロッティングによって分析した。膵組織中のヒドロキシプロリン（コラーゲンマーカー）レベルを、ヒドロキシプロリンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）によって分析した。
【0155】
結果
Ｈ＆Ｅで染色し、浸潤性好中球（ＭＰＯ）について免疫染色した膵組織の写真は、ＰＢＳ処置したＡＰ群（Ｃｅｒ－ＰＢＳ）と比較した場合のＴＲＡＩＬＰＥＧ（Ｃｅｒ－ＴＲＡＩＬ）の抗炎症効力を実証した。静脈内ＴＲＡＩＬＰＥＧ（Ｃｅｒ－ＴＲＡＩＬ）は、セルレイン誘導性ＡＰラット（Ｃｅｒ－ＰＢＳ）において急性膵炎（ＡＰ）を保護する。定量化した結果を図１１に示す。
Ｈ＆Ｅで染色し、浸潤性好中球（ＭＰＯ）について免疫染色した膵組織の写真は、ＰＢＳ処置したＡＰ群（Ｃｅｒ－ＰＢＳ）と比較した場合のＴＲＡＩＬＰＥＧ（Ｃｅｒ－ＴＲＡＩＬ）の抗炎症効力を実証した。静脈内ＴＲＡＩＬＰＥＧ（Ｃｅｒ－ＴＲＡＩＬ）は、セルレイン誘導性ＡＰラット（Ｃｅｒ－ＰＢＳ）において急性膵炎（ＡＰ）を保護する。定量化した結果を図１１に示す。
【0156】
ＣＰモデルでは、膵線維化が、コラーゲンおよびα－ＳＭＡ（活性化されたＰＳＣのマーカー）（図１３Ａおよび１３Ｂ）ならびに複数の線維形成マーカー（図１４Ａ～１４Ｉ）の高い発現によって実証された。ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置は、コラーゲン沈着を大幅に低減させ、α－ＳＭＡおよびＰＤＧＦＲβ、ならびにコラーゲン（Ｃｏｌ１ａ２、Ｃｏｌ３ａ１）、ＴＩＭＰ（メタロプロテイナーゼの組織阻害剤）、フィブロネクチン、Ｐａｐ（膵炎関連タンパク質）およびＴＧＦβを含む他の線維形成マーカーおよび膵炎マーカーを下方調節した（図１４Ａ～１４Ｉ）。ヒドロキシプロリンレベルは、ＣＰモデルにおいて高度に増加した。ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置は、膵臓中のヒドロキシプロリン含量を大幅に低減させた（図１５）。切断されたカスパーゼ－８は、ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置したＣＰにおいてのみ大幅に上方調節され、これは、活性化されたＰＳＣの根絶が、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに起因し得ることを示している。重要なことに、膵組織の二重免疫染色（ａＰＳＣ－ａ－ＳＭＡ染色、アポトーシス－ＴＵＮＥＬ染色および核－ＤＡＰＩ染色）を介して、アポトーシス（ＴＵＮＥＬ染色）が、α－ＳＭＡ＋ａＰＳＣにおいて特異的に生じたことを検証できた。正常ラットへのＴＲＡＩＬＰＥＧ単独の全身投与は、目を引く毒性を全く誘導しなかった。例えば、ＴＲＡＩＬＰＥＧ処置は、未処置ＣＰラットと比較して、肝臓損傷の有用なマーカーであるＡＬＴレベルを、大幅に正常化した。
【0157】
ＣＰには、重症で一定の腹部痛が伴う。驚くべきことに、ＴＲＡＩＬＰＥＧは、ＣＰモデルにおいて抗侵害受容効力を示した。ＴＲＡＩＬＰＥＧは、エタノール／セルレイン／ＬＤ食誘導性ＣＰラットにおいて、体性と呼ばれる痛覚過敏を減少させた。ＴＲＡＩＬＰＥＧ（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）処置した動物（ｎ＝４）は、ＶＦＦ試験によって測定した場合、体性と呼ばれる痛覚過敏における大幅な減退を実証した（図１６）。ＮＧＦ（神経成長因子）またはＴＧＦβによるＤＲＧニューロンの処理は、それらの興奮性における変化を誘導し、ＣＰにおける侵害受容性興奮性の特徴である特異的電位依存性カリウム電流（ＩＡ）（Zhuら、Mol Pain、８号：６５頁（２０１２年））を抑制したことがここで示された。ＴＧＦβは、侵害受容器をそれ自体過敏化し、膵痛覚過敏を誘導し得る。予備研究において、ＰＳＣが活性化プロセスの間にＴＧＦβを上方調節し、ａＰＳＣから得た順化培地（ＣＭ）がＤＲＧニューロンの興奮性に影響することが検証された。活性化されたＰＳＣは、ＴＧＦβを上方調節し（図３Ｂ）、ａＰＳＣから得た順化培地（ＣＭ）は、ＤＲＧニューロンの興奮性に影響する（図１０）。従って、活性化されたＰＳＣは、膵臓において侵害受容性過敏化を担うべき優勢な細胞型であり、ＰＳＣ活性化は、侵害受容器過敏化において重要な役割を果たす。従って、この技術は、デス受容体アゴニストを利用することによって、ＰＳＣ活性化を選択的に遮断し、またはＴＧＦβおよびＮＧＦ（神経成長因子）の支配的な細胞供給源の１つである活性化されたＰＳＣを枯渇させることによって、疼痛を寛解させるための新たな方法を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図14G】
【図14H】
【図14I】
【図15】
【図16】
【配列表】