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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-19
(45)【発行日】2023-05-29
(54)【発明の名称】リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/08 20060101AFI20230522BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230522BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20230522BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230522BHJP
【ＦＩ】
C12P21/08
C12N15/13 ZNA
C12N15/11 Z
C12N15/63 Z
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019563521
(86)(22)【出願日】2018-05-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-07-16
(86)【国際出願番号】 IN2018050315
(87)【国際公開番号】W WO2018211529
(87)【国際公開日】2018-11-22
【審査請求日】2021-05-17
(31)【優先権主張番号】201711017654
(32)【優先日】2017-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(73)【特許権者】
【識別番号】596020691
【氏名又は名称】カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＆ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バンブレ、ラフル・シャラド
(72)【発明者】
【氏名】ガニ、カヤナット・マハマッダッキ
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／００５９３１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１４／１７８０７８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２００８－５１２０８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０２９６２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００３－１０２４９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Microbial Cell Factories，2016年，Vol.15，Article No.22，DOI:10.1186/s12934-016-0419-5
【文献】Protein Science，2004年，Vol.13，p.1698-1703，DOI:10.1110/ps.04644504
【文献】Journal of Bioscience and Bioengineering，2005年，Vol.99, No.4，p.303-310，DOI:10.1263/jbb.99.303
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ １５／１１
Ｃ１２Ｎ １５／６３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）１つのベクターにつき、抗体フラグメントの重鎖をコードする配列番号１を有するヌクレオチド配列及び抗体フラグメントの軽鎖をコードする配列番号３を有するヌクレオチド配列を両方とも含む、ベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、ｂ）前記宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
ｃ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で前記宿主細胞の細胞質中に共発現させ、封入体を得ること、
ｄ）等しい割合の組み換え抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を含む前記封入体を可溶化緩衝液の存在下で可溶化し、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を得ること、
ｅ）変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖をリフォールディングし、ｒＨｕラニビズマブの生物学的活性型を得ること、及び
ｆ）上記ｅ）で得たｒＨｕラニビズマブを、２０ｍＭのトリスｐＨ９．０により後続される、５ｋＤａタンジェント流ろ過装置を用いて限外ろ過すること、
を含む、リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを生産する方法。
【請求項2】
前記可溶化は、０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ９．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、変性剤及び還元剤を含む可溶化緩衝液を用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記変性剤は、塩酸グアニジン又は尿素から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はβ－メルカプトエタノールから成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖は、インビトロでのリフォールディング方法中に、１０ｍＭ酸化型グルタチオンの添加に続いて、１ＳＬＰＭ（標準リットル毎分）の流量で純酸素を通過させることで、酸化される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記リフォールディングは、０．１ＭのトリスｐＨ９．０、０．６Ｍのアルギニン、５％のソルビトール、２ｍＭのＥＤＴＡを含むリフォールディング緩衝液を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖遺伝子の発現のためのデュエット（バイシストロニック）ベクター発現系であって、第１のＴ７プロモーターに続くＮｃｏｌ／ＨｉｎｋＩＩＩ部位に５’末端で挿入された状態で、前記第１のＴ７プロモーターに連結されている軽鎖をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、及び第２のＴ７プロモーターに続くＮｄｅｌ／Ｘｈｏｌ部位に５’末端で挿入された状態で、第２のＴ７プロモーターに連結されている重鎖をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を含む、デュエットベクターと、
前記デュエットベクターのトランスフォーメーションに供するためのＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞と、
を含む、該ベクター発現系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗体フラグメントの調製のための、新規のクローニング、発現、及びリフォールディング方法に関する。
【0002】
より詳細には、本発明は、組み換えヒト化（ｒＨｕ）ラニビズマブの調製のための、クローニング、発現、及びリフォールディングのプラットフォームに関する。
【発明の背景】
【0003】
標的治療タンパク質の時間及び費用効果の高い製造は、バイオシミラー産業の成功における重要な要素である。バイオ医薬品の研究及び開発における最近の動向は、抗体フラグメントの開発により重点を置いている。抗体フラグメントは、フルサイズのｍＡｂでは利用できない改善した深い腫瘍浸透性、特異的エピトープ結合等、フルサイズのモノクローナル抗体療法よりも優れた確実な利点を提供する［１－２］。
【0004】
少さく且つグリコシル化されていない抗体フラグメントの細菌発現は、哺乳類の細胞系におけるモノクローナル抗体の生産よりも、より容易且つより安価になる。ラニビズマブは、滲出型加齢黄斑変性の治療に用いられる、組み換えヒト化モノクローナル抗体フラグメントである［３］。それは、抗血管新生抑制剤であり、ヒト血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ Ａ）の生物学的活性を阻害する。ヒト化モノクローナル抗体フラグメントは、従来、組み換えＤＮＡ技術によりＥ．ｃｏｌｉ細胞中で発現され、血管内皮細胞増殖因子Ａを標的としている［３、４］。
【0005】
ｒＨｕラニビズマブは、Ｃ末端で、重鎖の２３１残基のＮ末端セグメントに、ジスルフィド結合により結合した２１４残基の軽鎖を含む［５］。ｒＨｕラニビズマブの分子量は、それぞれ２４，９５３ダルトンの重鎖の分子量と、２３，４３０ダルトンの軽鎖の分子量とを有する、４８，３８０ダルトンである。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を用いて生産されたｒＨｕラニビズマブは、不溶性タンパク質凝集体の形態で、封入体を形成する。
【0006】
封入体として発現したｒＨｕラニビズマブに関して、リフォールディングは、製造全体において重要な律速段階である。このＦａｂ領域分子の既存の商業的なリフォールディング方法は、タンパク質の凝集体を生物学的活性のある可溶型へと変換する「３Ｄ」技術（希釈、透析濾過、透析）の一つに基づいている［６－９］。現在、インビボ及びインビトロにおける、ラニビズマブ調製のフォールディング方法についての理解はほとんどない。ｒＨｕラニビズマブのインビトロでのリフォールディングについての理解及び利用できる文献が限られているために、抗体フラグメントは、しばしばＥ．ｃｏｌｉのペリプラズムにおいて可溶型で発現される。しかしながら、細菌のペリプラズムは、細胞の総体積の８％～１６％しか構成しておらず、発現される可溶性タンパク質の量を制限している。ペリプラズムでのより高いレベルのタンパク質の発現は、封入体形成をも引き起こし、生産されたタンパク質の量と、生産に必要な時間との両方に関して、生産性を深刻に制限している。
【0007】
Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム区画への発現は、最も一般的な抗体フラグメントの製造技術である。ペリプラズム発現の重大な欠点は、低い収量であり、この方法の商業的実現性を困難なものにしている。Ｅ．ｃｏｌｉ中の抗体フラグメントのペリプラズム発現に関する報告がいくつかある。破傷風トキソイドに対する抗体フラグメントは、単一の配列を抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖と共役させることにより、ペリプラズム空間で発現され１６ｍｇ／ｌの収量をもたらした。
【0008】
抗体フラグメントのペリプラズム分泌が、最小限の収量のタンパク質合成をもたらすことは、いくつかの先行技術の開示において見る価値のあることである。Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ＤＰらは、デュアルプロモーターベクターｐＤＰＨ１２８を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中における抗ヒトＩｇＧの抗体フラグメントの生産を実証している。この抗体フラグメントの機能的な可溶型は、ペリプラズム分泌により１５０ｍｇ／ｌの収量で達成された。ウシ抗体フラグメントＦａｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１において、ｐＣｏｍＢｏベクターを用いて生産された。ペリプラズム中でのこの抗体フラグメントの発現は、２ｍｇ／ｌの全収量をもたらした［１３］。ＨｕＭＡｂ４Ｄ５－８の抗体フラグメントのペリプラズム発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で１～２ｇ／ｌの収量で達成された［１４］。治療用タンパク質のペリプラズム発現は、ミスフォールディング及び凝集のために、より低い発現量をしばしば引き起こす［１５］
