7285495 二重特異的抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-25

(45)【発行日】2023-06-02

(54)【発明の名称】二重特異的抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20230526BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20230526BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230526BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230526BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230526BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230526BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20230526BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230526BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230526BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230526BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230526BHJP

【ＦＩ】

C07K16/30

C12N15/13

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61P35/02

A61K45/00

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61K31/7088

A61K35/12

A61K48/00

C12N15/63 Z ZNA

【請求項の数】 70

(21)【出願番号】P 2022512232

(86)(22)【出願日】2021-03-29

(86)【国際出願番号】 JP2021013378

(87)【国際公開番号】W WO2021200857

(87)【国際公開日】2021-10-07

【審査請求日】2023-02-24

(31)【優先権主張番号】P 2020061476

(32)【優先日】2020-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(73)【特許権者】

【識別番号】307010166

【氏名又は名称】第一三共株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】珠玖 洋

(72)【発明者】

【氏名】赤堀 泰

(72)【発明者】

【氏名】田中 健人

(72)【発明者】

【氏名】谷津 彩香

(72)【発明者】

【氏名】市川 淳也

(72)【発明者】

【氏名】大塚 敏明

(72)【発明者】

【氏名】上妻 志保

(72)【発明者】

【氏名】橋本 隆二

(72)【発明者】

【氏名】中山 麻紀子

(72)【発明者】

【氏名】篠崎 直也

(72)【発明者】

【氏名】中村 健介

(72)【発明者】

【氏名】渡辺 一郎

(72)【発明者】

【氏名】古薗 信二

【審査官】松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５２５９７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１０／１０６４３１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１８／１１７２３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５２０５９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】PNAS，2009年，Vol.106, No.14, p.5784-5788

【文献】Eur. J. Immunol.，2004年，Vol.34, p.2919-2929

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５３で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号５３で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は
配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の１６１番目～２７１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片。

【請求項2】

ｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗体又はその結合断片。

【請求項3】

配列番号５３で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、又は
配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２１番目～２７１番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
である、請求項２記載の抗体又はその結合断片。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片をコードするポリヌクレオチド。

【請求項5】

請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項6】

請求項４に記載のポリヌクレオチド又は請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項7】

（ｉ）請求項６に記載の宿主細胞を培養する工程、及び、（ii）工程（i）で得られた培養物から抗体又はその結合断片を精製する工程を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片を製造する方法。

【請求項8】

請求項７に記載の方法により得られた、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片。

【請求項9】

下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有し、ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯに結合する抗体又はその結合断片：
（ｉ）請求項３記載の抗体又はその結合断片が認識するＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ上の部位に結合する；
（ｉｉ）請求項３記載の抗体又はその結合断片と、ヒトＬＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯへの結合において競合する。

【請求項10】

請求項１～３、８及び９のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、又は請求項６に記載の細胞を有効成分として含む医薬組成物。

【請求項11】

請求項１～３、８及び９のいずれか１項に記載の抗体又はその結合断片を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する分子。

【請求項12】

多重特異性抗体である、請求項１１記載の分子。

【請求項13】

二重特異性抗体である、請求項１１記載の分子。

【請求項14】

ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の分子。

【請求項15】

ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、
（CCH1）配列番号１４１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（CCH2）配列番号１４２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２若しくは配列番号１４２で表されるアミノ酸配列において、３番目のアミノ酸がＮ又はＳであるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
（CCH3）配列番号１４３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
（CCL1）配列番号１４４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（CCL2）配列番号１４５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２若しくは配列番号１４５で表されるアミノ酸配列において、２番目のアミノ酸がＮであるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、並びに
（CCL3）配列番号１４６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
を含む、ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項１４に記載の分子。

【請求項16】

ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、
（CH1）配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH2）配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH3）配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH4）配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH5）配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH6）配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH7）配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２７２番目～３８９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH8）配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２７７番目～３９４番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、若しくは
（CH9）配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２７７番目～３９４番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、並びに、
（CL1）配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL2）配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL3）配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL4）配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL5）配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL6）配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL7）配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の４０５番目～５１１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL8）配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の４１０番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、若しくは
（CL9）配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の４１０番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
を含む、請求項１５に記載の分子。

【請求項17】

ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、
（CH1CL1）配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH2CL2）配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH3CL3）配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH4CL4）配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH5CL5）配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH6CL6）配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH7CL7）配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２７２番目～３８９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の４０５番目～５１１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH8CL8）配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２７７番目～３９４番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の４１０番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
（CH9CL9）配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２７７番目～３９４番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の４１０番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を含む、請求項１６に記載の分子。

【請求項18】

ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の分子。

【請求項19】

ｓｃＦｖが、
（CS1）配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の２番目～２４３番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
（CS2）配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の２番目～２４１番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
（CS3）配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の２番目～２４３番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
（CS4）配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の２番目～２４１番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
（CS5）配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の２番目～２４３番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
（CS6）配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の２番目～２４３番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
（CS7）配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２７２番目～５１１番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
（CS8）配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２７７番目～５１６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、若しくは
（CS9）配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２７７番目～５１６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
を含む、請求項１８に記載の分子。

【請求項20】

Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ及びＦｃ領域（ｉ）をその順に含んでなる第１のポリペプチド；並びに、
Ｆｃ領域（ｉｉ）を含む第２ポリペプチドを含み、好適には、Ｆｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合してなる、請求項１４～１９のいずれか１項に記載の分子。

【請求項21】

ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項１記載のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項２０記載の分子。

【請求項22】

ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項２記載のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項２０記載の分子。

【請求項23】

ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項３記載のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項２０記載の分子。

【請求項24】

ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項１５記載のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の分子。

【請求項25】

ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項１６記載のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の分子。

【請求項26】

ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項１７に記載のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の分子。

【請求項27】

ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項１８又は１９に記載のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の分子。

【請求項28】

配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列を含む、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の分子。

【請求項29】

配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１６番目のアミノ酸配列、及び配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の分子。

【請求項30】

第１ポリペプチドが、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の５２９番目～７４５番目のアミノ酸配列を含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の分子。

【請求項31】

第１ポリペプチドが、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の５３４番目～７５０番目のアミノ酸配列、又は配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の５３４番目～７５０番目のアミノ酸配列を含む、請求項２０～２９のいずれか１項に記載の分子。

【請求項32】

第１ポリペプチドが、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる、請求項２８又は３０記載の分子。

【請求項33】

第１ポリペプチドが、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列からなる、又は配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列からなる、請求項２９又は３１記載の分子。

【請求項34】

第２ポリペプチドが、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２０～３３のいずれか１項に記載の分子。

【請求項35】

Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合する抗体重鎖の可変領域及び定常領域ＣＨ１並びに免疫グロブリンＦｃ領域（ｉ）をその順で含んでなる第１ポリペプチド、免疫グロブリンのヒンジ領域及びＦｃ領域（ｉｉ）を含んでなる第２ポリペプチド、並びに、可変領域及び定常領域からなる抗体軽鎖を含む第３ポリペプチドを含み、好適には、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドがＦｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合しており、第１ポリペプチドが抗体重鎖の可変領域及び定常領域ＣＨ１において第３ポリペプチドと会合してなる、
請求項１４～１７のいずれか１項に記載の分子。

【請求項36】

第３ポリペプチドが、可変領域及び定常領域からなる、該ＣＤ３に特異的に結合する抗体軽鎖を含む、請求項３５記載の分子。

【請求項37】

ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項１記載のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項３５又は３６に記載の分子。

【請求項38】

ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項２記載のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項３５又は３６に記載の分子。

【請求項39】

ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである請求項３記載のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項３５又は３６に記載の分子。

【請求項40】

該ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、Ｆａｂである、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の分子。

【請求項41】

該ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂが、Ｆａｂである請求項１５記載のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項４０に記載の分子。

【請求項42】

該ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂが、Ｆａｂである請求項１６記載のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項４０に記載の分子。

【請求項43】

該ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂが、Ｆａｂである請求項１７記載のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、請求項４０に記載の分子。

【請求項44】

第１ポリペプチドが、配列番号１６０で表されるアミノ酸配列の２１番目～３９４番目のアミノ酸配列を含む、請求項３５～４３のいずれか１項に記載の分子。

【請求項45】

第１ポリペプチドが、下記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３５～４４のいずれか１項に記載の分子：
（ｉ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列の２０番目～７２４番目のアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号１９７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７１９番目のアミノ酸配列。

【請求項46】

第２ポリペプチドが、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の分子。

【請求項47】

第３ポリペプチドが、配列番号１６１で表されるアミノ酸配列の２１番目～１２７番目のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３５～４６のいずれか１項に記載の分子。

【請求項48】

第３ポリペプチドが、配列番号１６１で表されるアミノ酸配列の２１番目～２３３番目のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３５～４７のいずれか１項に記載の分子。

【請求項49】

請求項１１～４８のいずれか１項に記載の分子であって、該分子に含まれる１つ又は２つ以上のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、該配列のカルボキシル末端から１つ又は２つのアミノ酸が欠失してなる、該分子。

【請求項50】

請求項１１～４９のいずれか１項に記載の分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項51】

請求項５０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項52】

請求項５０に記載のポリヌクレオチド又は請求項５１に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項53】

(i) 請求項５２に記載の宿主細胞を培養する工程、及び (ii)工程(i)で得られた培養物から抗体又はその結合断片を精製する工程を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びヒトＣＤ３に特異的に結合する分子を製造する方法。

【請求項54】

請求項５３に記載の方法により得られる、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びヒトＣＤ３に特異的に結合する分子。

【請求項55】

請求項１１～４９及び５４のいずれか１項に記載の分子、請求項５０に記載のポリヌクレオチド、請求項５１に記載のベクター、又は請求項５２に記載の宿主細胞を有効成分として含む医薬組成物。

【請求項56】

抗がん剤である、請求項１０又は５５記載の医薬組成物。

【請求項57】

がんが、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん（非小細胞肺がん（腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん）、小細胞肺がん）、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、精巣がん及び卵巣がんからなる群から選択される１つ又は２つ以上である、請求項５６記載の医薬組成物。

【請求項58】

他の薬剤と組み合わせて使用される、請求項１０及び５５～５７のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項59】

Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ及びＦｃ領域（ｉ）をその順に含んでなる第１のポリペプチド；並びに、Ｆｃ領域（ｉｉ）を含む第２ポリペプチドを含み、
Ｆｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合してなり、
第１のポリペプチドが、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列、若しくは、配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列のカルボキシル末端から１つ又は２つのアミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を含み、
第２のポリペプチドが、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目のアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列のカルボキシル末端から１つ又は２つのアミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を含んでなる、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びヒトＣＤ３に特異的に結合する多重特異性分子。

【請求項60】

Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合する抗体重鎖の可変領域及び定常領域ＣＨ１並びに免疫グロブリンＦｃ領域（ｉ）をその順で含んでなる第１ポリペプチド、免疫グロブリンのヒンジ領域及びＦｃ領域（ｉｉ）を含んでなる第２ポリペプチド、並びに、可変領域及び定常領域からなる抗体軽鎖を含む第３ポリペプチドを含み、
第１ポリペプチドと第２ポリペプチドがＦｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合しており、第１ポリペプチドが抗体重鎖の可変領域及び定常領域ＣＨ１において第３ポリペプチドと会合してなり、
第１のポリペプチドが、配列番号１６０で表されるアミノ酸配列の２０番目～７２４番目のアミノ酸配列若しくは配列番号１９７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７１９番目のアミノ酸配、又は、該アミノ酸配列のカルボキシル末端から１つ又は２つのアミノ酸が欠失してなるアミノ酸配列を含み、
第２のポリペプチドが、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目のアミノ酸配列を含み、
第３ポリペプチドが、配列番号１６１で表されるアミノ酸配列の２１番目～１２７番目のアミノ酸配列、又は、配列番号１６１で表されるアミノ酸配列の２１番目～２３３番目のアミノ酸配列を含んでなる、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びヒトＣＤ３に特異的に結合する多重特異性分子。

【請求項61】

請求項５９又は６０に記載の分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項62】

請求項６１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項63】

請求項６１に記載のポリヌクレオチド又は請求項６２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項64】

(i) 請求項６３に記載の宿主細胞を培養する工程、及び (ii)工程(i)で得られた培養物から抗体又はその結合断片を精製する工程を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びヒトＣＤ３に特異的に結合する多重特異性分子を製造する方法。

【請求項65】

請求項６４に記載の方法により得られる、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びヒトＣＤ３に特異的に結合する多重特異性分子。

【請求項66】

請求項５９、６０又は６５に記載の分子、請求項６１に記載のポリヌクレオチド、請求項６２に記載のベクター、又は請求項６３に記載の宿主細胞を有効成分として含む医薬組成物。

【請求項67】

抗がん剤である、請求項６６記載の医薬組成物。

【請求項68】

がんが、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん（非小細胞肺がん（腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん）、小細胞肺がん）、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、精巣がん及び卵巣がんからなる群から選択される１つ又は２つ以上である、請求項６７記載の医薬組成物。

【請求項69】

他の薬剤と組み合わせて使用される、請求項６６～６８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項70】

他の薬剤を含む、請求項６６～６９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんの治療に有用な抗体、二重特異的抗体等に関する。

【背景技術】

【0002】

ＮＹ－ＥＳＯ－１はＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＳＥＲＥＸ）法により食道がんから同定された分子であり（非特許文献１）、ＬＡＧＥ－１は別名ＮＹ－ＥＳＯ－２とも呼ばれ、腫瘍ｃＤＮＡライブラリーのＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓから同定された分子である（非特許文献２）。いずれの分子も正常組織においては精巣に発現は限局していることが知られているが、機能は明らかになっていない。ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１は、メラノーマ、肺がん、膀胱がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨髄腫など幅広いがん種での発現が報告されていることから（非特許文献３）、がんとの関連性が示唆されている。また、悪性度との相関に関して、ＮＹ－ＥＳＯ－１はメラノーマの原発巣よりも転移巣での発現が高い（非特許文献４）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１は尿路上皮がんにおいて初期のがんと比較して進行がんにおいて発現が高い（非特許文献５）、ＮＹ－ＥＳＯ－１は染色体異常を有する高リスクの骨髄腫において、染色体正常の骨髄腫よりも発現が高い（非特許文献６）、などの報告がある。これらの情報から、ＮＹ－ＥＳＯ－１やＬＡＧＥ－１はがん特異性の高い分子として注目されており、がんワクチン療法の創薬標的として多くの研究開発がなされているが、現在までに承認を受けた医薬品はない。

【0003】

ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１の１５７番目から１６５番目の９－ｍｅｒのＮＹ－ＥＳＯペプチド：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣはＨＬＡ（Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）－Ａ２と複合体（ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯペプチド複合体）を形成し、細胞外に提示されることが知られている（非特許文献７）。上述したように、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１の発現はがん特異的であることから、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯペプチド複合体はＨＬＡ－Ａ２陽性、且つＮＹ－ＥＳＯ－１あるいはＬＡＧＥ－１陽性のがん細胞上においてのみ存在するがん特異的な治療標的であることが示唆されている（非特許文献８）。そして、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯペプチド複合体に結合する分子として、ＴＣＲ（特許文献１、２）や抗体（特許文献３、特許文献８）の報告がある。

【0004】

がん標的分子に対する結合分子の用途の一つとして、Ｔ細胞をがん細胞へ誘導し細胞傷害による抗腫瘍効果を示すＴ細胞リダイレクションをメカニズムとしたＣＤ３二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体がある（非特許文献９、１０）。現在上市されているＣＤ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体医薬品として、ＣＤ１９に対するＢｉＴＥ（ｂｉｓｐｅｃｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）であるＢｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂが挙げられる。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）で承認され、他血液がんを対象とした臨床試験が進行中である。ただしｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃの抗体フォーマットとしてはＦｃ領域を持たないｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）であり、治療用抗体として通常用いられるＩｇＧ型の抗体に比べ、患者に投与された際の血中半減期は非常に短い（非特許文献１１）。

【0005】

血中半減期がＩｇＧ型の抗体と同程度のヘテロダイマーＦｃ領域を有する二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体のとして、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ、ＣｒｏｓｓＭＡｂ、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）など（特許文献４、５、６、７）様々な抗体フォーマットを用いたＣＤ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体の研究や臨床試験が進行中であり、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯペプチド複合体に対する抗体を利用したＣＤ３ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体が報告されている（非特許文献１２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】ＷＯ２００５／１１３５９５

【文献】ＷＯ２０１７／１０９４９６

【文献】ＷＯ２０１０／１０６４３１

【文献】ＷＯ１９９８／０５０４３１

【文献】ＷＯ２００６／１０６９０５

【文献】ＷＯ２０１１／０２８９５２

【文献】ＷＯ２０１１／１３１７４６

【文献】ＷＯ２０２１／００３３５７

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．；９４（５）：１９１４－８（１９９７）．

【文献】Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．；７６（６）：９０３－８（１９９８）．

【文献】Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．；８４（３）：３０３－１７（２００６）．

【文献】Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ．；９８（２）：７６－８０（２００１）．

【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；６１（１２）：４６７１－４（２００１）．

【文献】Ｂｌｏｏｄ．；１０５（１０）：３９３９－４４（２００５）．

【文献】Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．；１８７（２）：２６５－７０（１９９８）．

【文献】Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１７６（１２）：７３０８－１６（２００６）．

【文献】Ｎａｔｕｒｅ；３１４ （６０１２）；６２８－３１（１９８５）．

【文献】Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；４（２）；１５９－７３（１９８９）．

【文献】Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ．；１０；７５７－７６５（２０１６）．

【文献】第２１回がん免疫学会抄録集；Ｏ１３－４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、抗腫瘍剤として用いることができる新規な抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ抗体、及び該抗体等を含むＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯに結合する分子を有効成分として含む抗腫瘍剤の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、新規な抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ抗体、及び該抗体等を含むＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯに結合する分子を創出し、本発明を完成した。

【0010】

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[１] 配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、若しくは配列番号５７で表されるアミノ酸配列において、７番目のアミノ酸がＷ及び／若しくは８番目のアミノ酸がＫであるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、並びに
配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、若しくは配列番号５９で表されるアミノ酸配列において、２番目のアミノ酸がＡ若しくはＳであるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片。

【0011】

[２] （ｉ） 配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
（ｉｉ） 配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列において、７番目のアミノ酸がＷであるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
（ｉｉｉ） 配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列において、２番目のアミノ酸がＡであるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（ｉｖ） 配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列において、２番目のアミノ酸がＳであるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、並びに、
（ｖ） 配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
配列番号５５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
配列番号５６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
配列番号５７で表されるアミノ酸配列において、７番目のアミノ酸がＷであり、８番目のアミノ酸がＫであるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、及び、
配列番号５９で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
の（ｉ）～（ｖ）のグループからなる群より選択される１つ又は２つ以上のグループのＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３を含む、[１]の抗体又はその結合断片。

【0012】

[３] 配列番号２７で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０のアミノ酸配列、又は３８若しくは３９で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号２７若しくは配列番号５２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６のアミノ酸配列、又は配列番号４０で表されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、[１]の抗体又はその結合断片。

【0013】

[４] (H1) 配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域
(H2) 配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H3) 配列番号２９で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H4) 配列番号２６で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H5) 配列番号２７で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H6) 配列番号２８で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H7) 配列番号３６で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H8) 配列番号４７で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H9) 配列番号４８で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H10) 配列番号５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H11) 配列番号５１で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H12) 配列番号５２で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H13) 配列番号５３で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(H14) 配列番号３０で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のからなる重鎖可変領域、若しくは、
（H15) 配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、並びに、
(L1) 配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L2) 配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L3) 配列番号２９で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L4) 配列番号２６で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L5) 配列番号２７で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L6) 配列番号２８で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L7) 配列番号３６で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L8) 配列番号４７で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L9) 配列番号４８で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L10) 配列番号５０で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L11) 配列番号５１で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L12) 配列番号５２で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L13) 配列番号５３で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(L14) 配列番号３０で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、若しくは、
（L15) 配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の１６１番目～２７１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
を含む、[１]の抗体又はその結合断片。

【0014】

[５] (H1L1) 配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H2L2) 配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H3L3) 配列番号２９で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２９で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H4L4) 配列番号２６で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H5L5) 配列番号２７で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２７で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H6L6) 配列番号２８で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H7L7) 配列番号３６で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３６で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H8L8) 配列番号４７で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４７で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H9L9) 配列番号４８で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４８で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H10L10) 配列番号５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号５０で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H11L11) 配列番号５１で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号５１で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H12L12) 配列番号５２で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号５２で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H13L13) 配列番号５３で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号５３で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(H14L14) 配列番号３０で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３０で表されるアミノ酸配列の１５６番目～２６６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
（H15L14) 配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２１番目～１４０番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の１６１番目～２７１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
を含む、[４]の抗体又はその結合断片。

【0015】

[６] ｓｃＦｖである、[１]～[５]のいずれかの抗体又はその結合断片。
[７] (s1) 配列番号７０で表されるアミノ酸配列の２１～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s2) 配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖ、
(s3) 配列番号２９で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s4) 配列番号２６で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s5) 配列番号２７で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s6) 配列番号２８で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s7) 配列番号３６で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s8) 配列番号４７で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s9) 配列番号４８で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s10) 配列番号５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s11) 配列番号５１で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s12) 配列番号５２で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s13) 配列番号５３で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(s14) 配列番号３０で表されるアミノ酸配列の２１番目～２６６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、又は
(s15) 配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２１番目～２７１番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
である、[６]の抗体又はその結合断片。

【0016】

[８] [１]～[７]のいずれかの抗体又はその結合断片をコードするポリヌクレオチド。
[９] [８]のポリヌクレオチドを含むベクター。
[１０] [８]のポリヌクレオチド又は[９]のベクターを含む宿主細胞。
[１１]（ｉ）[１０]の宿主細胞を培養する工程、及び、（ii）工程（i）で得られた培養物から抗体又はその結合断片を精製する工程を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片を製造する方法。
[１２] [１１]の方法により得られた、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片。
[１３] 下記（ｉ）又は（ｉｉ）記載の性質を有し、ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯに結合する抗体又はその結合断片：
（ｉ）［７］記載の抗体又はその結合断片が認識するＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ上の部位に結合する；
（ｉｉ）［７］記載の抗体又はその結合断片と、ヒＬＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯへの結合において競合する。
[１４] [１]～[７]、[１２]及び[１３]のいずれかの抗体又はその結合断片、[８]のポリヌクレオチド、[９]のベクター、又は[１０]の細胞を有効成分として含む医薬組成物。
[１５] [１]～[７]、[１２]及び[１３]のいずれかの抗体又はその結合断片を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する分子。
[１６] 多重特異性抗体である、[１５]の分子。
[１７] 二重特異性抗体である、[１５]の分子。
[１８] ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片を含む、[１５]～[１７]のいずれかの分子。

【0017】

[１９] ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、
（CCH1）配列番号１４１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（CCH2）配列番号１４２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２若しくは配列番号１４２で表されるアミノ酸配列において、３番目のアミノ酸がＮ又はＳであるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、
（CCH3）配列番号１４３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、
（CCL1）配列番号１４４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（CCL2）配列番号１４５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２若しくは配列番号１４５で表されるアミノ酸配列において、２番目のアミノ酸がＮであるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、並びに
（CCL3）配列番号１４６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３
を含む、ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[１８]の分子。

【0018】

[２０] ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、
(CH1) 配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(CH2) 配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(CH3) 配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(CH4) 配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(CH5) 配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
(CH6) 配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH7) 配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２７２番目～３８９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、
（CH8) 配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２７７番目～３９４番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、若しくは
（CH9) 配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２７７番目～３９４番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、並びに、
(CL1) 配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CL2) 配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CL3) 配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CL4) 配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CL5) 配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CL6) 配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL7) 配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の４０５番目～５１１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CL8) 配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の４１０番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、若しくは
（CL9) 配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の４１０番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
を含む、[１９]の分子。

【0019】

[２１] ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、
(CH1CL1) 配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CH2CL2) 配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CH3CL3) 配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CH4CL4) 配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４１番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CH5CL5) 配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(CH6CL6) 配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の２番目～１１９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の１３５番目～２４３番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH7CL7) 配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２７２番目～３８９番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２７２番目～３８９番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
（CH8CL8) 配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２７７番目～３９４番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の４１０番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は、
（CH9CL9) 配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２７７番目～３９４番目のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の４１０番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を含む、[２０]の分子。
[２２] ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、ｓｃＦｖである、[１８]～[２１]のいずれかの分子。

【0020】

[２３] ｓｃＦｖが、
(CS1) 配列番号１３６で表されるアミノ酸配列の２番目～２４３番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(CS2) 配列番号１３７で表されるアミノ酸配列の２番目～２４１番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(CS3) 配列番号１４７で表されるアミノ酸配列の２番目～２４３番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(CS4) 配列番号１３８で表されるアミノ酸配列の２番目～２４１番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(CS5) 配列番号１３９で表されるアミノ酸配列の２番目～２４３番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(CS6) 配列番号１４０で表されるアミノ酸配列の２番目～２４３番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(CS7) 配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２７２番目～５１１番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
(CS8) 配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２７７番目～５１６番目のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、若しくは
(CS9) 配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２７７番目～５１６のアミノ酸配列からなるｓｃＦｖ、
を含む、[２２]の分子。

【0021】

[２４] Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ及びＦｃ領域（ｉ）をその順に含んでなる第１のポリペプチド；並びに、
Ｆｃ領域（ｉｉ）を含む第２ポリペプチドを含み、好適には、Ｆｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合してなる、[１８]～[２３]のいずれかの分子。
[２５] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[１]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[２４]の分子。
[２６] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[２]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[２４]の分子。
[２７] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[３]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[２４]の分子。
[２８] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[４]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[２４]の分子。
[２９] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[５]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[２４]の分子。

【0022】

[３０] ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[１８]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[１９]～[２４]のいずれかの分子。
[３１] ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[１９]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[１９]～[２４]のいずれかの分子。
[３２] ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[２０]又は[２１]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[１９]～[２４]のいずれかの分子。
[３３] ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[２３]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[１９]～[２４]のいずれかの分子。

【0023】

[３４] 配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列及び配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、[２４]～[３３]のいずれかの分子。
[３５] 配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１６番目のアミノ酸配列、配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１６番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、[２４]～[３３]のいずれかの分子。
[３６] 第１ポリペプチドが、配列番号８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、８６、１４９又は１５０で表されるアミノ酸配列の５２９番目～７４５番目のアミノ酸配列を含む、[２４]～[３４]のいずれかの分子。
[３７] 第１ポリペプチドが、配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の５２９番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の５３４番目～７５０番目のアミノ酸配列、又は配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の５３４番目～７５０番目のアミノ酸配列を含む、[２４]～[３３]及び[３５]のいずれかの分子。

【0024】

[３８] 第１ポリペプチドが、配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列及び配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、[３４]又は[３６]の分子。
[３９] 第１ポリペプチドが、配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、又は配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、[３５]又は[３７]の分子。
[４０] 第２ポリペプチドが、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目のアミノ酸配列を含んでなる、[２４]～[３９]のいずれかの分子。

【0025】

[４１]第１ポリペプチド、第２ポリペプチド及び、第３ポリペプチドを含み、
第１ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ及びＦｃ領域（ｉ）を、その順に含んでなり、
第２ポリペプチドが、Ｆｃ領域（ｉｉ）を含む免疫グロブリン重鎖からなり、
第３ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖からなり、
好適には、第２ポリペプチドと第３ポリペプチドが会合しており、
第１ポリペプチドと第２ペプチドが、それぞれのＦｃ領域において会合している、
[１８]～[２３]のいずれかの分子。
[４２] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[１]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４１]の分子。
[４３] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[２]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４１]の分子。
[４４] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[３]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４１]の分子。
[４５] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[４]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４１]の分子。
[４６] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[５]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４１]の分子。

【0026】

[４７] ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[１８]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４２]～[４６]のいずれかの分子。
[４８] ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[１９]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４２]～[４６]のいずれかの分子。
[４９] ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[２０]又は[２１]に記載のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４２]～[４６]のいずれかの分子。
[５０] ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[２３]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[４２]～[４６]のいずれかの分子。
[５１] 第２ポリペプチドが、配列番号９９で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２０～２４２のアミノ酸配列を含む、[４１]～[５０]のいずれかの分子。
[５２] 第３ポリペプチドが配列番号１００で表されるアミノ酸配列を含む、[４１]～[５１]のいずれかの分子。

【0027】

[５３] 第１ポリペプチドが、
配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列及び配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、[４１]～[５２]のいずれかの分子

【0028】

[５４] 第１ポリペプチドが、配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列及び配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列及び配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、[４１]～[５３]のいずれかの分子。

【0029】

[５５] Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合する抗体重鎖の可変領域及び定常領域ＣＨ１並びに免疫グロブリンＦｃ領域（ｉ）をその順で含んでなる第１ポリペプチド、免疫グロブリンのヒンジ領域及びＦｃ領域（ｉｉ）を含んでなる第２ポリペプチド、並びに、可変領域及び定常領域からなる抗体軽鎖を含む第３ポリペプチドを含み、好適には、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドがＦｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合し、第１ポリペプチドが抗体重鎖の可変領域及び定常領域ＣＨ１において第３ポリペプチドと会合してなる、［１８］～［２３］のいずれか一つに記載の分子。
[５６] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[１]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[５５]の分子。
[５７] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[２]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[５５]の分子。
[５８] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[３]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[５５]の分子。
[５９] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[４]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[５５]の分子。
[６０] ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖが、ｓｃＦｖである[５]のヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[５５]の分子。
[６１] ＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片が、Ｆａｂである、[１８]～[２１]のいずれかの分子。
[６２] ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂが、Ｆａｂである[１８]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[５６]～[６１]のいずれかの分子。
[６３] ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂが、Ｆａｂである[１９]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[５６]～[６１]のいずれかの分子。
[６４] ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂが、Ｆａｂである[２０]又は[２１]のＣＤ３に特異的に結合する抗体又はその結合断片である、[５６]～[６１]のいずれかの分子。
[６５] 第１ポリペプチドが、配列番号１６０で表されるアミノ酸配列の２１番目～３９４番目のアミノ酸配列を含んでなる、[５５]～[６４]のいずれかの分子。
[６６] 第１ポリペプチドが、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、[５５]～[６５]のいずれかの分子：
（ｉ）配列番号１６０で表されるアミノ酸配列の２０番目～７２４番目のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１９７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７１９番目のアミノ酸配；
（ｉｉｉ）配列番号１９８で表されるアミノ酸配列２０番目～７１９番目のアミノ酸配列。
。
[６７] 第２ポリペプチドが、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目のアミノ酸配列を含んでなる、[５５]～[６６]のいずれかの分子。
[６８] 第３ポリペプチドが、配列番号１６１で表されるのアミノ酸配列の２１番目～１２７番目のアミノ酸配列を含んでなる、［５６］～［６７］のいずれかの分子。
[６９] 第３ポリペプチドが、配列番号１６１で表されるのアミノ酸配列の２１番目～２３３番目のアミノ酸配列を含んでなる、［５６］～［６８］のいずれかの分子。
[７０] ［１５］～［６９］のいずれかの分子であって、該分子に含まれる１つ又は２つ以上のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、該配列のカルボキシル末端から１つ又は２つのアミノ酸が欠失してなる、該分子。
[７１] [１５]～[７０]のいずれかの分子に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[７２] [７１]のポリヌクレオチドを含むベクター。
[７３] [７１]のポリヌクレオチド又は[７２]のベクターを含む宿主細胞。
[７４] (i) [７３]の宿主細胞を培養する工程、及び(ii)工程(i)で得られた培養物から抗体又はその結合断片を精製する工程を含む、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びヒトＣＤ３に特異的に結合する分子を製造する方法。
[７５] [７４]の方法により得られる、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びヒトＣＤ３に特異的に結合する分子。
[７６] [１５]～[７０]及び[７５]のいずれかの分子、[７１]のポリヌクレオチド、[７２]のベクター、又は[７３]の宿主細胞を有効成分として含む医薬組成物。
[７７] 抗がん剤である、[１４]又は[７６]の医薬組成物。
[７８] がんが、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん（非小細胞肺がん（腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん）、小細胞肺がん）、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、精巣がん及び卵巣がんからなる群から選択される１つ又は２つ以上である、[７７]の医薬組成物。
[７９] 他の薬剤と組み合わせて使用される、[７６]～[７８]のいずれかの医薬組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-061476号の開示内容を包含する。

