特許 7289798 肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-02

(45)【発行日】2023-06-12

(54)【発明の名称】肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/744 20150101AFI20230605BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230605BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230605BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230605BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20230605BHJP

   A61K 39/02 20060101ALN20230605BHJP

【ＦＩ】

A61K35/744

A61P37/04

A61P31/04

A61P11/00

A23L33/135

A61K39/02

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2019569207

(86)(22)【出願日】2019-01-31

(86)【国際出願番号】 JP2019003296

(87)【国際公開番号】W WO2019151371

(87)【国際公開日】2019-08-08

【審査請求日】2021-08-20

(31)【優先権主張番号】P 2018015333

(32)【優先日】2018-01-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】500580677

【氏名又は名称】ニュートリー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100098121

【弁理士】

【氏名又は名称】間山 世津子

(74)【代理人】

【識別番号】100107870

【弁理士】

【氏名又は名称】野村 健一

(72)【発明者】

【氏名】川口 晋

(72)【発明者】

【氏名】加藤 美穂

【審査官】六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】特開２００３－２６１４５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００３－０４０７８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５３８６１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－００１９６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００３－１３７７９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－０５６８５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】日本内科学会雑誌，2015年，104(11)，pp.2307-2313

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８

Ａ２３Ｌ ３３／１３５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤。

【請求項2】

エンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項１記載の肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤。

【請求項3】

１回あたり1億～1,000億 CFU/kg体重のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項２記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項4】

１日に１回以上、１回あたり1億～1,000億 CFU/kg体重のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項３記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項5】

１日に１回以上５回以下の回数で、１回あたり1億～1,000億 CFU/kg体重のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項４記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項6】

１回あたり10～500億 CFU/kg体重のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項２記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項7】

１日に１回以上、１回あたり10～500億 CFU/kg体重のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項６記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項8】

１日に１回以上５回以下の回数で、１回あたり10～500億 CFU/kg体重のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項７記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項9】

１回あたり120億 CFU/kg体重以上のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項２記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項10】

１日に１回以上、１回あたり120億 CFU/kg体重以上のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項９記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項11】

１日に１回以上５回以下の回数で、１回あたり120億 CFU/kg体重以上のエンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が経口投与されるように用いられる請求項１０記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項12】

エンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌が7日以上経口投与されるように用いられる請求項２～１１のいずれかに記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項13】

肺炎球菌感染症の予防に用いられる請求項１～１２のいずれかに記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項14】

肺炎球菌感染症の治療に用いられる請求項１～１２のいずれかに記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。

【請求項15】

エンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療用医薬品。

【請求項16】

エンテロコッカス・フェカリスEF-2001株の死菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療用食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

肺炎球菌は（Streptococcus pneumoniae）はグラム陽性双球菌で、上気道の常在菌として知られている。主要な呼吸器病原性菌である。

【0003】

国立感染症研究所の報告には、肺炎球菌は市中肺炎（CAP）において最も頻度の高い病原微生物であり（非特許文献１）、当院でのCAPと医療・介護関連肺炎（NHCAP）の前向きの研究でも肺炎球菌の頻度はそれぞれ34.8％、33.9％で最も多く（非特許文献２）、さらには悪寒・戦慄を呈した患者の菌血症のリスクは全くない患者に比べて12.1倍にのぼる（95% confidence interval [CI] 4.1-36.2）ともいわれており（非特許文献３）、適切な抗菌薬の投与の他、日本においては65歳以上の高齢者を対象として平成26年10月1日から肺炎球菌ワクチンについて定期接種投与に公費補助をしている。

【0004】

しかし、抗菌薬では肺炎球菌に対する耐性菌の存在も確認され、ワクチンにおいては接種状況は思わしくないとの報告もあり、課題があるため、新たな対策が望まれている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Bartlett JG, et al., N Engl J Med 333: 1618, 1995

【文献】Fukuyama H, et al., Published online J Infect Chemother, 25 January 2013

【文献】Tokuda Y, et al., Am J Med 118(12): 1417, 2005

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、新たな肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、鋭意努力した結果、エンテロコッカス属に属する乳酸菌が肺炎球菌感染を予防及び／又は治療できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0008】

