特許 7290288 免疫不全及び自己免疫疾患を治療するための、造血幹細胞でＦＯＸＰ３を発現するレンチウイルスベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-05

(45)【発行日】2023-06-13

(54)【発明の名称】免疫不全及び自己免疫疾患を治療するための、造血幹細胞でＦＯＸＰ３を発現するレンチウイルスベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20230606BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230606BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230606BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20230606BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230606BHJP

   A61K 35/51 20150101ALI20230606BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20230606BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20230606BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230606BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20230606BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230606BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/12

C12N5/10

C12N7/01

A61P37/06

A61K35/76

A61K35/51

A61K35/28

A61K35/15

A61K48/00

A61K31/7088

A61P1/00 171

A61P25/00

A61P21/04

A61P19/02

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2020511428

(86)(22)【出願日】2018-08-22

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-11-26

(86)【国際出願番号】 US2018047586

(87)【国際公開番号】W WO2019040655

(87)【国際公開日】2019-02-28

【審査請求日】2021-08-20

(31)【優先権主張番号】62/548,891

(32)【優先日】2017-08-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(73)【特許権者】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ドナルド・ビー・コーン

(72)【発明者】

【氏名】マリア・グラツィア・ロンカローロ

(72)【発明者】

【氏名】ロジャー・ピー・ホリス

(72)【発明者】

【氏名】ケイトリン・イー・マシウク

(72)【発明者】

【氏名】ローザ・バチェッタ

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】特開２００４－２０８５４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】J. Exp. Med.，2007年，Vol. 204, No. 7，pp.1543-1551

【文献】Nat. Immunol.，2008年，Vol. 9, No. 2，pp.194-202

【文献】Nature，2010年，Vol. 463，pp.808-812

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

内因性ＦｏｘＰ３プロモーターに動作可能に連結されるヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む発現カセットを含む組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、
前記発現カセットがヒトＦｏｘＰ３－ＣＮＳ１配列、ヒトＦｏｘＰ３－ＣＮＳ２配列及びヒトＦｏｘＰ３－ＣＮＳ３配列からなるエンハンサーエレメントを前記プロモーターの上流に含み、
前記ＬＶがＴＡＴ非依存性及び自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである、前記レンチウイルスベクター。

【請求項2】

前記ヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列がＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡを含む、請求項１に記載のベクター。

【請求項3】

前記ヒトＦｏｘＰ３をコードするヌクレオチド配列がコドン最適化される、請求項２に記載のベクター。

【請求項4】

前記ベクターがＦｏｘＰ３ ３’ＵＴＲを含む；及び/又は
前記ベクターがΨ領域ベクターゲノムのパッケージングシグナルを含む；及び/又は
前記ベクターがＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む５’ＬＴＲを含む；及び/又は
前記ベクターがＲｅＶ応答性エレメント（ＲＲＥ）を含む；及び/又は
前記ベクターがインスレーターエレメントを含む；及び/又は
前記ベクターがＡ２インスレーターを含むインスレーターエレメントを含む；及び/又は
前記ベクターがＡ２インスレーターを含むインスレーターエレメントをＵ３領域内に含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項5】

前記ベクターがＰＣＣＬ骨格を含む、請求項４に記載のベクター。

【請求項6】

前記ベクターでトランスフェクトされた細胞が適切な成熟リンパ球においてＦｏｘＰ３の正常な生理的発現を再現する、請求項５に記載のベクター。

【請求項7】

前記ベクターが配列番号１の核酸を含む、請求項１に記載のベクター。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか１項に記載のベクターでトランスフェクトされたパッケージング細胞。

【請求項9】

請求項１～７のいずれか１項に記載のベクターによりコードされたレンチウイルス粒子。

【請求項10】

請求項１～７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターによりコードされたレンチウイルス粒子に感染した宿主細胞。

【請求項11】

前記細胞が幹細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項12】

前記細胞が骨髄由来の幹細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項13】

前記細胞が臍帯血由来の幹細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項14】

前記細胞が末梢血幹細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項15】

前記細胞がヒト造血前駆細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項16】

前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４^＋細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。

【請求項17】

前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－細胞である、請求項１６に記載の宿主細胞。

【請求項18】

ヒトＦｏｘＰ３タンパク質を発現する核酸を含む、感染性のレンチウイルス粒子であって、
前記ウイルス粒子が請求項１～７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを用いて産生される、レンチウイルス粒子。

【請求項19】

ＦｏｘＰ３発現が欠損した哺乳類における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能を回復する治療における使用のための医薬組成物であって、請求項１～７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター及び／または請求項１８に記載のウイルス粒子を含む医薬組成物。

【請求項20】

自己免疫障害の治療における使用のための医薬組成物であって、請求項１～７のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクター及び／または請求項１８に記載のウイルス粒子を含む医薬組成物。

【請求項21】

重症筋無力症、多発性硬化症、ＩＰＥＸ（免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）及び自己免疫性関節炎からなる群から選択される自己免疫障害の治療における使用のための、請求項２０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月２２日に出願された米国特許出願第６２／５４８，８９１号の利益及びその優先権を主張し、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に援用される。
政府支援の声明
［該当なし］

【0002】

ＦｏｘＰ３遺伝子機能（遺伝性変異により）の先天性欠損症の患者を同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を用いて治療すると、免疫エフェクター細胞の正常集団を産生する正常な幹細胞源に必要なＦｏｘＰ３遺伝子機能を提供し得る。しかし、同種ＨＳＣＴは、良好に適合したドナーの必要性及びドナーとレシピエントとの免疫学的相違による移植片拒絶または移植片対宿主病に対するリスクによって限定される。

【0003】

遺伝子を修正したＨＳＣの自家移植によりこれらの免疫性合併症が回避され、非常に有効なＨＳＣＴを実行することができる。患者由来の自己Ｔ細胞は構成的プロモーターを伴うこの因子（ＦｏｘＰ３）を発現するベクターを用いて修飾される場合があり、これらのＴ細胞はｉｎ ｖｉｖｏで有限寿命を有し、その効果は経時的に衰える場合がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】ＵＳ２００９／０３２５８６８Ａ１

【文献】ＵＳ２０１６／００４６６８５Ａ１

【文献】ＵＳ２０１４／００６５１１０Ａ１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

多種類の免疫抑制剤（コルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、代謝拮抗剤ヌクレオシドなど）は遺伝性または後天性自己免疫／自己炎症性疾患の合併症のいくつかを抑制し得るが、部分的にまたは最小限にだけ有効であり、有意な毒性を有し得る。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本明細書において考察される種々の実施形態は以下の１つ以上を含み得るが、これらに限定されない。
実施形態１：組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）であって、

【0007】

内因性ＦｏｘＰ３プロモーターに動作可能に連結されたヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む発現カセットを含み、

【0008】

前記ＬＶがＴＡＴ非依存性及び自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである。

【0009】

実施形態２：前記ヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列がＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡである、実施形態１に記載のベクター。

【0010】

実施形態３：前記ヒトＦｏｘＰ３をコードするヌクレオチド配列がコドン最適化される、実施形態１～２のいずれか１項に記載のベクター。

【0011】

実施形態４：前記ヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列が１つ以上のＦｏｘＰ３エンハンサーエレメントに動作可能に連結される、実施形態１～３のいずれか１項に記載のベクター。

【0012】

実施形態５：前記エンハンサーエレメントがＦｏｘＰ３の保存された非コード配列１（ＦｏｘＰ３－ＣＮＳ１）、ＦｏｘＰ３の保存された非コード配列２（ＦｏｘＰ３－ＣＮＳ２）及びＦｏｘＰ３の保存された非コード配列３（ＦｏｘＰ３－ＣＮＳ３）からなる群から選択される、実施形態４に記載のベクター。

【0013】

実施形態６：前記発現カセットがＦｏｘＰ３－ＣＮＳ１、ＦｏｘＰ３－ＣＮＳ２及びＦｏｘＰ３－ＣＮＳ３を含む、実施形態５に記載のベクター。

【0014】

実施形態７：前記ベクターがＦｏｘＰ３ ３’ＵＴＲを含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載のベクター。

【0015】

実施形態８：前記ベクターがΨ領域ベクターゲノムのパッケージングシグナルを含む、実施形態１～７のいずれか１項に記載のベクター。

【0016】

実施形態９：５’ＬＴＲがＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む、実施形態１～８のいずれか１項に記載のベクター。

【0017】

実施形態１０：前記ベクターがＲｅＶ応答性エレメント（ＲＲＥ）を含む、実施形態１～９のいずれか１項に記載のベクター。

【0018】

実施形態１１：前記ベクターがセントラルポリプリン配列を含む、実施形態１～１０のいずれか１項に記載のベクター。

【0019】

実施形態１２：前記ベクターがインスレーターエレメントを含む、実施形態１～１１のいずれか１項に記載のベクター。

【0020】

実施形態１３：前記ベクターがＡ２インスレーターを含む、実施形態１２に記載のベクター。

【0021】

実施形態１４：前記ベクターがＡ２インスレーターをＵ３領域内に含む、実施形態１３に記載のベクター。

【0022】

実施形態１５：前記ベクターが組換えによる野生型レンチウイルスを再構成することができない、実施形態１～１４のいずれか１項に記載のベクター。

【0023】

実施形態１６：前記ベクターがＰＣＣＬ骨格を含む、実施形態１～１５のいずれか１項に記載のベクター。

【0024】

実施形態１７：前記ベクターをトランスフェクトされた細胞が適切な成熟リンパ球においてＦｏｘＰ３の正常な生理的発現を繰り返す、実施形態１～１６のいずれか１項に記載のベクター。

【0025】

実施形態１８：前記ベクターが配列番号１の核酸を含む、実施形態１に記載のベクター。

【0026】

実施形態１９：実施形態１～１８のいずれか１項に記載のベクターをトランスフェクトされたパッケージング細胞。

【0027】

実施形態２０：実施形態１～１８のいずれか１項に記載のベクターによりコードされたレンチウイルス粒子。

【0028】

実施形態２１：実施形態１～１８のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターによりコードされたレンチウイルス粒子に感染した宿主細胞。

【0029】

実施形態２２：前記細胞が幹細胞である、実施形態２１に記載の宿主細胞。

【0030】

実施形態２３：前記細胞が骨髄由来の幹細胞である、実施形態２１に記載の宿主細胞。

【0031】

実施形態２４：前記細胞が臍帯血由来の幹細胞である、実施形態２１に記載の宿主細胞。

【0032】

実施形態２５：前記細胞が末梢血幹細胞である、実施形態２１に記載の宿主細胞。

【0033】

実施形態２６：前記細胞がヒト造血前駆細胞である、実施形態２１に記載の宿主細胞。

【0034】

実施形態２７：前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４^＋細胞である、実施形態２１に記載の宿主細胞。

【0035】

実施形態２８：前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４^＋ＣＤ３８^－細胞である、実施形態２７に記載の宿主細胞。

【0036】

実施形態２９：ヒトＦｏｘＰ３タンパク質を発現する核酸を含む、感染性のレンチウイルス粒子。

【0037】

実施形態３０：前記ウイルス粒子が実施形態１～１８のいずれか１項に記載のレンチウイルスベクターを用いて産生される、実施形態２９に記載のレンチウイルス粒子。

【0038】

実施形態３１：ＦｏｘＰ３発現が欠損した哺乳類において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能を回復する方法であって、

【0039】

実施形態１～１８のいずれか１項に記載のレンチウイルス及び／または実施形態２９～３０のいずれか１項に記載のウイルス粒子を前記対象由来の幹細胞及び／または前駆細胞に形質導入すること、ならびに

【0040】

前記形質導入された細胞またはその細胞由来の細胞を前記対象に移植することを含み、前記細胞またはその細胞由来の誘導物が前記ヒトＦｏｘＰ３遺伝子を発現し、前記哺乳類における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を回復する、前記方法。

【0041】

実施形態３２：対象における自己免疫障害を治療する方法であって、実施形態１～１８のいずれか１項に記載のレンチウイルス及び／または実施形態２９～３０のいずれか１項に記載のウイルス粒子を前記対象由来の幹細胞及び／または前駆細胞に形質導入すること、ならびに前記形質導入された細胞またはその細胞由来の細胞を前記対象に移植することを含み、前記細胞またはその細胞由来の誘導物が前記ヒトＦｏｘＰ３遺伝子を発現し、前記自己免疫障害の１つ以上の病徴を改善する、及び／あるいは前記自己免疫障害を排除する、前記方法。

【0042】

実施形態３３：前記自己免疫障害が重症筋無力症、多発性硬化症、ＩＰＥＸ（免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）及び自己免疫性関節炎からなる群から選択される障害を含む、実施形態３２に記載の方法。

【0043】

実施形態３４：前記細胞またはその細胞由来の誘導物がＦｏｘＰ３の正常な生理的発現を繰り返す、実施形態３０～３３のいずれか１項に記載の方法。

【0044】

実施形態３５：前記細胞が幹細胞である、実施形態３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【0045】

実施形態３６：前記細胞が骨髄腫由来の幹細胞である、実施形態３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【0046】

実施形態３７：前記細胞が臍帯血由来の幹細胞である、実施形態３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【0047】

実施形態３８：前記細胞が末梢血幹細胞である、実施形態３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【0048】

実施形態３９：前記細胞がヒト造血前駆細胞である、実施形態３０～３４のいずれか１項に記載の方法。

【0049】

実施形態４０：前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４^＋細胞である、実施形態３９に記載の方法。

【0050】

実施形態４１：前記ヒト造血前駆細胞がＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－細胞である、実施形態４０に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1A】パネルＡ～Ｂは、ＦｏｘＰ３レポーターベクターがヒト細胞株においてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示すことを示す。パネルＡ：ＭＴ－２（Ｔｒｅｇ様）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）及びＫ５６２（赤血球系）の３つの異なる細胞株における内因性ＦｏｘＰ３タンパク質発現のフローサイトメトリーの測定。赤のヒストグラムはＦｏｘＰ３発現を表し、灰色のヒストグラムはアイソタイプコントロールの染色細胞の蛍光を表す。パネルＢ：ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクターが形質導入されたＭＴ－２、ＪｕｒｋａｔまたはＫ５６２細胞におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポータータンパク質の発現。ｙ軸はｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現に対して陽性である細胞の百分率を表し、ｘ軸は１個の細胞あたりのベクターコピー数を表す。

【図1B】パネルＡ～Ｂは、ＦｏｘＰ３レポーターベクターがヒト細胞株においてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示すことを示す。パネルＡ：ＭＴ－２（Ｔｒｅｇ様）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）及びＫ５６２（赤血球系）の３つの異なる細胞株における内因性ＦｏｘＰ３タンパク質発現のフローサイトメトリーの測定。赤のヒストグラムはＦｏｘＰ３発現を表し、灰色のヒストグラムはアイソタイプコントロールの染色細胞の蛍光を表す。パネルＢ：ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクターが形質導入されたＭＴ－２、ＪｕｒｋａｔまたはＫ５６２細胞におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポータータンパク質の発現。ｙ軸はｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現に対して陽性である細胞の百分率を表し、ｘ軸は１個の細胞あたりのベクターコピー数を表す。

【図2】パネルＡ～Ｂは、ＦｏｘＰ３レポーターベクターがマウス類遺伝子性移植片モデルにおいてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示すことを示す。パネルＡ：移植片準備。ＣＤ４５．２ＦｏｘＰ３－ＧＦＰ遺伝子導入マウス（ＦｏｘＰ３及びＧＦＰを共発現する）を骨髄ドナーとして使用した。ＣＤ４５．２ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウスからＬｉｎ細胞を単離し、ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレセプターベクターを形質導入した。致死的に照射された類遺伝子性ＣＤ４５．１レシピエントに形質導入されたＬｉｎ細胞を移植した。Ｔｒｅｇ系統（ＦｏｘＰ３－ＧＦＰを特徴とする）におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクター発現について、移植後１０週目にＣＤ４５．２ドナー細胞を分析した。パネルＢ：移植されたマウスの骨髄、脾臓及び胸腺のＦｏｘＰ３－（ＧＦＰ－）及びＦｏｘＰ３＋（ＧＦＰ＋）ドナー細胞において、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーター発現を測定した。ｙ軸は各集団におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞の百分率を表す。

【図3A】パネルＡ～Ｄは、ＦｏｘＰ３レポーターベクターがヒト化マウスモデルにおいてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示すことを示す。パネルＡ：実験準備。ヒト臍帯血から単離したＣＤ３４＋細胞にＦｏｘＰ３ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクターを形質導入し、新生の免疫が欠損したＮＳＧマウスに移植した。移植後１２週目にｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現について、移植されたｈＣＤ４５＋細胞を分析した。パネルＢ：移植されたｈＣＤ４５＋細胞における系統特異的なｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現。ｈＣＤ４５＋細胞は、ＮＳＧ骨髄（ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３３＋骨髄系細胞、ＣＤ３４＋幹及び前駆細胞、ならびにＣＤ３＋Ｔ細胞）、胸腺（ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブ［ＤＮ］、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ［ＤＰ］、ＣＤ４ＣＤ８＋シングルポジティブ［ＣＤ８ ＳＰ］、ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５－［ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞］及びＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５＋［Ｔｒｅｇ］）及び脾臓（ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞）において系統マーカーによってゲーティングされた。ヒストグラムは各系統内でｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を表す。点線は「ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高」に関するカットオフを示す。パネルＣ：各ｈＣＤ４５＋系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高細胞の百分率。Ｎは分析組織１個あたり１０～１４匹のマウスを表す。データは、異なる臍帯血ＣＤ３４＋ドナーを用いた２つの独立実験を表す。パネルＤ：ヒト化マウスにおけるＦｏｘＰ３及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの共発現。移植されたＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス由来のヒトＣＤ４＋細胞がｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現に基づいてソートされ、次にＦｏｘＰ３発現のために細胞内染色及びフローサイトメトリー解析が行われた。左側のパネルはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現によるヒトＣＤ４＋細胞のソーティングを示し、右側のパネルは各ソートされた集団内のＦｏｘＰ３発現を示す。

【図3BC】パネルＡ～Ｄは、ＦｏｘＰ３レポーターベクターがヒト化マウスモデルにおいてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示すことを示す。パネルＡ：実験準備。ヒト臍帯血から単離したＣＤ３４＋細胞にＦｏｘＰ３ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクターを形質導入し、新生の免疫が欠損したＮＳＧマウスに移植した。移植後１２週目にｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現について、移植されたｈＣＤ４５＋細胞を分析した。パネルＢ：移植されたｈＣＤ４５＋細胞における系統特異的なｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現。ｈＣＤ４５＋細胞は、ＮＳＧ骨髄（ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３３＋骨髄系細胞、ＣＤ３４＋幹及び前駆細胞、ならびにＣＤ３＋Ｔ細胞）、胸腺（ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブ［ＤＮ］、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ［ＤＰ］、ＣＤ４ＣＤ８＋シングルポジティブ［ＣＤ８ ＳＰ］、ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５－［ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞］及びＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５＋［Ｔｒｅｇ］）及び脾臓（ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞）において系統マーカーによってゲーティングされた。ヒストグラムは各系統内でｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を表す。点線は「ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高」に関するカットオフを示す。パネルＣ：各ｈＣＤ４５＋系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高細胞の百分率。Ｎは分析組織１個あたり１０～１４匹のマウスを表す。データは、異なる臍帯血ＣＤ３４＋ドナーを用いた２つの独立実験を表す。パネルＤ：ヒト化マウスにおけるＦｏｘＰ３及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの共発現。移植されたＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス由来のヒトＣＤ４＋細胞がｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現に基づいてソートされ、次にＦｏｘＰ３発現のために細胞内染色及びフローサイトメトリー解析が行われた。左側のパネルはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現によるヒトＣＤ４＋細胞のソーティングを示し、右側のパネルは各ソートされた集団内のＦｏｘＰ３発現を示す。

【図3D】パネルＡ～Ｄは、ＦｏｘＰ３レポーターベクターがヒト化マウスモデルにおいてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示すことを示す。パネルＡ：実験準備。ヒト臍帯血から単離したＣＤ３４＋細胞にＦｏｘＰ３ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクターを形質導入し、新生の免疫が欠損したＮＳＧマウスに移植した。移植後１２週目にｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現について、移植されたｈＣＤ４５＋細胞を分析した。パネルＢ：移植されたｈＣＤ４５＋細胞における系統特異的なｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現。ｈＣＤ４５＋細胞は、ＮＳＧ骨髄（ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３３＋骨髄系細胞、ＣＤ３４＋幹及び前駆細胞、ならびにＣＤ３＋Ｔ細胞）、胸腺（ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブ［ＤＮ］、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ［ＤＰ］、ＣＤ４ＣＤ８＋シングルポジティブ［ＣＤ８ ＳＰ］、ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５－［ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞］及びＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５＋［Ｔｒｅｇ］）及び脾臓（ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞）において系統マーカーによってゲーティングされた。ヒストグラムは各系統内でｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を表す。点線は「ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高」に関するカットオフを示す。パネルＣ：各ｈＣＤ４５＋系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高細胞の百分率。Ｎは分析組織１個あたり１０～１４匹のマウスを表す。データは、異なる臍帯血ＣＤ３４＋ドナーを用いた２つの独立実験を表す。パネルＤ：ヒト化マウスにおけるＦｏｘＰ３及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの共発現。移植されたＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス由来のヒトＣＤ４＋細胞がｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現に基づいてソートされ、次にＦｏｘＰ３発現のために細胞内染色及びフローサイトメトリー解析が行われた。左側のパネルはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現によるヒトＣＤ４＋細胞のソーティングを示し、右側のパネルは各ソートされた集団内のＦｏｘＰ３発現を示す。

【図4A】パネルＡ～Ｃは、ＦｏｘＰ３欠損マウスＨＳＣへの系統特異的なＦｏｘＰ３をコードするベクターの導入が機能的なＴｒｅｇの発生を回復することを示す。パネルＡ：実験準備。ＦｏｘＰ３欠損（ｓｃｕｒｆｙ）ドナーマウスからＬｉｎ細胞を単離し、ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ及びレポーターｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの両方を発現するＦｏｘＰ３をコードするベクターを形質導入した。致死的に照射されたＷＴＣＤ４５．１類遺伝子性レシピエントに形質導入されたＬｉｎ細胞を移植した。１２週間後、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞（「修正Ｔｒｅｇ」）をＴｒｅｇ抑制能力（パネルＢ）及びＴｒｅｇ表面マーカー発現（パネルＣ）について評価した。各実験について、ｓｃｕｒｆｙマウス由来の修正ＴｒｅｇをＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウス由来の天然ＧＦＰ＋Ｔｒｅｇと比較した。パネルＢ：ビーズ結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下でＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅバイオレット標識されたＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－レスポンダー細胞とともにソートされたＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ＝天然ＧＦＰ＋ＴｒｅｇまたはｃＴｒｅｇ＝修正ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｔｒｅｇ）を共培養した。１：１の比でＴｒｅｇをＴｒｅｓｐ細胞と培養した。培養４日後、各群の標識されたレスポンダー細胞の分割指数を算出することによって、Ｔｒｅｇ抑制を求めた。データは１～２の複製ウェルの平均＋／－ＳＥＭを表す。パネルＣ：ＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウス（上）または移植されたＣＤ４５．２修正ドナーｓｃｕｒｆｙ細胞（下）由来の胸腺細胞。右側のパネルは、ゲーティングされた各ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞集団（ＧＦＰ－、ＧＦＰ＋、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－またはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋）におけるＴｒｅｇ表面マーカー（ＣＤ２５、ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ４）の発現を示す。

