特許 7284384 シルクフィブロイン溶液の製造方法およびそれから形成される成形体の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-23

(45)【発行日】2023-05-31

(54)【発明の名称】シルクフィブロイン溶液の製造方法およびそれから形成される成形体の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C08J 3/11 20060101AFI20230524BHJP

   C08J 5/18 20060101ALI20230524BHJP

   D04H 1/4266 20120101ALI20230524BHJP

   D04H 1/728 20120101ALI20230524BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20230524BHJP

【ＦＩ】

C08J3/11 CFG

C08J5/18

D04H1/4266

D04H1/728

C07K14/435

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2019051614

(22)【出願日】2019-03-19

(65)【公開番号】P2019172985

(43)【公開日】2019-10-10

【審査請求日】2021-12-22

(31)【優先権主張番号】P 2018058153

(32)【優先日】2018-03-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000002200

【氏名又は名称】セントラル硝子株式会社

(72)【発明者】

【氏名】萩原 祐樹

(72)【発明者】

【氏名】魚山 大樹

(72)【発明者】

【氏名】河合 亘

(72)【発明者】

【氏名】関矢 雄貴

【審査官】加賀 直人

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－１５７０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０９４７２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１３１１９６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０８Ｊ ３／１１

Ｃ０８Ｊ ５／１８

Ｄ０４Ｈ １／４２６６

Ｄ０４Ｈ １／７２８

Ｃ０７Ｋ １４／４３５

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヘキサフルオロイソプロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、気密性および耐圧性を有する容器を用いて、５８．６℃以上、１８０℃以下の溶解温度で、シルクフィブロインを溶解させる工程を含む、
シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【請求項2】

ヘキサフルオロイソプロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、シルクフィブロインを溶解させる溶解時間が０．５時間以上、２４時間以内である、
請求項１に記載のシルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【請求項3】

シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液中のシルクフィブロインの濃度が０．０１質量％以上、１０質量％以下である、請求項１または請求項２に記載のシルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【請求項4】

溶解温度（Ｙ）が５８．６℃以上、１８０℃以下、溶解時間（Ｘ）が０．５時間以上、２４時間以内において、
溶解温度（Ｙ）の上限が、Ｙ＝－３５／８Ｘ＋１８５で表され、
溶解温度（Ｙ）の下限が、Ｙ＝－１３／３Ｘ＋１２５で表される範囲内で、
ヘキサフルオロイソプロパノールを７０質量％以上含む溶媒にシルクフィブロインを溶解させ、
シルクフィブロインの濃度が０．１質量％以上、３質量％以下である、シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液を得る、
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のシルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【請求項5】

シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液中のシルクフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）が、５０，０００以上、３７０，０００以下である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のシルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【請求項6】

ヘキサフルオロイソプロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、気密性および耐圧性を有する容器を用いて、５８．６℃以上、１８０℃以下の温度で、シルクフィブロインを溶解させ、シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液を得る第１の工程と、
前記シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液から、ヘキサフルオロイソプロパノールを含む液を除去し、シルクフィブロイン成形体を得る第２の工程と、
を含むシルクフィブロイン成形体の製造方法。

【請求項7】

第２の工程が、電界紡糸法によりシルクフィブロイン不織布を得る工程である、請求項６に記載のシルクフィブロイン成形体の製造方法。

【請求項8】

第２の工程が、溶液キャスト法によりシルクフィブロインフィルムまたはシルクフィブロインシートを得る工程である、請求項６に記載のシルクフィブロイン成形体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、シルクフィブロイン溶液の製造方法およびそれから形成される成形体の製造方法に関する。シルクフィブロインは、不織布、フィルム、シートまたは糸等の所望の形状に成形され、化粧品あるいは生体適合材料として、医療用縫合糸、創傷被覆材、人工血管、軟骨支持材または角膜再生材等に使用される。

【背景技術】

【0002】

フィブロインおよびセリシンは、蚕や蜘蛛等の生物が産生するタンパク質である。蚕の幼虫が体内で産生するフィブロインは、一般的にシルクフィブロインと呼ばれる。本明細書において、繭タンパク質とはシルクフィブロインおよびセリシンを指す。蚕の幼虫が吐き出す繭糸は、シルクフィブロインのフィラメントを膠質のセリシンで被覆したものであり、一本の長い繭糸からセリシンを接着剤とし、幼虫が営繭したものは繭玉と呼ばれる。特許文献１に、繭糸中の繭タンパク質の存在比はフィブロインが７０～８０質量％、セリシンが２０～３０質量％であり、その他、脂肪分等の少量の夾雑物が含まれると記載されている。

