特許 7285596 葛根多糖およびその製作方法並び用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-05-25

(45)【発行日】2023-06-02

(54)【発明の名称】葛根多糖およびその製作方法並び用途

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/00 20060101AFI20230526BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20230526BHJP

   A61K 36/488 20060101ALI20230526BHJP

【ＦＩ】

C08B37/00 Q

A61P3/06

A61K36/488

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2021576441

(86)(22)【出願日】2021-03-08

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-16

(86)【国際出願番号】 CN2021079531

(87)【国際公開番号】W WO2021180031

(87)【国際公開日】2021-09-16

【審査請求日】2021-12-21

(31)【優先権主張番号】202010156044.9

(32)【優先日】2020-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】521558329

【氏名又は名称】江西中医薬大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＸＩ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＲＡＤＩＴＩＯＮＡＬ ＣＨＩＮＥＳＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

【住所又は居所原語表記】１６８８ Ｍｅｉｌｉｎｇ Ａｖｅｎｕｅ，Ｗａｎｌｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｎａｎｃｈａｎｇ，Ｊｉａｎｇｘｉ ３３００００，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000291

【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】欧陽 輝

(72)【発明者】

【氏名】温 泉

(72)【発明者】

【氏名】朱 衛豊

(72)【発明者】

【氏名】馮 育林

(72)【発明者】

【氏名】劉 栄華

(72)【発明者】

【氏名】銭 ▲カイ▼

(72)【発明者】

【氏名】杜 恵

【審査官】前田 憲彦

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－２２４１１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００８－２１４１９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５３２７８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５２５４１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／０１１２４５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０８Ｂ ３７／

Ａ６１Ｋ ３６／

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＱＬは１種類の単糖からなるホモ多糖であり、その分子量が１０－６０ＫＤａであり、タンパク質含有量が０．６４％であり、ウロン酸がなく、糖の含有量が９８．７％であり、赤外線スペクトラムＩＲには典型的な多糖類吸収ピークが示され、約３３００ｃｍ^－１の水酸基吸収ピークと、約９５７ｃｍ^－1のグリコシル基吸収ピークとを含み、且つ１７００ｃｍ^－１のカルボニル基吸収ピークがなく、測定されたウロン酸含有量と一致し、ＧＣ－ＭＳ分析によって、葛根多糖ＱＬはグルコースで構成されることが実証され、葛根多糖ＱＬにおける単糖の主な結合方式はα－１,３－Ｇｌｕ結合であり、少量のＴｅｒｕｍｉｎａｌ－Ｇｌｕ末端結合があり、原子間力顕微鏡ＡＦＭテストによって、空間構造が球
状特性を示す、ことを特徴とする葛根多糖ＱＬ。

【請求項2】

請求項１に記載の葛根多糖ＱＬを製造する製造方法であって、
葛根を粉砕した後、９０℃の水で固液比１：２０によって３回浸出し、ろ過し、水浸出液を１．１－１．２密度に濃縮してから、２倍体積の無水エタノールを入れて、ろ過して沈殿を得た後、水で再び溶かしてから、活性炭素で色素を除去した後、遠心分離によって上清を得、凍結乾燥して粗多糖類を獲得、粗多糖類に蒸留水を入れて、磁気攪拌で溶解させ、遠心分離し、上清をマクロポーラス樹脂カラムＨＰ－２０に入れて分離を行い、純水、１０％エタノール、２０％エタノール溶液で溶離させ、各成分を収集し、フェノール硫酸法による発色及び４９０ｎｍでの検出結果により、同じ画分を合わせ、さらに濃縮、透析および凍結乾燥して、３つの二次成分を得、１０％エタノールで溶離された二次成分を取って、蒸留水で溶解させてから、１．５ｍ×２．５ｍのＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２０
０カラムで分離させ、蒸留水で溶離させ、各成分を収集し、フェノール硫酸法による発色及び４９０ｎｍでの検出結果により、同じ画分を合わせ、濃縮および凍結乾燥して多糖類ＱＬを得る、ことを特徴とする葛根多糖ＱＬの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は漢方薬分野に属し、多糖類に関し、具体的には葛根多糖の製作方法と脂質低下薬製作における用途に関する。

