特許 7290591 非常に低レベルのホルデインを有するオオムギ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-05

(45)【発行日】2023-06-13

(54)【発明の名称】非常に低レベルのホルデインを有するオオムギ

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/00 20160101AFI20230606BHJP

   C12C 1/00 20060101ALI20230606BHJP

   C12C 7/00 20060101ALI20230606BHJP

   A21D 13/00 20170101ALI20230606BHJP

   A23L 7/109 20160101ALI20230606BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20230606BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20230606BHJP

   A01H 6/46 20180101ALI20230606BHJP

   C12N 15/29 20060101ALN20230606BHJP

【ＦＩ】

A23L33/00 ZNA

C12C1/00

C12C7/00 Z

A21D13/00

A23L7/109 Z

A01H1/00 A

A01H5/10

A01H6/46

C12N15/29

【請求項の数】 18

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020047974

(22)【出願日】2020-03-18

(62)【分割の表示】P 2016518803の分割

【原出願日】2014-06-13

(65)【公開番号】P2020110171

(43)【公開日】2020-07-27

【審査請求日】2020-04-17

(31)【優先権主張番号】2013902140

(32)【優先日】2013-06-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(31)【優先権主張番号】2013902565

(32)【優先日】2013-07-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(73)【特許権者】

【識別番号】590003283

【氏名又は名称】コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション

(73)【特許権者】

【識別番号】506415252

【氏名又は名称】グレインズ・リサーチ・アンド・ディヴェロップメント・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー・ジョン・タナー

(72)【発明者】

【氏名】クリスピン・アレクサンダー・ホーウィット

(72)【発明者】

【氏名】ミッシェル・リサ・コルグレイヴ

(72)【発明者】

【氏名】マルコム・ジェームズ・ブランデル

【審査官】手島 理

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５３５５１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１３／０６３６５３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】G.J.Tanner et al.，Measuring Hordein (Gluten) in Beer - A comparison of ELISA and Mass Spectrometry，PLOS ONE，2013年02月，Vol.8, No.2，e56452

【文献】Journal of Cereal Science，vol.28，1998年，p.291-299

【文献】G.J.Tanner et al.,，Measuring Hordein (Gluten) in Beer - A comparison of ELISA and Mass Spectrometry，PLOS ONE，2013年02月，Vol.8, No.2，e56452

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｌ

Ｃ１２Ｃ

Ｃ１２Ｇ

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＢＡ／ＥＭＢＡＳＥ／ＦＳＴＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

食品若しくは麦芽ベースの飲料の成分、又は食品若しくは麦芽ベースの飲料を製造する方法であって、前記方法が、
（ｉ）麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉を製造するために、５０ｐｐｍ以下のホルデインを含むオオムギ粒を処理すること、及び／又は
（ｉｉ）オオムギ粒若しくは前記穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉を、少なくとも１つの他の食品若しくは飲料の成分と混合すること
を含み、
前記オオムギ粒、麦芽、麦芽汁、粒粉又は全粒粉が、５０ｐｐｍ以下のホルデインを含み、それにより、前記食品若しくは麦芽ベースの飲料の成分、又は食品若しくは麦芽ベースの飲料を製造し、
－ 前記穀粒が、Ｂ－ホルデインをコードする遺伝子のほとんど若しくは全てを欠失したＨｏｒ２座位のアリルに対してホモ接合型であり、又は、前記穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉が、Ｂ－ホルデインをコードする遺伝子のほとんど若しくは全てを欠失したＨｏｒ２座位の前記アリルを含むＤＮＡを含み、
－ 前記穀粒が、Ｈｏｒ３座位におけるＤ－ホルデインをコードする遺伝子のヌルアリルに対してホモ接合型であり、又は、前記穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉が、Ｄ－ホルデインをコードする遺伝子の前記ヌルアリルを含むＤＮＡを含み、
－ 前記穀粒が、前記穀粒がＣ－ホルデインを欠くように、Ｌｙｓ３座位におけるヌルアリルに対してホモ接合型である、
方法。

【請求項2】

前記穀粒が、約２０ｐｐｍ以下のホルデインを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記穀粒が、以下の１つ又は複数又は全てを有する、請求項１又は２に記載の方法：
ｉ）前記穀粒の平均重量が、３５ｍｇ～６０ｍｇである、
ｉｉ）前記穀粒の少なくとも８０％が、２．８ｍｍのふるいを通過しない、
ｉｉｉ）前記穀粒が、少なくとも４０％の収穫指数を有する植物由来である、
ｉｖ）前記穀粒が、５未満の、厚さに対する長さの比を有する、
ｖ）前記穀粒が、対応する野生型オオムギ植物由来の穀粒と比較して、少なくとも６０％の穀粒収量を有する植物由来である、
ｖｉ）前記穀粒の平均重量が、対応する野生型オオムギ植物由来の穀粒の少なくとも７０％である、及び
ｖｉｉ）前記穀粒が、非トランスジェニック植物由来である。

【請求項4】

前記穀粒から製造される粒粉又は全粒粉が、１０ｐｐｍ以下のホルデインを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記穀粒から製造される麦芽又は麦芽汁が、２０ｐｐｍ未満のホルデインを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記穀粒又は前記穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉が、以下：
ｉ）配列番号５３として提供されるアミノ酸の配列を含むＢ－ホルデイン；
ｉｉ）配列番号５４として提供されるアミノ酸の配列を含むＢ－ホルデイン；及び
ｉｉｉ）配列番号５６として提供されるアミノ酸の配列を含むＤ－ホルデイン
の１つ又は複数又は全てを欠く、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記Ｂ－ホルデインが、少なくともＢ１－ホルデイン及びＢ３－ホルデインである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記穀粒又は前記穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉が、野生型のレベルの２％未満のレベルの：
ｉ）配列番号５７として提供されるアミノ酸の配列を含むγ－ホルデイン；及び／又は、
ｉｉ）配列番号５２として提供されるアミノ酸の配列を含むアベニン様Ａタンパク質
をさらに有し、
前記２％未満のレベルは、オオムギ品種Ｂｏｍｉ、Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｙａｇａｎ、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ又はＣｏｍｍａｎｄｅｒの野生型オオムギ粒又は前記穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉に対するものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ｉ）前記食品の成分若しくは麦芽ベースの飲料の成分が、粒粉、デンプン、麦芽若しくは麦芽汁であり、若しくは、前記食品が、発酵した若しくは未発酵のパン、パスタ、麺類、朝食用シリアル、スナック食品、ケーキ、ペストリー若しくは小麦粉ベースのソースを含む食品である、又は
ｉｉ）前記麦芽ベースの飲料が、ビール若しくはウイスキーである、
請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

５０ｐｐｍ以下のホルデインを含む穀粒をもたらす、オオムギ植物であって、
－ 前記穀粒が、Ｂ－ホルデインをコードする遺伝子のほとんど又は全てを欠失したＨｏｒ２座位のアリルに対してホモ接合型であり、
－ 前記穀粒が、Ｈｏｒ３座位におけるＤ－ホルデインをコードする遺伝子のヌルアリルに対してホモ接合型であり、及び
－ 前記穀粒が、前記穀粒がＣ－ホルデインを欠くように、Ｌｙｓ３座位におけるヌルアリルに対してホモ接合型である、
オオムギ植物。

【請求項11】

前記穀粒が、請求項２～９に規定される特徴の１つ又は複数を含む、請求項１０に記載のオオムギ植物。

【請求項12】

請求項１０又は１１に記載のオオムギ植物の穀粒。

【請求項13】

オオムギ粒を製造する方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１０又は１１に記載のオオムギ植物を生育させること；
ｂ）前記穀粒を収穫すること；及び
ｃ）任意で、前記穀粒を処理すること
を含む、方法。

【請求項14】

粒粉、全粒粉、デンプン、麦芽、麦芽汁、又は穀粒から得られる他の製品を製造する方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１２に記載の穀粒を得ること；及び
ｂ）前記粒粉、全粒粉、デンプン、麦芽、麦芽汁又は他の製品を製造するために、前記穀粒を処理すること
を含む、方法。

【請求項15】

請求項１～９のいずれか一項に記載の方法を使用して製造される、食品又は麦芽ベースの飲料であって、前記食品又は麦芽ベースの飲料が、２０ｐｐｍ未満のホルデイン、並びにＢ－ホルデインをコードする遺伝子のほとんど又は全てを欠失したＨｏｒ２座位の前記アリル、Ｈｏｒ３座位におけるＤ－ホルデインをコードする遺伝子の前記ヌルアリル、及びＬｙｓ３座位における前記ヌルアリルを含むオオムギＤＮＡを含む、食品又は麦芽ベースの飲料。

【請求項16】

請求項１２に記載の穀粒の１つ又は複数のオオムギ粒タンパク質及び０．９ｐｐｍ未満のホルデインを含む、ビールであって、前記ビールが、Ｂ－ホルデインをコードする遺伝子のほとんど又は全てを欠失したＨｏｒ２座位の前記アリル、Ｈｏｒ３座位におけるＤ－ホルデインをコードする遺伝子の前記ヌルアリル、及びＬｙｓ３座位における前記ヌルアリルを含むオオムギＤＮＡを含む、ビール。

【請求項17】

請求項１２に記載の穀粒の１つ又は複数のオオムギ粒タンパク質及び１０ｐｐｍ未満のホルデインを含む、粒粉又は全粒粉であって、前記粒粉又は全粒粉が、Ｂ－ホルデインをコードする遺伝子のほとんど又は全てを欠失したＨｏｒ２座位の前記アリル、Ｈｏｒ３座位におけるＤ－ホルデインをコードする遺伝子の前記ヌルアリル、及びＬｙｓ３座位における前記ヌルアリルを含むオオムギＤＮＡを含む、粒粉又は全粒粉。

【請求項18】

請求項１２に記載の穀粒の１つ又は複数のオオムギ粒タンパク質及び５０ｐｐｍ未満のホルデインを含む、麦芽又は麦芽汁であって、前記麦芽又は麦芽汁が、Ｂ－ホルデインをコードする遺伝子のほとんど又は全てを欠失したＨｏｒ２座位の前記アリル、Ｈｏｒ３座位におけるＤ－ホルデインをコードする遺伝子の前記ヌルアリル、及びＬｙｓ３座位における前記ヌルアリルを含むオオムギＤＮＡを含む、麦芽又は麦芽汁。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、セリアック病の対象者が摂取するのに適した食品、または、麦芽ベースの飲料を製造する方法に関する。特に、本発明は、非常に低レベルのホルデインを有する食品、または、麦芽ベースの飲料を製造する方法にも関する。また、本発明の方法において使用することができる穀物を生産するオオムギ植物もまた、提供される。

【背景技術】

【0002】

セリアック病（ＣＤ）は、コムギ、オオムギ及びライムギなどの穀物からのプロラミンの消費により誘発されるＴ細胞媒介性の腸疾患である。ＣＤの臨床症状は、疲労、下痢、腹部膨満、体重減少、貧血症及び神経障害を含む（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＣＤは、腸がんリスクの１０倍増加、非ホジキンリンパ腫リスクの３～６倍増加、及び、腸Ｔ－細胞リンパ腫リスクの２８倍増加などの腸の悪性腫瘍の増加率（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、並びに、貧血、骨粗しょう症、神経障害の増加率、及び、糖尿病などの更なる自己免疫疾患の増加率（Ｓｋｏｖｂｊｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）と関連する。最も多く研究されたプロラミン、α－グリアジンの場合、毒性は、主として、単一ペプチド中の単一グルタミンにより媒介され（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、それにより最終的に小腸絨毛が損傷し、栄養吸収が低減し、かつ健康に影響を与える破壊的な反応の連鎖が生じる。コムギ、オオムギ及びライムギからのすべての既知のプロラミンタンパク質に対するセリアック毒性エピトープは、現在、コムギ、オオムギ及びライムギによる短期間の食事誘発性の、ＨＬＡ－ＤＱ２^＋セリアック病患者の末梢血から分離された不偏性のＴ細胞集団を用いて、広範囲にマッピングされている（Ｔｙｅ－Ｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。驚くべきことに、α－グリアジン（ＥＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＱ、配列番号：１）、ω－グリアジン／Ｃ－ホルデイン（ＥＱＰＦＰＱＰＥＱＰＦＰＷＱＰ、配列番号：２）、及び、Ｂ－ホルデイン（ＥＰＥＱＰＩＰＥＱＰＱＰＹＰＱＱ、配列番号：３）から誘導される３つの高い免疫原性を有するペプチドのみで、コムギ、オオムギ及びライムギタンパク質の完全な補体で誘発されるセリアック特異性応答の９０％を占める可能性がある。

【0003】

ＣＤのための現在の唯一の治療は、食事から、コムギ（グリアジン、グルテニン）、ライムギ（セカリン）、オオムギ（ホルデイン）、及びオートムギ（アベニン）で見出される類似のタンパク質のファミリーより成るグルテンを生涯に亘って回避することである。しかし、そのような食事は、高価であり（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）、そして、低繊維かつ高い糖質摂取量に付随して（Ｋｕｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５； Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｏｈｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、健康上のリスクがある。食事からグルテンを回避することは、大半のセリアック病患者の保健統計の正規化につながるが、全てではない（Ｌａｎｚｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｒｕｂｉｏ－Ｔａｐｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。全世界人口の約１％がセリアック病を患っているが、最大で５０％の成人が、診断されないままか、または、明白な症状が見られない（Ｃａｔａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｆｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0004】