。
【0009】
抗体フラグメントのペリプラズム発現、及びタグ付けを用いるような技術に関連する特許文献が採用されてきたが、抗体フラグメントの調製を可能にする試みはなかった。
【0010】
米国特許出願公開第２０１６／２８９３１４号は、ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖をＥ．ｃｏｌｉ細胞のペリプラズム空間へと輸送するためのシグナル配列を開示している。この特許出願公開には、ペリプラズム中のタンパク質発現に、異なる発現ベクターを使用するが、同じ宿主細胞を用いる、ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の発現のための技術が記載されている。希釈法によるインビトロでのリフォールディングのために、等しい割合の軽鎖及び重鎖を結合させた。
【0011】
ＰＣＴ国際公開第９８４５３３１号は、（ａ）ＶＥＧＦ抗原に対する強い結合親和性、（ｂ）ＶＥＧＦ誘導性内皮細胞の増殖を阻害する能力、及び（ｃ）インビボでＶＥＧＦ誘導性の血管新生を阻害する能力を含む、治療学上の観点からの性質を伴うヒト化及び変異抗ＶＥＧＦ抗体の生産を開示している。該特許出願は、ＶＬ及びＶＨを含むベクターをＥ．ｃｏｌｉ細胞中でトランスフォームすることにより発現される、可変軽鎖及び可変重鎖のヌクレオチド配列を開示している。
【0012】
ＰＣＴ国際公開第２０１３０７６６５７号は、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で、目的の可溶性タンパク質を得るための融合タグとして、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）タンパク質を開示している。ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖遺伝子配列は、ｓＭＡＰタンパク質でタグ付けされて、ＭＡＰＬＣ及びＭＡＰＨＣ融合タンパク質は可溶型で発現した。
【0013】
ＰＨ１２０１５５０１５９３（Ａ１）は、抗ＶＥＧＦ抗体、ウサギモノクローナル抗体のＣＤＲを含む、可溶であって、安定した、抗ＶＥＧＦイムノバインダーを合成するハイブリドーマ技術を開示している。それは、軽鎖及び重鎖の可変領域のヌクレオチド配列と、組み換え抗体フラグメントの発現のための発現構築物とを更に開示している。ｓｃＦｖ又はＦａｂポリペプチドを発現しているプラスミドは、適切な宿主、好ましくは、ペリプラズム発現のためにＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ８３に、又は封入体中における発現のためにＢＬ２１に導入される。該ポリペプチドは、ペリプラズム又は封入体のいずれかから得られ、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及び／又はゲルろ過のような一般的な技術を用いて精製され得る。
【0014】
米国特許出願公開第２００８１２５５８０号は、異種宿主細胞中で生産されたリフォールディングした組み換えタンパク質を精製し、及び高ｐＨ緩衝液中でタンパク質をリフォールディングする方法を開示している。酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、及び血管内皮増殖因子のような増殖因子と類似の組み換えタンパク質は、宿主細胞内で発現され、還元剤及びカオトロピック剤を含む緩衝液を空気又は酸素の添加と同時に添加することにより、リフォールディングされた。
【0015】
抗体フラグメントのペリプラズム発現にもたらされる欠点を考慮して、当技術分野では改善された純度及び収量を有する、等しい割合の抗体フラグメントの細胞質発現の方法を開発する必要がある。
【発明の課題】
【0016】
本発明の決定的な課題は、抗体フラグメントの調製のためのクローニング方法を提供することである。
【0017】
本発明の課題は、抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え構築物と、宿主細胞中でその均等な発現を提供することである。
【0018】
本発明の他の課題は、組み換え抗体フラグメントの細胞質発現を得ることである。
【0019】
本発明の更に他の課題は、組み換え抗体フラグメントの経済的生産のために高密度細胞発酵を用いることである。
【0020】
本発明のまた更に他の課題は、組み換えヒト化（ｒＨｕ）ラニビズマブの調製のために、ハイスループットのリフォールディング方法を提供することである。
【発明の概要】
【0021】
本発明の決定的な側面は、リフォールディングした抗体フラグメントを調製するためのクローニング方法を提供することである。
【0022】
他の側面において、本発明は、リフォールディングした組み換えヒト化抗体フラグメントを調製するためのクローニング方法を提供し、前記方法は、
ａ）抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
ｂ）宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
ｃ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
ａ）抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
ｂ）宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
ｃ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
【0023】
リフォールディングした組み換えヒト化抗体フラグメントを調製するための方法は、
（ｉ）組み換え抗体フラグメントの等しい割合の軽鎖及び重鎖を含む封入体を可溶化緩衝液の存在下で可溶化して、可溶化した軽鎖及び重鎖を得ること、及び
（ｉｉ）変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントをリフォールディングして、ｒＨｕラニビズマブの生物学的活性型を得ること
を更に含む。
（ｉ）組み換え抗体フラグメントの等しい割合の軽鎖及び重鎖を含む封入体を可溶化緩衝液の存在下で可溶化して、可溶化した軽鎖及び重鎖を得ること、及び
（ｉｉ）変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントをリフォールディングして、ｒＨｕラニビズマブの生物学的活性型を得ること
を更に含む。
【0024】
更に他の側面において、本発明は、組み換えヒト化ラニビズマブのクローニング及びリフォールディング法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図4】図４は、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示し、ここで、レーン１：還元された標準イノベーターｒＨｕラニビズマブ、２：デュエットベクターＡを用いた軽鎖及び重鎖遺伝子の発現、３：デュエットベクターＢを用いた軽鎖及び重鎖遺伝子の発現、４：誘導されていないＥ．ｃｏｌｉ細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
発明の詳細な説明
以下、本発明を、その様々な側面がより十分に理解され、評価され得るように、ある好ましく及び任意的な実施形態と関連付けて詳細に記載する。
以下、本発明を、その様々な側面がより十分に理解され、評価され得るように、ある好ましく及び任意的な実施形態と関連付けて詳細に記載する。
【0027】
生体材料の供給源：メルクミリポアライフサイエンス非公開有限責任会社、インドから購入したＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞。
【0028】
ある好ましい実施形態において、本発明は、リフォールディングした組み換えヒト化抗体フラグメントを調製するためのクローニング方法を提供し、前記方法は、
ｄ）抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
ｅ）宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
ｆ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
ｄ）抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
ｅ）宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
ｆ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
【0029】
本発明における「ベクターをトランスフォームする」工程は、抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖をコードする塩基配列を持つ少なくとも１つのデュエットベクターを宿主細胞中でトランスフォームすることをいう。
【0030】
ある特定の実施形態において、本発明は、リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを調製するためのクローニング方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）ラニビズマブの重鎖及び軽鎖をコードする配列番号１及び配列番号３を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
（ｉｉ）宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
（ｉｉｉ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
（ｉ）ラニビズマブの重鎖及び軽鎖をコードする配列番号１及び配列番号３を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
（ｉｉ）宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
（ｉｉｉ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、宿主細胞の細胞質中で前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で共発現させること
を含む。
【0031】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２のラニビズマブの重鎖をコードする配列番号１のヌクレオチド配列を提供する。
【0032】
他の実施形態において、本発明は、配列番号４のラニビズマブの軽鎖をコードする配列番号３のヌクレオチド配列を提供する。
【0033】
一つの実施形態において、本発明は、抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖の均等な発現のために配列番号１及び配列番号３を持つベクター構築物を提供する。
【0034】
したがって、デュエットベクターは、マルチクローニングサイトＩ（ＭＣＳ Ｉ）中のＴ７プロモーターに続くＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に５’末端で挿入された、抗体フラグメントの軽鎖をコードする配列番号３のヌクレオチドと、マルチクローニングサイトＩＩ（ＭＣＳ ＩＩ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に５’末端で挿入された、抗体フラグメントの重鎖をコードする配列番号１のヌクレオチドとを含む（図２）。
