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特許7284447融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、組み換えベクター、形質転換された宿主細胞、エキソソームの機能調節剤、及びエキソソーム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-23
(45)【発行日】2023-05-31
(54)【発明の名称】融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、組み換えベクター、形質転換された宿主細胞、エキソソームの機能調節剤、及びエキソソーム
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20230524BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230524BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230524BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230524BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20230524BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20230524BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61K35/76
A61P43/00 111
C12N5/10
C07K19/00
C12N15/62 Z
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2018158686
(22)【出願日】2018-08-27
(65)【公開番号】P2020033276
(43)【公開日】2020-03-05
【審査請求日】2021-05-27
(73)【特許権者】
【識別番号】519288973
【氏名又は名称】株式会社プレッパーズ
(73)【特許権者】
【識別番号】000125381
【氏名又は名称】学校法人藤田学園
(74)【代理人】
【識別番号】100131705
【弁理士】
【氏名又は名称】新山 雄一
(74)【代理人】
【識別番号】100190621
【弁理士】
【氏名又は名称】崎間 伸洋
(72)【発明者】
【氏名】瀬藤 光利
(72)【発明者】
【氏名】上田 洋司
(72)【発明者】
【氏名】土田 邦博
【審査官】深草 亜子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０１３５５９６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】上田洋司他，新規翻訳後修飾因子UBL3によるエクソソームへのタンパク質輸送機構，２０１７年度生命科学系学会合同年次大会 要旨，2017年，2AW15-2
【文献】DOWNES P.B.et al.，MUBs, a family of Ubiquitin-fold proteins that are plasma membrane-anchored by a prenylation，Journal of Biological Chemistry，2006年，Vol.281，p.27145-27157
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＵＢＬ３タンパク質と機能性タンパク質との融合タンパク質、又は、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む、エキソソームの機能調節剤であって、前記機能性タンパク質が、疾患の原因物質又は疾患の抑制物質、膜タンパク質、細胞骨格形成タンパク質、標識タンパク質及び神経変性疾患関連タンパク質よりなる群から選択される少なくとも１つであり、
エキソソームにおいて、前記機能性タンパク質が機能発現可能な状態とするための、前記機能調節剤。
【請求項2】
前記疾患の原因物質がＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＲＲＡＳ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＲＢ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ｍＴＯＲ、ＴＳＣ２、ＡＰＬＰ２、ＩＲＦ３、ＩＫＢＫＧ、ＲＰＴＯＲ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＰＳＥＮ１、ＡＴＸＮ１０、ＨＩＰ１Ｒ及びＮＰＣ１よりなる群から選択される少なくとも１つであり、前記膜タンパク質が膜貫通型タンパク質であり、
前記細胞骨格形成タンパク質がチューブリンであり、
前記神経変性疾患関連タンパク質が、アミロイドβ、タウ、α－シヌクレイン及びプリオンよりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の機能調節剤。
【請求項3】
前記ＵＢＬ３タンパク質が下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、請求項１又は２に記載の機能調節剤。（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１又は２の１１３番目又は１１４番目のシステイン残基を介した結合によって任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１又は２の１１３番目又は１１４番目のシステイン残基を介した結合によって任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ上記任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質
【請求項4】
前記核酸を含む組み換えベクターを含む請求項１に記載の機能調節剤。
【請求項5】
前記機能性タンパク質が機能発現可能な状態で融合タンパク質を含有する、請求項１に記載の機能調節剤により改質されたエキソソーム。
【請求項6】
ＵＢＬ３タンパク質と機能性タンパク質との融合タンパク質、又は、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む、エキソソームの機能調節剤であって、前記エキソソームにおいて、前記機能性タンパク質が機能発現可能な状態であり、
前記機能性タンパク質が、疾患の原因物質、膜タンパク質、細胞骨格形成タンパク質、標識タンパク質及び神経変性疾患関連タンパク質よりなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記疾患の原因物質がＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＲＲＡＳ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＲＢ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ｍＴＯＲ、ＴＳＣ２、ＡＰＬＰ２、ＩＲＦ３、ＩＫＢＫＧ、ＲＰＴＯＲ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＰＳＥＮ１、ＡＴＸＮ１０、ＨＩＰ１Ｒ及びＮＰＣ１よりなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記膜タンパク質が膜貫通型タンパク質であり、
前記細胞骨格形成タンパク質がチューブリンであり、
前記神経変性疾患関連タンパク質が、アミロイドβ、タウ、α－シヌクレイン及びプリオンよりなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記エキソソームを受け取る細胞において、膜局在化機能、細胞骨格形成機能、標識機能、疾患の原因の発現機能を発現するための、前記機能調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エキソソームを改質し得る、融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、組み換えベクター、形質転換された宿主細胞、該融合タンパク質又は該核酸を含むエキソソームの機能調節剤、及び該融合タンパク質を含むエキソソームに関する。
【背景技術】
【0002】
小さな細胞外小胞（以下、単に「ｓＥＶ」という。）は、様々な種類の細胞から分泌されるナノメートルサイズの小胞である（例えば、非特許文献１参照。）。
エキソソームは、多胞体（以下、単に「ＭＶＢ」という。）に由来するｓＥＶの一種であり（例えば、非特許文献２、３参照。）、タンパク質、ｍＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡを輸送することによって細胞間コミュニケーションを仲介する（例えば、非特許文献３、４参照。）。
エキソソームを含むｓＥＶによる細胞間での機能性タンパク質の送達は、腫瘍の進行及び神経変性疾患に関連している（例えば、非特許文献５、６参照。）。
しかしながら、機能性タンパク質がｓＥＶにソーティングされる分子メカニズムは完全には解明されていない。
エキソソームは、多胞体（以下、単に「ＭＶＢ」という。）に由来するｓＥＶの一種であり（例えば、非特許文献２、３参照。）、タンパク質、ｍＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡを輸送することによって細胞間コミュニケーションを仲介する（例えば、非特許文献３、４参照。）。
エキソソームを含むｓＥＶによる細胞間での機能性タンパク質の送達は、腫瘍の進行及び神経変性疾患に関連している（例えば、非特許文献５、６参照。）。
しかしながら、機能性タンパク質がｓＥＶにソーティングされる分子メカニズムは完全には解明されていない。
【0003】
一方、タンパク質は、一般に、翻訳後、ユビキチン、スモールユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、及びＮｅｄｄ８７－１０等の翻訳後修飾因子によって種々の翻訳後修飾を受けることが知られており、このような翻訳後修飾は、様々な細胞プロセスに影響を及ぼし得ることが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．＆ Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ，Ｗ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｅｘｏｓｏｍｅｓ，ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ，ａｎｄ ｆｒｉｅｎｄｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００，３７３－３８３（２０１３）．
【文献】Ｋａｔｚｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｏｄｏｒｉｚｚｉ，Ｇ．＆ Ｅｍｒ，Ｓ．Ｄ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ－ｂｏｄｙ ｓｏｒｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３，８９３－９０５（２００２）．
【文献】Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ． ＆ Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３０，２５５－２８９（２０１４）．
【文献】Ｖａｌａｄｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ． Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９，６５４－６５９（２００７）．
【文献】Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ． Ｔｕｍｏｕｒ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｉｃ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ５２７，３２９－３３５（２０１５）．
【文献】Ｒａｊｅｎｄｒａｎ，Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｅｔａ－ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３，１１１７２－１１１７７（２００６）．
【文献】Ｄｏｗｎｅｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｓａｒａｃｃｏ，Ｓ．Ａ．，Ｌｅｅ，Ｓ． Ｓ．，Ｃｒｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｎ．＆Ｖｉｅｒｓｔｒａ，Ｒ．Ｄ．ＭＵＢｓ，ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｆｏｌｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｎｃｈｏｒｅｄ ｂｙ ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１，２７１４５－２７１５７（２００６）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
膜結合型Ｕｂフォールドタンパク質（ＭＵＢ）としても知られるユビキチン様タンパク質３（以下、単に「ＵＢＬ３」という。）はユビキチン様（ＵＢＬ）ドメインを含むことが知られており、動物、糸状菌及び植物において進化的に保存され、プレニル化によって局在化された膜タンパク質であることが知られている（例えば、非特許文献７参照。）。
しかし、ＵＢＬ３は、翻訳後修飾因子としては知られていなかった。
しかし、ＵＢＬ３は、翻訳後修飾因子としては知られていなかった。
【0006】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、エキソソームを改質し得る、融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む組み換えベクター、該組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞、該融合タンパク質又は該核酸を含むエキソソームの機能調節剤、及び該融合タンパク質を含むエキソソームの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ＵＢＬ３による翻訳後修飾が機能性タンパク質を機能発現可能な状態でｓＥＶへソーティングし得ること、及び機能発現可能な状態でレシピエント細胞へソーティングし得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【0008】
（１）ＵＢＬ３タンパク質と機能性タンパク質との融合タンパク質。
（２）前記ＵＢＬ３タンパク質が下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、（１）に記載の融合タンパク質。
（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾（例えば、翻訳後修飾）する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティング（輸送ないし分配）する活性、及び／又は膜タンパク質として（例えば、プレニル化によって）局在化する活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ上記任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質
（３）上記（１）又は（２）に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（４）上記（３）に記載の核酸を含む組み換えベクター。
（５）上記（４）に記載の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
（６）上記（１）又は（２）に記載の融合タンパク質又は上記（３）に記載の核酸を含む、エキソソームの機能調節剤。
（７）上記機能性タンパク質が機能発現可能な状態で上記（１）又は（２）に記載の融合タンパク質を含有するエキソソーム。
（２）前記ＵＢＬ３タンパク質が下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、（１）に記載の融合タンパク質。
（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾（例えば、翻訳後修飾）する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティング（輸送ないし分配）する活性、及び／又は膜タンパク質として（例えば、プレニル化によって）局在化する活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ上記任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質
（３）上記（１）又は（２）に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
（４）上記（３）に記載の核酸を含む組み換えベクター。
（５）上記（４）に記載の組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞。
（６）上記（１）又は（２）に記載の融合タンパク質又は上記（３）に記載の核酸を含む、エキソソームの機能調節剤。
（７）上記機能性タンパク質が機能発現可能な状態で上記（１）又は（２）に記載の融合タンパク質を含有するエキソソーム。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、エキソソームを改質し得る、融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む組み換えベクター、該組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞、該融合タンパク質又は該核酸を含むエキソソームの機能調節剤、及び該融合タンパク質を含むエキソソームの提供を提供することができる。
また、本発明は、腫瘍形成、腫瘍進行、腫瘍転移、神経変性疾患等のｓＥＶ関連疾患の治療ツール開発のインビトロ研究ツールとして好適である。
また、本発明は、腫瘍形成、腫瘍進行、腫瘍転移、神経変性疾患等のｓＥＶ関連疾患の治療ツール開発のインビトロ研究ツールとして好適である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】様々な種からのＵＢＬドメイン含有タンパク質の系統樹分析結果を示す図である。
【図2】新規翻訳後修飾因子ＵＢＬ３の分析結果を示す図である。
【図3】ＵＢＬ３ノックアウトマウスの作製の概要を示す図である。
【図4】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるＵＢＬ３修飾の分析結果を示す図である。
【図5】ＵＢＬ３の細胞内局在化を示す図である。
【図6】ＭＶＢへのＵＢＬ３の局在化がＵＢＬ３修飾に依存することを示す図である。
【図7】ｓＥＶにおける全タンパク質レベルがＵＢＬ３ノックアウトマウスにおいて減少することを示す図である。
【図8】ｓＥＶにおけるＵＢＬ３の分析を示す図である。
【図9】ＷＴマウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウスからの血清及び血漿由来ｓＥＶの分析結果を示す図である。
【図10】ＵＢＬ３修飾が、ｓＥＶへのタンパク質ソーティングに関与することを示す図である。
【図11】ＵＢＬ３によるチューブリンの翻訳後修飾及びｓＥＶへのソーティングを示す図である。
【図12】ＵＢＬ３によるＲａｓタンパク質の翻訳後修飾及びｓＥＶへのソーティングを示す図である。
【図13】ＵＢＬの細胞内局在化及びｓＥＶへのソーティングを示す図である。
【図14】ＵＢＬ３によってタグ付けされたＥＧＦＰ化タンパク質及びビオチン化タンパク質が、ｓＥＶにソーティングされることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
また、本明細書において、「～」は特に断りがなければ以上から以下を表す。
また、本明細書において、「～」は特に断りがなければ以上から以下を表す。
【0012】
まず、ＵＢＬ３遺伝子若しくはＵＢＬ３タンパク質及びその取得方法について説明する。
（ＵＢＬ３タンパク質）
ＵＢＬ３タンパク質は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾（例えば、翻訳後修飾）する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティング（輸送ないし分配）する活性、及び／又は膜タンパク質として（例えば、プレニル化によって）局在化する活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質
ヒト又はマウス由来のタンパク質をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、上記（ａ）のタンパク質であることが好ましい。
上記任意のタンパク質を修飾する活性としては、具体的には、配列番号１又は２の１１０～１１７番目（好ましくは１１１～１１７番目、より好ましくは１１１～１１６番目、更に好ましくは１１２～１１５番目、特に好ましくは１１３又は１１４番目）の少なくとも１つのアミノ酸残基を介して任意のタンパク質に結合する活性を意味する。
配列番号１は、ヒトＵＢＬ３タンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、マウスＵＢＬ３タンパク質のアミノ酸配列を表す。
（ＵＢＬ３タンパク質）
ＵＢＬ３タンパク質は、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾（例えば、翻訳後修飾）する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティング（輸送ないし分配）する活性、及び／又は膜タンパク質として（例えば、プレニル化によって）局在化する活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質
ヒト又はマウス由来のタンパク質をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、上記（ａ）のタンパク質であることが好ましい。
上記任意のタンパク質を修飾する活性としては、具体的には、配列番号１又は２の１１０～１１７番目（好ましくは１１１～１１７番目、より好ましくは１１１～１１６番目、更に好ましくは１１２～１１５番目、特に好ましくは１１３又は１１４番目）の少なくとも１つのアミノ酸残基を介して任意のタンパク質に結合する活性を意味する。
配列番号１は、ヒトＵＢＬ３タンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号２は、マウスＵＢＬ３タンパク質のアミノ酸配列を表す。
【0013】
本明細書で言う「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、アミノ酸の相同性が９０％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上である。
配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
本明細書で言う「９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、アミノ酸の相同性が９０％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上である。
配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
【0014】
従って、配列表の配列番号１又は２に記載したＵＢＬ３のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異がＵＢＬ３の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異タンパク質がＵＢＬ３と同様に任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質であれば、これらは全てＵＢＬ３の範囲内に属する。
ＵＢＬ３タンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
ＵＢＬ３タンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
【0015】
（ＵＢＬ３遺伝子）
ＵＢＬ３タンパク質（例えば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てＵＢＬ３遺伝子に属する。
配列番号３は、ヒトＵＢＬ３遺伝子をコードするコーディング領域（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
また、配列番号４は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｈｏｕｓｅ ｍｏｕｓｅ））ＵＢＬ３遺伝子をコードするＣＤＳ塩基配列を示す。
ＵＢＬ３タンパク質（例えば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てＵＢＬ３遺伝子に属する。
配列番号３は、ヒトＵＢＬ３遺伝子をコードするコーディング領域（ＣＤＳ）の塩基配列を示す。
また、配列番号４は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｈｏｕｓｅ ｍｏｕｓｅ））ＵＢＬ３遺伝子をコードするＣＤＳ塩基配列を示す。
【0016】
ＵＢＬ３遺伝子の具体例としては、下記（ｄ）及び（ｅ）の何れかに記載の遺伝子が挙げられ、ヒト又はマウス由来の遺伝子をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、下記（ｄ）の遺伝子であることが好ましい。
（ｄ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｅ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｅ）配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつ任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【0017】