【背景技術】

【0002】

人々の生活レベルが高くなるにつれ、高脂肪食の摂取が多くなり、高脂血症の低年齢化の傾向を見せていると同時に、冠状動脈硬化症を形成する主な危険性要素の一つとなっており、コレステロール代謝調節についての関連研究において、漢方薬はますます重要な役割を果たすようになっている。臨床上、主に西洋薬のスタチン類（例えば、新バタチンなど）薬で、高脂血症を治療しており、薬の長期間服用が必要であるだけでなく、横紋筋融解症などの著しい副作用が現れる。そのため、伝統的な漢方薬の中から安全且つ有効である脂質低下薬を探し出すことは効率性と指向性がある。

【0003】

葛根はマメ科植物クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ（Ｗｉｌｄ．）Ｏｈｗｉ）の乾燥した根である。葛根は中国南地方の山地にて盛んに出ており、江西省本場の薬種であって、熱除け薬として良く使われているだけでなく、熱除け、体液分泌、発斑促進、昇陽・下痢止めなどの効能があり、「南葛北参」や「南方の人参」とも呼ばれている。葛根は薬食両用の漢方薬として、日常食生活においても著しい健康保持および脂質低下の効果がある。葛根は臨床上、主に糖尿病と高脂血症患者に使用されており、葛根湯や葛根▲チン▼連湯などの伝統的な複方製剤は、脂質低下の面で著しい治療効果があるものの、その具体的な薬効物質が何であるかがはっきりとしていない。

【0004】

本研究は、葛根浸出物の体外脂質低下活性試験スクリーニングから、その浸出物が著しい脂質低下活性を有することを発見し、バイオアッセイ誘導分別法を利用して、葛根中から著しい脂質低下活性を有する葛根多糖ＱＬを分離したが、その構造が明らかで、製作工程が簡単で、安全且つ有効である。これは、葛根多糖を高脂血症治療に利用する研究に基礎データを提供し、将来の安全・且つ有効な脂質低下薬の開発に使用することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、脂質低下活性成分、具体的には、葛根から得たホモ多糖（ＱＬ）の製作方法と脂質低下薬製作におけるその用途を提供することを課題とする。

【0006】

本発明では葛根浸出物から誘導分別法によって分離したホモ多糖をＱＬと命名する。体内試験によって、葛根多糖は優れた脂質低下活性を有することが実証され、血清中のトリグリセリド含有量を著しく低下させ、白色の脂肪質粒子を著しく減らすことができ、脂質低下薬として開発することができる。

【0007】

本発明では、前記漢方薬葛根はマメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）植物クズＰｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ（Ｗｉｌｄ．）Ｏｈｗｉの乾燥した根である。