【0035】
更なる実施形態において、本発明は、マルチクローニングサイトＩ（ＭＣＳ Ｉ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に５’末端で挿入された、抗体フラグメントの軽鎖をコードする配列番号３のヌクレオチドと、マルチクローニングサイトＩＩ（ＭＣＳ ＩＩ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に５’末端で挿入された、抗体フラグメントの重鎖をコードする配列番号１のヌクレオチドとを含むデュエットベクターを提供する（図３）。
【0036】
他の好ましい実施形態において、軽鎖及び重鎖の遺伝子構築物を含む少なくとも１つのデュエットベクターは、発現系においてトランスフォームされる。トランスフォーメーションに供される最も好ましい発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルである。ｒＨｕラニビズマブ抗体フラグメントの発現のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の選別された形質転換体を決定した。
【0037】
図４は、デュエットベクターＡ及びデュエットベクターＢを用いた軽鎖及び重鎖の発現を示し、それは、非誘導Ｅ．ｃｏｌｉ細胞におけるいかなる漏出発現もない、両鎖のほとんど等しい発現を裏付けた。更に好ましくは、ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の一貫し、より高いレベルの均等な発現は、デュエットＡベクターを用いて観察され、１２％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥが、図５に示されている。
【0038】
もう一つの他の実施形態において、本発明は、約５ｇ／ｌから約１５ｇ／ｌまでの封入体を含む、約１７５ｇ／ｌから約１９０ｇ／ｌまでの範囲のバイオマス収量を提供する。図７は、ｒＨｕラニビズマブ生産のために、高密度細胞発酵に供されたトランスフォームされたＥ．ｃｏｌｉ細胞の増殖率の増加を示す。
【0039】
図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖曲線を示し、時間に関するバイオマス収量の増加を示している。
【0040】
他の好ましい実施形態において、本発明は、
（ｉ）組み換え抗体フラグメントの等しい割合の軽鎖及び重鎖を含む封入体を可溶化緩衝液の存在下で、可溶化して、可溶化した軽鎖及び重鎖を得、続いて酸化すること、及び
（ｉｉ）変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントをリフォールディングして、ｒＨｕラニビズマブの生物学的活性型を得ること
を更に含む、リフォールディングした組み換えヒト化抗体フラグメントを調製する方法を提供する。
（ｉ）組み換え抗体フラグメントの等しい割合の軽鎖及び重鎖を含む封入体を可溶化緩衝液の存在下で、可溶化して、可溶化した軽鎖及び重鎖を得、続いて酸化すること、及び
（ｉｉ）変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントをリフォールディングして、ｒＨｕラニビズマブの生物学的活性型を得ること
を更に含む、リフォールディングした組み換えヒト化抗体フラグメントを調製する方法を提供する。
【0041】
ある実施形態において、本発明は、トリス緩衝液、ＥＤＴＡ、変性剤、及び還元剤を含む可溶化緩衝液を提供する。
【0042】
好ましい変性剤は、塩酸グアニジニン又は尿素からなる群から選択される。
【0043】
好ましい還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又は／及びβ－メルカプトエタノールからなる群から選択される。
【0044】
したがって、好ましいトリス緩衝液の濃度は、７から１０までの範囲のｐＨを有する、０．１Ｍから０．５Ｍまでの範囲にある。好ましいＥＤＴＡの濃度は、１ｍＭから４ｍＭまでの範囲にあり、好ましい塩酸グアニジンの濃度は、約３ｍＭから約６ｍＭまでの範囲にある。
【0045】
より好ましくは、可溶化緩衝液は、０．１ＭのトリスｐＨ９．０、２ｍＭのＥＤＴＡ及び３０分間のための変性剤として６Ｍ塩酸グアニジンを含み、還元剤、即ち５ｍＭのＤＴＴを更に含む。
【0046】
可溶で還元された封入体溶液は、１０ｍＭの酸化型グルタチオンを添加することにより、酸化を受けた。続いて、０．１ＭのトリスｐＨ９．０、０．６Ｍのアルギニン、５％のソルビトール、及び２ｍＭのＥＤＴＡを含むリフォールディング緩衝液中における７５倍希釈を用いて、１０±２℃で、リフォールディングした。インビトロでのリフォールディング方法中に、１ＳＬＰＭ（標準リットル毎分）で純酸素を通過させることによって酸化リフォールディングも行った。
【0047】
酸素は、システインアミノ酸のチオール基の酸化により、ジスルフィド結合の形成と反応速度を引き起こした。レドックスシャッフルも使用され、タンパク質のシステインアミノ酸との混成したジスルフィド結合を形成し、続いて求核攻撃によりタンパク質分子のシステインアミノ酸間に正しいジスルフィド結合が形成されることを可能にした。
【0048】
１００から１１０μｇ／ｍｌまでの範囲の、生物学的活性なリフォールディングした機能的に活性なｒＨｕラニビズマブが得られた。
【0049】
更に、ペプチドフィンガープリンティング分析により、イノベーターｒＨｕラニビズマブ及び開発したｒＨｕラニビズマブの間に、８５．４％の理論的な配列重複度で、望ましい一致が得られた。
【0050】
例：以下の例は、例示として与えられているものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0051】
例１：軽鎖及び重鎖遺伝子配列の構築のためのコドンの最適化
ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋから取得し、コドンの最適化を行った（アクセッション番号：ＤＢ０１２７０）。
ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋから取得し、コドンの最適化を行った（アクセッション番号：ＤＢ０１２７０）。
【0052】
例２：ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の発現のためのデュエットベクターＡの構築
マルチクローニングサイトＩ（ＭＣＳ Ｉ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に５‘末端で配列番号３の軽鎖ヌクレオチド配列を挿入し、マルチクローニングサイトＩＩ（ＭＣＳ ＩＩ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に５’末端で配列番号１の重鎖ヌクレオチド配列を挿入することで、デュエットベクターＡ（図２）を構築した。
マルチクローニングサイトＩ（ＭＣＳ Ｉ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に５‘末端で配列番号３の軽鎖ヌクレオチド配列を挿入し、マルチクローニングサイトＩＩ（ＭＣＳ ＩＩ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に５’末端で配列番号１の重鎖ヌクレオチド配列を挿入することで、デュエットベクターＡ（図２）を構築した。
【0053】
例３：ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の発現のためのデュエットベクターＢの構築
マルチクローニングサイトＩ（ＭＣＳ Ｉ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に５’末端で配列番号３の軽鎖ヌクレオチド配列を挿入し、マルチクローニングサイトＩＩ（ＭＣＳ ＩＩ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に５‘末端で配列番号１の重鎖ヌクレオチド配列を挿入することで、デュエットベクターＢ（図３）を構築した。
マルチクローニングサイトＩ（ＭＣＳ Ｉ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に５’末端で配列番号３の軽鎖ヌクレオチド配列を挿入し、マルチクローニングサイトＩＩ（ＭＣＳ ＩＩ）中の、Ｔ７プロモーターに続くＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に５‘末端で配列番号１の重鎖ヌクレオチド配列を挿入することで、デュエットベクターＢ（図３）を構築した。
【0054】
例４：ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞中の発現構築物のトランスフォーメーション
軽鎖遺伝子構築物を有するデュエットベクターＡ及びＢを、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）発現系でトランスフォームした。トランスフォーメーション法は、１００μｌの宿主細胞の０．５μｇベクターによる氷上での３０分間のインキュベーションと、続く、４２℃で３５秒間のヒートショックを含む［２２］。ヒートショック後、氷上で１５分間、細胞を再びインキュベートした。次いで、８００μｌのカタボライト抑制された超最適ブロス（Ｓｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＳＯＣ）培地を反応混合物に加え、続いて１時間４５分間、４５０ｒｐｍでインキュベーションした。形質転換した細胞は、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を含むプレートを３７℃で一晩インキュベートした。抗生物質選択マーカーに基づいて、形質転換陽性の細胞をプレートから分離し、タンパク質発現のために用いた。
軽鎖遺伝子構築物を有するデュエットベクターＡ及びＢを、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）発現系でトランスフォームした。トランスフォーメーション法は、１００μｌの宿主細胞の０．５μｇベクターによる氷上での３０分間のインキュベーションと、続く、４２℃で３５秒間のヒートショックを含む［２２］。ヒートショック後、氷上で１５分間、細胞を再びインキュベートした。次いで、８００μｌのカタボライト抑制された超最適ブロス（Ｓｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＳＯＣ）培地を反応混合物に加え、続いて１時間４５分間、４５０ｒｐｍでインキュベーションした。形質転換した細胞は、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。形質転換体を含むプレートを３７℃で一晩インキュベートした。抗生物質選択マーカーに基づいて、形質転換陽性の細胞をプレートから分離し、タンパク質発現のために用いた。
【0055】
例５：振盪フラスコレベルでのｒＨｕラニビズマブ発現