コムギ連（ｔｒｉｃｉｃｅａｅ）穀粒の種子タンパク質における主要ファミリーとしては、アルブミン、グロブリン、及び、プロラミンと総称されるグルテン様タンパク質がある（Ｓｈｅｗｒｙ、及び、Ｔａｔｈａｍ，１９９０）。アルブミン及びグロブリンは、広く顕花植物間に分布しているが、プロラミンは、特に、イチゴツナギ亜科（Ｐｏｏｉｄｅａｅ）の草に制限されている（Ｈａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００２）。アミノ酸のプロリン及びグルタミンを、高い割合で含むため、そのように命名されたプロラミンは、消化の間、タンパク質分解に抵抗性をもつ（Ｈａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００２）。α－グリアジン遺伝子は、クローニングされた最初のプロラミン遺伝子であり、そして、セリアック病におけるこのタンパク質の役割について、現在、多くのことが知られている（Ｋａｓａｒｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。このプロラミンの毒性は、主要なアミノ酸であるグルタミン残基Ｑ６５を有する、単一タンパク質：５７－ＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＳ－７３（配列番号：４）に集中している。この単一のグルタミンの、例えば、リシンへの変異により、このプロラミンのセリアック病の毒性が消滅する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。部分的に加水分解されたペプチドは、上皮を横断し、そして、未知のメカニズムにより、粘膜固有層に接近し、ここで、Ｑ６５は、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）により、Ｅ６５（グルタミン酸）に脱アミド化され、ペプチドの免疫刺激の可能性を上昇させる（Ｓｋｏｖｂｊｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。負電荷は、抗原提示細胞の表面の受容体ＤＱ２（あまり一般的ではないが、ＤＱ８）へのペプチド結合を容易にし、腸を標的とする特定のグルテンに特異的で、ＤＱ２限定の、ＣＤ４＋Ｔ細胞へのペプチドの提示を可能にする。かくして活性化されたあと、ＣＤ４－Ｔ細胞は、クローン増殖を経て、わらにセリアック病に特徴的な、抗ＴＧ２及び抗グルテン抗体を最終的に産生するグルテン特異的、及び、ＴＧ２－特異的なＢ細胞の増殖を支える。細胞媒介性Ｔｈ１の応答は、また、炎症性サイトカインの分泌を介して発生する（Ｔｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。その結果、負に帯電した単一残基の導入で促進される単一のタンパク質の相互作用により、最終的に、腸絨毛の破壊につながる、一連の特定かつ標的となるカスケードが開始される。

【0005】

オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．）は、醸造や食品産業のための麦芽を製造するために使用される広く栽培される穀粒である。オオムギ麦芽は、発酵のための炭水化物源を供給するビールの主原料である。セリアック病患者には残念ながら、オオムギのビールにも、低レベルであるが、セリアック病毒性レベルのホルデイン（グルテン）が含まれている（Ｄｏｓｔａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ホルデインはオオオムギ粒タンパク質の半分を占め（Ｍｏｒａｖｃｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００９）、そして、４種の多重遺伝子ファミリーで構成され、Ｂ－ホルデイン（３０～４５ｋＤａ；ホルデイン含量の７０％）、及び、Ｃ－ホルデイン（４５～７５ｋＤａ；ホルデイン含量の２０％）が穀物のホルデインの大部分を占める一方、Ｄ－（１０５ｋＤａ）、及び、γ－ホルデイン（３５～４０ｋＤａ）は、微量成分である（Ｓｈｅｗｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ソルガム麦芽、キビ、ソバは、ビール製造のグルテンフリー代替品として使用されている（Ｗｉｊｎｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００７）が、これらの穀粒で大麦ビールの品質及び低コスト製造を再現することは困難である。

【0006】

２００８年にコーデックス委員会で採択されたグルテンフリー食品のＷＨＯの標準的な定義は、コムギ及びオオムギなどの穀粒から製造される食品は、「グルテンフリー」と表示されるためには、グルテン含量が２０ｍｇ／ｋｇ未満（２０ｐｐｍ）でなければならない。質量分析法を用いて、食品及び飲料のグルテン含有量を評価するための精度の高い定量法が、Ｃｏｌｇｒａｖｅらにより報告された（２０１２）。

【0007】

ＷＯ２００９／０２１２８５は、特に、ホルデインＢ及びＣにおいて、野生型レベルの１０％未満にホルデイン含量を低下させたオオオムギ粒の作製について記載している。しかし、ＣＤを患う人々が飲食できる食品及び飲料の製造のための非常に低レベルのホルデインを有する穀粒の必要性は、依然として存在する。
従って、ＣＤになり易い対象者の食料及び飲料製品に使用することができ、ＣＤを誘導するホルデインが実質的に低レベルであるオオムギが必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】ＷＯ２００９／０２１２８５

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６

【文献】Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９

【文献】Ｓｋｏｖｂｊｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００５

【文献】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００

【文献】Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２

【文献】Ｔｙｅ－Ｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００７

【文献】Ｋｕｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５

【文献】Ｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｏｈｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｌａｎｚｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００９

【文献】Ｒｕｂｉｏ－Ｔａｐｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｃａｔａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４

【文献】Ｆｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６

【文献】Ｓｈｅｗｒｙ、及び、Ｔａｔｈａｍ，１９９０

【文献】Ｈａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００２

【文献】Ｈａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００２

【文献】Ｋａｓａｒｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８４

【文献】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００

【文献】Ｓｋｏｖｂｊｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００４

【文献】Ｔｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｄｏｓｔａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００６

【文献】Ｍｏｒａｖｃｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００９

【文献】Ｓｈｅｗｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９

【文献】Ｗｉｊｎｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００７

【文献】Ｃｏｌｇｒａｖｅら，２０１２

【発明の概要】

【0010】

本発明者らは、非常に低レベルのホルデインを有するオオオムギ粒を生産している。この穀粒は、セリアック病を患う対象者が消費できる多種多様な食品及び麦芽ベース飲料の製造のために使用することができる。
第一の態様において、本発明は、食品若しくは麦芽ベースの飲料成分、または、食品若しくは麦芽ベースの飲料を製造する方法を提供し、該方法は、（ｉ）麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉を製造するためにオオオムギ粒を生産し、及び／または、（ｉｉ）オオオムギ粒、または、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉を少なくとも１つの他の食品または飲料成分と混合することを含み、ここに、オオオムギ粒、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉は、約５０ｐｐｍ以下のホルデインを含み、それにより、食品または麦芽ベースの飲料成分、食品または麦芽ベースの飲料を製造する。

【0011】

別の態様において、本発明は、食品若しくは麦芽ベースの飲料成分、または、食品若しくは麦芽ベースの飲料を製造する方法を提供し、方法は、（ｉ）麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒紛を生成するために、約５０ｐｐｍ以下のホルデインを含むオオムギ粒を加工すること、及び／または、（ｉｉ）オオムギ粒、または、該穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉を、少なくとも１つの他の食品若しくは飲料成分と混合することを含む方法を提供し、ここで、オオムギ粒、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉が約５０ｐｐｍ以下のホルデインを含み、それにより、食品若しくは麦芽ベースの飲料成分、または食品若しくは麦芽ベースの飲料を製造する。

【0012】

一実施形態において、穀粒、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉は、約２０ｐｐｍ以下、約１０ｐｐｍ以下、約５ｐｐｍ以下、約０．０５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍ、若しくは、約０．０５ｐｐｍ～約２０ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ～約１０ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ～約５ｐｐｍ、約０．１ｐｐｍ～約５ｐｐｍ、約３．９ｐｐｍ、または、約１．５ｐｐｍのホルデインを含む。

【0013】

別の実施形態において、穀粒の平均重量は、少なくとも約３５ｍｇ、少なくとも約３９ｍｇ、少なくとも約４１ｍｇ、少なくとも約４７ｍｇ、約３５ｍｇ～約６０ｍｇ、約４０ｍｇ～約６０ｍｇ、約４５ｍｇ～約６０ｍｇ、約３９．１ｍｇ、約４１．８ｍｇ、若しくは、約４７．２ｍｇである。

【0014】

更なる実施形態において、穀粒、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉は、２０ｐｐｍ以下のホルデインを含み、穀粒の平均重量は、約４０ｍｇ～約６０ｍｇである。別の実施形態において、穀粒、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉は、２０ｐｐｍ以下のホルデインを含み、穀粒の平均重量は、約４５ｍｇ～約６０ｍｇである。これらの組み合わせの具体的な言及は、これらの特徴の他の組み合わせを排除しない。

【0015】

更なる実施形態において、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約８０％～約９８％、若しくは、約８０％～約９３％の穀粒は、２．８ｍｍのふるいを通過しない。

【0016】

更なる実施形態において、穀粒、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉は、２０ｐｐｍ以下のホルデインを含み、穀粒の平均重量は、約４０ｍｇ～約６０ｍｇであり、穀粒の少なくとも約８０％が、２．８ｍｍのふるいを通過しない。別の実施形態において、穀粒、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉は、２０ｐｐｍ以下のホルデインを含み、穀粒の平均重量は、約４５ｍｇ～約６０ｍｇであり、及び、穀粒の少なくとも約８０％が、２．８ｍｍのふるいを通過しない。これらの組み合わせの具体的な言及は、これらの特徴の他の組み合わせを排除しない。

【0017】

尚、更なる実施形態において、穀粒は、少なくとも４０％、約４０％～約６０％、約４０％～約５５％、若しくは、約４０％～約５０％の収穫指数を有する植物からのものである。好ましい実施形態において、穀粒は、約４０％～約５０％の収穫指数を有する植物からのものである。

【0018】

別の実施形態において、穀粒は、厚さに対する長さの比が約５未満、約４未満、約３．８未満、約２～約５、若しくは、約２．５～約３．８である。

【0019】

更なる実施形態において、穀粒から製造された粒粉若しくは全粒粉は、約１０ｐｐｍ以下、約５ｐｐｍ以下、約０．０５ｐｐｍ～約１０ｐｐｍ、若しくは、約０．０５ｐｐｍ～約５ｐｐｍ、約３．９ｐｐｍ、若しくは、約１．５ｐｐｍのホルデインを含む。

【0020】

一実施形態において、穀粒から製造された麦芽、麦芽汁は、約５０ｐｐｍ未満、若しくは、約２０ｐｐｍ未満のホルデインを含む。

【0021】

更なる実施形態において、穀粒、または、該穀粒から製造される、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉は、１０％未満、５％未満、若しくは、２％未満レベルの野生型を有し、または：
ｉ）配列番号：５３として提供されるアミノ酸配列を含むＢ－ホルデイン；
ｉｉ）配列番号：５４として提供されるアミノ酸配列を含むＢ－ホルデイン；
ｉｉｉ）配列番号：５５として提供されるアミノ酸配列を含むＣ－ホルデイン；及び
ｉｖ）配列番号：５６として提供されるアミノ酸配列を含むＤ－ホルデイン：
の内の１つ、若しくは１つより多くの、若しくは、それら全てを欠き、ここに、１０％未満、５％未満若しくは２％未満の各々のレベルは、野生型のオオオムギ粒、または、オオムギ品種のＢｏｍｉ、Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｙａｇａｎ、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ、または、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒの該穀粒から製造された麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉に対してである。

【0022】

一実施形態において、Ｂ－ホルデインは、少なくともＢ１－ホルデイン（例えば、配列番号：７８として提供されるアミノ酸配列を含む）、及び、Ｂ３－ホルデイン（例えば、配列番号：７９として提供されるアミノ酸配列を含む）である。更なる例において、Ｃ－ホルデインは、配列番号：８０として提供されるアミノ酸配列を含む。尚、別の例において、Ｄ－ホルデインは、配列番号：７６として提供されるアミノ酸配列を含む。

【0023】

一実施形態において、穀粒、または、該穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉は、更に、１０％未満、５％未満、若しくは、２％未満レベルの野生型を含み、または、更に：
ｉ）配列番号：５７として提供されるアミノ酸配列を含むγ－ホルデイン；及び／または、
ｉｉ）配列番号：５２として提供されるアミノ酸配列を含むアベニン様Ａタンパク質；
を欠き、ここに、１０％未満、５％未満、若しくは、２％未満の各々のレベルは、野生型のオオオムギ粒、または、オオムギ品種のＢｏｍｉ、Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｙａｇａｎ、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ、またはＣｏｍｍａｎｄｅｒの該穀粒から製造された、麦芽、麦芽汁、粒粉若しくは全粒粉に対してである。例において、γ－ホルデインは、配列番号：８１として提供されるアミノ酸配列を含む。尚、別の例において、アベニン様Ａタンパク質は、配列番号：８４として提供されるアミノ酸配列を含む。

【0024】

好ましくは、上記の実施形態において、γ－ホルデインは、γ１－ホルデイン、及びγ２－ホルデインである。

【0025】

一実施形態において、穀粒は、Ｂホルデインをコードする遺伝子の大半または全てが削除されるＨｏｒ２座位のアリルに対してはホモ接合型であり、または、ここに、麦芽、麦芽汁、粒粉、若しくは、該穀粒から製造される全粒粉は、Ｂホルデインをコードする遺伝子の大半または全てが排除されるＨｏｒ２座位のアリルを含むＤＮＡを含有する。