本発明の要旨は以下の通りである。
（１）エンテロコッカス属に属する菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤。
（２）エンテロコッカス属に属する菌が乳酸球菌である（１）記載の肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤。
（３）乳酸球菌がエンテロコッカス・フェカリスである（２）記載の肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤。
（４）エンテロコッカス・フェカリスがEF-2001株である（３）記載の肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤。
（５）エンテロコッカス属に属する菌が死菌である（１）～（４）のいずれかに記載の肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤。
（６）エンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（１）～（５）のいずれかに記載の肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤。
（７）１回あたり1億～1,000億 CFU/kg体重のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（６）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（８）１日に１回以上、１回あたり1億～1,000億 CFU/kg体重のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（７）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（９）１日に１回以上５回以下の回数で、１回あたり1億～1,000億 CFU/kg体重のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（８）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１０）１回あたり10～500億 CFU/kg体重のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（６）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１１）１日に１回以上、１回あたり10～500億 CFU/kg体重のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（１０）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１２）１日に１回以上５回以下の回数で、１回あたり10～500億 CFU/kg体重のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（１１）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１３）１回あたり120億 CFU/kg体重以上のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（６）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１４）１日に１回以上、１回あたり120億 CFU/kg体重以上のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（１３）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１５）１日に１回以上５回以下の回数で、１回あたり120億 CFU/kg体重以上のエンテロコッカス属に属する菌が経口投与されるように用いられる（１４）記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１６）エンテロコッカス属に属する菌が7日以上経口投与されるように用いられる（６）～（１５）のいずれかに記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１７）肺炎球菌感染症の予防に用いられる（１）～（１６）のいずれかに記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１８）肺炎球菌感染症の治療に用いられる（１）～（１６）のいずれかに記載の肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療剤。
（１９）エンテロコッカス属に属する菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療用医薬品。
（２０）エンテロコッカス属に属する菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療用食品。
（２１）エンテロコッカス属に属する菌を医薬的に有効な量で被験者に投与することを含む、肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療方法。
（２２）肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療のための、エンテロコッカス属に属する菌の使用。
（２３）肺炎球菌感染症の予防及び/又は治療方法に使用するための、エンテロコッカス属に属する菌。

【発明の効果】

【0009】

本発明により、肺炎球菌感染を予防及び／治療できる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2018‐015333の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】実施例１の試験結果（生存率（Kaplan-Meier plot の結果））を示す。

【図2】実施例１の試験結果（直腸温度）を示す。

【図3】実施例１の試験結果（体重）を示す。

【図4】実施例１の試験結果（摂餌量）を示す。

【図5】実施例１の試験結果（摂水量）を示す。

【図6】実施例１の試験日程を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。

【0012】

本発明は、エンテロコッカス属に属する菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤を提供する。

【0013】

エンテロコッカス属に属する菌は、乳酸球菌であるとよく（例えば、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・アビウム（Enterococcus avium）、エンテロコッカス・ガリナルム（Enterococcus gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）など）、生体応答調節物質（Biological Response Modifier, BRM）活性（薬学誌 112:919-925 1992；薬学誌 113:396-399 1992；動物臨床医学 3:11-20 1994 ）を有するものが好ましい。エンテロコッカス・フェカリスは、BRM活性を有する乳酸球菌として知られている。エンテロコッカス・フェカリスEF-2001株は日本ベルム株式会社（東京都千代田区永田町2-14-3）から入手できる。