【図4B】パネルＡ～Ｃは、ＦｏｘＰ３欠損マウスＨＳＣへの系統特異的なＦｏｘＰ３をコードするベクターの導入が機能的なＴｒｅｇの発生を回復することを示す。パネルＡ：実験準備。ＦｏｘＰ３欠損（ｓｃｕｒｆｙ）ドナーマウスからＬｉｎ細胞を単離し、ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ及びレポーターｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの両方を発現するＦｏｘＰ３をコードするベクターを形質導入した。致死的に照射されたＷＴＣＤ４５．１類遺伝子性レシピエントに形質導入されたＬｉｎ細胞を移植した。１２週間後、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞（「修正Ｔｒｅｇ」）をＴｒｅｇ抑制能力（パネルＢ）及びＴｒｅｇ表面マーカー発現（パネルＣ）について評価した。各実験について、ｓｃｕｒｆｙマウス由来の修正ＴｒｅｇをＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウス由来の天然ＧＦＰ＋Ｔｒｅｇと比較した。パネルＢ：ビーズ結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下でＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅバイオレット標識されたＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－レスポンダー細胞とともにソートされたＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ＝天然ＧＦＰ＋ＴｒｅｇまたはｃＴｒｅｇ＝修正ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｔｒｅｇ）を共培養した。１：１の比でＴｒｅｇをＴｒｅｓｐ細胞と培養した。培養４日後、各群の標識されたレスポンダー細胞の分割指数を算出することによって、Ｔｒｅｇ抑制を求めた。データは１～２の複製ウェルの平均＋／－ＳＥＭを表す。パネルＣ：ＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウス（上）または移植されたＣＤ４５．２修正ドナーｓｃｕｒｆｙ細胞（下）由来の胸腺細胞。右側のパネルは、ゲーティングされた各ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞集団（ＧＦＰ－、ＧＦＰ＋、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－またはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋）におけるＴｒｅｇ表面マーカー（ＣＤ２５、ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ４）の発現を示す。

【図4C】パネルＡ～Ｃは、ＦｏｘＰ３欠損マウスＨＳＣへの系統特異的なＦｏｘＰ３をコードするベクターの導入が機能的なＴｒｅｇの発生を回復することを示す。パネルＡ：実験準備。ＦｏｘＰ３欠損（ｓｃｕｒｆｙ）ドナーマウスからＬｉｎ細胞を単離し、ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ及びレポーターｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの両方を発現するＦｏｘＰ３をコードするベクターを形質導入した。致死的に照射されたＷＴＣＤ４５．１類遺伝子性レシピエントに形質導入されたＬｉｎ細胞を移植した。１２週間後、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞（「修正Ｔｒｅｇ」）をＴｒｅｇ抑制能力（パネルＢ）及びＴｒｅｇ表面マーカー発現（パネルＣ）について評価した。各実験について、ｓｃｕｒｆｙマウス由来の修正ＴｒｅｇをＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウス由来の天然ＧＦＰ＋Ｔｒｅｇと比較した。パネルＢ：ビーズ結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下でＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅバイオレット標識されたＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－レスポンダー細胞とともにソートされたＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ＝天然ＧＦＰ＋ＴｒｅｇまたはｃＴｒｅｇ＝修正ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｔｒｅｇ）を共培養した。１：１の比でＴｒｅｇをＴｒｅｓｐ細胞と培養した。培養４日後、各群の標識されたレスポンダー細胞の分割指数を算出することによって、Ｔｒｅｇ抑制を求めた。データは１～２の複製ウェルの平均＋／－ＳＥＭを表す。パネルＣ：ＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウス（上）または移植されたＣＤ４５．２修正ドナーｓｃｕｒｆｙ細胞（下）由来の胸腺細胞。右側のパネルは、ゲーティングされた各ＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞集団（ＧＦＰ－、ＧＦＰ＋、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－またはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋）におけるＴｒｅｇ表面マーカー（ＣＤ２５、ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ４）の発現を示す。

【図5A】パネルＡ～Ｅは、系統特異的なＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターがｓｃｕｒｆｙマウス（ＦｏｘＰ３欠損マウスモデル）を救済することができる機能的なＴｒｅｇを生成することを示す。パネルＡ：実験準備。ｓｃｕｒｆｙまたはＷＴ ＨＳＰＣ（ＣＤ４５．２）にＦｏｘＰ３レポーターベクターまたはＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターを形質導入し、致死的に照射された類遺伝子性（ＣＤ４５．１）レシピエントに移植した。移植後１２週目に移植レシピエントの脾臓からドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞（推定上のＴｒｅｇを含む）を精製し、ｓｃｕｒｆｙ新生児へ肝臓内に注入した。ＣＤ４ Ｔ細胞の移入後２１日目にｓｃｕｒｆｙ新生児の救済を評価した。パネルＢ：２１日目に救済されたｓｃｕｒｆｙ新生児由来の脾臓のＣＤ４細胞。左図はＳｆ－Ｔｒｅｇ（未修正）を受け取るｓｃｕｒｆｙマウスを示し、右図はｃＳｆ－Ｔｒｅｇ（修正）を受け取るｓｃｕｒｆｙマウスを示す。ｙ軸はヒトＦｏｘＰ３発現（ＦｏｘＰ３ ＬＶによりコードされる）を示すが、ｘ軸はマウスＦｏｘＰ３発現（両ｓｃｕｒｆｙマウスに無い）を示す。パネルＣ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールに対する脾臓対体重の比。パネルＤ：２１日目に救済されたｓｃｕｒｆｙ新生児における脾臓のＣＤ４ Ｔ細胞の表現型。赤色の囲みはＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－（活性化）ＣＤ４ Ｔ細胞を強調し、青色の囲みはＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブ）ＣＤ４ Ｔ細胞を強調する。パネルＥ：２１日目に救済したｓｃｕｒｆｙ新生児の写真。白矢印は耳の奇形の修正を強調する。

【図5BC】パネルＡ～Ｅは、系統特異的なＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターがｓｃｕｒｆｙマウス（ＦｏｘＰ３欠損マウスモデル）を救済することができる機能的なＴｒｅｇを生成することを示す。パネルＡ：実験準備。ｓｃｕｒｆｙまたはＷＴ ＨＳＰＣ（ＣＤ４５．２）にＦｏｘＰ３レポーターベクターまたはＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターを形質導入し、致死的に照射された類遺伝子性（ＣＤ４５．１）レシピエントに移植した。移植後１２週目に移植レシピエントの脾臓からドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞（推定上のＴｒｅｇを含む）を精製し、ｓｃｕｒｆｙ新生児へ肝臓内に注入した。ＣＤ４ Ｔ細胞の移入後２１日目にｓｃｕｒｆｙ新生児の救済を評価した。パネルＢ：２１日目に救済されたｓｃｕｒｆｙ新生児由来の脾臓のＣＤ４細胞。左図はＳｆ－Ｔｒｅｇ（未修正）を受け取るｓｃｕｒｆｙマウスを示し、右図はｃＳｆ－Ｔｒｅｇ（修正）を受け取るｓｃｕｒｆｙマウスを示す。ｙ軸はヒトＦｏｘＰ３発現（ＦｏｘＰ３ ＬＶによりコードされる）を示すが、ｘ軸はマウスＦｏｘＰ３発現（両ｓｃｕｒｆｙマウスに無い）を示す。パネルＣ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールに対する脾臓対体重の比。パネルＤ：２１日目に救済されたｓｃｕｒｆｙ新生児における脾臓のＣＤ４ Ｔ細胞の表現型。赤色の囲みはＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－（活性化）ＣＤ４ Ｔ細胞を強調し、青色の囲みはＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブ）ＣＤ４ Ｔ細胞を強調する。パネルＥ：２１日目に救済したｓｃｕｒｆｙ新生児の写真。白矢印は耳の奇形の修正を強調する。

【図5DE】パネルＡ～Ｅは、系統特異的なＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターがｓｃｕｒｆｙマウス（ＦｏｘＰ３欠損マウスモデル）を救済することができる機能的なＴｒｅｇを生成することを示す。パネルＡ：実験準備。ｓｃｕｒｆｙまたはＷＴ ＨＳＰＣ（ＣＤ４５．２）にＦｏｘＰ３レポーターベクターまたはＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターを形質導入し、致死的に照射された類遺伝子性（ＣＤ４５．１）レシピエントに移植した。移植後１２週目に移植レシピエントの脾臓からドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞（推定上のＴｒｅｇを含む）を精製し、ｓｃｕｒｆｙ新生児へ肝臓内に注入した。ＣＤ４ Ｔ細胞の移入後２１日目にｓｃｕｒｆｙ新生児の救済を評価した。パネルＢ：２１日目に救済されたｓｃｕｒｆｙ新生児由来の脾臓のＣＤ４細胞。左図はＳｆ－Ｔｒｅｇ（未修正）を受け取るｓｃｕｒｆｙマウスを示し、右図はｃＳｆ－Ｔｒｅｇ（修正）を受け取るｓｃｕｒｆｙマウスを示す。ｙ軸はヒトＦｏｘＰ３発現（ＦｏｘＰ３ ＬＶによりコードされる）を示すが、ｘ軸はマウスＦｏｘＰ３発現（両ｓｃｕｒｆｙマウスに無い）を示す。パネルＣ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールに対する脾臓対体重の比。パネルＤ：２１日目に救済されたｓｃｕｒｆｙ新生児における脾臓のＣＤ４ Ｔ細胞の表現型。赤色の囲みはＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－（活性化）ＣＤ４ Ｔ細胞を強調し、青色の囲みはＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブ）ＣＤ４ Ｔ細胞を強調する。パネルＥ：２１日目に救済したｓｃｕｒｆｙ新生児の写真。白矢印は耳の奇形の修正を強調する。

【図6】図６はｐＣＣＬ－ＣＮＳｐ－ＦＯＸＰ３－３ＵＴＲ－Ａ２ベクター（配列番号１（接合マーカー由来の配列））の構造を示す。ヒトゲノム源の配列：（Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｍａｄ３ ａｎｄ ＮＦＡＴ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ＦｏｘＰ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｔｓ ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９：１９４－２０２）に記載の配列と同一ではないが、それに基づくＣＮＳ１（２３７ｂｐ）最小配列；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ（２００７）ＣＲＥＢ／ＡＴＦ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＦｏｘＰ３ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．ＪＥＭ，２０４：１５４３－１５５１に公表されたＣＮＳ２（３５９ｂｐ）；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＦｏｘＰ３ ｇｅｎｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｆａｔｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４７３：８０８－８１３に公表されたＣＮＳ３（２１７ｂｐ）；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ（２００７）、上記から修飾されたプロモーター（３８２ｂｐ）配列；ヒトゲノムＮＣＢＩ参照配列ファイルＮＭ＿０１４００９に基づく５’ＵＴＲ（１８７ｂｐ）；ヒトゲノムＮＣＢＩ参照配列ファイルＮＭ＿０１００９に基づくＦｏｘＰ３ｃＤＮＡ（１２９２ｂｐ）；ヒトゲノムＮＣＢＩ参照配列ファイルＮＭ＿０１４００９に基づく３’ＵＴＲ（８７５ｂｐ）。

【図7】図７はＦｏｘＰ３レンチウイルスの成分を示す。

【図8AB】パネルＡ～Ｆは、構成的ＦｏｘＰ３発現がＨＳＰＣ移植を損なうことを示す。パネルＡ：形質導入後３日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたマウスのＬｉｎ－ＨＳＰＣにおける生存率及びＧＦＰ発現。パネルＢ：移植後７日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたドナー（ＣＤ４５．１）Ｌｉｎ－ＨＳＰＣにおける末梢血移植。ＦＡＣＳプロットはドナー細胞（ｎ＝マウス１０匹／群）におけるドナー（ＣＤ４５．１）移植及びＧＦＰ発現を示す。パネルＣ：移植後１０日及び２１日目（ｎ＝１群１たりマウス１０匹）の移植されたマウスにおける白血球（ＷＢＣ）数、赤血球（ＲＢＣ）数及び血小板数。パネルＤ：移植後のマウスの生存。Ｎ＝１群あたりマウス１０匹。パネルＥ：形質導入後３日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたＣＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける生存率及びＧＦＰ発現。パネルＦ：移植後６～８週目のヒト化ＮＳＧマウスにおけるｈＣＤ４５＋細胞（ｈＣＤ４５＋とｍＣＤ４５＋との合計百分率として表す）の末梢血移植。データは独立ドナー１２体由来のＣＢＣＤ３４＋細胞を用いてヒト化されたマウスを表し、ｎは１群あたりマウス１６～１７匹である。スチューデントｔ検定。データはパネルＢに対する平均±ＳＤ、パネルＣに対する平均±ＳＥＭ及びパネルＦに対する中央値±ＩＱＲ及び範囲を表す。パネルＣ及びＦにおけるデータを、スチューデントｔ検定を用いて分析する。（Ｄ）のデータを、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて分析する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図8CD】パネルＡ～Ｆは、構成的ＦｏｘＰ３発現がＨＳＰＣ移植を損なうことを示す。パネルＡ：形質導入後３日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたマウスのＬｉｎ－ＨＳＰＣにおける生存率及びＧＦＰ発現。パネルＢ：移植後７日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたドナー（ＣＤ４５．１）Ｌｉｎ－ＨＳＰＣにおける末梢血移植。ＦＡＣＳプロットはドナー細胞（ｎ＝マウス１０匹／群）におけるドナー（ＣＤ４５．１）移植及びＧＦＰ発現を示す。パネルＣ：移植後１０日及び２１日目（ｎ＝１群１たりマウス１０匹）の移植されたマウスにおける白血球（ＷＢＣ）数、赤血球（ＲＢＣ）数及び血小板数。パネルＤ：移植後のマウスの生存。Ｎ＝１群あたりマウス１０匹。パネルＥ：形質導入後３日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたＣＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける生存率及びＧＦＰ発現。パネルＦ：移植後６～８週目のヒト化ＮＳＧマウスにおけるｈＣＤ４５＋細胞（ｈＣＤ４５＋とｍＣＤ４５＋との合計百分率として表す）の末梢血移植。データは独立ドナー１２体由来のＣＢＣＤ３４＋細胞を用いてヒト化されたマウスを表し、ｎは１群あたりマウス１６～１７匹である。スチューデントｔ検定。データはパネルＢに対する平均±ＳＤ、パネルＣに対する平均±ＳＥＭ及びパネルＦに対する中央値±ＩＱＲ及び範囲を表す。パネルＣ及びＦにおけるデータを、スチューデントｔ検定を用いて分析する。（Ｄ）のデータを、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて分析する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図8EF】パネルＡ～Ｆは、構成的ＦｏｘＰ３発現がＨＳＰＣ移植を損なうことを示す。パネルＡ：形質導入後３日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたマウスのＬｉｎ－ＨＳＰＣにおける生存率及びＧＦＰ発現。パネルＢ：移植後７日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたドナー（ＣＤ４５．１）Ｌｉｎ－ＨＳＰＣにおける末梢血移植。ＦＡＣＳプロットはドナー細胞（ｎ＝マウス１０匹／群）におけるドナー（ＣＤ４５．１）移植及びＧＦＰ発現を示す。パネルＣ：移植後１０日及び２１日目（ｎ＝１群１たりマウス１０匹）の移植されたマウスにおける白血球（ＷＢＣ）数、赤血球（ＲＢＣ）数及び血小板数。パネルＤ：移植後のマウスの生存。Ｎ＝１群あたりマウス１０匹。パネルＥ：形質導入後３日目のコントロールＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）または構成的ＦｏｘＰ３ＬＶ（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）が形質導入されたＣＢＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおける生存率及びＧＦＰ発現。パネルＦ：移植後６～８週目のヒト化ＮＳＧマウスにおけるｈＣＤ４５＋細胞（ｈＣＤ４５＋とｍＣＤ４５＋との合計百分率として表す）の末梢血移植。データは独立ドナー１２体由来のＣＢＣＤ３４＋細胞を用いてヒト化されたマウスを表し、ｎは１群あたりマウス１６～１７匹である。スチューデントｔ検定。データはパネルＢに対する平均±ＳＤ、パネルＣに対する平均±ＳＥＭ及びパネルＦに対する中央値±ＩＱＲ及び範囲を表す。パネルＣ及びＦにおけるデータを、スチューデントｔ検定を用いて分析する。（Ｄ）のデータを、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて分析する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図9】図９Ａ及び９Ｂは、系統特異的なＦｏｘＰ３発現のためのレンチウイルスベクターのデザインを示す。図９Ａ：内因性ヒトＦＯＸＰ３遺伝子は、ベクターに含まれる制御領域（プロモーター、ＣＮＳ１、ＣＮＳ２、ＣＮＳ３及び３’ＵＴＲ）の位置を示す。図９Ｂ：ベクターマップは、ｐＣＣＬベクター骨格内のＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ及びＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙコンストラクトのデザインを示す。ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを発現させる。ＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙにＰ２Ａで連結されたＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡを発現させる。

【図10A-D】パネルＡ～Ｅ。ＦｏｘＰ３レポーターＬＶはＴｒｅｇ系統特異的な発現を示す。パネルＡ：ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが形質導入されたヒト造血細胞株の分析。左側のパネルにおけるヒストグラムは各細胞株の内因性ＦｏｘＰ３状態を示す。右側のパネルにおけるヒストグラムはＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが形質導入された各細胞株におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を示す。パネルＢ：ベクターコピー数の範囲でヒト造血細胞株におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現。ｙ軸はｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現（左）に対して陽性である細胞の百分率またはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ蛍光（右）の平均強度を表し、ｘ軸は細胞１個あたりのベクターコピー数を表す（ｎ＝細胞株１個あたり１２）。パネルＣ：ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙのｉｎ ｖｉｖｏでの系統特異的な発現を評価するための実験計画。ＣＤ４５．２ＦｏｘＰ３－ＧＦＰ遺伝子導入マウス（ＦｏｘＰ３及びＧＦＰを共発現する）を骨髄ドナーとして使用した。ＣＤ４５．２ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウスからＬｉｎ－ＨＳＰＣを単離し、ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入した。致死的に照射された類遺伝子性ＣＤ４５．１レシピエントに形質導入されたＬｉｎ－ＨＳＰＣを移植した。ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクター発現について、移植後２０週目に各造血系統内のＣＤ４５．２ドナー細胞を分析した。パネルＤ：ヒストグラムが移植マウスの骨髄、胸腺及び脾臓における各造血系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーター発現を示す。個々のヒストグラム線は各マウス（ｎ＝マウス９匹）に対して特定した系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を表す。パネルＥ：ｙ軸はＢＭ、脾臓及び胸腺（ｎ＝マウス９匹）における各造血系統内のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞の百分率を表す。パネルＥのデータは平均±ＳＤを表す。

【図10E】パネルＡ～Ｅ。ＦｏｘＰ３レポーターＬＶはＴｒｅｇ系統特異的な発現を示す。パネルＡ：ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが形質導入されたヒト造血細胞株の分析。左側のパネルにおけるヒストグラムは各細胞株の内因性ＦｏｘＰ３状態を示す。右側のパネルにおけるヒストグラムはＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが形質導入された各細胞株におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を示す。パネルＢ：ベクターコピー数の範囲でヒト造血細胞株におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現。ｙ軸はｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現（左）に対して陽性である細胞の百分率またはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ蛍光（右）の平均強度を表し、ｘ軸は細胞１個あたりのベクターコピー数を表す（ｎ＝細胞株１個あたり１２）。パネルＣ：ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙのｉｎ ｖｉｖｏでの系統特異的な発現を評価するための実験計画。ＣＤ４５．２ＦｏｘＰ３－ＧＦＰ遺伝子導入マウス（ＦｏｘＰ３及びＧＦＰを共発現する）を骨髄ドナーとして使用した。ＣＤ４５．２ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウスからＬｉｎ－ＨＳＰＣを単離し、ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入した。致死的に照射された類遺伝子性ＣＤ４５．１レシピエントに形質導入されたＬｉｎ－ＨＳＰＣを移植した。ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクター発現について、移植後２０週目に各造血系統内のＣＤ４５．２ドナー細胞を分析した。パネルＤ：ヒストグラムが移植マウスの骨髄、胸腺及び脾臓における各造血系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーター発現を示す。個々のヒストグラム線は各マウス（ｎ＝マウス９匹）に対して特定した系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を表す。パネルＥ：ｙ軸はＢＭ、脾臓及び胸腺（ｎ＝マウス９匹）における各造血系統内のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞の百分率を表す。パネルＥのデータは平均±ＳＤを表す。

【図11AB】パネルＡ～Ｆ。系統特異的なＦｏｘＰ３発現はｓｃｕｒｆｙ（ＦｏｘＰ３が欠損した）ＨＳＣからＴｒｅｇの発生を回復する。パネルＡ：Ｔｒｅｇの発生を評価するための移植片準備。ＦｏｘＰ３欠損（ｓｃｕｒｆｙ）または野生型（ＦｏｘＰ３－ＧＦＰ）ドナーマウスからＬｉｎ－ＨＳＰＣを単離し、ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入した。形質導入されたＬｉｎ－ＨＳＰＣを致死的に照射されたＷＴＣＤ４５．１類遺伝子性レシピエントに移植した。１２週間後、Ｔｒｅｇの胸腺及び脾臓の再構成について、各移植片コホート由来のドナー細胞を評価した。各群のＴｒｅｇ集団は、ＣＤ４＋ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞（未修正ｓｃｕｒｆｙ Ｔｒｅｇ［Ｓｆ－Ｔｒｅｇ］、修正ＳｃｕｒｆｙＴｒｅｇ［ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ］）またはＣＤ４＋ＧＦＰ＋細胞（野生型Ｔｒｅｇ［ＷＴ－Ｔｒｅｇ］）として確認された。パネルＢ：Ｓｆ、ｃＳｆまたはＷＴ ＢＭ Ｌｉｎ細胞で再構成されたマウスにおける全ドナー胸腺細胞の系統分布。（ｎ＝１アームあたりマウス３～５匹）。パネルＣ：胸腺のＴｒｅｇの再構成。ＦＡＣＳプロットは移植片レシピエントの胸腺におけるドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４ＳＰ細胞を示す。ゲートは胸腺Ｓｆ－Ｔｒｅｇ、ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ及びＷＴ－Ｔｒｅｇを示す。下のパネルは各推定上のＴｒｅｇ集団内にＴｒｅｇ表面マーカーＣＤ２５、ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ４の発現を示す。表面マーカー発現について、Ｓｆ－Ｔｒｅｇ及びｃＳｆ－ＴｒｅｇはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現の上５０％を表す細胞によって定義される。ヒストグラムは３つのうちの代表的な実験を表す。パネルＤ：脾臓のＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖのソーティング。脾臓のＴｒｅｇ集団（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋またはＧＦＰ＋ゲート）は、Ｔｒｅｇ抑制分析についてＦＡＣＳでソートされた。Ｔｃｏｎｖ集団（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－またはＧＦＰ－ゲート）は、ｉＴｒｅｇ誘導分析についてソートされた。パネルＥ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇ抑制分析。ビーズが結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下、ソートされたＴｒｅｇ（パネルＤに示される）をレスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ、蛍光性増殖染料で標識された類遺伝子性ＷＴＣＤ４＋細胞）と１：１の比で共培養した。培養３日後、フローサイトメトリーで増殖染料の希釈によってＴｒｅｓｐ増殖を判定した。ヒストグラムは、３つの代表的な実験のうちの１つにおけるＴｒｅｓｐ増殖を表す。棒グラフは、各Ｔｒｅｇ培養条件（ｎ＝１アームあたり６～９、１アームあたり３つの異なるＴｒｅｇ源由来、各実験について内部の「Ｔｒｅｇでない」コントロールに正規化されたデータ）に対する増殖指数を示す。パネルＦ：ソートされた脾臓のＴｃｏｎｖ細胞（パネルＤに示される）を２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下で４日間、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化し、ｉＴｒｅｇを誘発した。ＦＡＣＳプロットは、各群（ｎ＝マウス３匹／群）からｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＧＦＰ発現を示す。パネルＢ、Ｃ、Ｅ及びＦのデータは平均±ＳＤとして提示される。各系統について、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定によってパネルＢのデータを分析した。パネルＥのデータを、全群に対する総合比較についてＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定によって分析し、対での比較についてＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定によって分析する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ＮＳ、有意差なし。