【0026】

別の実施形態において、穀粒は、Ｈｏｒ３座位におけるＤ－ホルデインをコードする遺伝子のヌルアリルに対してホモ接合型であり、または、ここに、該穀粒から製造される麦芽、麦芽汁、粒粉、若しくは、全粒粉は、Ｄ－ホルデインをコードする遺伝子のヌルアリルを含むＤＮＡを含有し、ヌルアリルは、好ましくは、終止コドン、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異、挿入、欠失を含むか、または短縮型のＤ－ホルデインをコードし、または、Ｄ－ホルデインをコードする遺伝子の大半、または全てが欠失する。

【0027】

更なる実施形態において、短縮型Ｄ－ホルデインは、アミノ酸配列番号１５０をコードするトリプレットにおいて終止コドンを有する。

【0028】

別の実施形態において、穀粒は、Ｃ－ホルデインを欠く穀粒をもたらすオオムギのＬｙｓ３座位のアリルに対してホモ接合型であり、または、ここで該穀粒から製造された麦芽、麦芽汁、粒粉、または、全粒粉は、Ｌｙｓ３座位においてアリルを含むＤＮＡを含有する。

【0029】

更なる実施形態において、穀粒、麦芽、麦芽汁、粒粉、若しくは、全粒粉は、対応する野生型のオオムギ植物、または、対応する野生型のオオムギ植物からの穀粒から同一手法で製造した、麦芽、麦芽汁、粒粉、若しくは、全粒粉と比較したとき、約１％以下、約０．０１％以下、約０．００７％以下、約０．００２７％以下、約０．００１％～約１％、約０．００１％～約０．０１％、約０．００７％、若しくは、約０．００２７％のホルデインを含む。

【0030】

尚、別の実施形態において、穀粒は、野生型オオムギ植物の穀粒収量の少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、約６０％～１００％、約７０％～１００％、約８０％～１００％、約６０％、約７０％、約８０％若しくは約９０％を有する植物からのものである。

【0031】

別の実施形態において、穀粒の平均重量は、野生型オオムギ植物穀粒の、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、若しくは、約１００％である。

【0032】

尚、更なる実施形態において、穀粒、または、該穀粒から製造された麦芽、麦芽汁、粒粉、若しくは、全粒粉は、対応する野生型オオムギ植物と比較したとき、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、約０．１％～約１０％、若しくは、約０．１％～約１０％の１つ、または、１つ若しくはそれ以上の、または、全ての以下のもの：
ｉ）配列番号：５３として提供されるアミノ酸配列を含むＢ－ホルデイン；
ｉｉ）配列番号：５４として提供されるアミノ酸配列を含むＢ－ホルデイン；
ｉｉｉ）配列番号：５５として提供されるアミノ酸配列を含むＣ－ホルデイン；及び
ｉｖ）配列番号：５６として提供されるアミノ酸配列を含むＤ－ホルデイン；
を含む。

【0033】

別の実施形態において、穀粒、または、該穀粒から製造された麦芽、麦芽汁、粒粉、若しくは、全粒粉は、更に、対応する野生型オオムギ植物と比較したとき、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％～約１０％、若しくは、約０．１％～約１０％の以下のもの：
ｉ）配列番号：５７として提供されるアミノ酸配列を含むγ－ホルデイン；及び／または、
ｉｉ）配列番号：５２として提供されるアミノ酸配列を含むアベニン様Ａタンパク質；
を含む。

【0034】

別の実施形態において、穀粒、または、該穀粒から製造された麦芽、麦芽汁、粒粉、若しくは、全粒粉は、更に、対応する野生型オオムギ植物における量と比較したとき、約６０％以下の量のγ３－ホルデインを含み、γ３－ホルデインは、その配列が配列番号：８３として提供されるアミノ酸をはじめ、その配列が配列番号：５８として提供されるアミノ酸を含む。

【0035】

野生型オオムギ植物の例としては、Ｂｏｍｉ、Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｙａｇａｎ、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ、またはＣｏｍｍａｎｄｅｒを含むが、それに限定されない。

【0036】

別の実施形態において、穀粒のデンプン含量は、少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）である。より好ましくは、穀粒のデンプン含量は、約５０％～約７０％（ｗ／ｗ）である。

【0037】

更なる実施形態において、穀粒から製造された粒粉のセリアック病毒性は、対応する野生型オオムギ植物の穀粒から製造された粒粉の約５％未満、若しくは、約１％未満である。

【0038】

更なる実施形態において、平均粒重は：
ｉ）大半または全てのＢ－ホルデインをコードする遺伝子を欠失したＨｏｒ２座位のアリルに対してホモ接合型であり；
ｉｉ）Ｃ－ホルデインを欠く穀粒をもたらすオオムギのＬｙｓ３座位のアリルに対してホモ接合型であり；及び
ｉｉｉ）Ｄ－ホルデインをコードする全長タンパク質の野生型アリルに対してホモ接合型である；
穀粒よりも、少なくとも１．０５倍、少なくとも１．１倍、若しくは、１．０５～１．３倍大きい。

【0039】

尚、更なる実施形態において、穀粒は：
ｉ）Ｂ－ホルデインをコードする遺伝子の大半または全てを除去したＨｏｒ２座位のアリルに対してホモ接合型であり、；
ｉｉ）Ｃ－ホルデインを欠く穀粒をもたらすオオムギのＬｙｓ３座位のアリルに対してホモ接合型であり；、及び
ｉｉｉ）Ｄ－ホルデイン全長タンパク質をコードする野生型のアリルに対してホモ接合型である；植物からの穀粒収量より、少なくとも１．２０倍、若しくは、少なくとも１．３５倍、若しくは、１．２～１．５倍、若しくは、１．２～２．０倍高い穀粒収量を有する植物からのものである。

【0040】

例えば、２つの上記実施形態に関して、ｉ）～ｉｉｉ）で定義された特徴を有する穀粒は、ＷＯ２００９／０２１２８５で記載されたＧ１^＊粒であり得る。

【0041】

別の実施形態において、オオムギ粒のゲノムの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは、少なくとも約９５％は、Ｓｌｏｏｐ、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ、Ｏｘｆｏｒｄ、またはＭａｒａｔｉｍｅなどのオオムギ野生型栽培種のゲノムと同一であるが、しかしそれに限定されない。

【0042】

一実施形態において、穀粒は、非トランスジェニック植物からのものである。

【0043】

更なる実施形態において、穀粒は、トランスジェニック植物からのものである。

【0044】

更なる実施形態において、植物は、穀粒中に少なくとも１つのホルデインの生成を下方制御するポリヌクレオチドをコードする導入遺伝子を含む。好ましくは、この実施形態のポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒性ポリヌクレオチド、人工マイクロＲＮＡ、または、ホルデインをコードする１つまたは好ましくはそれ以上の遺伝子の発現を下方制御する二本鎖ＲＮＡ分子である。

【0045】

別の実施形態において、この方法は、穀粒からの粒粉若しくは全粒粉を製造することを含む。

【0046】

更なる実施形態において、方法は、穀粒からの麦芽を製造することを含む。

【0047】

一実施形態において、麦芽ベースの飲料はビールであり、方法は、穀粒の発芽及びそれらに由来する穀粒の粉砕からなる。実施形態において、方法は、更に、乾燥した発芽穀粒を、２つ若しくはそれ以上の、胚乳画分、内皮層画分、穀皮画分、幼芽鞘画分及び麦芽根画分に分別すること；並びに、２つ若しくはそれ以上の画分の所定量を組合せること、及び、混合することを含む。

【0048】

一実施形態において、穀粒の少なくとも約５０％が、吸水後３日以内に発芽する。

【0049】

更なる実施形態において、食品成分または麦芽ベースの飲料成分は、粒粉、デンプン、麦芽若しくは麦芽汁であり、または、ここで食品は、発酵パン、または、無発酵パン、パスタ、麺類、朝食用シリアル、スナック食品、ケーキ、ペストリー、若しくは、粉ベースのソースを含む食品である。

【0050】

一実施形態において、麦芽ベースの飲料はビールまたはウイスキーである。

【0051】

一実施形態において、食品または麦芽ベースの飲料は、ヒトの飲食用である。

【0052】

更なる実施形態において、食品または飲料を飲食後、セリアック病の少なくとも１つの症状が、該疾患を患う対象者で現れない。

【0053】

別の態様において、本発明は、約５０ｐｐｍ以下のホルデインを含む穀粒を製造するオオムギ植物を提供する。

【0054】

本発明のオオムギ植物の穀粒もまた提供される。

【0055】

本発明の穀粒、及び／または、本発明のオオムギ植物の穀粒は、上記で定義した１つ若しくはそれ以上の特徴を有してもよい。

【0056】

一実施形態において、オオオムギ粒は、本発明のオオムギ植物を生産することが可能である。

【0057】

一実施形態において、穀粒は、発芽することができないように処理される。

【0058】

一実施形態において、穀粒は外皮がない。

【0059】

別の態様において、本発明は、オオムギ粒を製造する方法を提供し、該方法は：
ａ）本発明のオオムギ植物を発育させ；
ｂ）穀粒を収穫し；及び
ｃ）任意に穀粒を製造する；
ことを含む。

【0060】

一実施形態において、この方法は、少なくとも１ヘクタールの面積の農地に、少なくとも１０，０００本の植物を発育させることを含む。

【0061】

別の態様において、本発明は、粒粉、全粒粉、デンプン、麦芽、麦芽汁、または、穀粒から得られる他の製品を製造する方法を提供し、前記方法は：
ａ）本発明の穀粒を得ること；及び
ｂ）粒粉、全粒粉、デンプン、麦芽、麦芽汁または他の製品を製造するために穀粒を加工すること；
を含む。

【0062】

また、本発明のオオムギ植物、または、本発明の穀粒から製造される製品を提供する。

【0063】

一実施形態において、製品は、食品成分、麦芽ベースの飲料成分、食品または麦芽ベースの飲料製品である。

【0064】

一実施形態において、麦芽ベースの飲料製品は、ビールまたはウイスキーである。

【0065】

更なる実施形態において、製品は非食品である。例としては、フィルム、コーティング剤、接着剤、建材及び包装材が挙げられるが、それに限定されない。

【0066】

また、本発明の方法を用いて製造される食品または麦芽ベースの飲料も提供される。

【0067】

別の態様において、１つ若しくはそれ以上のオオオムギ粒タンパク質、及び、０．９ｐｐｍ未満のホルデインを含むビールが提供される。

【0068】

実施形態において、ビールは、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、若しくは、少なくとも約５％のエタノールを含む。

【0069】

別の態様において、本発明は、１つ若しくはそれ以上のオオオムギ粒タンパク質、及び、約５０ｐｐｍ未満、若しくは、約２０ｐｐｍ未満のホルデインを含む、粒粉若しくは全粒粉を提供する。

【0070】

別の態様において、本発明は、１つ若しくはそれ以上のオオオムギ粒タンパク質、及び、約５０ｐｐｍ未満、若しくは、約２０ｐｐｍ未満のホルデインを含む、麦芽、または、麦芽汁を提供する。

【0071】

更なる態様において、本発明は、短縮型Ｄ－ホルデインをコードするオオムギのＤ－ホルデイン遺伝子のアリルを同定する方法を提供し、方法は：
ｉ）オオムギ植物から核酸を含むサンプルを得ること；及び
ｉｉ）Ｄ－ホルデインをコードするオープンリーディングフレームの４５０位におけるグアニン残基の有無についてサンプルを分析すること；
を含み、ここで、グアニンの存在は、Ｄ－ホルデイン遺伝子が短縮型Ｄ－ホルデインをコードすることを示す。

【0072】

実施形態において、工程ｂ）は、プライマー：ＧＧＣＡＡＴＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣ（配列番号：６６）及び、ＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＣ（配列番号：６７）、または、その内の１つ、若しくは、両方の多様体を用いてゲノムＤＮＡを増幅すること、及び、制限酵素ＫｐｎＩと増幅産物を接触させることを含み、ここで開裂の非存在は、Ｄ－ホルデイン遺伝子が短縮型Ｄ－ホルデインをコードすることを示す。

【0073】

更なる態様において、本発明は、対象者においてセリアック病を回避する、または、重症度を低減する方法を提供し、上述の方法は、本発明の食品若しくは麦芽ベースの飲料、または、本発明の穀粒を対象者に投与することを含み、ここで、セリアック病の発症率または重症度の低減は、対象者が、野生型のオオオムギ粒から作られた、対応する食品または麦芽ベース飲料を同量経口投与された場合に対する。

【0074】

また、対象者がセリアック病の発症の回避及び重症度の低減のために経口摂取する食品または飲料の製造に、本発明の食品若しくは麦芽ベース飲料、または本発明の穀粒の使用が提供される。

