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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-05-29
(45)【発行日】2023-06-06
(54)【発明の名称】ＳＣＮ９Ａ発現を阻害するための増強されたオリゴヌクレオチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230530BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20230530BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20230530BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230530BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230530BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230530BHJP
A61K 47/51 20170101ALI20230530BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230530BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 140Z
A61P25/04 ZNA
A61P25/02
A61P29/00
A61K31/7088
A61K48/00
A61K47/51
A61P19/02
【請求項の数】
40
(21)【出願番号】P 2021523913
(86)(22)【出願日】2020-12-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-09
(86)【国際出願番号】 EP2020086916
(87)【国際公開番号】W WO2021123086
(87)【国際公開日】2021-06-24
【審査請求日】2021-06-02
(31)【優先権主張番号】19218780.5
(32)【優先日】2019-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ピーダスン，リュケ
(72)【発明者】
【氏名】ラスムセン，セーレン・ウ
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５３１２８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／２３３９２１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１４１７２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１３８０５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０３０６６５４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２７３８５７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Pain，2018年，Vol.159, No.1，pp.139-149
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式１：
【請求項2】
式２：
【請求項3】
式３：
【請求項4】
式４：
【請求項5】
式５：
【請求項6】
式６：
【請求項7】
式７：
【請求項8】
式８：
【請求項9】
式９：
【請求項10】
式１０：
【請求項11】
式１１：
【請求項12】
式１２：
【請求項13】
式１３：
【請求項14】
式１４：
【請求項15】
式１５：
【請求項16】
式１６：
【請求項17】
式１７：
【請求項18】
式１８：
に示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩。
【請求項19】
式１９：
【請求項20】
式２０：
【請求項21】
式２１：
【請求項22】
式２２：
【請求項23】
式２３：
【請求項24】
式２４：
【請求項25】
式２５：
【請求項26】
式２６：
【請求項27】
式２７：
【請求項28】
式２８：
【請求項29】
式２９：
【請求項30】
請求項１～２９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含むコンジュゲート。
【請求項31】
請求項１～２９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項３０に記載のコンジュゲートの、薬学的に許容される塩。
【請求項32】
ナトリウム塩又はカリウム塩である、請求項３１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩。
【請求項33】
請求項１～２９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項３０に記載のコンジュゲート、又は請求項３１若しくは３２に記載の薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又は佐剤とを含む医薬組成物。
【請求項34】
ＳＣＮ９Ａを発現している標的細胞中のＳＣＮ９Ａ発現を阻害するための医薬組成物であって、有効量の請求項１～２９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項３０に記載のコンジュゲート、又は請求項３１若しくは３２に記載の薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項35】
疼痛を患っているか、又は患う可能性があるヒトなどの対象において疼痛を治療又は予防するための医薬組成物であって、前記疼痛を予防又は緩和するように、治療又は予防有効量の請求項１～２９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項３０に記載のコンジュゲート、又は請求項３１若しくは３２に記載の薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項36】
前記疼痛が、ａ．慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は
ｂ．侵害受容性疼痛、又は
ｃ．糖尿病性ニューロパチー、がん、頭蓋神経痛、帯状疱疹後神経痛及び術後神経痛からなる群から選択される障害により引き起こされるか、若しくはそれと関連付けられる疼痛、又は
ｄ．遺伝性肢端紅痛症（ＥＩＭ）若しくは発作性激痛障害（ＰＥＰＤ）若しくは三叉神経痛により引き起こされるか、若しくはそれと関連付けられる疼痛、又は
ｅ．神経障害性疼痛、慢性疼痛、そしてまた侵害受容性疼痛（例えば、神経の減圧）、若しくは神経障害性疼痛（例えば、糖尿病性ニューロパチー）、内臓疼痛、若しくは混合疼痛の一般的治療、又は
ｆ．腰痛、若しくは炎症性関節炎
のいずれかである、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項37】
薬剤において使用するための、請求項１～２９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項３０に記載のコンジュゲート、又は請求項３１若しくは３２に記載の薬学的に許容される塩。
【請求項38】
疼痛、例えば、請求項３６のパートａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ又はｆにしたがって定義されるような疼痛の治療又は予防又は緩和において使用するための、請求項１～２９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項３０に記載のコンジュゲート、又は請求項３１若しくは３２に記載の薬学的に許容される塩。
【請求項39】
疼痛、例えば、請求項３６のパートａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ又はｆにしたがって定義されるような疼痛の治療、予防又は緩和用の医薬の調製のための、請求項１～２９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項３０に記載のコンジュゲート、又は請求項３１若しくは３２に記載の薬学的に許容される塩の使用。
【請求項40】
前記疼痛が、腰痛、又は炎症性関節炎である、請求項３９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＣＮ９Ａ核酸の発現の阻害において使用するための、ヒトＳＣＮ９Ａに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に関する。ＳＣＮ９Ａは、電位依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．７をコードする。ＳＣＮ９Ａ発現の阻害は、疼痛の予防又は治療において有用である。
【背景技術】
【0002】
電位依存性ナトリウムチャネル（Ｎａｖｓ）は、興奮性組織において必須の役割を果たし、それらの活性化及び開通は、活動電位の初期相をもたらす。開通、閉鎖及び不活性化状態を通じたＮａｖｓのサイクリング、並びに他のイオンチャネルの活性とのそれらの密接に振り付けされた関係性は、細胞内イオン濃度の精巧な制御に繋がる。
【0003】
Ｎａｖ１．７は、ほぼ排他的に小細胞末梢感覚神経において発現される電圧活性化イオンチャネルである。感覚ニューロン中のＮａｖ１．７の条件付きノックアウトを有するマウスは、抗侵害受容性表現型を表し示した（Ｎａｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００４ Ａｕｇ ２４；１０１（３４）：１２７０６－１１）。ヒトの疼痛感覚におけるＮａｖ１．７の役割は、自発性疼痛症候群遺伝性肢端紅痛症（ＩＥＭ）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．２００４；４１（３）：１７１－４）及び発作性激痛障害（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００６ Ｎｏｖ；７７（１１）：１２９４－５）とこれらの患者のＮａｖ１．７における機能突然変異の獲得の関連性により実証されている（Ｃｕｍｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４；２４（３８）：８２３２－８２３６）。Ｎａｖ１．７のさらなるサポートは、疼痛に対する先天性の無感覚をもたらす機能突然変異の喪失の同定により生成された（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ＡＡＡ．２００６；７１２１：８９４－８）。これらの発見は、Ｎａｖ１．７モジュレータの同定のための多数の小分子創薬プログラムに繋がったが、高い選択性及び良好なＰＫ／ＰＤ特性を有する良好な化合物を見出すことが課題となってきたようである。
【0004】
米国特許出願公開第２０１６０２４２０８号は、Ｎａｖ１．７に対するヒト抗体を開示している。
【0005】
国際公開第０２０８３９４５号は、乳がんの治療において使用するための、ＳＣＮ５Ａ及び任意選択的にＳＣＮ９Ａの特定の領域に対するアンチセンス配列を有する合成オリゴヌクレオチドに言及している。
【0006】
米国特許出願公開第２００７／２１２６８５号は、鎮痛剤を同定する方法に言及しており、ＳＣＮ９Ａの細胞中での遺伝子発現又は遺伝子転写産物レベルをモジュレートする特定の化合物にはアンチセンス核酸が含まれることを記載している。
【0007】
米国特許出願公開第２０１０２７３８５７号は、Ｎａｖ１．７チャネルをコードするアミノ酸配列の発現を抑制するか、又は他にＮａｖ１．７チャネルの機能を阻害するｓｉＲＮＡ分子を局所的に投与することを介して疼痛を治療するために使用される方法、配列及び核酸分子に言及しており、Ｎａｖ１．７チャネルレベル及び／又は機能の局所的な抑制は、後根神経節の末梢感覚ニューロンにおいて起こることを報告している。
【0008】
国際公開第１２１６２７３２号は、ナトリウムチャネル、特に電位依存性ナトリウムチャネルをモジュレートするための新規のスクリーニングアッセイに関する。
【0009】
韓国特許出願公開第２０１１００８７４３６号は、ＳＣＮ９Ａアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。
【0010】
Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｎａｖ１．７を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示し、げっ歯動物の脊髄及び後根神経節（ＤＲＧ）におけるＡＳＯの薬力学的活性を特徴付けている（Ｐａｉｎ（２０１８）Ｖｏｌｕｍｅ １５９・Ｎｕｍｂｅｒ １，ｐ１３９ － １４９）。
【0011】
国際公開第１８０５１１７５号は、ヒトＳＣＮ９ＡプレｍＲＮＡの部分を標的化するＳＣＮ９Ａアンチセンスペプチド核酸オリゴヌクレオチドを開示する。ペプチド核酸誘導体は、細胞中でＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡのスプライスバリアントを強力に誘導し、Ｎａｖ１．７活性を伴う疼痛又は状態を治療するために有用である。
【0012】
国際公開第１９２４３４３０号は、ＳＣＮ９Ａを標的化するＬＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。
【0013】
したがって、疼痛の予防又は治療などのための、ヒトにおけるＳＣＮ９Ａなどの、電位依存性ナトリウムイオンチャネルをコードする核酸の発現の阻害において有効なアンチセンスオリゴヌクレオチド治療の必要性が存在する。
【0014】
発明の目的
本発明は、ＳＣＮ９Ａの発現を阻害することができ、鎮痛剤などの、疼痛の予防又は治療などのための薬剤において使用され得る、新規のオリゴヌクレオチドを同定する。本発明の化合物は、末梢疼痛の予防又は治療において使用され得る。
本発明は、ＳＣＮ９Ａの発現を阻害することができ、鎮痛剤などの、疼痛の予防又は治療などのための薬剤において使用され得る、新規のオリゴヌクレオチドを同定する。本発明の化合物は、末梢疼痛の予防又は治療において使用され得る。
【発明の概要】
【0015】
発明の要約
本発明は、薬剤において使用するための、ＳＣＮ９Ａ核酸に相補的であり、かつその発現を阻害することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
本発明は、薬剤において使用するための、ＳＣＮ９Ａ核酸に相補的であり、かつその発現を阻害することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0016】
本発明は、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択される、（配列番号１に示されるような）ヒトＳＣＮ９ＡプレｍＲＮＡの領域に相補的な、例えば完全に相補的な、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0017】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、１２～２４ヌクレオチド長であり、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択される、（配列番号１に示されるような）ヒトＳＣＮ９ＡプレｍＲＮＡの領域に相補的な、例えば完全に相補的な、少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【0018】
本発明は、配列番号２８～５２からなる群から選択される配列に対して１００％同一の１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド１０～３０ヌクレオチド長を提供する。
【0019】
本発明は、配列番号２８～５２からなる群から選択される配列に対して１００％同一の１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド１０～３０ヌクレオチド長を提供する。
【0020】
本発明は、配列番号２８～５２からなる群から選択される配列に対して１００％同一の１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１６連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド１０～３０ヌクレオチド長を提供する。
【0021】
本発明は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９からなる群から選択される配列に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0022】
本発明は、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、及び３９からなる群から選択される連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0023】
本発明は、配列番号２９に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６若しくは１７連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0024】
本発明は、配列番号３１に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６、１７若しくは１８連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0025】
本発明は、配列番号３３に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６、１７、１８若しくは１９連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0026】
本発明は、配列番号３９に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６、１７若しくは１８連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0027】
本発明は、配列番号４７に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６、１７若しくは１８連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0028】
本発明は、配列番号４８に対して１００％同一の連続ヌクレオチド配列、又はその少なくとも１４、１５、１６、１７若しくは１８連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0029】
本発明は、化合物番号２９＿１５、２９＿１０、２９＿２２、３９＿６、３９＿１、３９＿２、３９＿７、３１＿１、３１＿３、３１＿４、３１＿５、３３＿１、３３＿２、３３＿３、４７＿１、４８＿８、２９＿２４、２９＿２５、２９＿２６、３９＿９、３９＿１０、４８＿１０、２９＿３５、２９＿３４、３９＿１７、３９＿１８、３９＿１９、３９＿２０、及び２９＿１１からなる群から選択される化合物の連続ヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0030】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化合物番号２９＿３３、３９＿１３、４８＿９、２９＿３３、３９＿１３、４８＿９、２９＿３３、３９＿１３及び４８＿９からなる群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
【0031】
本発明は、表１に列記される群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0032】
本発明は、表３に列記される群から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0033】
本発明は、図１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿１５のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0034】
本発明は、図２のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿１０のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0035】