【発明の効果】

【0030】

本発明によれば、ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯに結合する抗体、並びに、ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯに結合しかつＣＤ３に結合する新規な二重特異的抗体（二重特異的分子）が得られる。また、そのような抗体（分子）を有効成分として含有する新規な医薬組成物が得られる。該抗体、あるいは、該分子等は、細胞傷害活性を有しており、がん等の治療剤又は予防剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】図１は、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ ＮＹＡ－０００１、１１４３、１１５４、１１６３、２０２３、２０２７、２０３５、２０４４、２０４５、２０４７、２０４８、２０６０、２０６１、２１４３、ＮＹＣ－０００３、０００４の各種点変異ペプチド添加Ｔ２細胞に対する標準化ｇＭＦＩを示した表である。＊／下線は、各ｓｃＦｖのＮＹ－ＥＳＯペプチド添加Ｔ２細胞に対する標準化ｇＭＦＩと比較して半分以下であることを表す。

【図2A】図２Ａは、選択された相同性ペプチド情報を示した表である。ＮｅｔＭＨＣＰａｎ２．８によりＨＬＡ－Ａ０２０１に対する結合性を予測し、５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）として示した。

【図2B】図２Ｂは、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ ＮＹＡ－０００１、１１４３、１１５４、１１６３、２０２３、２０２７、２０３５、２０４４、２０４５、２０４７、２０４８、２０６０、２０６１、２１４３、ＮＹＣ－０００３、０００４の各種相同性ペプチド添加Ｔ２細胞に対する標準化ｇＭＦＩを示した表である。＊／下線は、各ｓｃＦｖのＤＭＳＯ添加Ｔ２細胞に対する標準化ｇＭＦＩと比較して大きい値であることを表す。

【図3】図３は、本実施例に示される抗体のフォーマットを示した図である。(a) ｓｃＦｖ：抗体Ｈ鎖可変領域（ＶＨ、後述）及び抗体Ｌ鎖可変領域（ＶＬ、後述）（いずれも白）をリンカーで繋げたフォーマットである。本実施例では抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ及びＣＤ３のｓｃＦｖを評価に用いた。(b) Ｆａｂ：ＶＨ（白）と抗体Ｈ鎖定常領域(ＣＨ１：市松模様)及びＶＬ（白）と抗体Ｌ鎖定常領域(横線)からなるフォーマットである。本実施例では抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ Ｆａｂ等を評価に用いた。(c) ｔａＦｖ：２種類のｓｃＦｖ（白と右上斜線）をリンカーでつなげたフォーマットである。本実施例では抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むｔａＦｖを評価に用いた。(d) ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型：ｔａＦｖのＣ末端側にヘテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃ（左上斜線）が付加し（第１ポリペプチドともいう）、もう一つのＦｃ（黒塗り：第２ポリペプチドともいう）とヘテロに会合したフォーマットである。本実施例では抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃを評価に用いた。(e) ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型：上記ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型にＦａｂを付加したフォーマットである。本実施例では抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むｔａＦｖ及びＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ Ｆａｂを用いたｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ等を評価に用いた。(f) ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型及びｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型に共通である第１ポリペプチドを示す。第１ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ及びＦｃ領域（ｉ）を、その順に含んでなる。(g) ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型の第２ポリペプチドを示す。第２ポリペプチドは、ヒンジ領域及びＦｃ領域（ｉｉ）を含んでなる。(h) ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型の第２ポリペプチドを示す。第２ポリペプチドは、ヒンジ領域及びＦｃ領域（ｉｉ）を含む免疫グロブリン重鎖を含んでなる。(i) ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型の第３ポリペプチドを示す。第３ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖を含んでなる。

【図4A】図４Ａは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００１９、ＮＹＦ－００２２、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００２７，ＮＹＦ－００３５、ＮＹＦ－００４４、ＮＹＦ－００４７が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4B】図４Ｂは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００５８が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4C】図４Ｃは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００４５、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０、ＮＹＦ－００６１が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4D】図４Ｄは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００１９、ＮＹＦ－００２２、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００２７，ＮＹＦ－００３５、ＮＹＦ－００４４、ＮＹＦ－００４７が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現ＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4E】図４Ｅは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００５８が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現ＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4F】図４Ｆは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００４５、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０、ＮＹＦ－００６１が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現ＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4G】図４Ｇは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００１９、ＮＹＦ－００２２、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００２７，ＮＹＦ－００３５、ＮＹＦ－００４４、ＮＹＦ－００４７が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＡＧＳ細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4H】図４Ｈは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００５８が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＡＧＳ細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4I】図４Ｉは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００４５、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０、ＮＹＦ－００６１が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＡＧＳ細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4J】図４Ｊは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００１９、ＮＹＦ－００２２、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００２７，ＮＹＦ－００３５、ＮＹＦ－００４４、ＮＹＦ－００４７が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＣＦＰＡＣ－１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4K】図４Ｋは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００５８が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＣＦＰＡＣ－１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図4L】図４Ｌは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００４５、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０、ＮＹＦ－００６１が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＣＦＰＡＣ－１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図5A】図５Ａは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００１９、ＮＹＦ－００４４、ＮＹＦ－００４７が、ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準誤差（ＮＹＦ－００４４ Ｄａｙ３２のみｎ＝４、その他はｎ＝５）を示す。

【図5B】図５Ｂは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００２２、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００２７、ＮＹＦ－００３５、ＮＹＦ－００５８が、ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５、Ｖｅｈｉｃｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ群のみｎ＝６）を示す。

【図5C】図５Ｃは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００４５、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０、ＮＹＦ－００６１が、ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）を示す。

【図6A】図６Ａは、本実施例に示される抗体のフォーマットを示した図である。(a) Ｈｙｂrｉｄ型：Ｆａｂ及びｓｃＦｖそれぞれのＣ末端側にへテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃ（斜線及び黒塗り）が付加し、２つのＦｃが会合したフォーマットである。本実施例では抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ Ｆａｂと抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＨｙｂrｉｄ型を評価に用いた。(b) Ｄｕａｌ型：２種類の異なるｓｃＦｖそれぞれのＣ末端側にへテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃ（左上斜線及び黒塗り）が付加し、２つのＦｃヘテロに会合したフォーマットである。本実施例では抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＤｕａｌ型を評価に用いた。(c) ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型：ｓｃＦｖとＦａｂをリンカーで繋げたＣ末端側にヘテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃ（左上斜線）が付加し、もう１つのＦｃ（黒塗り）と会合したフォーマットである。本実施例では抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（右上斜線）と抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ Ｆａｂを含むｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型を評価に用いた。また、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ（右上斜線）と抗ＣＤ３ Ｆａｂを含むｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型も評価に用いた。

【図6B】図６Ｂは、本実施例に示される抗体のフォーマットを示した図である。(a) ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型：図３(d)に同じ。ｔａＦｖのＣ末端側にヘテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃ（左上斜線）が付加し、もう１つのＦｃ（黒塗り）とヘテロに会合したフォーマットである。本実施例では抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ ｓｃＦｖからなるｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型を評価に用いた。(b) ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型：上記ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型における２つのｓｃＦｖの順序を入れかえたもの。本実施例では抗ＣＤ３ ｓｃＦｖと抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖとからなるｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型を評価に用いた。(c) ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型の第１ポリペプチドを示す。第１ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ及びＦｃ領域（ｉ）をその順に含んでなる。(d) ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型の第２ポリペプチドを示す。第２ポリペプチドは、ヒンジ領域及びＦｃ領域（ｉｉ）を含んでなる。

【図7A】図７Ａは、各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、Ｈｙｂｒｉｄ体（ＮＹＧ－３１４３）、Ｄｕａｌ体（ＮＹＧ－２１４３）、ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ体（ＮＹＦ－００１１）の、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞に対するヒトＰＢＭＣ共存下での細胞傷害活性を示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図7B】図７Ｂは、各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ体（ＮＹＦ－０００３）、ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ体（ＮＹＦ－００１０）、ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ体（ＮＹＦ－０００４）の、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞に対するヒトＰＢＭＣ共存下での細胞傷害活性を示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図8】ＮＹ－ＥＳＯ中のペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）

【図9】ＭＡＧＥＣ－１中のペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）

【図10】ｓｃＦｖシークエンス解析用プライマー１（配列番号３）

【図11】ｓｃＦｖシークエンス解析用プライマー２（配列番号４）

【図12】ＮＹＡ－０００１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５）

【図13】ＮＹＡ－０００１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６）

【図14】ＮＹＡ－０００１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号７）

【図15】ＮＹＡ－０００１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）

【図16】ＮＹＡ－００６０の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号９）

【図17】ＮＹＡ－００６０の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）

【図18】ＮＹＡ－００６０の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１１）

【図19】ＮＹＡ－００６０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）

【図20】ＮＹＡ－００６８の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１３）

【図21】ＮＹＡ－００６８の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４）

【図22】ＮＹＡ－００６８の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１５）

【図23】ＮＹＡ－００６８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１６）

【図24】ＮＹＡ－００８２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１７）

【図25】ＮＹＡ－００８２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１８）

【図26】ＮＹＡ－００８２の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号１９）

【図27】ＮＹＡ－００８２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２０）

【図28】ＮＹＡ－１１６３タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号２１）

【図29】ＮＹＡ－２０２３タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号２２）

【図30】ＮＹＡ－２０２７タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号２３）

【図31】ＮＹＡ－１１４３タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号２４）

【図32】ＮＹＡ－２１４３タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号２５）

【図33】ＮＹＡ－１１６３タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号２６）、ＮＹＡ－１１６３はアミノ酸番号２１～２６６

【図34】ＮＹＡ－２０２３タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号２７）、ＮＹＡ－２０２３はアミノ酸番号２１～２６６

【図35】ＮＹＡ－２０２７タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号２８）、ＮＹＡ－２０２７はアミノ酸番号２１～２６６

【図36】ＮＹＡ－１１４３タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号２９）、ＮＹＡ－１１４３はアミノ酸番号２１～２６６

【図37】ＮＹＡ－２１４３タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号３０）、ＮＹＡ－２１４３はアミノ酸番号２１～２６６

【図38】ＮＹＡ－１１５４タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号３１）

【図39】ＮＹＡ－１１５４タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号３２）、ＮＹＡ－１１５４はアミノ酸番号２１～２６６

【図40】ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＳＡ４７５３４．１）のトランケート体のアミノ酸配列（配列番号３３）

【図41】β２－マイクログロビンのアミノ酸配列（配列番号３４）

【図42】ＮＹＡ－２０３５タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号３５）

【図43】ＮＹＡ－２０３５タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号３６）、ＮＹＡ－２０３５はアミノ酸番号２１～２６６

【図44】ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０１のアミノ酸配列（配列番号３７）

【図45】ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０２のアミノ酸配列（配列番号３８）

【図46】ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０３のアミノ酸配列（配列番号３９）

【図47】ＮＹＡ－１１４３－ＶＬ０１のアミノ酸配列（配列番号４０）

【図48】ＮＹＡ－２０４４タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号４１）

【図49】ＮＹＡ－２０４５タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号４２）

【図50】ＮＹＡ－２０４７タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号４３）

【図51】ＮＹＡ－２０４８タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号４４）

【図52】ＮＹＡ－２０６０タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号４５）

【図53】ＮＹＡ－２０６１タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号４６）

【図54】ＮＹＡ－２０４４タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号４７）、ＮＹＡ－２０４４はアミノ酸番号２１～２６６

【図55】ＮＹＡ－２０４５タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号４８）、ＮＹＡ－２０４５はアミノ酸番号２１～２６６

【図56】ＮＹＡ－００８２のアミノ酸配列（配列番号４９）

【図57】ＮＹＡ－２０４７タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号５０）、ＮＹＡ－２０４７はアミノ酸番号２１～２６６

【図58】ＮＹＡ－２０４８タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号５１）、ＮＹＡ－２０４８はアミノ酸番号２１～２６６

【図59】ＮＹＡ－２０６０タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号５２）、ＮＹＡ－２０６０はアミノ酸番号２１～２６６

【図60】ＮＹＡ－２０６１タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号５３）、ＮＹＡ－２０６１はアミノ酸番号２１～２６６

【図61】ＮＹＡ－０００１重鎖のＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３、及び軽鎖のＣＤＲＬ１～Ｌ３のアミノ酸配列（配列番号５４～５９）

【図62】ＮＹＡ－２０２３のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号６０）

【図63】ＮＹＡ－２０２７のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号６１）

【図64】ＮＹＡ－１１５４のＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号６２及び６３）

【図65】ＮＹＡ－００３５のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（配列番号６４）

【図66】ＮＹＣ－０００３タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号６５）

【図67】ＮＹＣ－０００４タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号６６）

【図68】ＮＹＣ－０００３タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号６７）、ＮＹＣ－０００３はアミノ酸番号２１～２６３

【図69】ＮＹＣ－０００４タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号６８）、ＮＹＣ－０００４はアミノ酸番号２１～２６３

【図70】ＮＹＡ－０００１タグ付加体のヌクレオチド配列（配列番号６９）

【図71】ＮＹＡ－０００１タグ付加体のアミノ酸配列（配列番号７０）、ＮＹＡ－０００１はアミノ酸番号２１～２６６

【図72】ＨＣ１のヌクレオチド配列（配列番号７１）

【図73】ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号７２）

【図74】ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号７３）

【図75】ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号７４）

【図76】ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号７５）

【図77】ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号７６）

【図78】ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号７７）

【図79】ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号７８）

【図80】ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号７９）

【図81】ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号８０）

【図82】ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号８１）

【図83】ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号８２）

【図84】ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号８３）

【図85】ＨＣ１のアミノ酸配列（配列番号８４）

【図86】ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号８５）、ＮＹＡ－１１４３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図87】ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号８６）、ＮＹＡ－２１４３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図88】ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号８７）、ＮＹＡ－１１６３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図89】ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号８８）、ＮＹＡ－２０２３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図90】ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号８９）、ＮＹＡ－２０２７はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図91】ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号９０）、ＮＹＡ－２０３５はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図92】ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号９１）、ＮＹＡ－２０４４はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図93】ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号９２）、ＮＹＡ－２０４５はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図94】ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号９３）、ＮＹＡ－２０４７はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図95】ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号９４）、ＮＹＡ－２０４８はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図96】ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号９５）、ＮＹＡ－２０６０はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図97】ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号９６）、ＮＹＡ－２０６１はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図98】ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（配列番号９７）

【図99】ＮＹＡ－０００１－ＬＣのヌクレオチド配列（配列番号９８）

【図100】ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号９９）、ＮＹＡ－０００１の重鎖可変領域はアミノ酸番号２０～１３９

【図101】ＮＹＡ－０００１－ＬＣのアミノ酸配列（配列番号１００）、ＮＹＡ－０００１の軽鎖可変領域はアミノ酸番号２１～１３１

【図102】ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（配列番号１０１）

【図103】ＮＹＡ－１１４３－ＬＣのヌクレオチド配列（配列番号１０２）

【図104】Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅＣのヌクレオチド配列（配列番号１０３）

【図105】ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号１０４）、ＮＹＡ－１１４３の重鎖可変領域はアミノ酸番号２０～１３９

【図106】ＮＹＡ－１１４３－ＬＣのアミノ酸配列（配列番号１０５）、ＮＹＡ－１１４３の軽鎖可変領域はアミノ酸番号２１～１３１

【図107】Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号１０６）、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２１～２６０

【図108】ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（配列番号１０７）

【図109】ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号１０８）、ＮＹＡ－１１４３はアミノ酸番号２１～２６６

【図110】Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（配列番号１０９）

【図111】ＮＹＡ－１１５４－ＬＣのヌクレオチド配列（配列番号１１０）

【図112】ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（配列番号１１１）

【図113】Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号１１２）、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２１～２６０、ＮＹＡ－１１５４の重鎖可変領域はアミノ酸番号２６６～２８５

【図114】ＮＹＡ－１１５４－ＬＣのアミノ酸配列（配列番号１１３）、ＮＹＡ－１１５４の軽鎖可変領域はアミノ酸番号２１～１３１

【図115】ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号１１４）、

【図116】ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（配列番号１１５）

【図117】ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（配列番号１１６）

【図118】ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（配列番号１１７）

【図119】ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号１８）、ＮＹＡ－１１５４はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図120】ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号１１９）Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２１～２６０、ＮＹＡ－１１５４はアミノ酸番号２７２～５１１

【図121】ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（配列番号１２０）、ＮＹＡ－１１４３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図122】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド１Ｆのアミノ酸配列（配列番号１２１）

【図123】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド２Ｍのアミノ酸配列（配列番号１２２）

【図124】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド３Ａのアミノ酸配列（配列番号１２３）

【図125】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド４Ａのアミノ酸配列（配列番号１２４）

【図126】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド５Ａのアミノ酸配列（配列番号１２５）

【図127】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド６Ｌのアミノ酸配列（配列番号１２６）

【図128】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド７Ｆのアミノ酸配列（配列番号１２７）

【図129】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド８Ａのアミノ酸配列（配列番号１２８）

【図130】点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド９Ａのアミノ酸配列（配列番号１２９）

【図131】ｇｐ１００ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１３０）

【図132】相同性ペプチドＤＯＬＰＰ１のアミノ酸配列（配列番号１３１）

【図133】相同性ペプチドＩＬ２０ＲＢのアミノ酸配列（配列番号１３２）

【図134】相同性ペプチドＰＲＫＤ２のアミノ酸配列（配列番号１３３）

【図135】相同性ペプチドＣＤ１６３のアミノ酸配列（配列番号１３４）

【図136】相同性ペプチドのＰ２ＲＹ８のアミノ酸配列（配列番号１３５）

【図137】Ｃ３Ｅ－７０３４のアミノ酸配列（配列番号１３６）

【図138】Ｃ３Ｅ－７０３６のアミノ酸配列（配列番号１３７）

【図139】Ｃ３Ｅ－７０８５のアミノ酸配列（配列番号１３８）

【図140】Ｃ３Ｅ－７０８８のアミノ酸配列（配列番号１３９）

【図141】Ｃ３Ｅ－７０９３のアミノ酸配列（配列番号１４０）

【図142】Ｃ３Ｅ－７０８５重鎖のＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３、及び軽鎖のＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（配列番号１４１～１４６）

【図143】Ｃ３Ｅ－７０７８のアミノ酸配列（配列番号１４７）

【図144】ＮＹＦ－００１４－ＨＣ２のヌクレオチド配列（配列番号１４８）

【図145】ＮＹＦ－００１４－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号１４９）、ＮＹＡ－０００１はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図146】ＮＹＦ－００８２－ＨＣ２のアミノ酸配列（配列番号１５０）、ＮＹＡ－００８２はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１

【図147】ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列（配列番号１５１）

【図148】ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列（配列番号１５２）

【図149】ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列（配列番号１５３）

【図150】ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列（配列番号１５４）

【図151】ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（配列番号１５５）、ＮＹＡ－２０６１はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０９６はアミノ酸番号２７２～５１１

【図152】ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（配列番号１５６）、ＮＹＡ－３０６１はアミノ酸番号２１～２７１、Ｃ３Ｅ－７０９６はアミノ酸番号２７７～５１６

【図153】ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（配列番号１５７）、ＮＹＡ－３０６１はアミノ酸番号２１～２７１、Ｃ３Ｅ－７０９７はアミノ酸番号２７７～５１６

【図154】ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列（配列番号１５８）

【図155】Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣ全長のヌクレオチド配列（配列番号１５９）

【図156】ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（配列番号１６０）、ＮＹＡ－３０６１はアミノ酸番号２１～２７１、Ｃ３Ｅ－７０８５重鎖可変領域はアミノ酸番号２７７～３９４

【図157】Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣ全長のアミノ酸配列（配列番号１６１）

【図158A】図１５８Ａは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子ＮＹＺ－００３８、００８２、００８３、１０１０の各種点変異ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞に対する標準化ｇＭＦＩを示した表である。＊／下線は、各Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子のＮＹ－ＥＳＯペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞に対する標準化ｇＭＦＩと比較して半分以下、＊太字は４分の１以下であることを表す。

【図158B】図１５８Ｂは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子ＮＹＺ－００３８、００８２、００８３、１０１０の各種相同性ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞に対する標準化ｇＭＦＩを示した表である。＊／下線は、各Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子のＤＭＳＯ添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞に対する標準化ｇＭＦＩと比較して大きい値であることを表す。

【図159A】図１５９Ａは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００３８、００８２、００８３が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図159B】図１５９Ｂは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－１０１０が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図159C】図１５９Ｃは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００８２、１０１０が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現ＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図159D】図１５９Ｄは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００３８、００８３が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現ＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図159E】図１５９Ｅは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００３８、００８２、００８３が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＡＧＳ細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図159F】図１５９Ｆは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－１０１０が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＡＧＳ細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図159G】図１５９Ｇは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００８２、１０１０が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＣＦＰＡＣ－１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図159H】図１５９Ｈは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００３８、００８３が、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現ＣＦＰＡＣ－１細胞に対してヒトＰＢＭＣ共存下で細胞傷害活性を示さないことを示す図である。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図160A】図１６０Ａは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００３８が、ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）を示す。

【図160B】図１６０Ｂは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００８２が、ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）を示す。

【図160C】図１６０Ｃは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－００８３が、ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）を示す。

【図160D】図１６０Ｄは、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子、ＮＹＺ－１０１０が、ヒトＰＢＭＣ移入モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを示した図である。図中のエラーバーは標準誤差（ｎ＝５）を示す。

【図161】ペプチドリンカーのアミノ酸配列（配列番号１６２）

【図162】各種Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を酸処理した場合の多量体の含有量（％）を示す図である。

【図163】抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃの溶液安定性評価の結果を示す図である。

【図164】ＮＹＡ－３０６1全長のヌクレオチド配列（配列番号１６３）

【図165】ＮＹＡ－３０６１全長のアミノ酸配列（配列番号１６４）

【図166】ＮＹＣ－０００５全長のヌクレオチド配列（配列番号１６５）

【図167】ＮＹＣ－０００５全長のアミノ酸配列（配列番号１６６）

【図168】ＮＹＣ－０００６全長のヌクレオチド配列（配列番号１６７）

【図169】ＮＹＣ－０００６全長のアミノ酸配列（配列番号１６８）

【図170】ＮＹC－０００７全長のヌクレオチド配列（配列番号１６９）

【図171】ＮＹＣ－０００７全長のアミノ酸配列（配列番号１７０）

【図172】ＮＹＣ－０００８全長のヌクレオチド配列（配列番号１７１）

【図173】ＮＹＣ－０００８全長のアミノ酸配列（配列番号１７２）

【図174】ＮＹＣ－０００９全長のヌクレオチド配列（配列番号１７３）

【図175】ＮＹＣ－０００９全長のアミノ酸配列（配列番号１７４）

【図176】ＮＹＣ－００１０全長のヌクレオチド配列（配列番号１７５）

【図177】ＮＹＣ－００１０全長のアミノ酸配列（配列番号１７６）

【図178】ＨＣ－ｈ全長のヌクレオチド配列（配列番号１７７）

【図179】ＨＣ－ｈ全長のアミノ酸配列（配列番号１７８）

【図180】ＮＹＤ－２０４７－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１７９）

【図181】ＮＹＤ－２０４７－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１８０）

【図182】ＮＹＤ－２０６１－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１８１）

【図183】ＮＹＤ－２０６１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１８２）

【図184】ＮＹＤ－３０６１－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１８３）

【図185】ＮＹＤ－３０６１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１８４）

【図186】ＮＹＣ－００１１－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１８５）

【図187】ＮＹＣ－００１１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１８６）

【図188】ＮＹＣ－００１２－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１８７）

【図189】ＮＹＣ－００１２－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１８８）

【図190】ＮＹＣ－００１３－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１８９）

【図191】ＮＹＣ－００１３－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１９０）

【図192】ＮＹＣ－００１４－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１９１）

【図193】ＮＹＣ－００１４－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１９２）

【図194】ＮＹＣ－００１５－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１９３）

【図195】ＮＹＣ－００１５－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１９４）

【図196】ＮＹＣ－００１６－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（配列番号１９５）

【図197】ＮＹＣ－００１６－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（配列番号１９６）

【図198】ＮＹＺ－１００７－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（配列番号１９７）、ＮＹＡ－２０６１はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５重鎖可変領域はアミノ酸番号２７２～３８９。

【図199】ＮＹＺ－１０１７－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（配列番号１９８）、ＮＹＡ－２０４７はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５重鎖可変領域はアミノ酸番号２７７～３８９。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下、本発明を詳細に説明する。
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチド鎖又はその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチド鎖又はその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明において塩基配列とヌクレオチド配列は同義である。

【0033】

本発明において、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド鎖」、「核酸」及び「核酸分子」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、プライマー等も「ポリヌクレオチド」の意味に含まれる。かかるポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖又は三本以上の鎖からなるポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のポリヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなポリヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本以上の鎖の会合体も「ポリヌクレオチド」の意味に含まれる。

【0034】

本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」は同義である。
本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞及び微生物等も含まれる。

【0035】

本発明において、「抗体」は免疫グロブリンと同義である。ただし、本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体という場合の「抗体」は、定常領域と可変領域とを有する免疫グロブリンの意味で用いる。抗体は、天然のものであるか、又は、部分的若しくは完全合成により製造された免疫グロブリンであるかは特に限定されない。本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体は後述の「分子」に含まれる。

【0036】

本発明において、「ＮＹ－ＥＳＯペプチド」とは、ＮＹ－ＥＳＯ－１とＬＡＧＥ－１の１５７番目から１６５番目の９アミノ酸からなるペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ：配列番号１）を意味する。

【0037】

本発明において、「ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ」とは、ＮＹ－ＥＳＯペプチド及びＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）の複合体を意味し、「ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ」とも表記される。

【0038】

本発明において、「抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ抗体」とは、ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯに結合する抗体、言い換えればＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯを認識する抗体を意味する。同様に、「抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ」とは、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する、言い換えればＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯを認識するｓｃＦｖを意味する。「抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ抗体」及び「抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ」は、それぞれ「抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体」及び「抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ」とも表記される。

【0039】

基本的な４鎖抗体の構造は、２つの同一な軽鎖（Ｌ鎖）、及び、２つの同一な重鎖（Ｈ鎖）から構成される。軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合する。２つの重鎖は、重鎖のアイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれの軽鎖、重鎖は規則的な間隔を持つ鎖内ジスルフィド結合を持つ。重鎖と軽鎖には、アミノ酸配列が非常に高い類似性を示す定常領域とアミノ酸配列の類似性が低い可変領域とが存在する。軽鎖は、定常領域（ＣＬ）が続く可変領域（ＶＬ）をアミノ末端に有する。重鎖は３つの定常領域（ＣＨ１／ＣＨ２／ＣＨ３）が続く可変領域（ＶＨ）をアミノ末端に有する。ＶＬとＶＨは対となり、ＣＬは重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）と並んでいる。ＶＬとＶＨは対となって、単一の抗原結合部位を形成する。

【0040】

本発明の抗体の定常領域としては、特に限定されるものではないが、ヒトの疾患を治療又は予防するための本発明の抗体としては、好適にはヒト抗体のものが使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃε等を挙げることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Ｃκ、Ｃλ等を挙げることができる。

【0041】

Ｆａｂは、重鎖のＶＨとそれに続くＣＨ１、及び、軽鎖のＶＬとそれに続くＣＬからなる。ＶＨとＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

【0042】

Ｆｃ（Ｆｃ領域ともいう）は、重鎖の定常領域のカルボキシル末端領域であって、ＣＨ２とＣＨ３を含み、二量体である。本発明のＦｃは、天然の配列のＦｃであっても、天然の配列に変異がなされた変異型のＦｃ（「変異型Ｆｃ」という）であってもよく、本発明の多重特異性分子及び二重特異性分子において、好適なＦｃ領域は変異型Ｆｃであり、より好適にはヘテロ２量体を形成し得る１組のＦｃである。１組のＦｃとしては、後述の、第１ポリペプチドに含まれるＦｃ（ｉ）及び第２ポリペプチドに含まれるＦｃ（ｉｉ）の組合せをあげることができるが、１組のＦｃが会合（ヘテロ２量体形成）することができれば、それらに限定されるものではない。

【0043】

変異型Ｆｃとしては、ＷＯ２０１３／０６３７０２に開示される、向上した安定性を有するヘテロ多量体に含まれる改変Ｆｃ領域（ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含む）、ＷＯ１９９６／２７０１１に開示される、異種多量体に含まれる、「突起」及び「空隙」を有するＩｇＧ抗体から誘導されるイムノグロブリンのＣＨ３領域を含むＦｃ、ＷＯ２００９／０８９００４に開示される、１以上のアミノ酸残基を荷電アミノ酸に置換することで静電的に有利であるヘテロ二量体に含まれるＣＨ３ドメインを含むＦｃ、ＷＯ２０１４／１１０６０１に開示される、立体構造変異及び／又はｐＩ（等電点）変異を用いた異種二量体に含まれる異種二量体Ｆｃ領域、ＷＯ２０１０／１５１７９２に開示される、プロテインＡへの結合を無くすか又は減少させる改変を含むＣＨ３ドメインを含む、ヘテロ二量体のＦｃ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。