【0075】

更なる態様において、本発明は：
ａ）１つ若しくはそれ以上の下記の材料を得ること；
ｉ）該穀粒を製造可能にする植物からの試料；
ｉｉ）穀粒；
ｉｉｉ）穀粒から製造される麦芽；及び／または、
ｉｖ）該穀粒の抽出物；
ｂ）工程ａ）からの材料のＢ、Ｃ及びＤ－ホルデイン由来の、Ｂ、Ｃ及びＤ－ホルデインペプチドのレベル、及び／または、Ｂ、Ｃ及びＤ－ホルデイン遺伝子のアリルを分析すること；
ｃ）セリアック病を患う対象者が飲食する食品及び／または麦芽ベース飲料製造のために、約５０ｐｐｍ以下のホルデインを含む穀粒を選択すること；
を含む、セリアック病を患う対象者による消費のための食品、及び／または、麦芽ベース飲料を製造するために使用することができるオオオムギ粒を同定するための方法を提供する。

【0076】

実施形態において、工程ａ）からの材料は、ゲノムＤＮＡを含み、そして、工程ｂ）は：
ｉ）配列番号：５３として提供されるアミノ酸の配列を含むＢ－ホルデイン；
ｉｉ）配列番号：５４として提供されるアミノ酸の配列を含むＢ－ホルデイン；
ｉｉｉ）配列番号：５５として提供されるアミノ酸の配列を含むＣ－ホルデイン；及び
ｉｖ）配列番号：５６として提供されるアミノ酸の配列を含むＤ－ホルデイン；
の内、１つ若しくはそれ以上、若しくは全てをコードする遺伝子のアリルの不在または存在を同定することを含み、ここで、アリルの不在は、約５０ｐｐｍ以下のホルデインを含む穀粒と同定される。

【0077】

本明細書におけるいずれかの実施形態は、特に指示のない限り、他の実施形態に準用されるべきである。

【0078】

本発明は、例示の目的のみを意図した、本明細書に記載の特定の実施形態により範囲を限定されるものではない。本明細書に記載の通り、機能的に等価な製品、組成物及び方法は、本発明の範囲内に明示されている。

【0079】

本明細書を通して、特に指示のない限り、または、文脈上他の意味に解釈される場合を除き、単一工程、材料の組成物、工程のグループ、または、材料の組成物のグループへの言及は、１つ及び複数（即ち、１つ若しくはそれ以上）のこれらの工程、材料の組成物、工程のグループまたは材料の組成物のグループを包含すると解釈すべきである。

【0080】

本発明は、以下の非限定的な実施例により、及び、添付の図面を参照して、下記で説明される。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】オオムギ染色体１の模式図を表す。

【図2】ビール中の相対的なホルデインの定量結果を表す。選択されたペプチドのピーク面積は、ビール中で検出された最も多いホルデイン、または、関連ポリペプチドを表す。（Ａ）ＱＱＣＣＱＰＬＡＱＩＳＥＱＡＲ（配列番号：５）は、アベニン様Ａタンパク質を表し；（Ｂ）ＶＦＬＱＱＱＣＳＰＶＲ（配列番号：５３）は、Ｂ１－ホルデインを表し； （Ｃ）ＶＦＬＱＱＱＣＳＰＶＰＭＰＱＲ（配列番号：５４）は、Ｂ３－ホルデインを表し； （Ｄ）ＥＬＱＥＳＳＬＥＡＣＲ（配列番号：５６）は、Ｄ－ホルデインを表し； 及び（Ｅ）ＱＱＣＣＱＱＬＡＮＩＮＥＱＳＲ（配列番号：５８）は、γ－ホルデイン－３を表す。これらの代表的なペプチドは、野生型（Ｓｌｏｏｐ）、並びに、Ｒｉｓ_φ５６及びＲｉｓ_φ１５０８からそれぞれ作られた、２つのホルデイン欠失ビール、及び６０の市販ビールの、主要なホルデインタンパク質の相対量を示すために使用された。グルテンフリーのビール１７、４７、４９～５２、５４で見られる小ピーク面積は、低レべルの信号ノイズに起因し、ホルデイン検出に起因するものではない。

【図3】Ｓｌｏｏｐ（野生型）及びＥｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８（ヌル型）のＤ－ホルデインアミノ酸配列の比較を示す。

【図4-1】Ｓｌｏｏｐ（野生型）及びＥｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８（ヌル型）からのＤ－ホルデインアミノ酸及び翻訳領域のヌクレオチド配列の比較を示す。各アリルの検出のためのプライマーの位置は、野生型配列中にのみ存在するＫｐｎ１切断部位に沿って示される。

【図4-2】Ｓｌｏｏｐ（野生型）及びＥｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８（ヌル型）からのＤ－ホルデインアミノ酸及び翻訳領域のヌクレオチド配列の比較を示す。各アリルの検出のためのプライマーの位置は、野生型配列中にのみ存在するＫｐｎ１切断部位に沿って示される。

【図4-3】Ｓｌｏｏｐ（野生型）及びＥｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８（ヌル型）からのＤ－ホルデインアミノ酸及び翻訳領域のヌクレオチド配列の比較を示す。各アリルの検出のためのプライマーの位置は、野生型配列中にのみ存在するＫｐｎ１切断部位に沿って示される。

【図4-4】Ｓｌｏｏｐ（野生型）及びＥｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８（ヌル型）からのＤ－ホルデインアミノ酸及び翻訳領域のヌクレオチド配列の比較を示す。各アリルの検出のためのプライマーの位置は、野生型配列中にのみ存在するＫｐｎ１切断部位に沿って示される。

【図5】ピーク面積でのＭＲＭ ＭＳによるＵＬＧ３．０系統のホルデイン含量の定量、及びＳｌｏｏｐ（１００％）のピーク面積に対する百分率を示す。

【図6】ピーク面積でのＭＲＭ ＭＳによるＵＬＧ３．０系統のホルデイン含量の定量、及びＳｌｏｏｐ（１００％）のピーク面積に対する百分率を示す。

【図7】定義されたペプチドに対するピーク面積でのＭＲＭ ＭＳによるＵＬＧ３．０ビールのホルデイン含量の定量を示す。ピーク面積は、Ｓｌｏｏｐ（１００％）に対する百分率として示される。

【図8-1】野生型品種Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ、及び、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈと比較した、ＵＬＧ３．０（Ｔ２－４－８）、及び、ＵＬＧ３．２候補系統からの粒粉におけるＭＲＭ ＭＳによるホルデイン、及び、ホルデイン様タンパク質の定量を示す。各グラフは、各ホルデインファミリ－からの代表的なペプチドの合計ピーク面積（３つのＭＲＭ遷移）に対する平均値＋／－ＳＤを示す。各々のケースにおいて、ペプチド（グラフに記載された配列）は、アベニン様Ａタンパク質、Ｂ１－、Ｂ３－、Ｃ－、Ｄ－、γ１－、または、γ３－ホルデインを図示する。Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号は、凡例に示されている（例えば、第一の例に対してＦ２ＥＧＤ５）。

【図8-2】野生型品種Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ、及び、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈと比較した、ＵＬＧ３．０（Ｔ２－４－８）、及び、ＵＬＧ３．２候補系統からの粒粉におけるＭＲＭ ＭＳによるホルデイン、及び、ホルデイン様タンパク質の定量を示す。各グラフは、各ホルデインファミリ－からの代表的なペプチドの合計ピーク面積（３つのＭＲＭ遷移）に対する平均値＋／－ＳＤを示す。各々のケースにおいて、ペプチド（グラフに記載された配列）は、アベニン様Ａタンパク質、Ｂ１－、Ｂ３－、Ｃ－、Ｄ－、γ１－、または、γ３－ホルデインを図示する。Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号は、凡例に示されている（例えば、第一の例に対してＦ２ＥＧＤ５）。

【図8-3】野生型品種Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ、及び、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈと比較した、ＵＬＧ３．０（Ｔ２－４－８）、及び、ＵＬＧ３．２候補系統からの粒粉におけるＭＲＭ ＭＳによるホルデイン、及び、ホルデイン様タンパク質の定量を示す。各グラフは、各ホルデインファミリ－からの代表的なペプチドの合計ピーク面積（３つのＭＲＭ遷移）に対する平均値＋／－ＳＤを示す。各々のケースにおいて、ペプチド（グラフに記載された配列）は、アベニン様Ａタンパク質、Ｂ１－、Ｂ３－、Ｃ－、Ｄ－、γ１－、または、γ３－ホルデインを図示する。Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号は、凡例に示されている（例えば、第一の例に対してＦ２ＥＧＤ５）。

【図8-4】野生型品種Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ、及び、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈと比較した、ＵＬＧ３．０（Ｔ２－４－８）、及び、ＵＬＧ３．２候補系統からの粒粉におけるＭＲＭ ＭＳによるホルデイン、及び、ホルデイン様タンパク質の定量を示す。各グラフは、各ホルデインファミリ－からの代表的なペプチドの合計ピーク面積（３つのＭＲＭ遷移）に対する平均値＋／－ＳＤを示す。各々のケースにおいて、ペプチド（グラフに記載された配列）は、アベニン様Ａタンパク質、Ｂ１－、Ｂ３－、Ｃ－、Ｄ－、γ１－、または、γ３－ホルデインを図示する。Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号は、凡例に示されている（例えば、第一の例に対してＦ２ＥＧＤ５）。

【0082】

主要な配列リスト
配列番号：１及び４－コムギα－グリアジンペプチド；
配列番号：２、３、６～１１、１６～５９、及び８５－オオムギホルデインペプチド：
配列番号：５－コムギアベニン様Ａペプチド；
配列番号１２～１５－ライムギプロラミンペプチド；
配列番号６０～７１－オリゴヌクレオチドプライマー；
配列番号：７２－オオムギ品種Ｓｌｏｏｐ Ｄ－ホルデインをコードするゲノム領域；
配列番号：７３－オオムギ品種Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８、Ｄ－ホルデイン（ヌル型）をコードするゲノム領域；
配列番号：７４－オオムギ品種Ｓｌｏｏｐ Ｄ－ホルデイン；
配列番号：７５－オオムギ品種Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１１８ Ｄ－ホルデイン；
配列番号：７６－ オオムギ品種Ｓｌｏｏｐ Ｄ－ホルデインをコードするオープンリーディングフレーム；
配列番号：７７－オオムギ品種Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８ Ｄ－ホルデインをコードするオープンリーディングフレーム；
配列番号：７８－野生型オオムギ、Ｂ１－ホルデインの例（アクセッション番号：Ｑ４００２０）；
配列番号：７９－野生型オオムギ、Ｂ３－ホルデインの例（アクセッション番号：Ｑ４Ｇ３Ｓ１）；
配列番号：８０－野生型オオムギ、Ｃ－ホルデインの例（アクセッション番号：Ｑ４００５５）；
配列番号：８１－野生型オオムギ、γ１－ホルデインの例（アクセッション番号：Ｐ１７９９０）；
配列番号：８２－野生型オオムギ、γ２－ホルデインの例（アクセッション番号：Ｑ７０ＩＢ４）；
配列番号：８３－野生型オオムギ、γ３－ホルデインの例（アクセッション番号：Ｐ８０１９８）；
配列番号：８４－野生型オオムギ、アベニン様Ａタンパク質の例（アクセッション番号：Ｆ２ＥＧＤ５）；

【発明を実施するための形態】

【0083】

一般技術及び定義：
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有すると解釈すべきである（例えば、植物育種、食品製造技術、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、タンパク質化学及び生化学において）。

【0084】

特に指示しない限り、本発明で利用される、組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学的手法は、当業者に公知の標準的な手法である。その様な技術は：Ｊ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９），Ｔ．Ａ． Ｂｒｏｗｎ（編者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １及び２， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６），及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までのすべての改訂を含む），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），及びＪ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までのすべての改訂を含む）などの文献を通して、記載及び説明される。

【0085】

本明細書で使用される、用語「オオムギ」は、他の種との交雑により生成されるその祖先、並びに、その子孫を含め、オオムギ属（Ｇｅｎｕｓ Ｈｏｒｄｅｕｍ）の任意の種を指す。大麦の好ましい形態は、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）種である。現在世界で商業的に栽培されているオオムギの大半の品種の穀粒は、外穎（ｏｕｔｅｒ ｌｅｍｍａ）と内花穎（ｉｎｎｅｒ ｐａｌｅａ）であるいわゆる籾殻は、成熟期に果皮の表皮に接合される（脱殻した）穎果（ｃａｒｙｏｐｓｅｓ）を包含する。殻なし、または、ハダカムギと呼ばれている他の品種は、脱穀フリーであり、籾殻は、容易に、脱穀工程で除去される。脱穀したオオムギ粒は、醸造業及び動物飼料に好ましいが、脱穀粒は、精麦後も使用することができ、ハダカムギはヒトの消費にとって好ましいものである。殻なしの穀粒形質は、染色体７Ｈの長腕上に位置する単一の、劣性遺伝子として指定されるｎｕｄにより制御される（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0086】