【図11CD】パネルＡ～Ｆ。系統特異的なＦｏｘＰ３発現はｓｃｕｒｆｙ（ＦｏｘＰ３が欠損した）ＨＳＣからＴｒｅｇの発生を回復する。パネルＡ：Ｔｒｅｇの発生を評価するための移植片準備。ＦｏｘＰ３欠損（ｓｃｕｒｆｙ）または野生型（ＦｏｘＰ３－ＧＦＰ）ドナーマウスからＬｉｎ－ＨＳＰＣを単離し、ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入した。形質導入されたＬｉｎ－ＨＳＰＣを致死的に照射されたＷＴＣＤ４５．１類遺伝子性レシピエントに移植した。１２週間後、Ｔｒｅｇの胸腺及び脾臓の再構成について、各移植片コホート由来のドナー細胞を評価した。各群のＴｒｅｇ集団は、ＣＤ４＋ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞（未修正ｓｃｕｒｆｙ Ｔｒｅｇ［Ｓｆ－Ｔｒｅｇ］、修正ＳｃｕｒｆｙＴｒｅｇ［ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ］）またはＣＤ４＋ＧＦＰ＋細胞（野生型Ｔｒｅｇ［ＷＴ－Ｔｒｅｇ］）として確認された。パネルＢ：Ｓｆ、ｃＳｆまたはＷＴ ＢＭ Ｌｉｎ細胞で再構成されたマウスにおける全ドナー胸腺細胞の系統分布。（ｎ＝１アームあたりマウス３～５匹）。パネルＣ：胸腺のＴｒｅｇの再構成。ＦＡＣＳプロットは移植片レシピエントの胸腺におけるドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４ＳＰ細胞を示す。ゲートは胸腺Ｓｆ－Ｔｒｅｇ、ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ及びＷＴ－Ｔｒｅｇを示す。下のパネルは各推定上のＴｒｅｇ集団内にＴｒｅｇ表面マーカーＣＤ２５、ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ４の発現を示す。表面マーカー発現について、Ｓｆ－Ｔｒｅｇ及びｃＳｆ－ＴｒｅｇはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現の上５０％を表す細胞によって定義される。ヒストグラムは３つのうちの代表的な実験を表す。パネルＤ：脾臓のＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖのソーティング。脾臓のＴｒｅｇ集団（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋またはＧＦＰ＋ゲート）は、Ｔｒｅｇ抑制分析についてＦＡＣＳでソートされた。Ｔｃｏｎｖ集団（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－またはＧＦＰ－ゲート）は、ｉＴｒｅｇ誘導分析についてソートされた。パネルＥ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇ抑制分析。ビーズが結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下、ソートされたＴｒｅｇ（パネルＤに示される）をレスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ、蛍光性増殖染料で標識された類遺伝子性ＷＴＣＤ４＋細胞）と１：１の比で共培養した。培養３日後、フローサイトメトリーで増殖染料の希釈によってＴｒｅｓｐ増殖を判定した。ヒストグラムは、３つの代表的な実験のうちの１つにおけるＴｒｅｓｐ増殖を表す。棒グラフは、各Ｔｒｅｇ培養条件（ｎ＝１アームあたり６～９、１アームあたり３つの異なるＴｒｅｇ源由来、各実験について内部の「Ｔｒｅｇでない」コントロールに正規化されたデータ）に対する増殖指数を示す。パネルＦ：ソートされた脾臓のＴｃｏｎｖ細胞（パネルＤに示される）を２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下で４日間、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化し、ｉＴｒｅｇを誘発した。ＦＡＣＳプロットは、各群（ｎ＝マウス３匹／群）からｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＧＦＰ発現を示す。パネルＢ、Ｃ、Ｅ及びＦのデータは平均±ＳＤとして提示される。各系統について、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定によってパネルＢのデータを分析した。パネルＥのデータを、全群に対する総合比較についてＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定によって分析し、対での比較についてＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定によって分析する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ＮＳ、有意差なし。

【図11EF】パネルＡ～Ｆ。系統特異的なＦｏｘＰ３発現はｓｃｕｒｆｙ（ＦｏｘＰ３が欠損した）ＨＳＣからＴｒｅｇの発生を回復する。パネルＡ：Ｔｒｅｇの発生を評価するための移植片準備。ＦｏｘＰ３欠損（ｓｃｕｒｆｙ）または野生型（ＦｏｘＰ３－ＧＦＰ）ドナーマウスからＬｉｎ－ＨＳＰＣを単離し、ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入した。形質導入されたＬｉｎ－ＨＳＰＣを致死的に照射されたＷＴＣＤ４５．１類遺伝子性レシピエントに移植した。１２週間後、Ｔｒｅｇの胸腺及び脾臓の再構成について、各移植片コホート由来のドナー細胞を評価した。各群のＴｒｅｇ集団は、ＣＤ４＋ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞（未修正ｓｃｕｒｆｙ Ｔｒｅｇ［Ｓｆ－Ｔｒｅｇ］、修正ＳｃｕｒｆｙＴｒｅｇ［ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ］）またはＣＤ４＋ＧＦＰ＋細胞（野生型Ｔｒｅｇ［ＷＴ－Ｔｒｅｇ］）として確認された。パネルＢ：Ｓｆ、ｃＳｆまたはＷＴ ＢＭ Ｌｉｎ細胞で再構成されたマウスにおける全ドナー胸腺細胞の系統分布。（ｎ＝１アームあたりマウス３～５匹）。パネルＣ：胸腺のＴｒｅｇの再構成。ＦＡＣＳプロットは移植片レシピエントの胸腺におけるドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４ＳＰ細胞を示す。ゲートは胸腺Ｓｆ－Ｔｒｅｇ、ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ及びＷＴ－Ｔｒｅｇを示す。下のパネルは各推定上のＴｒｅｇ集団内にＴｒｅｇ表面マーカーＣＤ２５、ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ４の発現を示す。表面マーカー発現について、Ｓｆ－Ｔｒｅｇ及びｃＳｆ－ＴｒｅｇはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現の上５０％を表す細胞によって定義される。ヒストグラムは３つのうちの代表的な実験を表す。パネルＤ：脾臓のＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖのソーティング。脾臓のＴｒｅｇ集団（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋またはＧＦＰ＋ゲート）は、Ｔｒｅｇ抑制分析についてＦＡＣＳでソートされた。Ｔｃｏｎｖ集団（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－またはＧＦＰ－ゲート）は、ｉＴｒｅｇ誘導分析についてソートされた。パネルＥ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴｒｅｇ抑制分析。ビーズが結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下、ソートされたＴｒｅｇ（パネルＤに示される）をレスポンダーＴ細胞（Ｔｒｅｓｐ、蛍光性増殖染料で標識された類遺伝子性ＷＴＣＤ４＋細胞）と１：１の比で共培養した。培養３日後、フローサイトメトリーで増殖染料の希釈によってＴｒｅｓｐ増殖を判定した。ヒストグラムは、３つの代表的な実験のうちの１つにおけるＴｒｅｓｐ増殖を表す。棒グラフは、各Ｔｒｅｇ培養条件（ｎ＝１アームあたり６～９、１アームあたり３つの異なるＴｒｅｇ源由来、各実験について内部の「Ｔｒｅｇでない」コントロールに正規化されたデータ）に対する増殖指数を示す。パネルＦ：ソートされた脾臓のＴｃｏｎｖ細胞（パネルＤに示される）を２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβの存在下で４日間、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化し、ｉＴｒｅｇを誘発した。ＦＡＣＳプロットは、各群（ｎ＝マウス３匹／群）からｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＧＦＰ発現を示す。パネルＢ、Ｃ、Ｅ及びＦのデータは平均±ＳＤとして提示される。各系統について、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定によってパネルＢのデータを分析した。パネルＥのデータを、全群に対する総合比較についてＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定によって分析し、対での比較についてＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定によって分析する。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ＮＳ、有意差なし。

【図12AB】パネルＡ～Ｅ。系統特異的なＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターは、ｓｃｕｒｆｙマウスを救済することができる機能的なＴｒｅｇを生成する。パネルＡ：実験準備。ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙをｓｃｕｒｆｙまたはＷＴ ＨＳＰＣ（ＣＤ４５．２）に形質導入し、致死的に照射された類遺伝子性（ＣＤ４５．１）レシピエントに移植した。移植後８週目に移植レシピエントの脾臓からドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞（推定上のＴｒｅｇを含む）を精製し、ｓｃｕｒｆｙ新生児の腹腔内に注入した。ＣＤ４ Ｔ細胞の移入後２１日目にｓｃｕｒｆｙ新生児の救済を評価した。パネルＢ：２１日目の救済したｓｃｕｒｆｙマウスの写真。白矢印はＳｆ－Ｔｒｅｇではなく、ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ及びＷＴ－Ｔｒｅｇのｓｃｕｒｆｙマウスレシピエントにおける耳皮膚炎の修正を強調する。パネルＣ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールに対する脾臓対体重の比（ｎ＝３つの独立実験、マウス３～６匹／アーム）。パネルＤ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールの脾臓における活性化（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－）ＣＤ４ Ｔ細胞の百分率。パネルＥ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールにおける血清サイトカインレベル。パネルＣ～Ｅのデータは平均±ＳＤとして提示される。パネルＣ、Ｄ及びＥのデータを、全群に対する総合比較についてＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定によって分析し、対での比較についてＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定が行われた。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＮＳ、有意差なし。

【図12C-E】パネルＡ～Ｅ。系統特異的なＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターは、ｓｃｕｒｆｙマウスを救済することができる機能的なＴｒｅｇを生成する。パネルＡ：実験準備。ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙをｓｃｕｒｆｙまたはＷＴ ＨＳＰＣ（ＣＤ４５．２）に形質導入し、致死的に照射された類遺伝子性（ＣＤ４５．１）レシピエントに移植した。移植後８週目に移植レシピエントの脾臓からドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞（推定上のＴｒｅｇを含む）を精製し、ｓｃｕｒｆｙ新生児の腹腔内に注入した。ＣＤ４ Ｔ細胞の移入後２１日目にｓｃｕｒｆｙ新生児の救済を評価した。パネルＢ：２１日目の救済したｓｃｕｒｆｙマウスの写真。白矢印はＳｆ－Ｔｒｅｇではなく、ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ及びＷＴ－Ｔｒｅｇのｓｃｕｒｆｙマウスレシピエントにおける耳皮膚炎の修正を強調する。パネルＣ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールに対する脾臓対体重の比（ｎ＝３つの独立実験、マウス３～６匹／アーム）。パネルＤ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールの脾臓における活性化（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－）ＣＤ４ Ｔ細胞の百分率。パネルＥ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールにおける血清サイトカインレベル。パネルＣ～Ｅのデータは平均±ＳＤとして提示される。パネルＣ、Ｄ及びＥのデータを、全群に対する総合比較についてＫｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定によって分析し、対での比較についてＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定が行われた。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、ＮＳ、有意差なし。

【図13A-D】パネルＡ～Ｆ。ＦｏｘＰ３レポーターベクターがヒト化マウスモデルにおけるＴｒｅｇ系統特異的な発現を示す。パネルＡ：ヒト化マウスモデルのための実験準備。ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙをＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（正常なヒト臍帯血由来）に形質導入し、新生児ＮＳＧマウス（パネルＢ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）またはＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（パネルＤ）に移植した。移植後１２～１６週目にｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現について、移植されたｈＣＤ４５＋細胞を分析した。パネルＢ：各造血系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーター発現。分析された系統は、骨髄ＣＤ３４＋幹細胞及び前駆細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３３＋骨髄性細胞、ならびにＣＤ３＋Ｔ細胞、胸腺ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブ（ＤＮ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）、ＣＤ４－ＣＤ８＋シングルポジティブ（ＣＤ８ ＳＰ）、ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５－（ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞）及びＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５＋（Ｔｒｅｇ）及び脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を含む。各重なったヒストグラムは、個々のマウス（ｎ＝２つの異なる臍帯血ＣＤ３４＋ドナーを用いてヒト化されたマウス１０～１４匹）における系統定義のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を表す。パネルＣ：パネルＢに示される各系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞の百分率。パネルＤ：ヒト化マウスにおけるＦｏｘＰ３及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの共発現。移植ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの２つのプールされた脾臓からヒトＣＤ４＋細胞を濃縮した。ＣＤ４＋細胞をｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－集団にＦＡＣＳでソートした後、ＦｏｘＰ３発現のために細胞内染色した。ＦｏｘＰ３細胞内染色プロトコル時、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ蛍光をクエンチするため、ＦｏｘＰ３分析の前にＦＡＣＳソーティングが行われた。左側のパネルはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現によるヒトＣＤ４＋細胞のソーティングを示し、右側のパネルはソートされた集団内のＦｏｘＰ３発現を示す。結果は２つの独立実験の代表である。パネルＥ：ＮＳＧ競合的再増殖分析のための実験準備。「試験」ＣＢ ＣＤ３４＋細胞にＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入したが、「競合」ＣＤ３４＋細胞にＵＢＣ－ｍＣｉｔｒｉｎｅベクターを形質導入した。１：１の比で試験及び競合細胞をＮＳＧ新生児に共移植し、各群（ｎ＝１群あたりマウス６匹、２つの異なるＣＢＣＤ３４＋ドナーからヒト化した）に対する１２週目にＢＭに移植された競合（ｍＣｉｔｒｉｎｅ＋）ＣＤ３４＋細胞の百分率を求めた。パネルＦ：ヒト化マウス由来のＴ細胞集団のＣＮＳ２メチル化分析。図は内因性ＦＯＸＰ３遺伝子内のＣＮＳ２及びウイルス性ゲノム内のＣＮＳ２の位置を表す。赤色矢印は内因性またはウイルス性ＣＮＳ２領域の増幅に対して差動的なプライマー結合部位を示す。ＣＮＳ２の拡張領域は、亜硫酸水素塩シークエンシングによるメチル化状態について分析された９つのＣｐＧ部位を表す。ＦＡＣＳプロットは、ヒト化マウス３～５匹のプールされた脾臓から単離されたＣＤ４豊富細胞におけるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）及びＴｃｏｎｖ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）を定義するために用いられるソーティングゲートを示す。ヒートマップは、内因性及びウイルス性ＣＮＳ２内の９つのＣｐＧ部位のそれぞれで検出されたメチル化された読み出しの百分率を表す。結果は、２つの異なるＣＢ ＣＤ３４＋ドナー（図１８）からヒト化されたプールされたＮＳＧコホートを用いる２つの独立実験の代表である。パネルＥのデータは平均±ＳＤを表す。パネルＥのデータをＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定によって分析し、ＮＳは有意差なしである。

【図13EF】パネルＡ～Ｆ。ＦｏｘＰ３レポーターベクターがヒト化マウスモデルにおけるＴｒｅｇ系統特異的な発現を示す。パネルＡ：ヒト化マウスモデルのための実験準備。ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙをＣＤ３４＋ＨＳＰＣ（正常なヒト臍帯血由来）に形質導入し、新生児ＮＳＧマウス（パネルＢ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）またはＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス（パネルＤ）に移植した。移植後１２～１６週目にｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現について、移植されたｈＣＤ４５＋細胞を分析した。パネルＢ：各造血系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーター発現。分析された系統は、骨髄ＣＤ３４＋幹細胞及び前駆細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３３＋骨髄性細胞、ならびにＣＤ３＋Ｔ細胞、胸腺ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブ（ＤＮ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）、ＣＤ４－ＣＤ８＋シングルポジティブ（ＣＤ８ ＳＰ）、ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５－（ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞）及びＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５＋（Ｔｒｅｇ）及び脾臓ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を含む。各重なったヒストグラムは、個々のマウス（ｎ＝２つの異なる臍帯血ＣＤ３４＋ドナーを用いてヒト化されたマウス１０～１４匹）における系統定義のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を表す。パネルＣ：パネルＢに示される各系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞の百分率。パネルＤ：ヒト化マウスにおけるＦｏｘＰ３及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの共発現。移植ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスの２つのプールされた脾臓からヒトＣＤ４＋細胞を濃縮した。ＣＤ４＋細胞をｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－集団にＦＡＣＳでソートした後、ＦｏｘＰ３発現のために細胞内染色した。ＦｏｘＰ３細胞内染色プロトコル時、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ蛍光をクエンチするため、ＦｏｘＰ３分析の前にＦＡＣＳソーティングが行われた。左側のパネルはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現によるヒトＣＤ４＋細胞のソーティングを示し、右側のパネルはソートされた集団内のＦｏｘＰ３発現を示す。結果は２つの独立実験の代表である。パネルＥ：ＮＳＧ競合的再増殖分析のための実験準備。「試験」ＣＢ ＣＤ３４＋細胞にＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入したが、「競合」ＣＤ３４＋細胞にＵＢＣ－ｍＣｉｔｒｉｎｅベクターを形質導入した。１：１の比で試験及び競合細胞をＮＳＧ新生児に共移植し、各群（ｎ＝１群あたりマウス６匹、２つの異なるＣＢＣＤ３４＋ドナーからヒト化した）に対する１２週目にＢＭに移植された競合（ｍＣｉｔｒｉｎｅ＋）ＣＤ３４＋細胞の百分率を求めた。パネルＦ：ヒト化マウス由来のＴ細胞集団のＣＮＳ２メチル化分析。図は内因性ＦＯＸＰ３遺伝子内のＣＮＳ２及びウイルス性ゲノム内のＣＮＳ２の位置を表す。赤色矢印は内因性またはウイルス性ＣＮＳ２領域の増幅に対して差動的なプライマー結合部位を示す。ＣＮＳ２の拡張領域は、亜硫酸水素塩シークエンシングによるメチル化状態について分析された９つのＣｐＧ部位を表す。ＦＡＣＳプロットは、ヒト化マウス３～５匹のプールされた脾臓から単離されたＣＤ４豊富細胞におけるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）及びＴｃｏｎｖ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）を定義するために用いられるソーティングゲートを示す。ヒートマップは、内因性及びウイルス性ＣＮＳ２内の９つのＣｐＧ部位のそれぞれで検出されたメチル化された読み出しの百分率を表す。結果は、２つの異なるＣＢ ＣＤ３４＋ドナー（図１８）からヒト化されたプールされたＮＳＧコホートを用いる２つの独立実験の代表である。パネルＥのデータは平均±ＳＤを表す。パネルＥのデータをＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定によって分析し、ＮＳは有意差なしである。

【図14】（図１０に対応する）：マウス造血系統のフローサイトメトリーの定義脾臓（Ｇｒ１＋、Ｂ２２０＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）、骨髄（ｃＫｉｔ＋）及び胸腺（ＤＮ、ＤＰ、ＣＤ８ ＳＰ、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）における定義された各集団について、ゲーティングが示される。

【図15】パネルＡ及びＢ。ｓｃｕｒｆｙ新生児のＨＳＣ移植片。パネルＡ：Ｌｉｎ細胞を用いるＨＳＣ移植後の生存曲線。ｓｃｕｒｆｙまたはＷＴ新生児（ｄ０～ｄ１）を５００Ｒａｄで照射し、その後、ＬＶ修飾Ｌｉｎ細胞の肝内注入を行った。各子は、ドナーマウス１匹の大腿骨及び脛骨から精製された総Ｌｉｎ細胞投与量を得た（１Ｅ６～６Ｅ６のＬｉｎ細胞／マウスの範囲）。ＷＴ Ｌｉｎ細胞及び未修正ｓｃｕｒｆｙ Ｌｉｎ細胞にはＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターＬＶを形質導入した一方、修正ｓｃｕｒｆｙ Ｌｉｎ細胞にはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙＬＶを形質導入した。結果は、１治療群あたりマウス合計６～１６匹とともに、移植された同腹仔９匹（ｓｃｕｒｆｙ及びＷＴ同腹仔を含む）からプールされたデータを表す。死亡マウスは、自発的に死んだか、または治療群が見えないと獣医が判断した瀕死状態であるため、安楽死させたマウスである。パネルＢ：Ｌｉｎ細胞を得るｓｃｕｒｆｙ新生児の２１日の末梢血移植。百分率は、ＣＤ４５．２＋ドナー細胞を総ＣＤ４５＋（ＣＤ４５．２及びＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２）細胞の百分率として表す。赤で記した印は、研究の最後まで（１１４日）生存しているマウスにおける移植を表す。

【図16A】パネルＡ～Ｄ。（図１２に対応する）：パネルＡ：養子移入のためのＣＤ４精製細胞産物の特徴「アーム」はレシピエント新生児（ｓｃｕｒｆｙ［Ｓｆ］または野生型［ＷＴ］＋注入された細胞産物（ＰＢＳ＝偽ＰＢＳ注入、Ｓｆ－ＣＤ４＝未修正ｓｃｕｒｆｙＣＤ４、ｃＳｆ－ＣＤ４＝修正ＳｃｕｒｆｙＣＤ４、ＷＴ－ＣＤ４＝野生型ＣＤ４）の遺伝子型を定義する。パネルＢ：養子移入の前の磁性ビーズ精製ＣＤ４＋細胞の代表的なＦＡＣＳ分析。プロットは、汚染するレシピエントＣＤ４５．１＋細胞が無い場合、高純度のＣＤ４＋細胞を示す。パネルＣ：失敗したｓｃｕｒｆｙ救済（ｃＳｆ－ＣＤ４ ＶＣＮ＜２）及び成功したｓｃｕｒｆｙ救済（ｃＳｆ－ＣＤ４＞３）における活性化された脾臓のＣＤ４細胞の比較。パネルＤ：レシピエントマウスにおけるＣＤ４活性化（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－）を抑制しないｃＳｆ－ＣＤ４産物（ＶＣＮ＜２）の特徴。

【図16B-D】パネルＡ～Ｄ。（図１２に対応する）：パネルＡ：養子移入のためのＣＤ４精製細胞産物の特徴「アーム」はレシピエント新生児（ｓｃｕｒｆｙ［Ｓｆ］または野生型［ＷＴ］＋注入された細胞産物（ＰＢＳ＝偽ＰＢＳ注入、Ｓｆ－ＣＤ４＝未修正ｓｃｕｒｆｙＣＤ４、ｃＳｆ－ＣＤ４＝修正ＳｃｕｒｆｙＣＤ４、ＷＴ－ＣＤ４＝野生型ＣＤ４）の遺伝子型を定義する。パネルＢ：養子移入の前の磁性ビーズ精製ＣＤ４＋細胞の代表的なＦＡＣＳ分析。プロットは、汚染するレシピエントＣＤ４５．１＋細胞が無い場合、高純度のＣＤ４＋細胞を示す。パネルＣ：失敗したｓｃｕｒｆｙ救済（ｃＳｆ－ＣＤ４ ＶＣＮ＜２）及び成功したｓｃｕｒｆｙ救済（ｃＳｆ－ＣＤ４＞３）における活性化された脾臓のＣＤ４細胞の比較。パネルＤ：レシピエントマウスにおけるＣＤ４活性化（ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－）を抑制しないｃＳｆ－ＣＤ４産物（ＶＣＮ＜２）の特徴。

【図17】パネルＡ及びＢ。図１３に対応する。ヒト化ＮＳＧマウスのヒト造血系統のフローサイトメトリーの特徴。パネルＡ：脾臓（ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｄ４＋ＣＤ２５＋）、骨髄（ＣＤ３３＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋、ＣＤ３４＋）及び胸腺（ＤＮ、ＤＰ、ＣＤ８ ＳＰ、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）における定義された各集団について、ゲーティングが示される。パネルＢ：ＮＳＧ骨髄における移植されたヒト細胞の系統分布。百分率は、各系統の相対寄与を総ｈＣＤ４５＋細胞の百分率として表す。ｎ＝２つの独立実験からプールされたマウス１３匹。

【図18A】パネルＡ～Ｃ。（図１３に対応する）。内因性及びウイルス性ＣＮＳ２のメチル化分析。パネルＡ：ＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２内の９つのＣｐＧ部位でのメチル化された読み出しの百分率が、ＦｏｘＰ３ ＬＶ修飾ＣＤ３４＋細胞を用いてヒト化されたＮＳＧマウスからソートされたＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ細胞について示される。値は、雌の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を用いた２つの独立実験について示される。上の行は、内因性ＣＮＳ２に関するメチル化された読み出しの絶対数を示す。真ん中の行は、２Ｘ染色体のベースライン５０％のメチル化を占める内因性ＣＮＳ２に関する正規化された読み出しを示す。下の行は、ウイルス性ＣＮＳ２におけるメチル化された読み出しの百分率を示す。パネルＢ：ＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２メチル化分析のための分析コントロール。ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ ＬＶゲノムをコードするプラスミドＤＮＡがポジティブコントロールとしてＣｐＧメチルトランスフェラーゼで処理された一方、未処理のｃＤＮＡ ＬＶプラスミドはネガティブコントロールとして使用された。ウイルス性ＣＮＳ２部位のためにパイロシークエンシングプライマーを用いたＣｐＧメチル化について、試料を分析した。コントロールはパイロシークエンシングメチル化分析の能力を実証し、ウイルス性ＣＮＳ２プライマーを有する各ＣｐＧ部位で全範囲のメチル化を検出する。パネルＣ：ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターが形質導入されたＪｕｒｋａｔ及びＭＴ２細胞における内因性及びウイルス性ＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２のメチル化分析。

