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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-19
(45)【発行日】2023-05-29
(54)【発明の名称】電気生理学的解析を可能にした原子間力顕微鏡
(51)【国際特許分類】
G01Q 60/60 20100101AFI20230522BHJP
G01Q 10/04 20100101ALI20230522BHJP
G01Q 30/14 20100101ALI20230522BHJP
G01Q 60/24 20100101ALI20230522BHJP
【ＦＩ】
G01Q60/60
G01Q10/04 101
G01Q30/14
G01Q60/24
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019153689
(22)【出願日】2019-08-26
(65)【公開番号】P2021032725
(43)【公開日】2021-03-01
【審査請求日】2022-06-16
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、「高速原子間力顕微鏡１分子計測のデータ同化による生体分子４次元構造解析法の開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114074
【弁理士】
【氏名又は名称】大谷 嘉一
(72)【発明者】
【氏名】古寺 哲幸
(72)【発明者】
【氏名】米川 拓臣
(72)【発明者】
【氏名】執行 航希
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 信嗣
(72)【発明者】
【氏名】安藤 敏夫
【審査官】佐々木 崇
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－０３２３８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－２７５４８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－０８５６００（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－０６６１４０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０４９２４０９１（ＵＳ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｑ１０／００－９０／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
先端部に試料を配置するナノピペットと、自由端に探針を有するカンチレバーと、前記カンチレバーの変位を検出するための変位センサーとを備え、
前記探針はセル部の内部に配置してあり、
前記ナノピペットは走査機構を有し
前記ナノピペットの内部に有する内部の電極と、電解質溶液が収容された前記セル部に有する外部の電極とにて、電解質溶液中のイオンの挙動による試料の、電気生理学的変化と構造変化とを観察可能にしたことを特徴とする原子間力顕微鏡。
【請求項2】
前記ナノピペットの走査機構は相互に直交するＸ軸方向及びＹ軸方向のＸ－Ｙ面と、前記Ｘ－Ｙ面に直交するＺ軸方向に走査制御可能であることを特徴とする請求項１記載の原子間力顕微鏡。
【請求項3】
前記ナノピペットの先端孔の内径は１０～１００ｎｍの範囲であることを特徴とする請求項１記載の原子間力顕微鏡。
【請求項4】
請求項３記載の原子間力顕微鏡を用いた膜輸送タンパク質の電気生理学的機能解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、原子間力顕微鏡に関し、特に試料の電気生理学的変化と構造変化を同時に観察できる原子間力顕微鏡に係る。
【背景技術】
【0002】
これまでに、生体膜中にある、イオンチャンネルやトランスポーター等の膜輸送タンパク質の機能解析にパッチクランプ法を代表とする電気生理学的手法が採用されている（特許文献１）。
しかし、パッチクランプ法では、膜輸送体の電気生理学的変化に伴う構造変化までは観察することができない。
一方、試料の構造をナノメートルオーダーの高い解像度で観察する手段として、高速原子間力顕微鏡が知られている（特許文献２）。
しかし、これまでの原子間力顕微鏡では、試料の電気生理学的変化を解析することが難しい。
しかし、パッチクランプ法では、膜輸送体の電気生理学的変化に伴う構造変化までは観察することができない。
一方、試料の構造をナノメートルオーダーの高い解像度で観察する手段として、高速原子間力顕微鏡が知られている（特許文献２）。
しかし、これまでの原子間力顕微鏡では、試料の電気生理学的変化を解析することが難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２００４－３３３４８５号公報