【0003】

蚕の幼虫が営繭し、何ら処理していない状態の繭玉を、生繭と呼ぶ。生繭に対し、生繭内の蛹の発蛾による繭の穴あけ、および保存中の着色防止のため、生繭を加熱乾燥処理したものを乾繭と呼ぶ。特許文献１に、乾繭は、生繭を１１５～１２０℃に加熱した後、５～６時間かけて８０℃程度の温度に徐々に下げる加熱乾燥処理が施されたものであることが記載されている。

【0004】

乾繭から繭糸を引き出す際は、上記加熱乾燥処理により硬く固化したセリシンを柔らかくするために煮繭を行う。特許文献１に、煮繭は、１００～１０５℃の水蒸気または熱水に乾繭を１０分間程さらす工程であることが記載されている。煮繭後、柔らかくなった繭玉から繭糸を引き出し、数本揃えて生糸とする。生糸からセリシンを適度に除き、シルクフィブロインを露出させることで、光沢や柔軟性を向上させた糸は絹糸と呼ばれる。セリシンがシルクフィブロインを被覆した状態である生糸から絹糸を得るためには、精練と呼ばれる作業を行う。精練は、一般的に、生糸をアルカリ性の溶液、例えば、石鹸液、灰汁またはソーダ液等に接触させることでセリシンを溶解させて除き、これらアルカリ性溶液に難溶なシルクフィブロインを得る作業である。本明細書において、精練によりセリシンおよび夾雑物が除去された後のシルクフィブロインを精練シルクフィブロインと呼ぶことがある。

【0005】

特許文献１、４には炭酸ナトリウム水溶液を用いた精練が記載され、特許文献２、３の実施例にはマルセル石鹸水を用いた精練が記載されている。

【0006】

一方、シルクフィブロインは、ヘキサフルオロイソプロパノール（１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール、ＨＣ（ＣＦ_３）_２ＯＨ、ＣＡＳ番号９２０－６６－１、以下、ＨＦＩＰと呼ぶことがある）に溶解することが知られている。例えば、特許文献５には、シルクフィブロインは、ＨＦＩＰに溶解することが開示されている。

【0007】

しかしながら、シルクフィブロインを含むＨＦＩＰ溶液を得るには、精練シルクフィブロインのままではＨＦＩＰに溶解しないため、一旦精練シルクフィブロインを臭化リチウム等の金属塩水溶液に溶解させた後、そこから乾燥して得られるフィルムやスポンジ等のシルクフィブロイン成形体を用いてＨＦＩＰに溶解させる必要がある。特許文献５の実施例において、シルクフィブロインフィルムを、ＨＦＩＰに添加し、時々激しく攪拌しつつ、８日間かけて、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を製造したことが記載されている。

【0008】

また、精練シルクフィブロインを特定の金属塩溶液に溶解させてシルクフィブロイン溶液を得る方法として、特許文献１には、シルクフィブロインは、塩化カルシウム、臭化リチウム、チオシアン酸リチウムまたはチオシアン酸ナトリウム等の特定の金属塩の水溶液に溶解することが記載されている。しかし、これらシルクフィブロインの塩溶液は、加水分解によりシルクフィブロインの分子量が低下するなどの問題があった。特許文献６には、家蚕シルクフィブロインを溶解する際に臭化リチウム等の中性塩や、銅エチレンジアミン等の錯塩水溶液などの溶液中に長時間置くと、シルクフィブロイン分子鎖が分解し、再生絹糸（再生フィブロインと呼ぶことがある）が得られたとしても力学物性は極めて低いなどの欠点があると記載されている。いずれの方法も、得られるシルクフィブロイン溶液は水溶液であるため、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を得るには、乾燥工程を経て、シルクフィブロイン成形体を取り出す必要がある。

【0009】

さらに、前述の金属塩水溶液に溶解した溶液から得られるシルクフィブロイン成形体を生体適合材料等として使用するには、金属塩を透析等の工程により除去する必要がある。そのため、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を得る製造方法としては、煩雑な操作が多く、生産性の低い方法であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【文献】特開２００１－１６３８９９号公報

