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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-06-01
(45)【発行日】2023-06-09
(54)【発明の名称】腫瘍性疾患を治療する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230602BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230602BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230602BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230602BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230602BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230602BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230602BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230602BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20230602BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230602BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230602BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
A61K45/00
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K35/17
A61P35/04
A61K39/00 Z
A61K35/15
A61K48/00
C12N15/12 ZNA
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020502511
(86)(22)【出願日】2018-03-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-04-23
(86)【国際出願番号】 US2018024764
(87)【国際公開番号】W WO2018183447
(87)【国際公開日】2018-10-04
【審査請求日】2021-03-26
(31)【優先権主張番号】62/477,754
(32)【優先日】2017-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/516,401
(32)【優先日】2017-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】519349562
【氏名又は名称】ツェンラン・チュー
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100188374
【弁理士】
【氏名又は名称】一宮 維幸
(72)【発明者】
【氏名】ツェンラン・チュー
【審査官】伊藤 良子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１８３５５３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Cancer Research, 1990, Vol.50, No.23, pp.7450-7456
【文献】Cancer Gene Therapy, 1995, Vol.2, No.2, pp.113-124
【文献】Modern Pathology, 2008, Vol.21, No.11, pp.1403-1412
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００－００－３５／７６８
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片をコードする外因性核酸配列を含む修飾腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）であって、該Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片を発現する、前記修飾ＴＡＭ。
【請求項2】
該対象または別の対象のマクロファージまたは単球に外因性核酸を導入することにより生成される、請求項１に記載の修飾ＴＡＭ。
【請求項3】
外因性核酸が、ｍＲＮＡ分子である、請求項１に記載の修飾ＴＡＭ。
【請求項4】
ｍＲＮＡ分子が、化学的に修飾されたｍＲＮＡ分子である、請求項３に記載の修飾ＴＡＭ。
【請求項5】
修飾ＴＡＭが、Ｍ１表現型を示す、請求項１に記載の修飾ＴＡＭ。
【請求項6】
外因性核酸配列が、ヘテロなまたは内因性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の修飾ＴＡＭ。
【請求項7】
プロモーターが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、請求項６に記載の修飾ＴＡＭ。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の修飾ＴＡＭを含む、対象におけるがんの治療剤。
【請求項9】
修飾ＴＡＭが、該対象にとって自家性またはヘテロである、請求項８に記載の剤。
【請求項10】
対象に免疫モジュレーターと投与するための、請求項８または９に記載の剤。
【請求項11】
免疫モジュレーターが、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはネオアンチゲンに対する抗体からなる群から選択される、請求項１０に記載の剤。
【請求項12】
ネオアンチゲンが、ＣＫ２０である、請求項１１に記載の剤。
【請求項13】
該対象が、対照と比較して、腫瘍関連マクロファージにおけるより低レベルのＨｏｍ－１発現が検出されている、請求項８から１２のいずれか一項に記載の剤。
【請求項14】
がんが、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、メラノーマ、グリオーマ、膠芽腫、褐色細胞腫、肝がん、卵巣がん、皮膚がん、睾丸がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、脳腫瘍、食道がん、膀胱がん、副腎皮質がん、肺がん、気管支がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、鼻咽頭がん、子宮頸がん、肝臓がん、転移性がん、および原発性部位不明のがんからなる群から選択される、請求項８に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４７７，７５４号および２０１７年６月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５１６，４０１号の優先権を主張するものである。両方の先行出願の内容は、本明細書でその内容全体が参照により組み込まれる。
本出願は、２０１７年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４７７，７５４号および２０１７年６月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５１６，４０１号の優先権を主張するものである。両方の先行出願の内容は、本明細書でその内容全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
マクロファージは自然免疫と適応免疫の両方の実行者であり、腫瘍とその微小環境の重要な構成要素として認識されている。広範な調査は、ほぼすべての腫瘍の増殖、浸潤、転移における腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の役割を示唆した。血中単球に由来するＴＡＭは、選択された腫瘍の初期段階におけるＭ１様表現型から、最も進行した腫瘍におけるＭ２様表現型に至るまでの、広範なスペクトルの表現型を示す。腫瘍形成の促進におけるその役割と一致して、Ｍ２様ＴＡＭは、ＩＬ－１０、ＩＬ４、ＭＭＰ、ＶＥＧＦの発現の上昇と、殺腫瘍性活性に関与する炎症誘発性サイトカインおよび細胞毒性ｉＮＯおよびＲＯＩの発現の減少を伴う特徴的な表現型を示す。ＴＡＭは、腫瘍形成の促進における本来の機能の他に、腫瘍微小環境においてＴ細胞応答とバランスを交互に繰り返すことにより、抗腫瘍免疫の抑制にも寄与する。ＴＡＭの機能的柔軟性は十分に認識された。腫瘍促進性Ｍ２様ＴＡＭを抗腫瘍Ｍ１様表現型に変換することにより、ＴＡＭが抗腫瘍療法の魅力的な標的として機能する可能性があることが提案されている。過去数年にわたって、複数の細胞外因性および内因性因子が、ＴＡＭを殺腫瘍細胞に変換するそれらの潜在的な機能について探索されてきた。しかし、ＴＡＭの柔軟性が細胞内因性因子によってどのように制御されているかが十分に理解されていないため、腫瘍治療におけるＴＡＭの標的化の有効性と潜在的な応用は制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、がん免疫療法のための標的として幅広く研究されてきた。これらの抗原を標的とすることにより、オフターゲット毒性を最小限に抑えながら、有効性を高めることができる。他方では、これらの抗原に対する抗体は、多くの場合それ自体では効果的ではない。
【課題を解決するための手段】
【0004】
概要