【0044】

可変領域は、超可変領域（ＨＶＲ：ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）と称される極度の可変性を有する領域と、その領域により分離されたフレームワーク領域（ＦＲ：Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれる比較的不変の領域からなる。天然の重鎖と軽鎖の可変領域は、３つの超可変領域により接続される４つのＦＲを含み、各鎖の超可変領域はＦＲにより他の鎖の超可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。

【0045】

抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。

【0046】

本発明において、ＣＤＲの位置と長さは、ＩＭＧＴの定義（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２７ （２００３） ５５－７７）により決定した。

【0047】

ＦＲは、ＣＤＲ残基以外の可変領域である。可変領域は、一般にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の４つのＦＲを持つ。

【0048】

重鎖並びに軽鎖に含まれるＣＤＲとＦＲは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲＨ１－ＣＤＲＨ１－ＦＲＨ２－ＣＤＲＨ２－ＦＲＨ３－ＣＤＲＨ３－ＦＲＨ４、並びに、ＦＲＬ１－ＣＤＲＬ１－ＦＲＬ２－ＣＤＲＬ２－ＦＲＬ３－ＣＤＲＬ３－ＦＲＬ４、の順にそれぞれ配置される。

【0049】

ＣＤＲとＦＲの位置は、当技術分野で周知の様々な定義、例えば、ＩＭＧＴ以外にも、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ｃｏｎｔａｃｔ等の定義により決定することもできる。

【0050】

本発明において、「抗体の抗原結合断片」とは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域から構成される、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味する。「抗体の抗原結合断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｄＡｂ）等の抗原結合断片を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の抗原結合断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。本発明において、「抗体の結合断片」は「抗体の抗原結合断片」と同義である。

【0051】

本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合又は認識する抗原上の部分ペプチド又は部分高次構造を意味する。

【0052】

本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。本発明において、「変異抗体」とは、元の抗体が有するアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加（付加には挿入が含まれる）（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を有し、且つ本発明のＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合するポリペプチドを意味する。かかる変異抗体における変異アミノ酸の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０又は５０個である。かかる変異抗体も本発明の「抗体」に包含される。

【0053】

本発明において、「１又は数個」における「数個」とは、２～１０個を指す。
本明細書中において、「分子」は、上述の抗体、抗体の抗原結合断片を含む分子であり、さらに抗体又はそれらに由来する複数の抗原結合断片より形成された多重特異的である分子を含む。

【0054】

本明細書中において、「多重特異的である分子」、「多重特異的（な）分子」及び「多重特異性分子」は同義であり、１つの分子上の複数の互いに異なるエピトープ、及び／又は、２つ以上の分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能な分子であれば特に限定されない。多重特異的である分子としては、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体も含まれる。このような多重特異的な分子には、異なる２種類以上の重鎖及び軽鎖を有する完全長抗体分子、すなわちＩｇＧ型多重特異性分子、及び２種類以上のＶＬ及びＶＨを有する抗原結合断片からなる分子、すなわち、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ等を組合せて派生する分子、すなわちｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ、ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、トリアボディ等を含むが、これらに限定されない。その他抗原結合断片に免疫グロブリン骨格を有さないで抗原結合性を有する蛋白質を遺伝子的、あるいは化学的に連結させることにより生じる分子も多重特異性分子として含まれる。本発明においては、このような多重特異性分子を、抗体又はその抗原結合断片を含まない場合を除き、「多重特異的抗体」、「多重特異性抗体」等とも呼ぶことがある。

【0055】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又は該抗体の抗原結合断片、あるいは、本発明の分子が奏する活性・性質としては、例えば、生物学的活性、物理化学的性質（物性ともいう）等を挙げることができ、具体的には、細胞傷害活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍活性（いずれも後述）等の各種生物活性、抗原やエピトープに対する結合活性、製造や保存時における安定性、熱安定性等の物性をあげることができる。

【0056】

本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、並びに、０．２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭＮａＣｌ－１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。

【0057】

本発明において「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことを指し、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を意味する。本発明において「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。

【0058】

本発明において「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性」を指し、ＮＫ細胞が抗体を介して腫瘍細胞等の標的細胞を傷害する作用活性を意味する。

【0059】

本発明において「Ｔ細胞リダイレクションによる細胞傷害活性」とは抗腫瘍抗原抗体と抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体とを含む多重特異的な分子を介して上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。すなわち抗腫瘍抗原抗体が標的腫瘍細胞と結合し、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体がＴ細胞に結合することにより標的腫瘍細胞とＴ細胞の距離を近づけ、Ｔ細胞活性化を介して細胞傷害を誘導することを意味する。該分子は、医薬組成物に含めることができる。

【0060】

２．抗原
２－１．ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗原
本発明において、「ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ」は、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ蛋白質と同じ意味で用いられる。

【0061】

ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯは、ＨＬＡ－Ａ２、β２－Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ、ＮＹ－ＥＳＯペプチドの三者複合体である。ＨＬＡ－Ａ２はＨＬＡのアレルの一種であり、Ｃａｕｃａｓｉａｎで最も頻度の高いアレルとして知られる。ＨＬＡは、細胞の小胞体内でβ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎと自己蛋白のペプチド断片の三者複合体を形成して細胞外に提示し、Ｔ細胞のＴＣＲ（Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に認識を受ける。ＮＹ－ＥＳＯペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ：配列番号１、図８）は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１の１５７番目から１６５番目の９アミノ酸からなるペプチドであり、ＨＬＡ－Ａ２に提示されることが報告されている。

【0062】

２－２．ＣＤ３抗原
本発明において、「ＣＤ３」は、ＣＤ３蛋白質と同じ意味で用いている。
ＣＤ３は、多分子Ｔ細胞レセプター複合体の一部分としてＴ細胞上に発現され、γ鎖、δ鎖、ε鎖、ζ鎖、η鎖の５種類のポリペプチド（分子量は順に２５０００－２８０００、２１０００、２００００、１６０００、２２０００）の複合体である。

【0063】

ＣＤ３複合体としては、γ、δ、ε、ζ、η鎖が挙げられる。これらはサブユニットとも称される。抗ＣＤ３抗体がＴ細胞に結合することにより、Ｔ細胞活性化を介して細胞傷害を誘導する。多くの抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３εに結合する。

【0064】

ヒトＣＤ３εをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ／ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿０００７３３（ＮＭ＿０００７３３．３）で、ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列はＮＣＢＩ／ＧｅｎＰｅｐｔにアクセッション番号：ＮＰ＿０００７２４（ＮＭ＿０００７２４．１）で、それぞれ登録されている。カニクイザルＣＤ３をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿００１２８３６１５．１で登録されている。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は配列表の配列番号１５１（図１４７）に記載されている。

【0065】

２－３．抗原の調製
本発明で用いる上述の抗原蛋白質；ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ、ＣＤ３（以下、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ、ＣＤ３をまとめて、該抗原蛋白質とも記す）は、動物組織（体液を含む）、該組織由来の細胞若しくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、インビトロ翻訳、化学合成等により調製することができる。

【0066】

該抗原蛋白質のｃＤＮＡは、例えば、該抗原蛋白質のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、該抗原蛋白質のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ． Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，４８７－４９）を行う、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。

【0067】

ヒト又はラットに発現している該抗原蛋白質をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、該抗原蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも、該抗原蛋白質のｃＤＮＡに含まれる。

【0068】

さらに、ヒト又はラットに発現している該抗原蛋白質遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、且つ、該抗原蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドも、該抗原蛋白質のｃＤＮＡに含まれる。

【0069】

ヒト又はラットの該抗原蛋白質のアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸が、置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、該抗原蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列も、該抗原蛋白質遺伝子のヌクレオチド配列に含まれる。

【0070】

ヒト又はラットの該抗原蛋白質の遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が、置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、該抗原蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質も、該抗原蛋白質に含まれる。

【0071】

２－４ 抗原蛋白質への結合特異性
本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体及びその抗原結合断片等は、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯを認識する。すなわち、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗原に結合する。ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯは、マウス、ラット、カニクイサル等の非ヒト動物における存在は知られていない。

【0072】

本発明の多重特異的分子に含まれる抗ＣＤ３抗体及びその結合断片等は、ＣＤ３抗原を認識、すなわち、結合する。かかる抗ＣＤ３抗体等は、好適には、ヒトＣＤ３、サルＣＤ３等に結合し、より好適には、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に結合する。一方、かかる好適な抗ＣＤ３抗体は、ラット及び／又はマウスのＣＤ３には結合しない。

【0073】

本発明の多重特異的分子の抗腫瘍活性は、例えば、（ｉ）ヒト末梢血リンパ細胞を移植した非ヒト動物、好適にはラット又はマウス、より好適には内在性のエフェクター機能が不全のラット又はマウス（例えば、免疫不全のラット又はマウス）に、ヒトがん細胞、ヒトがん組織等を移植して、あるいは（ｉｉ）ヒトＣＤ３遺伝子をノックインした非ヒト動物、好適にはラット又はマウスに、ＨＬＡ及びＮＹ－ＥＳＯを遺伝子導入したマウスがん細胞等を移植して、評価することができる。かかる免疫不全動物やノックイン動物を使用して評価を行うことにより、各種アッセイ、免疫組織化学等を、マウス及び／又はラットの生体を利用して実施することができ、そのことは本発明の多重特異的分子を含む医薬、非臨床開発等において好ましい。
本発明において「認識」、すなわち「結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。認識しているか否か、すなわち、結合しているか否の判定基準としては、例えば、解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ：以下、「ＫＤという」）を挙げることができる。本発明の好適な抗体等のＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ又はＣＤ３に対するＫＤ値は、１×１０^－５Ｍ以下、５×１０^－６Ｍ以下、２×１０^－６Ｍ以下、１×１０^－６Ｍ以下であり、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに対する好適なＫＤ値は、５×１０^－７Ｍ以下、２×１０^－７Ｍ以下、１×１０^－７Ｍ以下、５×１０^－８Ｍ以下、２×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－８Ｍ以下、５×１０^－９Ｍ以下、又は２×１０^－９Ｍ以下であり、より好適には１×１０^－９Ｍ以下である。優れた抗原結合活性を有する本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖとして、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－２０２３、ＮＹＡ－２１４３、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０６０、ＮＹＡ－２０６１、ＮＹＡ－３０６１を例示することができ、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５及びＮＹＡ－２１４３等のＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに対するＫＤ値は１×１０^－９Ｍ以下である（実施例４等）。

【0074】

本発明における抗原と抗体の結合は、ＳＰＲ法、ＢＬＩ法等の生体分子間相互作用解析システム、あるいはＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により測定又は判定することができる。細胞表面上の発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法等により測定することができる。

【0075】

ＳＰＲ法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ解析法）は、反応速度論的（カイネティクス）解析により結合速度定数（Ｋａ値）と解離速度定数（Ｋｄ値）を計測することによりアフィニティーの指標となる解離定数（ＫＤ値）等を求める分析手法として用いられている。ＳＰＲ解析に用いる機器としては、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥヘルスケア社製）、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）（ＢｉｏＲａｄ社製）、ＳＰＲ－Ｎａｖｉ（商標）（ＢｉｏＮａｖｉｓ社製）、Ｓｐｒｅｅｔａ（商標）（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳＰＲｉ－ＰｌｅｘＩＩ（商標）（ホリバ社製）、Ａｕｔｏｌａｂ ＳＰＲ（商標）（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）等を例示することができる。

【0076】

ＢＬＩ法（ＢｉｏＬａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）は、バイオレイヤー干渉を用いた生体分子間相互作用を計測する方法である。ＢＬＩ法を用いた相互作用解析に用いる機器としては、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）等を例示することができる。

【0077】

ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法は、試料溶液中に含まれる目的の抗原あるいは抗体を、特異抗体あるいは抗原で捕捉するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法である。酵素標識した抗原あるいは抗体を反応系に組込んで、酵素活性を検出する。酵素活性の検出には、反応によって吸光スペクトルが変化する基質が用いられ、吸光度測定で数値化する。

【0078】

Ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡでは、細胞表面にある測定対象を細胞ごと捕捉するとともに、酵素反応を利用して検出・定量する方法である。

【0079】

ＲＩＡ法（Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ法）では、放射性物質を使って抗体を標識し、抗体からの放射能を測定することで、抗体の定量をすることができる。

【0080】

フローサイトメトリー法は、細胞を流体中に分散させ、その流体を細く流して、個々の細胞を光学的に分析する手法である。蛍光色素で標識された抗体が、抗原抗体反応により細胞表面抗原に結合し、細胞に結合した標識された抗体による蛍光強度を測定することにより、抗体の抗原結合性を定量する。

【0081】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体等のうち、優れた抗原結合特異性を有するものとして、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖであるＮＹＡ－０００１、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－１１６３、ＮＹＡ－２０２３、ＮＹＡ－２０２７、ＮＹＡ－２０３５、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０４８、ＮＹＡ－２０６０、ＮＹＡ－２０６１、ＮＹＡ－２１４３及びＮＹＡ－３０６１を例示することができる（実施例６等）。

【0082】

３．ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合する抗体又はその結合断片
３－１ 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ又はその結合断片
本発明は、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯを認識し結合する抗体又はその結合断片を提供する。

【0083】

前述の通り、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯは、ＨＬＡ－Ａ２と９ｍｅｒのＮＹ－ＥＳＯペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ：配列番号１）を含む複合体である。ＮＹ－ＥＳＯペプチドは、細胞内タンパク質でありＣａｎｃｅｒ－Ｔｅｓｔｉｓ抗原であるＮＹ－ＥＳＯ－１又はＬＡＧＥ－１由来のペプチドである。ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯは、がん細胞表面に提示される。

【0084】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体及び該抗体の抗原結合断片（以下、本発明の抗体等とも記す）は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のモノクローナル抗体のアイソタイプは、特に限定されるものではなく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等のＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉｇ等をあげることができる。モノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスは、例えば、オクテロニー法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等で決定することができる。本発明のモノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体（非ヒト動物抗体）、ヒト抗体、キメラ化抗体（「キメラ抗体」ともいう）、ヒト化抗体などを挙げることができ、好ましくはヒト抗体を用いることができる。本発明の抗体の範囲には、抗体の変異体（後述の「変異抗体」）も含まれ、例えば、ヒト抗体の範囲には、ヒト変異抗体も含まれる。

【0085】

非ヒト動物抗体としては、哺乳類、鳥類等の脊椎動物に由来する抗体などを挙げることができる。哺乳類由来の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体などのげっ歯類由来の抗体などを挙げることができる。鳥類由来の抗体としては、ニワトリ抗体等を挙げることができる。

【0086】

キメラ化抗体としては、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体（ヒト免疫グロブリン）定常領域とを結合してなる抗体などを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。

【0087】

ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲをヒト抗体（ヒト免疫グロブリンの可変領域）に移植したもの、ＣＤＲに加え非ヒト動物抗体のフレームワーク領域の配列も一部ヒト抗体に移植したもの、それらのいずれかの非ヒト動物抗体由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸をヒト型のアミノ酸で置換したものなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。

【0088】

抗体は、公知の種々の方法で作製することができる。公知の方法として、ハイブリドーマを用いる方法や細胞免疫法等により作製し、遺伝子組換えの手法により作製することができる。また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域をｓｃＦｖとしてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，４３３－４５５）。

【0089】

このようにして得られた高活性を有する抗体をリード抗体として用い、該リード抗体をコードする遺伝子を変異させて、より高活性の変異体（後述の「変異抗体」）を作製することもできる。

【0090】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の重鎖に含まれるＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３としては、好適には、配列番号５４（図６１）で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５５（図６１）で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、並びに、列番号５６（図６１）で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号５６（図６１）で表されるアミノ酸配列において６番目のアミノ酸がＮ（Ａｓｎ）であるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３の組合せをあげることができる。より好適には、配列番号６（図１３）で表されるアミノ酸配列からなるＮＹＡ－０００１重鎖可変領域、配列番号１８（図２５）で表されるアミノ酸配列からなるＮＹＡ－００８２重鎖可変領域、配列番号２７（図３４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０２３重鎖可変領域、配列番号２８（図３５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０２７重鎖可変領域、配列番号２９（図３６）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－１１４３重鎖可変領域、配列番号２６（図３３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－１１６３重鎖可変領域、配列番号２７（図３４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０２３重鎖可変領域、配列番号２８（図３５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０２７重鎖可変領域、配列番号３６（図４３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０３５重鎖可変領域、配列番号４７（図５４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０４４重鎖可変領域、配列番号４８（図５５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０４５重鎖可変領域、配列番号５０（図５７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０４７重鎖可変領域、配列番号５１（図５８）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０４８重鎖可変領域、配列番号５２（図５９）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０６０重鎖可変領域、配列番号５３（図６０）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２０６１重鎖可変領域、又は、配列番号３０（図３７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－２１４３重鎖可変領域に含まれるＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３の組合せをあげることができる。
さらに、配列番号１５６（図１５２）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０からなるＮＹＡ－３０６１重鎖可変領域に含まれるＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３の組合せをあげることができる。

【0091】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の軽鎖に含まれるＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３としては、好適には、配列番号５７（図６１）で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号５７（図６１）で表されるアミノ酸配列において７番目のアミノ酸がＷ（Ｔｒｐ）若しくは８番目のアミノ酸がＫ（Ｌｙｓ）であるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５８（図６１）で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、並びに、配列番号５９（図６１）で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号５９（図６１）で表されるアミノ酸配列において２番目のアミノ酸がＡ（Ａｌａ）若しくはＳ（Ｓｅｒ）であるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３の組合せをあげることができる。

【0092】

より好適には、配列番号８（図１５）で表されるアミノ酸配列からなるＮＹＡ－０００１軽鎖可変領域、配列番号２０（図２７）で表されるアミノ酸配列からなるＮＹＡ－００８２軽鎖可変領域、配列番号２９（図３６）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－１１４３軽鎖可変領域、配列番号２６（図３３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－１１６３軽鎖可変領域、配列番号２７（図３４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０２３軽鎖可変領域、配列番号２８（図３５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０２７軽鎖可変領域、配列番号３６（図４３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０３５軽鎖可変領域、配列番号４７（図５４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０４４軽鎖可変領域、配列番号４８（図５５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０４５軽鎖可変領域、配列番号５０（図５７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０４７軽鎖可変領域、配列番号５１（図５８）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０４８軽鎖可変領域、配列番号５２（図５９）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０６０軽鎖可変領域、配列番号５３（図６０）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０６１軽鎖可変領域、又は、配列番号３０（図３７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６からなるＮＹＡ－２１４３軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３の組合せをあげることができる。
さらに、配列番号１５６（図１５２））で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１６１～２７１からなるＮＹＡ－３０６１軽鎖可変領域に含まれるＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３の組合せをあげることができる。

【0093】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の重鎖に含まれるＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及び軽鎖に含まれるＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３としては、好適には、配列番号５４（図６１）で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５５（図６１）で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号５６（図６１）で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号５６（図６１）で表されるアミノ酸配列において６番目のアミノ酸がＮ（Ａｓｎ）であるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３、配列番号５７（図６１）で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号５７（図６１）で表されるアミノ酸配列において７番目のアミノ酸がＮ（Ａｓｎ）及び／若しくは８番目のアミノ酸がＫ（Ｌｙｓ）であるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５８（図６１）で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、並びに、配列番号５９（図６１）で表されるアミノ酸配列、若しくは、配列番号５９で表されるアミノ酸配列において２番目のアミノ酸がＡ（Ａｌａ）若しくはＳ（Ｓｅｒ）であるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３の組合せをあげることができる。より好適には、配列番号６及び８でそれぞれ表されるアミノ酸配列からなるＮＹＡ－０００１重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２９（図３６）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－１１４３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２６（図３３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－１１６３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２７（図３４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０２３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号２８（図３５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０２７重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号３６（図４３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０３５重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号４７（図５４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０４４重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号４８（図５５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０４５重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号５０（図５７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０４７重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号５１（図５８）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０４８重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号５２（図５９）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０６０重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、配列番号５３（図６０）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２０６１重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、又は、配列番号３０（図３７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１５６～２６６からなるＮＹＡ－２１４３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に、それぞれ含まれるＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３の組合せをあげることができる。
さらに、配列番号１５６（図１５２）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０及び１６１～２７１からなるＮＹＡ－３０６１重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に、それぞれ含まれるＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３の組合せをあげることができる。

【0094】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域としては、上記重鎖ＣＤＲ又はそれらの組合せを含むものを、好適な例としてあげることができ、より好適には、ＮＹＡ－０００１重鎖可変領域、ＮＹＡ－００８２重鎖可変領域、ＮＹＡ－１１４３重鎖可変領域、ＮＹＡ－１１６３重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０２３重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０２７重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０３５重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４４重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４５重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４７重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４８重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０６０重鎖可変領域、ＮＹＡ－２０６１重鎖可変領域、ＮＹＡ－２１４３重鎖可変領域、及び、ＮＹＡ－３０６１重鎖可変領域を例示することができる。それぞれの重鎖可変領域のアミノ酸配列は上記のとおりである。

【0095】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の軽鎖可変領域としては、上記軽鎖ＣＤＲ又はそれらの組合せを含むものを、好適な例としてあげることができ、より好適には、ＮＹＡ－０００１軽鎖可変領域、ＮＹＡ－００８２軽鎖可変領域、ＮＹＡ－１１４３軽鎖可変領域、ＮＹＡ－１１６３軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０２３軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０２７軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０３５軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４４軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４５軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４７軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４８軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０６０軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０６１軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２１４３軽鎖可変領域、及び、ＮＹＡ－３０６１軽鎖可変領域を例示することができる。それぞれの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は上記のとおりである。

【0096】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域としては、上記重鎖及び軽鎖のＣＤＲ又はそれらの組合せを含むものを、好適な例としてあげることができ、より好適には、ＮＹＡ－０００１重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－００８２重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－１１４３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－１１６３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０２３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０２７重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０３５重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４４重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４５重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４７重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０４８重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０６０重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ＮＹＡ－２０６１重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、及び、ＮＹＡ－２１４３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、及び、ＮＹＡ－３０６１重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを例示することができる。

【0097】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の重鎖としては、上記好適又はより好適な重鎖可変領域を含むものを、好適な例としてあげることができ、より好適には、ＮＹＡ－０００１重鎖、ＮＹＡ－００８２重鎖、ＮＹＡ－１１４３重鎖、ＮＹＡ－１１６３重鎖、ＮＹＡ－２０２３重鎖、ＮＹＡ－２０２７重鎖、ＮＹＡ－２０３５重鎖、ＮＹＡ－２０４４重鎖、ＮＹＡ－２０４５重鎖、ＮＹＡ－２０４７重鎖、ＮＹＡ－２０４８重鎖、ＮＹＡ－２０６０重鎖、ＮＹＡ－２０６１重鎖、ＮＹＡ－２１４３重鎖、及び、ＮＹＡ－３０６１重鎖を例示することができる。

【0098】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の軽鎖としては、上記好適又はより好適な軽鎖可変領域を含むものを、好適な例としてあげることができ、より好適には、ＮＹＡ－０００１軽鎖、ＮＹＡ－００８２軽鎖、ＮＹＡ－１１４３軽鎖、ＮＹＡ－１１６３軽鎖、ＮＹＡ－２０２３軽鎖、ＮＹＡ－２０２７軽鎖、ＮＹＡ－２０３５軽鎖、ＮＹＡ－２０４４軽鎖、ＮＹＡ－２０４５軽鎖、ＮＹＡ－２０４７軽鎖、ＮＹＡ－２０４８軽鎖、ＮＹＡ－２０６０軽鎖、ＮＹＡ－２０６１軽鎖、ＮＹＡ－２１４３軽鎖、及び、ＮＹＡ－３０６１軽鎖を例示することができる。

【0099】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖としては、上記好適又はより好適な重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をそれぞれ含むものを、好適な例としてあげることができ、より好適には、ＮＹＡ－０００１、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－１１６３、ＮＹＡ－２０２３、ＮＹＡ－２０２７、ＮＹＡ－２０３５、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０４８、ＮＹＡ－２０６０、ＮＹＡ－２０６１、ＮＹＡ－２１４３、及びＮＹＡ－３０６１の重鎖及び軽鎖の組合せを例示することができる。

【0100】

抗体の抗原結合断片とは、該抗体の有する機能のうち少なくとも抗原結合性を保持する断片又はその修飾物を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性、抗原の活性を調節する活性、抗体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞傷害活性等を挙げることができる。本発明の抗体等及び本発明の抗体等を含む多重特異的な分子とした場合の機能としては、例えばＴ細胞のリダイレクション、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞を活性化することによるがん細胞の細胞傷害活性を挙げることができる。

【0101】

抗体の抗原結合断片としては、該抗体の有する活性のうち少なくとも抗原結合性を保持している該抗体の断片であれば特に限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させた一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。リンカー部分を保有するｓｃＦｖのように、本発明の抗体の抗原結合断片以外の部分を含む分子も、本発明の抗体の抗原結合断片の意味に包含される。

【0102】

抗体蛋白質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端のアミノ酸が１若しくは数個又はそれ以上を欠失してなり、且つ該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持している分子も、抗体の抗原結合断片の意味に包含される。そのような抗体の抗原結合断片の修飾体も、本発明の抗体若しくはその抗原結合断片、又はその修飾体（後述）に包含される。

【0103】

本発明の抗体又はその抗原結合断片の一つの態様は、ｓｃＦｖである。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａ．Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６９－３１５（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるタンデムｓｃＦｖも二重特異性分子として使用することができる。さらに３つ以上のｓｃＦｖより成るトリアボディ等も多重特異性分子として使用することができる。

【0104】

ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的なｓｃＦｖ（「抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ」とも呼ばれる）としては、好適には上記ＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３を含むもの、より好適には上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むもの、より一層好適にはＮＹＡ－０００１（配列番号７０（図７１）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－００８２（配列番号１８（図２５）で表されるアミノ酸配列及び配列番号２０（図２７で表されるアミノ酸配列を含む）、ＮＹＡ－１１４３（配列番号２９（図３６）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－１１６３（配列番号２６（図３３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０２３（配列番号２７（図３４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０２７（配列番号２８（図３５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０３５（配列番号３６（図４３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０４４（配列番号４７（図５４）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０４５（配列番号４８（図５５）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０４７（配列番号５０（図５７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０４８（配列番号５１（図５８）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０６０（配列番号５２（図５９）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、ＮＹＡ－２０６１（配列番号５３（図６０）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）、及び、ＮＹＡ－２１４３（配列番号３０（図３７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２６６）をそれぞれ例示することができる。さらに、ＮＹＡ－３０６１（配列番号１５６（図１５２）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～２７１）を例示することができる。

【0105】

抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖの好適な態様にはカルボキシル末端側にＦＬＡＧ－Ｈｉｓタグが融合したもの（単に「タグ付加体」とも呼ばれる）が含まれる。好適なタグ付加体としては、ＮＹＡ－０００１タグ付加体（配列番号７０（図７１）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－１１４３タグ付加体（配列番号２９（図３６）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－１１６３タグ付加体（配列番号２６（図３３）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０２３タグ付加体（配列番号２７（図３４）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０２７タグ付加体（配列番号２８（図３５）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０３５タグ付加体（配列番号３６（図４３）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０４４タグ付加体（配列番号４７（図５４）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０４５タグ付加体（配列番号４８（図５５）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０４７タグ付加体（配列番号５０（図５７）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０４８タグ付加体（配列番号５１（図５８）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０６０タグ付加体（配列番号５２（図５９）のアミノ酸番号２０～２９２）、ＮＹＡ－２０６１タグ付加体（配列番号５３（図６０）のアミノ酸番号２０～２９２）、及び、ＮＹＡ－２１４３タグ付加体（配列番号３０（図３７）のアミノ酸番号２０～２９２）をあげることができる。

【0106】

それらのうち、ＮＹＡ－２０２３及びそのタグ付加体、ＮＹＡ－２０４７及びそのタグ付加体、ＮＹＡ－２０４８及びそのタグ付加体、ＮＹＡ－２０６０及びそのタグ付加体、並びに、ＮＹＡ－２０６１及びそのタグ付加体は、Ｆｃ付加型二重特異性分子において、優れた生物活性、物性等を有し、より好適である。

【0107】

また、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ及びそのタグ付加体を宿主細胞において発現させる場合、そのアミノ末端にシグナルペプチドを付加させることができる。シグナルペプチドが付加した抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖタグ付加体のアミノ酸配列としては、配列番号７０、２９、２６～２８、３６、４７、４８、５０～５３及び３０（図７１、３６、３３～３５、４３、５４、５５、５７～６０及び３７）をあげることができる。

【0108】

ｓｃＦｖは、抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５－１１１６）により取得することができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３－４５５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５－１１１６）。

【0109】

本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であってもよい。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８），４４６－４４８）。これらの抗体も、本発明における抗体の抗原結合断片の意味に包含される。

【0110】

また、本発明には、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結した一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）が含まれる（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２（１），１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体は、一本鎖イムノグロブリンであってもよい。
本発明のｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がジスルフィド結合していてもよい。

【0111】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体は、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合すれば、複数の異なる抗体に由来する部分から構成される抗体であってもよく、例えば、複数の異なる抗体間で重鎖及び／又は軽鎖を交換したもの、重鎖及び／又は軽鎖の全長を交換したもの、可変領域のみ又は定常領域のみを交換したもの、ＣＤＲの全部又は一部のみを交換したもの等を挙げることができる。キメラ化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、異なる本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体に由来してもよい。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中の重鎖ＣＤＲ１乃至重鎖ＣＤＲ３並びに軽鎖ＣＤＲ１乃至軽鎖ＣＤＲ３は、２種又はそれ以上の本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体に由来してもよい。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中の重鎖ＣＤＲ１乃至重鎖ＣＤＲ３並びに軽鎖ＣＤＲ１乃至軽鎖ＣＤＲ３は、２種又はそれ以上の本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体が有するＣＤＲの組合せであってもよい。

【0112】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体には、本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する抗体も含まれる。

【0113】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域に含まれるアミノ酸配列（好適には、配列番号２７で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０のアミノ酸配列、配列番号３８で表されるアミノ酸配列、配列番号３９で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号１６０、配列番号１９７もしくは配列番号１９８で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２１～１４０のアミノ酸配列）、及び／又、軽鎖可変領域に含まれるアミノ酸配列（好適には、配列番号２７で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６のアミノ酸配列、配列番号５２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６のアミノ酸配列、配列番号４０で表されるアミノ酸配列、配列番号１６０で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１６１～２７１のアミノ酸配列、又は、配列番号１９７もしくは配列番号１９８で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１５６～２６６のアミノ酸配列）と、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上同一のアミノ酸配列を含み、且つＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する抗体又はその抗原結合断片であってもよい。

【0114】

軽鎖可変領域の位置と長さは、ＩＭＧＴの定義により決定する場合と比べ、ＩＭＧＴとは異なる定義（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ，ｃｏｎｔａｃｔ等）を用いて決定した場合、ＩＭＧＴの定義により決定した該軽鎖可変領域アミノ酸配列のカルボキシル末端に、さらに、１つ又は２つ以上のアミノ酸、例えば、アルギニンやグリシンが含まれることがある。このような軽鎖可変領域を有する抗体又はその結合断片も本発明の抗体又はその結合断片に包含される。