【文献】国際公開ＷＯ２００８／０２９５６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、試料の電気生理学的変化とそれに伴う構造変化を同時に観察できる原子間力顕微鏡の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明に係る原子間力顕微鏡は、先端部に試料を配置するナノピペットと、自由端に探針を有するカンチレバーと、前記カンチレバーの変位を検出するための変位センサーとを備え、前記ナノピペットは走査機構を有することで試料に有する、電気生理学的変化と構造変化とを観察可能にしたことを特徴とする。
【0006】
ここで、カンチレバーの自由端に有する探針と試料の表面との間の原子間力によって生ずる相互作用により、カンチレバーに変位が生ずる。
この相互作用量が一定になるように試料の表面を相対的に走査すると、カンチレバーの変位量により試料の表面の情報が得られる。
本発明においては、生体膜等をナノピペットの先端孔に配置したので、相対的な走査機構をこのナノピペット側に設けた。
この相互作用量が一定になるように試料の表面を相対的に走査すると、カンチレバーの変位量により試料の表面の情報が得られる。
本発明においては、生体膜等をナノピペットの先端孔に配置したので、相対的な走査機構をこのナノピペット側に設けた。
【0007】
本発明でナノピペットは、極細のガラス管等にて形成されるが、生体膜等の試料にプレッシャー等の外力を加えたり、電気的変位を加えたりするために用いられる。
試料に電気的変位を加え、電気生理学的変化を観察する場合には、ナノピペットは内部と外部とに一対の電極を配置してあるのがよい。
試料に電気的変位を加え、電気生理学的変化を観察する場合には、ナノピペットは内部と外部とに一対の電極を配置してあるのがよい。
【0008】
本発明にて、ナノピペットの走査機構は相互に直交するＸ軸方向及びＹ軸方向のＸ－Ｙ面と、前記Ｘ－Ｙ面に直交するＺ軸方向に走査制御可能であってよい。
【0009】
本発明に係る原子間力顕微鏡は、細胞等のいろいろなものが対象になるが、膜輸送体等の輸送活性を観察するには、試料を溶液中に保持するためのセル部を有し、前記探針は前記セル部の内部に配置してあるのが好ましい。
この場合に、ナノピペットの先端孔の内径は１０～１００ｎｍの範囲であるのがよい。
また、上記先端孔は１つに限る必要はなく、複数の孔を有するマルチ孔タイプのナノピペットでもよい。
この場合に、ナノピペットの先端孔の内径は１０～１００ｎｍの範囲であるのがよい。
また、上記先端孔は１つに限る必要はなく、複数の孔を有するマルチ孔タイプのナノピペットでもよい。
【発明の効果】
【0010】
本発明に係る原子間力顕微鏡は、ナノピペットの先端部に試料を付着等により配置し、この試料にプレッシャーや電気刺激を与えることで、試料の電気生理学的変化と同時にその構造変化を観察できる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本発明に係る電気生理学的解析を可能にした原子間力顕微鏡の要部の模式図を示す。
【図2】ナノピペットの先端孔に膜輸送体を含んだ脂質二重膜を付着させ、輸送活性を観察する例を示す。
【図3】走査機構とカンチレバーの構造例を示す。
【図4】走査機構の構成例を示す。
【図5】（ａ）はピペットの取付構造例を示し、（ｂ）はカンチレバーとの位置関係を示す。
【図6】ナノピペットの先端孔付近での観察像の例を示し、（ｂ）はリポソーム添加前、（ｃ）はリポソーム添加後を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明に係る原子間力顕微鏡の構成例を図に基づいて説明する。
図１，２に要部の拡大図を示し、図３，４に走査機構の構成例を示す。
図１に示し、後述する走査機構により、Ｘ－Ｙ面及びそれに直交するＺ軸方向に位置制御可能に取り付けられたナノピペット１１と、このナノピペット１１の先端孔１１ｂに対向配置されたカンチレバー１２を備えている。
図１，２に要部の拡大図を示し、図３，４に走査機構の構成例を示す。
図１に示し、後述する走査機構により、Ｘ－Ｙ面及びそれに直交するＺ軸方向に位置制御可能に取り付けられたナノピペット１１と、このナノピペット１１の先端孔１１ｂに対向配置されたカンチレバー１２を備えている。
【0013】
カンチレバー１２は、自由端側に設けた探針１２ａと、この探針１２ａが電解質を含有する溶液を収容するセル部１３の内部に位置するように設けられている。
ナノピペット１１の先端孔１１ｂには、観察対象となる試料１が付着等により配置される。
ナノピペット１１の内部の孔１１ａ中には電解質等が充填され、内部の電極１４ａを有し、セル部１３の内部には外部の電極１４ｂが配置され、この一対の電極間の電位や電流を制御したり、その変位が検出される。
ナノピペット１１の先端孔１１ｂには、観察対象となる試料１が付着等により配置される。
ナノピペット１１の内部の孔１１ａ中には電解質等が充填され、内部の電極１４ａを有し、セル部１３の内部には外部の電極１４ｂが配置され、この一対の電極間の電位や電流を制御したり、その変位が検出される。
【0014】
探針１２ａと試料１の表面間には、原子間力により相互作用が生じる。
例えば、相互作用量が一定になるように制御し、探針１２ａの変位量を検出することで、試料の表面の構造変化等の情報が得られる。
この探針１２ａの変位は、セル部１３の下面等からレーザー光等の光学的変位センサー等にて、カンチレバー１２の背面等を介して検出される。
例えば、相互作用量が一定になるように制御し、探針１２ａの変位量を検出することで、試料の表面の構造変化等の情報が得られる。