一態様では、がんを治療する方法が本明細書で提供される。該方法は、Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片をコードする外因性核酸配列を含む修飾マクロファージまたは単球を提供するステップ、ここで修飾マクロファージまたは単球は該Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはその断片を発現する、および、該修飾マクロファージまたは単球を、がんを有する対象へ投与するステップ、を含む。修飾マクロファージはＭ１表現型を示す。一部の実施形態では、核酸配列はｍＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、外因性核酸配列はヘテロな（heterologous）または内因性プロモーターに作動可能に連結されている。該方法は、免疫モジュレーターを対象に投与するステップをさらに含むことができる。
一態様では、がんを治療する方法が本明細書で提供される。該方法は、Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片をコードする外因性核酸配列を含む修飾マクロファージまたは単球を提供するステップ、ここで修飾マクロファージまたは単球は該Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはその断片を発現する、および、該修飾マクロファージまたは単球を、がんを有する対象へ投与するステップ、を含む。修飾マクロファージはＭ１表現型を示す。一部の実施形態では、核酸配列はｍＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、外因性核酸配列はヘテロな（heterologous）または内因性プロモーターに作動可能に連結されている。該方法は、免疫モジュレーターを対象に投与するステップをさらに含むことができる。
【0005】
別の態様では、マクロファージまたは単球をＨｏｍ－１の発現を誘導する１つまたは複数の薬剤と接触させ、それによってマクロファージまたは単球中の内因性Ｈｏｍ－１の発現レベルが接触ステップ前よりも高くなるステップ、および、こうして接触させたマクロファージまたは単球および免疫モジュレーターを、がんを有する対象に投与するステップ、を含むがんを治療する方法が本明細書に記載される。
【0006】
また、マクロファージまたは単球をＭ１遺伝子の発現を誘導する薬剤またはＭ２遺伝子の発現を阻害する薬剤と接触させ、それによってＭ１表現型を示すマクロファージが生成されるステップ、および、そのように生成されたマクロファージおよび免疫モジュレーターを、がんを有する対象に投与するステップ、を含むがんを治療する方法が本明細書に記載される。
【0007】
これらの方法のいずかでは、免疫モジュレーターは、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはネオアンチゲンに対する抗体からなる群から選択することができる。一部の実施形態では、ネオアンチゲンはＣＫ２０である。
【0008】
本明細書で開示された方法のいずれかでは、投与ステップの前に、対照と比較して、該対象において、腫瘍関連マクロファージにおけるより低レベルのＨｏｍ－１発現を検出することをさらに含むことができる。
【0009】
１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。実施形態の他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【0010】
正常組織から単離されたマクロファージと比較して、ＴＡＭでは、Ｈｏｍ－１発現が著しく減少することが予期せずに発見された。また、予期せずに、ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１の発現の増加が、殺腫瘍活性を持つＭ１様マクロファージにＴＡＭを変換することがさらに発見された。さらに、Ｈｏｍ－１発現ＴＡＭとネオアンチゲンに対する抗体の同時投与は、インビボでの腫瘍増殖の抑制に驚くほど効果的であることが示された。したがって、Ｈｏｍ－１によって調節されるＴＡＭは、がん治療の新しい様式として、単独で、またはＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、または腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、もしくは結腸直腸がんの場合はＣＫ２０、肺がんの場合はＭＥ１、メラノーマの場合はＣＤＣ２７のようなネオアンチゲンに対する抗体、などの免疫モジュレーターと組み合わせて使用できる。
【0011】
ヒトホメオボックス転写因子であるＨｏｍ－１は、標準Ｗｎｔシグナリングのアンタゴニストである。Ｈｏｍ－１の核酸配列（配列番号１）およびそれがコードするアミノ酸配列（配列番号２）は本明細書に開示されている。配列番号２内の位置９１～１５１は、ホメオボックスドメインを含む。
【0012】
抗腫瘍活性を示すマクロファージを対象に投与することによって対象のがんを治療する方法が本明細書に記載される。本明細書で使用される場合、特別の定めのない限り、「抗腫瘍活性を示すマクロファージ」、「Ｍ１様マクロファージ」、および「Ｍ１表現型を示すマクロファージ」という用語は、互換的に使用できる。
【0013】
Ｍ１様マクロファージは、（１）マクロファージまたは単球におけるＨｏｍ－１発現の増加、（２）マクロファージまたは単球における１つまたは複数のＭ１遺伝子の発現の増加、および／または（３）マクロファージまたは単球における１つまたは複数のＭ２遺伝子の発現の阻害によって作製され得る。
【0014】
Ｈｏｍ－１の発現は単球からマクロファージへの分化に必要かつ十分であることが示されたため、（例えば、対象の末梢血に由来する）単球をこの方法で使用できる。つまり、単球でＨｏｍ－１の発現を増加させると、単球をマクロファージに分化させることができる。
【0015】
マクロファージまたは単球をエクスビボで誘導して、より高いレベルの内因性Ｈｏｍ－１を発現させることができる。例えば、ＬＰＳ、コレラトキシン（ＣＴＸ）、化学療法剤、放射線、サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、およびＨｏｍ－１発現の阻害剤に対する抗体またはＲＮＡｉなどのさまざまな薬剤または治療を使用してＨｏｍ－１発現を誘導することができる。
【0016】
Ｍ１表現型を示す修飾マクロファージまたは単球は、Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片をコードする配列を含む外因性ｍＲＮＡ分子（例えば、合成ｍＲＮＡ分子）をマクロファージまたは単球に導入することにより生成され得る。したがって、マクロファージまたは単球におけるＨｏｍ－１の発現は一時的に増加し、Ｍ１表現型を誘導する。修飾マクロファージまたは単球は、次いでがん患者へ投与され得る。ｍＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を促進するために化学的に修飾されたｍＲＮＡであり得る。
【0017】
上昇したレベルのＨｏｍ－１を発現するように遺伝子修飾されたマクロファージまたは単球も、がんを有する対象の治療に使用することができる。例えば、遺伝子修飾マクロファージまたは単球は、Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片をコードする核酸配列を含むことができる。核酸配列はプロモーターに作動可能に連結され、修飾マクロファージまたは単球は、Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはその断片を発現する。そのような修飾マクロファージまたは修飾単球（マクロファージへ分化する）は十分に高レベルのＨｏｍ－１を発現し、抗腫瘍活性および／またはＭ１表現型を示す。
【0018】
遺伝子修飾マクロファージまたは単球は、追加のコピーのＨｏｍ－１遺伝子をマクロファージまたは単球へ導入することによって生成され得る。例えば、内因性Ｈｏｍ－１プロモーターに作動可能に連結されたＨｏｍ－１核酸配列（Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片をコードする）を含む発現構築体はマクロファージまたは単球に導入され得る。
【0019】
マクロファージまたは単球における内因性Ｈｏｍ－１の発現レベルは、また、Ｈｏｍ－１発現の遺伝子修飾調節エレメントによって増加させることができる。例えば、Ｈｏｍ－１の１つまたは複数のネガティブ転写または翻訳調節エレメントを修飾、欠失、または置換して、Ｈｏｍ－１転写産物および／またはタンパク質レベルを増加させることができる。ＣＲＩＰＲ、ＴＡＬＥＮ、もしくはＺＦＮを利用するゲノム編集技術、または当技術分野で知られている他の技術を使用して、Ｈｏｍ－１発現の調節エレメントを改変することができる。
【0020】
Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片は、直接ペプチド送達によりマクロファージまたは単球に導入することもできる。
当技術分野で既知の方法を使用して、マクロファージおよび単球を遺伝子修飾することができる。例えば、Ｈｏｍ－１を発現するための外因性発現構築体は、マクロファージまたは単球に導入（例えば、安定的または一時的にトランスフェクト）され得る。一実施形態では、Ｈｏｍ－１核酸配列はヘテロな（heterologous）（すなわち、Ｈｏｍ－１プロモーターではない）構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、Ｈｏｍ－１核酸配列は内因性プロモーターに作動可能に連結されている。
当技術分野で既知の方法を使用して、マクロファージおよび単球を遺伝子修飾することができる。例えば、Ｈｏｍ－１を発現するための外因性発現構築体は、マクロファージまたは単球に導入（例えば、安定的または一時的にトランスフェクト）され得る。一実施形態では、Ｈｏｍ－１核酸配列はヘテロな（heterologous）（すなわち、Ｈｏｍ－１プロモーターではない）構成的または誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、Ｈｏｍ－１核酸配列は内因性プロモーターに作動可能に連結されている。
【0021】