セリアック（ＣｏｅｌｉａｃまたはＣｅｌｉａｃ）病は、早期乳児期の後、すべての年齢層において、遺伝的素因を有する個体で発生する小腸の自己免疫疾患である。それは、大幅に過小診断されているが、インド・ヨーロッパ系民族の約１％に影響を与えている。セリアック病は、グリアジン、小麦で見出されたグルテンタンパク質（及び、オオムギ、ライムギなどの他の品種を含むＴｒｉｔｉｃｅａｅ連の類似タンパク質）により引き起こされる。グリアジンに曝露されるとき、酵素の組織トランスグルタミナーゼは、タンパク質を改変し、免疫系は腸組織と交差反応し、炎症反応を引き起こす。これは、小腸の内膜の平坦化につながり、栄養素の吸収を妨げる。唯一の有効な治療法は、生涯に亘るグルテンフリーの食事である。この状態は、セリアック病（合字）、セリアック（Ｃ（Ｏ）ｅｌｉａｃ）下痢、非熱帯性下痢、風土病下痢、グルテン性腸疾患、または、グルテン過敏性腸疾患、及び、グルテン不耐症を含むいくつかの別の名前を有する。セリアック病の症状は、個人により大きく異なる。セリアック病の症状は、１つ若しくは複数の下記の項目：ガス、再発性腹部膨満及び痛み、慢性下痢、便秘、蒼白、悪臭、または、脂肪便、体重減少／体重増加、疲労、原因不明の貧血（疲労の原因となる赤血球細胞の低い数値）、骨または関節の痛み、骨粗しょう症、骨減少症、行動の変化、足の刺痛、しびれ（神経損傷からの）、筋肉のけいれん、発作、（しばしば過度の体重減少に起因する）月経周期の欠落、不妊症、反復流産、成長遅延、乳児の成長障害、口腔内蒼白ただれ、いわゆるアフタ性潰瘍、歯の変色やエナメル質の喪失、及び、疱疹性皮膚炎と呼ばれるかゆみ、皮膚発疹を含む。疲労感、断続的な下痢、腹部の痛み若しくは痙攣、消化不良、鼓腸、腹部膨満及び体重減少などの幾つかの一般的症状が含まれる。例えば、ＷＯ０１／０２５７９３に記載されている通り、セリアック病は診断することができる。

【0087】

本明細書で使用する場合、「Ｈｏｒ３座位でのＤ－ホルデインをコードするＮｕｌｌアリル」は、Ｄ－ホルデインタンパク質をコードしないこの座位のいずれかのアリルを指し、または、タンパク質をコードしない場合、それはセリアック病を患う対象者に対しては免疫原性ではない（図３で提供する短縮型のＤ－ホルデインなど）。

【0088】

本明細書で使用される場合、記載された物質の文脈において本明細書中で使用する「欠失する」という用語は、物質が本発明のオオオムギ粒若しくはそれ由来する製品に存在しないこと、または、物質のアッセイを当該分野で公知の方法を用いて実施したとき、物質が本発明の穀粒若しくは製品中で検出されないことを意味する。即ち、物質は、検出するには不十分であるか、またはその物質のアッセイの標準誤差の範囲内のレベルで存在する。例えば、記載したホルデインの文脈において、用語「欠失する」は、特定のホルデインが、例えば、本明細書に例示した、ＭＲＭ ＭＳ測定法、ＥＬＩＳＡ測定法、または、２次元ゲル電気泳動法などの測定法では検出されないことを意味する。欠失している物質は、１種類の測定法または複数の種類の測定法で検出されない。対応する野生型の穀粒または製品において、当技術分野で公知の測定法により決定される通り、本発明の穀粒または製品に欠失していると言われる物質が存在することが理解されるであろう。

【0089】

本明細書で使用される通り、用語「ホルデイン」は、例えば、「約５０ｐｐｍ以下ホルデイン」の語句で使用されるとき、及び類似の語句は、Ｂ－、 Ｃ－、Ｄ－、及び、g－ホルデインを含む全ホルデインを意味する。

【0090】

用語「種子」及び「穀粒」は、本明細書において互換的に使用される。「穀粒」は、一般的に、成熟した収穫穀物を意味するだけでなく、例えば、粉砕または研磨などの処理後の穀粒を意味する。ここで、大半の穀粒は文脈に応じて、そのままの状態または吸収若しくは発芽後である。成熟した穀粒は、通常、約１８～２０％未満の水分を有する。野生型のオオムギ粒（全粒）は、一般的に、９～１２％のタンパク質を含み、その内の約３０～５０％、一般的には、３５％がプロラミンであり、野生型のオオムギの粒は、重量で約３～４％のプロラミンを有する。プロラミンは、胚乳中でほぼ独占的に見出され、それは全粒重量の約７０％である。

【0091】

本明細書で使用する場合、用語「収穫指数」とは、植物の総重量の百分率として収穫穀粒の重量を指す。

【0092】

本明細書で使用する場合、用語「対応する野生型」のオオムギ植物は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、及び、さらにより好ましくは９９．５％の、未改変のホルデインレベルを有する穀粒を生産する本発明の遺伝子型の植物を指す。一実施形態において、「対応する野生型」のオオムギ植物は、穀粒中のホルデイン生成の低下をもたらす遺伝的多様体を導入するために植物育種の実験で使用した栽培品種である。別の実施形態において、「対応する野生型」オオムギ植物は、穀粒中のホルデイン生成を低下させる導入遺伝子を導入した親品種である。更なる実施形態において、「対応する野生型」オオムギ植物は、Ｂｏｍｉ、Ｓｌｏｏｐ、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ ＩＩ、Ｋ８、Ｌ１、Ｖｌａｍｉｎｇｈ、Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、Ｈａｍｅｌｉｎ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ、Ｇａｉｒｄｎｅｒ、Ｂｕｌｏｋｅ、ＷＩ３５８６－１７４７、ＷＩ３４１６、Ｆｌａｇｓｈｉｐ、Ｃｏｗａｂｂｉｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＳｌｏｏｐＳＡ、ＳｌｏｏｐＶｉｃ、Ｑｕａｓａｒ、ＶＢ９１０４、Ｇｒｉｍｍｅｔｔ、Ｃａｍｅｏ^＊Ａｒｕｐｏ ３１－０４、 Ｐｒｉｏｒ、Ｓｃｈｏｏｎｅｒ、Ｕｎｉｃｏｒｎ、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｔｏｒｒｅｎｓ、Ｇａｌｌｅｏｎ、Ｍｏｒｅｘ、Ｄｈｏｗ、Ｃａｐｓｔａｎ、Ｆｌｅｅｔ、Ｋｅｅｌ、Ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｙａｒｒａ、Ｄａｓｈ、Ｄｏｏｌｕｐ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、Ｍｏｌｌｏｙ、Ｍｕｎｄａｈ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｎｓｌｏｗ、Ｓｋｉｆｆ、Ｕｎｉｃｏｒｎ、Ｙａｇａｎ、Ｃｈｅｂｅｃ、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ、Ｃｈａｒｉｏｔ、Ｄｉａｍａｎｔ、Ｋｏｒａｌ、Ｒｕｂｉｎ、Ｂｏｎｕｓ、Ｚｅｎｉｔ、Ａｋｃｅｎｔ、Ｆｏｒｕｍ、Ａｍｕｌｅｔ、Ｔｏｌａｒ、Ｈｅｒｉｓ、Ｍａｒｅｓｉ、Ｌａｎｄｏｒａ、Ｃａｒｕｓｏ、Ｍｉｒａｌｉｘ、Ｗｉｋｉｎｇｅｔｔ Ｂｒｉｓｅ、Ｃａｒｕｓｏ、Ｐｏｔｔｅｒ、Ｐａｓａｄｅｎａ、Ａｎｎａｂｅｌｌ、Ｍａｕｄ、Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｓａｌｏｏｎ、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ、Ａｓｔｏｒｉａ、Ｅｌｏ、Ｃｏｒｋ、Ｅｘｔｒａｃｔ、Ｌａｕｒａなどのオオオムギ粒の商業的製造のために、出願日で使用されている品種であるが、それに限定されない。一実施形態において、「対応する野生型」オオムギ植物は、Ｈｏｒ２、Ｈｏｒ１、Ｈｏｒ３、及びＨｏｒ５座位でコードされたＢ、Ｃ、Ｄ、及びγ－ホルデインを含む、機能的ホルデインタンパク質をコードする機能的ホルデイン遺伝子の完全相補体に基づき、未改変のホルデインレベルを有する穀粒を生産する。

【0093】

本明細書で使用する場合、用語「１つ若しくはそれ以上のオオムギ粒のタンパク質」は、ホルデイン以外のオオムギ粒により自然に生じるタンパク質を指す。その様なタンパク質の例は、当業者に公知である。具体的な例としては、９ｋＤａの脂質伝達タンパク質１（ＬＴＰ１）（参照：Ｄｏｕｌｉｅｚ ｅｔ ａｌ．（２０００）の総説、及び、例として、Ｓｗｉｓｓ－ｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０７５９７）、α－アミラーゼトリプシン阻害剤（ＣＭｄ、ＣＭｂ、ＣＭａ）、タンパク質Ｚ（参照：Ｂｒａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）及び、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｐ０６２９３）、及び、その製造（成熟）形態、並びに、変性された形態、及び／または、本発明の麦芽、粒粉、全粒粉、食品または麦芽ベースの飲料の製造の結果として生成された断片を含む、Ｃｏｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）により同定されたタンパク質などのオオムギアルブミンを含むが、それに限定されない。

【0094】

本明細書で使用する場合、「穀粒の平均重量」は、好ましくは、少なくとも２５、少なくとも５０または少なくとも１００、より好ましくは、少なくとも約１００の個々の植物（または、同一条件下で生育した遺伝的に同一の植物）から穀粒を入手することにより測定し、そして穀粒の平均重量を決定する。

【0095】

本明細書で使用する場合、用語「麦芽」は、オオムギ麦芽を指すために使用され、「粒粉」は、オオムギ粒粉を指し、「全粒粉」は、オオムギ全粒粉を指し、「ビール」は、麦芽、粒粉、全粒粉またはビールが明確にオオムギ以外の源から生成したと記載されている場合を除いて、発酵可能な炭水化物を提供する主成分としてオオムギを用い、製造されたビールを指す。本明細書で使用する場合、用語「麦芽汁」は、ビール、または、ウィスキーの醸造時にマッシング工程から抽出した液体を指す。麦芽汁は、アルコールを生成するためにビール酵母により発酵される糖を含む。より具体的には、本発明の麦芽、麦芽汁、粒粉、ビール、全粒粉、食品などの原料は、オオオムギ粒の製造処理（例えば、粉砕、及び／または、発酵）からである。本発明の穀粒、麦芽、麦芽汁、粒粉、全粒粉またはビールは、オオムギに由来しない穀粒、麦芽、麦芽汁、粒粉、全粒粉またはビールと混合し、または、ブレンドしてもよい。これらの用語は、オオムギを含む穀粒の混合物から製造された、麦芽、麦芽汁、粒粉、ビール、全粒粉、食品などが含まれる。好ましい実施形態において、麦芽、麦芽汁、粒粉、ビール、全粒紛、食品などを製造するために使用される少なくとも１０％若しくは少なくとも５０％の穀粒は、オオムギ粒である。

【0096】

名詞として本明細書で使用される用語「植物」は、例えば、オオムギの商業的生産用の農地で生育した植物など植物全体を指す。「植物部分」は、植生構造体（例えば、葉、茎）、根、花器官／構造体、種子（胚、胚乳及び種皮を含む）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）、細胞、デンプン顆粒またはその子孫を指す。

【0097】

「トランスジェニック植物」、「遺伝的に改変された植物」またはその変異体は、同一種、品種、または、栽培品種の野生型植物には見られない遺伝子コンストラクト（「導入遺伝子」）を含む植物を指す。本明細書で参照される「導入遺伝子」は、バイオテクノロジー分野における一般的な意味を有し、そして、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術により生成され、または、改変され、植物細胞に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、植物細胞に由来する遺伝子配列を含んでもよい。一般的に、導入遺伝子は、例えば、形質転換などのヒトの操作により植物に導入されるが、しかし、いずれの方法も、当業者が認識する通りに使用できる。

【0098】

「核酸分子」は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを指す。それは、ゲノムまたは合成源で、二本鎖若しくは一本鎖で、及び、炭水化物、脂質、タンパク質、または、本明細書で定義される特定の操作を実行するために他の物質と組み合わせた、ＤＮＡ若しくはＲＮＡであり得る。

【0099】

本明細書で用いられる「操作可能に連結された」は、２つ若しくはそれ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片間での機能的関係を意味する。一般的には、それは、転写される配列に対する転写調節エレメント（プロモーター）の機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、適切な細胞内で翻訳領域配列の転写を刺激する、または調節する場合、本明細書で定義されるポリヌクレオチドなどのコード配列に操作可能に連結される。一般的に、転写配列に操作可能に連結されるプロモーター転写調節エレメントは、転写配列に物理的に連続し、すなわち、それらはシス作用性である。しかし、エンハンサーなどのいくつかの転写調節エレメントは、物理的に連続し、または、転写を高める翻訳領域配列に近接して位置する必要はない。

【0100】

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、その最も広い文脈で解釈されるべきであり、そして、構造遺伝子のタンパク質翻訳領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を含み、及び、遺伝子の発現に関与するいずれかの末端に、少なくとも約２ｋｂの距離の、５′及び３′末端の両方の翻訳領域に隣接して位置する配列を含む。ｍＲＮＡ上に存在する、コード領域の５′に位置する配列は、５′非翻訳配列として参照される。ｍＲＮＡ上に存在する、３′、または、コード領域の下流に位置する配列は、３′非翻訳配列として参照される。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡ及び遺伝子のゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」、または、「介在領域」、若しくは、「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子の断片であり、イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含んでもよく、イントロンは、核若しくは一次転写産物から除外され、または、「スプライシング（ｓｐｌｉｃｅｄ ｏｕｔ）」され、従って、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定するために機能する。用語「遺伝子」は、本明細書に記載の本発明のタンパク質の全て、または、一部、及び、上記のいずれかに相補的な塩基配列をコードする合成または融合分子を含む。