【0014】

Enterococcus Faecalis-2001株は、正常の人の糞便から採取することができ、下記の性質を有している。

【0015】

グラム陽性球菌である。コロニーの形(トリプトソーヤ寒天培地、２４時間培養)：直径1．0ｍｍ，スムーズ、正円形、白色コロニー菌形態：球から卵円形(１．０×１．５μｍ)液体培地でよく連鎖する。芽胞非形成。通性嫌気性。グルコースを発酵し乳酸産生(最終pH４．３)。ガス非産生。カタラーゼ 陰性。１０～４５℃で増殖(最適は３７℃)。pH９．６、６．５％NaCl、４０％bileに増殖。０．０４％亜テルルサンカリウム 陽性。０．０１％テトラゾリウム 陽性。０．１％メチレンブルーミルク 陽性。アルギニンを加水分解。アミグダリン、セロビオース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グリセロール、ラクトース、マルトース、マンノース、マンニトール、リボース、サリシン、シュークロース、メレチトース、ソルビトールを発酵して酸産生。６０℃、３０分 耐性。カゼイン、ゲラチンを消化。チロシンを脱炭酸しチラミンに。Lancefield抗原グループ Ｄ。ＧＣ％ ３５．０±１．０％
エンテロコッカス属に属する菌は、生菌であっても、死菌であってもよく、菌体には、破壊処理（ホモジナイズ処理、酵素処理、超音波処理など）、加熱、乾燥（凍結乾燥、噴霧乾燥など）等の処理が施されてもよい。加熱処理により、生菌が死菌となりうる。生菌には乳酸発酵による作用が期待でき、死菌には腸管免疫賦活作用が期待できる。菌体の粒径は、0.05μm～50μmであるとよく、好ましくは、0.08～20μmであり、より好ましくは、0.1～10μmである。菌体は、希釈剤と混合した後、糊料を添加して、顆粒状としてもよい。希釈剤や糊料は、食品や医薬品に添加するものとして許可されている材料から選択するとよい。

【0016】

本発明の肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤は、肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療に用いることができる。本発明の肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療剤は、医薬品として、あるいは、食品添加物として、使用することができる。

【0017】

本発明は、エンテロコッカス属に属する菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療用医薬品を提供する。

【0018】

医薬として用いる場合には、エンテロコッカス属に属する菌を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、シロップ、エアロゾル、坐剤、注射剤等に製剤化するとよい。賦形剤または担体は、当分野で常套的に使用され、医薬的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は適宜選択される。例えば、液状担体としては水、植物油などが用いられる。固体担体としては、乳糖、白糖、ブドウ糖などの糖類、バレイショデンプン、トウモロコシデンプンなどのデンプン、結晶セルロースなどのセルロース誘導体などが使用される。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースなどの崩壊剤等を添加してもよい。その他、抗酸化剤、着色剤、矯味剤、保存剤等を添加してもよい。また、凍結乾燥製剤として用いたりすることもできる。

【0019】

エンテロコッカス属に属する菌は、経口、経鼻、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内などの種々の経路によって投与できる。

【0020】

エンテロコッカス属に属する菌の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常0.001～100質量％、好ましくは0.01～100質量％である。

【0021】

エンテロコッカス属に属する菌の投与量は、医薬的に有効な量、すなわち、肺炎球菌感染の予防及び／又は治療効果が確認できる量であればよく、剤型、投与経路、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などにより異なるが、例えば1回当たりの投与量は成人の場合、エンテロコッカス属に属する菌の量に換算して、1億～1,000億 CFU/kg体重程度、好ましくは 10～500億 CFU/kg体重程度とし、１日に１回から数回（例えば、２回、３回、４回、５回程度）投与するとよい。

【0022】

エンテロコッカス属に属する菌は、食品に添加してもよい。本発明は、エンテロコッカス属に属する菌を含有する肺炎球菌感染症の予防及び／又は治療用食品を提供する。

【0023】

本発明の食品には、たんぱく質、脂質、炭水化物、ナトリウムなどの一般成分、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リンなどのミネラル類、鉄、亜鉛、銅、セレン、クロムなどの微量元素、ビタミンＡ、β－カロテン、ビタミンＢ_１、ビタミンＢ_２、ビタミンＢ_６、ビタミンＢ_１２、ビタミンＣ、ナイアシン、葉酸、ビタミンＤ_３、ビタミンＥ、ビオチン、パントテン酸などのビタミン類、コエンザイムQ10、α－リポ酸、ガラクトオリゴ糖、食物繊維、賦形剤（水、カルボキシメチルセルロース、乳糖など）、甘味料、矯味剤（リンゴ酸、クエン酸、アミノ酸など）、香料などを添加してもよい。本発明の食品を液剤とする場合、食品成分を分散または溶解する液体として、水、生理食塩水、果汁等を用いることができ、経口投与における味覚向上の目的では、果汁を用いるとよい。