【0115】

本発明の抗体等としては、本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体の結合断片に変異を導入して、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ、特にヒト及び／又はカニクイザルのＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに対する結合能を最適化させたものであってもよい。変異を導入する具体的な方法として、エラープローンＰＣＲ法を用いたランダム突然変異誘発法、ＮＮＫライブラリーを用いた部位特異的アミノ酸変異導入、構造情報を利用した部位特異的変異導入、及びそれら組合せを挙げることができる。

【0116】

３－２．抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体の変異体（変異抗体）
本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体の変異抗体には、好適には、蛋白質の分解若しくは酸化に対する感受性の低下、生物活性や機能の維持、改善若しくは低下や変化の抑制、抗原結合能の改善若しくは調節、又は物理化学的性質若しくは機能的性質の付与等がなされ得る。蛋白質は、その表面にある特定のアミノ酸側鎖が変化して当該蛋白質の機能や活性が変化することが知られ、そのような例には、アスパラギン側鎖の脱アミド化、アスパラギン酸側鎖の異性化等が含まれる。そのようなアミノ酸側鎖の変化を防ぐために別のアミノ酸に置き換えたものも、本発明の変異抗体の範囲に含まれる。

【0117】

本発明の変異抗体の例として、抗体の有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換されてなるアミノ酸配列を有する抗体を挙げることができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。

【0118】

好適なアミノ酸グループは、以下の通りである：酸性グループ＝アスパラギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかる変異抗体におけるアミノ酸置換は、元の抗体が有する抗原結合活性を低下させない範囲で行うのが好ましい。

【0119】

ＮＹＡ－２０２３等の本発明の抗体が有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換及び／又はその他の変異がなされたアミノ酸配列を有し、且つ、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する変異抗体、それらの抗原結合断片、それらを含む分子等；ＮＹＡ－２０２３等を含む本発明の抗体由来のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換及び／又はその他の変異がなされたアミノ酸配列を有し、且つ、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する該ＣＤＲを含むキメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの抗原結合断片、それらを含む分子等も本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体、その抗原結合断片、その変異体（変異抗体又はその抗原結合断片）、又は本発明の分子に包含される。

【0120】

３－３．抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体の結合断片
本発明の一つの態様として、本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体の抗原結合断片（以下、単に「結合断片」という）を提供する。本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体の結合断片には、キメラ化抗体、ヒト化抗体、又は、ヒト抗体の結合断片が包含される。抗体の結合断片とは、該抗体の有する機能のうち少なくとも抗原結合性を保持する断片又はその修飾物を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性、抗原の活性を調節する活性（例えばアゴニスト活性）、抗原を細胞内に内在化させる活性、抗原と相互作用する物質との相互作用を阻害若しくは促進する活性等を挙げることができる。

【0121】

抗体の結合断片としては、該抗体の有する活性のうち少なくとも抗原結合性を保持している該抗体の断片であれば特に限定されない。このような抗体の結合断片として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ軽鎖のカルボキシル末端とＦａｂ重鎖のアミノ末端とが適当なリンカーで連結された一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、Ｆｖ、重鎖及び軽鎖のＦｖが適当なリンカーで連結された一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一の重鎖可変領域を有し軽鎖配列を有さない単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）とも呼ばれる。（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８），４４６－４４８）］等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。リンカー部分を保有するｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖのように、本発明の抗体の結合断片以外の部分を含む分子も、本発明の抗体の結合断片の意味に包含される。

【0122】

３－４．抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその結合断片の修飾体、複合体
本発明は、抗体又はその結合断片の修飾体を提供する。本発明の抗体又はその結合断片の修飾体とは、本発明の抗体又はその結合断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合又はＯ－結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合又はＯ－結合への糖鎖付加、アミノ末端領域又はカルボキシル末端領域のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりアミノ末端にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティー標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体又はその結合断片の修飾物は、元の本発明の抗体又はその結合断片の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。

【0123】

化学的修飾体に含まれる化学部分としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを例示することができる。

【0124】

生物学的な修飾物としては、酵素処理や細胞処理等により修飾が施されたもの、遺伝子組換えによりタグ等他のペプチドが付加された融合体、並びに内因性又は外来性の糖鎖修飾酵素を発現する細胞を宿主として調製されたもの等を挙げることができる。

【0125】

かかる修飾は、抗体又はその結合断片における任意の位置に、又は所望の位置において施されてもよく、１つ又は２つ以上の位置に同一又は２種以上の異なる修飾がなされてもよい。

【0126】

しかし、これらの重鎖配列の欠失、あるいは、重鎖又は軽鎖配列の修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）にはあまり影響を及ぼさない。

【0127】

従って、本発明には当該欠失又は修飾を受けた抗体も含まれる。例えば、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ；７０５；１２９－１３４（１９９５））、重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化された当該欠失体（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５－８３（２００７））、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端のグルタミン又はグルタミン酸残基がピログルタミル化修飾された抗体（国際特許公開ＷＯ２０１３／１４７１５３号）等を挙げることができる（それらをまとめて「欠失体」と呼ぶ）。ただし、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖及び軽鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体が２本以上の鎖（例えば重鎖）を含む場合、当該２本以上の鎖（例えば重鎖）は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組合せたものであっても良い。各欠失体の量比又は分子数比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。

【0128】

さらに、本発明の抗体又はその抗原結合断片（本発明の分子、多重特異的分子、二重特異的分子等に含まれるもの等）に、発現ベクター及び／又はシグナル配列等に由来する１乃至数個のアミノ酸がアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に付加され（且つその一部又は全部が前記のように修飾され）ていても、所望の抗原結合活性が維持されていれば、本発明の抗体の修飾体又はその抗原結合断片の修飾体の範囲に包含され、そのような抗体又は抗原結合断片の修飾体を含む分子も本発明の分子の範囲に包含される。

【0129】

本発明において「抗体又はその結合断片」は「抗体又はその抗原結合断片の修飾体」もその意味に含むものである。また、本発明の分子、多重特異的な分子、二重特異的な分子等に含まれる「抗体又はその抗原結合断片」はかかる「抗体又はその抗原結合断片の修飾体」もその意味に含むものである。

【0130】

また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること（グリコシル化、脱フコース化等）によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、国際特許公開ＷＯ９９／５４３４２号、ＷＯ００／６１７３９号、ＷＯ０２／３１１４０号等が知られているが、これらに限定されるものではない。

【0131】

本発明には、上述の抗体と他の分子がリンカーでつながれた複合体（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）も含まれる。該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物（薬物）と結合している抗体－薬物複合体の例としては、ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を挙げることができる（（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１３）１０４５：１－２７；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。

【0132】

更に本発明には、これらの抗体と他の機能性ポリペプチドを繋げた複合体も含まれる。このような抗体－ペプチド複合体の例としては、該抗体がアルブミン結合ポリペプチドと複合体を挙げることができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．（２０１２）（２）：８１－８）。

【0133】

上述の抗体の修飾体、糖鎖修飾を調節された抗体、複合体は、本発明の抗体に包含され、上述の抗体の修飾体、糖鎖修飾を調節された抗体、複合体の結合断片は、本発明の抗体の結合断片に包含される。

【0134】

４．抗体の産生方法
本発明の抗体は、例えば、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、発現用の宿主細胞を該ベクターで形質転換し、宿主細胞を培養することにより、リコンビナント抗体として細胞に産生させることができる。

【0135】

抗体をコードするＤＮＡは、重鎖可変領域をコードするＤＮＡと重鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結することにより重鎖をコードするＤＮＡが得られ、さらに軽鎖可変領域をコードするＤＮＡと軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結することにより軽鎖をコードするＤＮＡが得られる。

【0136】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体は、上記の重鎖をコードするＤＮＡ及び軽鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該ベクターで形質転換し、該宿主細胞を培養して産生させることができる。この際、上記の重鎖をコードするＤＮＡ及び軽鎖をコードするＤＮＡを同じ発現ベクターに導入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよいし、重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡを別々のベクターに挿入し、２つのベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよい。この際、重鎖定常領域をコードするＤＮＡ及び軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを予め導入したベクターに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを導入してもよい。また、該ベクターは宿主細胞からの抗体の分泌を促進するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含んでいてもよい、この場合、シグナルペプチドをコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡをインフレームで連結しておく。抗体が産生された後にシグナルペプチドを除去することにより、抗体を成熟タンパク質として得ることができる。

【0137】

この際、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ及び重鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡと軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡをプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。

【0138】

発現ベクターは、動物細胞、細菌、酵母等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、公知のプラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター（プロメガ社）、ｐＵＣ１９、ｐＵＥＸ２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ－ｎｅｏ（クロンテック社製）等が挙げられる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞も酵母、動物細胞等の真核細胞も用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。例えば、動物細胞として、ヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞等を用いればよい。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換すればよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法等が挙げられる。産生された抗体は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用して精製することができる。例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択し、組合せればよい。

【0139】

５．ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する分子
本発明の分子は、本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片を含む。本発明の分子は、好適には、２以上の抗原結合部位を持つ多重特異性分子である。すなわち、１つの分子上の２つ以上の互いに異なるエピトープ又は２つ以上の分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能な分子であり、複数の互いに異なる抗原結合断片を包む。このような多重特異性分子には、ＩｇＧ型多重特異性分子、２種類以上の可変領域を有する多重特異性分子、例えばタンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）、一本鎖ダイアボディ、ダイアボディ及びトリアボディのような抗体断片、共有結合又は非共有結合して連結されている抗体断片を含むが、これらに限定されない。多重特異的な分子はＦｃを含んでいてもよい。

【0140】

本発明の多重特異的な分子は、本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその抗原結合断片に加え、１つ又は２つ以上のさらなる抗体又は該抗体の抗原結合断片を含んでよい。さらなる抗体の抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂを挙げることができる。

【0141】

本発明の好適な多重特異性分子は、さらに、抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片を含み、ＣＤ３にも特異的に結合する。

【0142】

本発明の多重特異性分子に含まれる抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、ヒトＣＤ３に結合する抗体又はその結合断片であれば特に限定されるものではないが、好適にはカニクイザル等の非ヒト霊長類のＣＤ３にも結合する。より好適な抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合断片としては、配列番号１４１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ１、配列番号１４２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ２、配列番号１４３で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域ＣＤＲＨ３、配列番号１４４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ１、配列番号１４５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ２、及び、配列番号１４６で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域ＣＤＲＬ３（以上、図１４２）を含んでなる抗体又はその抗原結合断片を例示することができる。

【0143】

該ＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３を含むより好適な抗体又はその抗原結合断片としては、配列番号１３６（図１３７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～１１９のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０３４重鎖可変領域、配列番号１３７（図１３８）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～１１９のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０３６重鎖可変領域、配列番号１３８（図１３９）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～１１９のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０８５重鎖可変領域、配列番号１３９（図１４０）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～１１９のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０８８重鎖可変領域、配列番号１４０（図１４１）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～１１９のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９３重鎖可変領域、配列番号１５５（図１５１）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２７２～３８９のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９６重鎖可変領域、配列番号１５６（図１５２）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２７７～３９４のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９６重鎖可変領域、配列番号１５７（図１５３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２７７～３９４のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９７重鎖可変領域を含んでなる抗体又はその抗原結合断片を例示することができる。

【0144】

また、該ＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３を含むより好適な抗体又はその抗原結合断片としては、配列番号１３６（図１３７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３５～２４３のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０３４軽鎖可変領域、配列番号１３７（図１３８）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３５～２４１のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０３６軽鎖可変領域、配列番号１３８（図１３９）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３５～２４１のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０８５軽鎖可変領域、配列番号１３９（図１４０）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３５～２４３のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０８８軽鎖可変領域、配列番号１４０（図１４１）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３５～２４３のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９３軽鎖可変領域、配列番号１５５（図１５１）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４０５～５１１のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９６軽鎖可変領、配列番号１５６（図１５２）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４１０～５１６のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９６軽鎖可変領、配列番号１５７（図１５３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号４１０～５１６のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９７軽鎖可変領を含んでなる抗体又はその抗原結合断片を例示することができる。

【0145】

また、該ＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３を含むより好適な抗体又はその抗原結合断片としては、配列番号１３６（図１３７）で表されるアミノ酸番号２～１１９及び１３５～２４３からなるＣ３Ｅ－７０３４重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、配列番号１３７（図１３８）で表されるアミノ酸番号２～１１９及び１３５～２４１からなるＣ３Ｅ－７０３６重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、配列番号１４７（図１４３）で表されるアミノ酸番号２～１１９及び１３５～２４３からなるＣ３Ｅ－７０７８重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、配列番号１３８（図１３９）で表されるアミノ酸番号２～１１９及び１３５～２４１からなるＣ３Ｅ－７０８５重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、配列番号１３９（図１４０）で表されるアミノ酸番号２～１１９及び１３５～２４３からなるＣ３Ｅ－７０８８重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、配列番号１４０（図１４１）で表されるアミノ酸番号２～１１９及び１３５～２４３からなるＣ３Ｅ－７０９３重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、配列番号１５５（図１５１）で表されるアミノ酸番号２７２～３８９及び４０５～５１１からなるＣ３Ｅ－７０９６重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、配列番号１５６（図１５２）で表されるアミノ酸番号２７７～３９４及び４１０～５１６からなるＣ３Ｅ－７０９６重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せ、配列番号１５７（図１５３）で表されるアミノ酸番号２７７～３９４及び４１０～５１６からなるＣ３Ｅ－７０９７重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の組合せを含んでなる抗体又はその抗原結合断片を例示することができる。

【0146】

さらに、該ＣＤＲＨ１～ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１～ＣＤＲＬ３を含むより好適な抗体又はその抗原結合断片としては、配列番号１３６（図１３７）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～２４３のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０３４ｓｃＦｖ、配列番号１３７（図１３８）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～２４１のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０３６ｓｃＦｖ、配列番号１４７（図１４３）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～２４３のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０７８ｓｃＦｖ、配列番号１３８（図１３９）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～２４１のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０８５ｓｃＦｖ、配列番号１３９（図１４０）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～２４３のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０８８ｓｃＦｖ、配列番号１４０（図１４１）で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２～２４３のアミノ酸配列からなるＣ３Ｅ－７０９３ｓｃＦｖ、及び、それらのｓｃＦｖのいずれか一つを含む抗体又は抗体の結合断片等を例示することができる。ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（「抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ」とも呼ばれる）の好適な態様にはカルボキシル末端側にＦＬＡＧ－Ｈｉｓタグを付加したもの（単に「タグ付加体」とも呼ばれる）が含まれる。好適なタグ付加体としては、Ｃ３Ｅ－７０３４（配列番号１３６：図１３７）、Ｃ３Ｅ－７０３６（配列番号１３７：図１３８）、Ｃ３Ｅ－７０８５（配列番号１３８：図１３９）、Ｃ３Ｅ－７０８８（配列番号１３９：図１４０）及びＣ３Ｅ－７０９３（配列番号１４０：図１４１）を例示することができ、より好適にはＣ３Ｅ－７０８５をあげることができる。

【0147】

本発明の多重特異性分子の好適な例として、二重特異性分子を挙げることができる。「二重特異性」とは、同一分子の２つの互いに異なるエピトープ又は２つ分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能であることを意味し、このような二重特異性を有する抗体又は抗原結合断片を包含する。本発明の二重特異性分子は、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合し、さらにＣＤ３に結合する。

【0148】

本発明の二重特異性分子として以下の構造（フォーマット）を有するものが挙げられる。

【0149】

Ｄｕａｌ ｓｃＦｖ型の二重特異性分子では、異なるエピトープに結合する２種のｓｃＦｖが、二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。あるいは、異なるエピトープに結合する２種類のｓｃＦｖがそれぞれＣＨ、ＣＬにリンカーにて連結され、さらに二量体のＦｃの一方とそれぞれリンカーにて連結されている。該二重特異性分子は、２種類の異なるｓｃＦｖ其々の下流にヘテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃがヘテロに会合したフォーマットである。Ｄｕａｌ ｓｃＦｖ型の二重特異性分子を、Ｄｕａｌ型二重特異性分子、又は単にＤｕａｌ型と呼ぶ（図６Ａ(b))。

【0150】

本発明においては、例えば、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ｓｃＦｖからなるＤｕａｌ型二重特異性分子を用いればよい。

【0151】

あるいは、本発明の二重特異性分子として、異なるエピトープに結合するＦａｂとｓｃＦｖが、二量体のＦｃの一方に第１の抗体のＦａｂ、もう一方に第２の抗体のｓｃＦｖをリンカーを介して結合させた二重特異性分子であってもよい。該二重特異性分子は、Ｆａｂ及びｓｃＦｖのそれぞれ下流にへテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃがヘテロに会合したフォーマットである。このような二重特異性分子を、Ｈｙｂｒｉｄ型二重特異性分子、又はＨｙｂｒｉｄ型と呼ぶ（図６Ａ(a)）。本発明においては、例えば、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ Ｆａｂと抗ＣＤ３ｓｃＦｖからなるＨｙｂrｉｄ型を用いることができる。

【0152】

さらに、二量体のＦｃの一方に第１の抗体のＦａｂと第２の抗体のｓｃＦｖをリンカーを介して結合させた二重特異性分子であってもよい。この場合、ＦｃにＦａｂを結合させ、該ＦａｂにｓｃＦｖを結合させてもよいし、ＦｃにｓｃＦｖを結合させ、該ｓｃＦｖにＦａｂを結合させてもよい。好ましくは、Ｆａｂを結合させ、該ＦａｂにｓｃＦｖを結合させる。ＦａｂとｓｃＦｖの結合は、Ｆａｂの可変領域にリンカーを介してｓｃＦｖを結合させればよい。該二重特異性分子は、ｓｃＦｖとＦａｂをリンカーでつなげた下流にヘテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃが会合したフォーマットである。このような二重特異性分子をｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子又はｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型と呼ぶ（図６Ａ(c))。

【0153】

本発明においては、例えば、抗ＣＤ３ｓｃＦｖと抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ＦａｂからなるｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型を用いればよい。

【0154】

さらに、第１の抗体と第２の抗体の２種類のｓｃＦｖをリンカーでつなげたフォーマットを有するｔａＦｖ（図３(c))を、二量体のＦｃの一方にリンカーを介するか又はリンカーを介さずに直接結合させてもよい。このような二重特異性分子をｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子又はｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型と呼ぶ（図３(d)）。該二重特異性分子は、ｔａＦｖの下流にヘテロダイマーを形成する変異をいれたＦｃがヘテロに会合したフォーマットである。ｔａＦｖにおける第１の抗体と第２の抗体の連結順序は限定されないが、ｔａＦｖにおける第１の抗体と第２の抗体の連結順序を逆にした場合、最初の二重特異性分子をｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型と呼ぶのに対して、ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型（ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－Ｆｃ型ともいう）と呼ぶ。

【0155】

図６Ａ(a)にＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子、図６Ａ(b)にＤｕａｌ型二重特異性分子、図６Ａ(c)にｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の構造を示す。また、図３(a)にｓｃＦｖ、図３(b)にＦａｂ、図３(c)にｔａＦｖ、図３(d)にｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子、図３(e)にｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の構造を示す。さらに、図６Ｂ(a)にｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子（図３(d)に同じ）、図６Ｂ(b)にｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子、図６Ｂ(c)にｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチド、図６(d)にｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドの構造を示す。
本発明の二重特異性分子は、複数のポリペプチドが会合した構造を有している。

【0156】

本発明においては、例えば、ｔａＦｖとしては、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯｓｃＦｖと抗ＣＤ３ｓｃＦｖのｔａＦｖを用いればよい。ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子は、好適には、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ及び免疫グロブリンＦｃ領域（ｉ）をその順に含んでなる第１ポリペプチドと、免疫グロブリンのヒンジ領域及びＦｃ領域（ｉｉ）を含んでなる第２ポリペプチドを含み、より好適には、（ｂ）第１ポリペプチドと第２ポリペプチドがＦｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合してなる。第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドのＦｃ領域は、ヘテロダイマーを形成するための変異を含んでもよい。ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の例を図３(d)に示す。図３(d)に示すように、第１ポリペプチドのＦｃ領域（ｉ）部分と黒塗で示す第２ポリぺプチドのＦｃ領域（ｉｉ）部分が結合し、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドが会合している。図３(f)が第１ポリペプチドを示し、図３(g)が第２ポリペプチドを示す。例えば、図３(d)において、白で表されたｓｃＦｖが抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖであり、右上斜線で表されたｓｃＦｖが抗ＣＤ３ ｓｃＦｖである。

【0157】

本発明のより好適なｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチドは、配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２０番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２０番目～５１６番目のアミノ酸配列、又は配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２０番目～５１６番目のアミノ酸配列を含み、より一層好適なｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチドは、配列番号８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、８６、１４９、１５０又は１５５で表されるアミノ酸配列の５２９番目～７４５番目のアミノ酸配列、あるいは配列番号１５６又は１５７で表されるアミノ酸配列の５３４番目～７５０番目のアミノ酸配列を含み、さらにより層好適なｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチドは、配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列）、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列又は配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる。あるいは、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列又は配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列からなる。

【0158】

本発明の好適なｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドは、ヒト抗体由来のヒンジ領域及び変異型Ｆｃを含んでなり、より一層好適なｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドは、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目のアミノ酸配列を含んでなる。
これらのうち、配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００１６、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００２２、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００２３、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００２７、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００３５、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００４４、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００４５、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００４７、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００４８、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００６０、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００６１、配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００１９、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００１４、並びに、配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２１番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＦ－００８２を、本発明の好適なｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子として例示することができる。

【0159】

さらに、配列番号１５５で表されるアミノ酸配列の２０番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＺ－００３８、配列番号１５６で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＺ－００８２、配列番号１５７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７５０番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド及び及び配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目からなる第２ポリペプチドが会合してなるＮＹＺ－００８３を、本発明の好適なｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子として例示することができる。

【0160】

それらのうち、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００４７、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０、ＮＹＦ－００６１、ＮＹＺ－００３８、ＮＹＺ－００８２、及びＮＹＺ－００８３は、とりわけ優れた生物活性、物性等を有し、好適である。

【0161】

さらに、二量体のＦｃの一方に第１の抗体のｔａＦｖをリンカーを介するか又はリンカーを介さずに直接結合させ、もう一方のＦｃに第１の抗体若しくは第２の抗体のＦａｂをリンカーを介するか又はリンカーを介さずに直接結合させてもよい。該二重特異性分子は、ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型の第２ポリペプチドのＦｃ領域（ｉｉ）(黒塗り)側の上流にＦａｂを付加したフォーマットである。このような二重特異性分子をｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子又はｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型と呼ぶ（図３）。

【0162】

本発明においては、ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれるｔａＦｖとしては、例えば、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖと抗ＣＤ３ｓｃＦｖのｔａＦｖを用いればよく、Ｆａｂとしては、例えば、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ Ｆａｂを用いればよい。

【0163】

ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子は、好適には、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖ及び免疫グロブリンＦｃ領域（ｉ）をその順で含んでなる第１ポリペプチド、Ｆｃ領域（ｉｉ）を含む免疫グロブリン重鎖からなる第２ポリペプチド、及び、免疫グロブリン軽鎖からなる第３ポリペプチドを含み、より好適には、（ｂ）第２ポリペプチドと第３ポリペプチドが会合しており、（ｃ）第１ポリペプチドと第２ポリペプチドがＦｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合してなる。ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の例を図３(e）に示し、第１ポリペプチドを図３(f）に示し、第２ポリペプチドを図３(h）に示し、第３ポリペプチドを図３（i）に示す。図３(e）に示すように、第１ポリペプチドのＦｃ領域（ｉ）部分と黒塗で示すＦｃ領域（ｉｉ）を含む免疫グロブリン重鎖からなる第２ポリペプチドが第１ポリペプチドのＦｃ領域（ｉ）部分と第２ポリぺプチドのＦｃ領域（ｉｉ）部分で結合し、さらに、第２ポリペプチドに免疫グロブリン軽鎖が結合している。かかる好適なｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子は、ｔａＦｖ及び免疫グロブリンのＦｃ領域を含むｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に、Ｆａｂが結合してなる、ということもできる。好適なｔａＦｖ－ＦａｂヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列としては、配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列及び配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～５１１番目のアミノ酸配列を例示することができ、さらに好適なｔａＦｖ－ＦａｂヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチドは、配列番号８５で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８７で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８８で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号８９で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９０で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９１で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９２で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９３で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９４で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９５で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号９６で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列及び配列番号８６で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、配列番号１４９で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列、又は、配列番号１５０で表されるアミノ酸配列の２１番目～７４５番目のアミノ酸配列からなる。

【0164】

本発明の好適なｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドは、ヒト抗体又はヒト化抗体重鎖の可変領域、ＣＨ１領域及びヒンジ領域、並びに変異型Ｆｃを含んでなり、より好適なｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドは、配列番号９９で表されるアミノ酸配列の２０番目～２４２番目のアミノ酸配列を含んでなる。

【0165】

本発明の好適なｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第３ポリペプチドは、ヒト抗体又はヒト化抗体軽鎖の可変領域及び定常領域を含んでなり、より好適なｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第３ポリペプチドは、配列番号１００で表されるアミノ酸配列の２１番目～１３１番目を含んでなる。

【0166】

かかる好適なｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドのうち可変領域及びＣＨ１領域並びに第３ポリペプチドはＦａｂを構成し、好適なＦａｂは抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体のＦａｂであり、例えば、ＮＹＡ－０００１のＦａｂである。

【0167】

本発明においては、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれるｓｃＦｖとしては、例えば、抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ又は抗ＣＤ３ｓｃＦｖを用いればよく、Ｆａｂとしては、例えば、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ Ｆａｂ又は抗ＣＤ３ Ｆａｂを用いればよい。

【0168】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子は、好適には、（ａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに特異的に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ３に特異的に結合する抗体重鎖の可変領域及び定常領域ＣＨ１並びに免疫グロブリンＦｃ領域（ｉ）をその順で含んでなる第１ポリペプチド、免疫グロブリンのヒンジ領域及びＦｃ領域（ｉｉ）を含んでなる第２ポリペプチド、並びに、可変領域及び定常領域からなる抗体軽鎖を含む第３ポリペプチドを含み、より好適には、（ｂ）第１ポリペプチドと第２ポリペプチドがＦｃ領域（ｉ）とＦｃ領域（ｉｉ）において会合し、第１ポリペプチドが抗体重鎖の可変領域及び定常領域ＣＨ１において第３ポリペプチド（の抗体軽鎖）と会合してなる。第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドのＦｃ領域は、野生型であっても、ヘテロダイマーを形成する変異を含んでいてもよい。ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の例を図６Ａ（ｃ）に示す。図６Ａ（ｃ）の右半分が第１ポリペプチド及び第３ポリペプチドであり、左半分が第２ポリペプチドである。図６Ａ（ｃ）に示すように、第１ポリペプチドのＦｃ領域（ｉ）部分と黒塗で示す第２ポリぺプチドのＦｃ領域（ｉｉ）部分が会合し、第１ポリペプチドと第３ポリペプチドが会合している。例えば、図６Ａ(c)において、右上斜線で表されたｓｃＦｖが抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖであり、白及び市松模様及び横線で表されたＦａｂが抗ＣＤ３ Ｆａｂである。

【0169】

好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチドに含まれるアミノ酸配列としては、配列番号１６０で表されるアミノ酸配列の２１番目～３９４番目のアミノ酸配列を、さらに好適には２０番目～７２４番目のアミノ酸配列を、それぞれ例示することができる。

【0170】

また、好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチドに含まれる他のアミノ酸配列としては、配列番号１９７で表されるアミノ酸配列の２１番目～３８９番目のアミノ酸配列を、さらに好適には２０番目～７１９番目のアミノ酸配列を、それぞれ例示することができる。
さらに、好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第１ポリペプチドに含まれる他のアミノ酸配列としては、配列番号１９８で表されるアミノ酸配列の２１番目～３８９番目のアミノ酸配列を、さらに好適には２０番目～７１９番目のアミノ酸配列を、それぞれ例示することができる。

【0171】

本発明の好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドは、ヒト抗体由来のヒンジ領域及び変異型Ｆｃを含んでなり、より一層好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドは、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目のアミノ酸配列を含んでなる。

【0172】

本発明の好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第３ポリペプチドは、ヒト抗体由来の軽鎖を含んでなり、より好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第３ポリペプチドとしては、配列番号１６１で示されるアミノ酸配列の２１番目～１２７番目のアミノ酸配列、より一層好適には２１番目～２３３番目のアミノ酸配列を、それぞれ例示することができる。

【0173】

これらのうち、配列番号１６０で表されるアミノ酸配列の２０番目～７２４番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目からなる第２ポリペプチド、及び、配列番号１６１で示されるアミノ酸配列の２１番目～２３３番目からなる第３のポリペプチドが会合してなるＮＹＺ－１０１０を、本発明の好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子として例示することができる。

【0174】

また、配列番号１９７で表されるアミノ酸配列の２０番目～７１９番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目からなる第２ポリペプチド、及び、配列番号１６１で示されるアミノ酸配列の２１番目～２３３番目からなる第３のポリペプチドが会合してなるＮＹＺ－１００７も、本発明の好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子として例示することができる。

【0175】

さらに、配列番号１９８で表されるアミノ酸配列の２０番目～７１９番目のアミノ酸配列からなる第１ポリペプチド、配列番号８４で示されるアミノ酸配列の２０番目～２４６番目からなる第２ポリペプチド、及び、配列番号１６１で示されるアミノ酸配列の２１番目～２３３番目からなる第３のポリペプチドが会合してなるＮＹＺ－１０１７も、本発明の好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子として例示することができる。

【0176】

本発明の二重特異性分子に含まれる１つ、２つ又は３つ以上のペプチドは、前述の「欠失体」であってよく、すなわち、そのカルボキシル末端、とりわけ抗体重鎖に由来するカルボキシル末端において、１又は２個（又はそれ以上）のアミノ酸が変異（欠失を含む）していてよい。例えば、本発明の好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の一つであるＮＹＺ－１０１０に含まれる第１ポリペプチドが有するアミノ酸配列のカルボキシル末端は、配列番号１６０の７２４番目Ｌｙｓ、１アミノ酸が欠失してなる７２３番目Ｇｌｙ、それらを含む混合物、のいずれであってもよい。同様に、本発明の好適なｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子に含まれる第２ポリペプチドが有するアミノ酸配列のカルボキシル末端は、配列番号８４の２４６番目Ｌｙｓ、１アミノ酸が欠失してなる２４５番目Ｇｌｙ、それらを含む混合物、のいずれであってもい。