【0101】

本明細書で使用する場合、用語「他の食品または飲料成分」は、食品または飲料の一部として提供されるとき、動物の飲食に適した任意の物質、好ましくは、ヒトの飲食に適した任意の物質を指す。例としては、他の植物種からの穀粒、糖などを含み、水を除くが、これらに限定されない。

【0102】

本発明の植物は、一般的には、各々、少なくとも１つのホルデイン、より好ましくは、少なくともＢ、Ｃ及びＤ－ホルデインの低下したレベルをもたらす１つ若しくはそれ以上の遺伝的多様性を有する。本明細書で使用される場合、用語「少なくとも１つのホルデインの低下したレベルをもたらす遺伝的多様性」は、ホルデインの生成を低下させるオオムギ植物の任意の多型を指す。遺伝的多様性は、例えば、単数若しくは複数のホルデイン遺伝子若しくはその一部の欠失、または、オオムギ遺伝子の転写を低下させる変異を含んでもよい。そのような遺伝的多様性の例としては、Ｒｉｓ_φ５６、Ｒｉｓ_φ５２７、及び、Ｒｉｓ_φ１５０８、及び、ＥｔｈｉｏｐｉａＲ１１８に存在する。従って、そのような植物は、本発明の植物を作製するための親植物として使用してもよい。本発明の植物は、任意のこれらオオムギ変異体間の交配からの子孫より生じ得る。好ましい実施形態において、本発明の植物は、Ｄ－ホルデインをコードする遺伝子のため野生型でｈｏｒ２及びｌｙｓ３の変異を含む、Ｒｉｓ_φ５６及びＲｉｓ_φ１５０８との間の交配からの子孫ではない。一実施形態において、植物は、例えばその配列が配列番号：８３として提供されるアミノ酸を含むγ３－ホルデインなど、その配列が配列番号：５８として提供されるアミノ酸を含むγ３－ホルデインをコードする。例えば、植物は、オオムギ品種Ｂｏｍｉ、Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｙａｇａｎ、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ、または、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒのγ３－ホルデイン遺伝子など、機能的に野生型のγ３－ホルデイン遺伝子を有してもよい。一実施形態において、植物は、Ｒｉｓ_φ５２７とＲｉｓ_φ１５０８との間の交配からの子孫ではない。

【0103】

反対に述べられない限り、本明細書で使用する場合、語句「約」は、検討中の値を考慮して、任意の妥当な範囲を指す。好ましい実施形態において、用語「約」は、±１０％、より好ましくは、±５％、より好ましくは、±１％の指定された値を指す。

【0104】

特に指示のない限り、重量及び百分率を参照する場合、単位は、重量比（ｗ／ｗ）である。

【0105】

用語「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」、または、「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解すべきであり、両方の意味またはいずれかの意味のための明確な支持を提供すべきである。

【0106】

本明細書を通して、用語「含有する」、または、「含む」若しくは「含んでいる」などの変形体は、規定した要素、整数若しくは工程、または、要素、整数若しくは工程のグループを包含するが、任意の他の要素、整数若しくは工程、または、要素、整数若しくは工程のグループを排除しないことを暗示すると理解すべきであろう。

【0107】

プロラミン及びホルデイン：
穀物のプロラミン（コムギにおけるグリアジン、オオムギにおけるホルデイン、ライムギにおけるセカリン、オートムギにおけるアベニン、及びトウモロコシにおけるゼインとして知られている）は、オートムギ及びトウモロコシを除いて、すべての穀物の穀粒中の主要な胚乳貯蔵タンパク質である（Ｓｈｅｗｒｙ及びＨａｌｆｏｒｄ，２００２）。ホルデインは、オオムギ種子中の全タンパク質の３５～５０％を表す（Ｊａｒａｄａｔ，１９９１）。それらは、移動度が高い順に、４つのグループ：Ａ（γ－ホルデインとしても知られる）、Ｂ、Ｃ及びＤに分類される（Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びγ－ホルデインは、図１に概略的に図示される染色体１Ｈ上のＨｏｒ２、Ｈｏｒ１、Ｈｏｒ３、及びＨｏｒ５の座位によりコードされる。

【0108】

Ｂ－ホルデインは、その硫黄含有量でＣ－ホルデインと異なる主タンパク質画分である（Ｋｒｅｉｓ及びＳｈｅｗｒｙ，１９８９）。Ｂ－ホルデインは、全体の７０～８０％を占め、Ｃ－ホルデインは、１０～２０％を占める（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。Ｄ－ホルデインは高分子量グルテニンと相同性であるが、Ａ－ホルデインは、一般的に、貯蔵画分であるとは考えられない。ホルデインは、残りの関連する穀物のプロラミンのと共に、ナピン（ｎａｐｉｎ）などの他の貯蔵タンパク質とは異なり、接合体胚自体で発現しない。ホルデインは、種子発育の中期から後期段階で、デンプン質胚乳で主に発現すると考えられている。

【0109】

オオムギホルデインのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の例としては、ＷＯ２００９／０２１２８５で提供される。

【0110】

麦芽製造：
本発明により提供される麦芽ベースの飲料は、その出発物質の一部または全部の麦芽を用いることで製造される、アルコール飲料（蒸留飲料を含めて）及び非アルコール飲料を含む。例としては、ビール、発泡酒（低麦芽ビール飲料）、ウイスキー、低アルコールの麦芽ベース飲料（例えば、１％未満のアルコールを含む麦芽ベース飲料）、及び、非アルコール飲料を含む。

【0111】

麦芽製造には、オオムギ粒の制御された浸漬及び発芽に続く乾燥の工程がある。この連続した工程は、穀粒の改変を引き起こす多くの酵素の合成において重要であり、死滅した内胚乳細胞壁を分解し、穀粒の栄養素を動員する工程のために重要である。その後の乾燥工程において、風味及び色が、化学的褐変反応により生成される。麦芽の主な用途は、飲料製造のためであるが、それは、また、例えば、パン製造業における酵素源として、または、食品産業における香味剤及び着色剤として、例えば、麦芽または麦芽粒粉として、あるいは間接的に麦芽シロップとしてなど、他の工業的工程でも利用することができる。

【0112】

一実施形態において、本発明は、麦芽組成物を製造する方法に関する。方法は、好ましくは：
（ｉ）本発明のオオムギ植物の穀粒を提供し；
（ｉｉ）該穀粒を浸漬し；
（ｉｉｉ）所定の条件下で浸漬した穀粒を発芽させ；及び
（ｉｖ）該発芽粒を乾燥させる；
工程を含む。

【0113】

例えば、麦芽は、Ｈｏｓｅｎｅｙ（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９４： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ， Ｓｔ． Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）に記載のいずれかの方法により製造することができる。しかし、麦芽を焙煎する方法を含むがそれに限定されない、特殊麦芽を製造するための方法など、麦芽を製造するための任意の適切な他の方法も、また、本発明で使用される。１つの非限定の例を実施例６に記載する。

【0114】

麦芽は、本発明のオオムギ植物から生産される穀粒のみ、または、他の穀粒を含む混合物を用いて調製することができる。

【0115】

麦芽は、ビール醸造に主に使用されるが、蒸留酒の製造にも使用される。醸造は、麦芽汁の製造、一次及び二次発酵並びに後処理を含む。初めに麦芽を粉砕し、水中で撹拌され、そして加熱する。この「マッシング」の間に、麦芽製造中に活性化された酵素が、穀粒のデンプンを発酵可能な糖に分解する。生成した麦芽汁を清澄化し、酵母を加え、混合物を発酵させ、後処理を実施する。

【0116】

別の実施形態において、麦芽汁組成物は、麦芽から調製することができる。前述の麦芽汁は、第一、及び／または、第二、及び／または、更なる麦芽汁であってもよい。一般的に、麦芽汁組成物は、高含量のアミノ窒素及び発酵可能な炭水化物類、主としてマルトースを有する。一般的に麦芽汁は、水で麦芽をインキュベートすることにより、すなわち、マッシングすることにより調製される。マッシング中、麦芽／水組成物は、追加の炭水化物に富む組成物、例えばオオムギ、トウモロコシまたはコメなど付加物を補充してもよい。麦芽になっていない穀物添加物は、通常、活性酵素を含有しない。従って、糖変換に必要な酵素を提供するために、麦芽または外因性の酵素に依存する。

【0117】

一般的には、麦芽汁製造工程の最初の工程は、水がマッシング段階において穀粒子に接近できるようにするための麦芽の粉砕であり、基本的には基質の酵素的分解を伴う麦芽製造工程の延長である。マッシングの間に、粉砕した麦芽を、水などの液体画分と共にインキュベートする。温度は、一定（等温マッシング）に保つか、徐々に上げる。いずれの場合においても、麦芽製造及びマッシングにおいて製造された可溶性物質は、前述の液体画分中へ抽出され、その後ろ過によって麦芽汁及び麦芽粕と呼ばれる残留固体粒子へ分離される。この麦芽汁は、第一の麦芽汁とも呼ばれる。濾過した後、第二の麦芽汁が得られる。更に、麦芽汁は、この手法を繰り返すことにより調製することができる。麦芽汁の調製に適した手法の非限定的な例は、Ｈｏｓｅｎｅｙ（前出）に記載されている。

【0118】

麦芽汁組成物は、また、酵素組成物、または、酵素混合組成物、例えば、Ｕｌｔｒａｆｌｏ、または、Ｃｅｒｅｆｌｏ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）などの、１つ若しくはそれ以上の適切な酵素を用いて、本発明のオオムギ植物、または、その一部をインキュベートすることにより調製できる。麦芽汁組成物は、また、該調製の間、麦芽及び麦芽になっていないオオムギ植物の混合物を用いて、場合により、１つ若しくはそれ以上の適切な酵素を添加して調製できる。更に、セリアック病に関与する毒性アミノ結合を特異的に破壊するプロリル－エンドペプチダーゼ酵素は、残留ホルデインの毒性を低減するために、麦芽汁の発酵中に添加することができる（Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｍａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００５； Ｓｔｅｐｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0119】

穀粒の加工：
本発明のオオオムギ粒は、食品成分、飲料成分、食品もしくは飲料、または、当技術分野で公知の任意の技術を使用して、非食品を製造するために処理することができる。

【0120】

一実施形態において、製品は、全粒粉である（超微細粉砕全粒粉などの超微細に粉砕した全粒粉；全粒粉、または、約１００％の穀粒から作られる粒粉）。全粒粉は、精製された粒粉の成分（精製粒粉または精製粉）と粗画分（超微細粉砕された粗画分）が含まれる。

【0121】

精製された粒粉は、例えば、精製オオムギを、粉砕し、ふるい分けすることにより、調製される粒粉であり得る。食品医薬品局（ＦＤＡ）は、精製されたオオムギ粒粉の範疇に含めるために、特定の粒子サイズの規格を満たす粒粉を要求する。精製粒粉の粒子サイズは、９８％以上が「２１２μｍ（米国ワイヤ７０）」と称される織金網より、大きくない開口部を有する織金網を通過する粒粉と規定している。

【0122】

粗画分は、少なくとも１つのふすま及び胚芽を含む。例えば、胚芽は、オオオムギ粒内で見出された胚性植物である。胚芽には、脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル、フラボノイドなどの植物栄養素が含まれる。ふすまは、いくつかの細胞層を含み、脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル及びフラボノイドなどの植物栄養素をかなりの量で含有する。さらに、粗い画分は、また、脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル及びフラボノイドなどの植物栄養素を含むアリューロン層を含んでもよい。アリューロン層は技術的に胚乳の一部と考えられるが、ふすまと同じ多くの特徴を示すが、一般的には粉砕工程の間に、ふすま及び胚芽と共に除去される。アリューロン層はタンパク質、ビタミン及びフェルラ酸などの植物栄養素を含む。

【0123】

さらに、粗画分は、精製された粒粉の成分とブレンドしてもよい。好ましくは、粗画分は、精製された粒粉の成分と均一にブレンドされる。粗画分と精製された粒粉成分を均一にブレンドすることは、出荷中に、サイズによる粒子の層別化を低減することに役立つ。粗画分は、全粒粉を形成するために、精製された粒粉成分と混合してもよく、その結果、精製粒粉と比較して栄養価、繊維含有量及び抗酸化能力が増した全粒粉を提供することが可能である。例えば、粗画分または全粒粉は、焼き菓子、スナック製品及び食品において様々な量で精粉または全粒粉を置き換えるのに、使用することができる。本発明の全粒粉（即ち、超微細に粉砕した全粒粉）は、また、自家製の焼き菓子での使用のために消費者に直接、市販してもよい。例示的な実施形態において、全粒粉の造粒プロファイルは、全粒粉の９８重量％の粒子が、２１２μｍ未満である。