【0024】

本発明の食品は、粉末、顆粒、錠剤、液剤などのいかなる形状としてもよいが、病人や高齢者が容易に摂取可能とするためには、ゼリーなどのゲル状製品とすることが好ましい。

【0025】

ゲル化剤としては、デキストリン、寒天、キサンタンガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、ペクチンなどの増粘多糖類、ジェランガム、サイリュームシードガム、タラガム、グアガム、グルコマンナンアルギン酸、タマリンドシードガム、セルロースなどを用いることができ、１種又は２種以上の増粘多糖類を用いることが好ましい。ゲル状製品のゲル強度は、5℃におけるゲル強度が7,000±2,000 N/m²であることが好ましく、また、ゲル強度が7,000±2,000 N/m²のとき、付着エネルギーが60±40 J/m³であり、凝集性が0.7±0.1 J/m³であることがより好ましい。このように付着性が低く、凝集性が高いゲルは優れた嚥下適性を有する。

【0026】

ゲル強度は、以下のようにして測定することができる。ゲル強度測定機器としては、山電テクスチュロメーター及びφ16ｍｍのプランジャーを用い、測定温度25℃、圧縮速度（プランジャーを押し込む速度）10ｍｍ/s、測定歪率（試料の厚みに対する押し込み率）40.00%、プランジャーを押し込む距離10.00mm、プランジャーを押し込む回数2回にて測定を行う。

【0027】

付着エネルギーは上記ゲル強度測定において、1回押し込んだ後、プランジャーを引き抜くときの負のエネルギーとして測定する。

【0028】

凝集性は上記ゲル強度測定において、2回押し込んだ時に1回目と2回目のエネルギーの比率として測定する。

【0029】

エンテロコッカス属に属する菌の摂取量は、肺炎球菌感染の予防及び／又は治療効果が確認できる量であればよく、剤型、投与経路、患者の年齢、体重、疾患の重篤度などにより異なるが、例えば1回当たりの摂取量は成人の場合、エンテロコッカス属に属する菌の量に換算して、1億～1,000億 CFU/kg体重程度、好ましくは 10～500億 CFU/kg体重程度とし、１日に１回から数回（例えば、２回、３回、４回、５回程度）摂取するとよい。

【実施例】

【0030】

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕肺炎球菌感染マウスに対する加熱殺菌した乳酸菌E. faecalisの投与効果
肺炎球菌感染マウスを作製し、加熱殺菌した乳酸菌E. faecalisを経口投与することでその予防効果および治療効果について検討した。

【0031】

（試験日程）
図６に示す。

【0032】

（材料及び方法）
被験物質及び媒体
・被験物質
名称：乳酸菌粉末EF-2001（日本ベルム株式会社）（加熱殺菌したE. faecalis、径は500 nm＝0.5μm）
性状：黄褐色の粉末
保管条件：室温、遮光、防湿
管理温度：18.0～28.0 °C
・媒体
名称：注射用水
保管条件：室温
管理温度：18.0～28.0°C
製造元：株式会社大塚製薬工場

【0033】

検体
・被験物質の調製方法
乳酸菌粉末EF-2001を20 mg秤量（電子天秤：XP205DR、メトラー・トレド株式会社）し、注射用水に懸濁後、全量を125 mLにし、0.16 mg/mLとした。乳酸菌粉末は沈殿するため、良く撹拌し、懸濁した。用時調製とした。

【0034】

病原微生物
・使用菌株
Streptococcus pneumoniae（ATCC 6303）

・保存条件
超低温フリーザー（管理温度：-90～-70°C、MDF-394AT、三洋電機株式会社）で使用時まで凍結保存した。

・試薬
(1) 羊血液寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）
(2) 生理食塩液（株式会社大塚製薬工場）

・前培養
保存菌株を解凍し、羊血液寒天培地に塗沫後、炭酸ガス培養用炭酸ガス発生剤（アネロパックCO₂、三菱ガス化学株式会社）を入れた嫌気ジャーに入れ、37°C設定の恒温器（ILE800、ヤマト科学株式会社）で2日間培養し、生理食塩液を加えて菌細胞を遊離させ、滅菌済メッシュ（100 μm、セルストレイナー：FALCON（登録商標））で濾過して菌細胞塊及び不純物を除き、接種菌液の原液とした。接種菌原液は菌液接種日まで冷蔵庫（管理温度：2.0～8.0 °C 、UKS-3610DHC、日本フリーザー株式会社）に保管した。