【0177】

本発明の二重特異性分子に含まれるｓｃＦｖ及びＦａｂは、好ましくは、ヒト化抗体又はヒト抗体のｓｃＦｖ及びＦａｂであり、Ｆｃは、好ましくは、ヒト抗体のＦｃである。

【0178】

本発明の二重特異性分子に含まれる可変領域においては、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合していてもよく、あるいは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合していてもよい。両可変領域の間に、リンカーを有していてもよい（任意で）。また、アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有していてもよい（任意で）。タンデムｓｃＦｖ型の二重特異性分子では、カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、ＦＬＡＧタグ、及び／又は、Ｈｉｓタグが結合していてもよい（任意で）。好適な態様の一つとして、アミノ末端から、重鎖可変領域、第１のリンカー、軽鎖可変領域、第２のリンカー、ＦＬＡＧタグ、及び、Ｈｉｓタグの順に結合したものを例示することができる。

【0179】

リンカーは、一本鎖ポリペプチド又は一本鎖オリゴペプチド、あるいは、ＰＥＧ、ヌクレオチド、糖鎖、化合物等の合成品も含まれる。その他、二つのポリペプチドを結合するものであれば特に限定されず、公知のリンカーを使用することが可能である。

【0180】

リンカーの長さとしては、例えば、ペプチドリンカーの場合５～３０アミノ酸である。二重特異性分子に複数のリンカーが含まれる場合、すべて同じ長さのペプチドリンカーを用いてもよいし、異なる長さのペプチドリンカーを用いてもよい。

【0181】

ペプチドリンカーとしては、例えば、（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）（配列番号１６１）の繰り返しが例示されるが、これらに１～数個のＧｌｙ、Ｓｅｒとは異なるアミノ酸残基が付加していてもよい。

【0182】

上述のような、本発明の多重特異性抗体、特に二重特異性抗体が採り得る構造（フォーマット）のうち、好適なものは、ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型、ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型及びｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型であり、より好適なものはｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型であり、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの順に位置している型（ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型）は、その逆に位置している型（ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型）に比してより一層好適である（実施例１１等）。また、他のより好適なものはｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型である。

【0183】

本発明には、本発明の分子に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合し、好適にはさらにＣＤ３にも結合する分子も含まれる。

【0184】

本発明には、本発明の分子に含まれるアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上同一のアミノ酸配列を含み、且つ、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合し、好適にはさらにＣＤ３にも結合する分子も含まれる。

【0185】

本発明の抗体、その結合断片及びそれらを含む多重特異性抗体は、優れた生物学的活性、物理化学的性質（以下「物性」という。）、安全性、体内動態等の性質を具備している。（ａ）生物学的活性又はその指標としては、抗原結合活性、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性等を例示することができる。例えば、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに対する解離定数（ＫＤ値）は、１００ｎＭ以下又は５０ｎＭ以下、好適には２０ｎＭ以下又は１０ｎＭ以下、より好適には５ｎＭ以下である。また、例えば、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現細胞株であるＵ２６６Ｂ１及び／又はＮＣＩ－Ｈ１７０３に対して、ヒト末梢血単核細胞をエフェクター細胞として用いて発揮される細胞傷害活性のＥＣ_５０値は２０ｎＭ以下、好適には１０ｎＭ以下、より好適には５ｎＭ以下である（ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性の測定及び算出としては、実施例８記載の方法を例示できるが、それに限定されない）。さらに、例えば、ヒト扁平上皮肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７０３の６×１０^７細胞／ｍＬ懸濁液をＮＯＧマウスの皮下に０．１ｍＬ移植し、４日後ヒト末梢血単核細胞の３．７５×１０^７細胞／ｍＬ懸濁液を０．２ｍＬ尾静脈内移植し、１４日後から週１回、抗体を３回投与後腫瘍の体積を測定した際の、溶媒を投与した対照群に対する腫瘍増殖阻害活性は、５０％以上、好適には７５％以上、より好適には９０％以上である（ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性の測定及び算出としては、実施例９記載の方法を例示できるが、それに限定されない）。（ｂ）バイオ医薬品に含まれる不純物は、医薬品の安全性に関与するため、製造時および保存中での増加の有無を適切に規格設定し管理することが求められている。その中でもＨＭＷＳ（凝集物）は、主要な不純物の一つであり、免疫原性リスクや薬効の低下等にも関与するため、特に厳重に管理すべき項目である。不純物の管理は製造時のみでなく、製造工程中や製造後の経時的な安定性（増加の有無）も含めて評価を実施する必要がある。長期安定性試験の結果に基づいて医薬品の有効期間が設定されるため、経時的に安定な抗体のほうがより長い有効期間を設定することができる。よってバイオ医薬品をめざし好適な抗体を選抜する際の指標となる、本発明における物理化学的性質としては、耐酸性（ＨＭＷＳ生成抑制等）、溶液安定性（ＨＭＷＳ生成抑制等）が挙げられる。また他の指標としては、本発明の抗体若しくはその結合断片又はそれらを含む分子の産生に適した宿主細胞、例えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にそれらに含まれるアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入して得られる組換え細胞の培養物における収量が多い、収率が高いことなどを例示することができる。それらの物理化学的性質特徴を有する本発明の好適な抗体、その抗原結合断片、及び、それらを含有する多重特異性抗体は：それらの溶液を酸性条件下に晒すことが可能となり、それらの製造、例えば、プロテインＡ、イオン交換等のクロマトグラフィー、ウイルス不活性化等の工程の実施が可能又は容易になる；それらを溶液としてもＨＭＷＳの生成が低く抑えられるので、それらの製造、製剤化、それらを含む医薬品の流通や保存等の実施が可能又は容易になる；それらを効率よく生産することが可能となる。耐酸性について、例えば、ｐＨ３．５、室温、１時間保温し、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによりＨＭＷＳを測定して算出される生じるＨＭＷＳの含有量は５％以下、好適には２％以下、より好適には１％以下である（耐酸性評価のためのＨＭＷＳ含有量の測定及び算出としては、実施例１９－１記載の方法を例示できるが、それに限定されない）。溶液安定性について、例えば、２５ｍＭヒスチジン及び５％ソルビトールからなるｐＨ６．０に濃度２５ｍｇ/ｍｌになるよう溶解させ、２５℃、６日間保存し、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによりＨＭＷＳを測定して算出されるＨＭＷＳの含有量は２０％以下、好適には１０％以下である（溶液安定性評価のためのＨＭＷＳ含有量の測定及び算出としては、実施例１９－２記載の方法を例示できるが、それに限定されない）。生産効率又は収率の測定及び算出としては、実施例２０及び２１記載の方法を例示できるが、それに限定されない。（ｃ）安全性又はその指標としては、抗原認識特性、投与時の所見等を例示することができる。例えば、野生型ＮＹ－ＥＳＯペプチド上の複数のアミノ酸を認識し、野生型ＮＹ－ＥＳＯペプチドに類似するが同一ではないアミノ酸配列を有する相同性ペプチドには結合せず、オフターゲット効果に起因する副作用リスクが低い。また、ＩＳＰＲＩ ウェブベース免疫原性スクリーニング（ＥｐｉＶａｘ，Ｉｎｃ）において免疫原性が低く、抗抗体に起因するサイトカイン産生等の副作用リスクが低いことが予測できる。また、例えば、本発明の二重特異性抗体に含まれるＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００４５、ＮＹＦ－００４７、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０、ＮＹＦ－００６１、ＮＹＺ－００８２、又は、ＮＹＺ－１０１０をＢａｌｂ／ｃマウスに投与したところ、血中半減期には問題となるような所見は認められず、体重減少、その他の顕著な毒性所見も認められなかった。また、ＮＹＺ－００８２、又は、ＮＹＺ－１０１０をカニクイザルに単回投与したところ、血中半減期には問題となるような所見は認められず、一般状態、体重、摂餌量、体温測定、及び血漿中サイトカイン量について投与に起因する変化は認められなかった。（ｄ）動態又はその指標としては、血中半減期等を例示することができる。例えば、本発明において取得した数個の二重特異性抗体をＢａｌｂ／ｃマウス、又は、カニクイザルに投与したところ、血中半減期には問題となるような所見は認められなかった。このような、優れた生物学的活性、物理化学的性質、安全性、体内動態等の性質を具備する本発明の抗体、その結合断片及び分子は、医薬組成物に好適に含有せしめることができる。（ａ）記載の抗原結合活性及び（ｂ）記載の諸性質を有する本発明の好適な抗体又はその抗原結合断片としては、ＮＹＡ－１１４３，ＮＹＡ－１１６３、ＮＹＡ－２０２３、ＮＹＡ－２０２７、ＮＹＡ－２０３５、ＮＹＡ－２０４４，ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０４８、ＮＹＡ－２０６０、ＮＹＡ－２０３１、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０６１、ＮＹＡ－２１４３及びＮＹＡ－３０６１を、より好適にはＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０６１、ＮＹＡ－２１４３及びＮＹＡ－３０６１を、それぞれ例示することができるが、それらに限定されない。また、（ａ）～（ｄ）記載の性質を有する本発明の好適な多重特異性抗体としては、ＮＹＦ－００１６、ＮＹＦ－００１９、ＮＹＦ－００２２、ＮＹＦ－００２３、ＮＹＦ－００２７、ＮＹＦ－００３５、ＮＹＦ－００４４、ＮＹＦ－００４５、ＮＹＦ－００４７、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ０００５８、ＮＹＦ－００６０、ＮＹＦ－００６１、ＮＹＺ－００３８、ＮＹＺ－００８２、ＮＹＺ－００８８及びＮＹＺ－１０１０を、より好適には、ＮＹＦ－００６１、ＮＹＺ－００３８、ＮＹＺ－００８２、ＮＹＺ－００８８、ＮＹＺ－１００７、ＮＹＺ－１０１０、ＮＹＺ－１０１７を、それぞれ例示することができるが、それらに限定されない。

【0186】

本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合又は認識する抗原上の部分ペプチド又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体が結合又は認識するＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ上の部位としては、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯペプチド中の複数のアミノ酸、部分高次構造等を例示することができる。

【0187】

本発明の抗体又は結合断片と「同一の部位に結合する抗体又はその結合断片」も本発明に含まれる。ある抗体と「同一の部位に結合する抗体」とは、該抗体が認識する抗原分子上の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。本発明の第一抗体が上記（ａ）記載の抗原結合活性を有する場合、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ上の同一の部位に結合する第二抗体は、同様の活性を有する蓋然性が極めて高く、かかる第二抗体も本発明に包含される。また、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合において本発明の第一抗体と競合する抗体も、（ａ）記載の抗原結合活性を有していれば、本発明に包含される。そのような本発明のモノクローナル抗体が認識するＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ上の部位に結合する抗体、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合において本発明のモノクローナル抗体と競合する抗体、及びそれらの結合断片は、好適には、（ａ）記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性及びｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性並びに（ｂ）～（ｄ）記載の性質のうち１つ又は２つ以上、より好適にはそれらの３つ以上、最適には全てを有する。

【0188】

抗体の結合部位は、免疫アッセイ法など当業者に周知の方法により決定することができる。例えば、抗原のアミノ酸配列をＣ末またはＮ末から適宜削ってなる一連のペプチドを作製し、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドへの抗体の反応性を検討することにより、結合部位を決定することができる。または、例えば、抗原もしくは抗原断片ペプチド等のアミノ酸配列のうち、特定の部位や領域を削除もしくは別のアミノ酸配列に置換もしくはアミノ酸配列に変異を導入し、それらのペプチドへの抗体の反応性を検討することにより、結合部位を決定することができる。抗原断片ペプチドは、遺伝子組換、ペプチド合成等の技術を用いて調製することができる。

【0189】

抗体が抗原の部分高次構造に結合又は認識している場合、かかる抗体の結合部位は、Ｘ線構造解析を用いて、当該抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を特定することにより決定することができる。例えば、抗体又はその断片および抗原又はその断片を結合させて結晶化し、構造解析を行うことにより、抗体と相互作用距離を有する抗原上のアミノ酸残基を特定することができる。相互作用距離は８Å以下であり、好適には６Å以下であり、より好適には４Å以下である。そのような抗体との相互作用距離を有するアミノ酸残基は１つまたはそれ以上で抗体の抗原結合部位（エピトープ）を構成し得る。かかるアミノ酸残基が２つ以上の場合、各アミノ酸は一次配列上で互いに隣接していなくてもよい。

【0190】

本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はその結合断片は、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのアミノ酸配列中に存在する複数のアミノ酸を特異的に認識する。それら複数のアミノ酸を認識するか、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合において本発明の抗体又はその結合断片と競合するか、または、それら複数のアミノ酸と相互作用距離を有する抗体又はその結合断片も、本発明に包含される。さらに、そのような抗体又はその結合断片を含む多重特異性抗体も、本発明に包含される。

【0191】

６．医薬組成物
本発明は、本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体若しくはＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する多重特異性分子を有効成分として含む抗がん剤を包含する。

【0192】

本発明の抗がん剤は、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、胚細胞腫、脳腫瘍、カルチノイド、神経芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽腫から選択される一種又は複数種に対して使用することができる。具体的には、がん腫では、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん（非小細胞肺がん（腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん）、小細胞肺がん）、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がんなどが挙げられ、肉腫では、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫などが挙げられ、リンパ腫では、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫などが挙げられ、白血病では、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群などが挙げられ、骨髄腫では、多発性骨髄腫などが挙げられ、胚細胞腫では、精巣がん、卵巣がんなどが挙げられ、脳腫瘍では、神経膠腫、髄膜腫などが挙げられる。

【0193】

本発明の抗がん剤は、治療に有効量の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する多重特異性分子と薬学上許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤、補助剤等を含めることができる。「薬学上許容可能な担体」等は、対象疾患の種類や薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜選択することができる。本発明の抗がん剤の投与方法は適宜選択することができるが、例えば注射投与することができ、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等を採用することができる。また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、又は塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調製するようにしてもよい。

【0194】

他の投与方法についても、製剤の開発と共に適宜選択することができる。例えば経口投与の場合には、経口液剤や散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤等を適用することができる。経口液剤の場合には、懸濁剤及びシロップ剤等のような経口液体調整物として、水、シュークロース、ソルビトール、フラクト－ス等の糖類、ＰＥＧ等のグリコール類、ごま油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクト－ス、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギニン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤及びカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の組成物における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセル剤を製造する際には、固体の製造担体が用いられる。

【0195】

治療に用いるに有効な抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する多重特異性分子の量は、治療する病状の性質、患者の年齢や状態により変更され、最終的には医師が決めればよい。例えば、１回体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ～１００ｍｇである。所定の投与量は１～１８０日に１回投与してもよいし、１日当たり２回、３回、４回又はそれ以上の分割投与とし適当な間隔で投与してもよい。

【0196】

また、本発明の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体又はＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合する多重特異性分子に含まれるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び、該ポリヌクレオチド又はベクターを含む細胞、並びに、該ポリヌクレオチド、該ベクター及び該細胞のいずれかを有効成分として含む医薬組成物も本発明に包含される。かかる医薬組成物は、好適には抗がん剤である。

【0197】

さらに、本発明の医薬組成物は、他の薬剤と組み合わせて使用することができる。他の薬剤としては、化学療法剤、放射線療法、バイオ医薬品等特に限定されるものではなく、本発明の医薬組成物と同時に又は異なったスケジュールで、本発明の医薬組成物を含む単一の製剤として又は２つ以上の異なった製剤若しくは療法として、投与又は適用され得る。

【実施例】

【0198】

以下、実施例において本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【0199】

なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年発行）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。遺伝子合成やベクター構築のために必要なプライマー合成は、必要に応じて合成委託（株式会社ＦＡＳＭＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、およびユーロフィンジェノミクス社）した。

【0200】

（実施例１） ヒト抗体ファージライブラリー由来抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体の取得
１）－１ ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗原タンパク質の調製
ＨＬＡ－Ａ^＊０２０１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＳＡ４７５３４.１）のトランケート体（ビオチンリガーゼ認識配列付加：配列番号３３）とβ２－マイクログロビン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ６１７６９：配列番号３４）を其々発現させた大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）、アジレント・テクノロジー社）より調製した各インクルージョンボディーとＮＹ－ＥＳＯペプチド： ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列表の配列番号１）を大希釈によりリフォールデング後、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にてＨＬＡ－Ａ^＊０２０１／β２－マイクログロビン／ＮＹ－ＥＳＯペプチド複合体（以下ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯと表記）を調製した。

【0201】

ネガティブコントロール抗原として、ＭＡＧＥＣ－１ペプチド：ＩＬＦＧＩＳＬＲＥＶ（配列表の配列番号２）を用いて同様にリフォールディングしＨＬＡ－Ａ^＊０２０１／β２－マイクログロビン／ＭＡＧＥＣ－１ペプチド複合体（＝以下ＨＬＡ／ＭＣ１と表記）を調製した。更に、調製したＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ及びＨＬＡ／ＭＣ１は、大腸菌のビオチンリガーゼにてビオチン化後、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて分画し各ビオチン化タンパク質を調製した。

【0202】

１）－２ ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合能を有するｓｃＦｖの単離
ヒト抗体ファージライブラリーから、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合するｓｃＦｖを単離した。まず、ビオチン化ＨＬＡ／ＭＣ１を固相化したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍ－２８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にファージを添加し、結合しないファージを回収した。次に、ビオチン化ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯを固相化したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｍ－２８０Ａｇ添加し、結合しないファージをマグネットスタンド（ＤｙｎａＭａｇ‐２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた洗浄操作により除去した。

【0203】

その後、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合したファージを大腸菌（ＸＬ－１ Ｂｌｕｅ、アジレント・テクノロジー社）に感染させ、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合するファージを回収・増幅した。計３回のパニングを実施後、ポリクローナルなファージミドから、ｓｃＦｖのカルボキシル末端にＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグを付加する大腸菌用の発現ベクターに載せ換えた後、大腸菌を形質転換し、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）存在下でｓｃＦｖを発現させ、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングに供した。

【0204】

１）－３ ＥＬＩＳＡによるＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ結合ｓｃＦｖのスクリーニング
３８４ウェルＭａｘｉ－ｓｏｒｐ ｐｌａｔｅ（Ｂｌａｃｋ、Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳ（０．１３８Ｍ塩化ナトリウム、０．００２７Ｍ塩化カリウムを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を５０μＬずつ添加し、４℃で一晩静置し固相化した。Ｔｗｅｅｎ－２０（バイオ・ラッド社）を０．０５％含むＰＢＳ（ＥＬＩＳＡバッファ）で３回洗浄後、ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した、実施例１）－２でも用いたビオチン化ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯを添加して１時間室温で振とうした。ＥＬＩＳＡバッファで３回洗浄後、Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロッキングし、ＥＬＩＳＡバッファで３回洗浄した。その後、ｓｃＦｖを発現させた大腸菌の培養液を添加し、室温にて２時間反応させた。ＥＬＩＳＡバッファで３回洗浄後、ＥＬＩＳＡバッファで５０００倍に希釈したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＥＬＩＳＡバッファで５回洗浄後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｐｉｃｏ ＥＬＩＳＡ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、１０分後の化学発光をプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０４ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）で測定し、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯに結合するＥＬＩＳＡ陽性クローンを分離した。

【0205】

１）－４ ＥＬＩＳＡ陽性クローンＮＹ－Ｒ１１９のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の決定
１）－３で取得されたＥＬＩＳＡ陽性クローンの中から、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合能が強く認識特異性が優れているｓｃＦｖとしてＮＹ－Ｒ１１９を選抜した。ＮＹ－Ｒ１１９の重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド配列の解析を、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法（ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で実施した。配列解析に用いたプライマー配列は、以下の通りである。
Ｐｒｉｍｅｒ Ａ：５’－ＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＡ－３’（配列表の配列番号３（図１０））
Ｐｒｉｍｅｒ Ｂ：５’－ＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ－３’（配列表の配列番号４（図１１））

【0206】

決定されたＮＹ－Ｒ１１９の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５（図１２）に示し、アミノ酸配列を配列番号６（図１３）に示した。

【0207】

決定されたＮＹ－Ｒ１１９の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号７（図１４）に示し、アミノ酸配列を配列番号８（図１５）に示した。

【0208】

ＩＭＧＴのＣＤＲ定義におけるＮＹ－Ｒ１１９のＣＤＲ配列はそれぞれ、ＣＤＲＨ1は配列番号５４（図６１）に、ＣＤＲＨ２は配列番号５５（図６１）に、ＣＤＲＨ３は配列番号５６（図６１）に、ＣＤＲＬ1は配列番号５７（図６１）に、ＣＤＲＬ２は配列番号５８（図６１）に、ＣＤＲＬ３は配列番号５９（図６１）に示した。

【0209】

１）－５ ＮＹＡ－０００１の作製
１）－５－１ ＮＹＡ－０００１発現ベクターの構築
各種評価用サンプル調製のため、ＮＹ－Ｒ１１９の哺乳培養用発現ベクターを構築した。また哺乳培養細胞にて発現されたＮＹ－Ｒ１１９をＮＹＡ－０００１と命名した。ＮＹ－Ｒ１１９とＮＹＡ－０００１のｓｃＦｖ部分、重鎖及び軽鎖の可変領域、並びにＣＤＲＨ１～３及びＣＤＲＬ１～３は、同一アミノ酸配列からなる。ＮＹＡ－０００１をコードするＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）にてｐｃＤＮＡ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした哺乳動物細胞用発現ベクターに挿入し、ＮＹＡ－０００１発現ベクターを構築した。

【0210】

構築したＮＹＡ－０００１発現ベクターのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－０００１全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号６９（図７０）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＡ－０００１全長のアミノ酸配列は配列番号７０（図７１）に示されるアミノ酸配列であった。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－０００１であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、１８１番目から１８８番目のアミノ酸配列はＣＤＲＬ1であり、２０６番目から２０８番目のアミノ酸配列はＣＤＲＬ２であり、２４５番目から２５６番目のアミノ酸配列はＣＤＲＬ３である。

【0211】

１）－５－２ ＮＹＡ－０００１発現・精製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）はマニュアルに従い、継代、培養を行った。対数増殖期にあるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養液を２．５×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ になるようＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で希釈し、ＮＹＡ－０００１の生産に用いた。２０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にＮＹＡ－０００１発現ベクター０．３ｍｇと０．９ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞へ添加した。３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーターで６日間、１３５ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清を０．２μｍ ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過し、ＮＹＡ－０００１の培養上清を得た。精製は、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、にて溶出後濃縮し、２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、３００ｍＭ ＮａＣＬ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ６．０で平衡化したゲルろ過カラム （Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて精製した。精製タンパク質サンプルは分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、純度と濃度を決定した後、各種評価に用いた。

【0212】

（実施例２） ＮＹＡ－０００１変異体の作製
２）－１ ＮＹＡ－０００１変異体の取得
ＮＹＡ－０００１遺伝子を鋳型として、ＰＣＲを利用して変異を導入する方法（Ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ－ｂａｓｅｄ ライブラリー）、又は、ＣＤＲの全残基の各残基毎に、２０種類のアミノ酸にランダム変異させたオリゴマーを合成し、ライブラリーを構築する方法（ｏｌｉｇｏ‐ｂａｓｅｄライブラリー）を用いてファージライブラリーを構築し、高結合能クローンのスクリーニングを行い、高結合能変異体としてＮＹＡ－００６０、ＮＹＡ－００６８、ＮＹＡ－００８２を取得し、各ヌクレオチド配列を決定した。

【0213】

取得したＮＹＡ－００６０の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号９（図１６）に示し、アミノ酸配列を配列番号１０（図１７）に示した。

【0214】

取得したＮＹＡ－００６０の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１１（図１８）に示し、アミノ酸配列を配列番号１２（図１９）に示した。

【0215】

取得したＮＹＡ－００６８の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１３（図２０）に示し、アミノ酸配列を配列番号１４（図２１）に示した。

【0216】

取得したＮＹＡ－００６８の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１５（図２２）に示し、アミノ酸配列を配列番号１６（図２３）に示した。

【0217】

取得したＮＹＡ－００８２の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１７（図２４）に示し、アミノ酸配列を配列番号１８（図２５）に示した。

【0218】

取得したＮＹＡ－００８２の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１９（図２６）に示し、アミノ酸配列を配列番号２０（図２７）に示した。

【0219】

２）－２ ＮＹＡ－００６０、ＮＹＡ－００６８、ＮＹＡ－００８２より同定した変異部位及び組合せによる高結合能変異体の作製
ＮＹＡ－００６０、ＮＹＡ－００６８各々の変異部位をもつＮＹＡ－１１６３、ＮＹＡ－２０２３をコードするＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）にてｐｃＤＮＡ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした哺乳動物細胞用発現ベクターに挿入し、哺乳動物細胞用ｓｃＦｖ発現ベクターを構築した。

【0220】

また、ＮＹＡ－００６０、ＮＹＡ－００６８、ＮＹＡ－００８２より同定した変異部位及びそれらの組合せとして、ＮＹＡ－２０２７、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－２１４３を設計した。１）－５で構築したＮＹＡ－０００１発現ベクターへ部位特異的変異導入、若しくは目的ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）にてｐｃＤＮＡ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした哺乳動物細胞用発現ベクターに挿入することにより、各哺乳動物細胞用ｓｃＦｖ発現ベクターを構築した。

【0221】

構築したｓｃＦｖ発現ベクターのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－１１６３全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号２１（図２８）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0222】

ＮＹＡ－２０２３全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号２２（図２９）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0223】

ＮＹＡ－２０２７全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号２３（図３０）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0224】

ＮＹＡ－１１４３全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号２４（図３１）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0225】

ＮＹＡ－２１４３全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号２５（図３２）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0226】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＡ－１１６３、ＮＹＡ－２０２３、ＮＹＡ－２０２７、ＮＹＡ－１１４３及びＮＹＡ－２１４３全長のアミノ酸配列を確認した。

【0227】

ＮＹＡ－１１６３全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号２６（図３３）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１６３であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0228】

ＮＹＡ－２０２３全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号２７（図３４）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０２３であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0229】

ＮＹＡ－２０２７全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号２８（図３５）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０２７であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0230】

ＮＹＡ－１１４３全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号２９（図３６）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１４３であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0231】

ＮＹＡ－２１４３全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号３０（図３７）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２１４３であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0232】

なお、ＮＹＡ－１１６３のＣＤＲ配列は全てＮＹＡ－０００１のＣＤＲ配列と同一である。また、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－２１４３及びＮＹＡ－２０２３のＣＤＲ配列は同一であり、ＣＤＲＨ1は配列番号５４（図６１）に、ＣＤＲＨ２は配列番号５５（図６１）に、ＣＤＲＨ３は配列番号５６（図６１）に、ＣＤＲＬ1は配列番号６０（図６２）に、ＣＤＲＬ２は配列番号５８（図６１）に、ＣＤＲＬ３は配列番号５９（図６１）に示した。更に、ＮＹＡ－２０２７のＣＤＲ配列は、ＣＤＲＨ1は配列番号５４（図６１）に、ＣＤＲＨ２は配列番号５５（図６１）に、ＣＤＲＨ３は配列番号５６（図６１）に、ＣＤＲＬ1は配列番号５７（図６１）に、ＣＤＲＬ２は配列番号５８（図６１）に、ＣＤＲＬ３は配列番号６１（図６３）に示した。

【0233】

また、高結合能クローンのスクリーニングの際見られた結合変異部位を組合せたＮＹＡ－１１５４を設計し、ＮＹＡ－０００１発現ベクターへ部位特異的変異導入することによりｐｃＤＮＡ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格としたＮＹＡ－１１５４発現ベクターを構築した。構築したｓｃＦｖ発現ベクターのヌクレオチド配列は再解析し、配列番号３１（図３８）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＡ－１１５４全長のアミノ酸配列を確認した（配列番号３２（図３９））。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１５４であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0234】

ＮＹＡ－１１５４のＣＤＲ配列はそれぞれ、ＣＤＲＨ1は配列番号５４（図６１）に、ＣＤＲＨ２は配列番号５５（図６１）に、ＣＤＲＨ３は配列番号６２（図６４）に、ＣＤＲＬ1は配列番号５７（図６１）に、ＣＤＲＬ２は配列番号５８（図６１）に、ＣＤＲＬ３は配列番号６３（図６４）に示した。

【0235】

１）－５－２と同様の方法にてＮＹＡ－１１６３、ＮＹＡ－２０２３、ＮＹＡ－２０２７、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－２１４３及びＮＹＡ－１１５４を発現させ、各目的ｓｃＦｖを精製した。精製タンパク質サンプルは分析用ＳＥＣに供し、純度と濃度を決定した後、各種アッセイに用いた。

【0236】

２）－３ ＮＹＡ－１１４３変異体作製
２）－３－１ ＮＹＡ－２０３５の作製
ＮＹＡ－１１４３の変異体としてＮＹＡ－２０３５を設計し、哺乳動物細胞用ＮＹＡ－１１４３発現ベクターへ部位特異的変異導入することでＮＹＡ－２０３５発現ベクターを構築した。構築したｓｃＦｖ発現ベクターのヌクレオチド配列は再解析し、配列番号３５（図４２）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＡ－２０３５全長のアミノ酸配列を決定した（配列番号３６（図４３））。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０３５であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。ＩＭＧＴのＣＤＲ定義におけるＮＹＡ－２０３５のＣＤＲ配列はそれぞれ、ＣＤＲＨ1は配列番号５４（図６１）に、ＣＤＲＨ２は配列番号５５（図６１）に、ＣＤＲＨ３は配列番号５６（図６１）に、ＣＤＲＬ1は配列番号６４（図６５）に、ＣＤＲＬ２は配列番号５８（図６１）に、ＣＤＲＬ３は配列番号５９（図６１）に示した。

【0237】

２）－３－２ ＮＹＡ－１１４３ＣＤＲグラフト変異体の作製
物性向上をめざし、ＮＹＡ－１１４３ＣＤＲグラフト変異体を設計した。ＮＹＡ－１１４３のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域の配列を、ＫＡＢＡＴ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））において既定されるヒトのサブグループ・コンセンサス配列やＧｅｒｍｌｉｎｅ配列のフレームワーク領域と比較した。その結果、ＶＨについてはヒトＧｅｒｍｌｉｎｅ配列ＩＧＨＶ３＿３０＊１５とヒトγ鎖サブグループ３のコンセンサス配列が、ＶＬについてはヒトＧｅｒｍｌｉｎｅ配列ＩＧＬＶ１－４４＊０１が、そのフレームワーク領域において高い配列同一性を有するアクセプターとして選択された。次に、各アクセプターのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、ＮＹＡ－１１４３のアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用されている残基を同定した。