本明細書で言う「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列」における「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、更に好ましくは１から５個程度を意味する。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号３又は４に記載したＵＢＬ３遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられ、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
上述の通り、配列表の配列番号３又は４に記載したＵＢＬ３遺伝子の塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が、任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、配列番号３又は４に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、ＵＢＬ３遺伝子の範囲内のものである。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号３又は４に記載したＵＢＬ３遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられ、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
上述の通り、配列表の配列番号３又は４に記載したＵＢＬ３遺伝子の塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が、任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、配列番号３又は４に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、ＵＢＬ３遺伝子の範囲内のものである。
【0018】
（ＵＢＬ３遺伝子の取得）
ＵＢＬ３遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１～４に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ＵＢＬ３遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、ＵＢＬ３遺伝子を単離することができる。ＰＣＲ法によりＵＢＬ３遺伝子を取得することもできる。
ＵＢＬ３遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１～４に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ＵＢＬ３遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、ＵＢＬ３遺伝子を単離することができる。ＰＣＲ法によりＵＢＬ３遺伝子を取得することもできる。
【0019】
本明細書中上記した、配列表の配列番号３又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、任意のタンパク質を修飾する活性、上記修飾することによりＭＶＢ又はｓＥＶへ任意のタンパク質をソーティングする活性、及び／又は膜タンパク質として局在化する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。
【0020】
＜ＵＢＬタンパク質と機能性タンパク質との融合タンパク質＞
ＵＢＬタンパク質については上述の通りである。
本発明の融合タンパク質は、ＵＢＬタンパク質の遺伝子と機能性タンパク質の遺伝子とが一体となって転写及び発現し、１個のタンパク質を形成しているタンパク質が好ましい。
ＵＢＬタンパク質については上述の通りである。
本発明の融合タンパク質は、ＵＢＬタンパク質の遺伝子と機能性タンパク質の遺伝子とが一体となって転写及び発現し、１個のタンパク質を形成しているタンパク質が好ましい。
【0021】
（機能性タンパク質）
上記機能性タンパク質としては、疾患の原因物質又は疾患の抑制物質、膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）、細胞骨格形成タンパク質（例えば、チューブリン）、標識タンパク質（例えば、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、改良型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））等の任意のタンパク質が挙げられるが、疾患の原因物質又は疾患の抑制物質が好ましい。
例えば、後述する実施例の項においては、ＵＢＬタンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質等を実施している。
上記疾患の原因物質としては、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＲＲＡＳ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＲＢ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ｍＴＯＲ、ＴＳＣ２、ＡＰＬＰ２、ＩＲＦ３、ＩＫＢＫＧ、ＲＰＴＯＲ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＰＳＥＮ１、ＡＴＸＮ１０、ＨＩＰ１Ｒ及びＮＰＣ１よりなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ及びＲＲＡＳよりなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
上記機能性タンパク質としては、疾患の原因物質又は疾患の抑制物質、膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）、細胞骨格形成タンパク質（例えば、チューブリン）、標識タンパク質（例えば、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、改良型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））等の任意のタンパク質が挙げられるが、疾患の原因物質又は疾患の抑制物質が好ましい。
例えば、後述する実施例の項においては、ＵＢＬタンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質等を実施している。
上記疾患の原因物質としては、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＲＲＡＳ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＲＢ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ｍＴＯＲ、ＴＳＣ２、ＡＰＬＰ２、ＩＲＦ３、ＩＫＢＫＧ、ＲＰＴＯＲ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ２、ＰＳＥＮ１、ＡＴＸＮ１０、ＨＩＰ１Ｒ及びＮＰＣ１よりなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ及びＲＲＡＳよりなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
【0022】
また、ｓＥＶにおける特定のタンパク質は、腫瘍の進行及び有機性転移において重要な役割を果たすことが知られており（Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｕｒ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｏｒｇａｎｏｔｒｏｐｉｃ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５２７，３２９－３３５（２０１５）．、Ａｌ－Ｎｅｄａｗｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＥＧＦＲｖＩＩＩ ｂｙ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０，６１９－６２４（２００８）．、Ｐｅｉｎａｄｏ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｍｅｌａｎｏｍａ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｅｄｕｃａｔｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ａ ｐｒｏ－ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＭＥＴ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １８，８８３－８９１（２０１２）．）、上記機能性タンパク質として使用し得る。
【0023】
また、アミロイドβ、タウ、α－シヌクレイン、プリオンなどの神経変性疾患関連タンパク質もｓＥＶ内にパッケージングされ、脳内に分布していることが知られており（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｅｔａ－ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｒｅ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３，１１１７２－１１１７７（２００６）．、Ｆｅｖｒｉｅｒ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｐｒｉｏｎｓ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１，９６８３－９６８８（２００４）．、Ｌｅｅ， Ｈ． Ｊ．， Ｂａｅ， Ｅ． Ｊ． ＆ Ｌｅｅ， Ｓ． Ｊ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｌｐｈａ－－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ－ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｃｒｕｃｉａｌ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ １０，９２－９８（２０１４）．、Ｋａｎｍｅｒｔ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ｔａｕ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ Ｔａｕ ｏｒ ｉｔｓ Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ， ａｒｅ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３５，１０８５１－１０８６５（２０１５）．）、上記機能性タンパク質として使用し得る。
【0024】
＜核酸＞
本発明の核酸は、上記融合タンパク質をコードし、ＵＢＬ３遺伝子と機能性タンパク質の遺伝子とが一体となって転写及び発現して１個の融合タンパク質を形成し得る。
ＵＢＬ３遺伝子と機能性タンパク質の遺伝子との位置関係としては、ＵＢＬ３遺伝子がＮ末端側、Ｃ末端側のいずれであってもよいが、Ｎ末端側であることが好ましい。
上記核酸におけるＵＢＬ３遺伝子部分としては、上記（ｄ）及び（ｅ）の何れかに記載の遺伝子が好ましく、上記（ｄ）の遺伝子がより好ましい。
例えば、後述する実施例の項においては、ＵＢＬタンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質等をコードする核酸を使用している。
本発明の核酸は、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節領域を更に含んでいてもいなくてもよい。
本発明の核酸は、上記融合タンパク質をコードし、ＵＢＬ３遺伝子と機能性タンパク質の遺伝子とが一体となって転写及び発現して１個の融合タンパク質を形成し得る。
ＵＢＬ３遺伝子と機能性タンパク質の遺伝子との位置関係としては、ＵＢＬ３遺伝子がＮ末端側、Ｃ末端側のいずれであってもよいが、Ｎ末端側であることが好ましい。
上記核酸におけるＵＢＬ３遺伝子部分としては、上記（ｄ）及び（ｅ）の何れかに記載の遺伝子が好ましく、上記（ｄ）の遺伝子がより好ましい。
例えば、後述する実施例の項においては、ＵＢＬタンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質等をコードする核酸を使用している。
本発明の核酸は、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節領域を更に含んでいてもいなくてもよい。
【0025】
＜組換えベクター＞
本発明の組み換えベクターは上記核酸を含む。
本発明において「組換えベクター」とは、適当な宿主細胞で上記融合タンパク質を発現することができる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された調節領域を含む遺伝子作製物をいう。本発明において、「作動可能に連結された」とは、一般的機能を行うために、核酸発現調節配列と、上記融合タンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。組換えベクターとの作動的連結は、本発明が属する技術分野で公知されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡの切断及び連結は、本発明が属する技術分野で一般に知られている酵素などを用いて容易に行うことができる。
本発明の組み換えベクターは上記核酸を含む。
本発明において「組換えベクター」とは、適当な宿主細胞で上記融合タンパク質を発現することができる発現ベクターであって、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された調節領域を含む遺伝子作製物をいう。本発明において、「作動可能に連結された」とは、一般的機能を行うために、核酸発現調節配列と、上記融合タンパク質をコードする核酸配列とが機能的に連結されていることをいう。組換えベクターとの作動的連結は、本発明が属する技術分野で公知されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位特異的ＤＮＡの切断及び連結は、本発明が属する技術分野で一般に知られている酵素などを用いて容易に行うことができる。
【0026】
本発明で用いられる適切な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節領域の他にも、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列を含むことができる。開始コドン及び終止コドンは、通常、免疫原性標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部とみなされ、遺伝子作製物が投与された時、個体において必ず作用を示さなければならず、コード配列とインフレームにあるべきである。一般のプロモーターは、構成的又は誘導性である。原核細胞としてはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３及びＴ７のプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。真核細胞としては、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶの長末端反復部（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターだけでなく、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン由来のプロモーターが挙げられるが、これに限定されない。上記発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含むことができる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性又は表面タンパク質の発現といった選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられることができる。選択剤が処理された環境では選別マーカーを発現する細胞のみが生存するため、形質転換された細胞が選別可能である。また、ベクターは、複製可能な発現ベクターの場合、複製が開始される特定の核酸配列である複製起点を含むことができる。組換え発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、コスミドなどの様々な形態のベクターを用いることができる。組換えベクターの種類は、原核細胞及び真核細胞の各種宿主細胞で目的の遺伝子を発現し、目的のタンパク質を生産する機能を行うものであれば特に限定されないが、強い活性を示すプロモーターと強い発現力を有しながら自然状態と同様の形態の外来タンパク質を大量生産することができるベクターが好ましい。
【0027】
上記融合タンパク質を発現させるために、様々な発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核宿主に適した発現ベクターとしては、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス、及びレトロウイルス由来の発現調節配列などが用いられることができるが、これに限定されるものではない。細菌宿主に使用可能な発現ベクターとしては、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のような大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来の細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主域を有するプラスミド、λｇｔ１０とλｇｔ１１、ＮＭ９８９のように非常に多様なファージλ（ｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ）誘導体で例示されるファージＤＮＡ、及びＭ１３や繊維状１本鎖ＤＮＡファージなどの他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクターは、２℃プラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクターは、ｐＶＬ９４１である。
【0028】
＜形質転換された宿主細胞＞
本発明の宿主細胞は、上記組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞である。
上記組換えベクターは宿主細胞に挿入されて形質転換体を形成することができる。この際、適当な宿主細胞は、大膓菌、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）などの原核細胞であることができ、また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）などの真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）及びニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などの酵母、その他の下等真核細胞、及び昆虫からの細胞のような高等真核生物の細胞などの真核細胞であることができる。
本発明の宿主細胞は、上記組み換えベクターにより形質転換された宿主細胞である。
上記組換えベクターは宿主細胞に挿入されて形質転換体を形成することができる。この際、適当な宿主細胞は、大膓菌、バチルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）などの原核細胞であることができ、また、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）などの真菌、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）及びニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）などの酵母、その他の下等真核細胞、及び昆虫からの細胞のような高等真核生物の細胞などの真核細胞であることができる。
【0029】
また、前記宿主細胞は、好ましくは植物、哺乳動物由来のものであることができるが、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞）、ヒト胎児腎細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ヒト子宮頸がん細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ－Ｓ３細胞）、ハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞）等などが利用可能であり、これに限定されない。
【0030】
本発明において宿主細胞への「形質転換」は、核酸を、細胞又は組職に組み込む如何なる方法も含まれ、当分野で公知されたように、宿主細胞に応じて適当な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、エレクトロポーレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿法、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌法、アグロバクテリアを介した形質転換法、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミン及び乾燥／抑制を介した形質転換法などが含まれるが、これに限定されない。
【0031】
＜エキソソームの機能調節剤＞
本発明のエキソソームの機能調節剤は、上記融合タンパク質又は上記核酸を含む。
エキソソームの機能としては、天然のエキソームが元来有する機能のみならず、エキソームに人工的に付与された機能であってもよく、視認性（例えば、蛍光標識等）、識別性（例えば、タグ化）、標的であるレシピエント細胞に指向する機能、標的であるレシピエント細胞に取り込まれる機能等が挙げられる。
本発明のエキソソームの機能調節剤は、上記融合タンパク質又は上記核酸を含むことにより、エキソソームの上記機能を調節（例えば、亢進又は抑制）することができる。
本発明のエキソソームの機能調節剤が適用されるエキソームは、天然物（例えば、天然化合物、タンパク質、ペプチド、核酸（ｍｉＲＮＡ等））、人工物（例えば、合成化合物、組み換えないし合成タンパク質、組み換えないし合成ペプチド、組み換えないし合成核酸（組み換えないし合成ｍｉＲＮＡ等））を含有していてもいなくてもよい。
上記天然物ないし上記人工物を更に含有するエキソームとしては、例えば、上記天然物ないし上記人工物を高発現する細胞由来のエキソームを用いることができる（例えば、日経バイオテク２０１６年３月１４号「特集」動きだしたエクソーム創薬）。
本発明のエキソソームの機能調節剤は、上記融合タンパク質又は上記核酸を含む。
エキソソームの機能としては、天然のエキソームが元来有する機能のみならず、エキソームに人工的に付与された機能であってもよく、視認性（例えば、蛍光標識等）、識別性（例えば、タグ化）、標的であるレシピエント細胞に指向する機能、標的であるレシピエント細胞に取り込まれる機能等が挙げられる。
本発明のエキソソームの機能調節剤は、上記融合タンパク質又は上記核酸を含むことにより、エキソソームの上記機能を調節（例えば、亢進又は抑制）することができる。
本発明のエキソソームの機能調節剤が適用されるエキソームは、天然物（例えば、天然化合物、タンパク質、ペプチド、核酸（ｍｉＲＮＡ等））、人工物（例えば、合成化合物、組み換えないし合成タンパク質、組み換えないし合成ペプチド、組み換えないし合成核酸（組み換えないし合成ｍｉＲＮＡ等））を含有していてもいなくてもよい。
上記天然物ないし上記人工物を更に含有するエキソームとしては、例えば、上記天然物ないし上記人工物を高発現する細胞由来のエキソームを用いることができる（例えば、日経バイオテク２０１６年３月１４号「特集」動きだしたエクソーム創薬）。
【0032】
＜エキソソーム＞
本発明のエキソソームは上記機能性タンパク質が機能発現可能な状態で上記融合タンパク質を含有する。
本発明のエキソソームは、上記天然物、上記人工物を更に含有していてもいなくてもよい。
上記天然物ないし上記人工物を更に含有するエキソームとしては、例えば、上記天然物ないし上記人工物を高発現する細胞由来のエキソームを用いることができる。
上記機能性タンパク質の機能としては、例えば、上記機能性タンパク質が膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）である場合には膜局在化、上記機能性タンパク質が細胞骨格形成タンパク質である場合には細胞骨格形成、上記機能性タンパク質が疾患の原因物質又は疾患の抑制物質である場合には疾患の原因の発現又は疾患の抑制等が挙げられる。
本発明のエキソソームは上記機能性タンパク質が機能発現可能な状態で上記融合タンパク質を含有する。
本発明のエキソソームは、上記天然物、上記人工物を更に含有していてもいなくてもよい。
上記天然物ないし上記人工物を更に含有するエキソームとしては、例えば、上記天然物ないし上記人工物を高発現する細胞由来のエキソームを用いることができる。
上記機能性タンパク質の機能としては、例えば、上記機能性タンパク質が膜タンパク質（例えば、膜貫通型タンパク質）である場合には膜局在化、上記機能性タンパク質が細胞骨格形成タンパク質である場合には細胞骨格形成、上記機能性タンパク質が疾患の原因物質又は疾患の抑制物質である場合には疾患の原因の発現又は疾患の抑制等が挙げられる。
【0033】
本発明のエキソソームにおいて、上記機能性タンパク質が機能発現可能な状態であることにより、上記機能性タンパク質の機能に応じて、レシピエント細胞において任意の機能を発現することができる。
例えば、実施例の項において後述する≪レシピエント細胞（ｓＥＶを受け取る側の細胞）におけるＲａｓシグナル伝達の活性化試験≫にて説明するように、発癌性ＲａｓＧ１２ＶとＵＢＬ３タンパク質とが融合ないし結合したタンパク質を含有するエキソソーム等のｓＥＶが、レシピエント細胞におけるＲａｓシグナル伝達の活性化し得ることが示されている。
このことは、エキソソーム等のｓＥＶが、機能性タンパク質（発癌性ＲａｓＧ１２Ｖ）が機能発現可能な状態で上記融合タンパク質を含有し、レシピエント細胞において機能発現（Ｒａｓシグナル伝達活性化）し得ることを示している。
例えば、実施例の項において後述する≪レシピエント細胞（ｓＥＶを受け取る側の細胞）におけるＲａｓシグナル伝達の活性化試験≫にて説明するように、発癌性ＲａｓＧ１２ＶとＵＢＬ３タンパク質とが融合ないし結合したタンパク質を含有するエキソソーム等のｓＥＶが、レシピエント細胞におけるＲａｓシグナル伝達の活性化し得ることが示されている。
このことは、エキソソーム等のｓＥＶが、機能性タンパク質（発癌性ＲａｓＧ１２Ｖ）が機能発現可能な状態で上記融合タンパク質を含有し、レシピエント細胞において機能発現（Ｒａｓシグナル伝達活性化）し得ることを示している。
【実施例】
【0034】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。
【0035】