・接種菌原液中の生菌数確認
接種菌原液を生理食塩液で10²倍、10⁴倍及び10⁶倍希釈し、10⁴倍及び10⁶倍希釈液を羊血液寒天培地に塗沫後、炭酸ガス培養用炭酸ガス発生剤を入れた嫌気ジャーに入れ、37°C設定の恒温器で1日培養した。培養後のコロニー数をハンディコロニーカウンター（CC-1、アズワン株式会社）で計測し、接種菌原液1 mL中に含まれる生菌数を算出した。

・接種菌液の調製
菌液接種日に接種菌原液を生理食塩液で希釈し、1×10² CFU/mLの濃度に調製した。調製した菌液を接種菌液とした。調製後の接種菌液中の生菌数を（接種菌原液中の生菌数確認）で示した方法に準じて測定した。

【0035】

試験系
・動物種、系統
動物種：マウス（SPF）
系統：BALB/c 系（BALB/c Cr Slc）

・動物の性別、週齢、入手匹数
雌、4週齢、44匹

・入手後1日の体重範囲
13.4 ～ 17.9 g

・供給源
日本エスエルシー株式会社

・予備飼育
入手した動物は5日間の予備飼育期間を設けた。この間に一般状態の観察を1日1回行い、電子天秤（PB3002-S/FACT、メトラー・トレド株式会社）で体重を2回（動物入手の翌日及び予備飼育期間終了日）測定し、体重推移及び一般状態に異常の認められない動物を群分けに用いた。

・群分け方法
群分けはコンピュータプログラムを用いて、体重を層別に分けたのち、無作為抽出法により各群の平均体重及び分散がほぼ等しくなるように群分け日に行った。

・個体識別法
動物は入手日に油性インクによる尾への記入法及び油性インクによる四肢への色素塗布法を併用して識別した。群分け後には、油性インクを用いて尾への動物番号の記入により識別した。各ケージには、予備飼育期間中は試験番号、入手年月日、予備飼育動物番号を記入したラベルを、群分け後は試験番号、群名称及び動物番号を記入し、群ごとに色分けしたラベルを取り付けた。

・環境条件及び飼育管理
管理温度：18～28°C（実測値：20～27°C）、管理湿度：30～80%（実測値：45～73%）、明暗各12 時間（照明：午前6時～午後6時）に維持された飼育室（木曽三川分室 飼育室 1号室）で動物を飼育した。動物は予備飼育期間中及び群分け後とも、ステンレス製網ケージ（W：100 × D：160 × H：80 mm）を用いて個別飼育した。
ケージ及び給餌器の交換は1 週間に1回以上、給水瓶及び受け皿の交換は1週間に2回以上行った。動物飼育室の清掃は、消毒液を浸したモップによる床の拭き消毒を毎日実施した。

・飼料
製造後5ヵ月以内の固型飼料（CRF-1、オリエンタル酵母工業株式会社）を給餌器に入れて自由に摂取させた。
飼料の使用ロットについて、飼料中の汚染物質濃度、細菌数及び栄養成分含量が試験施設の許容基準に適合していることを確認した。

・飲料水
上水道水を飲料水として給水瓶を用いて自由に摂取させた。飲料水中の汚染物質濃度及び細菌数をほぼ6ヵ月ごとに分析し、試験施設の許容基準に適合していることを確認した。

【0036】

投与
・投与経路：経口

・投与方法
マウス用ゾンデ（有限会社 フチガミ器械）を装着した1 mL容ディスポーザブルシリンジ（テルモ株式会社）を用いて、強制的に経口投与した。なお、投与時には検体を攪拌して必要量を採取した。

・投与液量、投与時刻、投与回数及び投与期間
投与液量：投与日の体重値を基に10 mL/kgで算出した。
投与時刻：午前11時に第1群から順次行った。
投与回数：1日1回とした（第1群及び第2群は合計17回、第3群は7回、第4群は10回）。
投与期間：投与開始日を1日と起算した。第1群及び第2群では菌液接種前7日間、菌液接種日から10日間、第3群では菌液接種前7日間投与した。第4群では菌液接種日から10日間投与した。