【図18BC】パネルＡ～Ｃ。（図１３に対応する）。内因性及びウイルス性ＣＮＳ２のメチル化分析。パネルＡ：ＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２内の９つのＣｐＧ部位でのメチル化された読み出しの百分率が、ＦｏｘＰ３ ＬＶ修飾ＣＤ３４＋細胞を用いてヒト化されたＮＳＧマウスからソートされたＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ細胞について示される。値は、雌の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を用いた２つの独立実験について示される。上の行は、内因性ＣＮＳ２に関するメチル化された読み出しの絶対数を示す。真ん中の行は、２Ｘ染色体のベースライン５０％のメチル化を占める内因性ＣＮＳ２に関する正規化された読み出しを示す。下の行は、ウイルス性ＣＮＳ２におけるメチル化された読み出しの百分率を示す。パネルＢ：ＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２メチル化分析のための分析コントロール。ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ ＬＶゲノムをコードするプラスミドＤＮＡがポジティブコントロールとしてＣｐＧメチルトランスフェラーゼで処理された一方、未処理のｃＤＮＡ ＬＶプラスミドはネガティブコントロールとして使用された。ウイルス性ＣＮＳ２部位のためにパイロシークエンシングプライマーを用いたＣｐＧメチル化について、試料を分析した。コントロールはパイロシークエンシングメチル化分析の能力を実証し、ウイルス性ＣＮＳ２プライマーを有する各ＣｐＧ部位で全範囲のメチル化を検出する。パネルＣ：ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターが形質導入されたＪｕｒｋａｔ及びＭＴ２細胞における内因性及びウイルス性ＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２のメチル化分析。

【発明を実施するための形態】

【0052】

各種実施形態では、ＦｏｘＰ３の生理的遺伝子発現を調節するために内因性遺伝子エレメントを用いてＦｏｘＰ３を発現するレンチウイルスベクター及びこのようなベクターの使用を提供する。特に、各種実施形態では、ＦｏｘＰ３（例えば、ＩＰＥＸ疾患）の遺伝子欠損を治療するか、または他の自己免疫及び自己炎症性症状（例えば、炎症性腸疾患、１型糖尿病、ＳＬＥ、ＪＲＡ、多発性硬化症など）を治療するコドン最適化されたＦｏｘＰ３遺伝子またはｃＤＮＡを発現するために、ヒトＦｏｘＰ３遺伝子自体由来の内因性転写制御エレメントを用いるレンチウイルスベクターを提供する。これらのベクターを使用して、これらの配列を自己造血幹細胞に導入し、適切な成熟リンパ球におけるＦｏｘＰ３遺伝子産物の正常な生理的発現パターンを再現することができる。

【0053】

この方法は、非特異的なエンハンサー／プロモーターを使用して、複数の血液細胞型における異所性発現に至るかつ不要な効果につながるであろうこれらの遺伝子の構成的発現を引き起こす遺伝子導入ベクターとは対照的である。内因性転写制御エレメントを使用すると、遺伝子の精密で、正確で、的確な発現に至り、発現の正常なパターンが模倣される。例えば、後述するように、これにより有意な治療効果と種々の臨床状況が生まれると考えられている。

【0054】

スカルフィンとしても知られるＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスＰ３）は、免疫系応答に関与するタンパク質である（Ｂｒｕｎｋｏｗ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７（１）：６８－７３）。ＦＯＸタンパク質ファミリーのメンバーであるＦＯＸＰ３は、制御性Ｔ細胞の発生及び機能における調節経路のマスターレギュレーターとして機能するように見える（例えば、Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９（５６０９）：１０５７－１０６１；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４（４）：３３０－３３６；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２２（３）：３２９－３４１を参照）。一般に、制御性Ｔ細胞は免疫応答を下降させる。自己免疫疾患において、制御性Ｔ細胞の欠損は他の自己免疫細胞が体自身の組織を攻撃することを許容し得る（例えば、Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５３１－５６４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１１（３）：５９０－５９７を参照）。

【0055】

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は免疫応答を調節し、免疫寛容を維持する際に中心的な役割を果たす。Ｔｒｅｇ養子移入治療は、種々の免疫障害に対する臨床治療を提供することが期待されている（例えば、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２１２：８－２７；Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ，１３３（５）：７７５－７８７；Ｌｉｓｔｏｎ ａｎｄ Ｇｒａｙ（２０１４）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４（３）：１５４－１６５を参照）。Ｔｒｅｇは主に２つの異なる経路で発生する。１つ目は、高親和性を有する胸腺抗原提示による胸腺におけるＴｒｅｇ前駆細胞からの直接発生である。このＴｒｅｇは内在性Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）または胸腺Ｔｒｅｇ（ｔＴｒｅｇ）と呼ばれる。２つ目は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）－βでの抗原提示による末梢でのナイーブＣＤ４ Ｔ細胞からの分化である。このＴｒｅｇはｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）または末梢での誘導性Ｔｒｅｇ（ｐＴｒｅｇ）と呼ばれる（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８（１２）：１８７５－１８８６；Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚ ａｎｄ Ｒｕｄｅｎｓｋｙ（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３０（５）：６１６－６２５を参照）。両Ｔｒｅｇは類似の抑制活性を有し、Ｔｒｅｇに対するマスター転写因子であるフォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）を顕著に発現する。Ｔｒｅｇサイン遺伝子を発現し、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）遺伝子を抑制することによるＴｒｅｇ機能の分化及び維持には、ＦｏｘＰ３発現が必要である（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７（１）：２０－２１；Ｈｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９（５６０９）：１０５７－１０６１；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（４）：３３０－３３６；Ｂｅｔｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２（１４）：５１３８－５１４３；Ｉｃｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３（２５）：１７００３－１７００８を参照）。

【0056】

Ｔ_ｒｅｇ細胞の機能の低下はヒト及びマウスにおける種々の自己免疫障害に関連する（Ｐａｕｓｔ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ（２００５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０４：１９５－２０７）。ＦｏｘＰ３発現のレベルの低下はＴ_ｒｅｇ機能の障害と相関し、重症筋無力症及び多発性硬化症などの自己免疫疾患において見られた（例えば、Ｈｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８１：４５－５２；Ｂａｌａｎｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｌｏｏｄ，１０５：７３５－７４１）。Ｔ_ｒｅｇ機能の最も顕著な欠損がヒト自己免疫疾患ＩＰＥＸ（免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）及びｓｃｕｒｆｙマウスにおける相当する疾患において観察される（例えば、Ｌｅｖｙ－Ｌａｈａｄ ａｎｄ Ｗｉｌｄｉｎ（２００１）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１３８：５７７－５８０；Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．１３８：１３７９－１３８７）。罹患している男性は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞に媒介された致死的な多臓器リンパ増殖性疾患を発症する（例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２５４６－２５５４；Ｂｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３７６４－３７７４を参照）。その機能に影響を及ぼすＦｏｘＰ３遺伝子における突然変異が、ＩＰＥＸ及びｓｃｕｒｆｙ疾患の分子的機序であることが分かった。

【0057】

前述したことを考慮すると、ＦｏｘＰ３発現が欠損した哺乳類において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）機能を回復するために、本明細書に記載されるＦｏｘＰ３を発現するレンチウイルスベクターを効果的に使用することができると考えられる。同様に、対象における自己免疫障害を治療するために、本明細書に記載されるＦｏｘＰ３を発現するレンチウイルスベクターを効果的に使用することができると考えられる．特定の実施形態では、自己免疫障害はＦｏｘＰ３発現及び／またはＦｏｘＰ３突然変異の減少を特徴とする自己免疫障害である。例示的な自己免疫障害は重症筋無力症、多発性硬化症、ＩＰＥＸ（免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）、自己免疫関節炎などを含むが、これらに限定されない。

【0058】

一般に、これら方法は、自己造血幹細胞にレンチウイルスベクターの配列を導入するために、内因性ＦｏｘＰ３プロモーター（及びある特定の実施形態では、ＦｏｘＰ３エンハンサー（例えば、ＣＮＳ１及び／またはＣＮＳ２及び／またはＣＮＳ３））の制御下でＦｏｘＰ３遺伝子またはｃＤＮＡを含む、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターの使用に関連する。形質導入された細胞は、その細胞が適切な成熟リンパ球におけるＦｏｘＰ３遺伝子産物の正常な生理的発現パターンを再現する対象に再導入され、これにより疾患を寛解させるかつ／または治癒させる。

【0059】

各種実施形態では、組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）のベクターが提供され、当該ベクターは内因性ＦｏｘＰ３プロモーターに動作可能に連結したヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む発現カセットを含む。非限定的でないが、特定の例示的な実施形態では、前記ＬＶがＴＡＴ非依存性及び自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである。特定の実施形態では、ヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列はＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡを含む。特定の実施形態では、ヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１つ以上のＦｏｘＰ３エンハンサーエレメント（例えば、ＦｏｘＰ３－ＣＮＳ１及び／またはＦｏｘＰ３－ＣＮＳ２及び／またはＦｏｘＰ３－ＣＮＳ３）に動作可能に連結された。非限定的でないが、例示的なベクターを図６及び７に示す。一実施形態では、ベクターは表１に示される配列（配列番号１）を含む。

【0060】

本明細書に記載されるベクターを含むパッケージング細胞及び本明細書に記載されるベクターを用いて産生されたウイルス粒子も提供される。

【0061】

ＴＡＴ非依存性及び自己不活性化レンチウイルスベクター。
安全性を更に向上するために、各種実施形態では、本明細書に記載される、内因性プロモーターの制御下でヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードする核酸を含むＬＶがＴＡＴ依存性自己不活性化（ＳＩＮ）配位を含む。したがって、各種実施形態では、本明細書に記載されるＬＶにおいて、野生型ＬＴＲに対してプロモーター活性を低減したＬＴＲ領域を使用することが望ましい。バイオセイフティーの特徴を提供する効果的に「自己不活性化（ＳＩＮ）」するコンストラクトを提供することができる。ＳＩＮベクターは、形質導入された細胞における全長ベクターＲＮＡの産生がかなり低減するか、または一斉に無効にするものである。この特徴により複製可能なリコンビナント（ＲＣＲ）が吐き出されるリスクを最小化する。さらに、ベクター組込み部位に隣接する細胞のコード配列が異常に発現するリスクを減らす。

【0062】

ＳＩＮデザインにより、ＬＴＲと導入遺伝子の発現を引き起こしているプロモーターとの干渉の可能性が減る。ＳＩＮ ＬＶは内部プロモーターの全活性を許容することが多い。

【0063】

ＳＩＮデザインによりＬＶのバイオセイフティーが向上する。ＨＩＶ ＬＴＲの大部分はＵ３配列からなる。Ｕ３領域は感染細胞においてかつ細胞活性化に対応して、ＨＩＶゲノムの基本及び誘導性発現を調節するエンハンサー及びプロモーターエレメントを含む。これらのプロモーターエレメントのいくつかはウイルス複製に必要不可欠である。ウイルス単離菌のうち、エンハンサーエレメントのいくつかは高度に保存され、ウイルス性病原体において重要な病原性因子として関係づけられてきた。エンハンサーエレメントが作用し、ウイルスの異なる細胞の標的における複製率に影響を与え得る。

【0064】

ウイルス転写が５’ＬＴＲのＵ３領域の３’末端で開始する場合、これらの配列はウイルスｍＲＮＡの一部ではなく、３’ＬＴＲからのそのコピーは組み込まれたプロウイルスの両ＬＴＲの発生用テンプレートとして働く。レトロウイルスベクターコンストラクトにおいてＵ３領域の３’コピーが変化する場合、プロデューサー細胞においてインタクトな５’ＬＴＲからベクターＲＮＡが依然として産生されるが、標的細胞において再生され得ない。このようなベクターの形質導入により後代ウイルスにおいて両ＬＴＲが不活性化する。したがって、レトロウイルスは自己不活性化（ＳＩＮ）し、これらのベクターはＳＩＮ導入ベクターとして知られる。

【0065】

特定の実施形態では、ベクターＤＮＡ、すなわち、ベクターＲＮＡを産生するために用いられるＤＮＡの３’ＬＴＲのＵ３領域への欠損の導入により自己不活性化が達成される。ＲＴ時、この欠損はプロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲへ導入される。通常、Ｕ３配列を十分に排除すことにより、ＬＴＲの転写活性を一斉にかなり減少させるか、または無効にすることによって、形質導入された細胞における全長ベクターＲＮＡの産生をｋなり減少させるか、または無効にすることが望まれる。しかし、ウイルスＲＮＡのポリアデニル化、Ｕ３、Ｒ及びＵ５に通常、広がる機能に関与するＬＴＲのこれらのエレメントを保持することが一般的に望ましい。したがって、特定の実施形態では、ポリアデニル化決定要因を温存しながら、できるだけＬＴＲから転写的に重要なモチーフの多くを排除することが望ましい。

【0066】

ＳＩＮデザインがＺｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：９８７３－９８８０及び米国特許第５，９９４，１３６号に詳細に記述される。しかし、それらに記述されるように、３’ＬＴＲでの欠損の長さには制限がある。最初にＵ３領域の５’末端はベクター導入に必須の他の機能を果たすため、組込み（端末ジヌクレオチド＋ａｔｔ配列）に必要である。したがって、端末ジヌクレオチド及びａｔｔ配列は、欠損され得るＵ３配列の５’境界を表してもよい。加えて、いくらか緩やかに定義された領域は、Ｒ領域における下流のポリアデニル化部位の活性に影響を与え得る。３’ＬＴＲからのＵ３配列の過剰な欠損により、プロデューサー細胞におけるベクターのタイター及び標的細胞における導入遺伝子発現の両方について有害な結果とともにベクター転写物のポリアデニル化が低減され得る。

【0067】

追加のＳＩＮデザインは米国公開公報第２００３／００３９６３６号に記述される。そこで記述されるように、特定の実施形態では、ＬＴＲから除去されたレンチウイルス配列が非レンチウイルスレトロウイルス由来の相当する配列と置き換えられ、ハイブリッドＬＴＲを形成する。特に、ＬＴＲ内のレンチウイルスＲ領域は、非レンチウイルスレトロウイルス由来のＲ領域と全体的にまたは部分的に置き換えることができる。特定の実施形態では、レンチウイルスＴＡＲ配列、ウイルスの複製を強化するためにＴＡＴタンパク質と相互作用する配列がＲ領域から、好ましくは全体的に除去される。次に、ＴＡＲ配列は非レンチウイルスレトロウイルス由来のＲ領域の相当する部分と置き換えられ、ハイブリッドＲ領域を形成する。ＬＴＲは更に修飾され、レンチウイルスＵ３及びＵ５領域の全部または一部を除去するか、及び／または非レンチウイルス配列と置き換えることができる。

【0068】

したがって、特定の実施形態では、ＳＩＮ構成によりそのＴＡＲ配列の全部または一部が欠如するハイブリッドレンチウイルスＲ領域を含むレトロウイルスＬＴＲが提供され、その結果、ＴＡＴにより任意に可能な活性化が排除され、ＴＡＲ配列またはそのタンパク質は非レンチウイルスレトロウイルス由来のＲ領域の相当する部分と置き換えられ、ハイブリッドＲ領域を形成する。具体的な実施形態では、レトロウイルスＬＴＲはハイブリッドＲ領域を含み、ハイブリッドＲ領域はＨＩＶ ＴＡＲ配列を欠いているＲ領域の一部（例えば、ＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる部分）及びＨＩＶ Ｒ領域からＴＡＲ配列が欠けていることに相当するＭｏＭＳＶ Ｒ領域の一部（例えば、２００３／００３９６３６の配列番号９に示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる部分）を含む。他の具体的な実施形態では、ハイブリッドＲ領域全体が２００３／００３９６３６の配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。

【0069】

Ｒ領域が誘導され得る好適なレンチウイルスは例えば、ＨＩＶ（ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）、ＥＩＶ、ＳＩＶ及びＦＩＶを含む。非レンチウイルス配列が誘導され得る好適なレトロウイルスは、例えば、ＭｏＭＳＶ、ＭｏＭＬＶ、Ｆｒｉｅｎｄ、ＭＳＣＶ、ＲＳＶ及びスプーマウイルスを含む。例示的な一実施形態では、レンチウイルスはＨＩＶであり、非レンチウイルスレトロウイルスはＭｏＭＳＶである。

【0070】

ＵＳ２００３／００３９６３６に記載された別の実施形態では、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは左側の（５’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流にプロモーター配列を更に含む。好適なプロモーターは起点が非レンチウイルスであり、例えば、非レンチウイルスレトロウイルス（例えば、ＭｏＭＳＶ Ｕ３領域）由来のＵ３領域を含む。特別の一実施形態では、Ｕ３領域はＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、左側の（５’）ＬＴＲはハイブリッドＲ領域の下流にレンチウイルスＵ５領域を更に含む。一実施形態では、Ｕ５領域はゲノムの組込みに必要なＨＩＶａｔｔ部位を含むＨＩＶ Ｕ５領域である。別の実施形態では、Ｕ５領域はＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、左側の（５’）ハイブリッドＬＴＲ全体はＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0071】

他の例示的な実施形態では、ハイブリッドＲ領域を含むＬＴＲは右側の（３’）ＬＴＲであり、ハイブリッドＲ領域の上流に修飾された（例えば、切断された）レンチウイルスのＵ３領域を更に含む。修飾されたレンチウイルスのＵ３領域はａｔｔ配列を含み得るが、染色体の組込みの後での複製の第１ラウンドをウイルスの転写が越えることができないという点で、プロモーター活性を有する任意の配列を欠き、ベクターをＳＩＮにさせ得る。特別の実施形態では、ハイブリッドＲ領域の上流の修飾されたレンチウイルスのＵ３領域は、レンチウイルスのＵ３ａｔｔ部位までかつそれを含むレンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）のＵ３領域の３’末端からなる。一実施形態では、Ｕ３領域はＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１５に示されるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、右側の（３’）ＬＴＲはハイブリッドＲ領域の下流にポリアデニル化配列を更に含む。別の実施形態では、ポリアデニル化配列はＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号１６に示されるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、右側の（５’）ＬＴＲ全体はＵＳ２００３／００３９６３６の配列番号２または１７に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0072】

したがって、ＨＩＶのＬＶの場合、このようなベクターがベクタータイターの著しい減少なしでＬＴＲ ＴＡＴＡボックス（例えば、－４１８から－１８の欠損）の除去を含む顕著なＵ３欠損を許容することが発見された。これらの欠損によりＬＴＲの転写性能力が約９０％以下に減少したという点で、ＬＴＲ領域を実質的に転写的に不活性化する。

【0073】

導入ベクターコンストラクトにおいて上流のＬＴＲの一部が構成的に活性なプロモーター配列と置き換えられる場合、Ｔａｔのトランス作用性機能が不要になることも証明された（例えば、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３－８４７１を参照）。さらに、我々はトランスでのｒｅｖの発現が、ｇａｇ及びｐｏｌのみを含有するパッケージングコンストラクトからの高タイターのＨＩＶ由来ベクター系統の産生が許容されることを示す。このデザインは相補性を条件として、パッケージング機能の発現をプロデューサー細胞においてのみ利用可能にする。得られる遺伝子デリバリーシステムはＨＩＶ－１の９つの遺伝子のうちの３つのみを保存し、形質導入粒子の産生のため、４つの別々の転写性ユニットに依存する。

【0074】

実施例１で例示される一実施形態では、内因性ＦｏｘＰ３プロモーターに動作可能に連結されたＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ及び任意にＦｏｘＰ３制御性制御エレメントを発現するカセットは、ｐＣＣＬ ＬＶ骨格に存在し、その骨格は５’ＬＴＲにおいて置換されるＣＭＶエンハンサー／プロモーターを有するＳＩＮベクターである。

【0075】

ＣＭＶプロモーターが通常、高レベルの非組織特異的な発現を提供すると認識される。類似の構成型活性を有する他のプロモーターはＲＳＶプロモーター及びＳＶ４０プロモーターを含むが、これらに限定されない。β－アクチンプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、延長因子１αプロモーター－、チューブリンプロモーターなど哺乳類のプロモーターも使用され得る。

【0076】

前述のＳＩＮ構成は例示的であり、非限定的である。多くのＳＩＮ構成は当業者に既知である。上記のように、特定の実施形態では、ＬＴＲ転写は約９５％～約９９％だけ減少する。特定の実施形態では、ＬＴＲは、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％転写的に不活性化し得る。

【0077】

パッケージングシグナル
各種実施形態では、本明細書に記載されるベクターはパッケージングシグナルを含む。「パッケージングシグナル」、「パッケージング配列」または「プサイ配列」は、配列がパッケージングシグナルをレトロウイルス粒子に含む核酸のパッケージングに向けるのに十分な任意の核酸配列である。この用語は天然に存在するパッケージング配列、更にはその設計された変異体を含む。レンチウイルスを含む多くの異なるレトロウイルスのパッケージングシグナルは、当該技術分野において既知である。

【0078】

Ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＬＶはＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含み、スプライシングされていないＲＮＡの核外移行を強化する。ＲＲＥは当業者に周知である。例示的なＲＲＥはＨＩＶ ＮＬ４－３ゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３８８７）における位置７６２２～８４５９に存在するＲＲＥ、ならびにＨＩＶまたは他のレトロウイルスの他の株からのＲＲＥを含むが、これらに限定されない。このような配列は、ＧｅｎｂａｎｋからまたはＵＲＬ ｈｉｖ－ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｉｎｄｅｘのデータベースからすぐに利用できる。

【0079】

セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）
各種実施形態では、本明細書に記載されるベクターはセントラルポリプリン配列を含む。レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）ベクターコンストラクトにおけるセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）を含む断片の挿入は、報告によれば、セントラルＤＮＡフラップを介してウイルスｃＤＮＡの核内移行を容易にすることにより、大幅に形質導入効率を向上することが知られている。

【0080】

発現刺激による転写後調節エレメント（ＰＲＥ）
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＬＶは、転写物内の転写後調節エレメントの存在によりタンパク質量で異種核酸（例えば、ヒトＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ）の発現を増加させる、様々な転写後調節エレメント（ＰＲＥ）のいずれかを含み得る。特定の実施形態では、特にレンチウイルスコンストラクトが中程度のプロモーターに関連する実施形態では、ＰＲＥが特に有用となり得る。

【0081】

１種類のＰＲＥは発現カセット内に配置されるイントロンであり、これは遺伝子発現を刺激することができる。しかし、イントロンはレンチウイルスのライフサイクル事象時、スプライシングされ得る。したがって、イントロンがＰＲＥのものとして用いられる場合、イントロンは通常、ベクターゲノム転写物に逆の配向に配置される。

【0082】

スプライシング事象に依存しない転写後調節エレメントは、ウイルスのライフサイクル時に除去されないという利点を提示する。いくつかの例は、単純ヘルペスウイルスの転写後プロセッシングエレメント、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。これらのうち、ＨＰＲＥにおいて見られない追加シス作用エレメントを含むため、ＷＰＲＥが通常、好ましい。この調節エレメントは通常、導入遺伝子の翻訳ユニットの終止コドンの外であるが、導入遺伝子のＲＮＡ転写物に含まれるようにベクター内に位置する。

【0083】

ＷＰＲＥは特徴があり、米国特許第６，１３６，５９７号に記載されている。それに記載されるように、ＷＰＲＥは核から細胞質にＲＮＡの効率的な輸送を媒介するＲＮＡ輸出エレメントである。シス作用性核酸配列の挿入により導入遺伝子の発現が向上し、エレメント及び導入遺伝子は単一の転写物内に含まれる。センス配向のＷＰＲＥの存在は、導入遺伝子発現を最大７～１０倍だけ増加させることを示した。レトロウイルス粒子の形成に導く一連の事象時、通常、イントロンがスプライシングで切り出されるため、レトロウイルスベクターが完全なイントロン含有遺伝子の代わりにｃＤＮＡの形態で配列を移行させる。イントロンは、スプライシング機構を有する一次転写物の相互作用を媒介する。スプライシング機構と輸送機構との連結のため、スプライシング機構によるＲＮＡのプロセシングによりそれらの細胞質の排出が容易になることから、ｃＤＮＡは非効率的に発現されることが多い。したがって、ベクターのＷＰＲＥの包含により、導入遺伝子の発現が向上される。