Ｍ１様殺腫瘍マクロファージは、マクロファージまたは単球においてＭ１遺伝子の発現を誘導することによっても生成され得る。Ｍ１遺伝子を誘導できる薬剤は、ＬＰＳ、ＣＴＸ、ＰＭＡ、ＧＭ－ＳＣＦ、ＩＮＦγ、および化学療法剤を含むが、これに限定されない。マクロファージまたは単球は、上昇したレベルのＭ１遺伝子を発現するように遺伝子修飾することもできる。Ｍ１遺伝子は、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＩＬ２３、ＴＮＦα、ｉＮＯｓ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６８、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２、ＩＬ－１Ｒ、ＭＨＣＩＩ、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１、およびＳＯＣＳ３を含む。
【0022】
マクロファージまたは単球でのＭ２遺伝子の発現を阻害することにより、Ｍ１様殺腫瘍マクロファージを作製することもできる。Ｍ２遺伝子を阻害する薬剤は、抗ＩＬ４薬剤（例えば、抗体またはＲＮＡｉ薬剤）、抗ＩＬ１３薬剤（例えば、抗体またはＲＮＡｉ薬剤）、Ｍ２タンパク質に対する抗体、Ｍ２遺伝子を標的とするＲＮＡｉ薬剤を含む。Ｍ２遺伝子は、ＡＲＧ１、ＭＭＰ９、ＣＣＬ１８、ＶＥＧＦ、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＴＧＦｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＤ６８、ＴＬＲ８、ＴＬＲ１、ＭＨＣＩＩ、ＴＧＭ２、ＤｃｏｙＲ、ＩＬ－１ＲＩＩ、Ｙｍ１／２、ＭＭＲ／ＣＤ２０６、およびＳＲを含む。
【0023】
ヘテロな（heterologous）もしくは自家性マクロファージまたは単球を使用してＭ１様マクロファージを生成することができる。ヘテロなマクロファージまたは単球が使用される場合、ＨＬＡ一致を実行して、宿主反応を回避または最小限に抑えることができる。ＨＬＡ不一致マクロファージまたは単球が使用される場合もある。自家性マクロファージまたは単球は、当技術分野で既知の方法を使用してがん患者から得ることができる。
【0024】
免疫モジュレーターは、免疫系の１つまたは複数の構成要素を強化、阻害、または調節する。そのようなモジュレーターは、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、または腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、もしくは結腸直腸がんの場合はＣＫ２０、肺がんの場合はＭＥ１、メラノーマの場合はＣＤＣ２７のようなネオアンチゲンに対する抗体を含む。
【0025】
生成されたＭ１様マクロファージおよび／または免疫モジュレーターは、点滴または注射（例えば、静脈内、クモ膜下、筋肉内、内腔内、気管内、腹腔内、頭蓋内、皮下、もしくは他のタイプの組織内経路を介して）、経皮的投与、または当技術分野で既知の他の経路から対象へ投与され得る。一例では、マクロファージ、単球、および／または免疫モジュレーターは、腫瘍が発見された部位または組織（例えば、肝臓もしくは膵臓）またはその周辺領域に直接注射することができる。
【0026】
対象は、がんを治療するのに必要なだけ頻繁に（例えば、１～３０日ごとに）および必要な回数（例えば、１～３０回）Ｍ１様マクロファージで治療され得る。本明細書に記載のＭ１様マクロファージは、放射線、化学療法、および小分子薬剤のような他のがん治療との併用療法においても使用することができる。
【0027】
以下に記載されたデータは、Ｈｏｍ－１発現がＴＡＭを腫瘍のタイプに関係なく殺腫瘍細胞に変換することを示している。したがって、本明細書に記載のＭ１様マクロファージを使用して、あらゆるがん、特に低レベルのＨｏｍ－１を発現するＴＡＭに関連するがんを治療することができる。上記のように、Ｍ１様マクロファージで対象を治療する前に、対象のＴＡＭのＨｏｍ－１発現レベルが、対照（例えば、対象の正常組織で見られるマクロファージ）で見られるレベルより低いかどうかを判定することが有用な場合がある。
【0028】
Ｍ１様マクロファージで治療することができるがんの例は、これらに限定されないが、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、メラノーマ、グリオーマ、膠芽腫、褐色細胞腫、肝がん、卵巣がん、皮膚がん、睾丸がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、脳腫瘍、食道がん、膀胱がん、副腎皮質がん、肺がん、気管支がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、鼻咽頭がん、子宮頸がん、肝臓がん、転移性がん、のようながん腫および肉腫、ならびに原発性部位不明のがんが挙げられる。
【0029】
対照のものと比較して（例えば、正常組織のマクロファージにおける対応するレベル）、組織領域の微小環境で見られるマクロファージにおいて、Ｈｏｍ－１もしくはＭ１遺伝子のよち低い発現レベル、またはＭ２遺伝子のよち高い発現レベルを検出することは、組織領域ががんである、またはがんになる危険性があることを示す。したがって、本明細書では、疑わしい組織領域ががんであるか、がんになる危険性があるかどうかを識別する方法も企図している。
【0030】
さらに、がん治療の候補化合物を同定する方法が本明細書に記載される。試験細胞（すなわち、マクロファージまたは単球）を試験化合物に接触させることができ、試験細胞中の（ｉ）Ｈｏｍ－１、（ｉｉ）Ｈｏｍ－１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、（ｉｉｉ）Ｍ１遺伝子、（ｉｖ）Ｍ１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、（ｖ）Ｍ２遺伝子、または（ｖｉ）Ｍ２プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルが検出される。対照（例えば、試験化合物に接触させていない試験細胞における対応するレベル）と比較して、（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの発現レベルを増加させる、および／または（ｖ）もしくは（ｖｉ）の発現レベルを減少させる試験化合物は、がん治療の候補化合物である。
【0031】
１つのスクリーニング方法では、試験化合物は、試験細胞とがん試料を含む共培養に添加される。対照と比較して、（ｉ）試験細胞においてＨｏｍ－１、Ｈｏｍ－１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、Ｍ１遺伝子、またはＭ１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルを増加させる、（ｉｉ）試験細胞においてＨｏｍ－１、Ｈｏｍ－１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子、Ｍ１遺伝子、またはＭ１プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルの有意な減少を阻害する、または（ｉｉｉ）試験細胞中のＭ２遺伝子、もしくはＭ２プロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子の発現レベルを減少させる場合、試験化合物は、がん治療の候補化合物である。
【0032】
共培養システムでは、試験化合物ががん試料に対して阻害効果を有するかどうかも測定できる。対照と比較して、がん試料を阻害する（例えば、がん細胞の増殖を阻害する、がん細胞を死滅させる、またはがん試料のサイズを減少させる）試験化合物は、がん治療の候補化合物である。試験細胞とがん試料は、互いに直接接触することができる。あるいは、試験細胞とがん試料は直接接触しない（例えばトランズウェルインサートを使用して）。がん試料は、がん細胞、例えばがん組織試料、がん組織試料から単離されたがん細胞、またはがん細胞株の細胞を含む試料であり得る。がん組織試料は、がん患者の外科的に解剖された検体から取得できる。そのようながん組織試料はＴＡＭを含む場合がある。
【0033】
スクリーニング法は、また、試験細胞の非存在下でがん組織試料を用いて実行され得る。がん組織試料は試験化合物と接触させることができる。一定期間後、ＴＡＭをがん組織試料から単離し、ＴＡＭのＨｏｍ－１、Ｍ１遺伝子、またはＭ２遺伝子の発現レベルを測定することができる。あるいは、またはそれに加えて、組織試料中のＨｏｍ－１の発現レベルを測定することができる。対照と比較して、（ｉ）Ｈｏｍ－１またはＭ１遺伝子の発現レベルを増加させる、（ｉｉ）Ｈｏｍ－１またはＭ１遺伝子の発現レベルの有意な減少を阻害する、および／または（ｉｉｉ）Ｍ２遺伝子の発現レベルを減少させる場合、試験化合物は、がん治療の候補化合物である。対照と比較して、がん組織試料を阻害する（例えば、試料のサイズを小さくする）試験化合物は、また、がん治療の候補化合物であると考えられる。
【0034】
スクリーニングされる試験化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、抗体、ＲＮＡｉ、小分子、または他の薬物）は、当技術分野で知られている方法を使用して得ることができる。
【0035】
本明細書に記載のいずれかの方法では、Ｈｏｍ－１、Ｍ１遺伝子、またはＭ２遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。プロモーター活性もまた測定することができる。ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、およびプロモーター活性を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。
【0036】
上記のスクリーニング方法のいずれかでは、試験細胞はマクロファージまたは単球であり得る。マクロファージは、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、組織マクロファージ、または単球由来のマクロファージであり得る。試験細胞は、単球でもあり得る。
【0037】
以下の具体例は、ただ例示するだけのものとして解釈されるべきであり、いかなる形であれ本開示の残りの部分を限定するものではない。さらに詳述することなく、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本開示を最大限に利用できると考えられる。本明細書で引用されるすべての出版物は、その内容全体が本明細書で参照により組み込まれるものとする。
【実施例】
【0038】