選別されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の形質転換体をｒＨｕラニビズマブ発現に関して試験した。選別されたコロニーを３０μｇ／ｍｌのカナマイシンと共に１０ｍｌのＬＢブロスに播種した。６００ｎｍでの光学密度が１から１．５までの値に達するまで、細胞を増殖させた。これらの良く増殖したコロニーの２ｍｌを１００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ＨｉＶｅｇ（登録商標）ブロスに移し替え、３７℃で２５０ｒｐｍでインキュベートした。６００ｎｍで１～１．５０の光学密度に達した後、Ｅ．ｃｏｌｉ培養を５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。５時間の誘導後に細胞を回収し、６０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上澄みを捨て、細胞ペレットを２０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ９．０溶解緩衝液中に再懸濁した。細胞を高圧ホモジナイザー中で１５０００バール圧で２０分間溶解した。溶解した細胞を６０００ｒｐｍで２５分間遠心した。上澄み及びペレット中の発現したタンパク質の存在を、還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いて確認した。図４は、デュエットベクターＡ及びデュエットベクターＢを用いた軽鎖及び重鎖の発現を示し、そのことは、非誘導Ｅ．ｃｏｌｉ細胞におけるいかなる漏出発現もない、ほとんど等しい両鎖の発現を裏付けた。デュエットＡベクターを用いて、ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖のより高い水準の発現が、１２％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて観察された（図５）。振盪フラスコレベルのＥ．ｃｏｌｉ発酵は、６００ｎｍで３．７８±０．０５の光学密度をもたらし、０．８６８±０．０１ｇ／ｌの封入体生産の発生をもたらす９．３±０．１２ｇ／ｌのバイオマスを伴った。封入体中のｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の量及び純度は、逆相ＨＰＬＣによって測定した（図８）。
選別されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の形質転換体をｒＨｕラニビズマブ発現に関して試験した。選別されたコロニーを３０μｇ／ｍｌのカナマイシンと共に１０ｍｌのＬＢブロスに播種した。６００ｎｍでの光学密度が１から１．５までの値に達するまで、細胞を増殖させた。これらの良く増殖したコロニーの２ｍｌを１００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ＨｉＶｅｇ（登録商標）ブロスに移し替え、３７℃で２５０ｒｐｍでインキュベートした。６００ｎｍで１～１．５０の光学密度に達した後、Ｅ．ｃｏｌｉ培養を５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。５時間の誘導後に細胞を回収し、６０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上澄みを捨て、細胞ペレットを２０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ９．０溶解緩衝液中に再懸濁した。細胞を高圧ホモジナイザー中で１５０００バール圧で２０分間溶解した。溶解した細胞を６０００ｒｐｍで２５分間遠心した。上澄み及びペレット中の発現したタンパク質の存在を、還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いて確認した。図４は、デュエットベクターＡ及びデュエットベクターＢを用いた軽鎖及び重鎖の発現を示し、そのことは、非誘導Ｅ．ｃｏｌｉ細胞におけるいかなる漏出発現もない、ほとんど等しい両鎖の発現を裏付けた。デュエットＡベクターを用いて、ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖のより高い水準の発現が、１２％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて観察された（図５）。振盪フラスコレベルのＥ．ｃｏｌｉ発酵は、６００ｎｍで３．７８±０．０５の光学密度をもたらし、０．８６８±０．０１ｇ／ｌの封入体生産の発生をもたらす９．３±０．１２ｇ／ｌのバイオマスを伴った。封入体中のｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の量及び純度は、逆相ＨＰＬＣによって測定した（図８）。
【0056】
例６：バイオリアクター段階でのｒＨｕラニビズマブ発現
タンパク質発現を１Ｌバイオリアクター中で行った。選択的に形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｒＨｕラニビズマブ発現について評価した。選別したコロニーを３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１０ｍｌのＬＢブロスに播種した。細胞を６００ｎｍでの光学密度が１から１．５までに達するまで増殖させた。これらの良く増殖したコロニーの２ｍｌを１００ｍｌのＬＢブイヨン中でに移し替え、３７℃で２５０ｒｐｍでインキュベートした。１００ｍｌの種培養物を９００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ＨｉＶｅｇ（登録商標）中に移し替えた。ダイレクトドライブモーター、２つのラッシュトンインペラー、リングスパージャー（マクロスパージャー）を備えたバッフルアセンブリを有する２Ｌ熱ブランケットガラス管を使用することにより、１ＳＬＰＭのガス流量で自動ガス混合を行いながら、ＢｉｏＦｌｏ（登録商標）／ＧｅｌｌｉＧｅｎ（登録商標）１１５ベンチトップ発酵層を用いて高密度細胞発酵を行った。自動ＤＯカスケード撹拌、ＧａｓＦｌｏ及びＯ２ミックスを３０％のＤＯ設定点となるように選択した。撹拌カスケードの下限を３００ｒｐｍに保ち、上限を１０００ｒｐｍに保った。ＧａｓＦｌｏカスケードを１ＳＬＰＭに保ち、Ｏ２ミックスを０～８０％に保った。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を５ｍＭのＩＰＴＧで対数中期で誘導した。５時間の誘導後、細胞を回収し、６０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上澄みを捨て、細胞ペレットを２０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ９．０可溶化緩衝液中に再懸濁した。細胞を高圧ホモジナイザー中で２０分間１５０００ｂａｒの圧で可溶化した。上澄み及びペレット中の発現したｒＨｕラニビズマブの存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いて測定した。高細胞密度Ｅ．ｃｏｌｉ発酵は、６００ｎｍで７５．０±１．２の光学密度をもたらし、７．０±０．１ｇ／ｌの封入体生産の発生をもたらす１８２±２．９ｇ／ｌバイオマスを伴った（図７）。
タンパク質発現を１Ｌバイオリアクター中で行った。選択的に形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｒＨｕラニビズマブ発現について評価した。選別したコロニーを３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１０ｍｌのＬＢブロスに播種した。細胞を６００ｎｍでの光学密度が１から１．５までに達するまで増殖させた。これらの良く増殖したコロニーの２ｍｌを１００ｍｌのＬＢブイヨン中でに移し替え、３７℃で２５０ｒｐｍでインキュベートした。１００ｍｌの種培養物を９００ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ ＨｉＶｅｇ（登録商標）中に移し替えた。ダイレクトドライブモーター、２つのラッシュトンインペラー、リングスパージャー（マクロスパージャー）を備えたバッフルアセンブリを有する２Ｌ熱ブランケットガラス管を使用することにより、１ＳＬＰＭのガス流量で自動ガス混合を行いながら、ＢｉｏＦｌｏ（登録商標）／ＧｅｌｌｉＧｅｎ（登録商標）１１５ベンチトップ発酵層を用いて高密度細胞発酵を行った。自動ＤＯカスケード撹拌、ＧａｓＦｌｏ及びＯ２ミックスを３０％のＤＯ設定点となるように選択した。撹拌カスケードの下限を３００ｒｐｍに保ち、上限を１０００ｒｐｍに保った。ＧａｓＦｌｏカスケードを１ＳＬＰＭに保ち、Ｏ２ミックスを０～８０％に保った。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を５ｍＭのＩＰＴＧで対数中期で誘導した。５時間の誘導後、細胞を回収し、６０００ｒｐｍで２０分間遠心した。上澄みを捨て、細胞ペレットを２０ｍＭのトリス、０．１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ９．０可溶化緩衝液中に再懸濁した。細胞を高圧ホモジナイザー中で２０分間１５０００ｂａｒの圧で可溶化した。上澄み及びペレット中の発現したｒＨｕラニビズマブの存在は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いて測定した。高細胞密度Ｅ．ｃｏｌｉ発酵は、６００ｎｍで７５．０±１．２の光学密度をもたらし、７．０±０．１ｇ／ｌの封入体生産の発生をもたらす１８２±２．９ｇ／ｌバイオマスを伴った（図７）。
【0057】
例７：ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の封入体のためのタンパク質のリフォールディング及び前処理
可溶化手順：
まず、１７０ｍｇの湿潤重量の封入体を０．１Ｍのトリス１０ ｐＨ９．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、及び変性剤として６Ｍの塩酸グアニジンを含む１０ｍｌの可溶化緩衝液中で３０分間可溶化した。５ｍＭのＤＴＴを添加して還元を行い、還元のために２５℃で１時間保った。この可溶化し還元した封入体に１０ｍＭ酸化グルタチオンを添加して、酸化のために３時間２５℃に保った。
可溶化手順：
まず、１７０ｍｇの湿潤重量の封入体を０．１Ｍのトリス１０ ｐＨ９．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、及び変性剤として６Ｍの塩酸グアニジンを含む１０ｍｌの可溶化緩衝液中で３０分間可溶化した。５ｍＭのＤＴＴを添加して還元を行い、還元のために２５℃で１時間保った。この可溶化し還元した封入体に１０ｍＭ酸化グルタチオンを添加して、酸化のために３時間２５℃に保った。
【0058】
リフォールディング手順：
この可溶性で、還元し、酸化した封入体を０．１Ｍのトリス ｐＨ９．０、０．６Ｍのアルギニン、５％のソルビトール、２ｍＭのＥＤＴＡを含むリフォールディング緩衝液中で、１０±２℃で７５倍希釈した。インビトロにおけるリフォールディング方法で、１ＳＬＰＭ（標準リットル毎分）の流量で純酸素を通過させることで、酸化リフォールディングを行った。酸素は、システインアミノ酸中のチオール基の酸化により、ジスルフィド結合の形成と反応速度を起こした。レドックスシャッフルも使用されて、それは、タンパク質のシステインアミノ酸の混成したジスルフィド結合を形成し、続いて求核攻撃によりタンパク質分子のシステインアミノ酸間に正しいジスルフィド結合が形成されるのを可能にした。リフォールディング産物を５ＫＤａ Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ（登録商標）Ｌａｂタンジェント流ろ過装置を用いて限外ろ過し、続いて緩衝液を２０ｍＭのトリスｐＨ９．０に交換した。非還元１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上４８ｋＤａで、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブが観察された（図６）。リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの量及び性質を逆相及びサイズ排除ＨＰＬＣで測定した（図８）。