【文献】特開２００２－３０２４９９号公報

【文献】特開２００４－６８１６１号公報

【文献】特開２０１０－２７０４２６号公報

【文献】特表平７－５０３２８８号公報

【文献】特開２００９－２２１４０１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、上記課題を解決するものであり、シルクフィブロインの分子量を低下させることなく、短時間で簡便にシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を製造する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、室温（２５℃）で、精練シルクフィブロインのＨＦＩＰへの溶解を試みたが、精練シルクフィブロインはＨＦＩＰに極めて難溶であり、攪拌しつつ丸１日（２４時間）経過しても溶解しなかった（比較例１参照）。

【0013】

一方、高分子を溶解させる際、加熱し液温を上げることで溶解が促進されることは周知の事実である。しかしながら、一般的にタンパク質溶液を６０℃以上の高温に曝すと変性、凝集によるタンパク質の不溶化、および加水分解による分子量の低下が生じるおそれがある。

【0014】

本発明者らが鋭意検討したところ、密閉された加圧容器中で、ＨＦＩＰの大気圧（１０１３．２５ ｈＰａ）での沸点（５８．６℃）以上、１８０℃以下の温度で、精練シルクフィブロインの加熱溶解を行ったところ、シルクフィブロインの分子量の低下が起きることなく、短時間でシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、本明細書において短時間とは、２４時間以内のことであり、分子量の低下とは、シルクフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）が初期の７０％未満まで低下することをいう。

【0015】

特に、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液中のシルクフィブロインの濃度が０．１質量％以上、３質量％以下となるように、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を、溶解温度、５８．６℃以上、１８０℃以下、溶解時間、０．５時間以上、２４時間以内において調製した際の、本明細書の実施例の表１に示す結果から、
縦軸を溶解温度（Ｙ）とし、横軸を溶解時間（Ｘ）とする、図１に示すグラフにおいて、
溶解温度（Ｙ）の上限が、Ｙ＝－３５／８Ｘ＋１８５で表され、
溶解温度（Ｙ）の下限が、Ｙ＝－１３／３Ｘ＋１２５で表される、
範囲内で、シルクフィブロインは易溶（８０％以上溶解）であり、
得られたＨＦＩＰ溶液において、シルクフィブロインの分子量の低下は起きなかった。

【0016】

本発明は、以下の発明１～８を含む。

【0017】

［発明１］
ヘキサフルオロイソプロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、５８．６℃以上、１８０℃以下の溶解温度で、シルクフィブロインを溶解させる工程を含む、
シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【0018】

［発明２］
ヘキサフルオロイソプロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、シルクフィブロインを溶解させる溶解時間が０．５時間以上、２４時間以内である、
発明１のシルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【0019】

［発明３］
シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液中のシルクフィブロインの濃度が０．０１質量％以上、１０質量％以下である、発明１または発明２のシルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【0020】

［発明４］
溶解温度（Ｙ）が５８．６℃以上、１８０℃以下、溶解時間（Ｘ）が０．５時間以上、２４時間以内において、
溶解温度（Ｙ）の上限が、Ｙ＝－３５／８Ｘ＋１８５で表され、
溶解温度（Ｙ）の下限が、Ｙ＝－１３／３Ｘ＋１２５で表される範囲内で、
ヘキサフルオロイソプロパノールを７０％以上含む溶媒にシルクフィブロインを溶解させ、
シルクフィブロインの濃度が０．１質量％以上、３質量％以下である、シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液を得る、
発明１～３のシルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【0021】

［発明５］
シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液中のシルクフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）が、５０，０００以上、３７０，０００以下である、発明１～４のシルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液の製造方法。

【0022】

［発明６］
ヘキサフルオロイソプロパノールを７０質量％以上含む溶媒に、５８．６℃以上、１８０℃以下の温度で、シルクフィブロインを溶解させ、シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液を得る第１の工程と、
前記シルクフィブロインのヘキサフルオロイソプロパノール溶液から、ヘキサフルオロイソプロパノールを含む溶媒を除去し、シルクフィブロイン成形体を得る第２の工程と、
を含むシルクフィブロイン成形体の製造方法。

【0023】

［発明７］
第２の工程が、電界紡糸法によりシルクフィブロイン不織布を得る工程である、発明６のシルクフィブロイン成形体の製造方法。

【0024】

［発明８］
第２の工程が、溶液キャスト法によりシルクフィブロインフィルムまたはシルクフィブロインシートを得る工程である、発明６のシルクフィブロイン成形体の製造方法。