本発明者らは、ヒトマクロファージの機能的極性化におけるヒトホメオボックスタンパク質Ｈｏｍ－１の役割を確認する。Ｈｏｍ－１は、ヒトマクロファージのＭ１活性化を促進し、ヒトマクロファージのＭ１活性化に必要とされるが、Ｍ２活性化に関与する重要な遺伝子の発現には必要とされないことを本発明者らは見出した。
【0039】
がんから単離された初代ＴＡＭを使用することにより、正常な対照組織から単離されたマクロファージと比較して、ＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現が有意に減少することを本発明者らは見出した。本発明者らは、ＴＡＭ表現型と関連があるＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現プロファイルを示した。さらに、Ｈｏｍ－１の異所性発現は、ＴＡＭをＭ１様表現型に変換した。インビトロおよびインビボの両方のデータは、Ｈｏｍ－１がＴＡＭに殺腫瘍活性を付与することを示した。総合すると、本発明者らの研究は、Ｈｏｍ－１がＴＡＭを殺腫瘍細胞へ変換することを実証した。Ｈｏｍ－１発現ＴＡＭ（Ｍ１表現型を示す）は、さまざまながんの増殖に強力な阻害効果を発揮することから、がんの治療における新しい様式として、Ｈｏｍ－１調節ＴＡＭの役割が示唆されることを本発明者らは示した。
Ｈｏｍ－１発現はＴＡＭで減少した
進行性腫瘍では、ＴＡＭは前腫瘍Ｍ２様の表現型を示す。ＢｒｏｎｔｅおよびＭｕｒｒａｙ、（２０１５）、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２１、１１７～１１９を参照。ＴＡＭの柔軟性は十分に理解されており、さまざまなサイトカインがＭ２表現型へのＴＡＭの極性化に関与している。ＮｏｙおよびＰｏｌｌａｒｄ、（２０１４）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１、４９～６１を参照。それに比べて、ＴＡＭ極性化を制御する転写機構はほとんど不明のままである。
Ｈｏｍ－１発現はＴＡＭで減少した
進行性腫瘍では、ＴＡＭは前腫瘍Ｍ２様の表現型を示す。ＢｒｏｎｔｅおよびＭｕｒｒａｙ、（２０１５）、Ｎａｔ Ｍｅｄ ２１、１１７～１１９を参照。ＴＡＭの柔軟性は十分に理解されており、さまざまなサイトカインがＭ２表現型へのＴＡＭの極性化に関与している。ＮｏｙおよびＰｏｌｌａｒｄ、（２０１４）、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１、４９～６１を参照。それに比べて、ＴＡＭ極性化を制御する転写機構はほとんど不明のままである。
【0040】
結腸がん切除から廃棄された外科的検体を使用して、腫瘍組織からＴＡＭを単離し、以下に記載するように腫瘍部位から１５ｃｍ離れた正常粘膜からマクロファージを単離した。前述のように、正常な対照粘膜から単離されたマクロファージと比較して、ＴＡＭは有意に高いレベルのＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６などのＭ２表現型に関連する細胞表面マーカーを発現することをＦＡＣＳ分析は示した。Ｚｈａｎｇら、（２０１３）、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４９、３３２０～３３３４を参照。本発明者らは、ＴＡＭおよび対照マクロファージの非識別マクロファージマーカーＣＤ３３の発現に有意差はなかったことを見出した。
【0041】
Ｈｏｍ－１がＴＡＭで役割を果たす場合があるかどうかを判定するために、本発明者らはｑＲＴ－ＰＣＲによりＴＡＭでのＨｏｍ－１発現を定量し、対照マクロファージでの発現と比較して、Ｈｏｍ－１発現がＴＡＭで有意に減少することを見出した。
ＶｅｎｔＸはＴＡＭ柔軟性を制御し、Ｍ１表現型へＴＡＭを極性化した
以前の研究では、ＬＰＳによってＴＡＭが誘導されてＭ１表現型を示すことが示された。Ｚｈａｎｇらを参照。Ｈｏｍ－１がＴＡＭ柔軟性において役割を果たすかどうかを判定するために、本発明者らはＬＰＳに曝露したＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現を調べた。Ｈｏｍ－１発現はＬＰＳで刺激された後、ＴＡＭで有意に上昇することを本発明者らは見出した。Ｈｏｍ－１の発現上昇と並行して、以前の研究結果と一致して、ＴＡＭのＬＰＳ刺激は炎症性サイトカインおよび細胞毒性ｉＮＯの分泌の上昇をもたらした。
ＶｅｎｔＸはＴＡＭ柔軟性を制御し、Ｍ１表現型へＴＡＭを極性化した
以前の研究では、ＬＰＳによってＴＡＭが誘導されてＭ１表現型を示すことが示された。Ｚｈａｎｇらを参照。Ｈｏｍ－１がＴＡＭ柔軟性において役割を果たすかどうかを判定するために、本発明者らはＬＰＳに曝露したＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現を調べた。Ｈｏｍ－１発現はＬＰＳで刺激された後、ＴＡＭで有意に上昇することを本発明者らは見出した。Ｈｏｍ－１の発現上昇と並行して、以前の研究結果と一致して、ＴＡＭのＬＰＳ刺激は炎症性サイトカインおよび細胞毒性ｉＮＯの分泌の上昇をもたらした。
【0042】
Ｈｏｍ－１がＴＡＭ柔軟性の調節的役割を果たしているかどうかを判定するために、本発明者らはＴＡＭ表現型に対するＨｏｍ－１ノックダウンの影響を調べた。抗Ｈｏｍ－１モルホリノ（ＭＯ）によるＴＡＭの処理により、Ｈｏｍ－１発現が約８０％減少した。ＴＡＭ柔軟性の重要な調節因子としてのＨｏｍ－１の役割と一致して、Ｈｏｍ－１ ＭＯがＴＡＭのＬＰＳ誘導性炎症性サイトカインおよび細胞傷害性ｉＮＯの分泌を中断することを本発明者らは見出した。ＣＤ２０６はマンノース受容体であり、ＴＡＭで高度に発現するＭ２細胞表面マーカーである。ＴＡＭの柔軟性を反映して、ＴＡＭのＬＰＳへの曝露は、ＣＤ６８＋ＣＤ２０６＋集団の有意な減少とＣＤ６８＋ＣＤ２０６－細胞数の増加をもたらした。Ｈｏｍ－１ ＭＯは、ＴＡＭに対するＬＰＳの両方の効果を破棄した（ｐ＜０．０１）。
【0043】
Ｈｏｍ－１発現レベルとＴＡＭ表現型との相関は、Ｈｏｍ－１がＴＡＭ柔軟性を制御するという考えをさらに探索することを本発明者らに促した。ＴＡＭを単離し、ＧＰＦ－Ｈｏｍ－１または対照ＧＦＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。対照ＧＦＰをトランスフェクトしたＴＡＭと比較して、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭは、細長い／線維芽細胞様の細胞形状を持つ特徴的なＭ１形態を示した。ＦＡＣＳ分析は、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭで、Ｍ１マーカーのＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の表面発現が有意に増加したことを示した。さらに、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭにおいて、炎症誘発性サイトカインのＴＮＦα、ＩＬ－１β、およびＩＬ－１２の分泌は有意に増加し、一方Ｍ２サイトカインのＩＬ－１０の分泌は有意に減少した。一貫して、遺伝子発現分析は、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭにおいて、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、およびｉＮＯｓのようなＭ１遺伝子は有意に増加し、一方ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭにおいて、ＣＣＬ１８、ＭＭＰ９、ＶＥＧＦＡ、およびＡｒｇ１のようなＭ２遺伝子は有意に減少したことを示した。総合すると、本発明者らのデータは、Ｈｏｍ－１はＴＡＭ柔軟性を制御し、ＴＡＭのＭ１極性化を促進することを示唆した。
【0044】
Ｈｏｍ－１はＴＡＭを腫瘍抑制細胞に変換した
Ｈｏｍ－１がＴＡＭのＭ１極性化を促進するという本発明者らの研究結果は、Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭが腫瘍抑制を発揮できるかどうか探索することを本発明者らに促した。結腸がんから新たに単離されたＴＡＭを、ＧＰＦ－Ｈｏｍ－１または対照ＧＦＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。次いで、トランズウェル培養システムを使用して、修飾されたＴＡＭを同一患者の腫瘍または正常組織と共培養した。驚くべきことに、共培養の７～１０日後、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭとのインキュベート中に腫瘍体積は有意に減少した（約７０％）（ｐ＜０．０１）が、ＧＦＰをトランスフェクトしたＴＡＭまたはＴＡＭのみとインキュベートされた腫瘍のサイズに有意な変化はなかった。腫瘍体積の縮小ががん細胞の減少に関連しているかどうかを判定するために、本発明者らは組織切片、Ｈ＆Ｅ染色、およびＣＫ２０抗体による結腸がん細胞の免疫組織化学を実施した。ＣＫ２０陽性腫瘍細胞は、ＴＡＭまたはＧＦＰ修飾ＴＡＭとともにインキュベートした腫瘍のネスト、コード、およびシートに出現することを本発明者らは見出した。しかしＣＫ２０陽性腫瘍細胞は、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭとインキュベーションする間に消失した。Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭの殺腫瘍効果の特異性は、Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭがＧＦＰまたはＧＦＰ－Ｈｏｍ－１のいずれかをトランスフェクトしたＴＡＭとのインキュベーション中に、正常な結腸粘膜の体積および形態に最小限の影響しか及ぼさないという研究結果によって実証された。