この可溶性で、還元し、酸化した封入体を０．１Ｍのトリス ｐＨ９．０、０．６Ｍのアルギニン、５％のソルビトール、２ｍＭのＥＤＴＡを含むリフォールディング緩衝液中で、１０±２℃で７５倍希釈した。インビトロにおけるリフォールディング方法で、１ＳＬＰＭ（標準リットル毎分）の流量で純酸素を通過させることで、酸化リフォールディングを行った。酸素は、システインアミノ酸中のチオール基の酸化により、ジスルフィド結合の形成と反応速度を起こした。レドックスシャッフルも使用されて、それは、タンパク質のシステインアミノ酸の混成したジスルフィド結合を形成し、続いて求核攻撃によりタンパク質分子のシステインアミノ酸間に正しいジスルフィド結合が形成されるのを可能にした。リフォールディング産物を５ＫＤａ Ｕｌｔｒａｓｅｔｔｅ（登録商標）Ｌａｂタンジェント流ろ過装置を用いて限外ろ過し、続いて緩衝液を２０ｍＭのトリスｐＨ９．０に交換した。非還元１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上４８ｋＤａで、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブが観察された（図６）。リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブの量及び性質を逆相及びサイズ排除ＨＰＬＣで測定した（図８）。
【0059】
例８：組み換えｒＨｕラニビズマブの分析的特性評価
ｒＨｕラニビズマブ試料のＡ２８０での吸光度測定
ＵＶ吸光度測定を用いて、リフォールディング及びクロマトグラフィー産物中の総タンパク質を２８０ｎｍで測定した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）２０００及びＵＶ－１８００ 島津製作所 紫外可視分光光度計を用いて、採取された全ての画分を２８０ｎｍで読み取った。
ｒＨｕラニビズマブ試料のＡ２８０での吸光度測定
ＵＶ吸光度測定を用いて、リフォールディング及びクロマトグラフィー産物中の総タンパク質を２８０ｎｍで測定した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）２０００及びＵＶ－１８００ 島津製作所 紫外可視分光光度計を用いて、採取された全ての画分を２８０ｎｍで読み取った。
【0060】
例９：ｒＨｕラニビズマブの総タンパク質推定のためのブラッドフォードアッセイ
総タンパク質推定に使用したオルトゴナル技術は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）２０００を用いた５９５ｎｍでのブラッドフォードアッセイであった。５μｌの試料を２５０μｌのブラッドフォード試薬に添加後、３０分間撹拌機で混合を行った。混合した後、試料を染料の存在下で２５分間インキュベートし、５９５ｎｍでの吸光度を測定した［２５］。
総タンパク質推定に使用したオルトゴナル技術は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）２０００を用いた５９５ｎｍでのブラッドフォードアッセイであった。５μｌの試料を２５０μｌのブラッドフォード試薬に添加後、３０分間撹拌機で混合を行った。混合した後、試料を染料の存在下で２５分間インキュベートし、５９５ｎｍでの吸光度を測定した［２５］。
【0061】
例１０：ｒＨｕラニビズマブ試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の発現の同定のために、還元条件で、１２％（厚さ１ｍｍ）の分離ゲルを用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行い（図４）、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて、濃縮ゲル定電圧１２０Ｖ及び分離ゲル定電圧１００Ｖの条件で観察した（図７）。各試料をゲルに流し込む前に、開始バッファ中で１０分間沸騰させた。ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動分離後に、タンパク質を検出するために、４：１：５（水：氷酢酸：メタノール）中の０．０５％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＧ－２５０を用いた［２６］。
例１１：ｒＨｕラニビズマブの逆相ＨＰＬＣ分析
アジレント１２６０システムで４．６ｍｍ×５０ｍｍ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８ ２．７μｍカラムを用いた逆相クロマトグラフィーを用いて、ｒＨｕラニビズマブの定量及び定性分析を行った（図８）。移動相は、水中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（溶媒Ａ）と、１００％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（溶媒Ｂ）からなっていた。２１４ｎｍの波長でＡからＢへの線形勾配を用いて、流量を１ｍｌ／分で維持した。図８は、イノベーター及びリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブのＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の発現の同定のために、還元条件で、１２％（厚さ１ｍｍ）の分離ゲルを用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行い（図４）、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて、濃縮ゲル定電圧１２０Ｖ及び分離ゲル定電圧１００Ｖの条件で観察した（図７）。各試料をゲルに流し込む前に、開始バッファ中で１０分間沸騰させた。ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動分離後に、タンパク質を検出するために、４：１：５（水：氷酢酸：メタノール）中の０．０５％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルーＧ－２５０を用いた［２６］。
例１１：ｒＨｕラニビズマブの逆相ＨＰＬＣ分析
アジレント１２６０システムで４．６ｍｍ×５０ｍｍ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８ ２．７μｍカラムを用いた逆相クロマトグラフィーを用いて、ｒＨｕラニビズマブの定量及び定性分析を行った（図８）。移動相は、水中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（溶媒Ａ）と、１００％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ（溶媒Ｂ）からなっていた。２１４ｎｍの波長でＡからＢへの線形勾配を用いて、流量を１ｍｌ／分で維持した。図８は、イノベーター及びリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブのＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【0062】
例１２：ｒＨｕラニビズマブのインビトロでの生物学的活性の定量のためのＥＬＩＳＡ分析
リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを含む試料をプレートにコーティングされたＶＥＧＦ抗原と反応させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素で標識された抗ヒトＩｇＧにより、結合したｒＨｕラニビズマブを検出した。免疫学的反応により、固相の抗体と結合したＶＥＧＦ－ラニビズマブ－抗体を標識した酵素のサンドウィッチ複合体が形成する。マイクロタイターストリップを洗浄し、結合していない反応物を除去する。次に、基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を反応させる。加水分解された基質の量は、マイクロタイタープレートリーダー上で４５０ｎｍで読み取り、存在するｒＨｕラニビズマブの濃度に正比例する。生物学的に活性なリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをインビトロでの生物学的アッセイを用いて定量した。１０２μｇ／ｍｌの機能的に活性なｒＨｕラニビズマブを得た［２７］。
例１３：ｒＨｕラニビズマブのＳＥ ＨＰＬＣ分析
様々な手順における産生物中の凝集体含量をＹａｒｒａ（登録商標）３μｍ ＳＥＣ－２０００（３００×７．８ｍｍ ＩＤ）カラムを使用して行ったＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を用いて決定した（図９）。移動相は、ｐＨ５．５０で５０ｍＭの塩化ナトリウム緩衝液と共に２０ｍＭの酢酸緩衝液から成る。分析は、イソクラティック方式で０．５ｍｌ／分の流量にて２５℃で行った。フォトダイオードアレイ検出器を用いて、２８０ｎｍでタンパク質検出を行った。図９は、０．５％の凝集体を含むイノベーターｒＨｕラニビズマブに匹敵する、９９．５％の精製したｒＨｕラニビズマブの純度を示す。
リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブを含む試料をプレートにコーティングされたＶＥＧＦ抗原と反応させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素で標識された抗ヒトＩｇＧにより、結合したｒＨｕラニビズマブを検出した。免疫学的反応により、固相の抗体と結合したＶＥＧＦ－ラニビズマブ－抗体を標識した酵素のサンドウィッチ複合体が形成する。マイクロタイターストリップを洗浄し、結合していない反応物を除去する。次に、基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を反応させる。加水分解された基質の量は、マイクロタイタープレートリーダー上で４５０ｎｍで読み取り、存在するｒＨｕラニビズマブの濃度に正比例する。生物学的に活性なリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをインビトロでの生物学的アッセイを用いて定量した。１０２μｇ／ｍｌの機能的に活性なｒＨｕラニビズマブを得た［２７］。
例１３：ｒＨｕラニビズマブのＳＥ ＨＰＬＣ分析
様々な手順における産生物中の凝集体含量をＹａｒｒａ（登録商標）３μｍ ＳＥＣ－２０００（３００×７．８ｍｍ ＩＤ）カラムを使用して行ったＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を用いて決定した（図９）。移動相は、ｐＨ５．５０で５０ｍＭの塩化ナトリウム緩衝液と共に２０ｍＭの酢酸緩衝液から成る。分析は、イソクラティック方式で０．５ｍｌ／分の流量にて２５℃で行った。フォトダイオードアレイ検出器を用いて、２８０ｎｍでタンパク質検出を行った。図９は、０．５％の凝集体を含むイノベーターｒＨｕラニビズマブに匹敵する、９９．５％の精製したｒＨｕラニビズマブの純度を示す。
【0063】
例１４：二本鎖ＤＮＡの推定
リフォールディング産物中のＤＮＡの存在量をＱｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ピコグリーンアッセイを用いて推定した。二本鎖ラムダＤＮＡを用いて標準曲線を作成した。０．５ｍｌの方法産生物試料を０．５ｍｌの希釈したＱｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＢＲ試薬に添加し、反応混合物を５分間インキュベートした。５分後、蛍光分光光度計を用いて蛍光を測定した（励起波長４８０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）。