本発明は、図３のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿２２のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0036】
本発明は、図４のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿６のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0037】
本発明は、図５のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0038】
本発明は、図６のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿２のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0039】
本発明は、図７のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿７のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0040】
本発明は、図８のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３１＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0041】
本発明は、図９のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３１＿３のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0042】
本発明は、図１０のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３１＿４のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0043】
本発明は、図１１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３１＿５のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0044】
本発明は、図１２のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３３＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0045】
本発明は、図１３のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３３＿２のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0046】
本発明は、図１４のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３３＿３のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0047】
本発明は、図１５のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号４７＿１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0048】
本発明は、図１６のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号４８＿８のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0049】
本発明は、図１７のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿２４のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0050】
本発明は、図１８のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿２５のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0051】
本発明は、図１９のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿２６のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0052】
本発明は、図２０のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿９のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0053】
本発明は、図２１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿１０のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0054】
本発明は、図２２のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号４８＿１０のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0055】
本発明は、図２３のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿３５のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0056】
本発明は、図２４のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿３４のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0057】
本発明は、図２５のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿１７のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0058】
本発明は、図２６のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿１８のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0059】
本発明は、図２７のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿１９のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0060】
本発明は、図２８のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号３９＿２０のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0061】
本発明は、図２９のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。本発明は、化合物番号２９＿１１のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩を提供する。
【0062】
【表1-1】
【0063】
【表1-2】
【0064】
【表1-3】
【0065】
Ｈｅｌｍアノテーションの凡例：
［ＬＲ］（Ｇ）はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ｔ）はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ａ）はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（［５ｍｅＣ］はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ ５－メチルシトシンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｇ）はＤＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｔ）はＤＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ａ）はＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（［Ｃ］はＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ｇ）は２’－Ｏ－メチルＲＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ｕ）は２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡウラシルヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ａ）は２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（［Ｃ］は２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ｓＰ］はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
［ＬＲ］（Ｇ）はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ｔ）はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（Ａ）はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ＬＲ］（［５ｍｅＣ］はβ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ ５－メチルシトシンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｇ）はＤＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ｔ）はＤＮＡチミンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（Ａ）はＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｄＲ］（［Ｃ］はＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ｇ）は２’－Ｏ－メチルＲＮＡグアニンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ｕ）は２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡウラシルヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（Ａ）は２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡアデニンヌクレオシドであり、
［ｍＲ］（［Ｃ］は２’－Ｏ－メチルＲＮＡ ＤＮＡシトシンヌクレオシドであり、
［ｓＰ］はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0066】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは１つ以上のコンジュゲート基を含んでもよく、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートであってもよい。
【0067】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列からなる。
【0068】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、及び／又は佐剤を含む、医薬組成物を提供する。
【0069】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩及びアンモニウム塩からなる群から選択される。
【0070】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容される溶媒、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含む、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的溶液を提供する。
【0071】
本発明は、固体粉末化形態、例えば凍結乾燥粉末の形態の、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0072】
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含むコンジュゲートを提供する。
【0073】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明によるコンジュゲートの薬学的に許容される塩を提供する。
【0074】
本発明は、ナトリウム又はカリウム塩である、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩を提供する。
【0075】
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、並びに、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又は佐剤を含む、医薬組成物を提供する。
【0076】
本発明は、ＳＣＮ９Ａを発現している標的細胞中のＳＣＮ９Ａ発現を阻害する方法であって、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物を前記細胞に投与することを含む、方法を提供する。本発明は、インビボ方法又はインビトロ方法であり得る。
【0077】
本発明は、疼痛を患っているか又は患う可能性があるヒトなどの対象において疼痛を治療又は予防する方法であって、疼痛を予防又は緩和するように、治療又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【0078】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物は、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、又は自発性疼痛の治療において使用するためのものである。
【0079】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物は、侵害受容性疼痛の治療において使用するためのものである。
【0080】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物は、糖尿病性ニューロパチー、がん、頭蓋神経痛、帯状疱疹後神経痛及び術後神経痛からなる群から選択される障害により引き起こされるか、又はそれと関連付けられる疼痛の治療において使用するためのものである。
【0081】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物は、遺伝性肢端紅痛症（ＥＩＭ）又は発作性激痛障害（ＰＥＰＤ）又は三叉神経痛により引き起こされるか、又はそれと関連付けられる疼痛の治療において使用するためのものである。
【0082】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物は、神経障害性疼痛（ｎｅｕｒｏｐｈａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）、慢性疼痛の治療において使用するためのものであるが、侵害受容性疼痛（例えば、神経の減圧）、又は神経障害性疼痛（例えば、糖尿病性ニューロパチー）、内臓疼痛、又は混合疼痛の一般的治療においても使用するためのものである。
【0083】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の塩、又は本発明の組成物は、腰痛、又は炎症性関節炎の治療において使用するためのものである。
【0084】
本発明は、薬剤において使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は本発明のコンジュゲート、又は本発明の組成物若しくは塩を提供する。
【0085】
さらなる態様では、本発明は、ＳＣＮ９Ａを発現している標的細胞中のＳＣＮ９Ａ発現の阻害方法のための方法であって、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は組成物を前記細胞に投与することによる、方法を提供する。さらなる態様では、本発明は、ＳＣＮ９Ａを発現している標的細胞中のＳＣＮ９Ａ発現の阻害のためのインビボ又はインビトロ方法のための方法であって、有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は組成物を前記細胞に投与することによる、方法を提供する。細胞は、例えば、ヒト細胞、例えば神経細胞、例えば末梢神経細胞、又は初代神経細胞であり得る。
【0086】
さらなる態様では、本発明は、疼痛、例えば末梢疼痛からなる群から選択される疾患を治療若しくは予防するため、又はその予防のための方法であって、治療又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、疼痛、例えば末梢疼痛を患っているか、又は患い易い対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0087】
さらなる態様では、本発明は、疼痛、例えば末梢疼痛の治療又は予防用の医薬の製造において使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は医薬組成物を提供する。
【0088】
さらなる態様では、本発明は、鎮痛剤の製造において使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は医薬組成物を提供する。
【0089】
本発明は、疼痛、例えば末梢疼痛の治療において使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0090】
本発明は、鎮痛剤として使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0091】
さらなる態様では、本発明は、疼痛を治療又は予防する方法であって、治療又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、疼痛を患っているか、又は患い易い対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0092】
さらなる態様では、本発明は、末梢疼痛を治療又は予防する方法であって、治療又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、末梢疼痛を患っているか、又は患い易い対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0093】
配列表
本出願と共に提出された配列表が参照により本明細書に組み込まれる。配列表に列記されるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列モチーフはＤＮＡ配列として示される。なお、本明細書に開示される試験された化合物のいくつかにおいて、チミン塩基の代わりに（ｉｎ ｐｌａｃｅ ｏｒ）ウラシル塩基を用いて２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドが使用される。
本出願と共に提出された配列表が参照により本明細書に組み込まれる。配列表に列記されるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列モチーフはＤＮＡ配列として示される。なお、本明細書に開示される試験された化合物のいくつかにおいて、チミン塩基の代わりに（ｉｎ ｐｌａｃｅ ｏｒ）ウラシル塩基を用いて２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドが使用される。
【図面の簡単な説明】
【0094】
【図1】化合物番号 ２９＿１５
【図2】化合物番号 ２９＿１０
【図3】化合物番号 ２９＿２２
【図4】化合物番号 ３９＿６
【図5】化合物番号 ３９＿１
【図6】化合物番号 ３９＿２
【図7】化合物番号 ３９＿７
【図8】化合物番号 ３１＿１
【図9】化合物番号 ３１＿３