【0124】

さらなる実施形態では、全粒粉及び／または粗画分のふすま及び胚芽内に見出される酵素は、全粒粉及び／または粗画分を安定にするために不活性化される。本発明において不活性化は、阻害、変性なども意味すると考えられる。安定化は、ふすまや胚芽層で見出された酵素を不活性化するために、蒸気、熱、放射線、または他の処置を使用する工程である。ふすま及び胚芽中に自然に発生する酵素は、粒粉中の成分の変化を触媒し、粒粉の調理特性及び貯蔵寿命に悪影響を及ぼす。不活性化された酵素は、粒粉に存在する成分の変化を触媒しないので、従って、安定した粒粉は、その調理特性を保持し、より長い貯蔵寿命を有する。例えば、本発明は、粗画分を粉砕するための２つのストリームの製粒技術を導入することができる。粗画分を分離し、安定化させると、粗画分は、その後、約５００μｍ以下の粒子サイズ分布を有する粗画分を形成するために、粉砕機、好ましくはギャップミルを介して粉砕される。例示的な実施形態において、ギャップミルの先端速度は、通常、１１５ｍ／ｓ～１４４ｍ／ｓの間で動作し、高い先端速度では熱が発生する。製造中に発生する熱及び空気の流れは、粗画分の微生物の量を減少させる。更なる実施形態において、ギャップミルで粉砕する前に、粗画分は、平均９５，０００コロニー形成単位／グラム（ｃｆｕ／ｇ）の好気性生菌数、及び、平均１２，００ｃｆｕ／ｇの大腸菌数を有し得る。ギャップミルを通過した後、粗画分は、平均１０，０００ｃｆｕ／ｇの好気性生菌数、及び、平均９００ｃｆｕ／ｇの大腸菌数を有し得る。従って、微生物量は、本発明の粗画分において、著しく減少し得る。ふるい分けした後、５００ミクロンより大きい粒子サイズを有する任意の粉砕された粗画分は、更なる製粉化をおこなうために工程に戻すことができる。

【0125】

更なる実施形態においては、全粒粉または粗画分は、食品の成分であってもよい。例えば、食品の成分としては、ベーグル、ビスケット、パン、ロールパン、クロワッサン、ダンプリング、イングリッシュマフィン、マフィン、ピタパン、クイックブレッド、冷蔵／冷凍生地製品、パン生地、ベークトビーンズ、ブリトー、唐辛子、タコス、タマーリ、トルティーヤ、ポットパイ、即席シリアル、即席の食事、詰め物、電子レンジ調理可能食事、ブラウニー、ケーキ、チーズケーキ、コーヒーケーキ、クッキー、デザート、ペストリー、スイートロール、キャンディーバー、パイ生地、パイフィリング、ベビーフード、ベーキングミックス、バッター液、パン粉、グレービーミックス、肉増量剤、肉代用品、混合調味料、混合スープ、グレービー、ルウ、サラダドレッシング、スープ、サワークリーム、麺、パスタ、ラーメン、炒麺、拌麺、アイスクリーム含有物、アイスクリームバー、アイスクリームコーン、アイスクリームサンドイッチ、クラッカー、クルトン、ドーナツ、卵ロール、押出スナック、果物及び穀物バー、電子レンジ調理可能スナック製品、栄養バー、パンケーキ、半焼成の冷凍パン、プレッツェル、プリン、グラノーラベースの製品、スナックチップ、スナック食品、スナックミックス、ワッフル、ピザ生地、動物用食品、または、ペットフードであってもよい。

【0126】

代替の実施形態では、全粒粉または粗画分は、栄養補助食品の成分であってもよい。例えば、栄養補助食品は、一般的には、ビタミン、ミネラル、ハーブ、アミノ酸、酵素、抗酸化剤、ハーブ、スパイス、プロバイオティクス、抽出物、プレバイオティクス、及び、繊維を含む一つ若しくはそれ以上の成分を含有する食事に添加される製品であってもよい。本発明の全粒粉または粗画分は、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、酵素、及び、繊維を含む。例えば、粗画分は、濃縮量の食物繊維、並びに、ビタミンＢ群、セレン、クロム、マンガン、マグネシウム、及び、酸化防止剤などの他の必須栄養素が含み、それは、健康的な食生活のために必須である。例えば、２２グラムの本発明の粗画分は、個人の一日推奨摂取量の繊維の３３％を供給する。更に、個人の一日推奨摂取量の繊維の２０％を供給するのに必要とされるのは、１４グラムだけである。従って、粗画分は、個人に必要な繊維の摂取に優れた補給源である。したがって、本実施形態では、全粒粉または粗画分は、サプリメントの成分であってもよい。サプリメントは、個人の健康全般に役立つ任意の既知の栄養成分を含んでいてもよく、例としては、ビタミン、ミネラル、他の繊維成分、脂肪酸、抗酸化剤、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ルテイン、リボース、ω－３脂肪酸、及び／または、他の栄養成分が挙げられるが、それに限定されない。

【0127】

更なる実施形態においては、全粒粉または粗画分は、繊維サプリメント、または、その成分であってもよい。オオバコ外皮、セルロース誘導体、及び、加水分解されたグアーガムなどの現在ある多くの繊維サプリメントは、その繊維含有量の他に、不十分な栄養価を有する。さらに、多くの繊維サプリメントは、望ましくないテクスチャーを有し、味が悪い。全粒粉、または、粗画分から作られた繊維サプリメントは、繊維、並びに、タンパク質、及び、酸化防止剤の供給に役立つ。繊維サプリメントは、インスタント飲料ミックス、レディ・トゥ・ドリンク、栄養バー、ウエハース、クッキー、クラッカー、ゼリー飲料、カプセル、咀嚼菓子、咀嚼錠剤、及び、ピルの形態で提供され得るが、それらに限定されない。一実施形態は、フレーバーシェイクまたは麦芽タイプ飲料の形で繊維サプリメントを提供される。この実施形態は、子供用の繊維サプリメントとして特に魅力的だろう。

【0128】

さらなる実施形態では、製粒工程は、穀粒粉ブレンド、オオムギ粉ブレンド、または、穀粒の粗画分ブレンドを製造するために使用してもよい。例えば、一種類のオオムギのふすまや胚乳を粉砕し、別種類のオオムギを粉砕した胚乳または全粒粉と共にブレンドしてもよい。あるいは、１種類の穀粒のふすま及び胚芽を粉砕し、別種類の穀粒を粉砕した胚乳または全粒粉とブレンドしてもよい。更なる実施形態において、第一の種類のオオムギ、または、穀粒からのふすま及び胚芽は、穀粒の粗画分ブレンドを製造するために、第二の種類のオオムギまたは穀粒からのふすま及び胚芽とブレンドしてもよい。本発明は、１つ若しくはそれ以上のふすま、胚芽、胚乳、及び、１つ若しくはそれ以上の穀粒の全粒粉の任意の組み合わせの混合を包含することを意図する。この穀粒ブレンド、オオムギブレンドの取り組みは、特別な粉を調製するのに使用することができ、そして複数の種類の穀粒またはオオムギの品質、及び、栄養含量を活用して１種類の粒粉を調製することができる。

【0129】

本発明の全粒粉は、多様な製粉工程を経て製造することができる。例示的な実施形態は、別々のストリームに穀粒の胚乳、ふすま、及び胚芽を分離することなく、単一のストリーム内で、穀粒を粉砕することを含む。清潔に調節された穀粒は、ハンマーミル、ローラーミル、ピンミル、インパクトミル、ディスクミル、空気摩擦ミル、ギャップミルなどの、第１の通過粉砕機に移される。一実施形態において、粉砕機はギャップミルであってもよい。粉砕した後、穀粒を取り出し、ふるいに移す。粉砕された粒子を選別するために当該分野で公知の任意のふるいを使用してもよい。ふるいの網目を通過した物質は、本発明の全粒粉であり、それ以上の処理を必要としない。スクリーン上に残る物質は、第二の画分と称する。第二の画分は、更なる粒子の縮小が必要である。従って、この第二の画分は、第２の通過粉砕機に移すことができる。粉砕後、第二の画分は、第二のふるいに移すことができる。第二のふるいの網目を通過した物質は、本発明の全粒粉である。スクリーン上に残る物質は、第四の画分と称され、粒径を減少させるために更なる処理を必要とする。第二のふるいの網目上の第四の分画は、フィードバックループを介して、更なる処理のために第１の通過粉砕機、または、第２の通過粉砕機のいずれかに戻って搬送される。本発明の代替的な実施形態では、工程は、より高いシステム能を提供するために、複数の第一の通過運搬機を含んでいてもよい。

【0130】

なお、本発明の全粒粉、粗画分及び／または穀粒製品は、当該分野で公知の任意の製粒工程により製造できることを意図する。更に、本発明の全粒粉、粗画分及び／または穀粒製品を、発酵、インスタント化、押出し成型、カプセル化、焼く、焙煎などの多数の他の工程により、改変し、または、増強され得ることを意図する。

【0131】

ホルデインの生成を下方制御するポリヌクレオチド：
一実施形態において、本発明、及び／または、本発明の方法において使用される穀粒は、穀粒中の少なくとも１つのホルデインの生成を下方制御するポリヌクレオチドをコードする導入遺伝子を含むトランスジェニックオオムギ植物からのものである。そのようなポリヌクレオチドの例としては、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒性ポリヌクレオチド、人工マイクロＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ分子が挙げられるが、それに限定されない。穀粒内に存在する場合、これらのポリヌクレオチドのそれぞれは、翻訳のために利用されるホルデインｍＲＮＡを減少させる。

【0132】

アンチセンスポリヌクレオチド：
用語「アンチセンスポリヌクレオチド」は、ホルデインをコードする特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であり、及び、転写後のｍＲＮＡ翻訳などに干渉することができるＤＮＡまたはＲＮＡ、若しくは、その組み合わせの分子を意味すると解釈すべきである。アンチセンス法の使用は、当該分野で公知である（参照、例えば、Ｇ．Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｅｎｄｒｅｓ，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９））。植物中でのアンチセンス法の使用は、Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５）及びＳｅｎｉｏｒ（１９９８）によって論評されている。Ｓｅｎｉｏｒ（１９９８）は、アンチセンス法は、現在では、遺伝子発現を操作するのに非常によく確立された手法であると述べている。

【0133】

本発明のオオムギ植物におけるアンチセンスポリヌクレオチドは、生理学的条件下で標的ポリヌクレオチドに対してハイブリッド形成する。本明細書で使用する場合、用語「生理的条件下でハイブリッド形成するアンチセンスポリヌクレオチド」は、（完全に、または部分的に一本鎖である）ポリヌクレオチドがオオムギ細胞における通常の条件下で、オオムギホルデインなどのタンパク質をコードするｍＲＮＡと二本鎖ポリヌクレオチドを形成することが、少なくとも可能であることを意味する。

【0134】

アンチセンス分子は、構造遺伝子に対応する配列、または、遺伝子発現若しくはスプライシングの制御に影響を与える配列を含んでもよい。例えば、アンチセンス配列は、本発明の遺伝子、または、５′－非翻訳領域（ＵＴＲ）、若しくは、３′－ＵＴＲ、若しくは、これらの組み合わせに対応する。これは、転写中、または、転写後にスプライシングされ得るイントロン配列に部分的に相補的であってもよく、好ましくは、標的遺伝子のエキソン配列にのみ相補的であってもよい。一般的にＵＴＲは非常に異なることから、これらの領域を標的とすることで遺伝子阻害の特異性が高くなる。

【0135】

アンチセンス配列の長さは、少なくとも、１９個の連続するヌクレオチドであり、好ましくは、少なくとも５０個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも、１００、２００、５００または１０００個のヌクレオチドであるべきである。完全な遺伝子転写産物と相補的な全長の配列を使用してもよい。長さは、最も好ましくは、１００～～２０００個のヌクレオチドである。標的転写産物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％、より好ましくは９５～１００％であるべきである。アンチセンスＲＮＡ分子は、当然ながら当然ながら、分子を安定化するために機能し得る無関係な配列を含んでもよい。

【0136】

触媒性ポリヌクレオチド：
用語「触媒性ポリヌクレオチド／核酸」は、特異的に異なる基質を認識し、この基質の化学的改変を触媒するＤＮＡ分子若しくはＤＮＡ含有分子（当該技術分野では「デオキシリボザイム」としても知られる）、またはＲＮＡ若しくはＲＮＡ含有分子（「リボザイム」としても知られる）を指す。触媒性核酸中の核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（及び及びＲＮＡではＵ）であり得る。

【0137】

一般的に、触媒性核酸は、標的核酸の特異的な認識のためのアンチセンス配列、核酸を切断する酵素活性（本明細書では「触媒ドメイン」と称する）を含む。本発明において、特に有用なリボザイムの種類は、ハンマーヘッド型リボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｐｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、及び、ヘアピン型リボザイムである（Ｓｈｉｐｐｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。

【0138】

本発明のオオムギ植物のリボザイム及びリボザイムをコードするＤＮＡは、当該分野で公知の方法を用いて化学的に合成することができる。リボザイムは、また、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター）に操作可能に連結したＤＮＡ分子（すなわち、転写の時に、ＲＮＡ分子を生成する）からも調製することができる。ベクターがＤＮＡ分子に操作可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する場合、リボザイムを、ＲＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチドとインキュベーションすることによってｉｎ ｖｉｔｒｏで作製することができる。別の実施形態において、ＤＮＡは、発現カセットまたは転写カセットに挿入することができる。合成した後、ＲＮＡ分子は、リボザイムを安定化し、ＲＮＡ分解酵素に対する抵抗性を付与する能力を有するＤＮＡ分子に連結することにより修飾される。