【0238】

次に、ＮＹＡ－１１４３の三次元モデルを用いて、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９））によって与えられる基準などを参考に、アクセプター上に移入すべきフレームワーク残基を選択した。以上の手法により、ＮＹＡ－１１４３のＶＨ部分のＣＤＲグラフト変異アミノ酸配列としてＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０１、ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０２、ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０３を設計した。各当該アミノ酸配列は、配列番号３７（図４４）、３８（図４５）、３９（図４６）である。ＮＹＡ－１１４３のＶＬ部分のＣＤＲグラフト変異アミノ酸配列としてＮＹＡ－１１４３－ＶＬ０１を設計した。各当該アミノ酸配列は、配列番号４０（図４７）である。

【0239】

設計した各ＶＨ及びＶＬ配列を組合せ、以下に示す各種ｓｃＦｖを設計した。ＮＹＡ－１１４３のＶＨ部分を、ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０１のアミノ酸配列へ置き換えたｓｃＦｖをＮＹＡ－２０４４と命名した。またＮＹＡ－２０４４のＶＬ部分を、ＮＹＡ－１１４３－ＶＬ０１のアミノ酸配列へ置き換えたｓｃＦｖを、ＮＹＡ－２０４５と命名した。

【0240】

ＮＹＡ－１１４３のＶＨ部分を、ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０２のアミノ酸配列へ置き換えたｓｃＦｖをＮＹＡ－２０４７と命名した。またＮＹＡ－２０４７のＶＬ部分を、ＮＹＡ－１１４３－ＶＬ０１のアミノ酸配列へ置き換えたｓｃＦｖをＮＹＡ－２０４８と命名した。

【0241】

ＮＹＡ－１１４３のＶＨ部分を、ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０３のアミノ酸配列へ置き換えたｓｃＦｖをＮＹＡ－２０６０と命名した。またＮＹＡ－２０６０のＶＬ部分を、ＮＹＡ－１１４３－ＶＬ０１のアミノ酸配列へ置き換えたｓｃＦｖを、ＮＹＡ－２０６１と命名した。

【0242】

設計した各種ＮＹＡ－１１４３ＣＤＲグラフト変異体はＤＮＡ断片を全合成し（ファスマック社）ＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）にて結合することによりｐｃＤＮＡ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした哺乳動物細胞用ｓｃＦｖ発現ベクターを構築した。

【0243】

構築したｓｃＦｖ発現ベクターのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－２０４４全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４１（図４８）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0244】

ＮＹＡ－２０４５全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４２（図４９）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0245】

ＮＹＡ－２０４７全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４３（図５０）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0246】

ＮＹＡ－２０４８全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４４（図５１）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0247】

ＮＹＡ－２０６０全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４５（図５２）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0248】

ＮＹＡ－２０６１全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号４６（図５３）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0249】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０４８、ＮＹＡ－２０６０、及びＮＹＡ－２０６１全長のアミノ酸配列を決定した。なお、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０４８、ＮＹＡ－２０６０、及びＮＹＡ－２０６１のＣＤＲ配列はＮＹＡ－１１４３と同一である。

【0250】

ＮＹＡ－２０４４全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号４７（図５４）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０４４であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0251】

ＮＹＡ－２０４５全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号４８（図５５）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０４５であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0252】

ＮＹＡ－２０４７全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号５０（図５７）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０４７であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0253】

ＮＹＡ－２０４８全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号５１（図５８）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０４８であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0254】

ＮＹＡ－２０６０全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号５２（図５９）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０６０であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0255】

ＮＹＡ－２０６１全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号５３（図６０）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０６１であり、２６７番目から２９２番目のアミノ酸配列がＦｌａｇ－Ｈｉｓタグである。また、４６番目から５３番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1であり、７１番目から７８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２であり、１１７番目から１２９番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３である。また、アミノ酸番号１８１番から１８８番はＣＤＲＬ1であり、アミノ酸番号２０６番から２０８番はＣＤＲＬ２であり、アミノ酸番号２４５番から２５６番はＣＤＲＬ３である。

【0256】

２）－３－３ ＮＹＡ－１１４３変異体の発現・精製
１）－５－２と同様の方法にて２）－３－１及び２）－３－２で作製したＮＹＡ－２０３５、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０４８、ＮＹＡ－２０６０、及びＮＹＡ－２０６１を発現させ、各目的ｓｃＦｖを精製した。精製タンパク質サンプルは分析用ＳＥＣに供し、純度と濃度を決定した後、各種アッセイに用いた。

【0257】

（実施例３） 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ参照抗体のｓｃＦｖ作製
ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへ高結合能を有する抗体３Ｍ４Ｅ５及びＴ１（ＷＯ２０１０／１０６４３１）のｓｃＦｖを設計し、３Ｍ４Ｅ５のｓｃＦｖをＮＹＣ－０００３、Ｔ１のｓｃＦｖをＮＹＣ－０００４と命名した。

【0258】

ＮＹＣ－０００３及びＮＹＣ－０００４の各ＤＮＡ断片を全合成し（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）にてｐｃＤＮＡ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした哺乳動物細胞用ｓｃＦｖ発現ベクターを構築した。

【0259】

構築したｓｃＦｖ発現ベクターのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＣ－０００３及びＮＹＣ－０００４全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号６５（図６６）及び配列番号６６（図６７）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。また、上記ヌクレオチド配列より当該配列がコードするＮＹＣ－０００３全長のアミノ酸配列は配列番号６７（図６８）またＮＹＣ－０００４全長のアミノ酸配列は配列番号６８（図６９）に示されるアミノ酸配列である。

【0260】

１）－５－２と同様の方法にて、ＮＹＣ－０００３及びＮＹＣ－０００４を発現させ各目的ｓｃＦｖを精製した。各精製タンパク質サンプルは分析用ＳＥＣに供し、純度と濃度を決定した後、各種アッセイに用いた。

【0261】

（実施例４） ＢｉａｃｏｒｅによるＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合能評価
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用い、固定化した抗Ｈｉｓ抗体へ抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖをリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定した。抗原には、１）－１にて調製したＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯを使用した。抗Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓ Ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）はＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）へ、キット説明書に従い固定化させた。ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で０．５μｇ／ｍLに希釈した評価する各抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖを１０μＬ／ｍｉｎで６０秒間接触させて固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋で希釈した複数濃度のＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯをアナライトとして各サンプルを流速３０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間添加し、６００秒間乖離を測定するシングルサイクルカイネティクス解析によりＫ_Ｄを算出し、結果を表１に記載した。親抗体 ＮＹＡ－０００１に比べその変異体はいずれもＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合が強くなっていることが示された。またＮＹＣ－０００４に比べ、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－２０２３、ＮＹＡ－２１４３、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０６０及びＮＹＡ－２０６１は結合が強く、このうちＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２１４３はＫ_Ｄが１ｎＭ以下を示した。

【0262】

【表1】

【0263】

（実施例５） 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖのＮＹ－ＥＳＯペプチド内の認識アミノ酸解析
ヒトリンパ芽球細胞融合細胞株Ｔ２（ＡＴＣＣ）細胞を２０％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で適切な濃度に調整し、ＮＹ－ＥＳＯペプチド（配列番号１）、点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド１Ｆ、２Ｍ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ｌ、７Ｆ、８Ａ、９Ａ（配列番号１２１（図１２２）、１２２（図１２３）、１２３（図１２４）、１２４（図１２５）、１２５（図１２６）、１２６（図１２７）、１２７（図１２８）、１２８（図１２９）、１２９（図１３０））、ｇｐ１００ペプチド（配列番号１３０（図１３１））（いずれもＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ社）をＤＭＳＯで５ｍＭに溶解した溶液を、最終濃度が５０μＭになるように、あるいはＤＭＳＯを１／１００量添加し、３７℃で４時間インキュベートした。２０％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地で２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで適当な濃度に調製し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ ＤｅａｄＣｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、細胞を２つに分け、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１０^５細胞／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。一方の細胞について、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００ｎＭに希釈した抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖを２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＰｅｎｔａ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（ＱＩＡＧＥＮ社）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＡｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ－ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、マイルドホルム １０Ｎ（富士フイルム和光純薬社）で一晩固定後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁した。ＨＬＡ／ペプチド複合体量で標準化を行うため、もう一方の細胞について、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したＨＬＡ－Ａ２抗体ＢＢ７．２－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、あるいはマウスＩｇＧ２ｂ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、マイルドホルム １０Ｎ（富士フイルム和光純薬社）で一晩固定後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁した。これら細胞懸濁液をフローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行い、Ｔ２細胞の死細胞除去画分のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の幾何学的平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を測定した。Ｔ２細胞上のＨＬＡ／ペプチド複合体量で標準化された各ｓｃＦｖの結合性を示す値、標準化ｇＭＦＩは次式で算出した。

【0264】

標準化ｇＭＦＩ＝（Ａ／Ｂ）×（（Ｃ／Ｄ）／（Ｅ／Ｆ））
・Ａ／Ｂ＝相対ｇＭＦＩ
Ａ：抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
Ｂ：抗体非添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
・（Ｃ／Ｄ）／（Ｅ／Ｆ）＝ＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のＨＬＡ／ペプチド複合体量補正値
Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
Ｄ：マウスＩｇＧ２ｂ抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
Ｅ：ＨＬＡ－Ａ２抗体添加のＤＭＳＯ添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
Ｆ：マウスＩｇＧ２ｂ抗体添加のＤＭＳＯ添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ

【0265】

図１に示す通り、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ ＮＹＡ－０００１、１１４３、２０４４、２０４５、２０４７、２０４８、２０６０、２０６１は、野生型ＮＹ－ＥＳＯペプチドと比較し、１、４、５、７番目のアミノ酸に点変異を導入したペプチド添加Ｔ２に対する結合性が半分以下に低下したことから、ＮＹ－ＥＳＯペプチドの１、４、５、７番目のアミノ酸を認識していることが示唆された。同様に、ＮＹＡ－１１５４は１、５番目を認識し、ＮＹＡ－１１６３は１、３、４、５、６、７番目を認識し、ＮＹＡ－２０２３、２０２７、２０３５は１、４、５番目を認識し、ＮＹＡ－２１４３は１、５、７番目を認識していることが示唆された。一方で、ＮＹＣ－０００３、０００４は４、５番目を認識していることが示唆された。

【0266】

（実施例６） 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖの抗原結合特異性評価
ヒトプロテオーム（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ）の中から、結合する可能性のある、ＮＹ－ＥＳＯペプチド：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）とアミノ酸配列が類似するが同一ではないヒトペプチド（以下「相同性ペプチド」という）の検索のため、本抗体の多くが認識していると示唆される１、４、５番目が一致した９－ｍｅｒペプチドを検索した。検索された９－ｍｅｒペプチドに関して、ＮｅｔＭＨＣＰａｎ２．８でＨＬＡ－Ａ０２０１に対する結合性を予測し、ＩＣ５０が５００ｎＭ以下と予測された、図２Ａに示す９－ｍｅｒペプチドを抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖの結合特異性評価のための相同性ペプチドとして選択した。Ｔ２細胞を２０％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で適切な濃度に調製し、ＮＹ－ＥＳＯペプチド（配列番号１）、相同性ペプチドＤＯＬＰＰ１、ＩＬ２０ＲＢ、ＰＲＫＤ２、ＣＤ１６３、Ｐ２ＲＹ８（配列番号１３１（図１３２）、１３２（図１３３）、１３３（図１３４）、１３４（図１３５）、１３５（図１３６））、ｇｐ１００ペプチド（配列番号１３０（図１３１））（いずれもＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ社）をＤＭＳＯで５ｍＭに溶解した溶液を、最終濃度が５０μＭになるように、あるいはＤＭＳＯを１／１００量添加し、実施例５と同様の方法で各抗体の結合性を評価した。Ｔ２細胞上のＨＬＡ／ペプチド複合体量で標準化された各ｓｃＦｖの結合性を示す値、標準化ｇＭＦＩは次式で算出した。

【0267】

標準化ｇＭＦＩ＝（Ａ／Ｂ）×（（Ｃ／Ｄ）／（Ｅ／Ｆ））
・Ａ／Ｂ＝相対ｇＭＦＩ
Ａ：抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
Ｂ：抗体非添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
・（Ｃ／Ｄ）／（Ｅ／Ｆ）＝ＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のＨＬＡ／ペプチド複合体量補正値
Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
Ｄ：マウスＩｇＧ２ｂ抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
Ｅ：ＨＬＡ－Ａ２抗体添加のＤＭＳＯ添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ
Ｆ：マウスＩｇＧ２ｂ抗体添加のＤＭＳＯ添加Ｔ２細胞のｇＭＦＩ

【0268】

図２Ｂに示す通り、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ ＮＹＡ－０００１、１１４３、１１６３、２０２３、２０２７、２０３５、２０４４、２０４５、２０４７、２０４８、２０６０、２０６１、２１４３はいずれの相同性ペプチド添加細胞にも結合せず、特異性が高いことが示唆された。一方で、ＮＹＡ－１１５４、ＮＹＣ－０００３、０００４は一部の相同性ペプチド添加Ｔ２細胞への結合が見られた。

【0269】

（実施例７） Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の作製
７）－１ Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの作製
７）－１－１ ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子発現ベクターの作製
ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を評価するため、各分子の発現ベクターを設計した。抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体は、ＮＹＡ－１１４３、ＮＹＡ－２１４３、ＮＹＡ－１１６３、ＮＹＡ－２０２３、ＮＹＡ－２０２７、ＮＹＡ－２０３５、ＮＹＡ－２０４４、ＮＹＡ－２０４５、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０４８、ＮＹＡ－２０６０及びＮＹＡ－２０６１を用いた。抗ＣＤ３抗体はヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖであるＣ３Ｅ－７０８５（ＷＯ２０１８／１１７２３７）を用いた。ヘテロダイマーＦｃ配列には、エフェクター機能を低下させ、且つヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ配列（ＷＯ２０１４／１９０４４１）を用いた。

【0270】

エフェクター機能を低下させ、且つヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ（ＨＣ１若しくはＨＣ２）をコードするＤＮＡ断片を合成し（ファスマック社）、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）にてｐｃＤＮＡ３．３（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＨＣ１」と命名した。

【0271】

ＮＹＡ－１１４３とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へ、ＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２」と命名した。

【0272】

ＮＹＡ－２１４３とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２へ部位特異的変異導入することにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２」と命名した。

【0273】

ＮＹＡ－１１６３とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のＮＹＡ－１１４３をコードする塩基配列部分をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いてＮＹＡ－１１６３をコードするＤＮＡ断片へ置き換えることにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２」と命名した。

【0274】

ＮＹＡ－２０２３とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２へ部位特異的変異導入することにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２」と命名した。

【0275】

ＮＹＡ－２０２７とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ＮＹＡ－０００１とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へ、ＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターへ部位特異的変異導入を加えることにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２」と命名した。

【0276】

ＮＹＡ－２０３５とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２へ部位特異的変異導入することにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２」と命名した。

【0277】

ＮＹＡ－２０４４とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のＮＹＡ－１１４３をコードする塩基配列部分をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いてＮＹＡ－２０４４をコードするＤＮＡ断片へ置き換えることにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２」と命名した。

【0278】

ＮＹＡ－２０４５とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のＮＹＡ－１１４３をコードする塩基配列部分をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いてＮＹＡ－２０４５をコードするＤＮＡ断片へ置き換えることにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２」と命名した。

【0279】

ＮＹＡ－２０４７とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のＮＹＡ－１１４３をコードする塩基配列部分をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いてＮＹＡ－２０４７をコードするＤＮＡ断片へ置き換えることにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２」と命名した。

【0280】

ＮＹＡ－２０４８とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のＮＹＡ－１１４３をコードする塩基配列部分をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ クローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いてＮＹＡ－２０４８をコードするＤＮＡ断片へ置き換えることにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２」と命名した。

【0281】

ＮＹＡ－２０６０とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２へ部位特異的変異導入することにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２」と命名した。

【0282】

ＮＹＡ－２０６１とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へＨＣ２をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターは、ｐ＿ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２へ部位特異的変異導入することにより作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２」と命名した。

【0283】

ｐ＿ＨＣ１のヌクレオチド配列は再解析し、ＨＣ１全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７１（図７２）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0284】

ｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７２（図７３）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0285】

ｐ＿ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７３（図７４）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0286】

ｐ＿ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７４（図７５）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0287】

ｐ＿ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７５（図７６）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0288】

ｐ＿ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７６（図７７）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0289】

ｐ＿ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７７（図７８）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0290】

ｐ＿ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７８（図７９）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0291】

ｐ＿ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号７９（図８０）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0292】

ｐ＿ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号８０（図８１）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0293】

ｐ＿ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号８１（図８２）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0294】

ｐ＿ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号８２（図８３）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0295】

ｐ＿ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号８３（図８４）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0296】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＨＣ１、ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２、ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２、ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２、ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２、ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２、ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２、ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２、ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２、ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２、ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２、ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２、ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２全長のアミノ酸配列を確認した。

【0297】

ＨＣ１全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号８４（図８５）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から２４６番目のアミノ酸配列がＨＣである。

【0298】

ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号８５（図８６）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１４３―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0299】

ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号８６（図８７）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２１４３―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0300】

ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号８７（図８８）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１６３―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0301】

ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号８８（図８９）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０２３―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0302】

ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号８９（図９０）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０２７―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0303】

ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号９０（図９１）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０３５―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0304】

ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号９１（図９２）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０４４―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0305】

ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号９２（図９３）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０４５―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0306】

ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号９３（図９４）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０４７―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0307】

ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号９４（図９５）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０４８―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0308】

ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号９５（図９６）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０６０―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0309】

ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号９６（図９７）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０６１―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0310】

７）－１－２ ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子発現ベクターの作製
ｔａＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子発現用ベクターを設計した。抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体は、ＮＹＡ－０００１を用いた。抗ＣＤ３抗体はヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖであるＣ３Ｅ－７０８５（ＷＯ２０１８／１１７２３７）を用いた。ヘテロダイマーＦｃ配列には、エフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ配列（ＷＯ２０１４／１９０４４１）を用いた。

【0311】

ＮＹＡ－０００１の重鎖可変領域、及びヒトＩｇＧ由来ＣＨ１領域、及びエフェクター機能を低下させ、かつＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅをコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」と命名した。またＮＹＡ－０００１軽鎖可変領域、ヒトＩｇＧ由来ＣＬ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＡ－０００１－ＬＣ」と命名した。

【0312】

ｐ＿ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号９７（図９８）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0313】

ｐ＿ＮＹＡ－０００１－ＬＣのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－０００１－ＬＣ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号９８（図９９）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0314】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ及びＮＹＡ－０００１－ＬＣ全長のアミノ酸配列を確認した。

【0315】

ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号９９（図１００）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から１３９番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１４０番目から４６８番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、４５番目から５２番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1（配列番号５４（図６１））であり、７０番目から７７番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２（配列番号５５（図６１））であり、１１６番目から１２８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３（配列番号５６（図６１））である。

【0316】

ＮＹＡ－０００１－ＬＣ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１００（図１０１）に示されるアミノ酸配列である。１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１３１番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３２番目から２３７番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４６番から５３番はＣＤＲＬ1（配列番号５７（図６１））であり、アミノ酸番号７１番から７３番はＣＤＲＬ２（配列番号５８（図６１））であり、アミノ酸番号１１０番から１２１番はＣＤＲＬ３（配列番号５９（図６１））である。

【0317】

７）－２ Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の発現
７）－２－１ ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の発現
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期にあるＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培養液を２．５×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ になるようＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で希釈し、各種二重特異性分子の生産に用いた。２０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にベクターｐ＿ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を１：１．５の比率で混合したベクター混合物、０．３ｍｇと０．９ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞へ添加した。３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーターで６日間、１３５ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清を０．２μｍ ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ社）でろ過し、ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００１６）の培養上清を得た。ＮＹＦ－００１６を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号８５（図８６）及び８４（図８５）に示す。

【0318】

同様の手法にて、ｐ＿ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００１９）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００１９を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号８６（図８７）及び８４（図８５）に示す。

【0319】

ｐ＿ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００２２）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００２２を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号８７（図８８）及び８４（図８５）に示す。

【0320】

ｐ＿ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００２３）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００２３を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号８８（図８９）及び８４（図８５）に示す。

【0321】

ｐ＿ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００２７）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００２７を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号８９（図９０）及び８４（図８５）に示す。

【0322】

ｐ＿ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００３５）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００３５を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号９０（図９１）及び８４（図８５）に示す。

【0323】

ｐ＿ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００４４）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００４４を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号９１（図９２）及び８４（図８５）に示す。

【0324】

ｐ＿ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００４５）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００４５を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号９２（図９３）及び８４（図８５）に示す。

【0325】

ｐ＿ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００４７）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００４７を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号９３（図９４）及び８４（図８５）に示す。

【0326】

ｐ＿ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００４８）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００４８を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号９４（図９５）及び８４（図８５）に示す。

【0327】

ｐ＿ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００６０）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００６０を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号９５（図９６）及び８４（図８５）に示す。

【0328】

ｐ＿ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００６１）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００６１を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号９６（図９７）及び８４（図８５）に示す。

【0329】

７）－２－２ ｔａＦｖ－Ｆａｂ-ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の発現
７）－２－１と同様の手法にてｐ＿ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２、ｐ＿ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅおよびｐ＿ＮＹＡ－０００１－ＬＣを１：１：１.5の比率で混合したベクター混合物を用いてｔａＦｖ－Ｆａｂ-ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子（ＮＹＦ－００５８）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００５８を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号８８（図８９）のアミノ酸番号２０～７４５、配列番号９９（図１００）のアミノ酸番号２０～４６８および配列番号１００（図１０１）のアミノ酸番号２１～２３７に示す。

【0330】

７）－３ Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の精製
７）－２で得られた培養上清から各種二重特異性分子をＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの２段階工程で精製した。

【0331】

ＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社：単に「ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社」ともいう）に培養上清をアプライし、目的の二重特異性分子を吸着させた。非吸着成分をＰＢＳで除去した後、酢酸バッファ ｐＨ３．５で吸着成分を溶出した。溶出画分はＴｒｉｓバッファ ｐＨ９．５でｐＨを中性に調製した後、濃縮し、予め２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、３００ｍＭ ＮａＣＬ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ５．５で平衡化したゲルろ過カラム Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に供した。ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたピーク画分より、目的のヘテロダイマーに相当する画分を回収し、ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって、目的の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子が形成されていることを確認した。精製タンパク質サンプルは分析用ＳＥＣに供し、純度と濃度を決定した後各種評価に用いた。

【0332】

（実施例８） Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞傷害活性評価
８）－１ 標的細胞の調製
内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現細胞株（Ｕ２６６Ｂ１、及び、ＮＣＩ－Ｈ１７０３）、及び、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現細胞株（ＡＧＳ、及び、ＣＦＰＡＣ－１）を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（富士フイルム和光純薬社）で１×１０^６細胞／ｍＬの濃度に調製し、各細胞懸濁液１ｍＬあたり１００μＬのＣｈｒｏｍｉｕｍ－５１ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２時間培養した。１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０^５細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。

【0333】

８）－２ エフェクター細胞の調製
市販の凍結ヒトＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を３７℃で解凍し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にＡｎｔｉ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｗａｓｈ試薬（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を添加した溶液に移して２回洗浄した後に１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で１×１０^６細胞／ｍＬになるよう調製し、エフェクター細胞とした。

【0334】

８）－３ 細胞傷害アッセイ
８）－１で取得した各標的細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各種濃度に調製した実施例７で調製した各種Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、実施例８）－２で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２０－２４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて実施し、細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。

【0335】

図４Ａ－Ｆに示す通り、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現細胞株（Ｕ２６６Ｂ１、及び、ＮＣＩ－Ｈ１７０３）に対して、各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞傷害活性が示された。解析ソフトウェア（Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０）のＦｏｕｒ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｃｕｒｖｅの計算式を用いてＥＣ_５０を算出し、Ｕ２６６Ｂ１細胞株における結果を表２に、ＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞株における結果を表３に記載した。Ｎｏｔ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ（ＮＡ）は、相関係数Ｒ値が算出されず、カーブフィッティングできなかったことを示す。一方、図４Ｇ－Ｌに示すとおり、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現細胞株（ＡＧＳ、及び、ＣＦＰＡＣ－１）に対する細胞傷害活性は認められなかった。

【0336】

【表2】

【0337】

【表3】

【0338】

（実施例９） Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＰＢＭＣ移入モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性評価
ヒト扁平上皮肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７０３（ＡＴＣＣ）を５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）含有ＰＢＳで６×１０^７細胞／ｍＬになるよう調製し、ＮＯＧマウス（雌性、６～７週齢）の皮下に０．１ｍＬ移植した（Ｄａｙ０）。Ｄａｙ４にヒトＰＢＭＣをＰＢＳで３．７５×１０^７細胞／ｍＬになるよう調製し、０．２ｍＬ尾静脈内移植した。約１週間後（Ｄａｙ６～７）より経時的に腫瘍の長径（ｍｍ）及び短径（ｍｍ）を電子デジタルノギスで計測し、以下に示す計算式により推定腫瘍体積を算出した。
Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ（ｍｍ^３）＝各個体の推定腫瘍体積の平均値
各個体の推定腫瘍体積＝長径×短径^２／２

【0339】

Ｄａｙ１４に各群ｎ＝５～６になるよう腫瘍体積による群分けを実施し、各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を尾静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ、ＮＹＦ－００５８のみ同モル量で比較のため１．５ｍｇ／ｋｇ）した。投与はＤａｙ１４、Ｄａｙ２１、Ｄａｙ２８に実施した。各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子投与群において抗腫瘍効果が確認された（図５Ａ―Ｃ）。Ｄａｙ３１～３２におけるＴｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（％）を以下に示す計算式により算出し、表４に記載した。

【0340】

Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（％）＝１００－（各群のＥｓｔｉｍａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ／Ｖｅｈｉｃｌｅ ＣｏｎｔｒｏｌのＥｓｔｉｍａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ×１００）

【0341】

【表4】

【0342】

（実施例１０） 各種Ｆｃ付加型フォーマット抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の作製
１０）－１ 各種Ｆｃ付加型フォーマット抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの作製
１０）－１－１ Ｈｙｂｒｉｄ型二重特異性分子発現ベクターの作製
Ｈｙｂｒｉｄ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を評価するため、各分子の発現ベクターを設計した。抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体は、ＮＹＡ－１１４３を用いた。抗ＣＤ３抗体はヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖであるＣ３Ｅ－７０８５（ＰＣＴ／ＪＰ２０１７／０４６００６）を用いた。ヘテロダイマーＦｃ配列には、エフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ配列（ＷＯ２０１４／１９０４４１）を用いた。

【0343】

ＮＹＡ－１１４３の重鎖可変領域、及びヒトＩｇＧ由来ＣＨ１領域、及びエフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」と命名した。またＮＹＡ－１１４３軽鎖可変領域、ヒトＩｇＧ由来ＣＬ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＡ－１１４３－ＬＣ」と命名した。また、ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖ（Ｃ３Ｅ－７０８５）のカルボキシル末端へ、エフェクター機能を低下させヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクター「ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」を作製した。

【0344】

ｐ＿ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０１（図１０２）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0345】

ｐ＿ＮＹＡ－１１４３－ＬＣのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－１１４３－ＬＣ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０２（図１０３）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0346】

ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０３（図１０４）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0347】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ＮＹＡ－１１４３－ＬＣ及びＣ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列を確認した。

【0348】

ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１０４（図１０５）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１３９番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１４０番目から４６８番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、４５番目から５２番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ1（配列番号５４（図６１））であり、７０番目から７７番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ２（配列番号５５（図６１））であり、１１６番目から１２８番目のアミノ酸配列がＣＤＲＨ３（配列番号５６（図６１））である。

【0349】

ＮＹＡ－１１４３－ＬＣ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１０５（図１０６）に示されるアミノ酸配列である。１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１３１番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３２番目から２３７番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４６番から５３番はＣＤＲＬ1（配列番号６０（図６２））であり、アミノ酸番号７１番から７３番はＣＤＲＬ２（配列番号５８（図６１））であり、アミノ酸番号１１０番から１２１番はＣＤＲＬ３（配列番号５９（図６１））である。

【0350】

Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１０６（図１０７）に示されるアミノ酸配列である。１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６０番目のアミノ酸配列がＣ３Ｅ－７０８５であり、２６１番目から２６２番目のアミノ酸配列がリンカー、２６３番目から４９３番目のアミノ酸配列がエフェクター機能を低下させかつヘテロ二量体を形成させる変異を導入したＦｃである。

【0351】

１０）－１－２ Ｄｕａｌ型二重特異性分子発現ベクターの作製
Ｄｕａｌ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を評価するため、以下の発現ベクターを設計した。ＮＹＡ－１１４３のカルボキシル末端へ、エフェクター機能を低下させヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクター「ｐ＿ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」を作製した。

【0352】

ｐ＿ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０７（図１０８）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列を確認した。ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１０８（図１０９）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１４３であり、２６７番目から２６８番目のアミノ酸配列がリンカー、２６９番目から４９９番目のアミノ酸配列がエフェクター機能を低下させかつヘテロ二量体を形成させる変異を導入したＦｃである。

【0353】

１０）－１－３ ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子発現ベクターの作製
ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を評価するため、各分子の発現ベクターを設計した。抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体はＮＹＡ－１１５４、抗ＣＤ３抗体はＣ３Ｅ－７０８５を用いた。ヘテロダイマーＦｃ配列には、エフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ配列を用いた。

【0354】

Ｃ３Ｅ－７０８５のカルボキシル末端へＮＹＡ－１１５４の重鎖可変領域、及びヒトＩｇＧ由来ＣＨ１領域、及びエフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」と命名した。またＮＹＡ－１１５４軽鎖可変領域、ヒトＩｇＧ由来ＣＬ領域をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＡ－１１５４－ＬＣ」と命名した。またＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅをコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」と命名した。

【0355】

ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０９（図１１０）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0356】

ｐ＿ＮＹＡ－１１５４－ＬＣのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－１１５４－ＬＣ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１１０（図１１１）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0357】

ｐ＿ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１１１（図１１２）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0358】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＣ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ＮＹＡ－１１５４－ＬＣ及びＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列を確認した。

【0359】

Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１２（図１１３）に示されるアミノ酸配列である。１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２６０番目のアミノ酸配列がＣ３Ｅ－７０８５であり、２６１番目から３８５番目のアミノ酸配列がリンカーであり、２６６番目から３８５番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１５４－重鎖可変領域である。また、アミノ酸番号３８６番から７１４番目のアミノ酸配列はＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅである。

【0360】

ＮＹＡ－１１５４－ＬＣ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１３（図１１４）に示されるアミノ酸配列である。１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１３１番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１３２番目から２３７番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４６番から５３番はＣＤＲＬ1（配列番号５７（図６１））であり、アミノ酸番号７１番から７３番はＣＤＲＬ２（配列番号５８（図６１））であり、アミノ酸番号１１０番から１２１番はＣＤＲＬ３（配列番号６３（図６４））である。

【0361】

ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１４（図１１５）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２０番目から２４５番目のアミノ酸配列がＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅである。