【図10】化合物番号 ３１＿４
【図11】化合物番号 ３１＿５
【図12】化合物番号 ３３＿１
【図13】化合物番号 ３３＿２
【図14】化合物番号 ３３＿３
【図15】化合物番号 ４７＿１
【図16】化合物番号 ４８＿８
【図17】化合物番号 ２９＿２４
【図18】化合物番号 ２９＿２５
【図19】化合物番号 ２９＿２６
【図20】化合物番号 ３９＿９
【図21】化合物番号 ３９＿１０
【図22】化合物番号 ４８＿１０
【図23】化合物番号 ２９＿３５
【図24】化合物番号 ２９＿３４
【図25】化合物番号 ３９＿１７
【図26】化合物番号 ３９＿１８
【図27】化合物番号 ３９＿１９
【図28】化合物番号 ３９＿２０
【図29】化合物番号 ２９＿１１
【図30】低フラッシング体積対高フラッシング体積。チャートは、１６ｍｇの化合物の投薬後の高（左）及び低（右）フラッシング体積の関数としての曝露を示す。各ＤＲＧデータ点は、１匹のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｕｓ）から２つのＤＲＧをプールしたものからであった（Ｎ＝３）。全てのデータ点は、化合物番号３１＿１の単回の１６ｍｇの用量の１４日後に屠殺されたカニクイザルからのものであった。
【図31】投薬後の日数の関数としての後根神経節の曝露。各データ点は、カニクイザルから２つのＤＲＧをプールしたものからであった（Ｎ＝３）。全てのデータは、低フラッシング体積群かつ１６ｍｇの化合物番号３１＿１の単回用量からのものであった。
【発明を実施するための形態】
【0095】
定義
オリゴヌクレオチド
用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
オリゴヌクレオチド
用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、それが当業者により、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
【0096】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）又は相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）又は相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
【0097】
いくつかの実施形態では、本発明の単鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡヌクレオシドを含有しなくてもよい。
【0098】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどの１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。さらに、修飾されていないヌクレオシドがＤＮＡヌクレオシドであることは有利である。
【0099】
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」とは、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、任意には、更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基（例えば、コンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、連続ヌクレオチド配列を構成である。
用語「連続ヌクレオチド配列」とは、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ－Ｇ－Ｆ’ギャップマー領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、任意には、更なるヌクレオチド（複数可）、例えば、官能基（例えば、コンジュゲート基）を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、連続ヌクレオチド配列を構成である。
【0100】
ヌクレオチド及びヌクレオシド
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分及び１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドに存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。
【0101】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上は、修飾糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」はまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」と本明細書では互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、等価なＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドのうちの１つ以上は、修飾糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」はまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」と本明細書では互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合が可能であれば、依然として一般にＤＮＡ又はＲＮＡと称される。
【0102】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合又は１以上のホスホロジチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、１以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合又は１以上のホスホロジチオエートのヌクレオシド間結合のような、１以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
【0103】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド又はそのヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部は、ホスホロチオエートである。
【0104】
いくつかの有利な実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートであるか、又はオリゴヌクレオチドの全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【0105】
欧州特許第２７４２１３５号に開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエート以外の）、例えばアルキルホスホネート／メチルホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよいことが認識され、これは欧州特許第２７４２１３５号によれば、例えば別のＤＮＡホスホロチオエートのギャップ領域内で耐性であり得る。
【0106】
核酸塩基
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンと、天然に存在しない変異体との両方を指す。そのような変異体は、例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンと、天然に存在しない変異体との両方を指す。そのような変異体は、例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１に記載されている。
【0107】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、及び２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【0108】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵにより示され、ここで、各文字は、等価な機能の修飾核酸塩基を場合により含み得る。例えば、例示のオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ及び５－メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【0109】
修飾オリゴヌクレオチド
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。
【0110】
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋの塩基対合の能力を記述する。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５－メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾及び修飾核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋの塩基対合の能力を記述する。Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）－シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）－チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５－メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾及び修飾核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ４５ ｐａｇｅ ２０５５及びＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｕｐｐｌ．３７ １．４．１を参照されたい）。
【0111】
用語「％相補的」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、標的配列又は配列モチーフ）に相補的である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセント）を指す。したがって、相補性のパーセンテージは、２つの配列間（標的配列５’－３’と３’－５’からのオリゴヌクレオチド配列とを整列させた場合）で相補的である（ワトソン・クリック塩基対から）整列した核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算において許容されない。相補性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【0112】
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
【0113】
同一性
用語「同一性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
用語「同一性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、２つの配列（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性のパーセンテージ＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５－メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【0114】
ハイブリダイゼーション
用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」とは、本明細書で使用される場合、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって記述される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ及びＬａｃｒｏｉｘ（２００３年）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」第１３巻第５１５～５３７頁）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、又は－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」とは、本明細書で使用される場合、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）によって記述される。生理学的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ及びＬａｃｒｏｉｘ（２００３年）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」第１３巻第５１５～５３７頁）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝－ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ．３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載されているように、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：１４６０－１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｍｏｄｅｌ）を用いることにより数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば－１５ｋｃａｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ未満、及び例えば－２５ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ、例えば－１２～－４０、例えば－１５～－３０ｋｃａｌ、又は－１６～－２７ｋｃａｌ、例えば－１８～－２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
【0115】
標的
「標的」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトナトリウム電位依存性チャネルアルファサブユニット９（ＳＣＮ９Ａ）、及び配列番号１として本明細書に示されるような、ヒトＳＣＮ９Ａをコードする核酸を指すために使用される。ナトリウムチャネルのアルファサブユニットをコードするＳＣＮ９Ａ核酸は、Ｎａｖ１．７と呼ばれる。
「標的」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトナトリウム電位依存性チャネルアルファサブユニット９（ＳＣＮ９Ａ）、及び配列番号１として本明細書に示されるような、ヒトＳＣＮ９Ａをコードする核酸を指すために使用される。ナトリウムチャネルのアルファサブユニットをコードするＳＣＮ９Ａ核酸は、Ｎａｖ１．７と呼ばれる。
【0116】
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、ヒトＳＣＮ９Ａをコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＳＣＮ９Ａ標的核酸と称され得る。インビトロ及びインビボでの使用のための好ましい標的核酸は、ＳＣＮ９ＡをコードするプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡである。本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
本発明によれば、標的核酸は、ヒトＳＣＮ９Ａをコードする核酸であり、例えば遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る。したがって、標的は、ＳＣＮ９Ａ標的核酸と称され得る。インビトロ及びインビボでの使用のための好ましい標的核酸は、ＳＣＮ９ＡをコードするプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡである。本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
【0117】
好ましい標的遺伝子は、ヒトＳＣＮ９Ａ、例えばヒトＳＣＮ９ＡプレｍＲＮＡである（表２に提供され、配列番号１として本明細書に示されるような遺伝子座表を参照。
【0118】
【表2】
【0119】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、配列番号１の転写産物バリアント、すなわち、ヒト染色体座位（座標は表２において同定される）からコードされるＳＣＮ９Ａ遺伝子から転写される転写産物である。
【0120】
標的配列
用語「標的配列」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表すことができる。
用語「標的配列」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表すことができる。
【0121】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択される標的配列に相補的、例えば完全に相補的である。
【0122】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的且つハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
【0123】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的である標的配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基配列を含む。連続ヌクレオチド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、例えば１２～３０、例えば１４～２０、例えば１５～１８連続ヌクレオチド長、例えば１５、１６、１７連続ヌクレオチド長である。
【0124】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全長にわたり標的配列に完全に相補的である。
【0125】
標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはヒト細胞である。
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはヒト細胞である。
【0126】
典型的には、標的細胞は、ＳＣＮ９ＡプレｍＲＮＡ又はＳＣＮ９Ａ成熟ｍＲＮＡなどのＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡを発現する。実験的評価のために、標的配列を含む核酸を発現する標的細胞が使用され得る。
【0127】
ＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化では無視される。
【0128】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、例えばインビボ又はインビトロのいずれかにおいて、ＳＣＮ９Ａ標的核酸を発現する細胞（標的細胞）中のＳＣＮ９Ａ標的核酸の発現を阻害することができる。
【0129】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、場合によりアンチセンスオリゴヌクレオチドをコンジュゲートなどの任意の官能基に結合し得るヌクレオチドベースのリンカー領域、又は他の非相補的末端ヌクレオチド（例えば、領域Ｄ’又はＤ’’）を除いて、ＳＣＮ９Ａ標的核酸、例えば配列番号１に相補的、例えば完全に相補的である。標的核酸は、例えば、ＳＣＮ９ＡをコードするメッセンジャーＲＮＡ、例えば成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡであり得る。
【0130】
天然に存在する変異体
用語「天然に存在する変異体」は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＳＣＮ９Ａ遺伝子又は転写産物の変異体、及び対立遺伝子変異体を指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在する変異体を標的とし得る。