・群構成
動物数及び群構成を下表に示した。

*：媒体である注射用水を投与した。
乳酸菌粉末EF-2001を 80 mg/125mLの量で1日1回マウスに投与することは、120 億CFU/kg/日の投与量に相当する。

【0037】

菌液接種方法
群分け後7日に接種菌液0.5 mL（50 CFU）を27G注射針（テルモ株式会社）に取り付けた1 mL容ディスポーザブルシリンジ（テルモ株式会社）を用いて腹腔内に接種した。なお、接種ごとに接種菌液を攪拌して用いた。菌液接種時刻は、被験物質投与の2時間前とした。

【0038】

観察及び検査
・一般状態の観察
群分け日から菌液接種前日までは、1日1回被験物質投与前に、菌液接種日から接種3日後までは午前2回午後2回（午前2回は被験物質投与前）の1日計4回に、接種4日後以降は午前午後（午前は被験物質投与前）に1回の計2回観察した。なお、菌液接種日の午前1回目の観察は、菌液の接種前に行った。

・直腸温の測定
群分け日以降の被験物質投与前（午前1回目の一般状態確認後）に、直腸温を測定（Physitemp、Model BAT-12、PHYSITEMP INSTRUMENTS INC.）した。測定する際は、センサーにワセリンをつけて、マウスの肛門に挿入し、測定した。

・体重測定
群分け日以降は毎日、被験物質投与前（午前1回目の一般状態確認後）に体重を測定（電子天秤：PB3002-S/FACT、メトラー・トレド株式会社）した。

・摂餌量及び摂水量の測定
群分け日以降、毎日給餌器及び給水瓶ごと給餌量及び給水量を測定（電子天秤：PB3002-S/FACT、メトラー・トレド株式会社）し、翌日に残量を測定した。給餌量及び給水量とそれぞれの残量の差から、1日あたりの摂餌量及び摂水量を算出した。

【0039】

統計学的方法
各群で生存率を算出した。直腸温、体重、摂餌量及び摂水量は各群の平均値及び標準誤差を算出した。
有意差検定は生存率では、観察日ごとに対照群と各群間でFisher正確確率検定を行った。観察期間全体についてはKaplan-Meier plotを実施しLogrank test検定を行い、群間比較については多重性の調整をするためHolm補正をした。
直腸温、体重、摂餌量及び摂水量では、多重比較検定を行った。すなわち、Bartlett法による等分散性の検定を行い、等分散の場合にはTukey検定を用いて行った。一方、等分散と認められなかった場合は、Steel-Dwass検定を用いて行った。
危険率は5%とし、それぞれ5%未満及び1%未満に分けて表示した。
なお、統計解析は市販の統計プログラム（SASシステム：SASインスティチュートジャパン）を用いた。

【0040】

（試験成績）
一般状態
結果を表１に示した。生存率については、Kaplan-Meier plot の結果を図１に示した。

































（表１）

一般状態を観察すると、全群において粗毛及び自発運動の低下がみられた。また、全群において接種2日後から3日後にかけて死亡が見られた。
対照群では、菌液接種1日後から粗毛がみられ、接種2日後から自発運動の低下もみられた。死亡が接種2日後に5例、3日に5例がみられ、接種3日後の生存率は0%であった。
全期間投与群では、接種1日後から粗毛がみられ、接種2日後から自発運動の低下もみられた。これらの症状の発現例数は対照群と比べて少なかった。死亡が接種2日後に1例、3日に3例がみられ、接種3日後以降の生存率は60%であった。全期間投与群の生存率は、対照群と比較して、接種3日後以降に有意な上昇（Fisher正確確率検定）がみられ、さらに観察期間全体（Logrank test検定）で有意な上昇が認められた。
菌接種前投与群では、接種1日後から粗毛がみられ、接種2日後から自発運動の低下もみられた。これらの症状の発現例数は対照群と比べて少なかった。死亡は接種2日後で3例、2日で5例がみられ、接種3日後以降の生存率は20%であった。
菌接種後投与群では、接種1日後から粗毛がみられ、接種2日後から自発運動の低下がみられた。これらの症状の発現例数は対照群と比べてほぼ同程度であった。死亡が接種2日後に2例、3日に7例みられ、接種3日後以降の生存率は10%であった。