【発明の効果】

【0025】

本発明によれば、シルクフィブロインをＨＦＩＰに溶解させる際、精練シルクフィブロインからシルクフィブロイン成形体を得るまでの工程が必要ないため、短時間で簡便に、かつ、シルクフィブロインの分子量を低下させることなく、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、シルクフィブロインがＨＦＩＰに易溶（８０％以上溶解）であり、且つ分子量が低下することのない、溶解温度および溶解時間の範囲を表すための、縦軸を溶解温度（Ｙ）、横軸を溶解時間（Ｘ）とするグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下、本発明について、さらに詳しく説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。

【0028】

１．シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法
本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法は、ＨＦＩＰを７０質量％以上含む溶媒に、ＨＦＩＰの大気圧（１０１３．２５ ｈＰａ）での沸点である５８．６℃以上、１８０℃以下で、シルクフィブロインを溶解させる工程を含む。

【0029】

［容器］
本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法において、シルクフィブロインをＨＦＩＰに溶解させる際に用いる容器は、気密性および耐圧性を有する容器であれば特に制限はない。例えば、ガラス製やステンレス鋼製、またはこれらを樹脂でライニングした密閉耐圧容器を用いることができる。

【0030】

［シルクフィブロイン］
本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法において、シルクフィブロインを産生する蚕種は特に制限されない。例えば、エリ蚕、柞蚕、天蚕等の野蚕、または家蚕を挙げることができる。

【0031】

本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法において、ＨＦＩＰを含む溶媒に溶解させるシルクフィブロインは、繭（繭玉もしくは繭糸）または生糸から、セリシンおよびその他脂肪分等を除去する精練を経て得られた精練シルクフィブロインを用いることができる。精練シルクフィブロインは、絹糸、絹織物、健康食品等として市販されているものを使用してもよい。また、繭玉に含まれるシルクフィブロインであってもよく、生糸に含まれるシルクフィブロインであってもよく、シルクフィブロインとセリシンの混合物である繭タンパク質に含まれるシルクフィブロインであってもよい。これらシルクフィブロインを含む、繭玉、繭糸、生糸、絹糸または繭タンパク質を、ＨＦＩＰを含む溶媒に溶解させることも本発明の範疇である。

【0032】

本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法に用いるシルクフィブロインのＭｗは、５０，０００以上、３７０，０００以下である。好ましくは、Ｍｗが１００，０００以上、３７０，０００以下であり、特に好ましくは、Ｍｗが１５０，０００以上、３７０，０００以下である。Ｍｗが５０，０００より低いと、シルクフィブロイン溶液から形成した成形体の強度が低くなる。なお、上記Ｍｗは、ゲル浸透クロマトグラフィー（Gel Permeation Chromatography、以下、ＧＰＣと呼ぶことがある）で測定し、ポリメチルメタクリレートで換算した値である。なお、家蚕の絹糸腺から産生されるシルクフィブロインの文献値は３７０，０００である（非特許文献 Tashiro Yutaka and Otsuki Eiichi, Journal of Cell Biology, Vol.46, P1(1970)、非特許文献Prog.Polym.Sci.2007；32(8‐9):991‐1007に記載）。

【0033】

［溶媒］
本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法に使用する溶媒としては、ＨＦＩＰを単独で用いてもよく、また、３０質量％を上限とし、好ましくは２０質量％以下の範囲でＨＦＩＰ以外の他の溶媒を１種類または２種類以上用いてもよい。しかしながら、溶解速度が低下するおそれがあるため、ＨＦＩＰを単独で用いることが特に好ましい。他の溶媒としては、シルクフィブロインの変質および分子量の低下を起こすことなく溶解を妨げない溶媒であればよい。このような溶媒としては、Ｎ－メチルモルホリンＮ－オキシド、２，２，２－トリフルオロエタノール、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、トルエンまたはジクロロメタンを例示することができる。

【0034】

ＨＦＩＰ溶液中のシルクフィブロインの濃度は、ＨＦＩＰ溶液全体に対して、０．０１質量％以上、１０質量％以下である。好ましくは、０．０５質量％以上、５質量％以下であり、特に好ましくは、０．１質量％以上、３質量％以下である。シルクフィブロインの濃度が０．０１質量％より薄くても、シルクフィブロインはＨＦＩＰに溶解するが、生産性が低く好ましくない。シルクフィブロインの濃度が１０質量％より濃いと、シルクフィブロインの溶解時間が長くなり、分子量が低下するおそれがある。