リフォールディング産物中のＤＮＡの存在量をＱｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ピコグリーンアッセイを用いて推定した。二本鎖ラムダＤＮＡを用いて標準曲線を作成した。０．５ｍｌの方法産生物試料を０．５ｍｌの希釈したＱｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＢＲ試薬に添加し、反応混合物を５分間インキュベートした。５分後、蛍光分光光度計を用いて蛍光を測定した（励起波長４８０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）。
【0064】
例１５：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）（飛行時間型質量分析法）によるリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブのインタクト質量分析
標準及びリフォールディングした精製ｒＨｕラニビズマブをシナピン酸マトリックスと１：１の割合で混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を行った（図１１）。同様に、還元し及びアルキル化した、標準及びリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをシナピン酸マトリックスと１：１の割合で混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析した（図１２）。高純度水中の５０％ｖ／ｖアセトニトリル、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ中にシナピン酸マトリックス（１０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。１μｌの試料及びマトリックスの均一混合物を清潔な３８４ウェルＭＡＬＤＩプレートに載せた。プレートをＡＢ ＳＣＩＥＸ ＴＯＦ／ＴＯＦ（登録商標）５８００計器に挿入した。計器を陽イオンモードで使用した。３３７ｎｍ放射の窒素レーザーをイオン化源として維持した。４０００から５０００までのレーザー強度を試料の分析に使用した。データエクスプローラー（登録商標）ソフトウェア バージョン４．１１を用いて結果の分析を行った。図１０は、イノベーターｒＨｕラニビズマブとの、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブのインタクトな質量の比較を示す。図１１は、還元しアルキル化したイノベーターｒＨｕラニビズマブとの、精製したｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の質量の比較を示す。
標準及びリフォールディングした精製ｒＨｕラニビズマブをシナピン酸マトリックスと１：１の割合で混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を行った（図１１）。同様に、還元し及びアルキル化した、標準及びリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブをシナピン酸マトリックスと１：１の割合で混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析した（図１２）。高純度水中の５０％ｖ／ｖアセトニトリル、０．１％ｖ／ｖＴＦＡ中にシナピン酸マトリックス（１０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。１μｌの試料及びマトリックスの均一混合物を清潔な３８４ウェルＭＡＬＤＩプレートに載せた。プレートをＡＢ ＳＣＩＥＸ ＴＯＦ／ＴＯＦ（登録商標）５８００計器に挿入した。計器を陽イオンモードで使用した。３３７ｎｍ放射の窒素レーザーをイオン化源として維持した。４０００から５０００までのレーザー強度を試料の分析に使用した。データエクスプローラー（登録商標）ソフトウェア バージョン４．１１を用いて結果の分析を行った。図１０は、イノベーターｒＨｕラニビズマブとの、リフォールディングしたｒＨｕラニビズマブのインタクトな質量の比較を示す。図１１は、還元しアルキル化したイノベーターｒＨｕラニビズマブとの、精製したｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖の質量の比較を示す。
【0065】
例１６：ＬＣ－ＭＳによるペプチドフィンガープリンティング
ペプチドマッピングをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、標準イノベーターｒＨｕラニビズマブ、及びリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブのＩｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ消化により行った。６．０Ｍの塩酸グアニジンを用いて室温で１時間、タンパク質の変性を行った。変性したタンパク質の還元のために１０ｍＭのＤＴＴを添加し、１時間室温でインキュベートした。１５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いてアルキル化し、１５分間暗条件でインキュベートし、再び５ｍＭのＤＴＴを加えて過剰なＩＡＡを中和した。変性し、還元し及びアルキル化したタンパク質試料を５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中で緩衝液交換した。タンパク質試料の消化のために、１：５０（トリプシン：タンパク質）の割合で、トリプシンを用いた。消化混合物を３７℃で１８時間インキュベートし、続いてＺｉｐｔｉｐ（登録商標）ピペットチップを用いて試料を洗浄した。洗浄した試料をＳＰＤ１０１０ Ｓｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）濃縮装置を用いて乾燥した。消化したタンパク質試料を質量グレード水中の３％アセトニトリル及び０．１％ギ酸中で再構成した。ペプチドフィンガープリンティングをＡＢ ＳＣＩＥＸ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ（登録商標）５６００システムを用いて行い、データをＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて記録し、分析した。結果は、イノベーターｒＨｕラニビズマブと、開発されたｒＨｕラニビズマブとの間で、８５．４％の理論的な配列重複度の良好な一致を示す［２９］。
ペプチドマッピングをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、標準イノベーターｒＨｕラニビズマブ、及びリフォールディングしたｒＨｕラニビズマブのＩｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ消化により行った。６．０Ｍの塩酸グアニジンを用いて室温で１時間、タンパク質の変性を行った。変性したタンパク質の還元のために１０ｍＭのＤＴＴを添加し、１時間室温でインキュベートした。１５ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いてアルキル化し、１５分間暗条件でインキュベートし、再び５ｍＭのＤＴＴを加えて過剰なＩＡＡを中和した。変性し、還元し及びアルキル化したタンパク質試料を５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中で緩衝液交換した。タンパク質試料の消化のために、１：５０（トリプシン：タンパク質）の割合で、トリプシンを用いた。消化混合物を３７℃で１８時間インキュベートし、続いてＺｉｐｔｉｐ（登録商標）ピペットチップを用いて試料を洗浄した。洗浄した試料をＳＰＤ１０１０ Ｓｐｅｅｄｖａｃ（登録商標）濃縮装置を用いて乾燥した。消化したタンパク質試料を質量グレード水中の３％アセトニトリル及び０．１％ギ酸中で再構成した。ペプチドフィンガープリンティングをＡＢ ＳＣＩＥＸ ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ（登録商標）５６００システムを用いて行い、データをＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて記録し、分析した。結果は、イノベーターｒＨｕラニビズマブと、開発されたｒＨｕラニビズマブとの間で、８５．４％の理論的な配列重複度の良好な一致を示す［２９］。
【0066】
本発明の利点
・本発明に開示されるベクター構築物を用いることにより、軽鎖及び重鎖の均等な発現が得られ、ｍＡｂフラグメントの軽鎖及び重鎖の均等な発現を得るための手動プロセスが省略される。
・本発明に開示されるベクター構築物を用いることにより、軽鎖及び重鎖の均等な発現が得られ、ｍＡｂフラグメントの軽鎖及び重鎖の均等な発現を得るための手動プロセスが省略される。
【0067】
・組み換え抗体フラグメントのペリプラズム発現よりも、細胞質発現での高いバイオマス収量をもたらし、したがって組み換えタンパク質の増加した収量をもたらす。
【0068】
・本発明で用いられる高密度細胞発酵は、バイオマス生産の増加を提供する。
以下に、本願発明の実施態様を付記する。
［１］ ａ）抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖をコードする配列番号１及び配列番号３を有するヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
ｂ）前記宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
ｃ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で前記宿主細胞の細胞質中に共発現させ、封入体を得ることを含む、リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを製造する方法。
［２］ ｄ）等しい割合の組み換え抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を含む前記封入体を可溶化緩衝液の存在下で可溶化し、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を得ること、
ｅ）変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖をリフォールディングし、ｒＨｕラニビズマブの生物学的活性型を得ること、及び
ｆ）工程（ｖ）で得たｒＨｕラニビズマブを、２０ｍＭのトリスｐＨ９．０により後続される、５ｋＤａタンジェント流ろ過装置を用いて限外ろ過すること、を更に含む、［１］に記載のリフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを生産する方法。
［３］ 前記可溶化は、０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ９．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、変性剤及び還元剤を含む可溶化緩衝液を用いて行う、［２］に記載の方法。
［４］ 前記変性剤は、塩酸グアニジン又は尿素から成る群から選択される、［３］に記載の方法。
［５］ 前記還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はβ－メルカプトエタノールから成る群から選択される、［３］に記載の方法。
［６］ 前記可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖は、インビトロでのリフォールディング方法中に、１０ｍＭ酸化型グルタチオンの添加に続いて、１ＳＬＰＭ（標準リットル毎分）の流量で純酸素を通過させることで、酸化される、［２］に記載の方法。
［７］ 前記リフォールディングは、０．１ＭのトリスｐＨ９．０、０．６Ｍのアルギニン、５％のソルビトール、２ｍＭのＥＤＴＡを含むリフォールディング緩衝液を用いて行われる、［２］に記載の方法。