＜プロトコール＞
以下の実施例において、（細胞培養）、（プラスミド構築）、（抗体）、（免疫沈降）、（組織ホモジナイゼーション及びウェスタンブロット分析）、（膜タンパク質及び細胞質タンパク質画分の単離）及び（統計解析）は以下のプロトコールにて行なった。
（細胞培養）
ＰＳ（１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１０μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とともに、ロスウェルパークメモリアルインスティテュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞を培養した。
培養物を３７℃５％ＣＯ２下インキュベートした。以前の論文（Ｒｏｄｅｈｅｆｆｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｂｉｒｓｏｙ，Ｋ．＆ Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｃｅｌｌ １３５，２４０－２４９（２００８）．、Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．＆Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２（２０１０）．）に従い、脂肪組織由来の間質血管画分（ＳＶＦ）並びに野生型マウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウス由来の筋芽細胞から初代細胞を調製した。
以下の実施例において、（細胞培養）、（プラスミド構築）、（抗体）、（免疫沈降）、（組織ホモジナイゼーション及びウェスタンブロット分析）、（膜タンパク質及び細胞質タンパク質画分の単離）及び（統計解析）は以下のプロトコールにて行なった。
（細胞培養）
ＰＳ（１００ユニット／ｍＬペニシリンＧ、１０μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とともに、ロスウェルパークメモリアルインスティテュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＭＤＡ－ＭＢ－２３１－ｌｕｃ－Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞（Ｘｅｎｏｇｅｎ社製）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞を培養した。
培養物を３７℃５％ＣＯ２下インキュベートした。以前の論文（Ｒｏｄｅｈｅｆｆｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｂｉｒｓｏｙ，Ｋ．＆ Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｃｅｌｌ １３５，２４０－２４９（２００８）．、Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．＆Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２（２０１０）．）に従い、脂肪組織由来の間質血管画分（ＳＶＦ）並びに野生型マウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウス由来の筋芽細胞から初代細胞を調製した。
【0036】
（プラスミド構築）
様々な発現ベクターを、従来の分子生物学技術及びＰＣＲ（Ｙａｏ，Ｉ．ｅｔ ａｌ． ＳＣＲＡＰＰＥＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １３０，９４３－９５７（２００７）．、Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ． ＆Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２（２０１０）．、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｍ．＆Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－４８６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４７，９３－１０３（２０１４）．）を用いて、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）又はｐｃＤＮＡ６／ＢｉｏＥａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のいずれかにサブクローニングした。以前に報告されたように、Ｒａｂ２７ａ ｓｈＲＮＡの配列を使用して、ｐｃＤＮＡ ６．２－ＧＷ／ｍｉＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ． Ｒａｂ２７ａ ａｎｄ Ｒａｂ２７ｂ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１９－３０（２０１０）．）。
Ｒａｓ実験では、ＨＲａｓ発現ベクターセット（ｐＣＭＶ－Ｒａｓベクター及びｐＣＭＶ－ＲａｓＶ１２ベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用した。ＧＦＰ－ユビキチンは、Ｎｉｃｏ Ｄａｎｔｕｍａ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１９２８）からの贈与であった。
様々な発現ベクターを、従来の分子生物学技術及びＰＣＲ（Ｙａｏ，Ｉ．ｅｔ ａｌ． ＳＣＲＡＰＰＥＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １３０，９４３－９５７（２００７）．、Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ． ＆Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２（２０１０）．、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｍ．＆Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－４８６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４７，９３－１０３（２０１４）．）を用いて、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）又はｐｃＤＮＡ６／ＢｉｏＥａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のいずれかにサブクローニングした。以前に報告されたように、Ｒａｂ２７ａ ｓｈＲＮＡの配列を使用して、ｐｃＤＮＡ ６．２－ＧＷ／ｍｉＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ． Ｒａｂ２７ａ ａｎｄ Ｒａｂ２７ｂ ｃｏｎｔｒｏｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｅｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１９－３０（２０１０）．）。
Ｒａｓ実験では、ＨＲａｓ発現ベクターセット（ｐＣＭＶ－Ｒａｓベクター及びｐＣＭＶ－ＲａｓＶ１２ベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用した。ＧＦＰ－ユビキチンは、Ｎｉｃｏ Ｄａｎｔｕｍａ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１９２８）からの贈与であった。
【0037】
（抗体）
ウサギ抗ＵＢＬ３抗体を得るために、細菌で発現された１．５ｍｇのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合マウスＵＢＬ３タンパク質を９匹のウサギにそれぞれ４回注射した。組換えＵＢＬ３タンパク質、外因性ＵＢＬ３タンパク質及び内在性ＵＢＬ３タンパク質は、１つのウサギの血清においてのみ特異的に認識された。血清をＧＳＴカラムに３回通して非特異的抗体を除去した。得られたフロースルー（ＦＴ）を「ＵＢＬ３抗血清」と称する。ＵＢＬ３タンパク質のより特異的な抗体を得るために、ポリクローナルＵＢＬ３抗血清をＧＳＴカラムに通した。得られたＦＴを、ＵＢＬ３ ＫＯマウス由来の脳溶解物と結合したカラムにさらに通し、ＵＢＬ３以外の他のＵＢＬの認識を排除した。ＦＴをＧＳＴ－ＵＢＬ３カラムを用いてさらに精製した。このＦＴを「抗ＵＢＬ３抗体」と称する。
ウサギ抗ＵＢＬ３抗体を得るために、細菌で発現された１．５ｍｇのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合マウスＵＢＬ３タンパク質を９匹のウサギにそれぞれ４回注射した。組換えＵＢＬ３タンパク質、外因性ＵＢＬ３タンパク質及び内在性ＵＢＬ３タンパク質は、１つのウサギの血清においてのみ特異的に認識された。血清をＧＳＴカラムに３回通して非特異的抗体を除去した。得られたフロースルー（ＦＴ）を「ＵＢＬ３抗血清」と称する。ＵＢＬ３タンパク質のより特異的な抗体を得るために、ポリクローナルＵＢＬ３抗血清をＧＳＴカラムに通した。得られたＦＴを、ＵＢＬ３ ＫＯマウス由来の脳溶解物と結合したカラムにさらに通し、ＵＢＬ３以外の他のＵＢＬの認識を排除した。ＦＴをＧＳＴ－ＵＢＬ３カラムを用いてさらに精製した。このＦＴを「抗ＵＢＬ３抗体」と称する。
【0038】
実施例で用いた抗体は以下の通りである。
抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、１４Ｃ１０）、Ｆｌａｇ－Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製、Ｆ３１６５）、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１抗体（ＢＤ社製、クローン１８）、ＣＤ６３抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｔｓ６３；ＢＤ社製、Ｈ５Ｃ６）、ＥＥＡ１抗体（ＢＤ社製、６１０４５６）、Ｒａｂ１１抗体（ＢＤ社製、６１０６５６）、ＣＯＸＩＶ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、４８５０）、カルネキシン抗体（Ｅｎｚｏ社製、ＡＤＩ－ＳＰＡ－８６０）、ＧＭ１３０抗体（ＢＤ社製、６１０８２２）、ＰＭＰ７０抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製、ＰＡ１－６５０）、ラミンＢ１抗体（Ａｂｃａｍ社製、ａｂ１６０４８）、ＧＰ９６抗体（Ｅｎｚｏ社製、９Ｇ１０）、アルファアクチニン－４抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製、Ｃ２Ｃ３）、カルレティキュリン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、２８９１）、Ａｌｉｘ抗体（Ａｂｎｏｖａ社製、Ｈ０００１００１５－Ｂ０２）、ＣＤ９抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、１４－００９１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｔｓ９；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＭ２／５７）、アルファ－チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製、ＤＭ１Ａ）、ＧＦＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ａ１１１２２；Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ａ１１１２０）、ｐａｎ－Ｒａｓ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、３３３９；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＡＢＳ１９５）。
抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、１４Ｃ１０）、Ｆｌａｇ－Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社製、Ｆ３１６５）、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１抗体（ＢＤ社製、クローン１８）、ＣＤ６３抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｔｓ６３；ＢＤ社製、Ｈ５Ｃ６）、ＥＥＡ１抗体（ＢＤ社製、６１０４５６）、Ｒａｂ１１抗体（ＢＤ社製、６１０６５６）、ＣＯＸＩＶ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、４８５０）、カルネキシン抗体（Ｅｎｚｏ社製、ＡＤＩ－ＳＰＡ－８６０）、ＧＭ１３０抗体（ＢＤ社製、６１０８２２）、ＰＭＰ７０抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製、ＰＡ１－６５０）、ラミンＢ１抗体（Ａｂｃａｍ社製、ａｂ１６０４８）、ＧＰ９６抗体（Ｅｎｚｏ社製、９Ｇ１０）、アルファアクチニン－４抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製、Ｃ２Ｃ３）、カルレティキュリン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、２８９１）、Ａｌｉｘ抗体（Ａｂｎｏｖａ社製、Ｈ０００１００１５－Ｂ０２）、ＣＤ９抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製、１４－００９１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｔｓ９；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＭ２／５７）、アルファ－チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ社製、ＤＭ１Ａ）、ＧＦＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ａ１１１２２；Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ａ１１１２０）、ｐａｎ－Ｒａｓ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、３３３９；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＭＡＢＳ１９５）。
【0039】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－コンジュゲートストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１９５３４－０５０）、Ａｌｅｘａ ４８８又は５５５コンジュゲート抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製）、及びＨＲＰコンジュゲート二次抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製及びＡｂｃａｍ社製）を含む。
【0040】
分画遠心分離実験では、下記マーカーに対する抗体を使用した。
ｓＥＶマーカーに対してはＣＤ６３抗体及びＣＤ９抗体；複数のＥＶマーカーに対しては、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１抗体及びＡｌｉｘ抗体；並びに非ｓＥＶマーカーに対しては、ＧＰ９６抗体、アクチニン－４抗体、カルレティキュリン抗体及びＧＡＰＤＨ抗体。
ｓＥＶマーカーに対してはＣＤ６３抗体及びＣＤ９抗体；複数のＥＶマーカーに対しては、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１抗体及びＡｌｉｘ抗体；並びに非ｓＥＶマーカーに対しては、ＧＰ９６抗体、アクチニン－４抗体、カルレティキュリン抗体及びＧＡＰＤＨ抗体。
【0041】
（免疫沈降）
ＵＢＬ３修飾の検出のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びＨｅＬａ細胞を、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡでトランスフェクトした。２４時間又は７２時間後（図８ｆ）、細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳ中にこすり落として集め、４℃で１分間４００×ｇで遠心分離してペレット化し、１％トリトン緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ－１００）で４℃２０分間溶解した。粗核及び未破砕細胞を、５分間２０，０００×ｇの遠心分離によって除外した。氷冷ＰＢＳ中で洗浄した後、低張緩衝液を用いた実験では、細胞を低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．２］、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ）中に再懸濁し、ダウンスホモジナイザーで破砕した。
ＵＢＬ３修飾の検出のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びＨｅＬａ細胞を、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡでトランスフェクトした。２４時間又は７２時間後（図８ｆ）、細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳ中にこすり落として集め、４℃で１分間４００×ｇで遠心分離してペレット化し、１％トリトン緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ－１００）で４℃２０分間溶解した。粗核及び未破砕細胞を、５分間２０，０００×ｇの遠心分離によって除外した。氷冷ＰＢＳ中で洗浄した後、低張緩衝液を用いた実験では、細胞を低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．２］、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ）中に再懸濁し、ダウンスホモジナイザーで破砕した。
【0042】
粗核及び未破砕細胞を、４℃５分間８００×ｇの遠心分離によって除外した。プレクリーニングのために、細胞溶解物を２０μＬのプロテインＧ－セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）とともに４℃で１時間、回転させながらインキュベートした。得られた上清を回転させながらタンパク質Ｇ－セファロースビーズの１５μＬ中の抗Ｆｌａｇ抗体２μｇと４℃１０時間インキュベートするか、又はプレクリーニングなしで２０μＬのＧＦＰ－トラップ（Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ社製）と４℃１時間インキュベートした。ビーズを氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で４回洗浄した後、５０μｌの２×試料緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ［ｐＨ６．８］、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール及び０．０１％ブロモフェノールブルー、２－メルカプトエタノールを含まない）をビーズに加え、ビーズを３分間煮沸した（β－ＭＥ－）。試料の一部を２－メルカプトエタノールで処理し、３分間煮沸した（β－ＭＥ＋）。これらの試料をＵＢＬ３抗血清（１：１００希釈）でブロットした。内在性ＵＢＬ３修飾の検出のために、凍結組織５０ｍｇを粉砕し（ＢＭＳ社製、ＳｈａｋｅＭａｎ２）、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ノニデットＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム塩、０．１％ＳＤＳ）でホモジナイズした。
【0043】
プレクリーニングのために、細胞溶解物を４０μＬのプロテインＧ－セファロースビーズとともに４℃で１時間、回転させながらインキュベートした。得られた上清をプロテインＧ－セファロースビーズ２０μＬ中の抗ＵＢＬ３抗体（１：１０００希釈）と共に回転させながら４℃１０時間インキュベートした。
【0044】
抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体を用いたｓＥＶの免疫単離の方法は、Ｋｏｗａｌ Ｊらに記載された通りに行った（Ｋｏｗａｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．）。プロテインＡ磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、８８８４５）を使用した。
【0045】
ｓＥＶ内のＵＢＬ３の検出のために、ｓＥＶをビオチン標識タグ付きＵＢＬ３トランスフェクトＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の培地から精製し、ＰＢＳ又はＳＤＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＮＰ－４０，２％ＳＤＳ）で洗浄し、ストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、２９２０２）で処理した。ストレプトアビジン－ＨＲＰ又は抗ＣＤ６３抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、プルダウン（ＰＤ）画分及びフロースルー（ＦＴ）画分を分析した。
【0046】
（組織ホモジナイゼーション及びウェスタンブロット分析）
組織ホモジナイゼーション及びウェスタンブロット分析は、従来の方法を用いて実施した（Ｙａｏ，Ｉ．ｅｔ ａｌ． ＳＣＲＡＰＰＥＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １３０，９４３－９５７（２００７）．、Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．＆Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２（２０１０）．、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｍ．＆ Ｔｓｕｃｈｉｄａ， Ｋ． Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－４８６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４７，９３－１０３（２０１４）．）。
組織ホモジナイゼーション及びウェスタンブロット分析は、従来の方法を用いて実施した（Ｙａｏ，Ｉ．ｅｔ ａｌ． ＳＣＲＡＰＰＥＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １３０，９４３－９５７（２００７）．、Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．＆Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２（２０１０）．、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｍ．＆ Ｔｓｕｃｈｉｄａ， Ｋ． Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－４８６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４７，９３－１０３（２０１４）．）。
【0047】
（膜タンパク質及び細胞質タンパク質画分の単離）
膜タンパク質及び細胞質タンパク質画分の単離は、製造者のプロトコール（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製、ＰｒｏｔｅｏＪＥＴ；Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ｍｅｍ－ＰＥＲ Ｐｌｕｓキット）に従って行った。ＲＮＡ精製、逆転写反応、リアルタイムｑＰＣＲ分析は従来の方法で行った（Ｙａｏ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．ＳＣＲＡＰＰＥＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １３０，９４３－９５７（２００７）．、Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．＆ Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２（２０１０）．、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｍ． ＆ Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－４８６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４７，９３－１０３（２０１４）．）。
膜タンパク質及び細胞質タンパク質画分の単離は、製造者のプロトコール（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社製、ＰｒｏｔｅｏＪＥＴ；Ｔｈｅｒｍｏ社製、Ｍｅｍ－ＰＥＲ Ｐｌｕｓキット）に従って行った。ＲＮＡ精製、逆転写反応、リアルタイムｑＰＣＲ分析は従来の方法で行った（Ｙａｏ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．ＳＣＲＡＰＰＥＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １３０，９４３－９５７（２００７）．、Ｕｅｚｕｍｉ，Ａ．，Ｆｕｋａｄａ，Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｎ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．＆ Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｔ ｃｅｌｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２，１４３－１５２（２０１０）．、Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｋ．，Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｍ． ＆ Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｋ． Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ－４８６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４７，９３－１０３（２０１４）．）。