用語「天然に存在する変異体」は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在に起因して異なり得るＳＣＮ９Ａ遺伝子又は転写産物の変異体、及び対立遺伝子変異体を指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在する変異体を標的とし得る。
【0131】
いくつかの実施形態では、天然に存在する変異体は、哺乳動物ＳＣＮ９Ａ標的核酸、例えば配列番号１からなる群から選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％相同性を有する。いくつかの実施形態では、天然に存在する変異体は、配列番号１のヒトＳＣＮ９Ａ標的核酸に対して少なくとも９９％相同性を有する。
【0132】
発現の阻害
「発現の阻害」という用語は、本明細書で使用される場合、標的細胞中のＳＣＮ９Ａの量又は活性を阻害するオリゴヌクレオチドの能力についての全体的な用語として理解される。活性の阻害は、ＳＣＮ９ＡプレｍＲＮＡ若しくはＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡのレベルを測定することにより、又は細胞中のＳＣＮ９Ａ若しくはＳＣＮ９Ａ活性のレベルを測定することにより決定され得る。発現の阻害は、したがって、インビトロ又はインビボで決定され得る。ＳＣＮ９Ａ発現の阻害はまた、Ｎａｖ１．７の活性又はタンパク質レベルを測定することにより決定され得る。
「発現の阻害」という用語は、本明細書で使用される場合、標的細胞中のＳＣＮ９Ａの量又は活性を阻害するオリゴヌクレオチドの能力についての全体的な用語として理解される。活性の阻害は、ＳＣＮ９ＡプレｍＲＮＡ若しくはＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡのレベルを測定することにより、又は細胞中のＳＣＮ９Ａ若しくはＳＣＮ９Ａ活性のレベルを測定することにより決定され得る。発現の阻害は、したがって、インビトロ又はインビボで決定され得る。ＳＣＮ９Ａ発現の阻害はまた、Ｎａｖ１．７の活性又はタンパク質レベルを測定することにより決定され得る。
【0133】
典型的には、発現の阻害は、標的細胞への有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に起因する活性の阻害を比較し、そのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与なし（対照実験）で標的細胞から得られた参照レベル、又は既知の参照レベル（例えば、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前の発現レベル、若しくは予め決定する（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）若しくは他に既知の発現レベル）に対して比較することにより決定される。
【0134】
例えば、対照実験は、生理食塩水組成物又は参照オリゴヌクレオチド（多くの場合、スクランブル化対照）を用いて処理された動物若しくはヒト、又は標的細胞であり得る。
【0135】
阻害又は阻害するという用語はまた、ＳＣＮ９Ａの発現を下方調節し、低減し、抑制し、減少させ、低下させることとして言及され得る。
【0136】
発現の阻害は、例えば、（例えば、ＲＮａｓｅＨ動員性オリゴヌクレオチド、例えばギャップマーを使用する）プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡの分解により行われ得る。
【0137】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野にて既知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５～＋１２℃、より好ましくは＋１．５～＋１０℃、最も好ましくは＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野にて既知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）。
【0138】
糖修飾
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【0139】
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドのある特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。
【0140】
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）若しくは二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２及びＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、又は非結合リボース環（典型的には、Ｃ２及びＣ３炭素の間の結合を欠く（例えば、ＵＮＡ））で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）の場合には、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、又はモルホリノ核酸も含まれる。
【0141】
糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドに天然に存在する２’－ＯＨ基に変更することによる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’又は５’位で導入され得る。
【0142】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは－ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）である。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ若しくは－ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、又は２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’－４’バイラジカル架橋）である。
【0143】
実際、２’糖置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、数多くの２’置換ヌクレオシドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、向上された結合親和性、及び／又は増大されたヌクレアーゼ耐性をアンチセンスオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７を参照。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。
【化1】
【0144】
本発明に関して、２’置換糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡのような２’架橋ヌクレオシドを含まない。
【0145】
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これはアンチセンスオリゴヌクレオチド／相補的二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するバイラジカル（「２’－４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースの立体配座の固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上（二重鎖安定化）に関連している。これはアンチセンスオリゴヌクレオチド／相補的二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
【0146】
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、及びＭｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、及びＷａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７に開示されている。
【0147】
さらなる非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、スキーム１に開示されている。
スキーム１：
スキーム１：
【化2】
【0148】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－β－Ｄ－オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。特定の有利なＬＮＡは、β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡである。
【0149】
ＨＥＬＭアノテーション付きの例示的なヌクレオシド
ＤＮＡヌクレオシド
ＤＮＡヌクレオシド
【化3】
【0150】
β－Ｄ－オキシ－ＬＮＡヌクレオシド
【化4】
【0151】
２’－Ｏ－メチルヌクレオシド
【化5】
【0152】
ＨＥＬＭアノテーション付きの例示的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合
【化6】
【0153】
点線は、各ヌクレオシド及び５’又は３’ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の間の共有結合を表す。５’末端ヌクレオシドにおいて、５’の点線は、水素原子への結合（５’末端－ＯＨ基を形成する）を表す。３’末端ヌクレオシドにおいて、３’の点線は、水素原子への結合（３’末端－ＯＨ基を形成する）を表す。
【0154】
ＲＮａｓｅ Ｈ活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／Ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、そして国際公開第ＷＯ０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮＡＳＥＨ１）から入手できる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ Ｈを動員するその能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を決定するために使用され得る、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、ｐｍｏｌ／Ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、そして国際公開第ＷＯ０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１～９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％又は２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができると見なされる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性の決定での使用について、組換えヒトＲＮａｓｅ Ｈ１は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ（登録商標）（大腸菌で発現したＨｉｓタグと融合した組換えヒトＲＮＡＳＥＨ１）から入手できる。
【0155】
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド又はギャップマー設計とも称され得る。ギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマーは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’－フランク、ギャップ及び３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’－＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、ギャップマーがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）とが隣接する。領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するギャップマーの親和性を増強する（すなわち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド又はギャップマー設計とも称され得る。ギャップマーは、通常、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマーは、少なくとも３つの区別される構造領域、５’－フランク、ギャップ及び３’－フランク、Ｆ－Ｇ－Ｆ’を５’－＞３’配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、ギャップマーがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）と、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）とが隣接する。領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するギャップマーの親和性を増強する（すなわち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の１つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ及び２’－ＭＯＥから独立して選択される、例えば高親和性２’糖修飾である。
【0156】
ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も５’及び３’のヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、各々、５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置されている。フランクは更に、ギャップ領域から最も遠い端、すなわち５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを有することによって定義してもよい。
【0157】
領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ－Ｇ－Ｆ’のギャップマー領域を含んでもよい。
【0158】
ギャップマー設計Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、例えば１２～３２ヌクレオシド、例えば１３～２４、例えば１４～２２ヌクレオシド、例えば１４～１７、例えば１６～１８ヌクレオシドであってもよい。
【0159】
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’１－８、例えば
Ｆ１－８－Ｇ７－１６－Ｆ’２－８
ただし、ギャップマー領域 Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’１－８、例えば
Ｆ１－８－Ｇ７－１６－Ｆ’２－８
ただし、ギャップマー領域 Ｆ－Ｇ－Ｆ’の全長は、少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチド長であることを条件とする。
【0160】
本発明の一態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなるか又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１～８個のヌクレオシドを含むか又はそれらからなり、そのうち１～４個が２’糖修飾され、Ｆ及びＦ’領域の５’及び３’末端を規定し、ＧがＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる６～１６個のヌクレオシドの領域である。
【0161】
領域Ｆ、Ｇ及びＦ’は、さらに以下に定義され、Ｆ－Ｇ－Ｆ’式に組み込まれることができる。
【0162】
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方のいずれかが、ＬＮＡヌクレオシドを含み、又はそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方のいずれかが、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含み、又はそれからなるギャップマーである。
ＬＮＡギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方のいずれかが、ＬＮＡヌクレオシドを含み、又はそれからなるギャップマーである。β－Ｄ－オキシギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方のいずれかが、β－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドを含み、又はそれからなるギャップマーである。
【0163】
いくつかの実施形態では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］１－５－［領域Ｇ］－［ＬＮＡ］１－５であり、ここで、領域Ｇは、ＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる連続ＤＮＡヌクレオシドの領域であるか、又はそれを含む。
【0164】
ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］１－８－［領域Ｇ］ ５－１６－［ＭＯＥ］１－８、例えば［ＭＯＥ］２－７－［領域Ｇ］６－１４－［ＭＯＥ］２－７、例えば［ＭＯＥ］３－６－［領域Ｇ］８－１２－［ＭＯＥ］３－６のものであり、ここで、領域Ｇはギャップマーの定義に規定した通りである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
ＭＯＥギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、ＭＯＥギャップマーは、設計［ＭＯＥ］１－８－［領域Ｇ］ ５－１６－［ＭＯＥ］１－８、例えば［ＭＯＥ］２－７－［領域Ｇ］６－１４－［ＭＯＥ］２－７、例えば［ＭＯＥ］３－６－［領域Ｇ］８－１２－［ＭＯＥ］３－６のものであり、ここで、領域Ｇはギャップマーの定義に規定した通りである。５－１０－５設計（ＭＯＥ－ＤＮＡ－ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
【0165】
混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含み、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含み、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。
混合ウイングギャップマーは、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’－フルオロ－ＡＮＡ単位から独立して選択される２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含み、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方が、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含み、領域Ｆ及びＦ’の残りのヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域Ｆ及びＦ’の一方又は両方が、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドをさらに含んでもよい。
【0166】
交互フランクギャップマー
隣接領域は、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含み得、それらがＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。「交互フランクギャップマー」はそれ故、ＬＮＡギャップマーオリコヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方（Ｆ又はＦ’）が、ＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