Ｈｏｍ－１がＴＡＭのＭ１極性化を促進するという本発明者らの研究結果は、Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭが腫瘍抑制を発揮できるかどうか探索することを本発明者らに促した。結腸がんから新たに単離されたＴＡＭを、ＧＰＦ－Ｈｏｍ－１または対照ＧＦＰをコードするプラスミドでトランスフェクトした。次いで、トランズウェル培養システムを使用して、修飾されたＴＡＭを同一患者の腫瘍または正常組織と共培養した。驚くべきことに、共培養の７～１０日後、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭとのインキュベート中に腫瘍体積は有意に減少した（約７０％）（ｐ＜０．０１）が、ＧＦＰをトランスフェクトしたＴＡＭまたはＴＡＭのみとインキュベートされた腫瘍のサイズに有意な変化はなかった。腫瘍体積の縮小ががん細胞の減少に関連しているかどうかを判定するために、本発明者らは組織切片、Ｈ＆Ｅ染色、およびＣＫ２０抗体による結腸がん細胞の免疫組織化学を実施した。ＣＫ２０陽性腫瘍細胞は、ＴＡＭまたはＧＦＰ修飾ＴＡＭとともにインキュベートした腫瘍のネスト、コード、およびシートに出現することを本発明者らは見出した。しかしＣＫ２０陽性腫瘍細胞は、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭとインキュベーションする間に消失した。Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭの殺腫瘍効果の特異性は、Ｈｏｍ－１修飾ＴＡＭがＧＦＰまたはＧＦＰ－Ｈｏｍ－１のいずれかをトランスフェクトしたＴＡＭとのインキュベーション中に、正常な結腸粘膜の体積および形態に最小限の影響しか及ぼさないという研究結果によって実証された。
【0045】
Ｈｏｍ－１はインビボでＴＡＭの殺腫瘍機能を促進する
Ｈｏｍ－１がインビトロでＴＡＭを殺腫瘍細胞に変換したという本発明者らの研究結果は、インビボでの腫瘍形成におけるＨｏｍ－１調節ＴＡＭの潜在的な役割を探索することを本発明者らに促した。結腸がんを約０．５ｃｍの小片に切り分け、ＮＳＧマウスの腹部側の皮下スペースに外科的に播種した。１週間後、ＭＯ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭ（Ｈｏｍ－１阻害）またはＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭ（Ｈｏｍ－１発現）をマウスの尾の静脈（ｖａｉｎ）から注射した。異種移植の８週間後、ＭＯ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭを注射したマウスでは腫瘍が成長したが、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭを注射したマウスでは成長しなかった。
Ｈｏｍ－１がインビトロでＴＡＭを殺腫瘍細胞に変換したという本発明者らの研究結果は、インビボでの腫瘍形成におけるＨｏｍ－１調節ＴＡＭの潜在的な役割を探索することを本発明者らに促した。結腸がんを約０．５ｃｍの小片に切り分け、ＮＳＧマウスの腹部側の皮下スペースに外科的に播種した。１週間後、ＭＯ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭ（Ｈｏｍ－１阻害）またはＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭ（Ｈｏｍ－１発現）をマウスの尾の静脈（ｖａｉｎ）から注射した。異種移植の８週間後、ＭＯ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭを注射したマウスでは腫瘍が成長したが、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭを注射したマウスでは成長しなかった。
【0046】
さらに、同一のマウスモデルでＭＯ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭと組み合わせた抗ＣＫ２０抗体の効果を評価した。抗体単独で、またはＭＯ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭと組み合わせて、腫瘍が形成された後にマウスに投与した。抗体のみを投与したマウスの腫瘍は成長し続けた。他方では、抗体およびＭＯ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭを投与したマウスの腫瘍は、抗体のみで治療したマウスと比較して、成長が止まるか、はるかに遅い速度で成長した。
【0047】
本発明者らはまた、ＴＡＭまたは単球をＭ１分化培地で培養することにより、Ｍ１表現型を示すように誘導できることを見出した。これらのＭ１分化ＴＡＭ／単球をＮＳＧマウスに注射し、インビボでがんの増殖を阻害することができる。腫瘍の増殖に対するＭ１分化ＴＡＭの影響は、これらのＴＡＭまたは単球でのＨｏｍ－１発現の阻害により無効になる。
【0048】
さまざまながんタイプに及ぼすＴＡＭにおけるＨｏｍ－１の異所性発現の影響
ＴＡＭは基本的にすべての腫瘍の腫瘍形成に関与している。結腸がん細胞のＴＡＭに関する研究に続いて、本発明者らは他の種類の腫瘍にも調査を拡大した。
ＴＡＭは基本的にすべての腫瘍の腫瘍形成に関与している。結腸がん細胞のＴＡＭに関する研究に続いて、本発明者らは他の種類の腫瘍にも調査を拡大した。
【0049】
肺、メラノーマ、食道、胃、および膵臓のがんの外科的種を得て、ＴＡＭを上記のように単離した。同一患者の対応する正常な組織からマクロファージを得た。ＴＡＭおよび組織マクロファージにおけるＨｏｍ－１発現を、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを使用して定量した。これらすべての腫瘍のＴＡＭにおけるＨｏｍ－１発現は、対応する離れた正常組織由来のマクロファージにおけるＨｏｍ－１発現と比較して低かった。
【0050】
Ｈｏｍ－１がこれらのＴＡＭを殺腫瘍細胞に変換できるかどうかを判定するために、ＧＦＰまたはＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をＴＡＭにトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ陽性細胞を選別し、個々の腫瘍と共培養した。すべての腫瘍の腫瘍体積は、ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１をトランスフェクトしたＴＡＭとの共培養中に減少したが、対照ＧＦＰをトランスフェクトしたＴＡＭとの共培養では減少しなかった。本発明者らの結果は、Ｈｏｍ－１がＴＡＭを腫瘍の種類に関係なく殺腫瘍細胞に変換できることを示唆した。
【0051】
結腸組織試料の収集
がん組織および正常組織は、病理学検査室の患者から外科的に解剖された検体から得られた。各腫瘍塊から、または腫瘍塊から１５ｃｍ離れた正常粘膜から、約５～１０グラムの組織を採取した。患者の血液試料も収集した。
がん組織および正常組織は、病理学検査室の患者から外科的に解剖された検体から得られた。各腫瘍塊から、または腫瘍塊から１５ｃｍ離れた正常粘膜から、約５～１０グラムの組織を採取した。患者の血液試料も収集した。
【0052】
上皮内リンパ球の調製
粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）を、変更を加えた以前に記載された技術を使用して単離した（Ｋａｍａｄａ Ｎら、２００８； Ｐｉｇｎａｔａ Ｃら、１９９０）。簡単に言えば、解剖した新鮮な粘膜および腫瘍塊を、１０ｃｍペトリ皿の中で、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＣａ２＋フリーおよびＭｇ２＋フリーハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ですすぎ、粘液を除去した。粘膜および腫瘍をかみそりの刃で０．５ｃｍ小片に切断し、６ウェルプレートの中で、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む５ｍＬ ＨＢＳＳとともに３７°Ｃ、１時間インキュベートし、次いでグレーメッシュ（１００ミクロン）を通過させた。通過画分は上皮内リンパ球および上皮細胞を含み、フローサイトメーターで分析した。
粘膜固有層単核細胞（ＬＰＭＣ）を、変更を加えた以前に記載された技術を使用して単離した（Ｋａｍａｄａ Ｎら、２００８； Ｐｉｇｎａｔａ Ｃら、１９９０）。簡単に言えば、解剖した新鮮な粘膜および腫瘍塊を、１０ｃｍペトリ皿の中で、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＣａ２＋フリーおよびＭｇ２＋フリーハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ですすぎ、粘液を除去した。粘膜および腫瘍をかみそりの刃で０．５ｃｍ小片に切断し、６ウェルプレートの中で、１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む５ｍＬ ＨＢＳＳとともに３７°Ｃ、１時間インキュベートし、次いでグレーメッシュ（１００ミクロン）を通過させた。通過画分は上皮内リンパ球および上皮細胞を含み、フローサイトメーターで分析した。
【0053】
腫瘍塊および正常な粘膜からのマクロファージの単離
続いて粘膜および腫瘍を、２％ＦＢＳ、１．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）、０．１ｍｇ／ｍＬ Ｄｎａｓｅ Ｉを含むＨＢＳＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋含有）中で３７°Ｃ、１時間．インキュベートした。消化された組織はグレーメッシュ（７０ミクロン）フィルターを通過させた。通過画分を回収し、４０％パーコール溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に再懸濁し、次いで６０％パーコール上に層状にし、２０００ｒｐｍ、３０分間、ブレーキをかけずに遠心分離した。境界のＬＰＭＣを回収した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ＣＤ１６ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、ＬＰＭＣから正常な粘膜マクロファージおよびＴＡＭを精製した。これらの技術によって単離された細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって日常的に９８％以上生存した。腸管マクロファージの純度は９５％以上であった。