【0048】
（統計解析）
Ｐｒｉｓｍ ６．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ及びＰＥＲＳＥＵＳ（バージョン１．５．４．１）を用いて統計解析を行った。 Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定またはＷｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定及びＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの多重比較検定を、プロテオミクス分析を除く２群と３群以上の比較にそれぞれ適用した。実験ごとに２つ以上の独立したサンプルを使用した。横棒は各群の中央値を示す。
Ｐｒｉｓｍ ６．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ及びＰＥＲＳＥＵＳ（バージョン１．５．４．１）を用いて統計解析を行った。 Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定またはＷｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位検定及びＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの多重比較検定を、プロテオミクス分析を除く２群と３群以上の比較にそれぞれ適用した。実験ごとに２つ以上の独立したサンプルを使用した。横棒は各群の中央値を示す。
【0049】
≪新規翻訳後修飾因子ＵＢＬ３の抽出≫
バイオインフォマティクス法を用いて新規の翻訳後修飾因子を同定した（Ｙａｏ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．ＳＣＲＡＰＰＥＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １３０，９４３－９５７（２００７）．）。
バイオインフォマティクス法を用いて新規の翻訳後修飾因子を同定した（Ｙａｏ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．ＳＣＲＡＰＰＥＲ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｚｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＩＭ１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｅｌｌ １３０，９４３－９５７（２００７）．）。
【0050】
図１は様々な種からのユビキチン様（ＵＢＬ）ドメイン含有タンパク質の系統樹分析結果を示す図である。
ヒト、マウス、ハエ、ワーム、及び酵母の全てのＵＢＬアミノ酸配列をＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて分析し、クラスターに分類して系統樹を作成した。樹中の任意の２つの末端分類群間の平均距離は以下のように計算した。
平均距離＝２×（全枝の合計）／（ＵＢＬドメインの数－１）
＝２×（４１．４４）／（１８１－１）＝０．４６
ヒト、マウス、ハエ、ワーム、及び酵母の全てのＵＢＬアミノ酸配列をＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて分析し、クラスターに分類して系統樹を作成した。樹中の任意の２つの末端分類群間の平均距離は以下のように計算した。
平均距離＝２×（全枝の合計）／（ＵＢＬドメインの数－１）
＝２×（４１．４４）／（１８１－１）＝０．４６
【0051】
上記計算に基づいて、ＵＢＬドメイン含有タンパク質を以下のようにサブファミリーに分類した。
まず、内部節の分岐長を含む各ＵＢＬドメイン間の距離を調査した。上記距離が０．４６未満であれば、同じグループに２つのドメインを含め、上記グループをＵＢＬドメインのサブファミリーとして定義した。次に、ワーム、ハエ、又は酵母のいずれかと、ヒト、マウスとの間で高度に保存されたＵＢＬドメインのサブファミリーを定義した。
図中のボックスは、上記高度に保存されたＵＢＬドメインのサブファミリー、すなわちユビキチン、Ｎｅｄｄ８、ユビキチン様５（ＵＢＬ５）、ユビキチン、ユビキチン様３（ＵＢＬ３）、ＳＵＭＯ－１、ＳＵＭＯ－２／３、ユビキチン特異的プロテアーゼ１４（ＵＳＰ１４）、ＭＧＣ１００６７、及びＥｌｏｎｇｉｎ－Ｂを示す。
まず、内部節の分岐長を含む各ＵＢＬドメイン間の距離を調査した。上記距離が０．４６未満であれば、同じグループに２つのドメインを含め、上記グループをＵＢＬドメインのサブファミリーとして定義した。次に、ワーム、ハエ、又は酵母のいずれかと、ヒト、マウスとの間で高度に保存されたＵＢＬドメインのサブファミリーを定義した。
図中のボックスは、上記高度に保存されたＵＢＬドメインのサブファミリー、すなわちユビキチン、Ｎｅｄｄ８、ユビキチン様５（ＵＢＬ５）、ユビキチン、ユビキチン様３（ＵＢＬ３）、ＳＵＭＯ－１、ＳＵＭＯ－２／３、ユビキチン特異的プロテアーゼ１４（ＵＳＰ１４）、ＭＧＣ１００６７、及びＥｌｏｎｇｉｎ－Ｂを示す。
【0052】
ユビキチン、ＳＵＭＯ及びＮｅｄｄ８のカルボキシル末端のグリシン残基は、一般に標的タンパク質のリジン残基に共有結合していることが知られている（Ｗｅｌｃｈｍａｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｃ．＆Ｍａｙｅｒ，Ｒ．Ｊ． Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ａｎｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｇｎａｌｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６，５９９－６０９（２００５）．、Ｆｌｏｔｈｏ，Ａ．＆Ｍｅｌｃｈｉｏｒ，Ｆ．Ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ： ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ８２，３５７－３８５（２０１３）．、Ｗａｔｓｏｎ，Ｉ．Ｒ．，Ｉｒｗｉｎ，Ｍ．Ｓ．＆ Ｏｈｈ，Ｍ．ＮＥＤＤ８ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ， Ｓｉｎｅ Ｑｕｉｂｕｓ Ｎｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ １９，１６８－１７６（２０１１）．）。
【0053】
これに対し、以下説明するように、図１中のＵＢＬ３が、そのカルボキシル末端のシステイン残基を介したジスルフィド結合によって標的タンパク質を修飾することを見出し、ＵＢＬ３はユビキチン様ドメインを有するものの、ＵＢＬ３修飾は、従来のユビキチン及びユビキチン様修飾とは全く異なるメカニズムであることを以下説明するように見出した。
【0054】
≪新規翻訳後修飾因子ＵＢＬ３の分析≫
翻訳後修飾因子としてのＵＢＬ３の役割を明らかにするために、乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１にＦｌａｇ－ＵＢＬ３を発現させ、免疫沈降（ＩＰ）後ＵＢＬ３抗血清によるウェスタンブロッティングすることによりＵＢＬ３タンパク質を精製した。
図２ａは、ＵＢＬ３依存性翻訳後修飾が、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３でトランスフェクトされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞からの抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降（ＩＰ）、及びＵＢＬ３抗血清によるウェスタンブロッティングによって検出されたこと（右パネル）を示す図である（２０μｇ／レーン）。
Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３の推定分子量は１６ｋＤａである。興味深いことに、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３発現細胞において、ＵＢＬ３シグナルは非還元条件下でのみ高分子量までのスメアバンドとして観察された。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにロードする前に、２－メルカプトエタノール（β－ＭＥ＋）をサンプルに添加した後、スメアシグナルは消失した（図２ａ、右パネル）。
翻訳後修飾因子としてのＵＢＬ３の役割を明らかにするために、乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１にＦｌａｇ－ＵＢＬ３を発現させ、免疫沈降（ＩＰ）後ＵＢＬ３抗血清によるウェスタンブロッティングすることによりＵＢＬ３タンパク質を精製した。
図２ａは、ＵＢＬ３依存性翻訳後修飾が、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３でトランスフェクトされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞からの抗Ｆｌａｇ抗体による免疫沈降（ＩＰ）、及びＵＢＬ３抗血清によるウェスタンブロッティングによって検出されたこと（右パネル）を示す図である（２０μｇ／レーン）。
Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３の推定分子量は１６ｋＤａである。興味深いことに、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３発現細胞において、ＵＢＬ３シグナルは非還元条件下でのみ高分子量までのスメアバンドとして観察された。ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにロードする前に、２－メルカプトエタノール（β－ＭＥ＋）をサンプルに添加した後、スメアシグナルは消失した（図２ａ、右パネル）。
【0055】
＜ＵＢＬ３ノックアウトマウスを用いたインビボにおけるＵＢＬ３修飾の確認＞
インビボにおいてＵＢＬ３修飾が起こることを確認するために、まず、ＵＢＬ３ノックアウト（ＫＯ）マウスを樹立した。
インビボにおいてＵＢＬ３修飾が起こることを確認するために、まず、ＵＢＬ３ノックアウト（ＫＯ）マウスを樹立した。
【0056】
（Ｕｂｌ３－／－ノックアウト（ＫＯ）マウスの樹立）
標的戦略は、図３ａに示した。
図３は、ＵＢＬ３ ＫＯマウスの作製を示す図である。
図３ａは、開始コドンを含むＵＢＬ３遺伝子のエキソン２を除去するためのターゲッティングベクターの概略構造を示す図である。
図３ａ中、矢印Ｎｅｏはネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）遺伝子を示す。
矢印ＤＴ－Ａはジフテリア毒素Ａ（ＤＴ－Ａ）遺伝子を示す。
その他の矢印は遺伝子型解析のためのＰＣＲプライマーの位置を示す。
ＢＳはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを示す。
ＫｐｎＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたゲノムＤＮＡのサザンブロッティング分析によって標的クローンを確認した。標的構築物の５’位の外側のＫｐｎＩ部位の下流の７５０ｂｐ断片を用いた５’プローブでプローブした。ＮｃｏＩで消化したゲノムＤＮＡについては、３’末端のＮｄｅＩ部位及びＮｃｏＩ部位との間の８００ｂｐ断片を用いた３’プローブを用いてプローブした。
詳細には、標的構築物をＳｐｅＩ消化により線状化した。ＳｐｅＩ線状化ターゲティングベクターを用いてＣＣＥ（１２９／Ｓｖ／Ｅｖ）（Ｅ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士からの贈与）胚性幹（ＥＳ）細胞を電気穿孔し、Ｇ４１８で選択した。ヘテロ接合性ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ株マウスの胚盤胞に注入して、生殖系列キメラを作製した。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで１０世代戻し交配した。遺伝子型はサザンブロッティングまたは以下の３つのプライマーを用いたＰＣＲによって決定した。
ＵＢＬ３－ＫＯ－３’：５’－ＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＣＡＴＣＧＧＴＡＧＡ－３’（配列番号５）
ＵＢＬ３－ＫＯ－５’：５’－ＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＣ－３’（配列番号６）
ＵＢＬ３－ＫＯ－Ｎｅｏ：５’－ＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＧＣＴＣＧＧＴＧＴＴ－３’（配列番号７）
動物のケア及び治療に関連するすべての手順は、施設及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈガイドラインに準拠しており、藤田保健衛生大学の動物管理及び使用委員会によって承認された。
標的戦略は、図３ａに示した。
図３は、ＵＢＬ３ ＫＯマウスの作製を示す図である。
図３ａは、開始コドンを含むＵＢＬ３遺伝子のエキソン２を除去するためのターゲッティングベクターの概略構造を示す図である。
図３ａ中、矢印Ｎｅｏはネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）遺伝子を示す。
矢印ＤＴ－Ａはジフテリア毒素Ａ（ＤＴ－Ａ）遺伝子を示す。
その他の矢印は遺伝子型解析のためのＰＣＲプライマーの位置を示す。
ＢＳはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを示す。
ＫｐｎＩ－ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたゲノムＤＮＡのサザンブロッティング分析によって標的クローンを確認した。標的構築物の５’位の外側のＫｐｎＩ部位の下流の７５０ｂｐ断片を用いた５’プローブでプローブした。ＮｃｏＩで消化したゲノムＤＮＡについては、３’末端のＮｄｅＩ部位及びＮｃｏＩ部位との間の８００ｂｐ断片を用いた３’プローブを用いてプローブした。
詳細には、標的構築物をＳｐｅＩ消化により線状化した。ＳｐｅＩ線状化ターゲティングベクターを用いてＣＣＥ（１２９／Ｓｖ／Ｅｖ）（Ｅ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士からの贈与）胚性幹（ＥＳ）細胞を電気穿孔し、Ｇ４１８で選択した。ヘテロ接合性ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ株マウスの胚盤胞に注入して、生殖系列キメラを作製した。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで１０世代戻し交配した。遺伝子型はサザンブロッティングまたは以下の３つのプライマーを用いたＰＣＲによって決定した。
ＵＢＬ３－ＫＯ－３’：５’－ＡＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＴＧＣＡＴＣＧＧＴＡＧＡ－３’（配列番号５）
ＵＢＬ３－ＫＯ－５’：５’－ＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＡＣ－３’（配列番号６）
ＵＢＬ３－ＫＯ－Ｎｅｏ：５’－ＧＣＴＧＣＡＧＧＧＴＣＧＣＴＣＧＧＴＧＴＴ－３’（配列番号７）
動物のケア及び治療に関連するすべての手順は、施設及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈガイドラインに準拠しており、藤田保健衛生大学の動物管理及び使用委員会によって承認された。
【0057】
（結果）
図３ｂは、ＵＢＬ３ ＫＯマウスの遺伝子型分析結果を示す図である。
図３ｄは、内在性ＵＢＬ３タンパク質の組織分布を、ＵＢＬ３抗血清を用いたウェスタンブロッティング分析によって調査した結果を示す図である（５０μｇ／レーン）。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
ウェスタンブロット分析後、ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色した。
図３ｄ中、Ｈｔ：心臓、Ｌｇ：肺、Ｌｖ：肝臓、Ｓｐ：脾臓、Ｐｃ：膵臓、Ｓｉ：小腸、Ｃｌ：結腸、Ｋｉ：腎臓、Ｍｓ：骨格筋、Ｔｅ：精巣、Ｃｘ：大脳皮質、Ｃｂ：小脳、Ｈｐ：海馬を示す。
図３ｂは、ＵＢＬ３ ＫＯマウスの遺伝子型分析結果を示す図である。
図３ｄは、内在性ＵＢＬ３タンパク質の組織分布を、ＵＢＬ３抗血清を用いたウェスタンブロッティング分析によって調査した結果を示す図である（５０μｇ／レーン）。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。
ウェスタンブロット分析後、ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色した。
図３ｄ中、Ｈｔ：心臓、Ｌｇ：肺、Ｌｖ：肝臓、Ｓｐ：脾臓、Ｐｃ：膵臓、Ｓｉ：小腸、Ｃｌ：結腸、Ｋｉ：腎臓、Ｍｓ：骨格筋、Ｔｅ：精巣、Ｃｘ：大脳皮質、Ｃｂ：小脳、Ｈｐ：海馬を示す。
【0058】
図３ｄに示した結果から明らかなように、Ｃｘ（大脳皮質）、Ｃｂ（小脳）、Ｈｐ（海馬）等の脳内のＵＢＬ３の発現が比較的高いことが分かる。
図３ｃは、Ｕｂｌ３＋／＋（野生型；ＷＴ）マウス及びＵｂｌ３－／－（ノックアウト；ＫＯ）マウス由来脳におけるＵＢＬ３の抗ＵＢＬ３抗体を用いたウェスタンブロット結果を示す図である（２０μｇ／レーン）。
上記結果に基づき、以下、大脳皮質溶解物中のＵＢＬ３依存性翻訳後修飾について分析した。
図３ｃは、Ｕｂｌ３＋／＋（野生型；ＷＴ）マウス及びＵｂｌ３－／－（ノックアウト；ＫＯ）マウス由来脳におけるＵＢＬ３の抗ＵＢＬ３抗体を用いたウェスタンブロット結果を示す図である（２０μｇ／レーン）。
上記結果に基づき、以下、大脳皮質溶解物中のＵＢＬ３依存性翻訳後修飾について分析した。
【0059】
図２ｂは、野生型（ＷＴ）及びＵＢＬ３ ＫＯマウスの大脳皮質溶解物を抗ＵＢＬ３抗体で免疫沈降（ＩＰ）した図である（２０μｇ／レーン）。
図２ｂに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３ ＫＯマウスにおいて翻訳後修飾の程度が減少することがわかる。
図２ｂに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３ ＫＯマウスにおいて翻訳後修飾の程度が減少することがわかる。
【0060】
＜ＵＢＬ３変異体を用いたＵＢＬ３修飾その１＞
次に、ＵＢＬ３変異体を用いてＵＢＬ３修飾を検証した。
上述のように、ＵＢＬ３修飾は非還元的条件に依存していることから、ＵＢＬ３における全システイン残基に着目した。
ＵＢＬ３は、そのカルボキシル末端に２つのシステイン残基しか有さない（Ｃ１１３及びＣ１１４）。
そこで、図２ｃに示した３種のＵＢＬ３変異体（Ｃ１１３Ａ、Ｃ１１４Ａ、及びＣ１１３／１１４Ａ）を構築し、これらを野生型ＵＢＬ３と共に調査した。
図２ｃは、図２ｄ及びｅにおけるレーン１～５におけるＦｌａｇタグ付き野生型又はＵＢＬ３変異体の概略構造を示す図である（２０μｇ／レーン）。
次に、ＵＢＬ３変異体を用いてＵＢＬ３修飾を検証した。
上述のように、ＵＢＬ３修飾は非還元的条件に依存していることから、ＵＢＬ３における全システイン残基に着目した。
ＵＢＬ３は、そのカルボキシル末端に２つのシステイン残基しか有さない（Ｃ１１３及びＣ１１４）。
そこで、図２ｃに示した３種のＵＢＬ３変異体（Ｃ１１３Ａ、Ｃ１１４Ａ、及びＣ１１３／１１４Ａ）を構築し、これらを野生型ＵＢＬ３と共に調査した。
図２ｃは、図２ｄ及びｅにおけるレーン１～５におけるＦｌａｇタグ付き野生型又はＵＢＬ３変異体の概略構造を示す図である（２０μｇ／レーン）。
【0061】
図２ｄは、図２ｃにおけるＦｌａｇタグ付き野生型又はＵＢＬ３変異体を含む細胞におけるＵＢＬ３修飾の検出を示す図である（２０μｇ／レーン）。なお、ＩＰ産物はロード前に２－メルカプトエタノール（βＭＥ－）なしで煮沸し、試料の一部を２－メルカプトエタノール（βＭＥ＋）で処理した。
図４ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるＵＢＬ３修飾の解析結果を示す図であり、ＩＰ産物は、ロード前に２－メルカプトエタノール（βＭＥ－）なしで煮沸した（１０μｇ／レーン）。
図２ｄにおけるレーン５及び図４ａに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ変異体では、ＵＢＬ３修飾はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞だけでなく、試験された各細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞）においても完全に消失していることがわかる。
一方、図２ｄにおけるレーン３及び４及び後述する図４ａに示した結果から明らかなように、いくつかの細胞においてＵＢＬ３Ｃ１１３Ａ変異体及びＵＢＬ３Ｃ１１４Ａ変異体において、ＵＢＬ３修飾は減少しているものの、ＵＢＬ３修飾は依然として存在していることがわかる。
図４ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるＵＢＬ３修飾の解析結果を示す図であり、ＩＰ産物は、ロード前に２－メルカプトエタノール（βＭＥ－）なしで煮沸した（１０μｇ／レーン）。
図２ｄにおけるレーン５及び図４ａに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ変異体では、ＵＢＬ３修飾はＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞だけでなく、試験された各細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞）においても完全に消失していることがわかる。
一方、図２ｄにおけるレーン３及び４及び後述する図４ａに示した結果から明らかなように、いくつかの細胞においてＵＢＬ３Ｃ１１３Ａ変異体及びＵＢＬ３Ｃ１１４Ａ変異体において、ＵＢＬ３修飾は減少しているものの、ＵＢＬ３修飾は依然として存在していることがわかる。
【0062】
＜ＵＢＬ３変異体を用いたＵＢＬ３修飾その２＞
カルボキシル末端のＣＡＡＸモチーフ（Ｃ：システイン、Ａ：脂肪族アミノ酸、Ｘ：任意のアミノ酸）は、膜局在性タンパク質によく見られることが知られている（Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｌ．＆Ｃａｓｅｙ，Ｐ．Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６５，２４１－２６９（１９９６）．）。
図２ｃに示したように、ＵＢＬ３もまた、そのカルボキシル末端にＣＡＡＸモチーフを有し、Ｃ１１４を介して膜に固定するためにプレニル化されることが示されている（非特許文献７）。
図２ｅは、図２ｃに示したＦｌａｇ－ＵＢＬ３野生型又は変異体でトランスフェクトされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＵＢＬ３の細胞内局在化を示す図である（２０μｇ／レーン）。
図４ｂは、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３野生型及び変異体でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるＵＢＬ３の細胞内局在化を示す図である（１０μｇ／レーン）。
カルボキシル末端のＣＡＡＸモチーフ（Ｃ：システイン、Ａ：脂肪族アミノ酸、Ｘ：任意のアミノ酸）は、膜局在性タンパク質によく見られることが知られている（Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｌ．＆Ｃａｓｅｙ，Ｐ．Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６５，２４１－２６９（１９９６）．）。
図２ｃに示したように、ＵＢＬ３もまた、そのカルボキシル末端にＣＡＡＸモチーフを有し、Ｃ１１４を介して膜に固定するためにプレニル化されることが示されている（非特許文献７）。
図２ｅは、図２ｃに示したＦｌａｇ－ＵＢＬ３野生型又は変異体でトランスフェクトされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＵＢＬ３の細胞内局在化を示す図である（２０μｇ／レーン）。
図４ｂは、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３野生型及び変異体でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞におけるＵＢＬ３の細胞内局在化を示す図である（１０μｇ／レーン）。
【0063】
【0064】
＜ＵＢＬ３変異体を用いたＵＢＬ３修飾その３＞
膜画分中のＵＢＬ３の存在とＵＢＬ３修飾との関係を調査するために、上述のように、翻訳後修飾活性が喪失したにもかかわらず、膜画分に依然として存在しているＵＢＬ３変異体を同定することを試みた。
図２ｆは、図２ｇ及びｈにおけるレーン１、２及び６～８におけるＦｌａｇタグ付き野生型又はＵＢＬ３変異体の概略構造を示す図である（２０μｇ／レーン）。
図２ｇは、図２ｆにおけるＦｌａｇタグ付き野生型又はＵＢＬ３変異体を含む細胞におけるＵＢＬ３修飾の検出を示す図である（２０μｇ／レーン）。ＩＰ産物は２－メルカプトエタノール（βＭＥ－）なしで煮沸し、試料の一部を２－メルカプトエタノール（βＭＥ＋）で処理した。
図２ｈは、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３野生型又は変異体でトランスフェクトされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＵＢＬ３の細胞内局在化を示す図である（２０μｇ／レーン）。
図２ｆ、ｇ及び図４ａに示した結果から明らかなように、興味深いことに、たった１つのカルボキシル末端アミノ酸を欠くＵＢＬ３Δ１は、ＵＢＬ３修飾能を喪失していることが分かる。
しかし、図２ｈ及び図４ｂに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３Δ１は膜画分に保持される一方、ＵＢＬ３Δ２及びＵＢＬ３Δ３は膜画分に保持されないことがわかる。
これらの結果は、ＵＢＬ３修飾が膜画分中に存在するために必要でないことを示している。
膜画分中のＵＢＬ３の存在とＵＢＬ３修飾との関係を調査するために、上述のように、翻訳後修飾活性が喪失したにもかかわらず、膜画分に依然として存在しているＵＢＬ３変異体を同定することを試みた。
図２ｆは、図２ｇ及びｈにおけるレーン１、２及び６～８におけるＦｌａｇタグ付き野生型又はＵＢＬ３変異体の概略構造を示す図である（２０μｇ／レーン）。