【0008】

そのうち、葛根多糖ＱＬは以下の特徴がある。ＱＬは主に１種類の単糖からなるホモ多糖であり、その分子量が１０－６０ＫＤａ、比旋光度が［α］２０ Ｄ－２８．０ （ｃ ０．５, Ｈ_２Ｏ）、タンパク質含有量が０．６４％、ウロン酸がなく、糖の含有量が９８．７％であり、赤外線スぺクトラムＩＲには典型的な多糖類吸収ピークが現れ、約３３００ｃｍ^－１の水酸基吸収ピーク、約９５７ｃｍ^－1のグリコシル基吸収ピーク、且つ１７００ｃｍ^－１のカルボニル基吸収ピークがなく、測定されたウロン酸含有量と相違なく、十分な酸加水分解およびアセチル化誘導を通じて、またＧＣ－ＭＳ分析によって、葛根多糖ＱＬはグルコースで構成されることが発見され、また、メチル化反応が終わってから、遊離状態の水酸基を閉鎖し、さらに、十分な酸加水分解とＧＣ－ＭＳ分析を通じて、葛根多糖ＱＬ－１単糖グループの結合方式は主にα－１,３－Ｇｌｕ結合と、少量のＴｅｒｕｍｉｎａｌ－Ｇｌｕ末端結合とからなり、当該連結方式は同時にＮＭＲデータによっても実証され、^１３Ｃ－ＮＭＲ低磁場エリアには２つの典型的な末端基の炭素信号はδｃ９７．１と１００．９であり、そのうち、δ_Ｃ１００．９（Ｃ－１）はα－１，３－Ｇｌｕ末端基炭素信号であり、δ_Ｃ９７．１（Ｃ－１′）はＴｅｒｍｉｎａｌ－Ｇｌｕ末端基炭素信号であり、δ_Ｃ６１．８はグルコースＣ－６信号ピークであって、低磁場に移動していないが、これはＣ－６位置に結合置換がないことを説明し、残りのδ_Ｃ６０－８０はグルコースＣ２－Ｃ５信号エリアである。^１Ｈ－ＮＭＲも主な末端基水素信号δ_Ｈ５．３８と、結合定数Ｊ＝２．０Ｈｚを提供しているが、これはα結合であって、δ_Ｈ３．３－３．９エリアがグルコースＨ２－Ｈ５信号エリアであることを説明する。

【0009】

葛根を粉砕した後、９０℃の水で固液比１：２０によって３回浸出、且つろ過し、水浸出液を１．１－１．２密度に濃縮してから、２倍の体積に濃縮した無水エタノールを入れて、ろ過・沈殿させた後、水で再び溶かしてから、活性炭素で色素を除去し、遠心分離によって上清を獲得し、凍結・乾燥によって、粗多糖類を得る。

【0010】

粗多糖類に蒸留水を入れて、磁力ミキサーで溶解させ、遠心分離をして、上清をマクロ多孔質カラムＨＰ－２０中に入れて分離を行い、純水、１０％アルコール、２０％アルコール溶液で溶離して、各成分を収集し、フェノール硫酸法で発色現像し、４９０ｎｍ分析結果によって、同じ成分を合併してから、濃縮し、透析および凍結・乾燥を経て、３つの段階の成分Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を得る。そして、著しい脂質低下活性を有し、収率の最も高い１０％エタノール溶離液でＬ２成分をさらに分離する。

【0011】

Ｌ２に蒸留水を入れて溶解させ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００カラム（１．５ｍ×２．５ｃｍ）で分離を行なう。蒸留水で溶離し、各成分を収取する。フェノール硫酸法で発色現像し、同じ成分を合併して、濃縮および凍結・乾燥を経て、多糖類ＱＬを得る。

【0012】

体内動物実験によって、葛根多糖ＱＬは高脂血症ラットの肝臓指数を著しく低下させることができ、安全且つ有効な脂質低下薬を開発することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ＱＬのＨＰＧＰＣクロマトグラム（ＴＳＫ－ＧＥＬ ＧＭＰＷＸＬゲルカラム（３００×７．６ｍｍ）、溶離液：０．１％ＮａＣｌ、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、ＤＡＤ２１０ｎｍ測定）である。

【図2】葛根多糖ＱＬの^１３Ｃ－ＮＭＲである。

【図3】葛根多糖ＱＬの^１Ｈ－ＮＭＲである。

【図4】単糖標準品のＧＣ－ＭＳ図[単糖は順次にラムノース（Ｒｈａ）、アラビノース（Ａｒａ）、キシロース（Ｘｙｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）である。]である。