隣接領域は、ＬＮＡ及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含み得、それらがＬＮＡ－ＤＮＡ－ＬＮＡヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。「交互フランクギャップマー」はそれ故、ＬＮＡギャップマーオリコヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方（Ｆ又はＦ’）が、ＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｆ若しくはＦ’の少なくとも一方、又は領域Ｆ及びＦ’の両方は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’の両方は、少なくとも３つのヌクレオシドを含み、Ｆ及び／又はＦ’領域の最も５’及び３’のヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。
【0167】
アンチセンスオリゴヌクレオチドにおける領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’、並びに更に５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか又はそれからなり得る。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、又は完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書で領域Ｄ’及びＤ”と称され得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域Ｆ－Ｇ－Ｆ’、並びに更に５’及び／又は３’ヌクレオシドを含むか又はそれからなり得る。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、又は完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書で領域Ｄ’及びＤ”と称され得る。
【0168】
領域Ｄ’又はＤ”の追加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーをコンジュゲート部分又は他の官能基に連結することを目的として用いられ得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結するのに使用される場合、生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る。或いは、それはエキソヌクレオアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏａｓｅ）保護を提供するために、又は合成若しくは製造を容易にするために使用され得る。
【0169】
領域Ｄ’及びＤ’’は、各々、領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に結合されて、以下の式Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’又はＤ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’の設計を生成し得る。この場合、Ｆ－Ｇ－Ｆ’はアンチセンスオリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’はアンチセンスオリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
【0170】
領域Ｄ’又はＤ”は、独立して、１、２、３、４又は５個の追加のヌクレオチドを含み、又はそれからなり、標的核酸に相補的であっても、又は相補的でなくてもよい。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの塩基修飾バージョンである。Ｄ’及びＤ”領域は、ヌクレアーゼ感受性の生体切断可能なリンカーとしての役割を果たし得る（リンカーの定義を参照されたい）。いくつかの実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で連結され、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’及びＤ”としての使用に好適なヌクレオチドベースの生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生体切断可能なリンカーの使用は国際公開第ＷＯ２０１５／１１３９２２号に開示されており、それらは複数のアンチセンス構築物（例えば、ギャップマー領域）を単一のアンチセンスオリゴヌクレオチド内で結合するのに使用されている。
【0171】
一実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。
【0172】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’１－３－Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８－Ｄ’’１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’１－３－Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８－Ｄ’’１－３。
Ｆ－Ｇ－Ｆ’；特にＦ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’、特にＤ’１－３－Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８
Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＦ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８－Ｄ’’１－３
Ｄ’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－Ｄ’’、特にＤ’１－３－Ｆ１－８－Ｇ５－１６－Ｆ’２－８－Ｄ’’１－３。
【0173】
いくつかの実施形態では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
【0174】
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）。コンジュゲート部分は、場合により領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）。コンジュゲート部分は、場合により領域Ｄ’又はＤ’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
【0175】
アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート及びそれらの合成は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ編、第１６章、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（２００１年）及びＭａｎｏｈａｒａｎ、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（２００２年）第１２巻第１０３頁による包括的レビューにおいても報告されている。
【0176】
いくつかの実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）、又はそれらの組合せからなる群より選択される。
【0177】
リンカー
リンケージ又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、対象の化学基又はセグメントを別の対象の化学基又はセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接、又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、例えばコンジュゲート部分などの第３の領域（領域Ｃ）を、例えば標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列などの第１の領域（領域Ａ）に共有結合的に接続するのに役立つ。
リンケージ又はリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、対象の化学基又はセグメントを別の対象の化学基又はセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接、又は連結部分（例えば、リンカー又はテザー）を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、例えばコンジュゲート部分などの第３の領域（領域Ｃ）を、例えば標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列などの第１の領域（領域Ａ）に共有結合的に接続するのに役立つ。
【0178】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲート又はアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合により、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）とを含み得る。
【0179】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含み、又はそれからなる生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化若しくは還元条件又は薬剤などの化学条件、及び哺乳動物細胞で見られる又は遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは１～５個のヌクレオシド、例えば、少なくとも２つの連続ホスホジエステル結合を含むＤＮＡヌクレオシドを含む。ホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第ＷＯ２０１４／０７６１９５号により詳細に記載されている。
【0180】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）をアンチセンスオリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造又はオリゴマーを含み得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の局所要素Ａ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｃ、Ａ－Ｂ－Ｙ－Ｃ、Ａ－Ｙ－Ｂ－Ｃ又はＡ－Ｙ－Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６～Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２～Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。いくつかの実施形態では、リンカーはＮＡである。
【0181】
治療
用語「治療」とは、本明細書で使用される場合、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の治療、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
用語「治療」とは、本明細書で使用される場合、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患又は障害）の治療、又は疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【0182】
発明の詳細な説明
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＣＮ９Ａを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＣＮ９Ａを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0183】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の発現を阻害又はダウンレギュレートすることにより調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞への０．０３１μＭ、０．１μＭ、及び０．４μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用後に、インビトロで少なくとも６０％又は７０％だけＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡの発現レベルを阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞への０．０３１μＭ、０．１μＭ、及び０．４μＭのオリゴヌクレオチドの適用後に、インビトロで少なくとも５０％だけＳＣＮ９Ａタンパク質の発現レベルを阻害することができる。好適には、実施例は、ＳＣＮ９Ａ ＲＮＡ又はタンパク質阻害を測定するために用いられ得るアッセイを提供する（例えば、実施例１及び実施例３を参照）。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１μＭ以下、より好ましくは０．５μＭ以下の半数最大有効濃度（ＥＣ５０）で細胞中の標的ＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを阻害することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞へのオリゴヌクレオチドの適用後に、０．３μＭ以下、例えば０．２０μＭ以下、例えば０．１５μＭ以下、例えば０．１０μＭ以下、例えば０．０８μＭ以下、例えば０．０７μＭ以下、例えば０．０６、０．０５、０．０４又は０．０３μＭ以下のＥＣ５０でＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡ（又はタンパク質）の発現レベルを阻害できるものであり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞において、０．０３μＭ～０．１５μＭの範囲内、例えば０．０５～０．１０μＭの範囲内、例えば約０．０７μＭのＥＣ５０でＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡの発現レベルを阻害できるものであり得る。好適には、これは、実施例３で提供されるアッセイにおいて評価され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の発現を阻害又はダウンレギュレートすることにより調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞への０．０３１μＭ、０．１μＭ、及び０．４μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用後に、インビトロで少なくとも６０％又は７０％だけＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡの発現レベルを阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞への０．０３１μＭ、０．１μＭ、及び０．４μＭのオリゴヌクレオチドの適用後に、インビトロで少なくとも５０％だけＳＣＮ９Ａタンパク質の発現レベルを阻害することができる。好適には、実施例は、ＳＣＮ９Ａ ＲＮＡ又はタンパク質阻害を測定するために用いられ得るアッセイを提供する（例えば、実施例１及び実施例３を参照）。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１μＭ以下、より好ましくは０．５μＭ以下の半数最大有効濃度（ＥＣ５０）で細胞中の標的ＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを阻害することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞へのオリゴヌクレオチドの適用後に、０．３μＭ以下、例えば０．２０μＭ以下、例えば０．１５μＭ以下、例えば０．１０μＭ以下、例えば０．０８μＭ以下、例えば０．０７μＭ以下、例えば０．０６、０．０５、０．０４又は０．０３μＭ以下のＥＣ５０でＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡ（又はタンパク質）の発現レベルを阻害できるものであり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞において、０．０３μＭ～０．１５μＭの範囲内、例えば０．０５～０．１０μＭの範囲内、例えば約０．０７μＭのＥＣ５０でＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡの発現レベルを阻害できるものであり得る。好適には、これは、実施例３で提供されるアッセイにおいて評価され得る。
【0184】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、標的核酸、例えば、ＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡに対する高い選択性により特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列を含む核酸を発現する標的細胞中で、例えば、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞中でのそのＥＣ５０の約５０倍に対応する濃度において標的細胞に適用された場合に、少数又は０個のオフターゲット核酸、例えば、２０個以下、例えば１５個以下、例えば１２個以下、例えば１０個以下、例えば、８、７、６、５、４、３、２若しくは１個以下のオフターゲット遺伝子、又は０個のオフターゲット遺伝子の発現を低減し得る。「オフターゲット遺伝子」は、ＳＣＮ９Ａの遺伝子でも遺伝子転写産物、例えば、ｍＲＮＡでもないが、その発現がアンチセンスオリゴヌクレオチドにより低減される任意の遺伝子又は遺伝子転写産物を含むことが理解されるべきである。好ましくは、約３μＭの濃度においてヒトニューロン細胞、例えば、ｈｕｍａｎ ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎ（表１０を参照）に適用された場合に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５個以下、例えば３個以下、例えば１個以下のオフターゲット遺伝子、例えば０個のオフターゲット遺伝子の発現を低減し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの選択性を評価するための好適なアッセイは、実施例４に提供される。いくつかの実施形態では、オフターゲット遺伝子は、実施例４のアッセイにおいて試験された場合に、対照条件に対して調整ｐ値＜０．０５で低減した発現を有するとして、任意選択的にはまた、結合親和性予測に基づいて予測されるオフターゲット遺伝子の上位１％に入ること、又は１つのミスマッチを有する対応するスプライシングされていない転写産物に結合できることとして定義され得る。
【0185】
標的調節は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸との間のハイブリダイゼーションによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間のミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＳＣＮ９Ａ発現の所望の調節を示すのに尚十分であり得る。ミスマッチから生じる結合親和性の低下は、アンチセンスオリゴヌクレオチド内のヌクレオチド数の増加、及び／又は、標的への結合親和性を増加させることができる修飾ヌクレオシドの数、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド配列内に存在する、ＬＮＡを含む２’糖修飾ヌクレオシドの数の増加により有利に補償され得る。
【0186】
本発明の一態様は、ＳＣＮ９ＡプレｍＲＮＡ、例えば配列番号１、又はそれに由来する転写産物バリアントに対して少なくとも９０％の相補性を有する１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【0187】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長の連続配列を含み、これは、標的核酸又は標的配列の領域と、少なくとも９０％相補的、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的である。