この探針１２ａの変位は、セル部１３の下面等からレーザー光等の光学的変位センサー等にて、カンチレバー１２の背面等を介して検出される。
【0015】
本発明の観察対象となる試料に制限はないものの、特に有効なのはナノピペットにて電気生理学的な刺激等を付与し、その電気生理学的変化とそれに伴う試料の表面の構造変化を観察するのに有効である。
例えば、図２に脂質二重膜に再構成された膜輸送体１のイオンチャンネル１ａへのイオン２の挙動に伴う電気生理学的変化の観察例を示す。
観察画像を図６に示し、試料表面の構造変化を図７のグラフに示す。
図６（ｂ）は、セル部の電解質溶液中にリポソームを添加する前のＡＦＭ像を示し、図６（ｃ）はリポソーム添加後のＡＦＭ像を示す。
これに対応した計測結果を図７に示す。
このように、イオンチャンネルのような膜輸送体の挙動とその構造変化を同時に観察できる性能があることが示された。
例えば、図２に脂質二重膜に再構成された膜輸送体１のイオンチャンネル１ａへのイオン２の挙動に伴う電気生理学的変化の観察例を示す。
観察画像を図６に示し、試料表面の構造変化を図７のグラフに示す。
図６（ｂ）は、セル部の電解質溶液中にリポソームを添加する前のＡＦＭ像を示し、図６（ｃ）はリポソーム添加後のＡＦＭ像を示す。
これに対応した計測結果を図７に示す。
このように、イオンチャンネルのような膜輸送体の挙動とその構造変化を同時に観察できる性能があることが示された。
【0016】
本発明において試料の走査機構は、各種機構を用いることができる。
例として、その走査機構を図３～図５に示す。
ナノピペット１１を配置したステージ２１の模式図を図４に示す。
それぞれ圧電素子からなるＸピエゾ素子２２と、Ｙピエゾ素子２３にてＸ－Ｙ面を形成し、このＸ－Ｙ面に直交する方向にＺピエゾ素子２４を配置してある。
ステージ２１には、複数の切り込み２１ａ，２１ｂを入れることで、Ｘピエゾ素子２２とＹピエゾ素子２３に変位に対する復帰方向の付勢力が作用する。
例として、その走査機構を図３～図５に示す。
ナノピペット１１を配置したステージ２１の模式図を図４に示す。
それぞれ圧電素子からなるＸピエゾ素子２２と、Ｙピエゾ素子２３にてＸ－Ｙ面を形成し、このＸ－Ｙ面に直交する方向にＺピエゾ素子２４を配置してある。
ステージ２１には、複数の切り込み２１ａ，２１ｂを入れることで、Ｘピエゾ素子２２とＹピエゾ素子２３に変位に対する復帰方向の付勢力が作用する。
【0017】
Ｚピエゾ素子２４に、ナノピペット１１を固定した構造例を図５に示す。
ナノピペット１１の外周部をパイプ状の保持部１５にて保持しつつ、固定治具１６にてＺピエゾ素子に固定した例になっている。
ナノピペット１１の先端部は、振動等により揺れないようにしつつ、探針１２ａと干渉しないように保持部の先端部１５ａをＹ字形状に切り欠き、さらにその先端部１５ａとナノピペット１１との間の隙間部１５ｂを、例えばエポキシ樹脂（接着剤）にて埋めた。
図４に示したステージ２１を逆さにして、図５（ｂ）に示すようにカンチレバー１２に向けて配置した構造を図３に模式的に示す。
ナノピペット１１の後部側からＬＥＤライト３０を投光し、ナノピペット１１の先端が光学顕微鏡の焦点面に一致するとスポット状に光るので、このスポット状の光とカンチレバーの探針１２ａが合うようにアプローチを行い、位置合せを行うことができる。
ナノピペット１１の外周部をパイプ状の保持部１５にて保持しつつ、固定治具１６にてＺピエゾ素子に固定した例になっている。
ナノピペット１１の先端部は、振動等により揺れないようにしつつ、探針１２ａと干渉しないように保持部の先端部１５ａをＹ字形状に切り欠き、さらにその先端部１５ａとナノピペット１１との間の隙間部１５ｂを、例えばエポキシ樹脂（接着剤）にて埋めた。
図４に示したステージ２１を逆さにして、図５（ｂ）に示すようにカンチレバー１２に向けて配置した構造を図３に模式的に示す。
ナノピペット１１の後部側からＬＥＤライト３０を投光し、ナノピペット１１の先端が光学顕微鏡の焦点面に一致するとスポット状に光るので、このスポット状の光とカンチレバーの探針１２ａが合うようにアプローチを行い、位置合せを行うことができる。
【0018】
図８に、アクチン腺維を観察した例を示す。
図８（ａ）は、図４の走査機構を有するＺスキャナーの周波数特性の一例を示し、図８（ｂ）にＡＦＭ像を示す。
アクチン腺維の螺旋ピッチも観察できたことから、分子形状のイメージングも可能であった。
図８（ａ）は、図４の走査機構を有するＺスキャナーの周波数特性の一例を示し、図８（ｂ）にＡＦＭ像を示す。
アクチン腺維の螺旋ピッチも観察できたことから、分子形状のイメージングも可能であった。
【符号の説明】
【0019】
１ 膜輸送体（脂質二重膜）
１ａ イオンチャンネル
２ イオン
１１ ナノピペット
１１ａ 孔
１１ｂ 先端孔
１２ カンチレバー
１２ａ 探針
１３ セル部
１４ａ 電極
１４ｂ 電極
１５ 保持部
１６ 固定治具
２０ 走査機構
２１ ステージ
２２ Ｘピエゾ素子
２３ Ｙピエゾ素子
２４ Ｚピエゾ素子
３０ ＬＥＤライト
１ａ イオンチャンネル
２ イオン
１１ ナノピペット
１１ａ 孔
１１ｂ 先端孔
１２ カンチレバー
１２ａ 探針
１３ セル部
１４ａ 電極
１４ｂ 電極
１５ 保持部
１６ 固定治具
２０ 走査機構
２１ ステージ
２２ Ｘピエゾ素子
２３ Ｙピエゾ素子
２４ Ｚピエゾ素子
３０ ＬＥＤライト
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