続いて粘膜および腫瘍を、２％ＦＢＳ、１．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ）、０．１ｍｇ／ｍＬ Ｄｎａｓｅ Ｉを含むＨＢＳＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋含有）中で３７°Ｃ、１時間．インキュベートした。消化された組織はグレーメッシュ（７０ミクロン）フィルターを通過させた。通過画分を回収し、４０％パーコール溶液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に再懸濁し、次いで６０％パーコール上に層状にし、２０００ｒｐｍ、３０分間、ブレーキをかけずに遠心分離した。境界のＬＰＭＣを回収した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ＣＤ１６ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、ＬＰＭＣから正常な粘膜マクロファージおよびＴＡＭを精製した。これらの技術によって単離された細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって日常的に９８％以上生存した。腸管マクロファージの純度は９５％以上であった。
【0054】
末梢血由来のマクロファージの調製
Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ病院において、健康な成人ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ＣＤ１６ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎを使用し、製造業者の使用説明書に従って、ＰＢＭＣからヒト単球を精製した。精製した細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含む完全ＲＰＭＩ培地で培養した。濃縮後、単球をＭ－ＣＳＦを含む完全ＲＰＭＩ培地で５日間培養し、細胞を共培養システムに使用した。
Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ病院において、健康な成人ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離によって単離した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ＣＤ１６ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎを使用し、製造業者の使用説明書に従って、ＰＢＭＣからヒト単球を精製した。精製した細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含む完全ＲＰＭＩ培地で培養した。濃縮後、単球をＭ－ＣＳＦを含む完全ＲＰＭＩ培地で５日間培養し、細胞を共培養システムに使用した。
【0055】
ＦＡＣＳ分析
ＴＡＭおよび他のリンパ球の表現型分析は、蛍光色素結合抗体による細胞の免疫標識後にフローサイトメトリーを使用して行った。以下の抗体を使用した：ＰＥ結合－抗－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、－ＣＤ２５（ＢＣ９６）、－ＣＤ１４（６１Ｄ３）、－ＣＤ６８（ｅＢｉｏ Ｙ１８２Ａ）、－ＣＤ１６３（ｅＢｉｏ ＧＨ１６１）、－ＣＤ２０６、ＦＩＴＣ結合－抗－ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４）、－ＣＤ３３（ＨＩＭ３－４）、ＡＰＣ結合－抗－ＣＤ８（ＯＫＴ８）、－ＣＤ４（ＯＫＴ４）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ）。Ｆｏｘｐ３（２３６Ａ／Ｅ７）、ＩＦＮ－γ、パーフォリン、およびグランザイムＢの細胞内染色は、製造業者が提供するプロトコールに従ってＰＥ結合抗体を使用して行った。同位体コントロール標識を平行して行った。供給業者が推奨するように、抗体を希釈した。標識細胞をＣｅｌｌ－Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで回収し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。結果を陽性細胞の割合として表す。
ＴＡＭおよび他のリンパ球の表現型分析は、蛍光色素結合抗体による細胞の免疫標識後にフローサイトメトリーを使用して行った。以下の抗体を使用した：ＰＥ結合－抗－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、－ＣＤ２５（ＢＣ９６）、－ＣＤ１４（６１Ｄ３）、－ＣＤ６８（ｅＢｉｏ Ｙ１８２Ａ）、－ＣＤ１６３（ｅＢｉｏ ＧＨ１６１）、－ＣＤ２０６、ＦＩＴＣ結合－抗－ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４）、－ＣＤ３３（ＨＩＭ３－４）、ＡＰＣ結合－抗－ＣＤ８（ＯＫＴ８）、－ＣＤ４（ＯＫＴ４）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ）。Ｆｏｘｐ３（２３６Ａ／Ｅ７）、ＩＦＮ－γ、パーフォリン、およびグランザイムＢの細胞内染色は、製造業者が提供するプロトコールに従ってＰＥ結合抗体を使用して行った。同位体コントロール標識を平行して行った。供給業者が推奨するように、抗体を希釈した。標識細胞をＣｅｌｌ－Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで回収し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。結果を陽性細胞の割合として表す。
【0056】
腫瘍およびマクロファージの器官型共培養
トランズウェルインサート（０．４μｍ孔径、Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を１２ウェルのポリスチレン組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に設置した。粘膜および腫瘍塊を計量し、１×ＰＢＳ緩衝液と抗生物質で洗浄し、次いで０．５ｃｍの小片に切り分けた。約５０ｍｇの組織を１２ウェルのトランズウェルの上部コンパートメントに播種し、０．５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０完全培地で満たした。５×１０５個のＴＡＭを下部コンパートメントに５０万細胞／ウェルの密度で添加し、細胞と組織を直接接触させずに、２ｍＬのＰＲＭＩ完全培地で満たした。プレートを３７°Ｃ、５％ＣＯ２でインキュベートした。サイトカイン分析のために培地０．５ｍＬを回収し、３日ごとに新鮮な培地を添加した。２週間の共培養後、低チャンバーマクロファージを回収し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）によって総ＲＮＡを単離した。式（長さ×幅２）／２に従って腫瘍体積を算出するために、腫瘍および正常粘膜をキャリパーで週２回モニターした。組織の写真は、Ｌｅｉｃａ ＥＺ４Ｄ実体顕微鏡の３メガピクセルＣＭＯＳカメラまたはｉＰｈｏｎｅ（登録商標）のデジタルカメラで撮影した。
トランズウェルインサート（０．４μｍ孔径、Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を１２ウェルのポリスチレン組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に設置した。粘膜および腫瘍塊を計量し、１×ＰＢＳ緩衝液と抗生物質で洗浄し、次いで０．５ｃｍの小片に切り分けた。約５０ｍｇの組織を１２ウェルのトランズウェルの上部コンパートメントに播種し、０．５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０完全培地で満たした。５×１０５個のＴＡＭを下部コンパートメントに５０万細胞／ウェルの密度で添加し、細胞と組織を直接接触させずに、２ｍＬのＰＲＭＩ完全培地で満たした。プレートを３７°Ｃ、５％ＣＯ２でインキュベートした。サイトカイン分析のために培地０．５ｍＬを回収し、３日ごとに新鮮な培地を添加した。２週間の共培養後、低チャンバーマクロファージを回収し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）によって総ＲＮＡを単離した。式（長さ×幅２）／２に従って腫瘍体積を算出するために、腫瘍および正常粘膜をキャリパーで週２回モニターした。組織の写真は、Ｌｅｉｃａ ＥＺ４Ｄ実体顕微鏡の３メガピクセルＣＭＯＳカメラまたはｉＰｈｏｎｅ（登録商標）のデジタルカメラで撮影した。
【0057】
免疫組織化学
腫瘍または正常組織はホルマリンで固定した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）。ＣＫ２０染色（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、クローンＫｓ２０．８、１：５０）およびヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。ＣＫ２０染色は、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｅ ＩＩＩ染色プラットフォームで、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ２をオンラインで２０分間使用し、Ｂｏｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ検出キットを使用して行った。顕微鏡分析は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ蛍光顕微鏡で行った。ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を適用したカラーカメラを使用して、４０倍の元の倍率で画像を取得した。代表的な画像の明るさおよびコントラストは、グループ間で等しく調整された。