【0084】

インスレーターエレメント
特定の実施形態では、バイオセイフティーを更に高めるために、インスレーターが本明細書に記載されるＬＶに挿入される。インスレーターは、ゲノムの全体にわたって存在するＤＮＡ配列エレメントである。インスレーターはクロマチンを修正し、局所の遺伝子発現を変更するタンパク質を結合する。本明細書に記載されベクターにおけるインスレーターの配置により、１）隣接の染色体による発現の位置効果の斑入りからのベクターの遮蔽（すなわち、バリア活性）及び２）ベクターによる遺伝子発現の挿入性トランス活性化からの隣接の染色体の遮蔽（エンハンサーブロッキング）を含む種々の可能な利点が得られる。したがって、インスレーターはゲノムまたは遺伝子コンテクストに埋め込まれた遺伝子または転写単位の発現が当該ゲノムまたは遺伝子コンテクスト内の調節シグナルに影響され得る、遺伝子または転写単位の独立機能を保存するのに役立てることができる（例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ－Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６４３３；ａｎｄ Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照）。本コンテクストにおいて、インスレーターは組込み部位の効果からレンチウイルスを発現した配列の保護に寄与し得、これはゲノムＤＮＡに存在するシス作用性エレメントによって媒介され、導入された配列のデレギュレーションした発現を導き得る。各種実施形態では、一方または両方のＬＴＲあるいはインスレーター配列が細胞ゲノムに組み込まれるベクターの領域におけるそのほかの場所に挿入されるＬＶが提供される。

【0085】

第一及び最良の特徴がある脊椎動物クロマチンインスレーターは、ニワトリβ－グロビン遺伝子座制御領域内に位置する。このエレメントはＤＮａｓｅＩ過敏性部位－４（ｃＨＳ４）を含み、このエレメントはニワトリβ－グロビン遺伝子座の５’境界を構成するように見える（Ｐｒｉｏｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８：４０３５－４０４８）。ｃＨＳ４エレメントを含む１．２ｋｂの断片は、細胞株におけるグロビン遺伝子プロモーター及びエンハンサーの相互作用を遮断する能力（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ，７４：５０５－５１４）、ならびにショウジョウバエ（Ｉｄ．）、形質転換細胞（Ｐｉｋａａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１２：２８５２－２８６２）及びトランスジェニック哺乳類（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２３９－２４３；Ｔａｂｏｉｔ－Ｄａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．，８：２２３－２３５）における発現カセットを位置効果から保護する能力を含む標準的なインスレーター活性を示す。この活性の多くは２５０ｂｐの断片に含まれる。この伸展内に亜鉛フィンガーＤＮＡ結合タンパク質ＣＴＣＦと相互作用する４９ｂｐのｃＨＳ４コア（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９４：５７５－５８０）は、エンハンサーブロッキング分析（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ，９８：３８７－３９６）と関係づけられる。

【0086】

例示的で公的なインスレーターはＦＢ（ＦＩＩ／ＢＥＡＤ－Ａ）、すなわち７７ｂｐのインスレーターエレメントであり、これはニワトリβ－グロビン５’ＨＳ４インスレーターの最小ＣＴＣＦ結合部位エンハンサーブロッキング成分、ならびにＲａｍｅｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２６：３２５７－３２６６に記載のヒトＴ細胞レセプターα／δブロッキングエレメントα／δＩ（ＢＥＡＤ－Ｉ）インスレーター由来の相同領域を含む。ＦＢ「合成」インスレーターは完全なエンハンサーブロッキング活性を有する。このインスレーターは例示的であり、非限定的である。他の好適なインスレーターが用いられ、例えば、全長ニワトリβ‐グロビンＨＳ４またはそのインスレーターサブ断片、アンキリン遺伝子インスレーター及び他の合成インスレーターエレメントを含む。

【0087】

特定の実施形態では、Ｕ３領域に含まれるＡ２インスレーターがある。

【0088】

形質導入された宿主細胞及び細胞形質導入の方法
本明細書に記載される組換えＬＶ及び得られるウイルスは、核酸（例えば、ヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードする核酸）配列を哺乳類の細胞に導入することができる。細胞への送達のために、本発明のベクターは好適なパッケージング細胞株とともに使用されるか、または必要なレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ）を含む他のベクタープラスミドとともにｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に同時トランスフェクトし、本発明のベクターをパッケージして、細胞を感染することができる複製不全ウイルス粒子形成することが好ましい。

【0089】

本明細書に記載される組換えＬＶ及び得られるウイルスは、核酸（例えば、ヒトＦｏｘＰ３タンパク質をコードする核酸）配列を哺乳類の細胞に導入することができる。細胞への送達のために、本発明のベクターは通常、好適なパッケージング細胞株とともに使用されるか、または必要なレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ及びｐｏｌ）を含む他のベクタープラスミドとともにｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に同時トランスフェクトし、本発明のベクターをパッケージして、細胞を感染することができる複製不全ウイルス粒子形成する。

【0090】

ベクターは通常、パッケージング細胞株にトランスフェクションにより導入される。パッケージング細胞株はベクターゲノムを含むウイルス粒子を産生する。トランスフェクションの方法は当業者には周知である。パッケージングベクター及び導入ベクターのパッケージング細胞株への同時トランスフェクション後、組み換えウイルスを培地から回収し、当業者により用いられる標準方法によりタイターを測定した。したがって、パッケージングコンストラクトは一般にはネオマイシン、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼなどの優性選択マーカーとともに、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法によりヒト細胞株に導入し、その後、クローンの適切な薬剤及び単離の存在下で選択する。特定の実施形態では、選択マーカー遺伝子はコンストラクトにおけるパッケージング遺伝子に物理的に連結され得る。

【0091】

パッケージング機能が好適なパッケージング細胞により発現されるように構成される安定な細胞株が知られている（例えば、米国特許第５，６８６，２７９号を参照し、これにはパッケージング細胞が記載される）。一般に、ウイルス粒子の産生のために、レンチウイルスＧａｇ及びＰｏｌ遺伝子の発現と適合性がある任意の細胞またはこのような発現を支持するように操作され得る任意の細胞を使用してもよい。例えば、２９３Ｔ細胞及びＨＴ１０８０細胞などのプロデューサー細胞が使用されてもよい。

【0092】

パッケージング細胞に取り込まれるレンチウイルスベクターとともにパッケージング細胞は、プロデューサー細胞を形成する。したがって、プロデューサー細胞は対象となる治療遺伝子（例えば、ヒトＦｏｘＰ３遺伝子またはｃＤＮＡ）を運ぶパッケージ化された感染性ウイルス粒子を生成するか、または放出することができる細胞または細胞株である。これらの細胞がガラスまたはプラスチックなどの表面に付着する場合、これらの細胞が成長するか、残存するか、または最適に機能を維持することを意味する足場依存性が更にあり得る。レンチウイルスベクターが複製可能な場合、レンチウイルスベクターパッケージング細胞として使用される足場依存性細胞株のいくつかの例は、ＨｅＬａまたは２９３細胞及びＰＥＲＣ．６細胞である。

【0093】

したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターを含むウイルス粒子に細胞を接触することを含む、細胞のゲノムに組み込まれる細胞に遺伝子を供給する方法が提供される。細胞（例えば、組織または器官の形状で）はウイルス粒子にｅｘ ｖｉｖｏで接触され（例えば、感染する）、遺伝子（例えば、ＦｏｘＰ３遺伝子またはｃＤＮＡ）が発現される対象（例えば、哺乳類、動物またはヒト）に供給され得る。各種実施形態では、細胞は対象（すなわち、対象から）に自家移植され得るか、または対象に自家移植され得ない（すなわち、同種または異種間）。さらに、本明細書に記載されるベクターを分割及び非分割細胞に供給することができるため、細胞は例えば、骨髄細胞、間葉系幹細胞（例えば、脂肪組織から得られる）、ならびにヒト及び動物供給源から誘導される他の一次細胞を含む幅広い系統由来であり得る。あるいは、ウイルス粒子はｉｎ ｖｉｖｏで対象または対象の局限された範囲（例えば、骨髄）に直接投与され得る。

【0094】

勿論、上記のように、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターは、ヒト造血前駆細胞または造血幹細胞の形質導入、骨髄、末梢血または臍帯血液から得られたいずれか、ならびにＣＤ４^＋Ｔ細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞などの形質導入において特に有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的はＣＤ３４^＋細胞である。特定の実施形態では、特に好ましい標的はＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－細胞である。

【0095】

遺伝子治療
さらに他の実施形態では、本発明は造血幹細胞を含むヒト細胞の集団を前記レンチウイルスベクターの１つと、前記集団におけるヒト造血前駆細胞の形質導入をベクターにより引き起こす条件下で接触させることを含む、ヒト造血幹細胞に形質導入する方法に関する。幹細胞は最終的な用途に応じて、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入されてもよい。ヒト幹細胞の遺伝子治療などのヒト遺伝子治療との関係においても、幹細胞にｉｎ ｖｉｖｏで形質導入し、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入し、その後、ヒトコントロールに形質導入された幹細胞を注入してもよい。この実施形態の一態様では、ヒト幹細胞は当業者に周知の方法を用いて、ヒト、例えば、ヒト患者から除去され、上記のように形質導入され得る。次に、形質導入された幹細胞を同一または異なるヒトに再導入する。

【0096】

幹細胞／前駆細胞遺伝子治療
各種実施形態では、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターは、ヒト造血前駆細胞または造血幹細胞（ＨＳＣ）の形質導入、骨髄、末梢血または臍帯血液から得られたいずれか、ならびにＣＤ４^＋Ｔ細胞、末梢血ＢまたはＴリンパ球細胞などの形質導入において特に有用である。特定の実施形態では、特に好ましい標的はＣＤ３４^＋細胞である。特定の実施形態では、好ましい標的はＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－細胞である。

【0097】

特定の実施形態では、細胞、例えば、ＣＤ３４^＋細胞、樹状細胞、末梢血細胞または腫瘍細胞にｅｘ ｖｉｖｏで形質導入される場合、一般に、１×１０^５～５０×１０^５にも相当する１～５０の多重感染度（ＭＯＩ）で細胞１０^５個あたりウイルスベクターのユニットを形質導入する順番で、ウイルス粒子が当該細胞と共にインキュベートされる。これは、ＭＯＩ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５及び５０に相当するベクターの量を含み得る。通常、ベクターの量はＨＴ－２９形質導入単位（ＴＵ）の観点から発現され得る。

【0098】

特定の実施形態では、細胞に基づく治療は幹細胞及び／または造血前駆体を提供することを伴い、ＦｏｘＰ３タンパク質を発現する核酸をコードするレンチウイルスを細胞に形質導入し、その治療を必要とする対象（例えば、ＦｏｘＰ３欠損及び／または突然変異を有する対象、例えば、自己免疫不全を有する対象）に形質導入された細胞を導入する。

【0099】

特定の実施形態では、当該方法は、細胞、例えば、対象由来の幹細胞の集団を単離することを伴い、任意に組織培養において細胞を拡大して、細胞内のレンチウイルスベクターの存在によりｉｎ ｖｉｔｒｏでＦｏｘＰ３を産生するレンチウイルスベクターを投与する。次に、細胞を対象に戻し、例えば、細胞はＦｏｘＰ３を産生する白血球の集団を提供し、それによりＦｏｘＰ３欠損及び／または突然変異を修正することができる。特定の実施形態では、内因性プロモーターの存在に関して、更に特定の実施形態では、内因性エンハンサー（例えば、ＦｏｘＰ３の保存された非コード配列１（ＦｏｘＰ３－ＣＮＳ１）及び／またはＦｏｘＰ３の保存された非コード配列２（ＦｏｘＰ３－ＣＮＳ２）及び／またはＦｏｘＰ３の保存された非コード配列３（ＦｏｘＰ３－ＣＮＳ３））に関して、ＦｏｘＰ３発現はＦｏｘＰ３の正常な生理的発現を繰り返す。

【0100】

いくつかの実施形態では、細胞の集団を使用することができ、この細胞は細胞株由来または対象以外の個体由来の細胞でもよい。対象から幹細胞、免疫系細胞などを単離し、対象にその細胞を戻す方法が当該技術分野において周知である。このような方法が、化学療法を受けている患者に、例えば、骨髄移植、末梢血幹細胞移植などのために使用される。

【0101】

幹細胞が使われる場で、このような細胞が骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、動員末梢血幹細胞（ｍＰＢＳＣ）などを含む多くの供給源から誘導され得ることが認識される。特定の実施形態では、人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の使用が検討される。造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離し、このような細胞に形質導入され、哺乳類の対象に導入する方法は当業者に周知である。

【0102】

特定の実施形態では、本明細書（図６及び７、ならびに配列番号１を参照）に記載されるレンチウイルスベクターが欠損したまたは不完全なＦｏｘＰ３発現を特徴とする条件に対する幹細胞遺伝子治療で、例えば、本明細書に記載される自己免疫性疾患を有する患者の骨髄幹細胞にＦｏｘＰ３タンパク質コードする核酸を導入した後、自家移植することによって使用される。

【0103】

ベクターの直接導入
特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクターの直接導入による対象の直接治療が検討される。レンチウイルス組成物は非経口で（例えば、静脈内）、皮内で、皮下で、経口で（例えば、吸入）、経皮で（局所的）、経粘膜で、直腸で及び膣を含むが、これらに限定されない任意の使用可能な経路で送達のために調製され得る。送達の一般的に用いられる経路は吸入、非経口及び経粘膜を含む。

【0104】

各種実施形態では、医薬組成物は薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて、ＬＶを含み得る。本明細書に使用されるように「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、医薬品の投与と適合する溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗カビ剤、等張及び吸収遅延剤などを含む。補助活性化合物も当該組成物に組み込むことができる。

【0105】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性薬剤、すなわち、レンチウイルスベクター、ウイルス粒子など及び／またはベクターを共に投与される他の薬剤は、インプラント及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む制御放出製剤などの、体からの迅速な排除から当該化合物を保護するキャリアとともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解可能な生体適合性ポリマーを使用することができる。このような組成物の調製方法は、当業者に明らかである。好適な材料もＡｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソームも薬学的に許容されるキャリアとして使用することができる。これらは例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように当業者に既知の方法に従って調製することができる。いくつかの実施形態では、当該組成物は特定の細胞型にまたはウイルスに感染している細胞を標的とする。例えば、組成物は単クローン抗体を用いて細胞表面マーカー、例えば、感染細胞の表面に発現する内因性マーカーまたはウイルス抗原を標的とし得る。

【0106】

投与の容易さ及び投与量の均一性のための単位剤形で組成物を調製することが有利である。本明細書で使用される「単位剤形」とは治療される対象に単位投与量として適する物理的に別々の単位を意味する。医薬キャリアに関連して所望の治療効果を生むために、各単位は算出されたＬＶの所定量を含む。

【0107】

単位投与量は単回注入として投与される必要はないが、設定された期間の持続注入を含んでもよい。本明細書に記載されるＬＶの単位投与量は、ＨｅＬａまたは２９３などの細胞株上のベクターをタイター測定することにより定義されるレンチウイルスベクターの形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）の観点から、好都合に記載されてもよい。特定の実施形態では、単位投与量は１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３Ｔ．Ｕ．以上の範囲で変動し得る。

【0108】

医薬組成物は必要に応じて、種々の間隔及び様々な期間で、例えば、約１～約１０週間、約２～約８週間、約３～約７週間、約４週間、約５週間、約６週間などで週あたり１回投与され得る。不定の基準で治療組成物を投与することが必要になり得る。当業者は、特定の要因が対象の疾患または障害の重症度、以前の治療、公衆衛生及び／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むが、これらに限定されない対象を効果的に治療するために必要とする投与量及びタイミングに影響を与え得ることを理解する。ＬＶを有する対象の治療は単一治療を含むか、または多くの場合、一連の治療を含み得る。

【0109】

遺伝子治療ベクターの投与のための代表的な投与量及び好適な投与量を決定する方法は当該技術分野において既知である。ＬＶの適切な投与量が特定のレシピエント及び投与様式に依存し得ることが更に理解される。任意の特定の対象に適切な投与量レベルは、対象の年齢、体重、公衆衛生、性及び食事、投与時間、投与経路、排泄の割合、他の投与された治療薬などを含む様々な要因に依存し得る。

【0110】

特定の実施形態では、レンチウイルス遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注入、局所投与または定位注入により対象に供給され得る（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３０５４を参照）。特定の実施形態では、ベクターは経口的にまたは吸入で供給され、カプセル化されるか、または他の方法で操作され、分解から当該ベクターを保護し、組織または細胞への取り込みを向上させてもよい。医薬製剤は許容される希釈液中のＬＶを含むか、またはＬＶが包埋される徐放マトリックスを含み得る。代替的にまたは加えて、本明細書に記載されるレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターの場合のようにベクターが組換え細胞から無処置で産生され得る場で医薬製剤はベクターを生成する１つ以上の細胞を含み得る。本明細書に記載されるＬＶを含む医薬組成物は投与のための指示書とともに任意に容器、パックまたはディスペンサーに含まれ得る。

【0111】

前記組成物、方法及び使用は例示的であり、限定されないことを意図する。本明細書に提供される教示を用いて、当該組成物、方法及び使用に関する他の変形形態は当業者に容易に利用できる。

【実施例】

【0112】

以下の実施例は、請求された発明を制限しないが、例示するために提供される。

【0113】

実施例１
ｐＣＣＬ－ＣＮＳｐ－ＦＯＸＰ３－３ＵＴＲ－Ａ２ベクターの評価
図６及び７は、内因性ＦｏｘＰ３プロモーター及びエンハンサー（ＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３）の制御下でＦｏｘＰ３をコードするレンチウイルスベクターの構造を示す。特に、図６はｐＣＣＬ－ＣＮＳｐ－ＦＯＸＰ３－３ＵＴＲ－Ａ２ベクター（下表１にも示される配列番号１（接合マーカー由来の配列））の構造を示す。ヒトゲノム源の配列は、Ｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１９４－２０２に記載の配列に基づくが、同一ではない最小の配列であるＣＮＳ１（２３７ｂｐ）、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ（２００７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：１５４３－１５５１に記載されるＣＮＳ２（３５９ｂｐ）、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４７３：８０８－８１３に記載されるＣＮＳ３（２１７ｂｐ）、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ（２００７）、上記に記載される配列から修飾されるＦｏｘＰ３プロモーター（３８２ｂｐ）、ヒトゲノムＮＣＢＩ参照配列ファイルＮＭ＿０１４００９に基づく５’ＵＴＲ（１８７ｂｐ）、ヒトゲノムＮＣＢＩ参照配列ファイルＮＭ＿０１４００９に基づくＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ（１２９２ｂｐ）ヒトゲノムＮＣＢＩ参照配列ファイルＮＭ＿０１４００９に基づく３’ＵＴＲ（８７５ｂｐ）を含む。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【0114】

図１に示されるように、ＦｏｘＰ３レポーターベクターが上記コンストラクトに基づくことを示し、ヒト細胞株においてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示す。特に、パネルＡはＭＴ－２（Ｔ－ｒｅｇ様）、Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）及びＫ５６２（赤血球系）の３つの様々な細胞株における内因性ＦｏｘＰ３タンパク質発現のフローサイトメトリーの測定を示す。パネルＢはＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクターが形質導入されたＭＴ－２、ＪｕｒｋａｔまたはＫ５６２細胞におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポータータンパク質の発現を示す。ｙ軸はｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現に対して陽性である細胞の百分率を表し、ｘ軸は細胞１個あたりのベクターコピー数を表す。

【0115】

図２は、ＦｏｘＰ３レポーターベクターがマウス類遺伝子性移植片モデルにおいてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示すことを示す。ＣＤ４５．２ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰトランスジェニックマウス（ＦｏｘＰ３及びＧＦＰを同時発現する）が骨髄ドナーとして使われた。ＣＤ４５．２ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウスからＬｉｎ細胞を単離し、ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレセプターベクターを形質導入した。致死的に照射された類遺伝子性ＣＤ４５．１レシピエントに形質導入されたＬｉｎ細胞を移植した。Ｔｒｅｇ系統（ＦｏｘＰ３－ＧＦＰに特徴づけられる）におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクター発現について、移植後１０週目にＣＤ４５．２ドナー細胞を分析した。パネルＢに示されるように、移植したマウスの骨髄、脾臓及び胸腺のＦｏｘＰ３－（ＧＦＰ－）及びＦｏｘＰ３＋（ＧＦＰ＋）ドナー細胞においてｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーター発現を測定した。ｙ軸は各集団におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞の百分率を表す。

【0116】

図３は、ＦｏｘＰ３レポーターベクターがヒト化マウスモデルにおいてＴｒｅｇ系統特異的な発現を示すことを示す。ヒト臍帯血から単離したＣＤ３４＋細胞にＦｏｘＰ３ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターベクターを形質導入し、新生の免疫欠損ＮＳＧマウスに移植した。ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現について、移植後１２週間目に移植されたｈＣＤ４５＋細胞を分析した。パネルＢに示されるように、移植されたｈＣＤ４５＋細胞における系統特異的なｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現。ｈＣＤ４５＋細胞はＮＳＧ骨髄（ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３３＋骨髄系細胞、ＣＤ３４＋幹細胞及び前駆細胞、ならびにＣＤ３＋Ｔ細胞）、胸腺（ＣＤ４－ＣＤ８－ダブルネガティブ［ＤＮ］、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ［ＤＰ］、ＣＤ４ＣＤ８＋シングルポジティブ［ＣＤ８ＳＰ］、ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５－［ＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞］及びＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５＋［Ｔｒｅｇ］）及び脾臓（ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔｃｏｎｖ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞）において系統マーカーによってゲーティングされた。ヒストグラムは各系統内でｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を表す。点線は「ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高」に関するカットオフを示す。パネルは各ｈＣＤ４５＋系統におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高細胞の百分率を示す。データは異なる臍帯血ＣＤ３４＋ドナーを用いて２つの独立実験を表す。パネルＤはヒト化マウスにおけるＦｏｘＰ３及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの共発現を示す。移植されたＮＳＧＳＧＭ３マウス由来のヒトＣＤ４＋細胞をｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現に基づいてソートした後、細胞内染色及びＦｏｘＰ３発現に対するフローサイトメトリー解析が行われた。左側のパネルはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現によるヒトＣＤ４＋細胞のソーティングを示し、右側のパネルはソートされた集団内のＦｏｘＰ３発現を示す。

【0117】

図４は、ＦｏｘＰ３欠損マウスＨＳＣへの系統特異的なＦｏｘＰ３をコードするベクターの導入が機能的なＴｒｅｇ発生を回復することを示す。パネルＡは実験準備を示す。Ｌｉｎ細胞をＦｏｘＰ３欠損（ｓｃｕｒｆｙ）ドナーマウスから単離し、ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡ及びレポーターｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ両方を発現するＦｏｘＰ３コードベクターを形質導入した。致死的に照射されたＷＴ ＣＤ４５．１類遺伝子性レシピエントに形質導入されたＬｉｎ細胞を移植した。１２週間後、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞（「修正Ｔｒｅｇ」）をＴｒｅｇ抑制能力（パネルＢ）及びＴｒｅｇ表面マーカー発現（パネルＣ）について評価した。各実験について、ｓｃｕｒｆｙマウス由来の修正ＴｒｅｇをＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウス由来の天然ＧＦＰ＋Ｔｒｅｇと比較した。パネルＢに示されるように、ビーズ結合したＣＤ３／ＣＤ２８抗体の存在下でＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅバイオレット標識されたＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－レスポンダー細胞とともにソートされたＴｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ＝天然ＧＦＰ＋ＴｒｅｇまたはｃＴｒｅｇ＝修正ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｔｒｅｇ）を共培養した。１：１の比でＴｒｅｇをＴｒｅｓｐ細胞とともに培養した。培養４日後、各群の標識されたレスポンダー細胞の分割指数を算出することによってＴｒｅｇ抑制を求めた。データは１～２の複製ウェルからの平均＋／－ＳＥＭを表す。パネルＣ：ＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰマウス（上）または移植したＣＤ４５．２修正ドナーｓｃｕｒｆｙ細胞（下）由来の胸腺細胞。右側は各ゲートしたＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞集団（ＧＦＰ－、ＧＦＰ＋、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－またはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋）におけるＴｒｅｇ表面マーカー（ＣＤ２５、ＧＩＴＲ及びＣＴＬＡ４）の発現を示す。