【図5】葛根多糖（ＱＬ）のＧＣ－ＭＳ図である。

【図6】葛根多糖（ＱＬ）の原子間力顕微鏡図である。

【発明を実施するための形態】

【実施例1】

【0014】

葛根多糖ＱＬの製作
葛根薬種７．０ｋｇを粉砕し、９０℃の水で固液比１：２０によって３回浸出、且つろ過し、浸出液を合併して、１．１－１．２密度まで濃縮し、さらに２倍体積の無水アルコールを入れて、３ｈぐらい静置し、ろ過して沈殿物を得るが、沈殿物を水で再び溶かしてから、０．１％の活性炭素を入れて色素を除去し、遠心分離をし、上清を０．５－１Ｌまで濃縮し、凍結・乾燥によって、粗多糖類を得る。膨らんだ状態の葛根粗多糖１００－２４４ｇを得る。粗多糖２００ｇを量り取って、蒸留水を入れて、磁力ミキサーで溶解させ、遠心分離をし、上清をマクロ多孔質樹脂カラムＨＰ－２０中に入れて分離を行い、純水、１０％アルコール、２０％アルコール溶液で溶離して、各成分を収集し、フェノール硫酸法で発色現像し、４９０ｎｍ測定結果によって、同じ成分を合併してから、濃縮し、透析および凍結・乾燥を経て、３つの段階の成分Ｌ１、Ｌ２およびＬ３を得る。

【0015】

１０％エタノールで溶離したＬ２を蒸留水で溶解させて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００カラム（１．５ｍ×２．５ｃｍ）で分離を行い、蒸留水を溶離液として、定流量ポンプで流速を約０．８ｍL／ｍｉｎに制御して、各成分を収集する。フェノール硫酸法によるチューブ飛び越し発色を行ってから、４９０ｎｍ下で吸光度を測定し、測定結果によって同じ成分を合併し、０．１－０．５Ｌまで濃縮し、凍結・乾燥して多糖類ＱＬを得る。

【0016】

高速ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）と示差屈折率分析法によって、ＱＬを検出したが、ホモ多糖類であった（図１を参照）。

【実施例2】

【0017】

葛根多糖（ＱＬ）の構造特徴化
（１）分子量の測定
ＴＳＫ－ＧＥＬ ＣＭＰＷＸＬゲルカラム（３００×７．６ｍｍ）を使用し、流動相を０．０１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＮＯ_３、流速を０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を２５℃とし、一連の分子量からなるデキストランで標準グラフを作成して、測定した結果、葛根多糖ＱＬの分子量は１０－６０ＫＤａであった。

【0018】

（２）全糖、ウロン酸、タンパク質含有量測定
フェノール硫酸法による測定結果、ＱＬの全糖含有量は９８．７％である。
ｍ－ヒドロキシジフェニル法による測定結果、ＱＬのウロン酸含有量は０．０％である。
クマシーブリリアントブルー法による測定結果、ＱＬのタンパク質含有量は０．６４％である。

【0019】

（３）糖の構成の分析
ＱＬを２．０ｍｏｌ／Ｌ ＴＦＡ中にて定温１００℃下で６ｈ加水分解し、完全加水分解によって産物を獲得し、適当量のＮａＢＨ_４を入れて還元し、無水酢酸のアセチル化によってアルジトールアセテート誘導物を製作して、ガス相構成に対する分析を行う。
ＱＬは主に単糖グルコースで構成されるホモ多糖類であり、デキストランとも呼ばれる。

【0020】

（４）メチル化分析
ＱＬに対するメチル化を行い、メチル化済み産物をギ酸で４ｈ脱重合を行ない、その後、２ｍｏｌ／Ｌ ＴＦＡで１００℃下で６ｈ加水分解し、ＮａＢＨ_４で還元し、無水酢酸のアセチル化によって、一部がメチル化されたアルジトールアセテート誘導物を製作した後、ＧＣ－ＭＳ分析を行う。

【0021】

標準グラフによって、ＱＬの結合方式は、主にα－１，３－Ｇｌｕ結合と、少量のＴｅｒｍｉｎａｌ－Ｇｌｕ末端結合からなると判断され、この結合方式は、同時にＮＭＲデータによっても実証された。

【実施例3】

【0022】

体内脂質低下実験方法
５６匹のオスＷｉｓｔａｒラットは北京チャールズリバー実験動物技術有限公司（８週、体質量２００±２０ｇ）から購入する。すべての動物はいずれも正常な飲食を与え、適性飼育を１週間行う。その後、８匹をブランク偽薬群とし、ブランク群（１）と略称し、他の４８匹は高脂質飲食（ＨＦ、８８．５％の普通マウス飼料中に、１．２％のコレステロール、０．３％のコール酸ナトリウム、１０％のラードを添加）を与え、２カ月間飼育して、高脂血症モデルを作成する。