［８］ ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖遺伝子の発現のためのデュエット（バイシストロニック）ベクター発現系であって、前記デュエットベクターは、軽鎖をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、重鎖をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、プロモーター配列、及び制限部位を含む、該ベクター発現系。
以下に、本願発明の実施態様を付記する。
［１］ ａ）抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖をコードする配列番号１及び配列番号３を有するヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞中でトランスフォームすること、
ｂ）前記宿主細胞を高密度細胞発酵に供すること、
ｃ）グルコース及びＩＰＴＧを含む混合物の存在下での誘導により、前記抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を等しい割合で前記宿主細胞の細胞質中に共発現させ、封入体を得ることを含む、リフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを製造する方法。
［２］ ｄ）等しい割合の組み換え抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を含む前記封入体を可溶化緩衝液の存在下で可溶化し、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖を得ること、
ｅ）変性剤を希釈し、続いて酸化剤の存在下で酸化してジスルフィド結合の酸化を起こすことにより、可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖をリフォールディングし、ｒＨｕラニビズマブの生物学的活性型を得ること、及び
ｆ）工程（ｖ）で得たｒＨｕラニビズマブを、２０ｍＭのトリスｐＨ９．０により後続される、５ｋＤａタンジェント流ろ過装置を用いて限外ろ過すること、を更に含む、［１］に記載のリフォールディングした組み換えヒト化ラニビズマブを生産する方法。
［３］ 前記可溶化は、０．１Ｍのトリス緩衝液ｐＨ９．０、２ｍＭのＥＤＴＡ、変性剤及び還元剤を含む可溶化緩衝液を用いて行う、［２］に記載の方法。
［４］ 前記変性剤は、塩酸グアニジン又は尿素から成る群から選択される、［３］に記載の方法。
［５］ 前記還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はβ－メルカプトエタノールから成る群から選択される、［３］に記載の方法。
［６］ 前記可溶化した抗体フラグメントの軽鎖及び重鎖は、インビトロでのリフォールディング方法中に、１０ｍＭ酸化型グルタチオンの添加に続いて、１ＳＬＰＭ（標準リットル毎分）の流量で純酸素を通過させることで、酸化される、［２］に記載の方法。
［７］ 前記リフォールディングは、０．１ＭのトリスｐＨ９．０、０．６Ｍのアルギニン、５％のソルビトール、２ｍＭのＥＤＴＡを含むリフォールディング緩衝液を用いて行われる、［２］に記載の方法。
［８］ ｒＨｕラニビズマブの軽鎖及び重鎖遺伝子の発現のためのデュエット（バイシストロニック）ベクター発現系であって、前記デュエットベクターは、軽鎖をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、重鎖をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、プロモーター配列、及び制限部位を含む、該ベクター発現系。
【0069】
引用文献
１．Ｎｅｌｓｏｎ Ａ． ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９，２７，ｎｕｍｂｅｒ ４
２．Ｎｅｌｓｏｎ Ａ．， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｈｏｐｅ ａｎｄ ｈｙｐｅ．ＭＡｂｓ， ２０１０，２：１，７７－８３．
３．Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｓｅｒｔ ａｎｄ ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌｕｃｅｎｔｉｓ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｕｃｅｎｔｉｓ．ｃｏｍ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｗｅｔ－ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ－ｍａｃｕｌａｒ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｃｃｅｓｓｅｄ ｏｎ １４１２１６）
４．ＥＭＥＡ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ． Ｗｅｂｓｉｔｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｄｏｃｓ／ｅｎ＿ＧＢ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ＿ｌｉｂｒａｒｙ／ＥＰＡＲ＿－＿Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＿Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ／ｈｕｍａｎ／０００７１５／ＷＣ５０００４３５５０．ｐｄｆ）
５．Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ ｄｒｕｇ ｂａｎｋ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ｄｂ０１２７０）．
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８．Ｍｉｄｄｅｌｂｅｒｇ ＡＰＪ．， Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，２０（１０），４３７－４４３
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１０．Ｈａｎｎｉｇ Ｇ． ａｎｄ Ｍａｋｒｉｄｅｓ Ｓ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，１９９８，１６，５４－６０
１１．Ｃｏｒｉｓｄｅｏ Ｓ． ａｎｄ Ｗａｎｇ Ｂ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００４，３４，２７０－２７９
１２．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ Ｄ．，Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｂ．，Ｂｏｗｅｒｉｎｇ Ｌ．，Ｇａｎｅｓｈ Ｒ．，Ｓｅｈｄｅｖ Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ Ｂ．，Ｋｉｎｇ Ｌ．，Ｒｅｅｋｓ Ｄ，Ｌａｗｓｏｎ Ａ ａｎｄ Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ Ａ．Ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００２，２６，３０９－３２０
１３．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｐｈ．， Ｍａｘｗｅｌｌ Ｇ．， ａｎｄ Ｃａｍｐｏ Ｍ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｏｖｉｎｅ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００２，２４，４３－５０
１４．Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．， Ｋｅｌｌｅｙ Ｒ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｍ．，Ｓｎｅｄｅｃｏｒ Ｂ．，Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ Ｍ．，Ｖｅｌｌｉｇａｎ Ｍ．，Ｗｏｎｇ Ｗ．，Ｒｏｗｌａｎｄ Ａ．，Ｋｏｔｔｓ Ｃ．，Ｃａｒｖｅｒ Ｍ．，Ｙａｎｇ Ｍ．，Ｂｏｕｒｅｌｌ Ｊ．，Ｓｈｅｐａｒｄ Ｈ． ａｎｄ Ｈｅｎｎｅｒ Ｄ．Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎａｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０，１６３－１６７
１５．Ｂａｎｅｙｘ Ｆ． ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．，１９９９，１０，４１１－４２１
１６．Ｓｈａｎｄｉｌｙａ Ｈ，Ｇａｄｇｉｌ Ｈ． ａｎｄ Ｆａｒｋａｄｅ Ｖ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ．２０１６，ＵＳ２０１６０２８９３１４Ａ１
１７．Ｍａｎｕｅｌ Ｂ．，Ｊａｍｅｓ Ｗ．，Ｐｒｅｓｔａ Ａ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｂ． ａｎｄ Ｍａｎ Ｙｅｅ Ｙ．，Ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． １９９８，ＷＯ９８４５３３１（Ａ２）
１８．Ｓａｌｕｎｋｈｅ Ｓｈ．， Ｓｒｉｒａｍ Ｐ． ａｎｄ Ｋｕｍａｒ Ｊ． Ｍａｐ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．２０１３，ＷＯ２０１３０７６６５７（Ａ１）
１９．Ｂｏｒｒａｓ Ｌ．，Ｕｒｅｃｈ Ｄ． ａｎｄ Ｇｕｎｄｅ Ｔ．Ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＶＥＧＦ．２０１５，ＰＨ１２０１５５０１５９３（Ａ１）
２０．Ｌｉｕ Ｎ．，Ｓｏｎｇ Ｌ． ａｎｄ Ｚｈａｏ Ｗ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ，２０１２，ＣＮ１０２７５７４９６（Ａ）
２１．Ｐｉｚａｒｒｏ ＳＨ．，Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ． ａｎｄ Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ ＣＨ．Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＵＳ２００８１２５５８０（Ａ１）
２２．Ｕｓｅｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｗａｒｗｉｃｋ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｃ／ｓｃｉ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｂｕｇｇ／ｂｕｇｇｇｒｏｕｐ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｔｂ００９＿ｎｏｖａｇｅｎ＿ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ＿ｃｅｌｌｓ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆ）アクセス日２０１７／２／２７．