【0118】

図５のパネルＡ～Ｅは、系統特異的なＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターがｓｃｕｒｆｙマウス（ＦｏｘＰ３欠損マウスモデル）を救済することができる機能的なＴｒｅｇを生成することを示す。パネルＡ：実験準備。ｓｃｕｒｆｙまたはＷＴ ＨＳＰＣ（ＣＤ４５．２）にＦｏｘＰ３レポーターベクターまたはＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターを形質導入し、致死的に照射された類遺伝子性（ＣＤ４５．１）レシピエントに移植した。移植後１２週目にドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞（推定上のＴｒｅｇを含む）を移植レシピエントの脾臓から精製し、ｓｃｕｒｆｙ新生児の肝臓内に注入した。ＣＤ４Ｔ細胞の移植後２１日目にｓｃｕｒｆｙ新生児の救出を評価した。パネルＢ：２１日目に救済したｓｃｕｒｆｙ新生児由来の脾臓のＣＤ４細胞。左図はＳｆ－Ｔｒｅｇ（未修正）を受け取ったｓｃｕｒｆｙマウスを示すが、右図はｃＳｆ－Ｔｒｅｇ（修正した）を受け取ったｓｃｕｒｆｙマウスを示す。ｙ軸はヒトＦｏｘＰ３発現（ＦｏｘＰ３ ＬＶによりコードされる）を示すが、ｘ軸はマウスＦｏｘＰ３発現（両ｓｃｕｒｆｙマウスで欠ける）を示す。パネルＣ：救済されたｓｃｕｒｆｙマウスまたはＷＴ同腹仔コントロールに対する脾臓対体重の比。パネルＤ：２１日目に救済されたｓｃｕｒｆｙ新生児における脾臓のＣＤ４ Ｔ細胞の表現型。赤色の囲みはＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ－（活性化）ＣＤ４ Ｔ細胞を強調し、青色の囲みはＣＤ４４－ＣＤ６２Ｌ＋（ナイーブ）ＣＤ４ Ｔ細胞を強調する。パネルＥ：２１日目に救済したｓｃｕｒｆｙ新生児の写真。白矢印は耳奇形の修正を強調する。

【0119】

実施例２
ＩＰＥＸ症候群のための造血幹細胞遺伝子治療
ＩＰＥＸ（免疫調節不全、多腺性内分泌障害、腸疾患、Ｘ連鎖性）症候群は、ＦＯＸＰ３、すなわち制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の発生及び機能に必要な系統決定転写因子における突然変異により生じる荒廃的な自己免疫疾患である。Ｔｒｅｇは自己反応性Ｔ細胞応答の抑制に重要であるため、ＩＰＥＸ患者におけるその機能不全が重度の自己免疫に繋がる。同種造血幹細胞（ＨＳＣ）移植は治効があり得るが、好適なドナーが利用不可能であることが多い。本実施例では、我々は自己由来ＨＳＣ移植に対する手法及び内因性調節エレメントの制御下で発生的に適切なＦｏｘＰ３発現を回復するためのレンチウイルスベクター（ＬＶ）を用いる遺伝子治療を実証する。マウス類遺伝子性移植モデル及びＬＶ修飾ＨＳＣを移植したヒト化マウスは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇに制限される高レベルのＬＶ発現を示す。ｓｃｕｒｆｙ（ＦｏｘＰ３ｎｕｌｌ）ＨＳＣのＬＶ形質導入はｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞増殖を抑制し、ｉｎ ｖｉｖｏでｓｃｕｒｆｙ自己免疫表現型を救済する機能的なＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの発生を回復する。これらの所見から自己由来ＨＳＣ移植によってＩＰＥＸ患者の治療への道を整え、異なる供給源の自己免疫不全の患者の新規な治療に対する有益な洞察を提供することができる。

【0120】

ここで、より具体的に、我々は生理的なＦｏｘＰ３発現を繰り返すヒトＦＯＸＰ３遺伝的エレメントによって調節されるＬＶの発生を説明する。マウス及びヒトＨＳＰＣへのこのベクターの導入によりＴｒｅｇ制限された発現がもたらされ、ＦｏｘＰ３欠損ＨＳＰＣから機能的なＴｒｅｇ発育を回復させる。我々はこの手法がｓｃｕｒｆｙマウス（ＩＰＥＸのＦｏｘＰ３ｎｕｌｌマウスモデル）の自己免疫表現型を治療することができる抑制性ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを発生することを実証する。加えて、健康なドナー由来のＬＶ修飾ヒトＨＳＰＣを移植したヒト化マウスモデルが高レベルのＴｒｅｇ特異的なＬＶ発現を示し、この方法がヒトＩＰＥＸ患者において同じように有効であり得ることを示唆している。

【0121】

結果
構成的に活性なプロモーターからの異所性ＦｏｘＰ３発現がＨＳＰＣ機能を弱める
現在までに成功している多くのＬＶベースの遺伝子療法では、構成的に活性なプロモーターを利用して治療用タンパク質の高レベルの発現を引き起こす。構成的ＦｏｘＰ３発現がＩＰＥＸ ＨＳＰＣ遺伝子治療に対する好適な手法であるかを決定するために、我々は最初にＨＳＰＣ移植及び機能に関する異所性ＦｏｘＰ３発現の効果を判定することを試みた。ここで、我々は高レベルのＦｏｘＰ３（ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）を発現するＬＶを利用し、その効果を制御ベクター（ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ）と比較した。ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰが形質導入されたマウスＬｉｎ細胞は、生存率への識別可能な効果が無しで成功しているＬＶ形質導入及び発現（約３０％ＧＦＰ＋細胞）を示した（図８、パネルＡ）。ＬＶ修飾細胞がマウスに移植された場合、循環ＣＤ４５．１＋（ドナー）ＧＦＰ＋細胞は移植後７日目に末梢血で容易に検出され（図８、パネルＢ）、細胞が初期移植が可能であったことを示唆している。しかし、初期の移植後期間（１０～２１日）は赤血球数の急速な減少、ならびに白血球及び血小板数を再構成しないことを特徴とし（図８、パネルＣ）、ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを用いて修飾されたＨＳＰＣを受け取るマウスにおいて死亡率６０％を得た（図８、パネルＤ）。ヒトＨＳＰＣへの構成的ＦｏｘＰ３発現の効果を決定するために、ＮＳＧ新生児はＭＮＤＵ３－ＧＦＰまたはＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰが形質導入された臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣでヒト化された。形質導入後３日目にＧＦＰ＋細胞において細胞死が観察されなかった（図８、パネルＥ）が、ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰを形質導入されたＨＳＰＣを受け取るマウスにおいて、末梢血におけるｈＣＤ４５＋細胞のＮＳＦ移植が顕著に損なわれた（図８、パネルＦ）。まとめると、これらの結果からＨＳＰＣにおけるＦｏｘＰ３の異所性発現が造血にネガティブに影響を及ぼすことが示唆されている。

【0122】

ＦｏｘＰ３発現のための系統特異的なレンチウイルスベクターの発生
異所性ＦｏｘＰ３発現を有する障害性造血の観察から、我々は発生的に適切なＦｏｘＰ３発現を与えるＬＶを設計することを考えた。このタスクを達成するための主な課題は、ＬＶゲノムサイズ８～１０ｋｂを超えない主要なＦＯＸＰ３調節エレメントを含み、これを超えると、ＬＶが低いタイター及び形質導入効率を呈する。内因性ＦｏｘＰ３発現を繰り返すために、我々はＦＯＸＰ３遺伝子内に以前に特徴づけられた３つの保存された調節領域、保存された非コード配列（ＣＮＳ）１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３を利用した（図９Ａ）。３つのＣＮＳエレメントはＦＯＸＰ３プロモーターから上流に加えられ、ＦＯＸＰ３ ３’ＵＴＲは発現カセットの後に加えられた（図９Ｂ）。場合により、安全性を向上し、発現の位置斑入りを低減するために、ウイルス３’ＬＴＲ領域に先に記述したエンハンサーブロッキングインスレーターエレメント（「Ａ２」）を加え（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１５）、このコンストラクトはＶＳＶ－Ｇ－偽型第３世代自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＶにクローニングした（Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８）。蛍光レポーターｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙのみ（「ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ」と称される）または２Ａエレメント結合（「ＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ」）によるＦＯＸＰ３ｃＤＮＡ及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの発現を起こすために、２つのＬＶはこのコンストラクトを使用して設計された。

【0123】

内因的に調節されたＬＶ ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙがＴｒｅｇ系統について高特異性を示す
我々は最初に異なる造血系統（Ｋ５６２［赤血球系、ＦｏｘＰ３－］、Ｊｕｒｋａｔ［Ｔｃｏｎｖ様、ＦｏｘＰ３－］及びＭＴ－２［Ｔｒｅｇ様、ＦｏｘＰ３＋］、図１０、パネルＡ）由来のヒト細胞株におけるＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターＬＶの特異性を評価した。フローサイトメトリーによる形質導入された細胞の分析では、非常に高いベクターコピー数（最大約２５コピー／細胞）でさえ、ＦｏｘＰ３－細胞型における発現の低い固有「漏れやすさ」を有するＦｏｘＰ３＋ＭＴ－２細胞に制限されるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現が明らかになった（図１０、パネルＢ）。高レベルのＦｏｘＰ３を正常に発現するＭＴ－２細胞において、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの平均蛍光強度（ＭＦＩ）はコピー数が増加すると比例的に増加した（図１０、パネルＢ）。これらの結果からＣＮＳ１２３ｐエレメントがＦｏｘＰ３＋細胞の非常に特異的な遺伝子発現を与え、不適当な細胞型において基本の発現を欠いていることが示唆されている。

【0124】

ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターＬＶのｉｎ ｖｉｖｏでの系統特異性を評価するために、我々は造血発生全体に形質導入されたＨＳＰＣ及びそれらの後代におけるＬＶ発現を評価するマウス類遺伝子性移植システムを使用した。ここで、我々はＦｏｘＰ３－ＧＦＰレポーターマウス（ＦｏｘＰ３及びＧＦＰを同時発現する）の骨髄由来のＣＤ４５．２系統マーカーネガティブ（ｌｉｎ）ＨＳＰＣにＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入し、類遺伝子性ＣＤ４５．１レシピエントに修飾細胞を移植した（図１０、パネルＣ）。移植後２０週目に、ドナーＣＤ４５．２細胞（図１４に示される系統ゲーティング）の造血系統においてｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を評価した。ここで、我々はＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙからのｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現が内因性ＦＯＸＰ３遺伝子由来のＧＦＰ発現と密接に整合することが分かった。ｃＫｉｔ＋ＨＳＰＣ、Ｂ２２０＋Ｂ細胞、Ｇｒ１＋顆粒球、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＧＦＰ－Ｔｃｏｎｖ細胞におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現は無視でき、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現はＴｒｅｇ系統（ＣＤ４＋ＧＦＰ＋）に制限された（図９、パネルＤ及びＥ）。これらの結果からＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの発現が造血発生全体に内因性ＦｏｘＰ３発現と非常に調和することが示唆されている。

【0125】

ｓｃｕｒｆｙマウス由来のＦｏｘＰ３欠損ＨＳＣのＬＶ修正は抑制性機能を有する機能的なＴｒｅｇを生成する
我々は、ＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ ＬＶがｓｃｕｒｆｙ（ＦｏｘＰ３欠損）ＨＳＣの生理的ＦｏｘＰ３発現の回復により機能的なＴｒｅｇ発生を可能にすることができるかどうかを判定した。ｓｃｕｒｆｙマウスはＦＯＸＰ３のフォークヘッド領域にフレームシフト突然変異を有し、自己免疫反応を抑制することができない非機能的（ＦｏｘＰ３－）Ｔｒｅｇを産生する。治療がない場合、ｓｃｕｒｆｙマウスは、出生後約２１日で胎生期リンパ増殖性疾患に屈する。したがって、十分な数のｓｃｕｒｆｙＨＳＣを得るために、新生児ｓｃｕｒｆｙマウス（ＣＤ４５．２）は出生時、ＷＴ脾細胞（ＣＤ４５．１）の注入により救出され、成体期に生き残った。機能的なＴｒｅｇ発生の回復を評価するために、我々はＣＤ４５．２ ＨＳＰＣの３つの異なる供給源である、（１）ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入したｓｃｕｒｆｙＬｉｎ細胞、（２）ＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入したｓｃｕｒｆｙＬｉｎ細胞及び（３）ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入したＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰＬｉｎ細胞のうちの１つを有するＷＴ ＣＤ４５．１レシピエントを移植した（図１１、パネルＡ）。

【0126】

事前の働きはｌｃｋ近位（胸腺細胞特異的）プロモーター下でのＦｏｘＰ３の過剰発現が胸腺リンパ球新生を大幅に変えることができることを示したため（Ｋｈａｔｔｒｉ ｅｔ ａｌ．２００１）、我々は最初に系統特異的なＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ ＬＶが胸腺細胞分化を変えるかどうかを判断した。ここで、再構成されたドナー胸腺細胞内の系統分布がＷＴ、ｓｃｕｒｆｙまたは修正ｓｃｕｒｆｙＨＳＣを移植したレシピエントマウスと異ならないことが分かり（図１１、パネルＢ）、ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡの系統特異的な回復により胸腺系統分布が変わらないことを示唆した。

【0127】

次に、我々はレシピエント胸腺における修正ｓｃｕｒｆｙ Ｔｒｅｇ（ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ）の頻度を評価した。ＷＴ ＦｏｘＰ３－ＧＦＰ ＨＳＣで再構成された移植レシピエントはＣＤ４シングルポジティブな（ＣＤ４ ＳＰ）集団内に３．７±０．６％（平均±ＳＤ）のＧＦＰ＋細胞を示したが、ＬＶ修正ｓｃｕｒｆｙＨＳＣで再構成されたレシピエントは２．１±０．４％のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞を示し、修正ｓｃｕｒｆｙＨＳＰＣがＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４ ＳＰ胸腺細胞を産生することを確認した（図１１、パネルＣ）。Ｔｒｅｇ表面マーカーの発現について、ＧＦＰ＋またはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋ドナー胸腺細胞を更に評価した。胸腺における未修正（ＦｏｘＰ３－）Ｓｆ－ＴｒｅｇをＷＴ－Ｔｒｅｇと比較して、Ｔｒｅｇ表面マーカーＣＤ２５及びＧＩＴＲの発現の減少を示した（図１１、パネルＣ）。対照的に、最高レベルのＬＶ発現（ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ高）を有するｃＳｆ－ＴｒｅｇはＷＴ－Ｔｒｅｇと同等のＣＤ２５及びＧＩＴＲ発現を示し、ＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙからのＦｏｘＰ３の発現が胸腺において表現型Ｔｒｅｇ発生を回復することを示唆した。

【0128】

次に、我々は脾臓のｃＳｆ－Ｔｒｅｇの抑制性機能を特徴づけた。３つの群の推定上のＴｒｅｇ（Ｓｆ－Ｔｒｅｇ、ｃＳｆ－Ｔｒｅｇ及びＷＴ－Ｔｒｅｇ）を移植レシピエントの脾臓からＦＡＣＳでソートし（図１１、パネルＤ）、サプレッサー：エフェクター比１：１でＷＴ ＣＤ４ Ｔ細胞増殖を抑制するそれらの能力について評価した（図１１、パネルＥ）。予想されるように、非修正（ＦｏｘＰ３－）Ｓｆ－Ｔｒｅｇはコントロール（Ｔｒｅｇなし）に対するＴ細胞増殖を抑制しなかった。しかし、ｃＳｆ－ＴｒｅｇはＷＴ－Ｔｒｅｇの有意な抑制性能力と同等のものを示し、ＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙが機能的な能力を有する修正Ｔｒｅｇを生成することを確認した。

【0129】

胸腺由来Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）に加えて、ＦｏｘＰ３も、Ｔｃｏｎｖが免疫寛容原性コンテクストにおける強いＴＣＲシグナルを受けるとき発生する末梢性Ｔｒｅｇ（ｐＴｒｅｇ）の生成において重要な役割を果たす（Ｃｕｒｏｔｔｏ ｄｅ Ｌａｆａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．２００４）。このプロセスはＴＧＦβの存在下でＦｏｘＰ３－Ｔｃｏｎｖ細胞のＴＣＲ刺激によりｉｎ ｖｉｔｒｏでシミュレーションされ、抑制性機能を有するＦｏｘＰ３＋誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）を生成することができる（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００３）。修正ｓｃｕｒｆｙＣＤ４ Ｔｃｏｎｖ細胞がｉＴｒｅｇを生成することができたかどうかを判定するために、ｃＳｆ Ｔｃｏｎｖ（ＣＤ４＋ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ）細胞またはＷＴ Ｔｃｏｎｖ（ＣＤ４＋ＧＦＰ－）細胞をＦＡＣＳでソートし、ＴＧＦβの存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて活性化した。ＴＧＦβでの活性化の４日後、ｃＳｆ Ｔｃｏｎｖは修正Ｓｆ－Ｔｃｏｎｖ細胞が新規ＦｏｘＰ３誘導をできることを実証するｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（図１１、パネルＦ）のロバスト誘導を示した。まとめると、我々のデータからｓｃｕｒｆｙＨＳＣのＬＶ修正が機能的なＴｒｅｇコンパートメントの生理的な回復を促進することが示唆されている。

【0130】

系統特異的なＦｏｘＰ３ ＬＶ（ＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ）はｓｃｕｒｆｙマウスを救出することができるＴｒｅｇを生成する
Ｔｒｅｇ機能の最もストリンジェントな検定は、自己免疫のｉｎ ｖｉｖｏでの抑制による新生児ｓｃｕｒｆｙマウスにおける臨床疾患サインを元に戻す能力である。このために、我々は最初にＬＶ修正ＬｉｎＨＳＰＣを新生児ｓｃｕｒｆｙマウスに移植することを試みた。新生児ｓｃｕｒｆｙマウスは５００Ｒａｄの全身放射（ＴＢＩ）で条件づけし、ＷＴ ＨＳＰＣ、未修正Ｓｆ ＨＳＰＣまたは修正Ｓｆ ＨＳＰＣのいずれかを腹腔内に注入した。ドナー細胞の検出可能な（低いが）移植にもかかわらず、すべてのアームにおいて長期生存は低く、ｓｃｕｒｆｙモデルの精製ＨＳＰＣ移植の低い有効性を示唆した（図１５）。

【0131】

ＷＴ ＨＳＰＣ（ＦｏｘＰ３十分なＨＳＰＣに対するポジティブコントロール）を移植されたｓｃｕｒｆｙマウスの生存の低さは、ＨＳＰＣが成熟Ｔｒｅｇを生成し、このモデルシステムにおける自己免疫応答を制御するずっと前に発生することができる不可逆多臓器自己免疫損傷の急速な発症によるものと推測された。したがって、我々は成熟ＴｒｅｇがＷＴレシピエントマウスにＨＳＰＣ移植術により発生し、その後、ｓｃｕｒｆｙ新生児に養子移入のために精製された代替の方法を続行した。ｓｃｕｒｆｙまたはＷＴ ＨＳＰＣ（Ｌｉｎ－ＣＤ４５．２＋）には、ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ＬＶを形質導入し、類遺伝子性ＷＴレシピエント（ＣＤ４５．１）に移植した。移植後８週目にドナーＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞を移植レシピエントの脾臓から精製し、推定上のＴｒｅｇを含有する３群のバルクＣＤ４＋細胞である、未修正ｓｃｕｆｒｙＣＤ４＋（Ｓｆ－ＣＤ４＋）、修正ｓｃｕｒｆｙＣＤ４＋（ｃＳｆ－ＣＤ４＋）または野生型ＣＤ４＋（ＷＴ－ＣＤ４＋）を得た（図１２、パネルＡ）。導入前の精製ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞のＦＡＣＳ分析では、レシピエントＣＤ４５．１細胞を検出可能に汚染することはなく、約９５％のＣＤ４＋純度を示した（図１６）。

【0132】

８．６×１０^５～２．１×１０^６の推定上のＴｒｅｇ（ＧＦＰ＋またはｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋、図１６）を表す精製ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞をｓｃｕｒｆｙ新生児の腹膜内に注入した。自己免疫表現型の修正について、日齢２１日目にｓｃｕｒｆｙマウスを分析した。２１日齢の未処置の（偽ＰＢＳ注入）ｓｃｕｒｆｙ新生児は、鱗片に覆われた皮膚、小さく厚い耳（図１２、パネルＢ）及び脾腫（図１２、パネルＣ）を含む疾患進行の典型的な表現型徴候を示した。未処置のマウスも高い百分率の活性化ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４４＋ＣＤ４ Ｔ細胞（図１２、パネルＤ）を含む炎症性免疫表現型を呈し、同齢のＷＴコントロールに比べて炎症性血清サイトカイン（図１２、パネルＥ）のレベルの上昇も示した。ＷＴ－ＣＤ４及び細胞１個あたり３より大きいＶＣを含むｃＳｆ－ＣＤ４細胞の投与により、これらのマウスは同齢のＷＴコントロールと表現型的に識別不能であるｓｃｕｒｆｙ表現型のすべての測定の完全な修正が得られた。対照的に、未修正Ｓｆ－ＣＤ４細胞を受け取るｓｃｕｒｆｙマウスは、ＢＭＴ及びＣＤ４精製方法が移植レシピエントから任意の汚染ＣＤ４５．１ ＷＴ Ｔｒｅｇを運ばないことを確認する疾患寛解の徴候を示さなかった。さらに、ＶＣＮが２未満のｃＳｆ Ｔｒｅｇを受け取るｓｃｕｒｆｙマウスは、ｓｃｕｒｆｙ表現型の不完全な修正を示し（図１６）、このモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでの抑制性能力を有するＴｒｅｇを生成するために高レベルの遺伝子修飾が必要であることを示唆した。まとめると、これらの結果からＦｏｘＰ３欠損ＨＳＣのＬＶ修正がｉｎ ｖｏｖｉで自己免疫応答を抑制することができるＣＤ４＋Ｔｒｅｇを生成することが実証される。

【0133】

ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ ＬＶはヒト化マウスモデルの毒性のない高レベルの系統特異的な発現を示す
この治療のＩＰＥＸ患者への適用性を評価するために、我々はヒト化異種移植片モデルのＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレポーターＬＶの発現パターンを次に調査した。臍帯血から単離された健康なヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣにはＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入し、ＮＳＧ新生児に移植した（図１３、パネルＡ）。移植後１２～１６週目に移植されたｈＣＤ４５＋細胞を分析した。ＮＳＧ ＢＭにおける移植されたヒト細胞１個あたりのベクターコピーの平均±ＳＤ数は４．１±２．５であり、ＬＶを用いたＬＴ－ＨＳＣの効率的な修飾を示唆した。ＢＭにおける移植されたヒトＣＤ４５＋細胞はＴ細胞活性化から無症状移植片対宿主疾患及び潜在的人工産物の欠如を示すこのモデル系（５９％のＣＤ１９＋Ｂ細胞、１０％のＣＤ３３＋骨髄性細胞、２．５％のＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、３．３％のＣＤ３＋Ｔ細胞、図１７）を代表する系統分布を呈した。

【0134】

フローサイトメトリーにより細胞を分析し、各造血系統のＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙからｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現を求めた（図１３、パネルＢ及びＣ）。ＢＭにおけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現はＣＤ３３＋骨髄系統、ＣＤ１９＋Ｂ細胞系統またはＣＤ３４＋ＨＳＰＣ系統における検出可能な発現なしで、ＣＤ３＋Ｔ細胞に制限された。胸腺におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現はＤＮ、ＤＰ、ＣＤ４ＳＰまたはＣＤ８ＳＰステージにおける最小の発現であり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（平均３６％のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋）に対して選択的だった。低レベルの発現はＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔｃｏｎｖ細胞（１７％のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（４％のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋）において観察されたが、脾臓におけるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ（４６％のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋）においてが最も高かった。分析された各マウスについて、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ蛍光の強度はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇサブセットにおいて最も高かった（図１３、パネルＢ）。

【0135】

ＣＤ２５はＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを同定する有用な表面マーカーであるが、ＣＤ２５は活性化Ｔ細胞にも発現し、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇに特異的ではない。したがって、我々は細胞内のＦｏｘＰ３染色でＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙのＴｒｅｇ系統特異性をより厳しく決定した。ここで、我々はＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスを利用した。このマウスは従来のＮＳＧモデルと比較して、多数のＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを生成した（Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．２０１１）。ヒト臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにはＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入し、ＮＳＧ－ＳＧＭ３新生児に移植した。移植後１２週目にヒトＣＤ４＋細胞を脾臓から単離し、ＦｏｘＰ３染色の前にｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋及びｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－集団にＦＡＣＳでソートした（図１３、パネルＤ）。我々は８１％のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋細胞もＦｏｘＰ３＋であるが、２．５％のｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ－細胞だけがＦｏｘＰ３＋であったことが分かり、ヒト化マウスモデルにおいてＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現及び内因性ＦｏｘＰ３発現の高い一致を示唆した。