【0035】

［溶解］
以下、ＨＦＩＰ溶媒へのシルクフィブロインの溶解条件について記載する。

【0036】

＜溶解温度＞
本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法において、ＨＦＩＰを７０質量％以上含む溶媒にシルクフィブロインを溶解させる際の溶解温度は、ＨＦＩＰの沸点である５８．６℃以上、１８０℃以下である。ＨＦＩＰの沸点である５８．６℃より低い温度では、シルクフィブロインの溶解速度が遅く、不溶分の回収量が増加する。好ましくは、６０℃以上である。１８０℃より高い温度では、シルクフィブロインの加水分解または変質による溶液の着色が生じることがある。好ましくは１４０℃以下であり、特に好ましくは１２０℃以下である。

【0037】

＜溶解時間＞
本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法において、シルクフィブロインのＨＦＩＰを含む溶媒への溶解時間は、０．５時間以上、２４時間以内である。溶解時間が０．５時間より短いと、シルクフィブロインの溶解が不十分となり、不溶分の回収量が増加する。溶解時間が２４時間より長いと生産性が低く実用的でない。また、シルクフィブロインが加水分解し分子量の低下を起こし、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液が着色するおそれがある。好ましくは、１２時間以内であり、特に好ましくは６時間以内である。不要な加熱を避けるため溶解の進行を適宜確認し、溶解が完了した後は速やかに冷却し、溶解作業を終了することが好ましい。この際、溶解時間を短縮する目的で攪拌を行ってもよい。

【0038】

＜最適な溶解条件＞
Ｍｗが５０，０００以上、３７０，０００以下であるシルクフィブロインを使用し、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液中のシルクフィブロインの濃度が０．１質量％以上、３質量％以下である。シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を調製する際に、溶解温度、５８．６℃以上、１８０℃以下、溶解時間、０．５時間以上、２４時間以内において、
縦軸を溶解温度（Ｙ）とし、横軸を溶解時間（Ｘ）とする、図１に示すグラフにおいて、溶解温度（Ｙ）の上限が、Ｙ＝－３５／８Ｘ＋１８５で表され、
溶解温度（Ｙ）の下限が、Ｙ＝－１３／３Ｘ＋１２５で表される範囲内で、
シルクフィブロインはＨＦＩＰに易溶（８０％以上溶解）であり、得られたＨＦＩＰ溶液において、シルクフィブロインの分子量の低下は起こらない。

【0039】

[溶解雰囲気]
本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法は、窒素もしくはヘリウム等の不活性ガス雰囲気、および空気雰囲気のいずれでも行なうことができるが、不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。空気雰囲気は、加水分解や溶液の着色を促進する原因となることがある。

【0040】

［シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の濃縮］
以下、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の濃縮について記載する。
希薄なシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を調製した後、溶液中のＨＦＩＰの一部を留去することにより濃縮し、高濃度のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を得ることができる。例えば、濃度１質量％のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を調製した後、エバポレーターを用いて、濃度１０質量％以上のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を得ることができる。ＨＦＩＰの使用量は増えるが、溶解時間が短縮される効果を奏する。

【0041】

［シルクフィブロインのＨＦＩＰ中での溶解について］
以下、シルクフィブロインのＨＦＩＰへの溶解機構について説明する。

【0042】

タンパク質の二次構造には、アミノ基とカルボキシル基が水素結合した右巻き螺旋のαヘリックス構造と、隣り合ったペプチド鎖の間で一方の主鎖の Ｎ－Ｈ が隣接する主鎖の Ｃ＝Ｏ と水素結合した、結晶性の高い平面構造を形成しているβシート構造がある。

【0043】

繊維形状のシルクフィブロインはＨＦＩＰに対する溶解性に極めて乏しい。これはシルクフィブロインの二次構造として、結晶性の高いβシート構造が多く存在していることによると推察される。