２３．Ｂｕｃｈｎｅｒ Ｊ．， Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ．，Ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆａｂ－ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１，９，１５７－１６２
２４．Ｌｉｌｉｅ Ｈ．， Ｓｃｈｗａｒｚ Ｅ．， Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８，９，４９７－５０１
２５．Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．，Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７６，７２，２４８－２５４
２６．Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ．，Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｄ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ １９７０，２２７，６８０－６８５
２７．Ａｌｐｈａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．４ａｄｉ．ｃｏｍ／ｃｏｍｍｅｒｃｅ／ｃｃｐ２８６１７－ｌｕｃｅｎｔｉｓ－ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ－ｅｌｉｓａ－ｋｉｔ－ｆｏｒ－ｈｕｍａｎ－－９６－ｔｅｓｔ－ｅｌｉｓａ－ｋｉｔ－２００－８８０－ｌｕｇ．ｈｔｍ）アクセス日 ２０１６／９／１２．
２８．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏｔｅｓ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ ｂｒａｎｄｓ／Ｐｒｏｄｕｃｔ－Ｂｒａｎｄ／Ｑｕａｎｔ－ｉＴ．ｈｔｍｌ）．
２９．Ｒａｔｈｏｒｅ Ａ．， Ｂｈａｍｂｕｒｅ Ｒ．，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒｓ： ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ ａｓ ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，４０６，６５６９－６５７６．
１．Ｎｅｌｓｏｎ Ａ． ａｎｄ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｊ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｒｅｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００９，２７，ｎｕｍｂｅｒ ４
２．Ｎｅｌｓｏｎ Ａ．， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｈｏｐｅ ａｎｄ ｈｙｐｅ．ＭＡｂｓ， ２０１０，２：１，７７－８３．
３．Ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｓｅｒｔ ａｎｄ ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｌｕｃｅｎｔｉｓ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｕｃｅｎｔｉｓ．ｃｏｍ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｗｅｔ－ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ－ｍａｃｕｌａｒ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｃｃｅｓｓｅｄ ｏｎ １４１２１６）
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１２．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ Ｄ．，Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｂ．，Ｂｏｗｅｒｉｎｇ Ｌ．，Ｇａｎｅｓｈ Ｒ．，Ｓｅｈｄｅｖ Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ Ｂ．，Ｋｉｎｇ Ｌ．，Ｒｅｅｋｓ Ｄ，Ｌａｗｓｏｎ Ａ ａｎｄ Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ Ａ．Ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００２，２６，３０９－３２０
１３．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｐｈ．， Ｍａｘｗｅｌｌ Ｇ．， ａｎｄ Ｃａｍｐｏ Ｍ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｏｖｉｎｅ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２００２，２４，４３－５０
１４．Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．， Ｋｅｌｌｅｙ Ｒ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｍ．，Ｓｎｅｄｅｃｏｒ Ｂ．，Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ Ｍ．，Ｖｅｌｌｉｇａｎ Ｍ．，Ｗｏｎｇ Ｗ．，Ｒｏｗｌａｎｄ Ａ．，Ｋｏｔｔｓ Ｃ．，Ｃａｒｖｅｒ Ｍ．，Ｙａｎｇ Ｍ．，Ｂｏｕｒｅｌｌ Ｊ．，Ｓｈｅｐａｒｄ Ｈ． ａｎｄ Ｈｅｎｎｅｒ Ｄ．Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎａｉｚｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２，１０，１６３－１６７
１５．Ｂａｎｅｙｘ Ｆ． ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．，１９９９，１０，４１１－４２１
１６．Ｓｈａｎｄｉｌｙａ Ｈ，Ｇａｄｇｉｌ Ｈ． ａｎｄ Ｆａｒｋａｄｅ Ｖ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ．２０１６，ＵＳ２０１６０２８９３１４Ａ１
１７．Ｍａｎｕｅｌ Ｂ．，Ｊａｍｅｓ Ｗ．，Ｐｒｅｓｔａ Ａ，Ｌｅｏｎａｒｄ Ｇ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｂ． ａｎｄ Ｍａｎ Ｙｅｅ Ｙ．，Ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． １９９８，ＷＯ９８４５３３１（Ａ２）
１８．Ｓａｌｕｎｋｈｅ Ｓｈ．， Ｓｒｉｒａｍ Ｐ． ａｎｄ Ｋｕｍａｒ Ｊ． Ｍａｐ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．２０１３，ＷＯ２０１３０７６６５７（Ａ１）
１９．Ｂｏｒｒａｓ Ｌ．，Ｕｒｅｃｈ Ｄ． ａｎｄ Ｇｕｎｄｅ Ｔ．Ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＶＥＧＦ．２０１５，ＰＨ１２０１５５０１５９３（Ａ１）
２０．Ｌｉｕ Ｎ．，Ｓｏｎｇ Ｌ． ａｎｄ Ｚｈａｏ Ｗ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ，２０１２，ＣＮ１０２７５７４９６（Ａ）
２１．Ｐｉｚａｒｒｏ ＳＨ．，Ｓａｎｃｈｅｚ Ａ． ａｎｄ Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ ＣＨ．Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＵＳ２００８１２５５８０（Ａ１）
２２．Ｕｓｅｒ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｗａｒｗｉｃｋ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｃ／ｓｃｉ／ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｂｕｇｇ／ｂｕｇｇｇｒｏｕｐ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｃｌｏｎｉｎｇ／ｔｂ００９＿ｎｏｖａｇｅｎ＿ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ＿ｃｅｌｌｓ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆ）アクセス日２０１７／２／２７．
２３．Ｂｕｃｈｎｅｒ Ｊ．， Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ．，Ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｆａｂ－ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１，９，１５７－１６２
２４．Ｌｉｌｉｅ Ｈ．， Ｓｃｈｗａｒｚ Ｅ．， Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８，９，４９７－５０１
２５．Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．，Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７６，７２，２４８－２５４
２６．Ｌａｅｍｍｌｉ ＵＫ．，Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅａｄ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ １９７０，２２７，６８０－６８５
２７．Ａｌｐｈａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．４ａｄｉ．ｃｏｍ／ｃｏｍｍｅｒｃｅ／ｃｃｐ２８６１７－ｌｕｃｅｎｔｉｓ－ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ－ｅｌｉｓａ－ｋｉｔ－ｆｏｒ－ｈｕｍａｎ－－９６－ｔｅｓｔ－ｅｌｉｓａ－ｋｉｔ－２００－８８０－ｌｕｇ．ｈｔｍ）アクセス日 ２０１６／９／１２．
２８．Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏｔｅｓ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｓｉｔｅ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ ｂｒａｎｄｓ／Ｐｒｏｄｕｃｔ－Ｂｒａｎｄ／Ｑｕａｎｔ－ｉＴ．ｈｔｍｌ）．
２９．Ｒａｔｈｏｒｅ Ａ．， Ｂｈａｍｂｕｒｅ Ｒ．，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒｓ： ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ ａｓ ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，４０６，６５６９－６５７６．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】