図２ｇは、図２ｆにおけるＦｌａｇタグ付き野生型又はＵＢＬ３変異体を含む細胞におけるＵＢＬ３修飾の検出を示す図である（２０μｇ／レーン）。ＩＰ産物は２－メルカプトエタノール（βＭＥ－）なしで煮沸し、試料の一部を２－メルカプトエタノール（βＭＥ＋）で処理した。
図２ｈは、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３野生型又は変異体でトランスフェクトされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＵＢＬ３の細胞内局在化を示す図である（２０μｇ／レーン）。
図２ｆ、ｇ及び図４ａに示した結果から明らかなように、興味深いことに、たった１つのカルボキシル末端アミノ酸を欠くＵＢＬ３Δ１は、ＵＢＬ３修飾能を喪失していることが分かる。
しかし、図２ｈ及び図４ｂに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３Δ１は膜画分に保持される一方、ＵＢＬ３Δ２及びＵＢＬ３Δ３は膜画分に保持されないことがわかる。
これらの結果は、ＵＢＬ３修飾が膜画分中に存在するために必要でないことを示している。
【0065】
≪ＵＢＬ３細胞内局在化の免疫細胞化学的観察≫
まず、モック（Ｍｏｃｋ）ベクター、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ベクター、又はＦｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４ＡベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１％トリトン又はＨｙｐｏｔｏｎｉｃ（Ｈｙｐｏ）緩衝液で溶解し、細胞質におけるＵＢＬ３修飾の解析を行なった。
図５ａは、ＵＢＬ３による翻訳後修飾産物が細胞内の細胞質において減少することを示す図である。
図５ａに示した結果から明らかなように、細胞質分画においては、ＵＢＬ３修飾が減少することが分かる。
まず、モック（Ｍｏｃｋ）ベクター、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ベクター、又はＦｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４ＡベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１％トリトン又はＨｙｐｏｔｏｎｉｃ（Ｈｙｐｏ）緩衝液で溶解し、細胞質におけるＵＢＬ３修飾の解析を行なった。
図５ａは、ＵＢＬ３による翻訳後修飾産物が細胞内の細胞質において減少することを示す図である。
図５ａに示した結果から明らかなように、細胞質分画においては、ＵＢＬ３修飾が減少することが分かる。
【0066】
（免疫細胞化学）
次に、ＵＢＬ３の細胞内局在化を免疫細胞化学的に観察した。
リポフェクトアミン２０００を用いてＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＧＦＰ－ＵＢＬ３（野生型又は変異体）及びｉＲＦＰ６７０（形態学的マーカー）でコトランスフェクトした。２４時間後、細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで１５分間固定した。０．１Ｍグリシン／ＰＢＳでクエンチし；０．２％ＢＳＡ、２％ヤギ血清、及び０．０５％サポニン／ＰＢＳで１時間浸透化／ブロックし；一次抗体と４℃で１８時間インキュベートし、二次抗体を１時間インキュベートした。Ａｑｕａ－Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でマウントした。リソソームを５０μＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）で３７℃で１時間標識した。共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ－７８０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）上で、６３×対物レンズ（ＮＡ１．４）で共焦点画像を取得した。いくつかの０．５μｍ間隔の断面から投影された代表的な画像が示され、それぞれは挿入図に単一の共焦点画像を有する。蛍光強度及び細胞形態をフィジー（Ｉｍａｇｅ Ｊ）で測定した。
ＵＢＬ３のパーセンテージは以下のように算出した。
（％）＝（共焦点部分の各小器官領域におけるＧＦＰ－ＵＢＬ３シグナルの合計）／（各共焦点部分の全細胞領域におけるＧＦＰ－ＵＢＬ３シグナルの総和）×１００
次に、ＵＢＬ３の細胞内局在化を免疫細胞化学的に観察した。
リポフェクトアミン２０００を用いてＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＧＦＰ－ＵＢＬ３（野生型又は変異体）及びｉＲＦＰ６７０（形態学的マーカー）でコトランスフェクトした。２４時間後、細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで１５分間固定した。０．１Ｍグリシン／ＰＢＳでクエンチし；０．２％ＢＳＡ、２％ヤギ血清、及び０．０５％サポニン／ＰＢＳで１時間浸透化／ブロックし；一次抗体と４℃で１８時間インキュベートし、二次抗体を１時間インキュベートした。Ａｑｕａ－Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でマウントした。リソソームを５０μＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）で３７℃で１時間標識した。共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ－７８０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）上で、６３×対物レンズ（ＮＡ１．４）で共焦点画像を取得した。いくつかの０．５μｍ間隔の断面から投影された代表的な画像が示され、それぞれは挿入図に単一の共焦点画像を有する。蛍光強度及び細胞形態をフィジー（Ｉｍａｇｅ Ｊ）で測定した。
ＵＢＬ３のパーセンテージは以下のように算出した。
（％）＝（共焦点部分の各小器官領域におけるＧＦＰ－ＵＢＬ３シグナルの合計）／（各共焦点部分の全細胞領域におけるＧＦＰ－ＵＢＬ３シグナルの総和）×１００
【0067】
（結果）
図６は、ＭＶＢへのＵＢＬ３の局在化がＵＢＬ３修飾に依存することを示す図であり、図６ａは、改良型ＧＦＰ（以下単に「ＥＧＦＰ」ともいう。）－ＵＢＬ３でトランスフェクトされ、ＭＶＢマーカー（ＣＤ６３）、初期エンドソームマーカー（ＥＥＡ１）、リソソームマーカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）又はリサイクルエンドソームマーカー（Ｒａｂ１１）で共染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的な投影画像を示す図である。図中、点線のボックス内の領域を、インセット内に単一の共焦点画像として示した。
図６ｂは、図６ａにおけるＥＧＦＰ－ＵＢＬ３蛍光強度の定量解析結果を示す図である。図６ｂ中、ｎ数＝１０×４であり、＊は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの多重比較検定によるｐ＜０．０５であり、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
図６は、ＭＶＢへのＵＢＬ３の局在化がＵＢＬ３修飾に依存することを示す図であり、図６ａは、改良型ＧＦＰ（以下単に「ＥＧＦＰ」ともいう。）－ＵＢＬ３でトランスフェクトされ、ＭＶＢマーカー（ＣＤ６３）、初期エンドソームマーカー（ＥＥＡ１）、リソソームマーカー（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）又はリサイクルエンドソームマーカー（Ｒａｂ１１）で共染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的な投影画像を示す図である。図中、点線のボックス内の領域を、インセット内に単一の共焦点画像として示した。
図６ｂは、図６ａにおけるＥＧＦＰ－ＵＢＬ３蛍光強度の定量解析結果を示す図である。図６ｂ中、ｎ数＝１０×４であり、＊は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの多重比較検定によるｐ＜０．０５であり、＊＊＊はｐ＜０．００１である。
【0068】
図６ａ及びｂに示した結果から明らかなように、ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３の導入後、種々のオルガネラとの共局在化を調査した。総ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３シグナルの４０％超が、ＭＶＢマーカーである内在性ＣＤ６３と共局在し、ＵＢＬ３がＭＶＢにリッチであることが分かる。
【0069】
また、図５ｂは、ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３でトランスフェクトされ、ミトコンドリアマーカー（ＣＯＸＩＶ）、小胞体マーカー（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）、ゴルジ体マーカー（ＧＭ１３０）、ペルオキシソームマーカー（ＰＭＰ７０）、又は核膜マーカー（ラミンＢ１）で共染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的画像を示す図である。合成（Ｍｅｒｇｅ）された画像の数値は、合計ＵＢＬ３の％として表示している（ｎ数＝５×５）。
【0070】
図５ｂ及び図６ａに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３はエンドソームマーカー（Ｒａｂ１１）、ミトコンドリアマーカー（ＣＯＸＩＶ）、小胞体マーカー（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）、ゴルジ体マーカー（ＧＭ１３０）、ペルオキシソームマーカー（ＰＭＰ７０）、及び核膜リサイクリングマーカー（ＬａｍｉｎＢ１）との共局在を示していないことが分かる。
一方、初期エンドソームマーカー（ＥＥＡ１）及びリソソームマーカーとの共局在が検出されたことが分かるが、図６ａ及びｂに示した結果から明らかなように、ＭＶＢマーカーとの共局在の程度と比較して弱いことが分かる。
一方、初期エンドソームマーカー（ＥＥＡ１）及びリソソームマーカーとの共局在が検出されたことが分かるが、図６ａ及びｂに示した結果から明らかなように、ＭＶＢマーカーとの共局在の程度と比較して弱いことが分かる。
【0071】
次に、ＭＶＢにおけるＵＢＬ３修飾と局在化との関係を解明するために、ＵＢＬ３Ｃ１１３Ａ、ＵＢＬ３Ｃ１１４Ａ、ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ及びＵＢＬ３Δ１と、内在性ＣＤ６３との共局在を観察した。
図６ｃは、ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３野生型又は変異体でトランスフェクトし、ＣＤ６３値で共染色したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的画像を示し、全ＵＢＬ３の％として示す（ｎ数＝５×５）。
図６ｃに示した結果から明らかなように、野生型ＵＢＬ３はＣＤ６３との共局在を示し、それとは異なり、各変異体はＣＤ６３との共局在を示していないことが分かる（中央値：ＵＢＬ３，ＵＢＬ３Ｃ１１３Ａ，ＵＢＬ３Ｃ１１４Ａ，ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ，ＵＢＬ３Δ１は、それぞれ、４１．５％，３．０％，２．７％，１．９％，２．３％）。
図６ｃは、ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３野生型又は変異体でトランスフェクトし、ＣＤ６３値で共染色したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的画像を示し、全ＵＢＬ３の％として示す（ｎ数＝５×５）。
図６ｃに示した結果から明らかなように、野生型ＵＢＬ３はＣＤ６３との共局在を示し、それとは異なり、各変異体はＣＤ６３との共局在を示していないことが分かる（中央値：ＵＢＬ３，ＵＢＬ３Ｃ１１３Ａ，ＵＢＬ３Ｃ１１４Ａ，ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ，ＵＢＬ３Δ１は、それぞれ、４１．５％，３．０％，２．７％，１．９％，２．３％）。
【0072】
（免疫電子顕微鏡分析）
ＭＶＢ及び原形質膜におけるＵＢＬ３の局在を明らかにするために、免疫電子顕微鏡分析を行った。
３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３（野生型又はＵＢＬ３Δ１）でトランスフェクションしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞又は偽トランスフェクションＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで４℃３０分間固定し、続いて４％ＰＦＡ及び０．１％グルタルアルデヒド（ＧＡ）／ＰＢＳ中で４℃３０分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１％四酸化オスミウム／ＰＢＳで３０分間固定し、一連の段階的エタノールで脱水し、ｎ－ブチルグリシジルエーテル（ＱＹ－１）に移し、エポキシ樹脂（ＥＰＯＮ８１２、ＴＡＡＢ社製）に埋め込んだ。超薄切片をウルトラミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｎ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ－Ｎｉｓｓｅｉ社製）上で厚さ１００ｎｍにカットし、ニッケルグリッド（ＶＥＣＯ社製、２５５２）上に置き、５％メタ過ヨウ素酸ナトリウムで１０分間エッチングし、ＰＢＳで洗浄した。切片を抗Ｆｌａｇ抗体（１：１００）と共に２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片を１５ｎｍ金結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５０、Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片を２．５％ＧＡ／ＰＢＳ中に１０分間固定し、ミリ－Ｑ水で洗浄して抗原－抗体結合を安定化させた。免疫染色した切片を酢酸ウラニルで３分間染色し、クエン酸鉛で１分間染色した後、透過型電子顕微鏡（Ｈ－７６５０、Ｈｉｔａｃｈｉ社製）で観察した。ＭＶＢ、原形質膜、ミトコンドリア及び核膜における単位面積当たりの金粒子の数をカウントした。
ＭＶＢ及び原形質膜におけるＵＢＬ３の局在を明らかにするために、免疫電子顕微鏡分析を行った。
３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３（野生型又はＵＢＬ３Δ１）でトランスフェクションしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞又は偽トランスフェクションＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで４℃３０分間固定し、続いて４％ＰＦＡ及び０．１％グルタルアルデヒド（ＧＡ）／ＰＢＳ中で４℃３０分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１％四酸化オスミウム／ＰＢＳで３０分間固定し、一連の段階的エタノールで脱水し、ｎ－ブチルグリシジルエーテル（ＱＹ－１）に移し、エポキシ樹脂（ＥＰＯＮ８１２、ＴＡＡＢ社製）に埋め込んだ。超薄切片をウルトラミクロトーム（Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｎ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ－Ｎｉｓｓｅｉ社製）上で厚さ１００ｎｍにカットし、ニッケルグリッド（ＶＥＣＯ社製、２５５２）上に置き、５％メタ過ヨウ素酸ナトリウムで１０分間エッチングし、ＰＢＳで洗浄した。切片を抗Ｆｌａｇ抗体（１：１００）と共に２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片を１５ｎｍ金結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５０、Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片を２．５％ＧＡ／ＰＢＳ中に１０分間固定し、ミリ－Ｑ水で洗浄して抗原－抗体結合を安定化させた。免疫染色した切片を酢酸ウラニルで３分間染色し、クエン酸鉛で１分間染色した後、透過型電子顕微鏡（Ｈ－７６５０、Ｈｉｔａｃｈｉ社製）で観察した。ＭＶＢ、原形質膜、ミトコンドリア及び核膜における単位面積当たりの金粒子の数をカウントした。
【0073】
（結果）
図５ｃは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のミトコンドリア及び核膜におけるＦｌａｇ－ＵＢＬ３の免疫電子顕微鏡画像を示す図である。
図５ｄは、図５ｃにおける単位面積（μｍ２）当たりの金コロイド数の定量を示す図である（ｎ数＝１０）。図中、ｎ．ｓ．は両側スチューデントｔ検定によるｐ＞０．０５である。
図６ｄは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における野生型ＵＢＬ３及びＵＢＬ３Δ１の免疫電子顕微鏡画像を示す図である。
図６ｅは、上記図６ｄの単位面積（μｍ２）当たりの金コロイドの数の定量を示す図である（ＭＶＢ：ｎ数＝１０、細胞膜：ｎ数＝１３）。図中、＊は、両側スチューデント及びウェルチのｔ検定によるｐ＜０．０５を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
図５ｃは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のミトコンドリア及び核膜におけるＦｌａｇ－ＵＢＬ３の免疫電子顕微鏡画像を示す図である。
図５ｄは、図５ｃにおける単位面積（μｍ２）当たりの金コロイド数の定量を示す図である（ｎ数＝１０）。図中、ｎ．ｓ．は両側スチューデントｔ検定によるｐ＞０．０５である。
図６ｄは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における野生型ＵＢＬ３及びＵＢＬ３Δ１の免疫電子顕微鏡画像を示す図である。
図６ｅは、上記図６ｄの単位面積（μｍ２）当たりの金コロイドの数の定量を示す図である（ＭＶＢ：ｎ数＝１０、細胞膜：ｎ数＝１３）。図中、＊は、両側スチューデント及びウェルチのｔ検定によるｐ＜０．０５を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【0074】
図６ｄ及びｅに示した結果から明らかなように、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に導入したとき、ＵＢＬ３シグナルはＭＶＢ及び原形質膜ではっきりと検出されることが分かる。
一方、図５ｃ及びｄに示した結果から明らかなように、ミトコンドリア又は核膜では検出されないことがわかる。
一方、図５ｃ及びｄに示した結果から明らかなように、ミトコンドリア又は核膜では検出されないことがわかる。
【0075】
また、図６ｄ及びｅに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３Δ１は原形質膜に局在する一方、ＭＶＢには局在しないことがわかる。
これらの結果から、膜局在化が十分ではなく、ＭＶＢ局在化にＵＢＬ３修飾が必要であることを示している。
これらの結果から、膜局在化が十分ではなく、ＭＶＢ局在化にＵＢＬ３修飾が必要であることを示している。
【0076】
≪ＵＢＬ３の細胞外分泌≫
ＭＶＢの一つの運命は、エキソソームとしての放出のために原形質膜と融合することである。他の運命は、リソソームと融合して、ＭＶＢの中身を分解させることであることが知られている（Ｋａｔｚｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｏｄｏｒｉｚｚｉ，Ｇ．＆Ｅｍｒ，Ｓ．Ｄ． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ－ｂｏｄｙ ｓｏｒｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３，８９３－９０５（２００２）．、Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．＆Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３０，２５５－２８９（２０１４）．）。
ＭＶＢの一つの運命は、エキソソームとしての放出のために原形質膜と融合することである。他の運命は、リソソームと融合して、ＭＶＢの中身を分解させることであることが知られている（Ｋａｔｚｍａｎｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｏｄｏｒｉｚｚｉ，Ｇ．＆Ｅｍｒ，Ｓ．Ｄ． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ－ｂｏｄｙ ｓｏｒｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３，８９３－９０５（２００２）．、Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．＆Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３０，２５５－２８９（２０１４）．）。
【0077】
図６ａ及びｂを参照して上述したように、ＵＢＬ３がリソソームよりも大きな程度でＭＶＢと共局在化することから、ＵＢＬ３の細胞外分泌に着目した。
細胞は、様々な大きさの細胞外小胞（ＥＶ）を放出する。これらの小胞の一部は原形質膜に由来し、これらの小胞は２，０００×ｇ（２Ｋ）及び１０，０００×ｇ（１０Ｋ）で各々精製された大型及び中型のＥＶを含む。
ｓＥＶは１００，０００×ｇ（１００Ｋ）で精製され得、一部原形質膜に由来するか（非エキソソームｓＥＶ）、又はＭＶＢに由来し得る（エキソソームｓＥＶ）（Ｋｏｗａｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．）。
細胞は、様々な大きさの細胞外小胞（ＥＶ）を放出する。これらの小胞の一部は原形質膜に由来し、これらの小胞は２，０００×ｇ（２Ｋ）及び１０，０００×ｇ（１０Ｋ）で各々精製された大型及び中型のＥＶを含む。
ｓＥＶは１００，０００×ｇ（１００Ｋ）で精製され得、一部原形質膜に由来するか（非エキソソームｓＥＶ）、又はＭＶＢに由来し得る（エキソソームｓＥＶ）（Ｋｏｗａｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．）。
【0078】
（ＥＶの単離及びＲＮＡ分析）
ｓＥＶを、従来のプロトコールに準じて馴化培地から単離した（Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．，Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ． ＆ Ｃｌａｙｔｏｎ， Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ３，Ｕｎｉｔ ３ ２２（２００６）．）。簡潔には、馴化培地を調製するためにエキソソーム枯渇ＦＢＳ（１００，０００×ｇで１６時間遠心分離）を使用した。２４時間のインキュベーション後、培養培地（３×１０７個の細胞から約９０ｍＬ）を集め、４℃で３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を２，０００×ｇで４℃２０分間遠心分離した。上清を１０，０００×ｇで３０分間４℃で再び遠心分離した。細胞破片を除去するために、上清を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ）で濾過した。次に、１００，０００×ｇ（２４，０００ｒｐｍ、ＳＷ３２Ｔｉローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で４℃で７０分間超遠心分離することによりｓＥＶペレットを採取した。ｓＥＶペレットを１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１００，０００×ｇ（４２，９００ｒｐｍ、ＴＬＡ－１１０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で４℃で６０分間超遠心分離して回収した。ｓＥＶペレットを１ｍＬのＰＢＳで再度洗浄し、４℃６０分間１００，０００×ｇの超遠心分離によって集め、次いでＰＢＳに再懸濁した。２Ｋペレット、１０Ｋペレット及び１００Ｋペレットの精製のために、先の文献に準じて頻度別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）超遠心分離プロトコルを使用した１３。１００Ｋペレットの精製の前に０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ）による濾過をさらに行った。マウス血清については、回収後、全血を室温で３０分間静置して凝固させた。血餅を除去するために、全血を８，０００×ｇで１０分間２回遠心分離した。マウス血漿の調製のために、収集後、全血をヘパリン溶液（Ｍｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製、ヘパリンＮａ５０００単位／５ｍＬ）に加え、ゆっくりと回転させ、９，１００×ｇで５分間遠心分離し、上清を血漿として使用した。
ｓＥＶを、従来のプロトコールに準じて馴化培地から単離した（Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．，Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ． ＆ Ｃｌａｙｔｏｎ， Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ３，Ｕｎｉｔ ３ ２２（２００６）．）。簡潔には、馴化培地を調製するためにエキソソーム枯渇ＦＢＳ（１００，０００×ｇで１６時間遠心分離）を使用した。２４時間のインキュベーション後、培養培地（３×１０７個の細胞から約９０ｍＬ）を集め、４℃で３００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を２，０００×ｇで４℃２０分間遠心分離した。上清を１０，０００×ｇで３０分間４℃で再び遠心分離した。細胞破片を除去するために、上清を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ）で濾過した。次に、１００，０００×ｇ（２４，０００ｒｐｍ、ＳＷ３２Ｔｉローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で４℃で７０分間超遠心分離することによりｓＥＶペレットを採取した。ｓＥＶペレットを１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１００，０００×ｇ（４２，９００ｒｐｍ、ＴＬＡ－１１０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で４℃で６０分間超遠心分離して回収した。ｓＥＶペレットを１ｍＬのＰＢＳで再度洗浄し、４℃６０分間１００，０００×ｇの超遠心分離によって集め、次いでＰＢＳに再懸濁した。２Ｋペレット、１０Ｋペレット及び１００Ｋペレットの精製のために、先の文献に準じて頻度別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）超遠心分離プロトコルを使用した１３。１００Ｋペレットの精製の前に０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ）による濾過をさらに行った。マウス血清については、回収後、全血を室温で３０分間静置して凝固させた。血餅を除去するために、全血を８，０００×ｇで１０分間２回遠心分離した。マウス血漿の調製のために、収集後、全血をヘパリン溶液（Ｍｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製、ヘパリンＮａ５０００単位／５ｍＬ）に加え、ゆっくりと回転させ、９，１００×ｇで５分間遠心分離し、上清を血漿として使用した。