【0044】

そのため、シルクフィブロインをＨＦＩＰに溶解させる際は、一旦、臭化リチウム等の金属塩の水溶液に溶かし、透析によって溶液から金属塩を除去し、次いで乾燥して得られたシルクフィブロイン成形体を溶解させる方法が一般的である。金属塩の水溶液中において、フィブロイン分子同士の相互作用が緩和された結果、βシート構造からαヘリックス構造への二次構造の転移が起こるものと推察される。水溶液中のαヘリックス構造は、乾燥後の成形体においても保持されており、βシート構造を多く含む繊維形状のシルクフィブロインよりも結晶性が低下しているため、ＨＦＩＰに溶解し易くなるものと考えられる。

【0045】

ＨＦＩＰは、分子内で高度に分極していることから、配位性が高い溶媒である。本発明において、結晶性の高いβシート構造を多く含む、精練シルクフィブロインをＨＦＩＰ中で加熱したことで、フィブロイン分子間の相互作用を緩和するに十分なエネルギーが与えられ、αヘリックス構造への転移が進行した、すなわち、ＨＦＩＰが金属塩様の性質を示したため、精練シルクフィブロインが溶解したものと考察している。また、ＨＦＩＰによるシルクフィブロインのαヘリックス構造への誘起効果は、シルクフィブロインの加熱による変性、凝集による不溶化を抑制する効果があるものと推測される。

【0046】

２．シルクフィブロイン成形体の製造方法
本発明のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の製造方法により得られた、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液から得られるシルクフィブロイン成形体の形態に制限はない。例えば、不織布状、フィルム状、シート状、糸状、粉末状、スポンジ状（多孔質状）等の形態を挙げることができる。シルクフィブロイン溶液を用いて不織布を得る方法としては、例えば、電界紡糸法を挙げることができる。また、フィルムおよびシートを得る方法としては、例えば、溶液キャスト法を挙げることができる。

【0047】

［電界紡糸法］
電界紡糸法は、ノズル（ニードル）と電極（コレクター）の間に、高い電圧を印加した状態で、高分子溶液を噴射し、紡糸する方法である。

【0048】

具体的には、高分子溶液をシリンジに入れ、シリンジ先端のニードルと、コレクター間に１～１００ｋＶ程度の電圧をかけながら、高分子溶液をニードルからコレクターへ向けて噴射させる。この際、電圧がしきい値を超えると、電荷の反発力が高分子溶液の液滴の表面張力に打ち勝って、電荷を帯びた噴流が発生する。電場内で噴流が伸長しながら溶媒が蒸発し、細いファイバーを形成し、コレクター上にファイバーが集積されることで不織布が得られる。なお、日本工業規格（ＪＩＳ）では、不織布とは、「繊維が一方向またはランダムに配向しており、交絡、融着、接着によって繊維間が結合されたもの」と定義されている。

【0049】

電界紡糸を行う際のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の濃度は、０．１質量％以上、３０質量％以下である。好ましくは、０．５質量％以上、２０質量％以下である。特に好ましくは、１質量％以上、１０質量％以下である。シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の濃度が０．１質量％より低いと、シルクフィブロインが粒子状となり不織布にならない。シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の濃度が３０質量％より高いと、ニードル内でシルクフィブロインが固まり、それが原因で詰まりを起こし、噴射できなくなることがある。

【0050】

電界紡糸を行う際の印加電圧は、１ｋＶ以上、１００ｋＶ以下である。好ましくは、５ｋＶ以上、５０ｋＶ以下である。特に好ましくは、１０ｋＶ以上、３０ｋＶ以下である。印加電圧が１ｋＶより低いと、ニードルからシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を噴射したとしても、電荷を帯びた噴流が発生せず、液垂れが生じる。印加電圧が１００ｋＶより高い条件では、噴流の速度および形状を制御できない。

【0051】

電界紡糸を行う際のニードルとコレクター間の距離は、５ｃｍ以上、５０ｃｍ以下である。好ましくは、７．５ｃｍ以上、４０ｃｍ以下である。特に好ましくは、１０ｃｍ以上、３０ｃｍ以下である。ニードルとコレクター間の距離が５ｃｍよりも小さいと溶媒が十分に蒸発せず、液垂れが生じて不織布を得ることができない。ニードルとコレクター間の距離が５０ｃｍより大きいと噴流が発生せず、不織布を得ることができない。

【0052】

シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液から電界紡糸法で得ることのできる不織布の厚みは、1μｍ以上、２００μｍ以下である。好ましくは、５μｍ以上、１５０μｍ以下である。特に好ましくは、１０μｍ以上、１００μｍ以下である。厚みが1μｍより小さいと、材料として用いる上で十分な強度が得られない。２００μｍより厚い不織布を電界紡糸法で得ることは困難である。