【0023】

半月ごとに１回ラットの血漿ＴＧ、ＴＣ、ＬＤＬ－ＣおよびＨＤＬ－Ｃレベルに対するサンプリング検査を行い、２カ月後、すべてのラットをイソフルランで麻酔し、毛細管で眼窩静脈から血液サンプルを収集する。血液サンプルを遠心分離（４℃、４，０００ｒ×ｍｉｎ^－１、１５ｍｉｎ）して、血漿サンプルを獲得し、試薬キット（中国南京建生物技術有限公司から購入）で標準グラフを作成し、ステップ発色によって血漿ＴＧ、ＴＣ、ＬＤＬ－ＣおよびＨＤＬ―Ｃレベルを測定して、高脂血症モデルの作成成否を判断する。

【0024】

高脂血症モデルの作成が終わると、ランダムに５群に分ける。（２）モデル群：高コレステロール飲食、（３）高分量群：高コレステロール飲食＋高分量葛根胃内投与群（１００ｍｇ／ｋｇ）、（４）中分量群：高コレステロール飲食＋中量葛根胃内投与群（５０ｍｇ／ｋｇ）、（５）低分量群：高コレステロール飲食＋低量葛根胃内投与群（２５ｍｇ／ｋｇ）、（６）陽性薬群：高コレステロール飲食＋シンバタチン群（８ｍｇ／ｋｇ）。胃内投与半月後、実験の前に一晩禁食し、実験当日にラットの重量を量り、且つ記録し、イソフルランで麻酔した後、眼窩から血液を採って、ヘパリンナトリウム遠心管中に入れて、血液サンプルを遠心分離（４℃、４，０００ｒ×ｍｉｎ^－１、１５ｍｉｎ）することによって、血漿サンプルを獲得し、試薬キット（中国南京建生物技術有限公司から購入）で標準グラフを作成し、実験ステップによって、血漿ＴＧ、ＴＣ、ＬＤＬ－ＣおよびＨＤＬ－Ｃレベルを測定する。首を切ってラットを殺し、肝臓組織を取って重量を量り、肝臓指数＝肝臓重量（ｇ）／ラット重量の比率で肝臓指数を算出する。

【0025】

その結果、高コレステロール飲食がモデリングに成功し、モデル群の肝臓指数は明らかに上昇し、他の群に比べて有意差（Ｐ＜０．０５）があり、葛根多糖の高中低分量群中のＴＧ、ＴＣ、ＬＤＬ－Ｃはモデル群と有意差があり、ＨＤＬ－Ｃとは有意差がないが、葛根高中低分量（１００ｍｇ、５０ｍｇ、２５ｍｇ）間は明らかな分量効果関係がなかった。この結果は、葛根多糖は高脂血症ラット血漿中のＴＧ、ＴＣ、ＬＤＬ－Ｃ含有量を著しく低下させることができ、且つ葛根多糖は高脂血症ラットの肝臓指数を著しく低下させるということを表明する。そのため、葛根多糖ＱＬはラット血漿中のＴＧ、ＴＣ、ＬＤＬ－Ｃ含有量および肝臓指数を著しく低下させることができ、脂質低下薬として開発することができる。

【0026】

データ分析：今回の実験にはＳＰＳＳ１１．５バージョンを使用して分析を行い（３回繰り返す）、分散分析および群間Ｄｕｎｃａｎ多重比較法を使用する。

【0027】

表１は各処理群における高コレステロール血症ラットの総コレステロール（ＴＣ）、総トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ－Ｃ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ－Ｃ）および肝臓指数（Ｌｉｖｅｒ ｉｎｄｅｘ）の変化である。

【表1】

注：群間はＤｕｎｃａｎ多重比較（二つ二つずつ比較）を使用て比較し、異なるアルファベットの群の間には有意差があった（Ｐ＜０．０５）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】