【0079】
各実験において、ＵＢＬ３ ＫＯマウスからの血清の容量は、その野生型同腹仔の血清量（約３５０～５００μＬ）と一致した。採取した血清を直ちに等容量のＰＢＳで希釈し、４℃３０分間２，０００×ｇで遠心分離した。上清を１２，０００×ｇで４５分間４℃で遠心分離した。上清をＰＢＳで５倍に希釈し、０．２２μｍフィルターでろ過した。次いで、ＥＶペレットを１１０，０００×ｇ（３４，０００ｒｐｍ、ＳＷ５５Ｔｉローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で４℃７０分間超遠心分離して回収した。ｓＥＶペレットを１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１００，０００×ｇ（４２，９００ｒｐｍ、ＴＬＡ－１１０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で４℃６０分間超遠心分離して回収した。ｓＥＶペレットを１ｍＬのＰＢＳで再度洗浄し、１００，０００×ｇ（４２，９００ｒｐｍ、ＴＬＡ－１１０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で４℃で６０分間超遠心分離して回収し、ＰＢＳに再懸濁した。血清ｓＥＶの全ＲＮＡ量を定量するために、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、各マウスの全血清ｓＥＶからＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡ溶液をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００システム（ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により測定した。リアルタイムｑＰＣＲ分析のために、上記精製ＲＮＡ溶液（４０％）を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し、各ｍｉＲＮＡについて得られたｃＤＮＡ１０％溶液をリアルタイムｑＰＣＲ分析に使用した。
【0080】
血清、血漿及び細胞溶解物のタンパク質濃度をＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）によって測定した。２Ｋペレット、１０Ｋペレット及び１００Ｋペレットのタンパク質濃度を定量するために、各ペレットを２％ＳＤＳで希釈し、Ｍｉｃｒｏ－ＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）で測定した。
【0081】
（ｓＥＶにおける総タンパク質量の測定）
各実験の精製した１０％血清ｓＥＶをＳＤＳサンプルバッファーを含むβ－ＭＥで煮沸し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。得られたゲルを５０％メタノール及び１０％酢酸に３０分間固定し、１０％メタノール及び７％酢酸で３０分間洗浄した。ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）中で暗所にて３時間染色した。ゲルを１０％メタノール及び８％酢酸で３０分間洗浄し、次いで超純水で１０分間洗浄した。次いで、ゲルを、５３２ｎｍに設定した蛍光スキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００）を用いてスキャンした。全タンパク質強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。
各実験の精製した１０％血清ｓＥＶをＳＤＳサンプルバッファーを含むβ－ＭＥで煮沸し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。得られたゲルを５０％メタノール及び１０％酢酸に３０分間固定し、１０％メタノール及び７％酢酸で３０分間洗浄した。ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）中で暗所にて３時間染色した。ゲルを１０％メタノール及び８％酢酸で３０分間洗浄し、次いで超純水で１０分間洗浄した。次いで、ゲルを、５３２ｎｍに設定した蛍光スキャナー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００）を用いてスキャンした。全タンパク質強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。
【0082】
（結果）
図７は、ｓＥＶにおける全タンパク質レベルが、ＵＢＬ３ノックアウトマウスにおいて減少することを示す図であり、図７ａは、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地からの細胞溶解物（ＣＬ）及び２Ｋ、１０Ｋ及び１００Ｋの各遠心分離ペレットを種々の抗体でブロットした結果を示す図である。
図７ａにおいて、Ｆｌａｇ抗体、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１抗体、ＧＰ９６抗体、Ａｃｔｉｎｉｎ－４抗体、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ抗体、ＧＡＰＤＨ抗体、及びＡｌｉｘ抗体はβＭＥ＋条件であり、ＣＤ６３抗体及びＣＤ９抗体は、βＭＥ－条件である。
図７は、ｓＥＶにおける全タンパク質レベルが、ＵＢＬ３ノックアウトマウスにおいて減少することを示す図であり、図７ａは、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地からの細胞溶解物（ＣＬ）及び２Ｋ、１０Ｋ及び１００Ｋの各遠心分離ペレットを種々の抗体でブロットした結果を示す図である。
図７ａにおいて、Ｆｌａｇ抗体、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１抗体、ＧＰ９６抗体、Ａｃｔｉｎｉｎ－４抗体、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ抗体、ＧＡＰＤＨ抗体、及びＡｌｉｘ抗体はβＭＥ＋条件であり、ＣＤ６３抗体及びＣＤ９抗体は、βＭＥ－条件である。
【0083】
図７ａに示した結果から明らかなように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞からの２Ｋ、１０Ｋ及び１００Ｋ遠心分離ペレットからＥＶを精製し、ＵＢＬ３が２Ｋ及び１０Ｋ画分よりも１００Ｋ画分により濃縮されていることがわかる。
【0084】
（ｓＥＶの電子顕微鏡分析）
超微視的分析は、従来のプロトコールに準じて行った（Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．，Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．＆ Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ３，Ｕｎｉｔ ３ ２２（２００６）．）。簡潔に述べると、精製したｓＥＶを等量の４％ＰＦＡ／ＰＢＳと混合し、次いで電子顕微鏡（ＥＭ）グリッド（Ｎｉｓｓｈｉｎ ＥＭ、Ｅｘｃｅｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｆｉｌｍ）上に沈着させた。ＥＭグリッド上のｓＥＶをＰＢＳで洗浄し、さらに１％ＧＡで５分間固定し、超純水で２分ごとに８回洗浄した。ＥＭグリッドを１０％ＥＭ染色（Ｎｉｓｓｈｉｎ ＥＭ）でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡を用いて分析した。
超微視的分析は、従来のプロトコールに準じて行った（Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．，Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．＆ Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ３，Ｕｎｉｔ ３ ２２（２００６）．）。簡潔に述べると、精製したｓＥＶを等量の４％ＰＦＡ／ＰＢＳと混合し、次いで電子顕微鏡（ＥＭ）グリッド（Ｎｉｓｓｈｉｎ ＥＭ、Ｅｘｃｅｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｆｉｌｍ）上に沈着させた。ＥＭグリッド上のｓＥＶをＰＢＳで洗浄し、さらに１％ＧＡで５分間固定し、超純水で２分ごとに８回洗浄した。ＥＭグリッドを１０％ＥＭ染色（Ｎｉｓｓｈｉｎ ＥＭ）でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡を用いて分析した。
【0085】
図８ａは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地から頻度別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）超遠心分離プロトコールによって単離した１００Ｋペレット（ｓＥＶ）の電子顕微鏡分析結果を示す図である。右パネルは左パネルの白いボックスから拡大した領域である。
図８ａに示した電子顕微鏡ネガティブ染色結果から明らかなように、１００Ｋペレットから精製されたｓＥＶが、直径５０～１００ｎｍの範囲のナノメートルサイズの小胞を含むことがわかる。
図８ａに示した電子顕微鏡ネガティブ染色結果から明らかなように、１００Ｋペレットから精製されたｓＥＶが、直径５０～１００ｎｍの範囲のナノメートルサイズの小胞を含むことがわかる。
【0086】
ビオチン化タグベクター（ＢｉｏＥａｓｅ）中のＵＢＬ３でトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、抗ＣＤ９抗体及び抗ＣＤ６３抗体を用いたプルダウン試験に供した。
図８ｂは、免疫分離結果を示す図である。
Ｋｏｗａｌ Ｊら（Ｋｏｗａｌ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．）の免疫単離法に記載されているようにｓＥＶを抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体のいずれかで免疫沈降させると、図８ｂに示したように、ＵＢＬ３シグナルがプルダウン（ＰＤ）画分に見出された。
一方、ＵＢＬ３はコントロールＩｇＧプルダウン試料中のフロースルー（ＦＴ）画分にのみ見出された。等量のＰＤ画分及びＦＴ画分をウェスタンブロット分析のためにゲルにロードした。
図８ｂ中、＊は、免疫沈降に使用される免疫グロブリンの重鎖（５０ｋＤａ）からの非特異的シグナルである。
図８ｂに示した結果から明らかなように、大部分のＵＢＬ３がＣＤ６３を含むｓＥＶに存在することが見出された。
図８ｂは、免疫分離結果を示す図である。
Ｋｏｗａｌ Ｊら（Ｋｏｗａｌ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．）の免疫単離法に記載されているようにｓＥＶを抗ＣＤ９抗体又は抗ＣＤ６３抗体のいずれかで免疫沈降させると、図８ｂに示したように、ＵＢＬ３シグナルがプルダウン（ＰＤ）画分に見出された。
一方、ＵＢＬ３はコントロールＩｇＧプルダウン試料中のフロースルー（ＦＴ）画分にのみ見出された。等量のＰＤ画分及びＦＴ画分をウェスタンブロット分析のためにゲルにロードした。
図８ｂ中、＊は、免疫沈降に使用される免疫グロブリンの重鎖（５０ｋＤａ）からの非特異的シグナルである。
図８ｂに示した結果から明らかなように、大部分のＵＢＬ３がＣＤ６３を含むｓＥＶに存在することが見出された。
【0087】
図８ｃは、ｓＥＶ内のＵＢＬ３の検出を示す図である。等量のＰＤ画分及びＦＴ画分をウェスタンブロット分析のためにゲルにロードした。
図８ｃに示したように、ＰＢＳ処理の下で、ビオチン化ＵＢＬ３はＦＴ画分で同定されたが、ＰＤ画分では同定されなかった。
一方、大部分のトランスフェクションされたビオチニル化ＵＢＬ３は、ＳＤＳ処理を伴うＰＤ画分において同定され、ＵＢＬ３がｓＥＶ内にパッケージングされたことを示している。
図８ｃに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３がｓＥＶ内にパッケージングされていることが見出された。
図８ｃに示したように、ＰＢＳ処理の下で、ビオチン化ＵＢＬ３はＦＴ画分で同定されたが、ＰＤ画分では同定されなかった。
一方、大部分のトランスフェクションされたビオチニル化ＵＢＬ３は、ＳＤＳ処理を伴うＰＤ画分において同定され、ＵＢＬ３がｓＥＶ内にパッケージングされたことを示している。
図８ｃに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３がｓＥＶ内にパッケージングされていることが見出された。
【0088】
内在性ＵＢＬ３がｓＥＶで放出されたか否かを測定するために、野生型マウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウスから初代培養細胞を調製し、培養上清からｓＥＶを精製し、抗ＵＢＬ３抗体を用いてブロットした。サンプルをロードする前に、サンプルをβＭＥで沸騰した。各条件から精製されたｓＥＶの１０％をロードし、分析した。ゲルはＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙで染色した。
図８ｄは、ＷＴマウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウスから単離された初代間質血管（ＳＶＦ）画分及び初代筋管（Ｍｙｏｔｕｂｅ）画分の細胞培養培地からのｓＥＶのウェスタンブロッティング分析結果を示す図である。
図８ｄに示した結果から明らかなように、内在性ＵＢＬ３が、野生型マウス由来のｓＥＶにおいてのみ見出されたことがわかる。
図８ｄは、ＷＴマウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウスから単離された初代間質血管（ＳＶＦ）画分及び初代筋管（Ｍｙｏｔｕｂｅ）画分の細胞培養培地からのｓＥＶのウェスタンブロッティング分析結果を示す図である。
図８ｄに示した結果から明らかなように、内在性ＵＢＬ３が、野生型マウス由来のｓＥＶにおいてのみ見出されたことがわかる。
【0089】
ｓＥＶをＦｌａｇタグ付きＵＢＬ３でトランスフェクトされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の培地から単離した。同量のｓＥＶ（タンパク質１μｇ）をＵＢＬ３抗血清でブロットした。細胞溶解物由来のＩＰ産物をＵＢＬ３修飾の陽性コントロールとしてロードした。ゲルはＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙで染色した。
図８ｅは、ｓＥＶにおけるＵＢＬ３修飾を示す図である。
図８ｅに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３修飾が細胞溶解物だけでなくｓＥＶにおいても観察されたことがわかる。
図８ｅは、ｓＥＶにおけるＵＢＬ３修飾を示す図である。
図８ｅに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３修飾が細胞溶解物だけでなくｓＥＶにおいても観察されたことがわかる。
【0090】
ｓＥＶへのソーティングにＵＢＬ３修飾が不可欠であることを明らかにするために、１００ＫｓＥＶにおけるＵＢＬ３及びその変異体の存在を調査した。
図７ｂは、ｓＥＶにおけるＵＢＬ３及びその変異体の存在を示す図である。
図７ｂにおいて、Ｆｌａｇ抗体、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１抗体、及びＧＡＰＤＨ抗体はβＭＥ＋条件であり、ＣＤ９抗体はβＭＥ－条件である。
図７ｂは、ｓＥＶにおけるＵＢＬ３及びその変異体の存在を示す図である。
図７ｂにおいて、Ｆｌａｇ抗体、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１抗体、及びＧＡＰＤＨ抗体はβＭＥ＋条件であり、ＣＤ９抗体はβＭＥ－条件である。
【0091】
図７ｂから明らかなように、これらの中で、ＵＢＬ３システイン変異体はｓＥＶ画分にソーティングされなかったことがわかる。
一方、ＵＢＬ３Δ１は、野生型ＵＢＬ３のレベルと比較して非常に低いレベルで検出されたことがわかる。
一方、ＵＢＬ３Δ１は、野生型ＵＢＬ３のレベルと比較して非常に低いレベルで検出されたことがわかる。
【0092】
精製１００Ｋペレットには、エキソソームｓＥＶ及び非エキソソームｓＥＶの両方が含まれている。
後者は原形質膜から直接分泌される小胞を含むことが知られている（Ｋｏｗａｌ，Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．、Ｂｏｂｒｉｅ，Ａ．，Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．，Ｋｒｕｍｅｉｃｈ，Ｓ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．＆ Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．Ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｅｘｏｓｏｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ １，１８３９７（２０１２）．）。
図７ｂは、原形質膜に局在するがＭＶＢに局在しないＵＢＬ３Δ１がなぜ１００Ｋペレット中に少量検出されたのかを説明している（図２ｈ、図６ｄ、ｅ、及び図７ｂを参照）。
また、以上の知見は、ＵＢＬ３修飾がｓＥＶへのＵＢＬ３ソーティングに重要であることを示している。
後者は原形質膜から直接分泌される小胞を含むことが知られている（Ｋｏｗａｌ，Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．、Ｂｏｂｒｉｅ，Ａ．，Ｃｏｌｏｍｂｏ，Ｍ．，Ｋｒｕｍｅｉｃｈ，Ｓ．，Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．＆ Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．Ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｅｘｏｓｏｍｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ １，１８３９７（２０１２）．）。
図７ｂは、原形質膜に局在するがＭＶＢに局在しないＵＢＬ３Δ１がなぜ１００Ｋペレット中に少量検出されたのかを説明している（図２ｈ、図６ｄ、ｅ、及び図７ｂを参照）。
また、以上の知見は、ＵＢＬ３修飾がｓＥＶへのＵＢＬ３ソーティングに重要であることを示している。
【0093】
また、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡ又はＲａｂ２７ａ ｓｈＲＮＡのいずれかでトランスフェクトし、７２時間後、ＵＢＬ３修飾に対するＲａｂ２７ａ ｓｈＲＮＡの効果を評価した。
図８ｆは、ＵＢＬ３修飾に対するＲａｂ２７ａ ｓｈＲＮＡによるｓＥＶ放出の遺伝子レベルでの阻害効果を示す図である。
図８ｆから明らかなように、エキソソーム放出がＲａｂ２７ａ ｓｈＲＮＡ１５によって阻害されたとき、ＵＢＬ３修飾産物のレベルが増加したことが分かる。
図８ｆは、ＵＢＬ３修飾に対するＲａｂ２７ａ ｓｈＲＮＡによるｓＥＶ放出の遺伝子レベルでの阻害効果を示す図である。
図８ｆから明らかなように、エキソソーム放出がＲａｂ２７ａ ｓｈＲＮＡ１５によって阻害されたとき、ＵＢＬ３修飾産物のレベルが増加したことが分かる。
【0094】
以上の結果は、ＵＢＬ３修飾がＭＶＢにおけるＵＢＬ３の局在化に必要であり、ＵＢＬ３の大部分がエキソソームとして放出されるＭＶＢの融合に由来するｓＥＶにおいて分泌されることを示している。
ＵＢＬ３が原形質膜に局在するので、ＵＢＬ３修飾も非エキソソームｓＥＶに影響を及ぼし得る。
ＵＢＬ３が原形質膜に局在するので、ＵＢＬ３修飾も非エキソソームｓＥＶに影響を及ぼし得る。
【0095】
＜ｓＥＶへのタンパク質のソーティングにおけるＵＢＬ３の機能解析＞
ｓＥＶへのタンパク質のソーティングにおけるＵＢＬ３の機能的役割を解明するために、ＵＢＬ３－ＫＯマウス血清由来の精製ｓＥＶのタンパク質含量を定量した。
ｓＥＶへのタンパク質のソーティングにおけるＵＢＬ３の機能的役割を解明するために、ＵＢＬ３－ＫＯマウス血清由来の精製ｓＥＶのタンパク質含量を定量した。
【0096】
図７ｃは、ネガティブ染色によるＷＴマウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウスからの血清由来精製ｓＥＶの電子顕微鏡分析結果を示す図である。
図９ａ及びｂは、ＷＴマウス（ｎ＝３）及びＵＢＬ３ ＫＯマウス（ｎ＝３）の血清ｓＥＶにおけるＮａｎｏＳｉｇｈｔ（商品名）を用いたｓＥＶ粒子の測定を示す図であり、図９ａは粒子濃度（×１０８粒子／ｍｌ）を、図９ｂは平均小胞（粒子）径（ｎｍ）を示す。
図７ｃ、並びに図９ａ及びｂに示した結果から明らかなように、遺伝子型（ＷＴ又はＵＢＬ３ ＫＯ）は、ｓＥＶ粒子の粒子濃度又は平均小胞径に影響を及ぼさないことがわかる。
図９ａ及びｂは、ＷＴマウス（ｎ＝３）及びＵＢＬ３ ＫＯマウス（ｎ＝３）の血清ｓＥＶにおけるＮａｎｏＳｉｇｈｔ（商品名）を用いたｓＥＶ粒子の測定を示す図であり、図９ａは粒子濃度（×１０８粒子／ｍｌ）を、図９ｂは平均小胞（粒子）径（ｎｍ）を示す。
図７ｃ、並びに図９ａ及びｂに示した結果から明らかなように、遺伝子型（ＷＴ又はＵＢＬ３ ＫＯ）は、ｓＥＶ粒子の粒子濃度又は平均小胞径に影響を及ぼさないことがわかる。
【0097】
図７ｄの左上のパネルはＷＴマウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウスにおける血清由来ＥＶのタンパク質染色を示す図である。
【0098】
（ナノ粒子追跡分析によるｓＥＶの測定）
ＰＢＳで２５倍に希釈した単離血清ｓＥＶ粒子上において、青色レーザーシステム（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ、Ａｍｅｓｂｕｒｙ社製）を有するＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０ＨＳを用いて、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を行った（Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｙｐｅｓ． Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２，２０４２４（２０１３）．）。
ＰＢＳで２５倍に希釈した単離血清ｓＥＶ粒子上において、青色レーザーシステム（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ、Ａｍｅｓｂｕｒｙ社製）を有するＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０ＨＳを用いて、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を行った（Ｙｏｓｈｉｏｋａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｙｐｅｓ． Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２，２０４２４（２０１３）．）。
【0099】
上記システムは、関心のある粒子の懸濁液にレーザビームを集束させる。それらは視野内の各粒子から散乱された光を集めるビーム軸に垂直に配列された従来の光学顕微鏡を用いて光散乱によって視覚化された。６０秒間のビデオは、ＮＴＡソフトウェアによるさらなる解析のために全てのイベントを記録する。各粒子のブラウン運動をフレーム間で追跡して、ストークス－アインシュタイン方程式を用いてそのサイズを計算した。各サンプルを３回測定し、統計的解析のために平均値を使用した。
【0100】
図７ｄの左下のパネルは、精製血清ｓＥＶを、βＭＥとともに抗チューブリン抗体及びＣＤ９抗体でブロットした結果を示す図である。
図７ｄの右パネルは、血清ｓＥＶにおける全タンパク質の相対強度を示す図である（ｎ数＝９ペア）。
図９ｃは、ＷＴマウス（白四角；血清（ｎ＝１１）、血漿（ｎ＝５））及びＵＢＬ３ ＫＯマウス（グレー四角；血清（ｎ＝１０）、血漿（ｎ＝５））からの血清及び血漿中の全タンパク質濃度を示す図である。図中、ｎ．ｓ．はＷｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ－ｒａｎｋ検定によるｐ＞０．０５を示す。
図７ｄ及び図９ｃに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３ ＫＯマウスと、野生型マウスとで遺伝子型間に、血清及び血漿中の全タンパク質含量は有意差がないころが分かる一方、興味深いことに、ＵＢＬ３ ＫＯマウス由来の血清中のｓＥＶタンパク質の全レベルは、野生型マウスよりも６０％低いことがわかる（図７ｄの右パネル）。
図７ｄの右パネルは、血清ｓＥＶにおける全タンパク質の相対強度を示す図である（ｎ数＝９ペア）。
図９ｃは、ＷＴマウス（白四角；血清（ｎ＝１１）、血漿（ｎ＝５））及びＵＢＬ３ ＫＯマウス（グレー四角；血清（ｎ＝１０）、血漿（ｎ＝５））からの血清及び血漿中の全タンパク質濃度を示す図である。図中、ｎ．ｓ．はＷｉｌｃｏｘｏｎ ｓｉｇｎｅｄ－ｒａｎｋ検定によるｐ＞０．０５を示す。
図７ｄ及び図９ｃに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３ ＫＯマウスと、野生型マウスとで遺伝子型間に、血清及び血漿中の全タンパク質含量は有意差がないころが分かる一方、興味深いことに、ＵＢＬ３ ＫＯマウス由来の血清中のｓＥＶタンパク質の全レベルは、野生型マウスよりも６０％低いことがわかる（図７ｄの右パネル）。
【0101】
この結果は、ＵＢＬ３が全エキソソームタンパク質の半数を超えるタンパク質のソーティングに関与している可能性があることを示唆している。
【0102】
図７ｅは、血清ｓＥＶにおける全ＲＮＡレベルを示す図である。図中、ｎ数＝５×２であり、ｎ．ｓ．はマンホイットニー検定によるｐ＞０．０５を示す。