腫瘍または正常組織はホルマリンで固定した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）。ＣＫ２０染色（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、クローンＫｓ２０．８、１：５０）およびヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。ＣＫ２０染色は、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｅ ＩＩＩ染色プラットフォームで、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ２をオンラインで２０分間使用し、Ｂｏｎｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ検出キットを使用して行った。顕微鏡分析は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ蛍光顕微鏡で行った。ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を適用したカラーカメラを使用して、４０倍の元の倍率で画像を取得した。代表的な画像の明るさおよびコントラストは、グループ間で等しく調整された。
【0058】
Ｈｏｍ－１過剰発現
ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１の血液マクロファージおよびＴＡＭへのトランスフェクションは、製造プロトコールに従ってリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって行われた。トランスフェクションの４８時間後、細胞選別のために７０μｍフィルターを通して細胞を濾過した。ＧＦＰ陽性細胞を、無菌条件のＢａｋｅｒ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｈｏｏｄの下でＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩによって選別した。選別後、細胞をＲＰＭＩ １６４０完全培地で培養した。
ＧＦＰ－Ｈｏｍ－１の血液マクロファージおよびＴＡＭへのトランスフェクションは、製造プロトコールに従ってリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって行われた。トランスフェクションの４８時間後、細胞選別のために７０μｍフィルターを通して細胞を濾過した。ＧＦＰ陽性細胞を、無菌条件のＢａｋｅｒ Ｂｉｏ－Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｈｏｏｄの下でＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩによって選別した。選別後、細胞をＲＰＭＩ １６４０完全培地で培養した。
【0059】
Ｈｏｍ－１ノックダウン
Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、結腸ＴＡＭまたはヒト初代単球をモルホリノ（ＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。簡潔に言えば、５×１０６の細胞を２．５ｎｍｏｌのＨｏｍ－１ＭＯオリゴヌクレオチドまたは標準対照ＭＯオリゴヌクレオチドのいずれかを含む１００μｌヌクレオフェクター溶液に再懸濁し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）でエレクトロポレーションした。次いで、細胞を即時にデバイスから除去し、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの予め加温したＨｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍとともに一晩インキュベートした。次いで、細胞を完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、適切なサイトカインで処理して、マクロファージへの分化を誘導した。すべてのＭＯオリゴヌクレオチドはＧｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＯＲ）に注文した。
Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、結腸ＴＡＭまたはヒト初代単球をモルホリノ（ＭＯ）アンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。簡潔に言えば、５×１０６の細胞を２．５ｎｍｏｌのＨｏｍ－１ＭＯオリゴヌクレオチドまたは標準対照ＭＯオリゴヌクレオチドのいずれかを含む１００μｌヌクレオフェクター溶液に再懸濁し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）でエレクトロポレーションした。次いで、細胞を即時にデバイスから除去し、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＢＳを含む１ｍｌの予め加温したＨｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍとともに一晩インキュベートした。次いで、細胞を完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、適切なサイトカインで処理して、マクロファージへの分化を誘導した。すべてのＭＯオリゴヌクレオチドはＧｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＯＲ）に注文した。
【0060】
サイトカイン測定
Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）処理した血液マクロファージまたはＬＰＳ処理したＴＡＭの上清中のＩＬ－１β、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２ｐ７０のレベルを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したＥＬＩＳＡキットを使用して定量した。製造業者の使用説明書に従って分析を行った。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）処理した血液マクロファージまたはＬＰＳ処理したＴＡＭの上清中のＩＬ－１β、ＩＬ－１０、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２ｐ７０のレベルを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手したＥＬＩＳＡキットを使用して定量した。製造業者の使用説明書に従って分析を行った。
【0061】
ｑＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬によって単離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってＲＮＡ量を測定した。製造業者のプロトコールに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、同量のＲＮＡをファーストストランドｃＤＮＡ合成に使用した。従来のＰＣＲでＨｏｍ－１ｃＤＮＡを増幅するために、製造業者の使用説明書に従って、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（４８０ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｃｈｅ）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用して、Ｈｏｍ－１およびその他の遺伝子ｃＤＮＡの定量的測定を行った。次いで、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を使用して、ｍＲＮＡの相対発現プロファイルを算出した。
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬によって単離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってＲＮＡ量を測定した。製造業者のプロトコールに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、同量のＲＮＡをファーストストランドｃＤＮＡ合成に使用した。従来のＰＣＲでＨｏｍ－１ｃＤＮＡを増幅するために、製造業者の使用説明書に従って、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（４８０ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｃｈｅ）でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用して、Ｈｏｍ－１およびその他の遺伝子ｃＤＮＡの定量的測定を行った。次いで、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）を使用して、ｍＲＮＡの相対発現プロファイルを算出した。
【0062】
アルギナーゼ活性およびＮＯアッセイ
ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍアルギナーゼアッセイキット（ＤＡＲＧ－２００、ＢｉｏＡｓｓａｙｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して尿素の産生を測定することにより、細胞溶解物のアルギナーゼ活性を定量した。培養上清の亜硝酸濃度を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して測定した。
ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍアルギナーゼアッセイキット（ＤＡＲＧ－２００、ＢｉｏＡｓｓａｙｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して尿素の産生を測定することにより、細胞溶解物のアルギナーゼ活性を定量した。培養上清の亜硝酸濃度を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して測定した。