【0362】

１０）－１－４ 各種フォーマット評価用ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子発現ベクターの作製
各種フォーマット評価用ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を評価するため、各分子の発現ベクターを設計した。抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ抗体は、ＮＹＡ－１１４３及びＮＹＡ－１１５４を用いた。抗ＣＤ３抗体はヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖであるＣ３Ｅ－７０８５を用いた。ヘテロダイマーＦｃ配列には、エフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ配列を用いた。

【0363】

ＮＹＡ－１１５４とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へ、ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅをコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」と命名した。

【0364】

Ｃ３Ｅ－７０８５とＮＹＡ－１１５４をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へ、ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅをコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」と命名した。

【0365】

ＮＹＡ－１１４３とＣ３Ｅ－７０８５をＧＧＧＧＳリンカーでつなげたｔａＦｖのカルボキシル末端へ、ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅをコードするＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ」と命名した。

【0366】

ｐ＿ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１１５（図１１６）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0367】

ｐ＿ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１１６（図１１７）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0368】

ｐ＿ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１１７（図１１８）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0369】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ及びＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列を確認した。

【0370】

ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１８（図１１９）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１５４―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４４番目のアミノ酸配列がＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅである。

【0371】

ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１９（図１２０）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＣ３Ｅ－７０８５―ＮＹＡ－１１５４ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目のから７４４番目のアミノ酸配列がＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅである。

【0372】

ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１２０（図１２１）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－１１４３―Ｃ３Ｅ－７０８５ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅである。

【0373】

１０）－２ 各種フォーマットＦｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の発現
１０）－２－１ Ｈｙｂｒｉｄ型二重特異性分子の発現
７）－２－１と同様の手法にてｐ＿ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ及びｐ＿ＮＹＡ－１１４３－ＬＣを１：１：１．５の比率で混合したベクター混合物を用いてＨｙｂｒｉｄ型二重特異性分子（ＮＹＧ－３１４３）の培養上清を発現調製した。ＮＹＧ－３１４３を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１０４（図１０５）、配列番号１０５（図１０６）及び１０６（図１０７）に示す。

【0374】

１０）－２－２ Ｄｕａｌ型二重特異性分子の発現
７）－２－１と同様の手法にてｐ＿ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅを２：１の比率で混合したベクター混合物を用いてＤｕａｌ型二重特異性分子（ＮＹＧ－２１４３）の培養上清を発現調製した。ＮＹＧ－２１４３を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１０８（図１０９）及び１０６（図１０７）に示す。

【0375】

１０）－２－３ ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の発現
７）－２－１と同様の手法にてｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ｐ＿ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ｐ＿ＮＹＡ－１１５４－ＬＣを１：１：１．５の比率で混合したベクター混合物を用いてｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型（ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ型）二重特異性分子（ＮＹＦ－０００３）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－０００３を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１１２（図１１３）、配列番号１１３（図１１４）及び１１４（図１１５）に示す。

【0376】

１０）－２－４ 各種フォーマット評価用ｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型二重特異性分子の発現
７）－２－１と同様の手法にて、ｐ＿ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ｐ＿ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅを用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型（ｔａＦｖ－Ｆｃ型）抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００１０）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００１０を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１１８（図１１９）及び１１４（図１１５）に示す。

【0377】

ｐ＿ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ｐ＿ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅを用いてｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ型（ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－Ｆｃ型）抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－０００４）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－０００４を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１１９（図１２０）及び１１４（図１１５）に示す。

【0378】

ｐ＿ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅ、ｐ＿ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅを用いてｔａＦｖ－Ｆｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＦ－００１１）の培養上清を発現調製した。ＮＹＦ－００１１を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１２０（図１２１）及び１１４（図１１５）に示す。

【0379】

１０）－３ 各種フォーマットＦｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の精製
１０）－２－１及び１０）－２－２で得られた培養上清より、各種二重特異性分子をＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィーとセラミックハイドロキシアパタイトの２段階工程で精製した。

【0380】

ＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に培養上清をアプライし、目的の二重特異性分子を吸着させた。非吸着成分をＰＢＳで除去した後、酢酸バッファ ｐＨ３．６で吸着成分を溶出した。溶出画分はＴｒｉｓバッファ ｐＨ９．５でｐＨを中性に調製し、２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ５．５へバッファ交換した。１０ｍＭリン酸カリウム／５０ｍＭ ＭＥＳ／ｐＨ６．５のバッファで５倍希釈した目的画分溶液を、１０ｍＭ リン酸カリウム／５０ｍＭ ＭＥＳ／ｐＨ６．５のバッファで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ Ｔｙｐｅ―１ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ：日本バイオラッド社）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、目的のヘテロダイマーに相当する画分を集めた。予め２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、３００ｍＭ ＮａＣＬ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ６．０で平衡化したゲルろ過カラム Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に供した。ゲルろ過クロマトグラフィーで得られたピーク画分より、目的のヘテロダイマーに相当する画分を回収し、２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ５．５へバッファ交換した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって、目的の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子が形成されていることを確認した。精製タンパク質サンプルは分析用ＳＥＣに供し、純度と濃度を決定した後、各種評価に用いた。

【0381】

また１０）－２－３及び１０）－２－４で得られた培養上清より、各種二重特異性分子を７）－３ と同様の手法にて、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーの２段階工程で精製した。ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって、目的の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子が形成されていることを確認した。精製タンパク質サンプルは分析用ＳＥＣに供し、純度と濃度を決定した後、各種評価に用いた。

【0382】

（実施例１１） 各種フォーマットＦｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
１１）－１ Ｈｙｂｒｉｄ体、Ｄｕａｌ体、ｔａＦｖ－Ｆｃ体抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
１１）－１－１ 標的細胞の調製
Ｕ２６６Ｂ１細胞株を実施例８）－１と同様の方法で調製したものを標的細胞として用いた。

【0383】

１１）－１－２ エフェクター細胞の調製
市販の凍結ヒトＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を実施例８）－２と同様の方法で調製したものをエフェクター細胞として用いた。

【0384】

１１）－１－３ 細胞傷害アッセイ
実施例１１）－１－１で取得した各標的細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各種濃度に調製した実施例１０で調製した各種フォーマット抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、実施例１１）－１－２で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２０～２４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて実施し、細胞溶解率は次式で算出した。細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。図７Ａに示す通り、ｔａＦｖ－Ｆｃ体による細胞傷害活性が示された。解析ソフトウェア（Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０）のＦｏｕｒ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｃｕｒｖｅの計算式を用いてＥＣ_５０を算出し、結果を表５に記載した。Ｎｏｔ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ（ＮＡ）は、相関係数Ｒ値が算出されず、カーブフィッティングできなかったことを示す。Ｈｙｂｒｉｄ体、Ｄｕａｌ体による細胞傷害活性は認められなかった。

【0385】

【表5】

【0386】

１１）－２ ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ体、ｔａＦｖ－Ｆｃ体、ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－Ｆｃ体抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性評価
１１）－２－１ 標的細胞の調製
Ｕ２６６Ｂ１細胞株を実施例８）－１と同様の方法で調製したものを標的細胞として用いた。

【0387】

１１）－２－２ エフェクター細胞の調製
市販の凍結ヒトＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を実施例８）－２と同様の方法で調製したものをエフェクター細胞として用いた。

【0388】

１１）－２－３ 細胞傷害アッセイ
１１）－２－１で取得した各標的細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各種濃度に調製した実施例１０で調製した各種フォーマット抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、実施例１１）－２－２で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２０－２４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて実施し、細胞溶解率は次式で算出した。細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。図７Ｂに示す通り、ｔａＦｖ－Ｆｃ体による細胞傷害活性が示された。解析ソフトウェア（Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０）のＦｏｕｒ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｃｕｒｖｅの計算式を用いてＥＣ_５０を算出し、結果を表６に記載した。Ｎｏｔ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ（ＮＡ）は、相関係数Ｒ値が算出されず、カーブフィッティングできなかったことを示す。ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ体、ｔａＦｖ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ）－ヘテロダイマーＦｃ体はｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ体と比較して低活性であった。

【0389】

【表6】

【0390】

（実施例１２） ＮＹＦ－００６１へ変異導入およびフォーマット変更した各種Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の作製
１２）－１ ＮＹＦ－００６１へ変異導入およびフォーマット変更した各種Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子発現ベクターの作製
物性向上をめざしＮＹＦ－００６１の変異体を設計し、各分子を構成する以下のベクターを作製した。

【0391】

ＮＹＦ－００６１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるベクターｐ＿ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２のＣ３Ｅ－７０８５配列へ変異導入し、「ｐ＿ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２」と命名した。

【0392】

ＮＹＦ－００６１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるベクターｐ＿ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２のＮＹＡ－２０６１配列およびＣ３Ｅ－７０８５配列へ変異導入し、「ｐ＿ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２」および「ｐ＿ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２」と命名した。

【0393】

ｐ＿ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１５２（図１４８）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0394】

ｐ＿ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１５３（図１４９）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0395】

ｐ＿ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１５４（図１５０）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0396】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＺ－００３８－ＨＣ２、ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２、ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２全長のアミノ酸配列を確認した。

【0397】

ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５５（図１５１）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－２０６１―Ｃ３Ｅ－７０９６ｔａＦｖであり、５１２番目から５１３番目のアミノ酸配列がリンカー、５１４番目から７４５番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0398】

ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５６（図１５２）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－３０６１―Ｃ３Ｅ－７０９６ｔａＦｖであり、５１７番目から５１８番目のアミノ酸配列がリンカー、５１９番目から７５０番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0399】

ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５７（図１５３）に示されるアミノ酸配列である。当該配列において、１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から５１６番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－３０６１―Ｃ３Ｅ－７０９７ｔａＦｖであり、５１７番目から５１８番目のアミノ酸配列がリンカー、５１９番目から７５０番目のアミノ酸配列がＨＣ２である。

【0400】

またＮＹＦ－００６１をｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型へのフォーマット変更を検討するため、各分子を構成する以下のベクターを設計した。
ＮＹＡ－３０６１のカルボキシル末端へ（ｉ）Ｃ３Ｅ－７０８５の重鎖可変領域、（ｉｉ）ヒトＩｇＧ由来ＣＨ１領域、及び（ｉｉｉ）エフェクター機能を低下させ、かつヘテロ多量体を形成させる変異を導入したＦｃ領域の順に付加してなるポリペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２」と命名した。またＣ３Ｅ－７０８５軽鎖可変領域のカルボキシル末端にヒトＩｇＧ由来ＣＬ領域が付加してなるポリペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた哺乳動物細胞用発現ベクターを作製し、「ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣ」と命名した。

【0401】

ｐ＿ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２のヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１５８（図１５４）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0402】

ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣのヌクレオチド配列は再解析し、Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣ全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１５９（図１５５）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。

【0403】

また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードするＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２、Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣ全長のアミノ酸配列を確認した。

【0404】

ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１６０（図１５６）に示されるアミノ酸配列である。１番目から１９番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から２７１番目のアミノ酸配列がＮＹＡ－３０６１であり、２７２番目から２７６番目のアミノ酸配列がリンカーであり、２７７番目から３９４番目のアミノ酸配列がＣ３Ｅ－７０８５－重鎖可変領域である。また、３９５番目から７２４番目のアミノ酸配列が定常領域である。

【0405】

Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣ全長のアミノ酸配列は配列表の配列番号１６１（図１５７）に示されるアミノ酸配列である。１番目から２０番目のアミノ酸配列がシグナル配列であり、２１番目から１２７番目のアミノ酸配列が可変領域であり、１２８番目から２３３番目のアミノ酸配列が定常領域である。また、アミノ酸番号４６番から５３番はＣＤＲＬ1（配列番号１４４（図１４２））であり、アミノ酸番号７１番から７３番はＣＤＲＬ２（配列番号１４５（図１４２））であり、アミノ酸番号１１０番から１１７番はＣＤＲＬ３（配列番号１４６（図１４２））である。

【0406】

１２）－２ ＮＹＦ－００６１へ変異導入およびフォーマット変更した各種Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の発現および精製
７）－２－１と同様の手法にてｐ＿ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＺ－００３８）の培養上清を発現調製した。ＮＹＺ－００３８を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１５５（図１５１）及び８４（図８５）に示す。

【0407】

ｐ＿ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＺ－００８２）の培養上清を発現調製した。ＮＹＺ－００８２を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１５６（図１５２）及び８４（図８５）に示す。

【0408】

ｐ＿ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２、ｐ＿ＨＣ１を用いてｔａＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＺ－００８３）の培養上清を発現調製した。ＮＹＺ－００８３を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１５７（図１５３）及び８４（図８５）に示す。

【0409】

ｐ＿ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２、ｐ＿Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣおよびｐ＿ＨＣ１を用いてｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ヘテロダイマーＦｃ型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子（ＮＹＺ－１０１０）の培養上清を発現調製した。ＮＹＺ－１０１０を構成する各ベクターを発現させて得られＮＹＺ－１０１０を構成する各ベクターを発現させて得られるアミノ酸の配列を配列表の配列番号１６０（図１５６）、配列番号１６１（図１５７）及び８４（図８５）に示す。

【0410】

上記調製した各培養上清は、７）－３ と同様の手法で精製した。精製タンパク質サンプルは分析用ＳＥＣに供し、純度と濃度を決定した後各種評価に用いた。

【0411】

（実施例１３） ＢｉａｃｏｒｅによるＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合能評価
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用い、固定化した抗Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体へ各Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子をリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定した。抗原には、１）－１にて調製したＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯを使用した。抗Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）はＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）へ、キット説明書に従い固定化させた。ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で０．５μｇ／ｍLに希釈した評価する各Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を１０μＬ／ｍｉｎで６０秒間接触させて固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋で希釈した複数濃度のＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯをアナライトとして各サンプルを流速３０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間添加し、６００秒間乖離を測定するシングルサイクルカイネティクス解析によりＫ_Ｄを算出し、結果を表７に記載した。ＮＹＺ－００３８、ＮＹＺ－００８２、ＮＹＺ－００８３、及びＮＹＺ－１０１０はいずれもＮＹＦ－００６１と同程度の結合を保持していた。

【0412】

【表7】

【0413】

（実施例１４） ＣＤ３ｅノックアウトヒトリンパ芽球細胞融合細胞株Ｔ２細胞の作製
ＣＲＩＳＰＲ技術を使ってヒトリンパ芽球細胞融合細胞株Ｔ２（ＡＴＣＣ）細胞のゲノム配列よりＣＤ３eをノックアウトするため、Ｃａｓ９発現プラスミド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）とｓｇＲＮＡ発現プラスミドをＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（ＬＯＮＺＡ社）にて導入した。導入後、限界希釈法による細胞クローニングを行った。導入細胞におけるゲノムＤＮＡ解析による目的の遺伝子断片欠失および全ＲＮＡでのＲＴ－ＰＣＲ解析によりＣＤ３ｅ遺伝子発現が認められない細胞を取得し、以降の実験に供した。

【0414】

（実施例１５） Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子のＮＹ－ＥＳＯペプチド内の認識アミノ酸解析
実施例１４で作製したＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞を２０％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で適切な濃度に調製し、実施例５）と同様の手法にて、ＮＹ－ＥＳＯペプチド（配列番号１）、点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド１Ｆ、２Ｍ、３Ａ、４Ａ、５Ａ、６Ｌ、７Ｆ、８Ａ、９Ａ（配列番号１２１（図１２２）、１２２（図１２３）、１２３（図１２４）、１２４（図１２５）、１２５（図１２６）、１２６（図１２７）、１２７（図１２８）、１２８（図１２９）、１２９（図１３０））、ｇｐ１００ペプチド（配列番号１３０（図１３１））（いずれもＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ社）を添加し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）染色した細胞を２つに分け、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１０^５細胞／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。一方の細胞について、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１００ｎＭに希釈した実施例１２で調製した各種Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＰＥ ｃｏｎｊｕｇａｔeｄ Ｆ（ａｂ‘）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、マイルドホルム １０Ｎ（富士フイルム和光純薬社）で一晩固定後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁した。ＨＬＡ／ペプチド複合体量で標準化を行うため、もう一方の細胞について、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したＨＬＡ－Ａ２抗体ＢＢ７．２－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＢｉｏＲＡＤ社）、あるいはマウスＩｇＧ２ｂ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＢｉｏＲＡＤ社）を２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃で３０分静置した。５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、マイルドホルム １０Ｎ（富士フイルム和光純薬社）で一晩固定後、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで再懸濁した。これら細胞懸濁液をフローサイトメーター（ＣａｎｔｏＩＩ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）で行い、ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞の死細胞除去画分のＰＥあるいはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の幾何学的平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を測定した。ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞上のＨＬＡ／ペプチド複合体量で標準化された各Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の結合性を示す値、標準化ｇＭＦＩは次式で算出した。
標準化ｇＭＦＩ＝（Ａ／Ｂ）×（（Ｃ／Ｄ）／（Ｅ／Ｆ））
・Ａ／Ｂ＝相対ｇＭＦＩ
Ａ：抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＰＥ ｇＭＦＩ
Ｂ：抗体非添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＰＥ ｇＭＦＩ
・（Ｃ／Ｄ）／（Ｅ／Ｆ）＝ＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＨＬＡ／ペプチド複合体量補正値
Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＡｌｅｘａ４８８ ｇＭＦＩ
Ｄ：マウスＩｇＧ２ｂ抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＡｌｅｘａ４８８ ｇＭＦＩ
Ｅ：ＨＬＡ－Ａ２抗体添加のＤＭＳＯ添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＡｌｅｘａ４８８ ｇＭＦＩ
Ｆ：マウスＩｇＧ２ｂ抗体添加のＤＭＳＯ添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＡｌｅｘａ４８８ ｇＭＦＩ

【0415】

図１５８Ａに示す通り、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子ＮＹＺ－００３８、００８２、００８３、１０１０は、野生型ＮＹ－ＥＳＯペプチドと比較し、１、４、５、７番目のアミノ酸に点変異を導入したペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２に対する結合性が４分の１以下に低下したことから、ＮＹ－ＥＳＯペプチドの１、４、５、７番目のアミノ酸を強く認識していることが示唆された。

【0416】

（実施例１６） Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の抗原結合特異性評価
実施例６）と同様の手法にて、ＮＹ－ＥＳＯペプチド：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１）配列中、本抗体４種類が特に強く認識していると示唆される１、４、５番目のアミノ酸配列が一致した、図２Ａに示す９－ｍｅｒペプチドを相同性ペプチドとして選定し、結合特異性評価を実施した。ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞を２０％ＦＢＳ含有ＡＩＭ－Ｖ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で適切な濃度に調製し、ＮＹ－ＥＳＯペプチド（配列番号１）、相同性ペプチドＤＯＬＰＰ１、ＩＬ２０ＲＢ、ＰＲＫＤ２、ＣＤ１６３、Ｐ２ＲＹ８（配列番号１３１（図１３２）、１３２（図１３３）、１３３（図１３４）、１３４（図１３５）、１３５（図１３６））、ｇｐ１００ペプチド（配列番号１３０（図１３１））（いずれもＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ社）をＤＭＳＯで５ｍＭに溶解した溶液を、最終濃度が５０μＭになるように、あるいはＤＭＳＯを１／１００量添加し、実施例１５と同様の方法で各抗体の結合性を評価した。ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞の上のＨＬＡ／ペプチド複合体量で標準化された各Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の結合性を示す値、標準化ｇＭＦＩは次式で算出した。
標準化ｇＭＦＩ＝（Ａ／Ｂ）×（（Ｃ／Ｄ）／（Ｅ／Ｆ））
Ａ：抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＰＥ ｇＭＦＩ
Ｂ：抗体非添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＰＥ ｇＭＦＩ
・（Ｃ／Ｄ）／（Ｅ／Ｆ）＝ＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＨＬＡ／ペプチド複合体量補正値
Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＡｌｅｘａ４８８ ｇＭＦＩ
Ｄ：マウスＩｇＧ２ｂ抗体添加のＤＭＳＯあるいは各ペプチド添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＡｌｅｘａ４８８ ｇＭＦＩ
Ｅ：ＨＬＡ－Ａ２抗体添加のＤＭＳＯ添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＡｌｅｘａ４８８ ｇＭＦＩ
Ｆ：マウスＩｇＧ２ｂ抗体添加のＤＭＳＯ添加ＣＤ３ｅノックアウトＴ２細胞のＡｌｅｘａ４８８ ｇＭＦＩ

【0417】

図１５８Ｂに示す通り、Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子ＮＹＺ－００３８、００８２、００８３、１０１０はいずれの相同性ペプチド添加細胞にも結合せず、特異性が極めて高いことが示唆された。

【0418】

（実施例１７） Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞傷害活性評価
１７）－１ 標的細胞の調製
実施例８）－１と同様の手法にて、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現細胞株（Ｕ２６６Ｂ１、及び、ＮＣＩ－Ｈ１７０３）、及び、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現細胞株（ＡＧＳ、及び、ＣＦＰＡＣ－１）の懸濁液を調製し、標的細胞として用いた。

【0419】

１７）－２ エフェクター細胞の調製
実施例８）－２と同様の手法にて、市販の凍結ヒトＰＢＭＣ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）懸濁液を調製し、エフェクター細胞として用いた。

【0420】

１７）－３ 細胞傷害アッセイ
実施例１７）－１で取得した各標的細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ Ｕ底マイクロプレートに添加した。そこに各種濃度に調製した実施例１２で調製した各種Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、実施例１７）－２で調製したエフェクター細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０００ｒｐｍ×１分間遠心後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２０－２４時間培養した。上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に回収し、５０℃で約２時間乾燥させた後、プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で測定した。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて実施し、細胞溶解率は次式で算出した。細胞溶解率（％）＝（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）×１００
Ａ：サンプルウェルのカウント。
Ｂ：バックグラウンド（抗体非添加ウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ用培地を５０μＬ添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
Ｃ：最大放出（標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル）カウントの平均値（ｎ＝３）。抗体添加時にアッセイ培地を５０μＬ添加した。界面活性剤は１００μＬ添加し、サンプルウェルと同様に５０μＬ分をＬｕｍａＰｌａｔｅに移して測定を実施した。

【0421】

図１５９Ａ－Ｄに示す通り、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ発現細胞株（Ｕ２６６Ｂ１、及び、ＮＣＩ－Ｈ１７０３）に対して、各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の細胞傷害活性が示された。解析ソフトウェア（Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ １２．０）のＦｏｕｒ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｃｕｒｖｅの計算式を用いてＥＣ_５０を算出し、Ｕ２６６Ｂ１細胞株における結果を表８に、ＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞株における結果を表９に記載した。一方、図１５９Ｅ－Ｈに示すとおり、内因性ヒトＮＹ－ＥＳＯ非発現細胞株（ＡＧＳ、及び、ＣＦＰＡＣ－１）に対する細胞傷害活性は認められなかった。

【0422】

【表8】

【0423】

【表9】

【0424】

（実施例１８） Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子のヒトＰＢＭＣ移入モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性評価
ヒト扁平上皮肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７０３（ＡＴＣＣ）を５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）含有ＰＢＳで６×１０^７細胞／ｍＬになるよう調製し、ＮＯＧマウス（雌性、６～７週齢）の皮下に０．１ｍＬ移植した（Ｄａｙ０）。Ｄａｙ４にヒトＰＢＭＣをＰＢＳで３．７５×１０^７～５ｘ１０^７細胞／ｍＬになるよう調製し、０．２ｍＬ尾静脈内移植した。約１週間後（Ｄａｙ６～７）より経時的に腫瘍の長径（ｍｍ）及び短径（ｍｍ）を電子デジタルノギスで計測し、以下に示す計算式により推定腫瘍体積を算出した。

【0425】

Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ（ｍｍ^３）＝各個体の推定腫瘍体積の平均値
各個体の推定腫瘍体積＝長径×短径^２／２

【0426】

Ｄａｙ１４に各群ｎ＝５になるよう腫瘍体積による群分けを実施し、各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子を尾静脈内投与（ＮＹＺ－１０１０は１ｍｇ／ｋｇ、ＮＹＺ－１０１０は同モル量で比較のため１．２ｍｇ／ｋｇ）した。投与はＤａｙ１４、Ｄａｙ２１に実施した。各種抗ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子投与群において抗腫瘍効果が確認された（図１６０Ａ―Ｄ）。Ｄａｙ２８～２９におけるＴｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（％）を以下に示す計算式により算出し、表１０に記載した。
Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（％）＝１００－（各群のＥｓｔｉｍａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ／Ｖｅｈｉｃｌｅ ＣｏｎｔｒｏｌのＥｓｔｉｍａｔｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｖｏｌｕｍｅ×１００）

【0427】

【表10】

【0428】

（実施例１９） 各種Ｆｃ付加型抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ－抗ＣＤ３二重特異性分子の物理化学的性質の比較
１９）－１ 酸処理評価
７）－２－１ で作製したＮＹＦ－００１６および各種ＮＹＡ－１１４３ＣＤＲグラフト変異体（ＮＹＦ－００４４、ＮＹＦ－００４５、ＮＹＦ－００４７、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０およびＮＹＦ－００６１）を、Ａｍｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて遠心濃縮し２５ｍＭ 酢酸ナトリウム、５％ソルビトール、ｐＨ５．５へバッファー交換後、濃度を１５ｍｇ／ｍｌ （ＮＹＦ－００１６は１０ｍｇ／ｍｌ）に調製した。次に、各サンプルは、Ｘｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ Ｄｉａｌｙｚｅｒ （Ｓｃｉｅｎｏｖａ社）を用いて１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５もしくはコントロール用として２５ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール、ｐＨ５．５へ透析後サンプルを回収し、１時間、室温にて静置した。続いて各サンプルのｐＨを、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０を用いてｐＨ５．０へ戻した。各サンプルは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ２００ ＳＥＣ １．７μｍ ４．６＊１５０ mm（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）にて分析した。移動相は０．２Ｍ Ｋｉ／２００ｍＭ ＫＣｌ／ｐＨ７．０を用い、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎにて分析した（検出波長２８０nm）。各サンプル中に含まれる多量体の含有量（％）を各ピーク解析し、面積百分率法により算出、結果を図１６２に記載した。 ＮＹＦ－００１６は、酸処理により多量体が９６％に増加した。一方、各種ＮＹＡ－１１４３ＣＤＲグラフト変異体は、酸処理による多量体形成量は低下へ改善した。特にＮＹＦ－００４７、ＮＹＦ－００４８、ＮＹＦ－００６０およびＮＹＦ－００６１は、酸処理による多量体形成量が１％以下に低減し、酸耐性が大きく改善した。

【0429】

１９）－２ 溶液安定性評価
７）－２－１ で作製したＮＹＦ－００６１および１２）－２ で作製したＮＹＺ－００３８、ＮＹＺ－００８２、ＮＹＺ－００８３、ＮＹＺ－１０１０を用いて、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて遠心濃縮し２５ｍＭヒスチジン、５％ソルビトール、ｐＨ６．０へバッファー交換後、２５ｍＭヒスチジン、５％ソルビトール、ｐＨ６．０を添加しサンプル濃度を２５ｍｇ/ｍｌに調製し評価用サンプルとした。また各評価用サンプルの開始時のｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ｓｐｅｉｃｅｓ（ＨＭＷＳ）は、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ ２．７μｍ ４．６×３００ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用い面積百分率法により算出した。移動相は０．２Ｍ Ｋｉ／２００ｍＭ ＫＣｌ／ｐＨ７．０を用い、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎにて分析した（検出波長２８０ｎｍ）。各サンプルの溶液安定性試験は、２５℃で６日（ＮＹＦ－００６１は７日）保存後、上記と同条件にてサイズ排除クロマトグラフィーを実施し、各サンプルのＨＭＷＳ（％）を面積百分率法にて算出、結果を表１１に記載した。ＮＹＦ－００６１の保存時間経過によるＨＭＷＳ（％）は、約１０．６％まで増加した。一方、ＮＹＺ－００３８、ＮＹＺ－００８２、ＮＹＺ－００８３およびＮＹＺ－１０１０の保存時間経過によるＨＭＷＳ（％）は、約２％以下の増加にとどまった。よって、ＮＹＦ－００６１に比べ、ＮＹＺ－００３８、ＮＹＺ－００８２、ＮＹＺ－００８３およびＮＹＺ－１０１０の溶液安定性が優れていた。

【表11】

【0430】

（実施例２０） 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ作製
２０）－１ 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ発現ベクターの構築
ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－１へ高結合能を有するとされる抗体ｍＡｂ２４９５５Ｎ、ｍＡｂ２４９５６Ｎ、ｍＡｂ２８０７５Ｐ、ｍＡｂ２８１０５Ｐ、ｍＡｂ２８１１３ＰおよびｍＡｂ２９８２２Ｐ２（ＷＯ２０２１／００３３５７）のｓｃＦｖを設計し、ｍＡｂ２４９５５ＮのｓｃＦｖをＮＹＣ－０００５、ｍＡｂ２４９５６ＮのｓｃＦｖをＮＹＣ－０００６、ｍＡｂ２８０７５Ｐ のｓｃＦｖをＮＹＣ－０００７、ｍＡｂ２８１０５ＰのｓｃＦｖをＮＹＣ－０００８、ｍＡｂ２８１１３ＰのｓｃＦｖをＮＹＣ－０００９、ｍＡｂ２９８２２Ｐ２のｓｃＦｖをＮＹＣ－００１０と命名した。
ｐｃＤＮＡ３．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした各種ＮＹＣ－０００５、ＮＹＣ－０００６、ＮＹＣ－０００７、ＮＹＣ－０００８、ＮＹＣ－０００９及びＮＹＣ－００１０の哺乳動物細胞用ｓｃＦｖ発現用ベクターを設計した。さらにベクター骨格およびフォーマットを揃えて哺乳動物細胞における発現量を比較するために、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ－２０６１，ＮＹＡ－３０６１の哺乳動物細胞用ｓｃＦｖ発現用ベクターを設計した。
構築したｓｃＦｖ発現ベクターのヌクレオチド配列は再解析し、ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ―２０６１、ＮＹＡ－３０６１、ＮＹＣ－０００５、ＮＹＣ－０００６、ＮＹＣ－０００７、ＮＹＣ－０００８、ＮＹＣ－０００９及びＮＹＣ－００１０の全長のヌクレオチド配列はそれぞれ配列表の配列番号４３（図５０）、４６（図５３）、１６３（図１６４）、１６５（図１６６）、１６７（図１６８）、１６９（図１７０）、１７１（図１７２）、１７３（図１７４）、および１７５（図１７６）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。また、上記ヌクレオチド配列より当該配列がコードするＮＹＡ－２０４７全長のアミノ酸配列は配列番号５０（図５７）、ＮＹＡ－２０６１全長のアミノ酸配列は配列番号５３（図６０）、ＮＹＡ－３０６１全長のアミノ酸配列は配列番号１６４（図１６５）、ＮＹＣ－０００５全長のアミノ酸配列は配列番号１６６（図１６７）、ＮＹＣ－０００６全長のアミノ酸配列は配列番号１６８（図１６９）、ＮＹＣ－０００７全長のアミノ酸配列は配列番号１７０（図１７１）、ＮＹＣ－０００８全長のアミノ酸配列は配列番号１７２（図１７３）、ＮＹＣ－０００９全長のアミノ酸配列は配列番号１７４（図１７５）、ＮＹＣ－００１０全長のアミノ酸配列は配列番号１７６（図１７７）に示されるアミノ酸配列である。