図９ｄは、血清ｓＥＶ中の全ＲＮＡに関するエレクトロフェログラムデータを示す図である。
図９ｅは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて、血漿ｓＥＶ中の全ＲＮＡ量を測定した結果を示す図である。図中、各菱形のスポットは、ＷＴマウス（白四角、ｎ＝３）及びＵＢＬ３ ＫＯマウス（グレー四角、ｎ＝４）から精製した血漿ｓＥＶにおける全ＲＮＡ量を示す。図中、ｎ．ｓ．はマンホイットニー検定によるｐ＞０．０５を示す。
図７ｅ、並びに図９ｄ及びｅに示した結果から明らかなように、ＲＮＡプロファイル及びＲＮＡレベルに遺伝子型間に有意差がないことがわかる。
図９ｄは、血清ｓＥＶ中の全ＲＮＡに関するエレクトロフェログラムデータを示す図である。
図９ｅは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて、血漿ｓＥＶ中の全ＲＮＡ量を測定した結果を示す図である。図中、各菱形のスポットは、ＷＴマウス（白四角、ｎ＝３）及びＵＢＬ３ ＫＯマウス（グレー四角、ｎ＝４）から精製した血漿ｓＥＶにおける全ＲＮＡ量を示す。図中、ｎ．ｓ．はマンホイットニー検定によるｐ＞０．０５を示す。
図７ｅ、並びに図９ｄ及びｅに示した結果から明らかなように、ＲＮＡプロファイル及びＲＮＡレベルに遺伝子型間に有意差がないことがわかる。
【0103】
図９ｆはＷＴマウス及びＵＢＬ３ ＫＯマウスから精製した血清ｓＥＶ中のｍｉＲＮＡのリアルタイムｑＰＣＲ分析結果を示す図である。ｎ＝５であり、ｎ．ｓ．はマンホイットニー検定によるｐ＞０．０５を示す。
図９ｆに示した結果から明らかなように、特異的ｓＥＶ富化ｍｉＲＮＡレベルは統計学的に有意差はないことがわかる。
上記結果は、ＵＢＬ３ ＫＯマウスが、血清中に減少した各タンパク質及び正常レベルのｍｉＲＮＡとともにｓＥＶを産生することを示す。言い換えると、血清ｓＥＶ中のタンパク質のソーティングは、ＵＢＬ３の関与を受ける。
図９ｆに示した結果から明らかなように、特異的ｓＥＶ富化ｍｉＲＮＡレベルは統計学的に有意差はないことがわかる。
上記結果は、ＵＢＬ３ ＫＯマウスが、血清中に減少した各タンパク質及び正常レベルのｍｉＲＮＡとともにｓＥＶを産生することを示す。言い換えると、血清ｓＥＶ中のタンパク質のソーティングは、ＵＢＬ３の関与を受ける。
【0104】
以上の結果から、ＵＢＬ３修飾がＭＶＢ及びｓＥＶへのＵＢＬ３のソーティングに不可欠であることがわかった。
【0105】
≪Ｃ末端システイン残基２つに依存してＵＢＬ３と相互作用するタンパク質の同定≫
ＵＢＬ３修飾の生理学的機能をよりよく理解するために、Ｃ末端システイン残基２つに依存してＵＢＬ３と相互作用するタンパク質を同定するために包括的プロテオミクス解析を行った。
ＵＢＬ３修飾の生理学的機能をよりよく理解するために、Ｃ末端システイン残基２つに依存してＵＢＬ３と相互作用するタンパク質を同定するために包括的プロテオミクス解析を行った。
【0106】
（プロテオミクス解析）
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をリポフェクトアミン２０００を用いてプラスミドでトランスフェクションした。２４時間後、細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳ中にこすり落とし、４℃で１分間４００×ｇで遠心分離してペレット化し、１％トリトン緩衝液中４℃２０分間溶解した。粗核及び未破砕細胞を、４℃で５分間２０，０００×ｇ遠心分離によって除外した。プレクリーニングのために、上清を４０μＬプロテインＧ－セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社製、溶解緩衝液中５０％スラリー）で４℃１時間２回インキュベートした。次に上清を５０μｌの抗Ｆｌａｇ Ｍ２親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ社製、溶解バッファー中５０％スラリー）と共に４℃で１６時間インキュベートした。ビーズを１％トリトン緩衝液で洗浄し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］）で３回洗浄して界面活性剤を除去し、２００μＬ消化緩衝液（２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭヨードアセトアミド、１μｇのトリプシン［Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｖ５２８０］）に再懸濁し、１，２００ｒｐｍで３７℃１６時間振とうしてインキュベートした。サンプルを２２μＬの１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化した。次いで、上清中に含まれるペプチドを、４，４００×ｇで３０秒間の遠心分離によって採取した。ペプチドをＣ１８Ｔｉｐ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、ＳｔａｇｅＴｉｐｓ）で脱塩し、スピードバックで乾燥させた後、質量分析バッファー（２％アセトニトリル、０．２％ＴＦＡ）に再懸濁した。ペプチドを５０ｃｍの逆相カラム（内径７５μｍ、ＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱ１．９μｍ樹脂［Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ社製］）上で緩衝液Ａ（０．１％ギ酸（ＦＡ））及び緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル＋０．１％ＦＡ）のバイナリー緩衝液系で１００分勾配（それぞれ５％～３０％緩衝液Ｂを９５分間及び３０％～６５％緩衝液Ｂを５分間）にてＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて３００ｎＬ／分の流量にて分離した。カラム温度を５０℃に維持した。上記ｎＬＣシステムをＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に接続し、３ｅ６イオンのターゲットでフルスキャン（３００－１，６５０ｍ／ｚ、最大注入時間２０ｍ秒、２００ｍ／ｚで解像度６０，０００）を取得した。最も強い１５のイオンは、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）（ターゲット１ｅ５イオン、最大注入時間２５ミリ秒、分離ウィンドウ１．４ｍ／ｚ、ＮＣＥ２７％、アンダーフィル率０．１％）で単離され、フラグメント化され、オービトラップ（２００ｍ／ｚで解像度１５，０００）で検出した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をリポフェクトアミン２０００を用いてプラスミドでトランスフェクションした。２４時間後、細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳ中にこすり落とし、４℃で１分間４００×ｇで遠心分離してペレット化し、１％トリトン緩衝液中４℃２０分間溶解した。粗核及び未破砕細胞を、４℃で５分間２０，０００×ｇ遠心分離によって除外した。プレクリーニングのために、上清を４０μＬプロテインＧ－セファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社製、溶解緩衝液中５０％スラリー）で４℃１時間２回インキュベートした。次に上清を５０μｌの抗Ｆｌａｇ Ｍ２親和性ゲル（Ｓｉｇｍａ社製、溶解バッファー中５０％スラリー）と共に４℃で１６時間インキュベートした。ビーズを１％トリトン緩衝液で洗浄し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］）で３回洗浄して界面活性剤を除去し、２００μＬ消化緩衝液（２Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭヨードアセトアミド、１μｇのトリプシン［Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｖ５２８０］）に再懸濁し、１，２００ｒｐｍで３７℃１６時間振とうしてインキュベートした。サンプルを２２μＬの１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性化した。次いで、上清中に含まれるペプチドを、４，４００×ｇで３０秒間の遠心分離によって採取した。ペプチドをＣ１８Ｔｉｐ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、ＳｔａｇｅＴｉｐｓ）で脱塩し、スピードバックで乾燥させた後、質量分析バッファー（２％アセトニトリル、０．２％ＴＦＡ）に再懸濁した。ペプチドを５０ｃｍの逆相カラム（内径７５μｍ、ＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱ１．９μｍ樹脂［Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ社製］）上で緩衝液Ａ（０．１％ギ酸（ＦＡ））及び緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル＋０．１％ＦＡ）のバイナリー緩衝液系で１００分勾配（それぞれ５％～３０％緩衝液Ｂを９５分間及び３０％～６５％緩衝液Ｂを５分間）にてＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて３００ｎＬ／分の流量にて分離した。カラム温度を５０℃に維持した。上記ｎＬＣシステムをＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に接続し、３ｅ６イオンのターゲットでフルスキャン（３００－１，６５０ｍ／ｚ、最大注入時間２０ｍ秒、２００ｍ／ｚで解像度６０，０００）を取得した。最も強い１５のイオンは、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）（ターゲット１ｅ５イオン、最大注入時間２５ミリ秒、分離ウィンドウ１．４ｍ／ｚ、ＮＣＥ２７％、アンダーフィル率０．１％）で単離され、フラグメント化され、オービトラップ（２００ｍ／ｚで解像度１５，０００）で検出した。
【0107】
未加工のＭＳファイルは、ラベルフリーの定量化のためにＭａｘＬＦＱアルゴリズムを使用し、タンパク質及びペプチドレベルでＦＤＲ＜０．０１の統合アンドロメダ検索エンジンを使用して、ＭａｘＱｕａｎｔ環境（バージョン１．５．９．３）内で処理した（Ｃｏｘ，Ｊ．＆ Ｍａｎｎ， Ｍ． ＭａｘＱｕａｎｔ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ， ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ｐ．ｐ．ｂ．－ｒａｎｇｅ ｍａｓｓ ａｃｃｕｒａｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，１３６７－１３７２（２００８）．、Ｃｏｘ，Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｌａｙｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｘｉｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒａｔｉｏ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｔｅｒｍｅｄ ＭａｘＬＦＱ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３，２５１３－２５２６（２０１４）．）。
【0108】
検索には、酸化メチオニン（Ｍ）、アセチル化（タンパク質Ｎ末端）、及びカルバミドメチル（Ｃ）の固定修飾に対する可変修飾が含まれていた。プロテアーゼ消化には２までのミスクリーベージ（ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ）が許容された。少なくとも７個のアミノ酸を有するペプチドを同定のために考慮し、０．７分の一致時間ウインドウで「ラン間の一致」を可能にし、各単一測定で同定されなかったＭＳ１特徴の定量を可能にした。ペプチド及びタンパク質は、２１，０５１項目を含むヒト（２０１５）のＵｎｉＰｒｏｔ ＦＡＳＴＡデータベースを用いて同定した。
【0109】
フリーソフトウェアＰＥＲＳＥＵＳ（バージョン１．５．４．１）を用いてすべての統計分析及びバイオインフォマティクス分析を行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｅｒｓｅｕｓ－ｆｒａｍｅｗｏｒｋ．ｏｒｇ）。部位改変によってのみ同定されたタンパク質又はデコイリバースデータベースにて見出したタンパク質、及び夾雑物は、データ解析前に除外した。定量化のためにＭａｘＬＦＱ強度を取得し、ｌｏｇ２スケールに変換した。各プルダウンの３つの生物学的反復をグループ化し、少なくとも１つのグループにおいて少なくとも３つの有効値が必要であった。欠損値は、正規分布（幅＝０．３、ダウンシフト＝１．８）に基づいて帰属された。ＭａｘＬＦＱ強度を最初にｚスコアリングし、サンプルを、列及び行クラスタリングの距離尺度としてユークリッド距離に従って５つのクラスターにクラスター化した（距離閾値＝２．８）。アノテーションは、遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ；ＧＯ）から、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法のＦＤＲ閾値が０．０２であるエンリッチメント解析のために加えられた。有意性は、順列に基づくＦＤＲ５％及びＳ０値１を含むＡＮＯＶＡ分析を用いて評価した。有意性の方向は、５％ＦＤＲでの事後テストによっても評価した。グループのペアワイズ比較のために、順列に基づくＦＤＲ５％及びＳ０値１を含む２標本スチューデントのｔ検定（両側）を使用した。フィッシャーの正確検定は、閾値０．０２の切り捨てのためにｐ値を用いて適用した。生データセットはｊＰＯＳＴ（ＪＰＳＴ０００３１５）に寄託されている。
【0110】
（結果）
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中で発現する３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３から調製した溶解物をＦｌａｇ抗体－ビーズで精製し、ビーズ上で消化し、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計上でナノフロー液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）勾配によって分析した。結果を図１０ａ及びｂに示す。
図１０ａ及びｂは、３つの生物学的複製を有する３つの条件（３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３、又は３×Ｆｌａｇ空ベクター、又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ）全てにおいて相互作用して有意に調節されたタンパク質のｚスコアリングされたラベルフリー定量（ＬＦＱ）強度のヒートマップが、ＵＢＬ３相互作用タンパク質（Ｃｌｕｓｔｅｒ＿１）を明らかにすることを示す図である。データセットは合計３，８８２個のタンパク質を含み、偽陽性率（ＦＤＲ）が１％であった。ピアソン相関係数の平均は、３回のプルダウン内で０．９８８であった。
図１０ａに示したように、相互作用して有意に調節されたタンパク質のラベルフリー定量（ＬＦＱ）に基づく教師なし階層的クラスター分析（ＡＮＯＶＡ、ＦＤＲ＝０．０５及びＳ０＝１）により、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａベクター又はＦｌａｇ空ベクターと比較してＦｌａｇ－ＵＢＬ３ベクターでアップレギュレートされた１，４４７種のＵＢＬ３相互作用タンパク質候補が明らかにされた。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中で発現する３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３から調製した溶解物をＦｌａｇ抗体－ビーズで精製し、ビーズ上で消化し、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計上でナノフロー液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）勾配によって分析した。結果を図１０ａ及びｂに示す。
図１０ａ及びｂは、３つの生物学的複製を有する３つの条件（３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３、又は３×Ｆｌａｇ空ベクター、又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ）全てにおいて相互作用して有意に調節されたタンパク質のｚスコアリングされたラベルフリー定量（ＬＦＱ）強度のヒートマップが、ＵＢＬ３相互作用タンパク質（Ｃｌｕｓｔｅｒ＿１）を明らかにすることを示す図である。データセットは合計３，８８２個のタンパク質を含み、偽陽性率（ＦＤＲ）が１％であった。ピアソン相関係数の平均は、３回のプルダウン内で０．９８８であった。
図１０ａに示したように、相互作用して有意に調節されたタンパク質のラベルフリー定量（ＬＦＱ）に基づく教師なし階層的クラスター分析（ＡＮＯＶＡ、ＦＤＲ＝０．０５及びＳ０＝１）により、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａベクター又はＦｌａｇ空ベクターと比較してＦｌａｇ－ＵＢＬ３ベクターでアップレギュレートされた１，４４７種のＵＢＬ３相互作用タンパク質候補が明らかにされた。
【0111】
次に、ＧＯターム「細胞成分」（ＧＯＣＣ）によって定義されるように、ＵＢＬ３相互作用タンパク質の細胞下局在に基づいてＵＢＬ３相互作用タンパク質をグループ分けした。
図１０ｂに示したように、３１％のタンパク質（１，４４７種のタンパク質のうち４５４種、ｐ値０．００４０５）がＧＯＣＣターム「細胞外小胞エキソソーム」に分類されることを見出した。
図１０ｂに示したように、３１％のタンパク質（１，４４７種のタンパク質のうち４５４種、ｐ値０．００４０５）がＧＯＣＣターム「細胞外小胞エキソソーム」に分類されることを見出した。
【0112】
図１０ｃは、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ又はＦｌａｇ空ベクターのいずれかと比較した、Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３におけるｌｏｇ２タンパク質存在量の差に対するｐ値を示す火山プロットを示す図である。有意性カットオフは、ＦＤＲ＝０．０５及びＳ０＝１に基づいた。
ＵＢＬ３とＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａとのペアワイズ比較により、１，２４１種のタンパク質がＵＢＬ３と有意に相互作用することが明らかにされ（２標本スチューデントのｔ検定、ＦＤＲ＝０．０５及びＳ０＝１）、ＵＢＬ３修飾におけるシステイン残基の重要性が確認された。
これらのＵＢＬ３相互作用タンパク質のうち、２９％（３６９種）が「細胞外小胞エキソソーム」としてアノテーションされた。さらに、統計的に有意なタンパク質についてのフィッシャーの正確検定は、「細胞外小胞エキソソーム」のアノテーションのエンリッチメントを示した（ｐ値０．００８２８）。
ＵＢＬ３とＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａとのペアワイズ比較により、１，２４１種のタンパク質がＵＢＬ３と有意に相互作用することが明らかにされ（２標本スチューデントのｔ検定、ＦＤＲ＝０．０５及びＳ０＝１）、ＵＢＬ３修飾におけるシステイン残基の重要性が確認された。
これらのＵＢＬ３相互作用タンパク質のうち、２９％（３６９種）が「細胞外小胞エキソソーム」としてアノテーションされた。さらに、統計的に有意なタンパク質についてのフィッシャーの正確検定は、「細胞外小胞エキソソーム」のアノテーションのエンリッチメントを示した（ｐ値０．００８２８）。
【0113】
図１１ａは、プロテオミクス解析で３つの生物学的複製を有する３つの条件（３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３、又は３×Ｆｌａｇ空ベクター、又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ）における各種チューブリンタンパク質のプロファイルを示す図である。
図１０ｃ及び図１１ａに示した結果から明らかなように、これらのＵＢＬ３相互作用タンパク質のうち、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３サンプルにおいて、チューブリン（ＴＵＢＡ１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び４Ａ；及びＴＵＢＢ、Ｂ２Ａ、Ｂ３、Ｂ４Ａ、Ｂ４Ｂ、Ｂ６及びＢ８）を見出した。
図１０ｃ及び図１１ａに示した結果から明らかなように、これらのＵＢＬ３相互作用タンパク質のうち、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３サンプルにおいて、チューブリン（ＴＵＢＡ１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び４Ａ；及びＴＵＢＢ、Ｂ２Ａ、Ｂ３、Ｂ４Ａ、Ｂ４Ｂ、Ｂ６及びＢ８）を見出した。
【0114】
≪ＵＢＬ３修飾を介する内在性タンパク質（チューブリン）のｓＥＶへのソーティング≫
チューブリンは、ｓＥＶ及び他の細胞外小胞に存在することが報告されている（Ｋｏｗａｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．、Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０，３６３－３７９（２００９）．）。
チューブリンは、ｓＥＶ及び他の細胞外小胞に存在することが報告されている（Ｋｏｗａｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｎｏｖｅｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ ｓｕｂｔｙｐｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１３，Ｅ９６８－９７７（２０１６）．、Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｅｘｏｓｏｍｅｓ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０，３６３－３７９（２００９）．）。
【0115】
内在性チューブリンαは、一般的に使用される特異的抗体（ＤＭ１Ａ）を用いてｓＥＶにおいて検出することができることから、ＵＢＬ３修飾を介する内在性タンパク質のｓＥＶへのソーティングのモデルケースとしてチューブリンαを用いて調査した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＧＦＰタグ付きＵＢＬ３又はＧＦＰタグ付きＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａでトランスフェクトした。細胞溶解物をＧＦＰ－トラップにより免疫沈降（ＩＰ）に供し、得られた免疫沈降物を抗α－チューブリン抗体又は抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロットに供した。２×試料緩衝液（βＭＥなし）をビーズに加え、ビーズを３分間煮沸した（βＭＥ－）。試料の一部を２－メルカプトエタノール（βＭＥ＋）で処理した。結果を図１１ｂに示す。
図１１ｂは、ＧＦＰトラップ分析によるＵＢＬ３依存性翻訳後修飾を示す図である（１μｇ／レーン）。
図１１ｂに示した結果から明らかなように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に導入したＥＧＦＰ－ＵＢＬ３を抗ＧＦＰ－ビーズから免疫精製したとき、チューブリンはＵＢＬ３によって修飾され、非還元条件下でのみシフトバンドとして観察された。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、ＧＦＰタグ付きＵＢＬ３又はＧＦＰタグ付きＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａでトランスフェクトした。細胞溶解物をＧＦＰ－トラップにより免疫沈降（ＩＰ）に供し、得られた免疫沈降物を抗α－チューブリン抗体又は抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロットに供した。２×試料緩衝液（βＭＥなし）をビーズに加え、ビーズを３分間煮沸した（βＭＥ－）。試料の一部を２－メルカプトエタノール（βＭＥ＋）で処理した。結果を図１１ｂに示す。
図１１ｂは、ＧＦＰトラップ分析によるＵＢＬ３依存性翻訳後修飾を示す図である（１μｇ／レーン）。
図１１ｂに示した結果から明らかなように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に導入したＥＧＦＰ－ＵＢＬ３を抗ＧＦＰ－ビーズから免疫精製したとき、チューブリンはＵＢＬ３によって修飾され、非還元条件下でのみシフトバンドとして観察された。
【0116】
次に、分画遠心分離によって調製した分泌小胞中のＵＢＬ３によるチューブリンのソーティングを試験した。
図１１ｃは、モック（Ｍｏｃｋ）ベクター又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地からの細胞溶解物（ＣＬ）及びペレット（２Ｋ＝２，０００×ｇ；１０Ｋ＝１０，０００×ｇ；１００Ｋ×１００，０００×ｇ）を抗チューブリン抗体でブロットした結果を示す図である。
図１１ｃに示した結果から明らかなように、興味深いことに、チューブリンシグナルは、１００Ｋ画分ではＵＢＬ３発現によって特異的に増強されたが、２Ｋ画分又は１０Ｋ画分では増強されなかった。非還元条件下では、１００ＫのｓＥＶペレット中のチューブリンの大部分は還元条件下よりも高い分子量を有することが分かった。
図１１ｃは、モック（Ｍｏｃｋ）ベクター又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地からの細胞溶解物（ＣＬ）及びペレット（２Ｋ＝２，０００×ｇ；１０Ｋ＝１０，０００×ｇ；１００Ｋ×１００，０００×ｇ）を抗チューブリン抗体でブロットした結果を示す図である。
図１１ｃに示した結果から明らかなように、興味深いことに、チューブリンシグナルは、１００Ｋ画分ではＵＢＬ３発現によって特異的に増強されたが、２Ｋ画分又は１０Ｋ画分では増強されなかった。非還元条件下では、１００ＫのｓＥＶペレット中のチューブリンの大部分は還元条件下よりも高い分子量を有することが分かった。
【0117】
次に、ＵＢＬ３変異体を用いて、チューブリンのＵＢＬ３修飾とｓＥＶへのソーティングとの関係を試験した。
図１１ｄは、モックベクター、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａベクター又はＵＢＬ３Δ１ベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地からのｓＥＶを抗チューブリン抗体でブロットした結果を示す図である。