【0136】

ＭＮＤＵ３プロモーターからの構成的ＦｏｘＰ３発現を調査している我々の先行研究では、ＨＳＣにおける異常なＦｏｘＰ３発現が移植に有害であることを示唆した。したがって、我々はＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ（ＨＳＰＣにおいて発現しない）を用いた系統特異的な我々の発現手法が、競合的移植モデルにおける効率的なＨＳＣ移植を考慮することを確認しようと努力した。ＣＤ３４＋「試験細胞」にはＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙまたはＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入し、同数の蛍光標識（ＵＢＣ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ形質導入）された競合細胞と結合し、新生児ＮＳＧマウスに移植した（図１３、パネルＥ）。移植後１２週目に蛍光標識された競合細胞の相対寄与をＣＤ３４＋系統内で評価した。ここで、群の間に競合細胞の相対的な割合の違いは見られなかった。このことから、ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３からの構成的ＦｏｘＰ３発現とは異なり、ＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙからの系統特異的なＦｏｘＰ３発現がＨＳＣ移植への有害な影響を示さないことが示唆されている。

【0137】

次に、我々はＣＮＳ２メチル化がＬＶ発現を調節するのに果たす役割を評価した。胸腺リンパ球新生時、ＣＮＳ２領域の活性脱メチル化はＴｒｅｇ系統への遺伝的な関与を誘発する重大な事象である（Ｔｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３）。脱メチル化されたＣＮＳ２は、ＦｏｘＰ３プロモーター上のそのエンハンサー機能により安定な高レベルのＦｏｘＰ３発現を維持する（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１４ａ）ことから、我々はＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ内に含まれるウイルスＣＮＳ２エレメント内にＣｐＧメチル化パターンを評価することに関心があった。ここで、我々はＬＶが形質導入されたＣＤ３４＋ＣＢ細胞によって再構成されたＮＳＧマウスから脾臓を単離し、Ｔｃｏｎｖ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）及びＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）のために、プールされた脾細胞をソートした（図１３、パネルＦ）。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇサブセット由来のゲノムＤＮＡを、各配列に特異的なパイロシークエンシングプライマーを利用して、内因性及びウイルス性ＣＮＳ２に存在する９つの調節されたＣｐＧ部位のメチル化について分析した。予想通り、内因性ＦＯＸＰ３ ＣＮＳ２内のＣｐＧ部位は、ソートされたＴｃｏｎｖ細胞においてメチル化され、ソートされたＴｒｅｇにおいて脱メチル化された。興味深いことに、ウイルス性ＣＮＳ２は両集団において完全に脱メチル化されたままで、ＨＳＣからのＴｒｅｇ分化時、ウイルス性ＣＮＳ２が内因性ＣＮＳ２と同様に調節されないことが示唆されている。

【0138】

考察
２００１年におけるＩＰＥＸ及びｓｃｕｒｆｙのための突然変異を有する原因となる遺伝子としてのＦｏｘＰ３の遺伝子が特性決定されて（Ｗｉｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．２００１ｂ；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．２００１）以来、数多くの研究により、免疫寛容を維持する際、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇにとっての重要な役割が更に明らかにされてきた。Ｔｒｅｇが全くないことから生じる重度の自己免疫によりＩＰＥＸが非常に有益な疾患になり、ヒトＴｒｅｇ発生及び免疫寛容の機序の我々の理解が深まった。

【0139】

安全プロフィールを向上しつつ、ＨＳＣに対する効率的なウイルスの遺伝子移入を起こす最近の開発から、幅広い遺伝的な血液障害に有効な第Ｉ／ＩＩ相臨床試験に至る遺伝子治療の分野の範囲が非常に広がっている（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）。この方法が近年、成功したと仮定すると、我々は発生中の造血系内で生理的なＦｏｘＰ３発現を回復し、機能的なＴｒｅｇの発生及び自己免疫の回復に至ることになる、ＩＰＥＸを治療するためのＬＶベースの治療を開発しようとした。

【0140】

ＦｏｘＰ３は細胞運命決定における重要な役割を果たす転写因子であるため、我々は造血系の全体にわたる不適当なＦｏｘＰ３発現が正常な造血発生及び長期移植に有害となると推測した。実際、我々は構成的ＭＮＤＵ３プロモーターによって引き起こされる構成的ＦｏｘＰ３発現が結果として、ヒト及びマウスＨＳＰＣ移植モデルにおいて長期移植の障害になることが分かった。この認識は、強い胸腺プロモーター下での高レベルのＦｏｘＰ３発現が結果として、異常な胸腺リンパ球新生及び発生中の胸腺細胞におけるアポトーシスの増加を起こすことを示す先行研究と一致する（Ｋｈａｔｔｒｉ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．２０１３）。興味深いことに、Ｓａｎｔｏｎｉ ｄｅ Ｓｉｏ ｅｔ ａｌ．では、ＨＳＣ移植の亢進と、構成的に活性なＥＦ１ａプロモーター下でＦｏｘＰ３を発生するＬＶが形質導入された臍帯血ＨＳＰＣからの異常なＴ細胞発生が見られた（Ｓａｎｔｏｎｉ ｄｅ Ｓｉｏ ｅｔ ａｌ．２０１７）。これらの矛盾する結果は、（ＥＦ１ａ対ＭＮＤＵ３プロモーターの相対強度によって引き起こされる）異なるレベルの構成的ＦｏｘＰ３発現がＨＳＣ生物学への差次的な効果を有し得ることが示唆され得る。まとめると、我々の及び他の所見から、ＩＰＥＸ症候群の理想的なＨＳＣベースの遺伝子治療により異常な及び遍在するＦｏｘＰ３発現が回避されるべきことを示唆している。

【0141】

異常なＦｏｘＰ３発現の有害な効果を回避するために、我々は発生的に適切なＦｏｘＰ３発現を与えるようにヒトＦＯＸＰ３遺伝子の内因性エレメントを用いてＬＶを設計した。系統特異的なＬＶの設計の際の主要な課題の１つは、同時に小さいＬＶゲノムを維持しながら、高いｃＤＮＡ発現レベルを増進することができる内因性ＦＯＸＰ３エンハンサーエレメントを保持することです。大きいＬＶゲノムは通常、タイターの低減及び形質導入効率の減少を示すため（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．２００１；Ｃａｎｔｅ－Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．２０１６）、ＨＳＣの治療修正を達成することを困難にする。このことは、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）由来の大きなエンハンサーエレメントを含むＬＶを使用して異常ヘモグロビン症を治療して、ヒトβ－グロビン遺伝子の赤血球特異的な発現を引き起こす臨床の試みにおいて容易に明らかになった（Ｃａｖａｚｚａｎａ－Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ここで、我々は高タイター（ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡベクターの未処理のタイターは２．２５×１０６であった）を示し、マウス及びヒトＨＳＣにおける高コピー数を達成することができ、Ｔｒｅｇ系統内にＦｏｘＰ３発現の治療レベルを示す７．０ｋｂの系統特異的なＬＶを設計した。これらの因子の全ては、ＩＰＥＸ患者の治療に好ましい臨床解釈を示唆している。

【0142】

Ｔｒｅｇ特異的な発現を有するＬＶを設計するために、我々はＥＮＣＯＤＥデータベースに含まれている情報を利用し、ＦＯＸＰ３、ならびに同定したＣＮＳ１、ＣＮＳ２及びＣＮＳ３において重要なＴｒｅｇ特異的なエンハンサー領域としてＴｒｅｇ特異的なＤＮＡｓｅ過敏症の領域を同定した。３つのＣＮＳ領域は高度に保全され、ＦｏｘＰ３発現及びＴｒｅｇ発生に関する各領域の遺伝的除去の効果を実証するマウスモデルについて以前に特徴があった（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＣＮＳ３は「パイオニアエレメント」として特徴があり、胸腺細胞Ｔｒｅｇ発生時、ＦｏｘＰ３発現の初期誘導に重要である。ＣＮＳ１は多くのＳｍａｄ結合部位を有するＴＧＦβ応答性エレメントであると考えられ、ｐＴｒｅｇの誘導に重要である。ＣＮＳ２は関与したＴｒｅｇにおける安定的なＦｏｘＰ３発現の維持の原因である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）。近年の証拠では、ＣＮＳ２エンハンサー領域に関与したＴｒｅｇにおける高レベルのＦｏｘＰ３発現を引き起こすことが可能な胸腺Ｔｒｅｇ発生時、ＣＮＳ２の脱メチル化がＴｅｔ酵素によって開始される活性なプロセスであることが示唆されている（Ｔｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｙｕｅ ｅｔ ａｌ．２０１６）。興味深いことに、我々がＮＳＧ Ｔｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇサブセットにおいて、それぞれ内因性ＣＮＳ２メチル化／脱メチル化の予測パターンを観察すると共に、ウイルス性ＣＮＳ２配列はすべてのサブセットにおいて完全に脱メチル化された。このことは、ＨＳＣ状態（ＬＶ形質導入を介して）での脱メチル化されたＣＮＳ２領域の導入により、ＬＶ内のこの領域が発生全体にわたり、メチル化されていないままにすることができることを示唆している。対照的に、内因性ＦＯＸＰ３遺伝子は、胸腺リンパ球新生及びＴｒｅｇ発生時、発生している特異的な脱メチル化を有する胚形成の初期に包括的にメチル化させることができる。内因性及びウイルス性ＣＮＳ２メチル化の間の不一致にかかわらず、ＬＶ発現はＴｒｅｇ系統に対して高次に選択的なままであり、脱メチル化されたＣＮＳ２が単独でＦｏｘＰ３発現を引き起こさないこと、ならびにＣＮＳ１、ＣＮＳ３及びＦｏｘＰ３プロモーターが更なる特異性を与え得ることが示唆されている。さらに、ＣＮＳ２の過剰メチル化がＦｏｘＰ３発現の低減（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１４）及び自己免疫障害の患者におけるＴｒｅｇ機能の障害（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．２０１６）に関連する場合、脱メチル化されたＣＮＳ２を維持するＬＶは自己免疫障害におけるＦｏｘＰ３発現を向上するために有利であること推測することは、この可能性が調査されていないにもかかわらず、魅力的である。

【0143】

中枢性寛容シグナル（ｎＴｒｅｇ）においてまたは寛容誘発シグナル（ｐＴｒｅｇ）に応答する末梢性ＦｏｘＰ３－Ｔｃｏｎｖからの両方でＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇが発生する。Ｈａｒｉｂｈａｉ ｅｔ ａｌ．による中心的な研究は、ｎＴｒｅｇ及びｐＴｒｅｇサブセットの両方がｓｃｕｒｆｙマウスにおける自己免疫欠損を制御する際に非重複の役割を果たし、自己抗原への免疫寛容の基本保全のために重要であることを示唆している（Ｈａｒｉｂｈａｉ ｅｔ ａｌ．２０１１）。したがって、ＩＰＥＸの有効な治療は、胸腺及び末梢性Ｔｒｅｇ発生の両方を理想的に回復する。ＦｏｘＰ３ ｃＤＮＡを系統特異的に発現することがＴｒｅｇ機能及び表現型を回復するのに十分なＦｏｘＰ３発現レベルを達成するかどうかを判断するために、我々はｓｃｕｒｆｙＨＳＣにおけるＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを試験した。ｎＴｒｅｇ発生の回復は、修正ｓｃｕｒｆｙ胸腺細胞により示されるＴｒｅｇ表現型（ＧＩＴＲ＋、ＣＤ２５＋）及びＣＤ４＋ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋脾細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抑制性能力によって証明される。我々の研究では、ＴＧＦβの存在下での活性化により新規のＦｏｘＰ３発現を誘発する修正ｓｃｕｒｆｙＣＤ４細胞の能力によって示される、ｐＴｒｅｇコンパートメントの回復も示唆される。

【0144】

臨床解釈の前に考慮する重要な因子は、ＩＰＥＸ患者の自己免疫を回復するために必要なＨＳＣ修正及び移植のレベルである。ＩＰＥＸ患者の同種ＨＳＣ移植の報告では、自己免疫の回復の成功が部分的なドナーキメラ現象で達成することができることを実証している（Ｂａｒｚａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１８）。これらの症例のいくつかにおいては、ドナーＴｒｅｇが低レベルの総ドナー移植にもかかわらず、Ｔｒｅｇコンパートメントにおける完全なドナーキメラ現象を有する選択的有利を呈することが示された（Ｋａｓｏｗ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｓｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２００９）。ＣＤ４＋細胞の養子移入を有するｓｃｕｒｆｙ新生児を救済する我々の研究においては、精製されたＣＤ４産物における３より大きいＶＣＮが自己免疫を修正する十分に高いＦｏｘＰ３発現を有するＴｒｅｇを生成するために必要であった。このことは、ＬＶ構造体に含まれるＦｏｘＰ３エンハンサーの我々の設計した組み合せが、ＦｏｘＰ３発現を促進するときに内因性遺伝子よりも低い効率になること、あるいはＬＶに含まれるヒト調節エレメントがマウス細胞において最適以下の発現を提供することを示唆し得る。にもかかわらず、我々のＮＳＧ異種移植片の研究は、３より大きいＶＣＮがヒトＣＤ３４＋細胞において容易に達成することができることを示す。更なる研究では、ヒトＩＰＥＸ ＨＳＣからの機能的なＴｒｅｇの発生を回復するために必要な補正ＶＣＮを評価することを目標とする。

【0145】

要約すると、我々はＦｏｘＰ３欠損ＨＳＣからＴｒｅｇ発生をうまく回復するする内因的に調節されたＬＶの発生を実証する。表現型及び機能においてＷＴ Ｔｒｅｇと密接に似ている修正Ｔｒｅｇは、重要なことに、ｓｃｕｒｆｙマウスの自己免疫表現型を逆転させることができる。さらに、ヒト化マウスモデルはＬＴ－ＨＳＣの効率的な遺伝子修飾及び高レベルの系統特異的な発現を示し、ＩＰＥＸ患者にこの治療の好ましい解釈を示唆している。より広範には、この研究は、ＨＳＣレベルで免疫系を再プログラミングして免疫寛容を回復することの第一実証を示す。ＩＰＥＸは奇病であるが、その重症度及び適切な治療の不足により優れたゲートウェイ疾患とみなされ、免疫寛容を調節する新規なＨＳＣベースの治療の開発に生物学的洞察を提供する。これらの所見は、自己由来ＨＳＣＴによるＩＰＥＸ患者の治療の道を開き、異なる供給源の自己免疫不全の患者に新規な治療への有益な洞察を提供することができる。

【0146】

材料及び方法
レンチウイルスベクター
ＭＮＤＵ３－ＧＦＰ（Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．２００４）及びＵＢＣ－ｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）の構築が記載されている。ＭＮＤＵ３－ＦｏｘＰ３－ＩＲＥＳ－ＧＦＰは、Ｄｒ．Ｇａｙ Ｃｒｏｏｋｓからの親切な贈り物であった。ＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ及びＣＮＳ１２３ｐ－ＦｏｘＰ３－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙレンチウイルスベクターは、空のＣＣＬ骨格にクローニングされた（Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９８）。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（Ｒ）ＨｉＦｉ ＤＮＡ組み立てキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）レンチウイルスベクターを用いてクローニングされる適合性のある端を有するｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として断片を合成した。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプを使用して、レンチウイルスベクターをパッケージ化し、濃縮し、記載されるようにタイターを測定した（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１）。

【0147】

細胞株
ＭＴ２細胞は、Ｄｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ ＲｉｃｈｍａｎからＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨ：ＭＴ－２ Ｃｅｌｌｓより入手した。（Ｈａｅｒｔｌｅ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｈａｒａｄａ，Ｋｏｙａｎａｇｉ，ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ １９８５）。Ｊｕｒｋａｔ及びＫ５６２細胞はＡＴＣＣから入手した。細胞は、Ｒ１０（ＲＰＭＩ［Ｇｉｂｃｏ］／１０％のＦＢＳ［Ｇｉｂｃｏ］／１ｘＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ［ＰＳＧ、Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ］）で維持された。細胞を１Ｅ６細胞／ｍＬで培養し、濃度（１Ｅ５ ＴＵ／ｍＬ～１Ｅ８ ＴＵ／ｍＬ、ＭＯＩ ０．１～１００）でＣＮＳ１２３ｐ－ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを形質導入し、翌日、新しいＲ１０に変えた。培養の１０日後、細胞をｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ発現についてフローサイトメトリーによって分析し、ゲノムＤＮＡをベクターコピー数解析のために単離した。

【0148】

マウス
実験に関連するすべての動物は、ｔｈｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｄｉｃｉｎｅのｔｈｅ ＵＣＬＡ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコルに従って世話をし、取り扱った。Ｂ６（ＣＤ４５．２）、Ｂ６．ＳＪＬ（ＣＤ４５．１）、Ｂ６－ＦｏｘＰ３ＧＦＰ（ＣＤ４５．２）、Ｂ６－ｓｃｕｒｆｙ、ＮＳＧ及びＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ ｃｏｌｏｎｉｅｓから購入し、ＵＣＬＡで維持した。以下の飼育方法はｓｃｕｒｆｙマウスに使用した。ヘテロ接合型雌のｓｃｕｒｆｙマウス（ＣＤ４５．２、Ｘ／ＸＳｆ、表現型が正常）を野生型Ｂ６（ＣＤ４５．２）またはＢ６．ＳＪＬ（ＣＤ４５．１）雄と交配し、サブコロニーのＣＤ４５．２、ＣＤ４５．１及びＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２ｓｃｕｒｆｙマウスを産んだ。６０×１０^６個のＷＴ脾細胞の腹腔内注入により雄のｓｃｕｒｆｙ新生児（Ｘｓｆ／Ｙ）を救済し、ヘテロ接合型雌のｓｃｕｒｆｙ（Ｘ／ＸＳｆ）と再交配し、雌のｓｃｕｒｆｙ（Ｘｓｆ／Ｘｓｆ）を得た。救出された雄のｓｃｕｒｆｙ（Ｘｓｆ／Ｙ）及び雌のｓｃｕｒｆｙ（Ｘｓｆ／Ｘｓｆ）マウスを交配し、すべての子がＦｏｘＰ３欠損である同腹仔を得た。雄及び雌のｓｃｕｒｆｙマウスは識別不能な疾患の進展を示し、同じ意味で使用された。

【0149】

マウス類遺伝子性移植片
骨髄細胞は、乳鉢及び乳棒で無菌に単離された大腿骨、脛骨、骨盤、脊椎及び上腕骨を破砕することによって得られた。系統除去キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用い、製造業者の取扱説明書に従いＬｉｎ細胞を得た。２×１０^６個のＬｉｎ細胞／ｍＬでマウス形質導入媒体（Ｓｐａｎ ＳＦＥＭ［Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］、１ｘ ＰＳＧ［Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ］、１００ｎｇ／ｍＬのｍＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ｍＳＣＦ［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ］、５ｍｇ／ｍＬのポリブレン［Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ］）にＬｉｎ細胞を再懸濁し、ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ）コートウェル（ＲＴで２時間、２０ｎｇ／ｍＬ）で播種し、一晩、ＬＶでインキュベートした。養子移入に修正Ｔｒｅｇを生成するために用いられる移植において、１ｍｇ／ｍＬのポロキサマーＫＰ３３８（ＢＡＳＦ）を添加し、遺伝子転写効率を向上させた。

【0150】

形質導入後、細胞を回収し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。６～１０週齢のＢ６．ＳＪＬ（ＣＤ４５．１）またはＢ６（ＣＤ４５．２）レシピエントは、線量間が３～４時間で分割線量６００＋６００Ｒａｄを用いて１２００Ｒａｄ（線量率約１００Ｒａｄ／分）で照射した。最終放射線量の１～４時間後に、後眼窩注入により細胞を注入した。移植された細胞線量は、マウス１匹当たりＬｉｎ細胞５Ｅ５～１Ｅ６個に及ぶ。

【0151】

細胞１個当たりのベクターコピー（ＶＣ）の決定
ＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ）を用いて試料からゲノムＤＮＡを抽出した。ｄｄＰＣＲを用いて平均ＶＣ／細胞を測定した。１×ｄｄＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、プライマー及びＨＩＶ－１Ｐｓｉ範囲に特異的なプローブ（当該プライマー及びプローブに対してそれぞれ４００ｎＭ及び１００ｎＭ）を含む容量２２μＬ、ＤｒａＩ（４０Ｕ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ならびに１．１μＬのゲノムＤＮＡサンプルからなる反応混合物を調製した。ＱＸ１００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、液滴を発生させた。熱サイクル条件は、９５℃で１０分間、９４℃で３０秒間及び６０℃で１分間（５５サイクル）、９８℃で１０分間（１サイクル）及び１２℃保持からなる。ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ／Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔ Ｖ１．７（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて特定の増幅された部分の濃度を定量化し、常染色体ヒト遺伝子ＳＤＣ４遺伝子に対するプライマーまたはマウス試料にｕｃ３７８遺伝子を用いて正規化した。プライマー／プローブシーケンスは、表２に示される。

【表2】

【0152】

マウスＣＤ４単離
７０μＭメッシュフィルターによる無菌除去及び脾臓の穏やかな破壊によって、マウス脾細胞を得た。調整前塩化アンモニウム系溶解バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＲＢＣ溶解が行われた。ＣＤ４単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ４＋細胞に対して脾細胞を濃縮した。簡単に述べると、脾細胞はＣＤ４－細胞を標識しているビオチン化された抗体のカクテルを用いて標識され、抗ビオチン磁気ビーズを用いて標識した。ＣＤ４＋細胞を貫流内で回収しながら、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上で分離した。ｓｃｕｒｆｙ新生児にＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋細胞の養子移入を利用する実験において、抗ＣＤ４５．１ビオチン化された抗体を初期の培養工程で添加し、任意の残存するレシピエントＣＤ４５．１細胞を除去した。

【0153】

Ｔｒｅｇ抑制分析
ＦＡＣＳソーティングの前に、ＣＤ４豊富脾細胞をＣＤ４－ＡＰＣ（Ｃｌｏｎｅ ＲＭ４－５、ＢＤ）及びＧｈｏｓｔ ７８０バイアビリティー色素（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、標識した。抑制性機能の評価のために、生育可能なＣＤ４＋ＧＦＰ＋（ＷＴ Ｔｒｅｇ）またはＣＤ４＋ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ＋（ｓｃｕｒｆｙ Ｔｒｅｇ）をソートした。５μＭ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅバイオレット増殖色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、３７℃で２０分間、Ｔｒｅｓｐ細胞（ＷＴ Ｂ６ ＣＤ４＋細胞）を標識し、洗浄し、サイトカインなしでＲ１０において１：１の比でソートされたＴｒｅｇと共培養した。実験は、９６ウェルＵボトムプレートの２．５Ｅ４～５Ｅ４個／ウェルのＴｒｅｓｐ細胞に及ぶ。マウスＣＤ３／ＣＤ２８ ＴＡｃｔｉｖａｔｏｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を培養液にビーズ１個：Ｔｒｅｓｐ細胞１個の比で添加した。細胞は３日間、培養し、増殖色素を希薄するためにＦＡＣＳ分析を行った。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ７．６．５（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて増殖指数を算出した。

【0154】

修正Ｔｒｅｇを用いたｓｃｕｒｆｙ新生児の救出及び分析
ｓｃｕｒｆｙ新生児は、２９ゲージインスリンシリンジを用いて、５０ｕＬのＰＢＳ内の精製ＣＤ４＋細胞を腹膜内に注入された。ＣＤ４細胞の絶対数及び各集団の相対Ｔｒｅｇ含有量が図１６に記載される。顎下穿刺によって２１日齢ｓｃｕｒｆｙマウスから血清分離管（ＲＡＭ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に血液を回収し、１０分間、５００ｘｇで遠心分離し、サイトカイン分析のために血漿を得た。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを用いてＵＣＬＡ Ｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｃｏｒｅによってサイトカインを分析した。

【0155】

ヒト化異種移植片
臍部のＣＢは膣及び帝王切開後、ＵＣＬＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒで得られた。得られたすべての試料は、ＩＲＢ審査を免除されている匿名の医療廃棄物とみなされた。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度遠心分離を用いて、回収の４８時間内にＮＭＣを単離し、製造業者の取扱説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に従ってＣＤ３４濃縮を行った。単一コード由来のＣＤ３４＋細胞を９０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）／１０％のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）においてクライオバイアル内で凍結し、後の使用のために保存した。融解しながら、ＣＤ３４＋細胞をヒト形質導入媒体（Ｘ－ｖｉｖｏ－１５［Ｌｏｎｚａ］、１ｘ ＰＳＧ［Ｇｅｍｉｎｉ ｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ］、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ］）に再懸濁した。細胞を２４時間、形質導入媒体で培養し、さらに２４時間、ＬＶでインキュベートした。形質導入後、ＣＤ３４＋細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、氷上で３０分間、ＯＫＴ３（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１μｇ／１００μＬ）でインキュベートし、ＧＶＨＤがＣＤ３４＋移植片に存在するＴ細胞を汚染することを防いだ（Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１４）。移植直前に、１３７Ｃｓ源及び線量率１００Ｒａｄ／分を用いて線量１２５Ｒａｄで１～３日齢新生児ＮＳＧマウスを照射した。各マウスは１～３×１０^５個のＣＤ３４＋細胞を受け取った。

【0156】

フローサイトメトリー
ＢＭ由来の単一細胞懸濁液は、上述するように大腿骨を破砕することによって得られた。胸腺及び脾臓は、組織を７０ｕＭストレーナーにより破砕することによって調製された。試料は、以下の方法を用いてフローサイトメトリーのために準備した。５０ｕＬのＦＡＣＳバッファー（リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ］／０．５％のＢｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ［ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ］）に再懸濁し、１μＬの各抗体及び０．５μＬのＧｈｏｓｔ ７８０バイアビリティー色素（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で４℃で２０～３０分間、細胞をインキュベートした。

【0157】

すべての抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入された。ヒト細胞の分析のために、次の抗体を使用した。ＣＤ４５－ＡＰＣ、ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、ＣＤ３３－ＢＶ４２１、ＣＤ１９－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ３４－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ８－ＡＰＣ、ＣＤ２５－Ｖ４５０、ＣＤ２５－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５。マウス細胞の分析のために、次の抗体を使用した。ＣＤ４５．１－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５．１－Ｖ４５０、ＣＤ４５．１－ＡＰＣ、ＣＤ４５．２－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５．２－Ｖ４５０、ＣＤ４－ＰＥＣｙ７、ＣＤ４－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７、Ｇｒ１－ＡＰＣ、Ｂ２２０－ＰｅｒＣｐ、ＣＤ３－ＰｅｒＣｐ、ｃＫｉｔ－ＡＰＣ、ＣＤ４４－ＰｅｒＣｐＣｙ５．５、ＣＤ６２Ｌ－ＰＥ－Ｃｙ７、ＧＩＴＲ－ＡＰＣ、ＣＤ２５－ＡＰＣ、ＣＴＬＡ４－ＡＰＣ。

【0158】

細胞内のＦｏｘＰ３染色のために、上述するように、まず細胞を細胞表面マーカー及び固定可能なバイアビリティー色素で染色した。洗浄後、製造業者の指示に従ってＦｏｘＰ３染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞を固定し、透過処理した。ヒトＦｏｘＰ３－ＰＥまたはヒトＦｏｘＰ３－ＡＰＣ（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃｌｏｎｅ ２３６Ａ／Ｅ７）をＲＴで３０～６０分間、添加した。アイソタイプコントロールを用いてＦｏｘＰ３＋ゲートを設定した。ＬＳＲＩＩまたはＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に試料を獲得した。ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータを解析した。

【0159】

メチル化分析／亜硫酸水素塩シークエンシング
Ｐｕｒｅｌｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ソートされたＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）及びＴｃｏｎｖ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）サブセットからゲノムＤＮＡを抽出した。ＥｐｉｇｅｎＤｘによってヒトＦｏｘＰ３遺伝子のＣＮＳ２のＣｐＧジヌクレオチドメチル化分析が行われ、ＲＮａｓｅ処理されたゲノムＤＮＡの亜硫酸水素塩処理により判定され、ＰＣＲ増幅及びパイロシークエンシング（ＥｐｉｇｅｎＤｘ分析ＡＤＳ７８３－ＦＳ２）が行われた。ウイルス性ＣＮＳ２を独自に認識する以下のプライマーを用いて、合成ＬＶ ＤＮＡからのＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２のメチル化分析のためのＥｐｉｇｅｎＤｘによって、カスタム分析が行われた。ＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２ Ｖｉｒａｌ Ｆ：ＴＧＧＡＧＴＴＡＧＡＴＴＧＴＴＴＧＧＧＡ（配列番号１１）；ＦｏｘＰ３ ＣＮＳ２ Ｖｉｒａｌ Ｒ：ＣＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣＣＡＣ （配列番号１２）。

【0160】

実施例２のための参照
Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｋｉｓｍｅｔ，Ｆａｂｒｉｚｉａ Ｕｒｂｉｎａｔｉ，Ｚｕｌｅｍａ Ｒｏｍｅｒｏ，Ｂｅａｔｒｉｚ Ｃａｍｐｏ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｌ Ｋａｕｆｍａｎ，Ａａｒｏｎ Ｒ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｋａｔｅｌｙｎ Ｍａｓｉｕｋ，Ｒｏｇｅｒ Ｐ Ｈｏｌｌｉｓ，ａｎｄ Ｄｏｎａｌｄ Ｂ Ｋｏｈｎ．２０１５．“Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ／Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３（５）：１５３２－１５４２．

【0161】

Ｂａｒｚａｇｈｉ，Ｆｅｄｅｒｉｃａ，Ｌａｕｒａ Ｃｒｉｓｔｉｎａ Ａｍａｙａ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｂｅｎｅｄｉｃｔｅ Ｎｅｖｅｎ，Ｓｉｌｖｉａ Ｒｉｃｃｉ，Ｚｅｙｎｅｐ Ｙｅｓｉｍ Ｋｕｃｕｋ，Ｊａｃｋ Ｊ Ｂｌｅｅｓｉｎｇ，Ｚｏｈｒｅｈ Ｎａｄｅｍｉ，ｅｔ ａｌ．２０１８．“Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｆｏｌｌｏｗ－ｕｐ ｏｆ ＩＰＥＸ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｆｔｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ．”Ｊ．Ａｌｌｅｇｅｒｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４１（３）：１０３６－１０４９．

【0162】

Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃｒａｉｇ Ｌ．，Ｊａｃｉｎｄａ Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｆｒｅｄ Ｒａｍｓｄｅｌｌ，Ｍａｒｙ Ｅ．Ｂｒｕｎｋｏｗ，Ｐｏｌｌｙ Ｊ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｌｕｋｅ Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ，Ｔｈａｄｄｅｕｓ Ｅ．Ｋｅｌｌｙ，Ｆｒａｎｋ Ｔ．Ｓａｕｌｓｂｕｒｙ，Ｐｈｉｌｌｉｐ Ｆ．Ｃｈａｎｃｅ，ａｎｄ Ｈａｎｓ Ｄ．Ｏｃｈｓ．２００１．“Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ，Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ，Ｘ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＩＰＥＸ）Ｉｓ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＦＯＸＰ３．”Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７（１）：２０－２１．

【0163】

Ｂｉｌｌｅｒｂｅｃｋ，Ｅｖａ，Ｗａｌｔｅｒ Ｔ Ｂａｒｒｙ，Ｋａｔｈｙ Ｍｕ，Ｍａｒｃｕｓ Ｄｏｒｎｅｒ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｍ Ｒｉｃｅ，ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｐｌｏｓｓ．２０１１．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ－，Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ－，ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３－Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＮＯＤ－ＳＣＩＤ ＩＬ２Ｒγ（Ｎｕｌｌ）Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｉｃｅ．”Ｂｌｏｏｄ １１７（１１）：３０７６－３０８６．

【0164】

Ｃａｎｔe－Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｋｉｒｓｔｅｎ，Ｒｕｉ Ｄ．Ｍｅｎｄｅｓ，Ｗｉｌｌｅｍ Ｋ．Ｓｍｉｔｓ，Ｙｖｅｔｔｅ Ｍ．ｖａｎ Ｈｅｌｓｄｉｎｇｅｎ－ｖａｎ Ｗｉｊｋ，Ｒｏｂ Ｐｉｅｔｅｒｓ，ａｎｄ Ｊｕｌｅｓ Ｐ．Ｐ．Ｍｅｉｊｅｒｉｎｋ．２０１６．“Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｓｉｚｅ Ｍａｔｔｅｒｓ．”ＢＭＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｔｅｓ ９（１）：３１２．

【0165】

Ｃａｖａｚｚａｎａ－Ｃａｌｖｏ，Ｍａｒｉｎａ，Ｅｍｍａｎｕｅｌ Ｐａｙｅｎ，Ｏｌｉｖｉｅｒ Ｎｅｇｒｅ，Ｇａｒｙ Ｗａｎｇ，Ｋａｔｈｌｅｅｎ Ｈｅｈｉｒ，Ｆｌｏｒｉａｎｅ Ｆｕｓｉｌ，Ｊｕｌｉａｎ Ｄｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．２０１０．“Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ａｎｄ ＨＭＧＡ２ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ β－Ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉａ．”Ｎａｔｕｒｅ ４６７（７３１３）：３１８－３２２．

【0166】

Ｃｈｅｎ，ＷａｎＪｕｎ，Ｗｅｎｗｅｎ Ｊｉｎ，Ｎｅｉｌ Ｈａｒｄｅｇｅｎ，Ｋｅ－Ｊｉａｎ Ｌｅｉ，Ｌｉ Ｌｉ，Ｎａｎｃｙ Ｍａｒｉｎｏｓ，Ｇｅｏｒｇｅ ＭｃＧｒａｄｙ，ａｎｄ Ｓｈａｒｏｎ Ｍ Ｗａｈｌ．２００３．“Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｎａｉｖｅ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＴＧＦ－Ｂｅｔａ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＦｏｘＰ３．”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８（１２）：１８７５－１８８６．

【0167】

Ｃｏｏｐｅｒ，Ａａｒｏｎ Ｒ，Ｓａｎｊｅｅｔ Ｐａｔｅｌ，Ｓｈａｎｔｈａ Ｓｅｎａｄｈｅｅｒａ，Ｋａｔｈｒｉｎ Ｐｌａｔｈ，Ｄｏｎａｌｄ Ｂ Ｋｏｈｎ，ａｎｄ Ｒｏｇｅｒ Ｐ Ｈｏｌｌｉｓ．２０１１．“Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｔａｎｄｅｍ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７７（１）：１－９．

【0168】

Ｃｕｒｏｔｔｏ ｄｅ Ｌａｆａｉｌｌｅ，Ｍａｒｉａ Ａ，Ａｎｄｒｅｉａ Ｃ Ｌｉｎｏ，Ｎｉｎｏ Ｋｕｔｃｈｕｋｈｉｄｚｅ，ａｎｄ Ｊｕａｎ Ｊ Ｌａｆａｉｌｌｅ．２００４．“ＣＤ２５－ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅ ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（１２）：７２５９－７２６８．

【0169】

Ｄｕｌｌ，Ｔ，Ｒ Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，Ｍ Ｋｅｌｌｙ，Ｒ Ｊ Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ Ｔｒｏｎｏ，ａｎｄ Ｌ Ｎａｌｄｉｎｉ．１９９８．“Ａ Ｔｈｉｒｄ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ．”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３－８４７１．

【0170】

Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊａｓｏｎ Ｄ．，Ｍａｒｃ Ａ．Ｇａｖｉｎ，ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｙ．Ｒｕｄｅｎｓｋｙ．２００３．“ＦｏｘＰ３ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（４）：３３０－３３６．

【0171】

Ｇｕｏ，Ｈｕｉｆａｎｇ，Ｍｉｎｇ Ｚｈｅｎｇ，Ｋｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｆｅｎｇｆａｎ Ｙａｎｇ，Ｘｉｎ Ｚｈａｎｇ，Ｑｉｎｇ Ｈａｎ，Ｚｈｉ－Ｎａｎ Ｃｈｅｎ，ａｎｄ Ｐｉｎｇ Ｚｈｕ．２０１６．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ ＦｏｘＰ３＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ Ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ．”Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６（１）：３７５５９．

【0172】

Ｈａｅｒｔｌｅ，Ｔ，ＣＪ Ｃａｒｒｅｒａ，ＤＢ Ｗａｓｓｏｎ，ａｎｄ ＬＣ Ｓｏｗｅｒｓ．１９８８．“Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ－１ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ２－Ｈａｌｏ－２’，３’－Ｄｉｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：５８７０－５８７５．

【0173】

Ｈａｒａｄａ，Ｓ，Ｙ Ｋｏｙａｎａｇｉ，ａｎｄ Ｎ Ｙａｍａｍｏｔｏ．１９８５．“Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶ ｉｎ ＨＴＬＶ－Ｉ－Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ＭＴ－２ ａｎｄ ＭＴ－４ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｐｌａｑｕｅ Ａｓｓａｙ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９（４７１３）：５６３－５６６．

【0174】

Ｈａｒｉｂｈａｉ，Ｄｉｐｉｃａ，Ｊａｓｏｎ Ｂ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓｈｕａｎｇ Ｊｉａ，Ｄｅｒｅｋ Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｅｒｉｃａ Ｇ Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｂｒａｎｄｏｎ Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｚｉｅｇｅｌｂａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．２０１１．“Ａ Ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３５（１）：１０９－１２２．

【0175】

Ｋａｓｏｗ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ Ａ．，Ｖａｎｅｓｓａ Ｍ．Ｍｏｒａｌｅｓ－Ｔｉｒａｄｏ，Ｄａｖｉｄ Ｗｉｃｈｌａｎ，Ｓｈｅｉｌａ Ａ．Ｓｈｕｒｔｌｅｆｆ，Ａｌｌｉｓｔａｉｒ Ａｂｒａｈａｍ，Ｄｅｒｅｋ Ａ．Ｐｅｒｓｏｎｓ，ａｎｄ Ｊａｎｉｃｅ Ｍ．Ｒｉｂｅｒｄｙ．２０１１．“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｙｍｉｃ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｎｏｎ－Ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｆｏｒ ＩＰＥＸ．”Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１（２）：１６９－１７６．

【0176】

Ｋｈａｔｔｒｉ，Ｒ，Ｄ Ｋａｓｐｒｏｗｉｃｚ，Ｔ Ｃｏｘ，Ｍ Ｍｏｒｔｒｕｄ，Ｍ Ｗ Ａｐｐｌｅｂｙ，Ｍ Ｅ Ｂｒｕｎｋｏｗ，Ｓ Ｆ Ｚｉｅｇｌｅｒ，ａｎｄ Ｆ Ｒａｍｓｄｅｌｌ．２００１．“Ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ Ｓｃｕｒｆｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（１１）：６３１２－６３２０．

【0177】

Ｋｕｍａｒ，Ｍｕｋｅｓｈ，Ｂｒｉａｎ Ｋｅｌｌｅｒ，Ｎｄｅｙｅ Ｍａｋａｌｏｕ，ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｅ．Ｓｕｔｔｏｎ．２００１．“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２（１５）：１８９３－１９０５．

【0178】

Ｌｉ，Ｘｕｄｏｎｇ，Ｙｕｑｉｏｎｇ Ｌｉａｎｇ，Ｍａｔｈｉａｓ ＬｅＢｌａｎｃ，Ｃｈｒｉｓ Ｂｅｎｎｅｒ，ａｎｄ Ｙｅ Ｚｈｅｎｇ．２０１４ａ．“Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＦｏｘＰ３ Ｃｉｓ－Ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ．”Ｃｅｌｌ，１５８（４）：７３４－７４８．

【0179】

Ｌｉｕ，Ｍｉｎｇｄｏｎｇ，Ｍａｔｔｈｅｗ Ｔ Ｍａｕｒａｎｏ，Ｈａｏ Ｗａｎｇ，Ｈｅｙｕａｎ Ｑｉ，Ｃｈａｏ－Ｚｈｏｎｇ Ｓｏｎｇ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ａ Ｎａｖａｓ，Ｄａｖｉｄ Ｗ Ｅｍｅｒｙ，Ｊｏｈｎ Ａ Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｅ Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ．２０１５．“Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（２）：１９８－２０３．

【0180】

Ｌｏｇａｎ，Ａａｒｏｎ Ｃ，Ｓａｒａｈ Ｊ Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ，Ｄｅｎｎｉｓ Ｌ Ｈａａｓ，Ｇｅｒａｌｄ Ｊ Ｃｈｏ，Ｋａｒｅｎ Ａ Ｐｅｐｐｅｒ，ａｎｄ Ｄｏｎａｌｄ Ｂ Ｋｏｈｎ．２００４．“Ｆａｃｔｏｒｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｔｉｔｅｒ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：９７６－９８８．

【0181】

Ｍｏｒｇａｎ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ，Ｄａｖｉｄ Ｇｒａｙ，Ａｎａｓｔａｓｉａ Ｌｏｍｏｖａ，ａｎｄ Ｄｏｎａｌｄ Ｂ Ｋｏｈｎ．２０１７．“Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｌｅａｒｎｅｄ．”Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２１（５）：５７４－５９０．

【0182】

Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ，Ｌａｕｒａ，Ｅｖａ Ｒｏｓｓｉ Ｍｅｌ，Ｃｌａｕｄｉａ Ｓａｒｔｉｒａｎａ，Ｇｅｏｒｇｉａ Ｆｏｕｓｔｅｒｉ，Ａｔｔｉｌｉｏ Ｂｏｎｄａｎｚａ，Ｌｕｉｇｉ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｍａｒｉａ Ｇｒａｚｉａ Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，ａｎｄ Ｒｏｓａ Ｂａｃｃｈｅｔｔａ．２０１３．“ＣＤ４＋Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ＩＰＥＸ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｃｏｎｖｅｒｔ ｉｎｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＦＯＸＰ３ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．”Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５（２１５）：２１５ｒａ１７４．

【0183】

Ｒｉｌｅｙ，Ｊａｍｅｓ Ｌ．，Ｃａｒｌ Ｈ．Ｊｕｎｅ，ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ Ｒ．Ｂｌａｚａｒ．２００９．“Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔａｋｅ ａ Ｂｉｌｌｉｏｎ ｏｒ Ｓｏ ａｎｄ Ｃａｌｌ Ｍｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｒｎｉｎｇ．”Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（５）：６５６－６６５．

【0184】

Ｓａｆｉｎｉａ，Ｎｉｌｏｕｆａｒ，Ｐｅｒｖｉｎｄｅｒ Ｓａｇｏｏ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｌｅｃｈｌｅｒ，ａｎｄ Ｇｉｏｖａｎｎａ Ｌｏｍｂａｒｄｉ．２０１０．“Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌ．１５（４）：４２７－４３４．

【0185】

Ｓａｎｔｏｎｉ ｄｅ Ｓｉｏ，Ｆ．Ｒ．，Ｌ．Ｐａｓｓｅｒｉｎｉ，Ｍ．Ｍ．Ｖａｌｅｎｔｅ，Ｆ．Ｒｕｓｓｏ，Ｌ．Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｍ．Ｇ．Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，ａｎｄ Ｒ．Ｂａｃｃｈｅｔｔａ．２０１７．“Ｅｃｔｏｐｉｃ ＦＯＸＰ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｗｈｉｌｅ Ｉｍｐａｉｒｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．”Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７（１）：１５８２０．

【0186】

Ｓｅｉｄｅｌ，Ｍａｒｋｕｓ Ｇ，Ｇｅｒｈａｒｄ Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌｉｏｎ，Ｂｉｒｇｉｔ Ｊｕｒｇｅｎｓ，Ａｎｄｒｅａｓ Ｈｅｉｔｇｅｒ，Ｒｏｓａ Ｂａｃｃｈｅｔｔａ，Ａｎｉｔａ Ｌａｗｉｔｓｃｈｋａ，ｅｔ ａｌ．２００９．“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ ＣＤ４＋２５ｈｉｇｈ ＦＯＸＰ３－Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＩＰＥＸ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ａｆｔｅｒ Ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｂｌｏｏｄ，１１３（２２）：５６８９－５６９１．

【0187】

Ｔａｉ，Ｘｕｇｕａｎｇ，Ｂａｔｕ Ｅｒｍａｎ，Ａｍａｌａ Ａｌａｇ，Ｊｉｅ Ｍｕ，Ｍｏｔｏｋｏ Ｋｉｍｕｒａ，Ｇｉｌ Ｋａｔｚ，Ｔｅｒｒｙ Ｇｕｉｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．２０１３．“ＦｏｘＰ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｉｓ Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ Ｌｅｔｈａｌ ｔｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｌｅｓｓ Ｃｏｕｎｔｅｒｂａｌａｎｃｅｄ ｂｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｉｇｎａｌｓ．”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３８（６）：１１１６－１１２８．

【0188】

Ｔｏｋｅｒ，Ａｒａｓ，Ｄｉｒｋ Ｅｎｇｅｌｂｅｒｔ，Ｇａｒｉｍａ Ｇａｒｇ，Ｊｕｌｉａ Ｋ Ｐｏｌａｎｓｋｙ，Ｓｔｅｆａｎ Ｆｌｏｅｓｓ，Ｔａｋａｈｉｓａ Ｍｉｙａｏ，Ｕｄｏ Ｂａｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．２０１３．“Ａｃｔｉｖｅ Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＦｏｘＰ３ Ｌｏｃｕｓ Ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｂｌｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｙｍｕｓ．” Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０（７）：３１８０－３１８８．

【0189】

Ｗｉｌｄｉｎ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．，Ｆｒｅｄ Ｒａｍｓｄｅｌｌ，Ｊａｎｅ Ｐｅａｋｅ，Ｆｒａｎｃｅｓｃａ Ｆａｒａｖｅｌｌｉ，Ｊｅａｎ－Ｌａｕｒｅｎｔ Ｃａｓａｎｏｖａ，Ｎｅｉｌ Ｂｕｉｓｔ，Ｅｐｈｒａｔ Ｌｅｖｙ－Ｌａｈａｄ，ｅｔ ａｌ．２００１ａ．“Ｘ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｉｓ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃｕｒｆｙ．”Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７（１）：１８－２０．

【0190】

Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｍａｒｋ，Ｒｙａｎ Ａ Ｂｒｏｏｋｓ，Ｒｕｓｈｉ Ｐａｎｃｈａｌ，Ｇａｒｒｅｔｔ Ｗ Ｒｈｙａｓｅｎ，Ｇｗｅｎｎ Ｄａｎｅｔ－Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ，ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｃ Ｍｕｌｌｏｙ．２０１４．“ＯＫＴ３ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ＧＶＨＤ ａｎｄ Ａｌｌｏｗｓ Ｒｅｌｉａｂｌｅ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｔｉｓｓｕｅｓ．”Ｂｌｏｏｄ，１２３（２４）：ｅ１３４－１４４．

【0191】

Ｙｕｅ，Ｘｉａｏｊｉｎｇ，Ｓａｒａ Ｔｒｉｆａｒｉ，Ｔａｒｍｏ Ａｉｊｏ，Ａｇｅｌｉｋｉ Ｔｓａｇａｒａｔｏｕ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ａ Ｐａｓｔｏｒ，Ｊｏｒｇｅ Ａ Ｚｅｐｅｄａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃｈａｎ－Ｗａｎｇ Ｊ Ｌｉｏ，ｅｔ ａｌ．２０１６．“Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＦｏｘＰ３ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＥＴ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１３（３）：３７７－３９７．

【0192】

Ｚｈｅｎｇ，Ｙｅ，Ｓｔｅｖｅｎ Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚ，Ａｓｈｕｔｏｓｈ Ｃｈａｕｄｈｒｙ，Ｘｉａｏ Ｐ．Ｐｅｎｇ，Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｆｏｒｂｕｓｈ，ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｙ．Ｒｕｄｅｎｓｋｙ．２０１０．“Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｎｏｎ－Ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ＦｏｘＰ３ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｆａｔｅ．”Ｎａｔｕｒｅ，４６３（７２８２）：８０８－８１２．

【0193】

本明細書に記載された実施例及び実施形態は例示的な目的のためだけであり、それに関する様々な変形例または変化は当業者に提案され、本出願の精神及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用されたすべての刊行物、特許及び特許出願は、すべての目的のためにその全体が参照により援用される。
配列表
配列番号１
ｐＣＣＬ－ＣＮＳｐ－ＦＯＸＰ３－３ＵＴＲ－Ａ２。接合マーカー由来の配列：

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3BC】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5BC】

【図5DE】

【図6】

【図7】

【図8AB】

【図8CD】

【図8EF】

【図9】

【図10A-D】

【図10E】

【図11AB】

【図11CD】

【図11EF】

【図12AB】

【図12C-E】

【図13A-D】

【図13EF】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B-D】

【図17】

【図18A】

【図18BC】

【配列表】

0007290288000001.app