【0431】

２０）－２ 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ発現・精製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の培養および遺伝子導入は１）－５－２に記載の方法と同様に実施した。生産量を評価するために、遺伝子導入してから３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーターで４日間、１３５ｒｐｍで振とう培養し、得られた培養上清を０．２μｍ ｆｉｌｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でろ過し、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖの培養上清を得た。精製は、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌ（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて実施し、溶出液を分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、濃度を決定した。生産量を表１２に示した。ＮＹＡ－２０４７、ＮＹＡ―２０６１、ＮＹＡ－３０６１のＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌによる精製後溶出液における培養上清１Ｌあたりに換算した生産量は、ＮＹＣ－０００５、ＮＹＣ－０００６、ＮＹＣ－０００７、ＮＹＣ－０００８、ＮＹＣ－０００９及びＮＹＣ－００１０に比べて、いずれも多かった。

【表12】

各ｓｃＦｖのＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌ溶出液は濃縮し、２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ５．５で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ、Ｃｙｔｉｖａ）にて精製した。精製タンパク質サンプルは分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、純度と濃度を決定した後、各種評価に用いた。

【0432】

（実施例２１） 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃの発現・精製
２１）－１ 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ発現ベクターの構築
異なるフォーマットにおける生産性を比較するため、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖをＦｃ融合体へフォーマット変換した発現ベクターを構築した。ヘテロダイマーＦｃ配列（ＨＣ－ｈおよびＨＣ－ｋと以下記載する）には、（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８Ｊｕｌ；１６（７）６７７－８１．）に報告されたものを用いた。
ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－１へ高結合能を有するとされる抗体ｍＡｂ２４９５５Ｎ、ｍＡｂ２４９５６Ｎ、ｍＡｂ２８０７５Ｐ、ｍＡｂ２８１０５Ｐ、ｍＡｂ２８１１３ＰおよびｍＡｂ２９８２２Ｐ２（ＷＯ２０２１／００３３５７）のｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃを設計し、ｍＡｂ２４９５５ＮのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＣ－００１１、ｍＡｂ２４９５６ＮのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＣ－００１２、ｍＡｂ２８０７５ＰのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＣ－００１３、ｍＡｂ２８１０５ＰのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＣ－００１４、ｍＡｂ２８１１３ＰのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＣ－００１５、ｍＡｂ２９８２２Ｐ２のｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＣ－００１６と命名した。また、ＮＹＡ－２０４７のｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＤ－２０４７、ＮＹＡ－２０６１のｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＤ－２０６１、ＮＹＡ－３０６１のｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃをＮＹＤ－３０６１と命名した。
ｐｃＤＮＡ３．３またはｐｃＤＮＡ３．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を骨格とした各種ＨＣ－ｈ、ＮＹＣ－００１１－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１２－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１３－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１４－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１５－ＨＣ－ｋ及びＮＹＣ－００１６－ＨＣ－ｋの哺乳動物細胞用発現ベクターを設計した。さらにベクター骨格およびフォーマットを揃えて哺乳動物細胞における発現量を比較するために、ＮＹＤ－２０４７－ＨＣ－ｋ、ＮＹＤ－２０６１－ＨＣ－ｋ、ＮＹＤ－３０６１－ＨＣ－ｋの哺乳動物細胞用発現ベクターを設計した。
構築したｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃ発現ベクターのヌクレオチド配列は再解析し、ＨＣ－ｈ、ＮＹＤ－２０４７－ＨＣ－ｋ、ＮＹＤ―２０６１－ＨＣ－ｋ、ＮＹＤ－３０６１－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１１－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１２－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１３－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１４－ＨＣ－ｋ、ＮＹＣ－００１５－ＨＣ－ｋ及びＮＹＣ－００１６－ＨＣ－ｋの全長のヌクレオチド配列はそれぞれ配列表の配列番号１７７（図１７８）、１７９（図１８０）、１８１（図１８２）、１８３（図１８４、１８５（図１８６）、１８７（図１８８）、１８９（図１９０）、１９１（図１９２）、１９３（図１９４）および１９５（図１９６）に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。また、上記ヌクレオチド配列より当該配列がコードするＨＣ－ｈ全長のアミノ酸配列は配列番号１７８（図１７９）、ＮＹＤ－２０４７－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１８０（図１８１）、ＮＹＤ－２０６１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１８２（図１８３）、ＮＹＤ－３０６１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１８４（図１８５）、ＮＹＣ－００１１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１８６（図１８７）、ＮＹＣ－００１２－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１８８（図１８９）、ＮＹＣ－００１３－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１９０（図１９１）、ＮＹＣ－００１４－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１９２（図１９３）、ＮＹＣ－００１５－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１９４（図１９５）、ＮＹＣ－００１６－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列は配列番号１９６（図１９７）に示されるアミノ酸配列である。

【0433】

２１）－２ 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃの発現・精製
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の培養および遺伝子導入は１）－５－２に記載の方法と同様に実施した。各クローンの作製に用いたプラスミドの組み合わせを以下の表１３に示した。

【表13】

生産量を評価するために、遺伝子導入してから３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーターで４日間、１３５ｒｐｍで振とう培養し、得られた培養上清を０．２μｍ ｆｉｌｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でろ過し、抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃの培養上清を得た。精製は、ＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅレジン（Ｃｙｔｉｖａ社）に培養上清をアプライし、目的の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃを吸着させた。非吸着成分をＰＢＳで除去した後、酢酸緩衝液で溶出し、溶出液はＴｒｉｓ緩衝液でｐＨを中性に調製した後、溶出液を分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、純度と濃度を決定した。培養上清１Lあたりに換算した生産量を表１４に示した。ＮＹＣ－００１１、ＮＹＣ－００１２、ＮＹＣ－００１３、ＮＹＣ－００１４、ＮＹＣ－００１５及びＮＹＣ－００１６に比べて、ＮＹＤ－２０４７、ＮＹＤ―２０６１、ＮＹＤ－３０６１のＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅレジンによる精製後溶出液における培養上清１Ｌあたりに換算した生産量はいずれも多かった。

【表14】

各ｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃのＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅレジン溶出液は濃縮し、２５ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５％ Ｓｏｒｂｉｔｏｒ、ｐＨ５．５で平衡化したゲルろ過カラム （Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ、Ｃｙｔｉｖａ）にて精製した。精製タンパク質サンプルは分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、純度と量が確保できたＮＹＤ－２０４７、ＮＹＤ―２０６１、ＮＹＤ－３０６１、ＮＹＣ－００１１、ＮＹＣ－００１３、及びＮＹＣ－００１５を溶液安定性評価用サンプルとして用いた。なおＮＹＣ－００１６はＳＥＣでの予想される溶出時間に目的物が検出できなかったため、培養上清に目的物が発現しなかったと判断した。

【0434】

（実施例２２） 抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯのｓｃＦｖ－ヘテロダイマーＦｃの溶液安定性評価
実施例２１にて調製したＮＹＤ－２０４７、ＮＹＤ―２０６１、ＮＹＤ－３０６１、ＮＹＣ－００１１、ＮＹＣ－００１３、及びＮＹＣ－００１５を用いて、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にて遠心濃縮しＰＢＳへｂｕｆｆｅｒ交換後、ＰＢＳを添加しサンプル濃度を５ｍｇ/ｍｌに調整し評価用サンプルとした。また各評価用サンプルの開始時のＨＭＷＳ（％）は、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ ２．７μｍ ４．６×１５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用い面積百分率法により算出した。移動相は０．２Ｍ Ｋｉ／２００ｍＭ ＫＣｌ／ｐＨ７．０を用い、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎにて分析した（検出波長２８０ｎｍ）。各サンプルの加速劣化試験は、４０℃で１日、７日保存後、上記と同条件にてサイズ排除クロマトグラフィーを実施し、各サンプルのＨＭＷＳ（％）を面積百分率法にて算出した。各サンプルの４０℃で保存した際の経時変化を示した結果を図１６３に示す。
ＮＹＤ－２０４７、ＮＹＤ―２０６１、ＮＹＤ－３０６１の保存時間経過によるＨＭＷＳ（％）は、各８．７、８．１、４．４％へ増加した。一方、ＮＹＣ－００１１、ＮＹＣ－００１３、及びＮＹＣ－００１５の保存時間経過によるＨＭＷＳ（％）は、各７１．８、４２．４、９７．３％と顕著に増加した。
以上の結果より、ＮＹＤ－２０４７、ＮＹＤ―２０６１およびＮＹＤ－３０６１は、ＮＹＣ－００１１、ＮＹＣ－００１３、及びＮＹＣ－００１５に比べ、溶液安定性が優れていた。また、ＮＹＤ－３０６１は評価サンプル中でＨＭＷＳ（％）が最も低く、溶液安定性がもっとも優れていた。

【0435】

（実施例２３） ＢｉａｃｏｒｅによるＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合能評価
ＮＹＣ－００１１、ＮＹＣ－００１３、及びＮＹＣ－００１５の抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯを構成するｓｃＦｖに相当するＮＹＣ－０００５，ＮＹＣ－０００７、ＮＹＣ－０００８を用いてＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合能を評価した。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用い、固定化した抗Ｈｉｓ抗体へ上記抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖをリガンドとして捕捉（キャプチャー）し、抗原をアナライトとして測定した。抗原には、１）－１にて調製したＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯを使用した。抗Ｈｉｓ抗体（Ｈｉｓ Ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ、Ｃｙｔｉｖａ社）はＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（Ｃｙｔｉｖａ社）へ、キット説明書に従い固定化させた。ＨＢＳ－ＥＰ＋（Ｃｙｔｉｖａ社）で０．５μｇ／ｍLに希釈した評価する各抗ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯ ｓｃＦｖを１０μＬ／ｍｉｎで６０秒間接触させて固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰ＋で希釈した複数濃度のＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯをアナライトとして各サンプルを流速３０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間添加し、６００秒間乖離を測定するシングルサイクルカイネティクス解析によりＫ_Ｄを算出し、結果を表１５に記載した。陽性対照として用いたＮＹＡ－２０４７のＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへの結合能が安定して確認された条件下において、ＮＹＣ－０００５、ＮＹＣ－０００７、ＮＹＣ－０００８は、ＨＬＡ／ＮＹ－ＥＳＯへ結合することを確認した。

【表15】

【産業上の利用可能性】

【0436】

本発明の二重特異的抗体は、がん等の治療剤又は予防剤として利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

【配列表フリーテキスト】

【0437】

配列番号１：ＮＹ－ＥＳＯ中のペプチドのアミノ酸配列（図８）
配列番号２：ＭＡＧＥＣ－１中のペプチドのアミノ酸配列（図９）
配列番号３：ｓｃＦｖシークエンス解析用プライマー１（図１０）
配列番号４：ｓｃＦｖシークエンス解析用プライマー２（図１１）
配列番号５：ＮＹＡ－０００１の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（図１２）
配列番号６：ＮＹＡ－０００１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図１３）
配列番号７：ＮＹＡ－０００１の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（図１４）
配列番号８：ＮＹＡ－０００１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図１５）
配列番号９：ＮＹＡ－００６０の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（図１６）
配列番号１０：ＮＹＡ－００６０の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図１７）
配列番号１１：ＮＹＡ－００６０の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（図１８）
配列番号１２：ＮＹＡ－００６０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図１９）
配列番号１３：ＮＹＡ－００６８の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（図２０）
配列番号１４：ＮＹＡ－００６８の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２１）
配列番号１５：ＮＹＡ－００６８の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（図２２）
配列番号１６：ＮＹＡ－００６８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２３）
配列番号１７：ＮＹＡ－００８２の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（図２４）
配列番号１８：ＮＹＡ－００８２の重鎖可変領域のアミノ酸配列（図２５）
配列番号１９：ＮＹＡ－００８２の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（図２６）
配列番号２０：ＮＹＡ－００８２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（図２７）
配列番号２１：ＮＹＡ－１１６３タグ付加体のヌクレオチド配列（図２８）
配列番号２２：ＮＹＡ－２０２３タグ付加体のヌクレオチド配列（図２９）
配列番号２３：ＮＹＡ－２０２７タグ付加体のヌクレオチド配列（図３０）
配列番号２４：ＮＹＡ－１１４３タグ付加体のヌクレオチド配列（図３１）
配列番号２５：ＮＹＡ－２１４３タグ付加体のヌクレオチド配列（図３２）
配列番号２６：ＮＹＡ－１１６３タグ付加体のアミノ酸配列（図３３）、ＮＹＡ－１１６３はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号２７：ＮＹＡ－２０２３タグ付加体のアミノ酸配列（図３４）、ＮＹＡ－２０２３はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号２８：ＮＹＡ－２０２７タグ付加体のアミノ酸配列（図３５）、ＮＹＡ－２０２７はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号２９：ＮＹＡ－１１４３タグ付加体のアミノ酸配列（図３６）、ＮＹＡ－１１４３はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号３０：ＮＹＡ－２１４３タグ付加体のアミノ酸配列（図３７）、ＮＹＡ－２１４３はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号３１：ＮＹＡ－１１５４タグ付加体のヌクレオチド配列（図３８）
配列番号３２：ＮＹＡ－１１５４タグ付加体のアミノ酸配列（図３９）、ＮＹＡ－１１５４はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号３３：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＳＡ４７５３４．１）のトランケート体のアミノ酸配列（図４０）
配列番号３４：β２－マイクログロビンのアミノ酸配列（図４１）
配列番号３５：ＮＹＡ－２０３５タグ付加体のヌクレオチド配列（図４２）
配列番号３６：ＮＹＡ－２０３５タグ付加体のアミノ酸配列（図４３）、ＮＹＡ－２０３５はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号３７：ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０１のアミノ酸配列（図４４）
配列番号３８：ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０２のアミノ酸配列（図４５）
配列番号３９：ＮＹＡ－１１４３－ＶＨ０３のアミノ酸配列（図４６）
配列番号４０：ＮＹＡ－１１４３－ＶＬ０１のアミノ酸配列（図４７）
配列番号４１：ＮＹＡ－２０４４タグ付加体のヌクレオチド配列（図４８）
配列番号４２：ＮＹＡ－２０４５タグ付加体のヌクレオチド配列（図４９）
配列番号４３：ＮＹＡ－２０４７タグ付加体のヌクレオチド配列（図５０）
配列番号４４：ＮＹＡ－２０４８タグ付加体のヌクレオチド配列（図５１）
配列番号４５：ＮＹＡ－２０６０タグ付加体のヌクレオチド配列（図５２）
配列番号４６：ＮＹＡ－２０６１タグ付加体のヌクレオチド配列（図５３）
配列番号４７：ＮＹＡ－２０４４タグ付加体のアミノ酸配列（図５４）、ＮＹＡ－２０４４はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号４８：ＮＹＡ－２０４５タグ付加体のアミノ酸配列（図５５）、ＮＹＡ－２０４５はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号４９：ＮＹＡ－００８２のアミノ酸配列（図５６）
配列番号５０：ＮＹＡ－２０４７タグ付加体のアミノ酸配列（図５７）、ＮＹＡ－２０４７はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号５１：ＮＹＡ－２０４８タグ付加体のアミノ酸配列（図５８）、ＮＹＡ－２０４８はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号５２：ＮＹＡ－２０６０タグ付加体のアミノ酸配列（図５９）、ＮＹＡ－２０６０はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号５３：ＮＹＡ－２０６１タグ付加体のアミノ酸配列（図６０）、ＮＹＡ－２０６１はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号５４：ＮＹＡ－０００１重鎖ＣＤＲＨ１（図６１）
配列番号５５：ＮＹＡ－０００１重鎖ＣＤＲＨ２（図６１）
配列番号５６：ＮＹＡ－０００１重鎖ＣＤＲＨ３（図６１）
配列番号５７：ＮＹＡ－０００１軽鎖ＣＤＲＬ１（図６１）
配列番号５８：ＮＹＡ－０００１軽鎖ＣＤＲＬ２（図６１）
配列番号５９：ＮＹＡ－０００１軽鎖ＣＤＲＬ３（図６１）
配列番号６０：ＮＹＡ－２０２３のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図６２）
配列番号６１：ＮＹＡ－２０２７のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（図６３）
配列番号６２：ＮＹＡ－１１５４重鎖ＣＤＲＨ３（図６４）
配列番号６３：ＮＹＡ－１１５４軽鎖ＣＤＲＬ３（図６４）
配列番号６４：ＮＹＡ－００３５のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列（図６５）
配列番号６５：ＮＹＣ－０００３タグ付加体のヌクレオチド配列（図６６）
配列番号６６：ＮＹＣ－０００４タグ付加体のヌクレオチド配列（図６７）
配列番号６７：ＮＹＣ－０００３タグ付加体のアミノ酸配列（図６８）、ＮＹＣ－０００３はアミノ酸番号２１～２６３
配列番号６８：ＮＹＣ－０００４タグ付加体のアミノ酸配列（図６９）、ＮＹＣ－０００４はアミノ酸番号２１～２６３
配列番号６９：ＮＹＡ－０００１タグ付加体のヌクレオチド配列（図７０）
配列番号７０：ＮＹＡ－０００１タグ付加体のアミノ酸配列（図７１）、ＮＹＡ－０００１はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号７１：ＨＣ１のヌクレオチド配列（図７２）
配列番号７２：ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図７３）
配列番号７３：ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図７４）
配列番号７４：ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図７５）
配列番号７５：ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図７６）
配列番号７６：ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図７７）
配列番号７７：ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図７８）
配列番号７８：ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図７９）
配列番号７９：ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図８０）
配列番号８０：ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図８１）
配列番号８１：ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図８２）
配列番号８２：ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図８３）
配列番号８３：ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図８４）
配列番号８４：ＨＣ１のアミノ酸配列（図８５）
配列番号８５：ＮＹＦ－００１６－ＨＣ２のアミノ酸配列（図８６）、ＮＹＡ－１１４３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号８６：ＮＹＦ－００１９－ＨＣ２のアミノ酸配列（図８７）、ＮＹＡ－２１４３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号８７：ＮＹＦ－００２２－ＨＣ２のアミノ酸配列（図８８）、ＮＹＡ－１１６３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号８８：ＮＹＦ－００２３－ＨＣ２のアミノ酸配列（図８９）、ＮＹＡ－２０２３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号８９：ＮＹＦ－００２７－ＨＣ２のアミノ酸配列（図９０）、ＮＹＡ－２０２７はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号９０：ＮＹＦ－００３５－ＨＣ２のアミノ酸配列（図９１）、ＮＹＡ－２０３５はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号９１：ＮＹＦ－００４４－ＨＣ２のアミノ酸配列（図９２）、ＮＹＡ－２０４４はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号９２：ＮＹＦ－００４５－ＨＣ２のアミノ酸配列（図９３）、ＮＹＡ－２０４５はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号９３：ＮＹＦ－００４７－ＨＣ２のアミノ酸配列（図９４）、ＮＹＡ－２０４７はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号９４：ＮＹＦ－００４８－ＨＣ２のアミノ酸配列（図９５）、ＮＹＡ－２０４８はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号９５：ＮＹＦ－００６０－ＨＣ２のアミノ酸配列（図９６）、ＮＹＡ－２０６０はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号９６：ＮＹＦ－００６１－ＨＣ２のアミノ酸配列（図９７）、ＮＹＡ－２０６１はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号９７：ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（図９８）
配列番号９８：ＮＹＡ－０００１－ＬＣのヌクレオチド配列（図９９）
配列番号９９：ＮＹＡ－０００１－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１００）、ＮＹＡ－０００１の重鎖可変領域はアミノ酸番号２０～１３９
配列番号１００：ＮＹＡ－０００１－ＬＣのアミノ酸配列（図１０１）、ＮＹＡ－０００１の軽鎖可変領域はアミノ酸番号２１～１３１
配列番号１０１：ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（図１０２）
配列番号１０２：ＮＹＡ－１１４３－ＬＣのヌクレオチド配列（図１０３）
配列番号１０３：Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅＣのヌクレオチド配列（図１０４）
配列番号１０４：ＮＹＡ－１１４３－Ｆａｂ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１０５）、ＮＹＡ－１１４３の重鎖可変領域はアミノ酸番号２０～１３９
配列番号１０５：ＮＹＡ－１１４３－ＬＣのアミノ酸配列（図１０６）、ＮＹＡ－１１４３の軽鎖可変領域はアミノ酸番号２１～１３１
配列番号１０６：Ｃ３Ｅ－７０８５－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１０７）、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２１～２６０
配列番号１０７：ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（図１０８）
配列番号１０８：ＮＹＡ－１１４３－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１０９）、ＮＹＡ－１１４３はアミノ酸番号２１～２６６
配列番号１０９：Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（図１１０）
配列番号１１０：ＮＹＡ－１１５４－ＬＣのヌクレオチド配列（図１１１）
配列番号１１１：ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（図１１２） 配列番号１１２：Ｃ３Ｅ－７０８５－ＮＹＡ－１１５４－Ｆａｂ－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１１３）、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２１～２６０、ＮＹＡ－１１５４の重鎖可変領域はアミノ酸番号２６６～２８５
配列番号１１３：ＮＹＡ－１１５４－ＬＣのアミノ酸配列（図１１４）、ＮＹＡ－１１５４の軽鎖可変領域はアミノ酸番号２１～１３１
配列番号１１４：ＯＡＡ－ＨＣ１－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１１５）、
配列番号１１５：ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（図１１６）
配列番号１１６：ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（図１１７）
配列番号１１７：ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのヌクレオチド配列（図１１８）
配列番号１１８：ＮＹＦ－００１０－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１１９）、ＮＹＡ－１１５４はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号１１９：ＮＹＦ－０００４－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１２０）Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２１～２６０、ＮＹＡ－１１５４はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号１２０：ＮＹＦ－００１１－ＨＣ２－ｋ ｄｅｌｅｔｅのアミノ酸配列（図１２１）、ＮＹＡ－１１４３はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号１２１：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド１Ｆのアミノ酸配列（図１２２）
配列番号１２２：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド２Ｍのアミノ酸配列（図１２３）
配列番号１２３：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド３Ａのアミノ酸配列（図１２４）
配列番号１２４：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド４Ａのアミノ酸配列（図１２５）
配列番号１２５：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド５Ａのアミノ酸配列（図１２６）
配列番号１２６：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド６Ｌのアミノ酸配列（図１２７）
配列番号１２７：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド７Ｆのアミノ酸配列（図１２８）
配列番号１２８：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド８Ａのアミノ酸配列（図１２９）
配列番号１２９：点変異ＮＹ－ＥＳＯペプチド９Ａのアミノ酸配列（図１３０）
配列番号１３０：ｇｐ１００ペプチドのアミノ酸配列（図１３１）
配列番号１３１：相同性ペプチドＤＯＬＰＰ１のアミノ酸配列（図１３２）
配列番号１３２：相同性ペプチドＩＬ２０ＲＢのアミノ酸配列（図１３３）
配列番号１３３：相同性ペプチドＰＲＫＤ２のアミノ酸配列（図１３４）
配列番号１３４：相同性ペプチドＣＤ１６３のアミノ酸配列（図１３５）
配列番号１３５：相同性ペプチドのＰ２ＲＹ８のアミノ酸配列（図１３６）
配列番号１３６：Ｃ３Ｅ－７０３４のアミノ酸配列（図１３７）
配列番号１３７：Ｃ３Ｅ－７０３６のアミノ酸配列（図１３８）
配列番号１３８：Ｃ３Ｅ－７０８５のアミノ酸配列（図１３９）
配列番号１３９：Ｃ３Ｅ－７０８８のアミノ酸配列（図１４０）
配列番号１４０：Ｃ３Ｅ－７０９３のアミノ酸配列（図１４１）
配列番号１４１：Ｃ３Ｅ－７０８５重鎖ＣＤＲＨ１（図１４２）
配列番号１４２：Ｃ３Ｅ－７０８５重鎖ＣＤＲＨ２（図１４２）
配列番号１４３：Ｃ３Ｅ－７０８５重鎖ＣＤＲＨ３（図１４２）
配列番号１４４：Ｃ３Ｅ－７０８５軽鎖ＣＤＲＬ１（図１４２）
配列番号１４５：Ｃ３Ｅ－７０８５軽鎖ＣＤＲＬ２（図１４２）
配列番号１４６：Ｃ３Ｅ－７０８５軽鎖ＣＤＲＬ３（図１４２）
配列番号１４７：Ｃ３Ｅ－７０７８のアミノ酸配列（図１４３）
配列番号１４８：ＮＹＦ－００１４－ＨＣ２のヌクレオチド配列（図１４４）
配列番号１４９：ＮＹＦ－００１４－ＨＣ２のアミノ酸配列（図１４５）、ＮＹＡ－０００１はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号１５０：ＮＹＦ－００８２－ＨＣ２のアミノ酸配列（図１４６）、ＮＹＡ－００８２はアミノ酸番号２１～２６６、Ｃ３Ｅ－７０８５はアミノ酸番号２７２～５１１
配列番号１５１：ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列（図１４７）
配列番号１５２：ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列（図１４８）
配列番号１５３：ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列（図１４９）
配列番号１５４：ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列（図１５０）
配列番号１５５：ＮＹＺ－００３８－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（図１５１）
配列番号１５６：ＮＹＺ－００８２－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（図１５２）
配列番号１５７：ＮＹＺ－００８３－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（図１５３）
配列番号１５８：ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２全長のヌクレオチド配列（図１５４）
配列番号１５９：Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣ全長のヌクレオチド配列（図１５５）
配列番号１６０：ＮＹＺ－１０１０－ＨＣ２全長のアミノ酸配列（図１５６）
配列番号１６１：Ｃ３Ｅ－７０８５－ＬＣ全長のアミノ酸配列（図１５７）
配列番号１６２：ペプチドリンカーのアミノ酸配列（図１６１）
配列番号１６３：ＮＹＡ－３０６1全長のヌクレオチド配列（図１６４）
配列番号１６４：ＮＹＡ－３０６１全長のアミノ酸配列（図１６５）
配列番号１６５：ＮＹＣ－０００５全長のヌクレオチド配列（図１６６）
配列番号１６６：ＮＹＣ－０００５全長のアミノ酸配列（図１６７）
配列番号１６７：ＮＹＣ－０００６全長のヌクレオチド配列（図１６８）
配列番号１６８：ＮＹＣ－０００６全長のアミノ酸配列（図１６９）
配列番号１６９：ＮＹC－０００７全長のヌクレオチド配列（図１７０）
配列番号１７０：ＮＹＣ－０００７全長のアミノ酸配列（図１７１）
配列番号１７１：ＮＹＣ－０００８全長のヌクレオチド配列（図１７２）
配列番号１７２：ＮＹＣ－０００８全長のアミノ酸配列（図１７３）
配列番号１７３：ＮＹＣ－０００９全長のヌクレオチド配列（図１７４）
配列番号１７４：ＮＹＣ－０００９全長のアミノ酸配列（図１７５）
配列番号１７５：ＮＹＣ－００１０全長のヌクレオチド配列（図１７６）
配列番号１７６：ＮＹＣ－００１０全長のアミノ酸配列（図１７７）
配列番号１７７：ＨＣ－ｈ全長のヌクレオチド配列（図１７８）
配列番号１７８：ＨＣ－ｈ全長のアミノ酸配列（図１７９）
配列番号１７９：ＮＹＤ－２０４７－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１８０）
配列番号１８０：ＮＹＤ－２０４７－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１８１）
配列番号１８１：ＮＹＤ－２０６１－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１８２）
配列番号１８２：ＮＹＤ－２０６１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１８３）
配列番号１８３：ＮＹＤ－３０６１－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１８４）
配列番号１８４：ＮＹＤ－３０６１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１８５）
配列番号１８５：ＮＹＣ－００１１－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１８６）
配列番号１８６：ＮＹＣ－００１１－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１８７）
配列番号１８７：ＮＹＣ－００１２－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１８８）
配列番号１８８：ＮＹＣ－００１２－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１８９）
配列番号１８９：ＮＹＣ－００１３－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１９０）
配列番号１９０：ＮＹＣ－００１３－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１９１）
配列番号１９１：ＮＹＣ－００１４－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１９２）
配列番号１９２：ＮＹＣ－００１４－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１９３）
配列番号１９３：ＮＹＣ－００１５－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１９４）
配列番号１９４：ＮＹＣ－００１５－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１９５）
配列番号１９５：ＮＹＣ－００１６－ＨＣ－ｋ全長のヌクレオチド配列（図１９６）
配列番号１９６：ＮＹＣ－００１６－ＨＣ－ｋ全長のアミノ酸配列（図１９７）
配列番号１９７：ＮＹＺ－１００７－ＨＣの全長アミノ酸配列（図１９８）
配列番号１９８：ＮＹＺ－１０１７－ＨＣの全長アミノ酸配列（図１９９）

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】

【図81】

【図82】

【図83】

【図84】

【図85】

【図86】

【図87】

【図88】

【図89】

【図90】

【図91】

【図92】

【図93】

【図94】

【図95】

【図96】

【図97】

【図98】

【図99】

【図100】

【図101】

【図102】

【図103】

【図104】

【図105】

【図106】

【図107】

【図108】

【図109】

【図110】

【図111】

【図112】

【図113】

【図114】

【図115】

【図116】

【図117】

【図118】

【図119】

【図120】

【図121】

【図122】

【図123】

【図124】

【図125】

【図126】

【図127】

【図128】

【図129】

【図130】

【図131】

【図132】

【図133】

【図134】

【図135】

【図136】

【図137】

【図138】

【図139】

【図140】

【図141】

【図142】

【図143】

【図144】

【図145】

【図146】

【図147】

【図148】

【図149】

【図150】

【図151】

【図152】

【図153】

【図154】

【図155】

【図156】

【図157】

【図158A】

【図158B】

【図159A】

【図159B】

【図159C】

【図159D】

【図159E】

【図159F】

【図159G】

【図159H】

【図160A】

【図160B】

【図160C】

【図160D】

【図161】

【図162】

【図163】

【図164】

【図165】

【図166】

【図167】

【図168】

【図169】

【図170】

【図171】

【図172】

【図173】

【図174】

【図175】

【図176】

【図177】

【図178】

【図179】

【図180】

【図181】

【図182】

【図183】

【図184】

【図185】

【図186】

【図187】

【図188】

【図189】

【図190】

【図191】

【図192】

【図193】

【図194】

【図195】

【図196】

【図197】

【図198】

【図199】

【配列表】

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