【0053】

シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液から電界紡糸法で得ることのできる不織布を構成する繊維の太さ（円断面であれば直径）は、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である。好ましくは、２０ｎｍ以上、５μｍ以下である。特に好ましくは、３０ｎｍ以上、１μｍ以下である。１０ｎｍより細い、あるいは、１０μｍより太い繊維は、電界紡糸法で得ることは困難である。

【0054】

［溶液キャスト法］
溶液キャスト法とは、溶媒に高分子を溶解させた溶液を基板上に展開した後、溶媒を除去し、残った高分子体を基材から剥ぎ取る方法である。

【0055】

シルクフィブロインフィルムまたはシルクフィブロインシートは、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液を基材上に展開した後、溶媒であるＨＦＩＰを除去し、残ったシルクフィブロインを基材から剥ぎ取ることで得ることができる。

【0056】

基材上に展開したシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液から、溶媒であるＨＦＩＰを除去する際の温度および圧力に特に制限はない。室温（約２５℃）で風乾させてもよく、減圧下、加熱乾燥してもよい。好ましくは、風乾である。

【0057】

溶液キャスト法を行う際のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の濃度は、０．１質量％以上、３０質量％以下である。好ましくは、０．５質量％以上、２０質量％以下である。特に好ましくは、１質量％以上、１０質量％以下である。シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の濃度が０．１質量％より低いと、シルクフィブロインフィルムまたはシルクフィブロインシートを得るために使用する溶液の量が多くなり、生産性が低下する。シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液の濃度が３０質量％より高いと、溶液の粘度が極端に高くなり、扱い難い。

【0058】

シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液から溶液キャスト法で得ることのできるシルクフィブロインフィルムまたはシルクフィブロインシートの厚みは、１μｍ以上、１ｍｍ以下である。好ましくは、５μｍ以上、７５０μｍ以下である。特に好ましくは、１０μｍ以上、５００μｍ以下である。厚みが1μｍより小さいと、材料として用いる上で十分な強度が得られない。厚みが５００μｍより大きいものを得ようとすると、使用する溶液の量が多くなり、生産性が低下する。

【0059】

なお、日本工業規格（ＪＩＳ）の包装用語規格では、フィルムとは「厚さが２５０μｍ未満のプラスチックの膜状のもの」、シートとは「厚さが２５０μｍ以上のプラスチックの薄い板状のもの」と定義されている。

【実施例】

【0060】

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。

【0061】

［精練シルクフィブロインの作製（繭玉の精練）］
５００ｍＬのガラス製セパラブルフラスコに、濃度が０．２質量％となるように調製した炭酸ナトリウム水溶液５００ｍＬ、および繭玉（品種、錦秋×鐘和）１０．０ｇを入れ、１００℃に昇温し煮沸した。煮沸を２時間行った後で静置し、４０℃まで冷却した後、内容物を濾過器で吸引濾過し繭玉を取り出した。次いで、取り出した繭玉をセパラブルフラスコに戻しフラスコ内にイオン交換水５００ｍＬを加えた後、１００℃に昇温し煮沸を３０分間行った後、４０℃まで冷却し、その後、吸引濾過を行い洗浄した。この洗浄操作を再度繰り返した後、繭玉を減圧乾燥器に入れ、温度６０℃、圧力１０ｈＰａで６時間減圧乾燥し、精練シルクフィブロイン６．９０ｇを得た。ＧＰＣにより、下記の手順で重量平均分子量（Ｍｗ）を測定したところ、１７０，０００であった。得られた精練シルクフィブロインを以下、実施例、および比較例１、２に使用した。

【0062】

［ＧＰＣによるタンパク質の重量平均分子量（Ｍｗ）の測定］
精練シルクフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）はＧＰＣを用いて測定した。ＧＰＣ装置には、東ソー株式会社製、製品名、ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣを用い、カラムには、東ソー株式会社製、製品名、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＨＭ－Ｈを２個連結して用いた。カラム中には溶離液として、５×１０^－３モル濃度のトリフルオロ酢酸ナトリウムを含むＨＦＩＰを流した。ポリメチルメタクリレートを基準物質として検量線を作成して、Ｍｗを算出した。