【0041】

直腸温測定
結果を図２に示した。
対照群では、平均直腸温が接種2日後から3日に続けて下降し、2日間で3°C低下した。
全期間投与群では、平均直腸温が接種2日後に下降し、0.6°C低下した。接種4日後以降は接種前とほぼ同程度で推移した。
菌接種前投与群では、平均直腸温が接種2日後と3日に下降し、2日間で1.2°C低下した。接種4日後以降は接種前とほぼ同程度で推移した。
菌接種後投与群では、平均直腸温が接種2日後と3日に下降し、2日間で2.0°C低下した。接種4日後以降は接種前とほぼ同程度で推移した。

【0042】

体重
結果を図３に示した。
対照群では、平均体重が接種2日後には0.8 g減少し、さらに接種3日後に1.3 g減少した。
全期間投与群では、平均体重が接種3日後に0.7 g減少したが、その後は順調に推移した。
菌接種前投与群では、平均体重が接種3日後に1.0 g減少したが、その後は順調に推移した。
菌接種後投与群では、平均体重が接種2日後に0.6 g減少し、接種3日後に1.9 g減少したが、その後は順調に推移した。

【0043】

摂餌量
結果を図４に示した。
対照群では、平均摂餌量が接種3日後に3.6 g減少した。
全期間投与群では、平均摂餌量の変動はほとんどなかった。対照群と比較して接種3日後に有意な増加が認められた。
菌接種前投与群では、平均摂餌量が接種3日後に2.0 g減少したが、その後は回復した。対照群と比較して、接種1日後に有意な減少が認められた。
菌接種後投与群では、平均摂餌量が接種3日後に2.2 g減少したが、その後は回復した。

【0044】

摂水量
結果を図５に示した。
対照群では、平均摂水量が接種2日後から3日に続けて減少し、2日間で7.1 mL減少した。
全期間投与群では、平均摂水量が接種2日後に2.8 mL減少したが、その後は回復した。対照群と比較して、接種3日後に有意な増加が認められた。
菌接種前投与群では、平均摂水量の変動は少なかったが、接種2日後から3日に続けて減少し、2日間で2.2 mL減少したが、その後は回復した。
菌接種後投与群では、平均摂水量が接種2日後から3日に続けて減少し、2日間で5.6 mL減少したが、その後は回復した。対照群、全期間投与群及び菌接種前投与群と比較して、接種1日前及び接種日に有意な増加が認められた。

【0045】

（考察）
対照群では、肺炎球菌感染後に一般状態の異常、体重、摂餌量及び摂水量の減少、直腸温の下降がみられた。生存率は0%であった。
乳酸菌粉末を肺炎球菌接種前・後を通じて摂取させた17日間投与（全期間投与）群では、摂餌量及び摂水量は変化が小さく、一般状態、直腸温及び体重への影響は対照群よりも軽度であった。生存率は60%であり、対照群と比べて有意な上昇が認められた。
乳酸菌粉末を肺炎球菌接種前の期間のみ投与した7日間投与（菌接種前投与）群では、摂水量は変化が小さく、一般状態、直腸温、体重及び摂餌量への影響は対照群よりも軽度であった。生存率は20%であった。
肺炎球菌接種日から投与を開始した10日間投与（菌接種後投与）群では、直腸温、摂餌量及び摂水量への影響は対照群よりも軽度であったが、一般状態及び体重への影響は対照群と同程度であった。生存率は10%であった。

以上より、乳酸菌含有飲料の成分である乳酸菌粉末EF-2001の摂取は、肺炎球菌感染前から開始し、感染後も継続することが感染予防に最も効果的であることが示された。一方、感染前のみの摂取あるいは感染後の摂取でも、全期間投与群よりも限定的ではあるが感染予防及び治療効果が見られた。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

【産業上の利用可能性】

【0046】

本発明は、肺炎球菌感染の予防及び／又は治療に利用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】