【0063】
統計分析
スチューデント検定を統計分析に使用した。
他の実施形態
本明細書で開示されたすべての特徴は、どの組合せで組み合わせてもよい。本明細書で開示された各特徴は、同一、同等、または類似の目的を果たす代替する特徴に置換してもよい。したがって、明示されない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴の一般的な一連の例にすぎない。
スチューデント検定を統計分析に使用した。
他の実施形態
本明細書で開示されたすべての特徴は、どの組合せで組み合わせてもよい。本明細書で開示された各特徴は、同一、同等、または類似の目的を果たす代替する特徴に置換してもよい。したがって、明示されない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴の一般的な一連の例にすぎない。
【0064】
上記の記載から、当業者は、記載された実施形態の本質的な特性を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱しない範囲で、実施形態のさまざまな変更および修正を行って、さまざまな用途および条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
発明の態様
［態様１］がんを治療する方法であって、
Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片をコードする外因性核酸配列を含む修飾マクロファージまたは単球を提供するステップ、ここで修飾マクロファージまたは単球は該Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはその断片を発現する、および
該修飾マクロファージまたは単球を、がんを有する対象へ投与するステップ
を含む方法。
［態様２］修飾マクロファージまたは単球が、該対象または別の対象に由来するマクロファージまたは単球に外因性核酸を導入することにより生成される、請求項２に記載の方法。
［態様３］外因性核酸が、ｍＲＮＡ分子である、態様１に記載の方法。
［態様４］ｍＲＮＡ分子が、化学的に修飾されたｍＲＮＡ分子である、態様３に記載の方法。
［態様５］修飾マクロファージが、Ｍ１表現型を示す、態様１に記載の方法。
［態様６］外因性核酸配列が、ヘテロなまたは内因性プロモーターに作動可能に連結されている、態様１に記載の方法。
［態様７］プロモーターが、構成的プロモーターである、態様６に記載の方法。
［態様８］プロモーターが、誘導性プロモーターである、態様６に記載の方法。
［態様９］免疫モジュレーターを対象に投与することをさらに含む、態様１から８のいずれかに記載の方法。
［態様１０］免疫モジュレーターが、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはネオアンチゲンに対する抗体からなる群から選択される、態様９に記載の方法。
［態様１１］ネオアンチゲンが、ＣＫ２０である、態様１０に記載の方法。
［態様１２］投与ステップの前に、対照と比較して、該対象において、腫瘍関連マクロファージにおけるより低レベルのＨｏｍ－１発現を検出することをさらに含む、態様１から１１のいずれかに記載の方法。
［態様１３］がんが、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、メラノーマ、グリオーマ、膠芽腫、褐色細胞腫、肝がん、卵巣がん、皮膚がん、睾丸がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、脳腫瘍、食道がん、膀胱がん、副腎皮質がん、肺がん、気管支がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、鼻咽頭がん、子宮頸がん、肝臓がん、転移性がん、および原発性部位不明のがんからなる群から選択される、態様１に記載の方法。
［態様１４］がんを治療する方法であって、
マクロファージまたは単球をＨｏｍ－１の発現を誘導する１つまたは複数の薬剤と接触させ、それによってマクロファージまたは単球中の内因性Ｈｏｍ－１の発現レベルが接触ステップ前よりも高くなるステップ、および
そのように接触させたマクロファージまたは単球および免疫モジュレーターを、がんを有する対象に投与するステップ
を含む方法。
［態様１５］免疫モジュレーターが、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはネオアンチゲンに対する抗体からなる群から選択される、態様１４に記載の方法。
［態様１６］ネオアンチゲンが、ＣＫ２０である、態様１５に記載の方法。
［態様１７］マクロファージまたは単球が、該対象にとって自家性またはヘテロである、態様１４に記載の方法。
［態様１８］接触ステップおよび投与ステップが、少なくとも１回反復される、態様１４に記載の方法。
［態様１９］がんを治療する方法であって、
マクロファージまたは単球を、Ｍ１遺伝子の発現を誘導する薬剤またはＭ２遺伝子の発現を阻害する薬剤と接触させ、それによってＭ１表現型を示すマクロファージが生成されるステップ、および
そのように生成されたマクロファージおよび免疫モジュレーターを、がんを有する対象に投与するステップ
を含む方法。
［態様２０］マクロファージまたは単球が、該対象にとって自家性またはヘテロである、態様１９に記載の方法。
［態様２１］免疫モジュレーターが、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはネオアンチゲンに対する抗体からなる群から選択される、態様１９に記載の方法。
［態様２２］ネオアンチゲンが、ＣＫ２０である、態様２０に記載の方法。
発明の態様
［態様１］がんを治療する方法であって、
Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはＨｏｍ－１ホメオボックスドメインを含むその断片をコードする外因性核酸配列を含む修飾マクロファージまたは単球を提供するステップ、ここで修飾マクロファージまたは単球は該Ｈｏｍ－１ポリペプチドまたはその断片を発現する、および
該修飾マクロファージまたは単球を、がんを有する対象へ投与するステップ
を含む方法。
［態様２］修飾マクロファージまたは単球が、該対象または別の対象に由来するマクロファージまたは単球に外因性核酸を導入することにより生成される、請求項２に記載の方法。
［態様３］外因性核酸が、ｍＲＮＡ分子である、態様１に記載の方法。
［態様４］ｍＲＮＡ分子が、化学的に修飾されたｍＲＮＡ分子である、態様３に記載の方法。
［態様５］修飾マクロファージが、Ｍ１表現型を示す、態様１に記載の方法。
［態様６］外因性核酸配列が、ヘテロなまたは内因性プロモーターに作動可能に連結されている、態様１に記載の方法。
［態様７］プロモーターが、構成的プロモーターである、態様６に記載の方法。
［態様８］プロモーターが、誘導性プロモーターである、態様６に記載の方法。
［態様９］免疫モジュレーターを対象に投与することをさらに含む、態様１から８のいずれかに記載の方法。
［態様１０］免疫モジュレーターが、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはネオアンチゲンに対する抗体からなる群から選択される、態様９に記載の方法。
［態様１１］ネオアンチゲンが、ＣＫ２０である、態様１０に記載の方法。
［態様１２］投与ステップの前に、対照と比較して、該対象において、腫瘍関連マクロファージにおけるより低レベルのＨｏｍ－１発現を検出することをさらに含む、態様１から１１のいずれかに記載の方法。
［態様１３］がんが、白血病、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、メラノーマ、グリオーマ、膠芽腫、褐色細胞腫、肝がん、卵巣がん、皮膚がん、睾丸がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、頭頸部がん、脳腫瘍、食道がん、膀胱がん、副腎皮質がん、肺がん、気管支がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、鼻咽頭がん、子宮頸がん、肝臓がん、転移性がん、および原発性部位不明のがんからなる群から選択される、態様１に記載の方法。
［態様１４］がんを治療する方法であって、
マクロファージまたは単球をＨｏｍ－１の発現を誘導する１つまたは複数の薬剤と接触させ、それによってマクロファージまたは単球中の内因性Ｈｏｍ－１の発現レベルが接触ステップ前よりも高くなるステップ、および
そのように接触させたマクロファージまたは単球および免疫モジュレーターを、がんを有する対象に投与するステップ
を含む方法。
［態様１５］免疫モジュレーターが、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはネオアンチゲンに対する抗体からなる群から選択される、態様１４に記載の方法。
［態様１６］ネオアンチゲンが、ＣＫ２０である、態様１５に記載の方法。
［態様１７］マクロファージまたは単球が、該対象にとって自家性またはヘテロである、態様１４に記載の方法。
［態様１８］接触ステップおよび投与ステップが、少なくとも１回反復される、態様１４に記載の方法。
［態様１９］がんを治療する方法であって、
マクロファージまたは単球を、Ｍ１遺伝子の発現を誘導する薬剤またはＭ２遺伝子の発現を阻害する薬剤と接触させ、それによってＭ１表現型を示すマクロファージが生成されるステップ、および
そのように生成されたマクロファージおよび免疫モジュレーターを、がんを有する対象に投与するステップ
を含む方法。
［態様２０］マクロファージまたは単球が、該対象にとって自家性またはヘテロである、態様１９に記載の方法。
［態様２１］免疫モジュレーターが、ＣＡＲ－Ｔ細胞、免疫チェックポイント阻害剤、および腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、またはネオアンチゲンに対する抗体からなる群から選択される、態様１９に記載の方法。
［態様２２］ネオアンチゲンが、ＣＫ２０である、態様２０に記載の方法。
【配列表】