図１１ｄに示した結果から明らかなように、ｓＥＶにおけるチューブリンの増加は、野生型ＵＢＬ３に特異的であり、ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ及びＵＢＬ３Δ１変異体はそのような効果を示さなかったことがわかる。
また、図７ｄに示したように、血清ｓＥＶにおけるチューブリンのタンパク質レベルがＵＢＬ３ ＫＯマウスにおいて減少したことを観察している。
以上の結果から、ＵＢＬ３が翻訳後の内在性チューブリンを修飾し、ｓＥＶへのソーティングを制御すると結論づけることができる。
図１１ｄは、モックベクター、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａベクター又はＵＢＬ３Δ１ベクターでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地からのｓＥＶを抗チューブリン抗体でブロットした結果を示す図である。
図１１ｄに示した結果から明らかなように、ｓＥＶにおけるチューブリンの増加は、野生型ＵＢＬ３に特異的であり、ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ及びＵＢＬ３Δ１変異体はそのような効果を示さなかったことがわかる。
また、図７ｄに示したように、血清ｓＥＶにおけるチューブリンのタンパク質レベルがＵＢＬ３ ＫＯマウスにおいて減少したことを観察している。
以上の結果から、ＵＢＬ３が翻訳後の内在性チューブリンを修飾し、ｓＥＶへのソーティングを制御すると結論づけることができる。
【0118】
図１２ａは、プロテオミクス解析による３つの生物学的複製を有する３つの条件（３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３、３×Ｆｌａｇ空ベクター、又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ）でＵＢＬ３相互作用タンパク質として同定された疾患関連タンパク質のプロファイルを示す図である。
図１０ｃ及び図１２ａに示したように、少なくとも２２種の疾患関連分子がＵＢＬ３相互作用タンパク質として含まれることも見出された。
興味深いことに、これらの分子のいくつかは腫瘍形成及び腫瘍進行／転移、すなわちＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＲＢ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ｍＴＯＲ、ＴＳＣ２及びＡＰＬＰ２に関連している。
さらに、免疫応答分子（ＩＲＦ３及びＩＫＢＫＧ）、ｍＴＯＲシグナル伝達分子（ｍＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ及びＴＳＣ２）、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達分子（ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３）、ＢＭＰシグナル伝達分子（ＢＭＰＲ１Ａ及びＢＭＰＲ２）、並びに神経変性／ニューロン疾患に関与する分子（ＰＳＥＮ１、ＡＴＸＮ１０、ＨＩＰ１Ｒ、ＡＰＬＰ２及びＮＰＣ１）が、ＵＢＬ相互作用タンパク質として同定された。
これらの中でも、Ｒａｓファミリーメンバーは癌原遺伝子（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００７）．）であり、ｓＥＶにおいて豊富であると報告されている（Ｄｅｍｏｒｙ Ｂｅｃｋｌｅｒ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １２，３４３－３５５（２０１３）．）。
図１０ｃ及び図１２ａに示したように、少なくとも２２種の疾患関連分子がＵＢＬ３相互作用タンパク質として含まれることも見出された。
興味深いことに、これらの分子のいくつかは腫瘍形成及び腫瘍進行／転移、すなわちＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＲＢ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ｍＴＯＲ、ＴＳＣ２及びＡＰＬＰ２に関連している。
さらに、免疫応答分子（ＩＲＦ３及びＩＫＢＫＧ）、ｍＴＯＲシグナル伝達分子（ｍＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ及びＴＳＣ２）、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達分子（ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３）、ＢＭＰシグナル伝達分子（ＢＭＰＲ１Ａ及びＢＭＰＲ２）、並びに神経変性／ニューロン疾患に関与する分子（ＰＳＥＮ１、ＡＴＸＮ１０、ＨＩＰ１Ｒ、ＡＰＬＰ２及びＮＰＣ１）が、ＵＢＬ相互作用タンパク質として同定された。
これらの中でも、Ｒａｓファミリーメンバーは癌原遺伝子（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００７）．）であり、ｓＥＶにおいて豊富であると報告されている（Ｄｅｍｏｒｙ Ｂｅｃｋｌｅｒ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １２，３４３－３５５（２０１３）．）。
【0119】
≪ＵＢＬ３修飾を介するＨ－ＲａｓのｓＥＶへのソーティング≫
そこで、モデルタンパク質としてＨ－Ｒａｓを用いて、ＵＢＬ３修飾を介するｓＥＶへのソーティングを調査した。
図１２ｂは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を外因性野生型Ｒａｓ又は発癌性ＲａｓＧ１２Ｖでトランスフェクトし、かつ３×Ｆｌａｇタグ付きＵＢＬ３又はＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａのいずれかでトランスフェクトした結果を示す図である。図中、矢印はＵＢＬ３修飾Ｒａｓ又はＲａｓＧ１２Ｖを示す。
細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体により免疫沈降（ＩＰ）に供し、得られた免疫沈降物を抗Ｒａｓ抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。２×試料緩衝液（βＭＥなし）をビーズに加え、ビーズを３分間煮沸した（βＭＥ－）。試料の一部を２－メルカプトエタノール（βＭＥ＋）で処理した。
図１２ｂに示した結果から明らかなように、外因性野生型Ｒａｓ及び構成的に活性な発癌性ＲａｓＧ１２Ｖ変異体（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）．）がＵＢＬ３と相互作用し、非還元条件下でのみシフトしたバンドとして観察された。
そこで、モデルタンパク質としてＨ－Ｒａｓを用いて、ＵＢＬ３修飾を介するｓＥＶへのソーティングを調査した。
図１２ｂは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を外因性野生型Ｒａｓ又は発癌性ＲａｓＧ１２Ｖでトランスフェクトし、かつ３×Ｆｌａｇタグ付きＵＢＬ３又はＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａのいずれかでトランスフェクトした結果を示す図である。図中、矢印はＵＢＬ３修飾Ｒａｓ又はＲａｓＧ１２Ｖを示す。
細胞溶解物を抗Ｆｌａｇ抗体により免疫沈降（ＩＰ）に供し、得られた免疫沈降物を抗Ｒａｓ抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。２×試料緩衝液（βＭＥなし）をビーズに加え、ビーズを３分間煮沸した（βＭＥ－）。試料の一部を２－メルカプトエタノール（βＭＥ＋）で処理した。
図１２ｂに示した結果から明らかなように、外因性野生型Ｒａｓ及び構成的に活性な発癌性ＲａｓＧ１２Ｖ変異体（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）．）がＵＢＬ３と相互作用し、非還元条件下でのみシフトしたバンドとして観察された。
【0120】
図１２ｃは、モックベクター又は野生型Ｒａｓベクターでトランスフェクトし、かつモックベクター又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３ベクターのいずれかでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地からの細胞溶解物及びｓＥＶを抗Ｒａｓ抗体でブロットした結果を示す図である。
図１２ｃに示した結果から明らかなように、外因性野生型Ｒａｓタンパク質は、ＵＢＬ３により、より多くｓＥＶへソーティングされたことが分かる。
図１２ｃに示した結果から明らかなように、外因性野生型Ｒａｓタンパク質は、ＵＢＬ３により、より多くｓＥＶへソーティングされたことが分かる。
【0121】
図１０ｄは、ｓＥＶペレットを抗Ｒａｓ抗体でブロットした結果を示す図である。
図１０ｄに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａではなく野生型ＵＢＬ３が、ｓＥＶへのＲａｓＧ１２Ｖのソーティングを増強することがわかる。
図１０ｄに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａではなく野生型ＵＢＬ３が、ｓＥＶへのＲａｓＧ１２Ｖのソーティングを増強することがわかる。
【0122】
≪レシピエント細胞（ｓＥＶを受け取る側の細胞）におけるＲａｓシグナル伝達の活性化試験≫
ＵＢＬ３及び発癌性ＲａｓＧ１２Ｖをカプセル化したｓＥＶがレシピエント細胞におけるＲａｓシグナル伝達の活性化を引き起こすか否かを調べるために、モック、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａのいずれかと、ＲａｓＧ１２ＶでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞から精製したＰＫＨ６７標識ｓＥＶとをレシピエントＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に導入した。
レシピエント細胞におけるＲａｓ活性化の指標として、下流のシグナル伝達分子であるＥＲＫのリン酸化レベルを測定した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）．）。
ＰＫＨ６７標識ｓＥＶ取り込み細胞におけるリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）活性を抗体染色により試験した。
モック、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４ＡのいずれかとＲａｓＧ１２ＶとでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地から精製したｓＥＶ、又はモック及び３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３でトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地から精製したｓＥＶをＰＫＨ６７色素（図１０ｅにおける白色）で標識し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に添加した。
ＵＢＬ３及び発癌性ＲａｓＧ１２Ｖをカプセル化したｓＥＶがレシピエント細胞におけるＲａｓシグナル伝達の活性化を引き起こすか否かを調べるために、モック、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａのいずれかと、ＲａｓＧ１２ＶでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞から精製したＰＫＨ６７標識ｓＥＶとをレシピエントＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に導入した。
レシピエント細胞におけるＲａｓ活性化の指標として、下流のシグナル伝達分子であるＥＲＫのリン酸化レベルを測定した（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）．）。
ＰＫＨ６７標識ｓＥＶ取り込み細胞におけるリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）活性を抗体染色により試験した。
モック、３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３又は３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４ＡのいずれかとＲａｓＧ１２ＶとでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地から精製したｓＥＶ、又はモック及び３×Ｆｌａｇ－ＵＢＬ３でトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の馴化培地から精製したｓＥＶをＰＫＨ６７色素（図１０ｅにおける白色）で標識し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に添加した。
【0123】
（ＰＫＨ６７標識ｓＥＶの移送）
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞から精製したｓＥＶをＰＫＨ６７緑色蛍光キット（Ｓｉｇｍａ社製、ＰＫＨ６４ＧＬ－１ＫＴ）で標識した。ｓＥＶを２μＭＰＫＨ６７と共に５分間インキュベートし、１００ｋＤａフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、ＶＮ０１Ｈ４２）を用いて５回洗浄して過剰の色素を除去した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、２４ウェルプレート中のポリ－Ｌ－リシン被覆カバーガラス上に１２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩付着させ、次いでＰＫＨ６７標識ｓＥＶとインキュベートした。１２時間後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで１５分間固定し、５％ヤギ血清及び０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳで２０分間浸透／ブロックし、抗ｐＥＲＫ抗体と４℃１８時間、二次抗体と１時間インキュベートし、Ａｑｕａ－Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてマウントした。データをフィジー（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて分析し、ＰＫＨ６７標識ｓＥＶが取り込まれた細胞におけるｐＥＲＫシグナルの値は、核に隣接する細胞質の領域において２．５～５μｍ２の領域にわたって測定された平均シグナル強度として提示され、次いで、各画像において、ＰＫＨ６７標識ｓＥＶが取り込まれていない２つの隣接する細胞のｐＥＲＫの平均値に対して正規化した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞から精製したｓＥＶをＰＫＨ６７緑色蛍光キット（Ｓｉｇｍａ社製、ＰＫＨ６４ＧＬ－１ＫＴ）で標識した。ｓＥＶを２μＭＰＫＨ６７と共に５分間インキュベートし、１００ｋＤａフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、ＶＮ０１Ｈ４２）を用いて５回洗浄して過剰の色素を除去した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、２４ウェルプレート中のポリ－Ｌ－リシン被覆カバーガラス上に１２０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、一晩付着させ、次いでＰＫＨ６７標識ｓＥＶとインキュベートした。１２時間後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳで１５分間固定し、５％ヤギ血清及び０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳで２０分間浸透／ブロックし、抗ｐＥＲＫ抗体と４℃１８時間、二次抗体と１時間インキュベートし、Ａｑｕａ－Ｐｏｌｙ／Ｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてマウントした。データをフィジー（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて分析し、ＰＫＨ６７標識ｓＥＶが取り込まれた細胞におけるｐＥＲＫシグナルの値は、核に隣接する細胞質の領域において２．５～５μｍ２の領域にわたって測定された平均シグナル強度として提示され、次いで、各画像において、ＰＫＨ６７標識ｓＥＶが取り込まれていない２つの隣接する細胞のｐＥＲＫの平均値に対して正規化した。
【0124】
（結果）
図１０ｅは、ＰＫＨ６７標識ｓＥＶ組み込みＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）を示す図である。
図１０ｆは、各プロットは、図１０ｅ中の各画像からの２つの隣接するＰＫＨ６７標識ｓＥＶ非取り込み細胞におけるｐＥＲＫの平均値に対して正規化したＰＫＨ６７標識ｓＥＶｓ組み込み細胞におけるｐＥＲＫ蛍光を示す図である。ｎ数は１８～２１であり、＊＊は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの多重比較検定によるｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
図１０ｅは、ＰＫＨ６７標識ｓＥＶ組み込みＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるリン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）を示す図である。
図１０ｆは、各プロットは、図１０ｅ中の各画像からの２つの隣接するＰＫＨ６７標識ｓＥＶ非取り込み細胞におけるｐＥＲＫの平均値に対して正規化したＰＫＨ６７標識ｓＥＶｓ組み込み細胞におけるｐＥＲＫ蛍光を示す図である。ｎ数は１８～２１であり、＊＊は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの多重比較検定によるｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【0125】
図１０ｅ及びｆに示した結果から明らかなように、野生型ＵＢＬ３及びＲａｓＧ１２ＶでトランスフェクトしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞から精製したｓＥＶが、ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ及びＲａｓＧ１２Ｖでトランスフェクトした細胞からのｓＥＶと比較してレシピエント細胞におけるｐＥＲＫのレベルを有意に増強することがわかる。
これらの結果から、ＵＢＬ３修飾によるｓＥＶへのＲａｓＧ１２Ｖのソーティングの増加は、レシピエント細胞におけるＲａｓシグナル伝達の活性化を増強することがわかる。
これらの結果から、ＵＢＬ３修飾によるｓＥＶへのＲａｓＧ１２Ｖのソーティングの増加は、レシピエント細胞におけるＲａｓシグナル伝達の活性化を増強することがわかる。
【0126】
図１０ｃ～ｆの結果、すなわち、少なくとも２２種の疾患関連分子を含む２つのＣ末端システイン残基に依存する１，２４１種のＵＢＬ３相互作用タンパク質を同定し、発癌性ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質はＵＢＬ３修飾により、より多くｓＥＶにソーティングされ、ソーティングされたｓＥＶによりレシピエント細胞の状態が変化した結果から、ＵＢＬ３修飾の阻害は、ｓＥＶ関連障害の新規治療標的になり得ることが示唆される。
【0127】
≪比較例≫
ＵＢＬ３以外の他のＵＢＬを用いて比較試験を行った。
図１３ａは、ＥＧＦＰ－ユビキチン、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ１、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ２又はＥＧＦＰ－ＵＢＬ３のいずれかでトランスフェクトし、ＭＶＢマーカー（ＣＤ６３）で共染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的な画像を示す図である。
図１３ｂは、図１３ａにおけるＥＧＦＰ－ユビキチン、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ１、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ２及びＥＧＦＰ－ＵＢＬ３の蛍光強度の定量分析結果を示す図である（ｎ＝１０×５）。図１３ｂ中、＊はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの多重比較検定によるｐ＜０．０５を示し、＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
図１３ｃは、ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ－ユビキチン、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ１又はＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ２ではなく、ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３だけが、細胞培養培地のｓＥＶにおいて選択的にエンリッチされたことを示す図（サンプルをロードする前に、サンプルをβＭＥで煮沸した。）である。
図１３ａ～ｃに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３とは異なり、ユビキチン、ＳＵＭＯ１、及びＳＵＭＯ２等の他のＵＢＬは、ＭＶＢ又はｓＥＶのいずれにおいても豊富ではないことがわかる。
ＵＢＬ３以外の他のＵＢＬを用いて比較試験を行った。
図１３ａは、ＥＧＦＰ－ユビキチン、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ１、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ２又はＥＧＦＰ－ＵＢＬ３のいずれかでトランスフェクトし、ＭＶＢマーカー（ＣＤ６３）で共染色されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の代表的な画像を示す図である。
図１３ｂは、図１３ａにおけるＥＧＦＰ－ユビキチン、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ１、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ２及びＥＧＦＰ－ＵＢＬ３の蛍光強度の定量分析結果を示す図である（ｎ＝１０×５）。図１３ｂ中、＊はＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ／Ｄｕｎｎの多重比較検定によるｐ＜０．０５を示し、＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
図１３ｃは、ＥＧＦＰ、ＥＧＦＰ－ユビキチン、ＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ１又はＥＧＦＰ－ＳＵＭＯ２ではなく、ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３だけが、細胞培養培地のｓＥＶにおいて選択的にエンリッチされたことを示す図（サンプルをロードする前に、サンプルをβＭＥで煮沸した。）である。
図１３ａ～ｃに示した結果から明らかなように、ＵＢＬ３とは異なり、ユビキチン、ＳＵＭＯ１、及びＳＵＭＯ２等の他のＵＢＬは、ＭＶＢ又はｓＥＶのいずれにおいても豊富ではないことがわかる。
【0128】
≪ＵＢＬ３のｓＥＶへのタンパク質送達のためのタグとして機能試験≫
ＵＢＬ３がｓＥＶへのタンパク質送達のための有用なタグとして機能するか否かを試験した。結果を図１４に示す。ロードする前に、試料をβＭＥで煮沸した。同量のタンパク質をゲル上にロードした（細胞溶解液：２０μｇ／レーン；ｓＥＶ：１μｇ／レーン）。
図中下パネルは、ウェスタンブロット分析後、ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙで染色したことを示す。
図１４に示した結果から明らかなように、ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ又はＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａによってタグ付けされたビオチン化タンパク質ではなく、ＵＢＬ３によってタグ付けされたＥＧＦＰ－ＵＢＬ３タンパク質（左パネル）及びＵＢＬ３によってタグ付けされたビオチン化タンパク質（右パネル）は、細胞培養培地のｓＥＶに選択的に蓄積したことが分かる。
上記結果から、ＵＢＬ３がｓＥＶへのタンパク質の送達のためのタグとして役立つことを確認された。
すなわち、無関係のタンパク質であっても、ＵＢＬ３タグ付けによってｓＥＶにソーティングされることが分かった。
したがって、他のどのようなタイプのｓＥＶ関連疾患に対しても、ＵＢＬ３は、薬剤の新規な媒体として作用するように改変されたｓＥＶの生成のための有用なツールとして役立ち得るといえる。
ＵＢＬ３がｓＥＶへのタンパク質送達のための有用なタグとして機能するか否かを試験した。結果を図１４に示す。ロードする前に、試料をβＭＥで煮沸した。同量のタンパク質をゲル上にロードした（細胞溶解液：２０μｇ／レーン；ｓＥＶ：１μｇ／レーン）。
図中下パネルは、ウェスタンブロット分析後、ゲルをＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙで染色したことを示す。
図１４に示した結果から明らかなように、ＥＧＦＰ－ＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａ又はＵＢＬ３Ｃ１１３／１１４Ａによってタグ付けされたビオチン化タンパク質ではなく、ＵＢＬ３によってタグ付けされたＥＧＦＰ－ＵＢＬ３タンパク質（左パネル）及びＵＢＬ３によってタグ付けされたビオチン化タンパク質（右パネル）は、細胞培養培地のｓＥＶに選択的に蓄積したことが分かる。
上記結果から、ＵＢＬ３がｓＥＶへのタンパク質の送達のためのタグとして役立つことを確認された。
すなわち、無関係のタンパク質であっても、ＵＢＬ３タグ付けによってｓＥＶにソーティングされることが分かった。
したがって、他のどのようなタイプのｓＥＶ関連疾患に対しても、ＵＢＬ３は、薬剤の新規な媒体として作用するように改変されたｓＥＶの生成のための有用なツールとして役立ち得るといえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】