【0188】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００％相補的）である場合、又はいくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に１つ又は２つのミスマッチを含み得る場合に有利である。
【0189】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される（ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ）配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して少なくとも９０％相補的な、例えば完全に（又は１００％）相補的な１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0190】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な１４～２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0191】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な１５ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0192】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な１６ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0193】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な１７ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0194】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な１８ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0195】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な１９ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0196】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な２０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0197】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な２１ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0198】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド９７７０４～９７７３２、１０３２３２～１０３２５９、１５１８３１～１５１８４７、及び１５１９４９～１５２００６から選択されるものからなる群から選択される配列番号１に存在する標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な２２ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む。
【0199】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７からなる群から選択される標的核酸の領域に対して少なくとも９０％相補的な、例えば少なくとも９５％相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【0200】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、及び２７からなる群から選択される標的核酸の領域に対して完全に（又は１００％）相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。
【0201】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の領域、例えば本明細書に記載される標的配列に相補的又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド配列を含む。
【0202】
治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的又はハイブリダイズする標的核酸配列は、一般に、少なくとも１０ヌクレオチドの連続核酸塩基のストレッチを含む。連続ヌクレオチド配列は、１２～７０ヌクレオチド、例えば１２～５０、例えば１３～３０、例えば１４～２５、例えば１４～２０連続ヌクレオチドである。
【0203】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、例えば１２～２５、例えば１１～２２、例えば１２～２０、例えば１４～１８又は１４～１６連続ヌクレオチド長を含み、又はそれからなる。
【0204】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、２２以下のヌクレオチド、例えば２０以下のヌクレオチド、例えば１８以下のヌクレオチド、例えば１４、１５、１６又は１７ヌクレオチドを含み、又はそれからなる。本明細書で提供されるいずれの範囲も、範囲の終点を含むことを理解するべきである。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが１０～３０ヌクレオチドを含むと記される場合、１０ヌクレオチド及び３０ヌクレオチドの両方が含まれる。
【0205】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０連続ヌクレオチド長を含み、又はそれからなる。
【0206】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、配列番号２８～５２から選択される配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２連続ヌクレオチド長を含むか、又はそれからなる。
【0207】
有利な実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の糖修飾ヌクレオシド、例えば１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシド、例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’－フルオロ－ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される１つ以上の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。修飾ヌクレオシドの１つ以上がロックド核酸（ＬＮＡ）である場合、有利である。
【0208】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシドを含む。
【0209】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。
【0210】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドを含む。
【0211】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドを含み、かつ連続ヌクレオチド結合の各ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0212】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、ＬＮＡヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシド及び２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドを含み、かつ連続ヌクレオチド結合の各ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0213】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシドを含む。
【0214】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。
【0215】
有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列の最も３’のヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシドである。
【0216】
有利には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合、例えばホスホロチオエート又はホスホロジチオエートを含む。
【0217】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0218】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホロジチオエートヌクレオシド間結合である。
【0219】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列中の少なくとも１つのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合である。
【0220】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0221】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列内の少なくとも７５％のヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0222】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列内の全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【0223】
本発明の有利な実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈ１などのＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーである。
【0224】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、式５’－Ｆ－Ｇ－Ｆ’－３’のギャップマーからなる、又はこれを含む。
【0225】
いくつかの実施形態では、領域Ｇは６～１６個のＤＮＡヌクレオシドからなる。
【0226】
いくつかの実施形態では、領域Ｆ及びＦ’はそれぞれ、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。
【0227】
【表3-1】
【0228】
【表3-2】
【0229】
【表3-3】
【0230】
【表3-4】
【0231】
【表3-5】
【0232】
【表3-6】
【0233】
【表3-7】
【0234】
【表3-8】
【0235】
【表3-9】
【0236】
【表3-10】
【0237】
【表3-11】
【0238】
【表3-12】
【0239】
【表3-13】
ここで、下線を引いていない大文字はβ－Ｄ－オキシＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、全ＬＮＡ Ｃは５－メチルシトシンであり、全ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、下線を引いた大文字は２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオシドである。
【0240】
薬学的に許容される塩
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容される塩、例えば、薬学的に許容されるナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容される塩、例えば、薬学的に許容されるナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。
【0241】
製造方法
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ２８７－３１３を参照のこと）。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は結合アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又は佐剤と混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１５４，ｐａｇｅｓ ２８７－３１３を参照のこと）。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は結合アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、及び／又は佐剤と混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
【0242】
医薬組成物
さらなる態様では、本発明は、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又は佐剤とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水又は滅菌炭酸ナトリウム緩衝液である。
さらなる態様では、本発明は、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又は佐剤とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水又は滅菌炭酸ナトリウム緩衝液である。
【0243】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される希釈剤中の溶液、例えば、ＰＢＳ又は炭酸ナトリウム緩衝液中に溶解した溶液の形態である。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその薬学的に許容される塩は、粉末、例えば凍結乾燥粉末などの固体形態である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、溶液中に予め製剤化されていてもよく、又はいくつかの実施形態では、投与の前に薬学的に許容される希釈剤に溶解され得る乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【0244】
好適には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、０．１～１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１～１０ｍｇ／の濃度で薬学的に許容される希釈剤に溶解され得る。
【0245】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、０．５～１００ｍｇ、例えば１ｍｇ～５０ｍｇ、又は２～２５ｍｇの単位用量で製剤化される。
【0246】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５０～３００μＭの濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。
【0247】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容される活性又は不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の調製のための組成物及び方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含む多くの基準に依存する。
【0248】
溶液などの医薬組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、又は滅菌してフィルタにかけられ得る。得られた溶液は、そのまま使用するために包装するか、又は凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３～１１、より好ましくは５～９又は６～８、最も好ましくは７～８、例えば７～７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤又は薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。
【0249】
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分はアンチセンスオリゴヌクレオチドから切断される。
【0250】
用途
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防のための研究試薬として利用され得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防のための研究試薬として利用され得る。
【0251】
研究では、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、細胞（例えば、インビトロ細胞培養物）及び実験動物におけるＮａｖ１．７又はいくつかの態様ではＮａｖ１．８タンパク質の合成を特異的に調節し、それによって標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価を促進することができる。典型的には、標的調節は、タンパク質を生成するｍＲＮＡを分解又は阻害し、それによりタンパク質形成を防止することによって、又はタンパク質を生成する遺伝子若しくはｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することによって達成される。
【0252】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ又は合成核酸であり得る。
【0253】
本発明は、ＳＣＮ９Ａを発現している標的細胞におけるＳＣＮ９Ａ発現を調節するためのインビボ又はインビトロ方法を提供し、前記方法は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に有効量で投与することを含む。
【0254】
いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するインビトロ細胞培養物又はインビボ細胞であってよい。好ましい実施形態では、標的細胞は、末梢神経系、例えば後根神経節に存在する。
【0255】
診断では、オリゴヌクレオチドを使用して、ノーザンブロッティング、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又は同様の技術により、細胞及び組織におけるＳＣＮ９Ａ発現を検出及び定量することができる。
【0256】
治療応用
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、塩若しくは医薬組成物は、疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は侵害受容性疼痛の予防又は治療のために動物又はヒトに投与され得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、塩若しくは医薬組成物は、局所鎮痛剤として使用するためのものであり得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、塩若しくは医薬組成物は、疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は侵害受容性疼痛の予防又は治療のために動物又はヒトに投与され得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、塩若しくは医薬組成物は、局所鎮痛剤として使用するためのものであり得る。