【0063】

ＧＰＣ測定試料は、ヘキサフルオロアセトン３水和物１ｍＬの入った試験管中に精練シルクフィブロイン１０ｍｇを量り入れ、室温（２５℃）で溶解させた後、マイクロシリンジで採取した溶液５μＬを、上記溶離液２ｍＬと混合し、調製した。

【0064】

［不溶分回収率］
実施例および比較例において溶解操作が終わった際に精練シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液に不溶分が確認された場合、濾過により不溶分を回収し、減圧オーブン中で乾燥後に質量を測定した。回収率は以下の式により算出した。
式：不溶分回収率（％）＝（不溶分の回収量（ｇ）／精練シルクフィブロインの仕込量（ｇ））×１００

【0065】

［シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の作製］
実施例１
温度計および攪拌子を備えた１００ｍＬのステンレス鋼製耐圧容器内に、室温（２５℃）にて、精練シルクフィブロイン０．２００ｇを量り入れ、ＨＦＩＰ１９．８ｇを添加した。次いで、耐圧容器底部をオイルバスに漬け、容器内部を１２０℃まで昇温後、３時間攪拌した。攪拌後、精練シルクフィブロインはすべて溶解し、不溶分は得られなかった（不溶分回収率０％）。また、得られたシルクフィブロイン溶液の重量平均分子量（Ｍｗ）は１７０，０００であった。

【0066】

実施例２
表１に記載の各温度、各時間を変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、その結果を示した。

【0067】

表１において、前述の精練シルクフィブロインの不溶分を回収した結果、重量平均分子量（Ｍｗ）が初期の７０％以上、かつ、不溶分回収率が２０％未満であるものを［Ａ］、重量平均分子量（Ｍｗ）が初期の７０％以上、かつ、不溶分回収率が２０％以上、８０％未満であるものを［Ｂ］、重量平均分子量（Ｍｗ）が初期の７０％未満となったものを［Ｃ］、不溶分回収率が８０％以上であるものを［Ｄ］とした。

【0068】

【表1】

【0069】

比較例１
攪拌子を備えた１００ｍＬのガラス製ナスフラスコ内に、室温（２５℃）にて、０．２００ｇの精練シルクフィブロインを量り入れ、１９．８ｇのＨＦＩＰを添加した。そのまま、室温にて２４時間攪拌を行った後、不溶分を回収したところ、回収量は０．１６４ｇ（不溶分回収率８２％）であった。比較例１の条件では、精練シルクフィブロインは、ＨＦＩＰに不溶であった。

【0070】

比較例２
攪拌子および冷却器を備えた１００ｍＬのガラス製ナスフラスコ内に、室温（２５℃）にて、０．２００ｇの精練シルクフィブロインを量り入れ、１９．８ｇのＨＦＩＰを添加した。次いで、ナスフラスコ底部をオイルバスに漬け、フラスコ内液を５０℃まで昇温後、２４時間攪拌した。攪拌後、不溶分を回収したところ、回収量は０．１１９ｇ（不溶分回収率６０％）であった。また、得られたシルクフィブロイン溶液の重量平均分子量（Ｍｗ）は１７０，０００であった。比較例２の条件では、精練シルクフィブロインの分子量の低下はなかったが、ＨＦＩＰへの溶解が不十分であった。

【0071】

［電界紡糸法によるシルクフィブロイン不織布の作製］
実施例１で得られた１質量％シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液２０ｍＬから、エバポレーターを用いて、ＨＦＩＰ、１５ｍＬを減圧留去し、濃度４質量％のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液５ｍＬを得た。次いで、前述の溶液をシリンジ内に充填し、電界紡糸装置に取り付けた後、装置内温度２５℃、装置内湿度５０％ＲＨ、印加電圧２５ｋＶ、電極間距離１５０ｍｍ、吐出速度１ｍＬ／ｈの条件にて紡糸を行うことで、シルクフィブロインの不織布を得た。シルクフィブロインの不織布のサイズは２０ｃｍ×３０ｃｍ、膜厚は約３０μｍ、繊維径は約２００ｎｍであった。

【0072】

［溶液キャスト法によるシルクフィブロインフィルムの作製］
実施例１で得られた濃度１質量％のシルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液２０ｍＬを、ポリスチレン製シャーレ（内径８８ｍｍ）上に展開し、蓋を被せた。次いで、室温（２５℃）で静置し、４８時間乾燥させることで、シルクフィブロインフィルムを得た。シルクフィブロインフィルムの膜厚は約５０μｍであった。

【図1】