【0257】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、塩若しくは医薬組成物を用いて治療され得る疼痛は、末梢神経系における疼痛信号であり得る。顕著な末梢成分を伴う疼痛と関連付けられる適応症としては、例えば、糖尿病性ニューロパチー、がん、頭蓋神経痛、帯状疱疹後神経痛及び術後神経痛が挙げられる。
【0258】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、医薬組成物又は塩を使用して予防、治療又は寛解され得る疼痛は、例えば、遺伝性肢端紅痛症（ＥＩＭ）、発作性激痛障害（ＰＥＰＤ）、三叉神経痛、神経障害性疼痛、慢性疼痛、そしてまた侵害受容性（例えば、神経の減圧）、神経障害性疼痛（例えば、糖尿病性ニューロパチー）、内臓疼痛、又は混合疼痛の一般的治療と関連付けられる疼痛からなる群から選択され得る。
【0259】
本発明は、疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は侵害受容性疼痛の予防用又は治療用に使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、組成物又は塩を提供する。
【0260】
本発明はさらに、疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は侵害受容性疼痛の治療又は予防用の医薬の製造のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物の使用に関する。
【0261】
本発明は、局所鎮痛剤として使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、医薬組成物又は塩を提供する。
【0262】
本発明は、局所鎮痛剤の製造のための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、医薬組成物又は塩の使用を提供する。
【0263】
本発明は、遺伝性肢端紅痛症（ＥＩＭ）、発作性激痛障害（ＰＥＰＤ）、三叉神経痛、神経障害性疼痛、慢性疼痛、そしてまた侵害受容性（例えば、神経の減圧）、神経障害性疼痛（例えば、糖尿病性ニューロパチー）、内臓疼痛、又は混合疼痛の一般的治療と関連付けられる疼痛の予防又は治療のために使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、医薬組成物又は塩を提供する。
【0264】
本発明はさらに、遺伝性肢端紅痛症（ＥＩＭ）、発作性激痛障害（ＰＥＰＤ）、三叉神経痛、神経障害性疼痛、慢性疼痛、そしてまた侵害受容性（例えば、神経の減圧）、神経障害性疼痛（例えば、糖尿病性ニューロパチー）、内臓疼痛、又は混合疼痛の一般的治療と関連付けられる疼痛の予防又は治療用の医薬の製造ための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物の使用 に関する。
【0265】
治療方法
本発明は、疼痛を患っているか、又は患う可能性があるヒトなどの対象において疼痛を治療又は予防する方法であって、治療又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を、疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は侵害受容性疼痛を患っているか、又は患い易い対象に投与することを含む、方法を提供する。
本発明は、疼痛を患っているか、又は患う可能性があるヒトなどの対象において疼痛を治療又は予防する方法であって、治療又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を、疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は侵害受容性疼痛を患っているか、又は患い易い対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0266】
例として、治療方法は、糖尿病性ニューロパチー、がん、頭蓋神経痛、帯状疱疹後神経痛及び術後神経痛からなる群から選択される適応症を患っている対象におけるものであり得る。
【0267】
本発明の方法は、疼痛、例えば、遺伝性肢端紅痛症（ＥＩＭ）、発作性激痛障害（ＰＥＰＤ）、三叉神経痛、神経障害性疼痛、慢性疼痛、そしてまた侵害受容性（例えば、神経の減圧）、神経障害性疼痛（例えば、糖尿病性ニューロパチー）、内臓疼痛、又は混合疼痛の一般的治療と関連付けられる疼痛を治療及び緩和するためのものであり得る。
【0268】
本発明の方法は、好ましくは、Ｎａｖ１．７により媒介される疼痛に対する治療又は予防のために用いられる。
【0269】
投与
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、非経口投与を介して投与され得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、非経口投与を介して投与され得る。
【0270】
いくつかの実施形態では、投与経路は皮下又は静脈内である。
【0271】
いくつかの実施形態では、投与経路は、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、硬膜外、脳室内 眼内、髄腔内投与、及び経椎間孔（ｔｒａｎｓｆｏｒａｍｉｎａｌ）投与からなる群から選択される。
【0272】
いくつかの有利な実施形態では、投与は、髄腔内投与、又は硬膜外投与又は経椎間孔投与を介して為される。
【0273】
有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、髄腔内に投与され得る。
【0274】
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である疼痛の予防又は治療用の医薬の製造のための、本発明の薬学的塩又は組成物などの、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
【0275】
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である疼痛の予防又は治療用の医薬の製造のための医薬の製造のための、記載されるような本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
【0276】
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である疼痛の予防又は治療用の医薬として使用するための、本発明の薬学的塩又は組成物などの、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。
【0277】
本発明はまた、髄腔内投与用の剤形である疼痛の予防又は治療用の医薬として使用するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを提供する。
【0278】
併用療法
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療剤との併用治療で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、本発明の化合物又は組成物の投与と並行して又は独立して投与され得る小分子鎮痛剤と組み合わせて使用される。小分子鎮痛剤との本発明の化合物の併用療法の利点は、小分子鎮痛剤は、典型的には短い作用持続期間（数時間～数日）と共に、疼痛緩和活性の迅速な開始を有する一方、本発明の化合物は、活性の遅延した開始（典型的には数日又は１週より遅いことさえある）を有するが、長い作用持続期間（数週～数か月、例えば、２か月より長い、３か月より長い又は４か月より長い）を有することである。
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療剤との併用治療で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、本発明の化合物又は組成物の投与と並行して又は独立して投与され得る小分子鎮痛剤と組み合わせて使用される。小分子鎮痛剤との本発明の化合物の併用療法の利点は、小分子鎮痛剤は、典型的には短い作用持続期間（数時間～数日）と共に、疼痛緩和活性の迅速な開始を有する一方、本発明の化合物は、活性の遅延した開始（典型的には数日又は１週より遅いことさえある）を有するが、長い作用持続期間（数週～数か月、例えば、２か月より長い、３か月より長い又は４か月より長い）を有することである。
【実施例】
【0279】
実施例１：単一の濃度におけるＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞系中のＳＣＮ９Ａを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ有効性の試験
ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞は、供給業者により推奨されるように加湿インキュベーター中で維持していた。販売者及び推奨される培養条件を表４に報告する。
ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞は、供給業者により推奨されるように加湿インキュベーター中で維持していた。販売者及び推奨される培養条件を表４に報告する。
【0280】
【表4】
【0281】
アッセイのために、細胞を９６マルチウェルプレート中の培養培地に播種し、表４に報告したようにインキュベートした後に、５μＬの体積のＰＢＳに溶解したアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度を以下の表６に与える。
【0282】
細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の７２時間後に回収した（表４を参照）。製造者の説明書にしたがってＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡを抽出し、５０μＬの水に溶出させた。ＲＮＡをその後にＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１０倍に希釈し、９０℃に１分間加熱した。
【0283】
遺伝子発現解析のために、二重の設定においてｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用してＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲのために使用したプライマーアッセイを標的及び内因性対照の両方について表５に整理している。
【0284】
【表5】
【0285】
【表6-1】
【0286】
【表6-2】
【0287】
【表6-3】
【0288】
【表6-4】
【0289】
【表6-5】
【0290】
【表6-6】
【0291】
【表6-7】
【0292】
【表6-8】
【0293】
【表6-9】
【0294】
【表6-10】
【0295】
【表6-11】
【0296】
【表6-12】
【0297】
【表6-13】
【0298】
実施例２：実施例１の選択された化合物に対するカスパーゼ解析
マウス３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ中で培養し、ＨｅｐＧ２細胞をＭＥＭ中で培養した。全ての培地に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清を添加した。細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。トランスフェクションの１日前に、トランスフェクションの時点に６０％～７０％の細胞密集度をもたらす密度において９６ウェルプレート中の抗生物質を含まない１００μＬの増殖培地に細胞をプレーティングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を９６ウェルプレート中でのトランスフェクションのために使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２５μＬの総体積まで要求される濃度に希釈し、２５μＬのトランスフェクションコンプレックス（０．２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００及び２４．７５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標））と混合した。２０分のインキュベーション後、５０μＬの抗生物質フリー培地を溶液に加え、混合した。ウェルから培地を除去した後、１００μＬのアンチセンスオリゴヌクレオチド：トランスフェクション剤溶液を細胞に加え、２４時間インキュベートした（ＬＮＡ－ＡＳＯトランスフェクション）。全てのトランスフェクションは３連で行った。ＶＩＣＴＯＲ３（商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で製造者の説明書にしたがってＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してオリゴヌクレオチドトランスフェクションの２４時間後にカスパーゼ－３／７の活性を決定した。カスパーゼ解析の結果を表７に示す。
マウス３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ中で培養し、ＨｅｐＧ２細胞をＭＥＭ中で培養した。全ての培地に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清を添加した。細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で培養した。トランスフェクションの１日前に、トランスフェクションの時点に６０％～７０％の細胞密集度をもたらす密度において９６ウェルプレート中の抗生物質を含まない１００μＬの増殖培地に細胞をプレーティングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を９６ウェルプレート中でのトランスフェクションのために使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２５μＬの総体積まで要求される濃度に希釈し、２５μＬのトランスフェクションコンプレックス（０．２５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００及び２４．７５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標））と混合した。２０分のインキュベーション後、５０μＬの抗生物質フリー培地を溶液に加え、混合した。ウェルから培地を除去した後、１００μＬのアンチセンスオリゴヌクレオチド：トランスフェクション剤溶液を細胞に加え、２４時間インキュベートした（ＬＮＡ－ＡＳＯトランスフェクション）。全てのトランスフェクションは３連で行った。ＶＩＣＴＯＲ３（商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で製造者の説明書にしたがってＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してオリゴヌクレオチドトランスフェクションの２４時間後にカスパーゼ－３／７の活性を決定した。カスパーゼ解析の結果を表７に示す。
【0299】
実施例３：濃度応答アッセイにおけるＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞系中のＳＣＮ９Ａを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ効力の試験
ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞は、供給業者により推奨されるように加湿インキュベーター中で維持した。販売者及び推奨される培養条件を実施例１の表４に報告する。
ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞は、供給業者により推奨されるように加湿インキュベーター中で維持した。販売者及び推奨される培養条件を実施例１の表４に報告する。
【0300】
アッセイのために、細胞を９６マルチウェルプレート中の培養培地に播種し、表４に報告したようにインキュベートした後に、５μＬの体積のＰＢＳに溶解したアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えた。濃度応答実験のために、表９のオリゴヌクレオチドを、３１．６μＭ～０．００１μＭにわたる細胞増殖培地中の最終濃度まで１０ステップの３．１６倍（１／２ｌｏｇ）希釈で希釈した。これにより、ＰＢＳ対照を用いる１６ウェルを残して９６ウェルプレートで８つの化合物の試験が可能となった。
【0301】
細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加の７２時間後に回収した（表４を参照）。製造者の説明書にしたがってＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｒｏ ９６ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡを抽出し、５０μＬの水に溶出させた。ＲＮＡをその後にＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１０倍に希釈し、９０℃に１分間加熱した。
【0302】
遺伝子発現解析のために、二重の設定においてｑＳｃｒｉｐｔ（商標）ＸＬＴ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲ ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ ＲＯＸ（商標）（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用してＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲのために使用したプライマーアッセイを標的及び内因性対照の両方について表８に整理している。
【0303】
【表8】
【0304】
ＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡの量を各ｑＰＣＲプレートにおいて含まれる標準曲線に基づいて算出した。標準曲線用のインプットＲＮＡは、（上記のように）同じ細胞プレート上のＰＢＳ処理ウェルからのＲＮＡであった。同じウェルにおける内因性対照遺伝子アッセイランについて算出された量（ＧＵＳＢ）に対して量を正規化した。相対標的量＝ＱＵＡＮＴＩＴＹ＿標的遺伝子（ＳＣＮ９Ａ）／ＱＵＡＮＩＴＹ＿内因性対照遺伝子（ＧＵＳＢ）。
【0305】
同じプレート上の全てのＰＢＳ処理ウェルのメジアンで除算することにより、各ウェルについてＲＮＡノックダウンを算出した。正規化標的量＝（相対標的量／［平均］相対標的量］＿ｐｂｓ＿ｗｅｌｌｓ）＊１００。
【0306】
表９におけるＥＣ５０値を生成するために、４パラメーターシグモイド用量応答モデルを使用して、ＳＣＮ９Ａの正規化標的量からの曲線のフィッティングを行った。
【0307】
【表9】
【0308】
実施例４：化合物の選択性及び潜在的なオフターゲットプロファイルの試験
選択された化合物（３１＿１、３９＿９、及び２９＿２５）を、意図したＳＣＮ９Ａ標的以外の標的に影響する傾向について試験した。
選択された化合物（３１＿１、３９＿９、及び２９＿２５）を、意図したＳＣＮ９Ａ標的以外の標的に影響する傾向について試験した。
【0309】
以下の材料を使用した：
・ Ｈｕｍａｎ ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧＮＣ－３０１－０３０－００１、Ｌｏｔ ＃１０１４４２（Ｒ１０３４）
・ ＲｈＬａｍｉｎｉｎ－５２１、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ ＃ＬＮ５２１、１００μｇ／ｍＬ
・ Ｂｒａｉｎｐｈｙｓ Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃０５７９０
・ ｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ ＃Ｍ１０２９
・ ｉＣｅｌｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＃Ｍ１０３１
・ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００ｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１７５０２－０４８
・ ２４ウェル培養プレート、Ｃｏｓｔａｒ ＃３５２４
・ Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍマウス肉腫基底膜からのラミニン、Ｓｉｇｍａ ＃Ｌ２０２０、１ｍｇ／ｍＬ
・ 処理化合物：３１＿１，３９＿９及び２９＿２５、ＰＢＳ中の５ｍＭストック、＋４°Ｃ
・ Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含む１０ｘ ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ ＃１４０６５－０４９
・ ＲＬＴ ｐｌｕｓ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｑｉａｇｅｎ ＃１０５３３９３＋１％ ｂ－ｍＥｔＯＨ、Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７５２２
・ Ｈｕｍａｎ ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧＮＣ－３０１－０３０－００１、Ｌｏｔ ＃１０１４４２（Ｒ１０３４）
・ ＲｈＬａｍｉｎｉｎ－５２１、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ ＃ＬＮ５２１、１００μｇ／ｍＬ
・ Ｂｒａｉｎｐｈｙｓ Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃０５７９０
・ ｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ ＃Ｍ１０２９
・ ｉＣｅｌｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＃Ｍ１０３１
・ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００ｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１７５０２－０４８
・ ２４ウェル培養プレート、Ｃｏｓｔａｒ ＃３５２４
・ Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍマウス肉腫基底膜からのラミニン、Ｓｉｇｍａ ＃Ｌ２０２０、１ｍｇ／ｍＬ
・ 処理化合物：３１＿１，３９＿９及び２９＿２５、ＰＢＳ中の５ｍＭストック、＋４°Ｃ
・ Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含む１０ｘ ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ ＃１４０６５－０４９
・ ＲＬＴ ｐｌｕｓ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｑｉａｇｅｎ ＃１０５３３９３＋１％ ｂ－ｍＥｔＯＨ、Ｓｉｇｍａ ＃Ｍ７５２２
【0310】
製造者のプロトコール（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にしたがってｈｕｍａｎ ｉＣｅｌｌ ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎの凍結細胞懸濁液を解凍することによりヒトｉＰＳＣ由来皮質グルタミン酸作動性ニューロン（ｈＧＮ）を調製した。新たに解凍した細胞を増殖培地（９６ｍＬのＢｒａｉｎＰｈｙｓ Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ；２ｍＬのｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ；１ｍＬのｉＣｅｌｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；１ｍＬのＮ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１００ｘ）に再懸濁し、２４ウェルプレートに３７５，０００細胞／ウェルの播種密度まで播種した。１０μｇ／ｍＬのＬａｍｉｎｉｎ－５２１と共に４００μＬ／ウェルの１ｘＨＢＳＳを各ウェルに加えることにより２４ウェルプレートをラミニンで新たにコーティングし、３７℃で４時間インキュベートした。細胞培養条件を表１０に要約する。培養の第１週について、５０％パーセントの培地を毎日交換した。第１週の後に化合物の添加の開始（１４日目）まで、５０％の培地を２日毎に交換した。
【0311】
【表10】
【0312】
１４日の細胞培養後に、試験化合物（３１＿１、３９＿９及び２９＿２５）を最終濃度３μＭ及び３０μＭまで細胞増殖培地に直接的に加えた。これらの濃度は、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞中でのＳＣＮ９ａについてのそれらのＥＣ５０値の５０及び５００倍に概ね対応する。７２ｈのインキュベーション後に、培地を除去し、細胞を６００μＬ／ウェルの１％のｂ－ｍＥｔｏＨ／ＲＬＴ緩衝液に溶解した後、トータルＲＮＡの単離まで－８０℃で貯蔵した。
【0313】
ＲＮＡシークエンシング解析：
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｉＰＳＣ由来グルタミン酸作動性ニューロンからトータルＲＮＡを単離し、製造者の説明書にしたがってＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してさらに処理してシークエンシングライブラリーとした。ライブラリーをＮｏｖａＳｅｑ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシークエンシングした（２×５０ｂｐ）。遺伝子発現レベルを推定するために、ショートリードアライナーＧＳＮＡＰの使用によりペアードエンドＲＮＡＳｅｑリードをヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。ＳＡＭｔｏｏｌｓバージョン１．５及び特製の自社製ツールを適用することにより、遺伝子の全てのＲｅｆＳｅｑ転写産物バリアントについてのマッピングされたリードを合わせて遺伝子当たりの単一の値のリード数とした。その後に、ｒｐｋｍ（マッピングされたリードの数／転写産物キロ塩基／１００万のシークエンシングされたリード）として表される、Ｍｏｒｔａｚａｖｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８ Ｊｕｌ；５（７）：６２１－８）によるシークエンシングライブラリーサイズ及び遺伝子長によりリード数を正規化した。負の二項回帰モデルを導出して、共変量の包含に伴う潜在的な混乱因子について補正した。差次的遺伝子発現解析についての目的のコントラストは、ビヒクルに対する２つの異なる濃度（３μＭ及び３０μＭ）における各ＬＮＡであった。各条件は４つの複製を有した。ＤＥＳｅｑ２パッケージ（Ｌｏｖｅ ＭＩ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４；１５：５５０ ｅｔ ｓｅｑ．）を使用してＲにおいて実行した。
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｉＰＳＣ由来グルタミン酸作動性ニューロンからトータルＲＮＡを単離し、製造者の説明書にしたがってＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してさらに処理してシークエンシングライブラリーとした。ライブラリーをＮｏｖａＳｅｑ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシークエンシングした（２×５０ｂｐ）。遺伝子発現レベルを推定するために、ショートリードアライナーＧＳＮＡＰの使用によりペアードエンドＲＮＡＳｅｑリードをヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。ＳＡＭｔｏｏｌｓバージョン１．５及び特製の自社製ツールを適用することにより、遺伝子の全てのＲｅｆＳｅｑ転写産物バリアントについてのマッピングされたリードを合わせて遺伝子当たりの単一の値のリード数とした。その後に、ｒｐｋｍ（マッピングされたリードの数／転写産物キロ塩基／１００万のシークエンシングされたリード）として表される、Ｍｏｒｔａｚａｖｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８ Ｊｕｌ；５（７）：６２１－８）によるシークエンシングライブラリーサイズ及び遺伝子長によりリード数を正規化した。負の二項回帰モデルを導出して、共変量の包含に伴う潜在的な混乱因子について補正した。差次的遺伝子発現解析についての目的のコントラストは、ビヒクルに対する２つの異なる濃度（３μＭ及び３０μＭ）における各ＬＮＡであった。各条件は４つの複製を有した。ＤＥＳｅｑ２パッケージ（Ｌｏｖｅ ＭＩ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４；１５：５５０ ｅｔ ｓｅｑ．）を使用してＲにおいて実行した。
【0314】
２つの解析を実行した。第１の解析では、０．０５の調整（ａｄｊ．）ｐ値／ＦＤＲ閾値と共に対照と比較した場合に発現における変化を示す全ての遺伝子を調べた。第２の解析は、オフターゲット候補遺伝子に集中し、該遺伝子は、下方調節（ｌｏｇＦＣ＜０かつ調整ｐ値＜０．０５として定義される）され、かつ（ｉ）結合親和性予測に基づいて予測されるオフターゲット遺伝子の上位１％に入るか、又は（ｉｉ）対応するスプライシングされていない転写産物と１つのミスマッチを有するものとして定義した。
【0315】
表１１は、両方の解析からの全体的な結果を要約する一方、表１２及び表１３は、それぞれ第１及び第２の解析からの結果に関するより詳細を示す。データは、化合物３１＿１及び３９＿９はＳＣＮ９Ａノックダウンに非常に選択的であることを示した。３ｕＭにおいて、化合物３１＿１は０個の候補オフターゲット遺伝子を有した。
【0316】
【表11】
【0317】
【表12】
【0318】
【表13-1】
【0319】
【表13-2】
【0320】
【表13-3】
【0321】
実施例５：化合物３１＿１のインビボ試験
この研究の目標は、忍容性を評価すること、及び高フラッシング対低フラッシング体積（髄腔内用量注射後）を比較して、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の後根神経節（ＤＲＧ）への化合物３１＿１の送達を最適化することの他に、いくつかの時点でのＤＲＧにおける薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）リードアウトを得ることであった。用量レベルは、「適応性」（すなわち、新たな発見に基づいて投薬を変動させ、用量を調整した）に保った。投与の経路は、それは予期されるヒト治療用経路かつＤＲＧへの該化合物の最良の送達を提供し得る経路であることから選んだ。
この研究の目標は、忍容性を評価すること、及び高フラッシング対低フラッシング体積（髄腔内用量注射後）を比較して、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の後根神経節（ＤＲＧ）への化合物３１＿１の送達を最適化することの他に、いくつかの時点でのＤＲＧにおける薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）リードアウトを得ることであった。用量レベルは、「適応性」（すなわち、新たな発見に基づいて投薬を変動させ、用量を調整した）に保った。投与の経路は、それは予期されるヒト治療用経路かつＤＲＧへの該化合物の最良の送達を提供し得る経路であることから選んだ。
【0322】
アプローチ
可能な場合には既存の社会群及び層化された体重に基づいて、研究動物を各群に３匹の研究動物を含む群１～６とそれぞれ表される６つの群に割り当てた。
可能な場合には既存の社会群及び層化された体重に基づいて、研究動物を各群に３匹の研究動物を含む群１～６とそれぞれ表される６つの群に割り当てた。
【0323】
動物に化合物３１＿１の１．０ｍＬの溶液の髄腔内ボーラス注射により投薬を行い、続いて０．５ｍＬ／ｋｇ体重（群１及び２）又は０．１ｍＬ／ｋｇ（群３～６）の人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）フラッシュを行った。詳細について、表１４を参照。投与の前に、少なくとも０．５ｍＬのＣＳＦ（実行可能なおおよその用量体積まで）を収集し、ＣＳＦ解析のために使用した。
【0324】
群１及び５：投薬相の４３日目に最終屠殺。群２、３及び４：投薬相の１５日目に最終屠殺。グループ６：投薬相の６４日目に最終屠殺。
【0325】
組織収集
屠殺時に、脊髄領域の各レベル（腰部、胸部、頸部）において各側（左、右）から２対のＤＲＧを収集し、全てのＤＲＧ試料の正確な重量を記録した。脊髄からは、２つの試料（最大５０ｍｇ、正確な重量を記録する）を腰部、胸部及び頸部区画から解剖した。脳からは、４つの試料（最大５０ｍｇ、正確な重量を記録した）を以下の脳領域：前頭皮質、後頭皮質、小脳、海馬のそれぞれから解剖した。適切に標識された２．０ｍＬのＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイゼーションチューブに全ての試料を入れ、液体窒素中でスナップ冷却し、さらなる分析まで－７０℃又はより低い温度で貯蔵した。
屠殺時に、脊髄領域の各レベル（腰部、胸部、頸部）において各側（左、右）から２対のＤＲＧを収集し、全てのＤＲＧ試料の正確な重量を記録した。脊髄からは、２つの試料（最大５０ｍｇ、正確な重量を記録する）を腰部、胸部及び頸部区画から解剖した。脳からは、４つの試料（最大５０ｍｇ、正確な重量を記録した）を以下の脳領域：前頭皮質、後頭皮質、小脳、海馬のそれぞれから解剖した。適切に標識された２．０ｍＬのＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイゼーションチューブに全ての試料を入れ、液体窒素中でスナップ冷却し、さらなる分析まで－７０℃又はより低い温度で貯蔵した。
【0326】
試料を生化学分析のためにホモジナイズした。全ての組織はＰｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ中で凍結されたものとして受け取り、８００μｌの氷冷したＣｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＡＲＩＳ Ｋｉｔ、カタログ＃ ＡＭ１９２１、Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各チューブに加えた。試料をＰｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー（組織種に依存したプログラム）でホモジナイズした。例えば、ＲＮＡ単離及びｈＥＬＩＳＡによる曝露分析のために、ホモジネートをアリコートに分割した。
【0327】
ｈＥＬＩＳＡによる曝露分析
材料及び方法
試薬及び材料を表１５に示す。ホモジネートを室温（ＲＴ）にし、希釈プレートに加える前にボルテックスした。ｈＥＬＩＳＡ用の参照標準として、非投薬試料からのホモジネートプールに化合物３１＿１をスパイクした。スパイクイン濃度は、試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）含有量に近くなるように調製した（通常、約１０倍以内）。
材料及び方法
試薬及び材料を表１５に示す。ホモジネートを室温（ＲＴ）にし、希釈プレートに加える前にボルテックスした。ｈＥＬＩＳＡ用の参照標準として、非投薬試料からのホモジネートプールに化合物３１＿１をスパイクした。スパイクイン濃度は、試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）含有量に近くなるように調製した（通常、約１０倍以内）。
【0328】
試料を５×ＳＳＣＴ緩衝液に希釈した。希釈係数は、ＣＳＦ早期時点について５倍（低濃度血漿）から１０，０００倍の希釈の範囲に及んだ。組織試料を少なくとも１０倍に希釈した。試料マトリックス及び希釈係数にマッチする適切な標準をあらゆるプレートにおいて実行した。試料及び標準を所望のセットアップにおいて希釈プレートに加え、希釈系列を作製した。３００μＬの試料／標準＋捕捉検出溶液を第１のウェルに加え、１５０μＬの捕捉検出溶液を残りのウェルに加えた。１５０μＬの液体を逐次的に移すことにより標準及び試料の２倍希釈系列を作製した（６ステップ）。希釈された試料をＲＴで３０分間希釈プレート上でインキュベートした。
【0329】
【表15】
【0330】
【表16】
【0331】
次に、１００μＬの液体を希釈プレートからストレプトアビジンプレートに移した。プレートを穏やかな撹拌（プレートシェーカー）と共にＲＴで１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬの２ｘＳＳＣＴ緩衝液を用いて３回洗浄した。各ウェルに、ＰＢＳＴ中で１：４０００に希釈した１００μＬの抗ＤＩＧ－ＡＰ（同日に作製）を加え、穏やかな撹拌の下ＲＴで１時間インキュベートした。
【0332】
ウェルを次に吸引し、３００μＬの２ｘＳＳＣＴ緩衝液を用いて３回洗浄した。最後に、１００μＬの新たに調製した基質（ＡＰ）溶液を各ウェルに加えた。
【0333】
穏やかな撹拌を伴う３０分のインキュベーションの後に、色反応の強度を６１５ｎｍで分光光度的に測定した。未加工データをリーダー（Ｇｅｎ５ ２．０ソフトウェア）からエクセル形式にエクスポートし、エクセルでさらに解析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア及びロジスティック４ＰＬ回帰モデルを使用して標準曲線を生成した。データ点を技術的複製の平均値として報告した。
【0334】
結果
高フラッシング体積及び低フラッシング体積の両方は、腰部、頸部及び胸部領域の全てでカニクイザルＤＲＧにおいて化合物３１＿１の高い曝露を生成したことをデータは示した（図３０）。さらに、右側及び左側ＤＲＧで曝露は有意に異ならなかった。低フラッシング体積は、全ての分析した脳領域（前頭皮質、小脳、及び海馬）においてはるかにより低い曝露をもたらした一方、高フラッシング体積は全ての脳領域において高い曝露をもたらした（図３０）。
高フラッシング体積及び低フラッシング体積の両方は、腰部、頸部及び胸部領域の全てでカニクイザルＤＲＧにおいて化合物３１＿１の高い曝露を生成したことをデータは示した（図３０）。さらに、右側及び左側ＤＲＧで曝露は有意に異ならなかった。低フラッシング体積は、全ての分析した脳領域（前頭皮質、小脳、及び海馬）においてはるかにより低い曝露をもたらした一方、高フラッシング体積は全ての脳領域において高い曝露をもたらした（図３０）。
【0335】
最も高い曝露の測定は、投薬後１４日の時点において達成され、Ｃｍａｘは腰部ＤＲＧにおいて１０００ｎＭを超えた（図３１）。
【0336】
ＲＮＡシークエンシングによる発現解析
製造者のプロトコールにしたがってＰＡＲＩＳ Ｋｉｔ（カタログ＃ ＡＭ１９２１、Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して組織ホモジネートからＲＮＡを単離した。
製造者のプロトコールにしたがってＰＡＲＩＳ Ｋｉｔ（カタログ＃ ＡＭ１９２１、Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して組織ホモジネートからＲＮＡを単離した。
【0337】
リボソーム枯渇プロトコールを使用してシークエンシングを行い、２０００万のペアードエンド（ＰＥ）リード（２×１０１ｂｐ）を得る。ショートリード（リード＜５０ヌクレオチド）及びＱ３０より低い品質の除去を含む品質評価後にデータ解析を行う。ＰＥリードをカニクイザルゲノム（参照配列Ｍａｃａｃａ＿ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ＿５．０（ｍａｃＦａｓ５）；ＵＣＳＣゲノムブラウザからダウンロード可能）にマッピングし、ソフトウェアＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈバージョン２０を使用して遺伝子発現解析を行う。
【0338】
生理食塩水処置動物におけるＳＣＮ９Ａの発現と発現が相関する遺伝子のセットが先行研究において見出されている。この遺伝子のセットは「ＨＫ遺伝子」と表され、各ＨＫ遺伝子の発現及びＳＣＮ９Ａの発現の間のピアソン相関は０．９５より高い。生理食塩水処置動物におけるＨＫ遺伝子の幾何平均を算出し、ＧＭＨＫにより表す。各試料において、ＧＭＨＫを使用して、以下の式（式Ｉ）（Ｘ生理食塩水は生理食塩水処置動物におけるＳＣＮ９Ａの発現である）によりＳＣＮ９Ａの発現（Ｘ）を正規化する。
【数1】
【0339】
腰部ＤＲＧにおける高い曝露の測定及び化合物の効力を考慮すれば、標的の効率的な阻害を予期することができる。
【0340】
【表7-1】
【0341】
【表7-2】
【0342】
【表7-3】
【0343】
【表14】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】