【0139】

本明細書に記載のアンチセンスポリヌクレオチドと同様に、触媒性ポリヌクレオチドは、また、「生理学的条件」、すなわち、オオムギ細胞内でのこれらの条件下で、標的核酸分子（例えばオオムギのホルデインをコードするｍＲＮＡ）をハイブリダイズすることを可能にしなければない。

【0140】

ＲＮＡ干渉：
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特に、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するのに特に有用である。理論に制限されることを望まないが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９８）は、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）がタンパク質の産生を低下させるのに使用できるメカニズムのモデルを提供した。この技術は、対象またはその一部の遺伝子のｍＲＮＡと本質的に同一である配列を含むｄｓＲＮＡ分子（この場合、本発明に関連するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）の存在に依存する。好都合なことに、ｄｓＲＮＡは、組換えベクターまたは宿主細胞内の単一のプロモーターから生成することができ、ここで、センス及びアンチセンス配列は、無関係な配列の両端に配置される。この無関係な配列がループ構造を形成しながらセンス及びアンチセンス配列がハイブリダイズすることにより、ｄｓＲＮＡ分子が形成される。される。本発明に適したｄｓＲＮＡ分子の設計及び生成は、特に、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、及びＷＯ０１／３４８１５の文献を考慮して、十分、当業者の能力の範囲内にある。

【0141】

一例では、不活性化する標的遺伝子に対して相同性があり、少なくとも部分的に二本鎖（二重鎖）のＲＮＡ産物（単数若しくは複数の）の合成を導くＤＮＡが、導入される。従って、ＤＮＡは、ＲＮＡに転写される場合、二本鎖ＲＮＡ領域を形成するようにハイブリッド化することができる、センス及びアンチセンス配列の両方を含む。好ましい実施形態において、センス配列及びアンチセンス配列は、ＲＮＡに転写されるときに、スプライシングされたイントロンを含むスペーサー領域により分離される。この配列は、遺伝子サイレンシングのより高い効率をもたらすことが示される。二本鎖領域は、１つまたは２つのＤＮＡ領域のいずれかから転写される１つまたは２つのＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の存在は、二本鎖ＲＮＡ、及び、また、標的植物遺伝子からの相同的なＲＮＡ転写物の両方を破壊し、効率よく、標的植物遺伝子を減少させ、または、除去する内因性の植物システムからの応答を誘発すると考えられる。

【0142】

ハイブリダイズしたセンス配列及びアンチセンス配列の長さは、それぞれ、少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３０または５０個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも、１００、２００、５００または１０００個のヌクレオチドであるべきである。完全な遺伝子転写産物に対応する全長の配列を使用してもよい。長さは、最も好ましくは、１００～２０００個のヌクレオチドである。標的転写産物に対するセンス及びアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、９５～１００％であるべきである。ＲＮＡ分子は、当然ながら、分子を安定化するために機能し得る無関係な配列を含んでもよい。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、または、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で発現し得る。後者の例としては、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡプロモーターが含まれる。

【0143】

好ましい低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡの」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９～２１個の連続したヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、標的ｍＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０～７０％のＧＣ含有量（好ましくは、３０～６０％、より好ましくは４０～６０％、より好ましくは、約４５％～５５％）を含み、及び、例えば、標準的なＢＬＡＳＴ検索により決定される通り、導入されるべきオオムギ植物のゲノム中において標的以外のいかなるヌクレオチド配列にも高い同一性を有していない。

【0144】

マイクロＲＮＡ：
マイクロＲＮＡの調節は、従来のＲＮＡｉ／ＰＴＧＳと異なり、遺伝子調節を目的として発展した、ＲＮＡサイレンシング経路が明確に枝分かれしたものである。マイクロＲＮＡは、固有の分類の低分子ＲＮＡであり、特徴的な逆方向反復を有する遺伝子様エレメントでコードされている。転写されると、マイクロＲＮＡ遺伝子は、ステムループ構造の前駆体ＲＮＡを形成する。その後、その前駆体ＲＮＡからマイクロＲＮＡが得られる。マイクロＲＮＡは、一般的には、約２１個のヌクレオチド長である。放出されたｍｉＲＮＡは、配列特異性の遺伝子抑制を発揮するアルゴノートタンパク質の特定のサブセットを含むＲＩＳＣ様複合体中に組み込まれる（参照、例えば、Ｍｉｌｌａｒ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，２００５； Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｌｍｅｉｄａ ａｎｄ Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００５）。

【0145】

共抑制：
使用することができる別の分子生物学的アプローチは共抑制である。共抑制のメカニズムはよく理解されていないが、転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）に関与すると考えられ、その点でアンチセンス抑制の多くの例と非常に類似している。共抑制は、遺伝子またはその断片の過剰なコピーを植物の中に、その発現プロモーターに対してセンスの配置で導入することを含む。センス断片のサイズ、標的遺伝子領域への応答、及び、標的遺伝子への配列同一性の程度は、上記に記載のアンチセンス配列と同様である。幾つかの例において、遺伝子配列の追加のコピーは、標的植物遺伝子の発現を妨害する。共抑制アプローチを実施する方法は、ＷＯ９７／２０９３６及びＥＰ０４６５５７２で言及されている。

【0146】

核酸コンストラクト：
トランスジェニック植物を作製するために有用な核酸は、標準的な技術を用いて容易に生成することができる。

【0147】

ｍＲＮＡをコードする領域を挿入するとき、コンストラクトは、イントロン配列を含んでもよい。このイントロン配列は、植物における導入遺伝子の発現を助けることができる。用語「イントロン」は、転写されるが、翻訳前にＲＮＡからスプライシングされて除かれるタンパク質をコードしない遺伝子断片を意味するものとして、その通常の意味で使用される。イントロンは、５′－ＵＴＲに、または、導入遺伝子が翻訳産物をコードする場合、コード領域に、または、そうでない場合、いずれかの転写領域に組み込むことができる。しかし、好ましい実施形態において、任意のポリペプチドコード領域は、単一のオープンリーディングフレームとして提供される。当業者に理解されるように、このようなオープンリーディングフレームは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを逆転写することにより得ることができる。

【0148】

目的のｍＲＮＡをコードする遺伝子の適切な発現を確実にするために、核酸コンストラクトは、一般的には、転写終結配列、または、ポリアデニル化配列とともに、１つ若しくはそれ以上の調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサーを含む。そのようなエレメントは、当該分野で公知である。

【0149】

単数若しくは複数の調節エレメントを含む転写開始領域は、植物中で調節的、または恒常的発現をもたらす。好ましくは、発現は、少なくとも、種子の細胞内で起こる。

【0150】

植物細胞において機能する多くの恒常的プロモーターが報告されている。植物における恒常的発現に好適なプロモータとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＶ）３５Ｓ、サトウキビ桿状ウイルス（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ツユクサ黄色斑紋ウイルス（ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、リブロース－１，５－ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットからの光誘導性プロモーター、イネサイトゾルトリオースホスフェートイソメラーゼプロモーター、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼ、及び、オクトピンシンターゼプロモータ、Ａｄｈプロモータ、スクロースシンターゼ、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、及び、クロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターが挙げられるが、それに限定されない。これらのプロモーターは、植物中で発現されるＤＮＡベクターを作製するために使用される（例として、ＷＯ８４／０２９１３を参照）。これらのプロモーターのすべては、様々な種類の植物で発現可能な組換えＤＮＡベクターを作製するために使用される。

【0151】

プロモーターは、温度、光またはストレスなどの因子により調節され得る。通常、調節エレメントは、発現するために、遺伝子配列の５′に提供される。コンストラクトは、また、例えば、ｎｏｓ３′または、ｏｃｓ３′ポリアデニル化領域、または、転写ターミネーターなどの転写を強化する他のエレメントを含んでもよい。

【0152】

５′非翻訳リーダー配列は、異種遺伝子配列を発現するために選択されたプロモーターから導入することができ、そしてｍＲＮＡの翻訳を増加させるように、必要に応じて特異的に改変することができる。導入遺伝子の発現を最適化するための総説については、Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照すること。５′非翻訳領域は、また、植物ウイルスＲＮＡ（タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシドワーフモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルスなど）から、適切な真核生物の遺伝子、植物遺伝子（コムギ及びトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または、合成遺伝子配列から得られる。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列を伴う、５′非翻訳配列から導入されたコンストラクトの使用に限定されない。リーダー配列は、また、無関係のプロモーターまたはコード配列から導入することができる。本発明の文脈において有用なリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０のリーダー（ＵＳ５，３６２，８６５、及び、ＵＳ５，８５９，３４７）、及びＴＭＶオメガエレメントを含む。

【0153】

転写の終結は、キメラベクターの中で目的のポリヌクレオチドに対して作動可能に連結された３′非翻訳ＤＮＡ配列により達成される。組換えＤＮＡ分子の３′非翻訳領域は、ＲＮＡの３′末端へのアデニル酸ヌクレオチドを付加させるために、植物に機能するポリアデニル化シグナルを含む。３′非翻訳領域は、植物細胞において発現される様々な遺伝子から得ることができる。ノパリン合成酵素３′非翻訳領域；エンドウマメ小サブユニットルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）遺伝子からの３′非翻訳領域；ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子からの３′非翻訳領域が、通常この目的で使用される。アグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル酸シグナルを含む３′非翻訳領域も適切である。

【0154】

一般的には、核酸コンストラクトは、選択可能なマーカーを含む。選択マーカーは、外因性の核酸分子で形質転換された植物または細胞の同定及びスクリーニングに役立つ。選択マーカー遺伝子は、オオムギ細胞に抗生物質または除草剤への耐性を与え、または、マンノースなどの基質の利用を可能にすることができる。選択可能なマーカーは、好ましくは、オオムギ細胞にハイグロマイシン耐性を付与する。

【0155】

好ましくは、核酸コンストラクトは、植物のゲノムに安定的に組み込まれる。従って、核酸は、ゲノムに分子を組み込むことを可能にする適切なエレメントを含むか、または、コンストラクトが植物細胞の染色体に組み込むことができる適切なベクター中に配置される。

【0156】

本発明の一実施形態は、宿主細胞に核酸分子を送達することが可能な任意のベクターに挿入された、少なくとも本明細書で概説した導入遺伝子を有する、組換えベクターの使用を含む。このようなベクターは、本発明の核酸分子に隣接している、自然には見出されない核酸配列であり、そして好ましくは、単数若しくは複数の核酸分子が、由来する種以外の種から導入された異種核酸配列を含む。ベクターは、原核生物または真核生物のＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり、一般的には、ウイルスまたはプラスミドであってもよい。

【0157】

植物細胞の安定なトランスフェクション、または、トランスジェニック植物の確立に適した多数のベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， １９８５， ｓｕｐｐ．１９８７；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８９； ａｎｄ Ｇｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９０に、記載されている。一般的に、植物発現ベクターは、例えば、５′及び、３′調節配列の下で転写制御されている、１つ若しくはそれ以上のクローン化植物遺伝子と、優性選択マーカーを含む。このような植物発現ベクターは、また、プロモーター調節領域（例えば、誘導的若しくは恒常的、または、環境的若しくは発生的な制御、または、細胞若しくは組織特異的な発現を制御する調節領域）；転写開始部位；リボソーム結合部位；ＲＮＡプロセシングシグナル；転写終結部位；及び／または；ポリアデニル化シグナルを含有することができる。

【0158】

トランスジェニック植物：
本発明の文脈で定義されるトランスジェニックオオムギ植物は、植物（並びに、該植物の部分及び細胞）及び所望の植物または植物器官における、少なくとも１つのポリヌクレオチド、及び／または、ポリペプチドの生成を引き起こすために、組換え技術を用いて、遺伝的に改変されたその子孫を含む。トランスジェニック植物は、Ａ．Ｓｌａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ －Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （２００３），ａｎｄ Ｐ． Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｈ． Ｋｌｅｅ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （２００４）に、一般的に、記載されたものなどの、当該分野で公知の技術を用いて生成することができる。

【0159】

好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は、導入された各々及び全ての遺伝子（導入遺伝子）に対してホモ接合型であり、所望の表現型から分離しない。トランスジェニック植物は、また、例えば、ハイブリッド種子から生長したＦ１子孫など、単数若しくは複数の導入遺伝子に対してヘテロ接合であってもよい。そのような植物は、当該分野で公知のハイブリッド強勢のような利点を提供することができる。

【0160】

細胞への遺伝子の直接送達のための４つの一般的な方法が、下記に記載されている：（１）化学的方法（Ｇｒａｈａｍら、１９７３）；（２）ミクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８０）；エレクトロポレーション（参照：例えば、ＷＯ８７／０６６１４、ＵＳ５，４７２，８６９。ＵＳ５，３８４，２５３、ＷＯ９２／０９６９６、及び、ＷＯ９３／２１３３５）；及び遺伝子銃（参照、例えば、ＵＳ４，９４５，０５０及びＵＳ５，１４１，１３１）などの物理的方法；（３）ウイルスベクター（Ｃｌａｐｐ，１９９３；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８）；及び（４）受容体を介したメカニズム（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。

【0161】

使用することができる加速方法は、例えば、微粒子銃などを含む。植物細胞に形質転換の核酸分子を送達するための方法の一例は、微粒子銃である。この方法は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ （１９９４）において総説されている。非生物学的粒子（微粒子）は、核酸で被覆され、推進力により細胞に送達され得る。典型的な粒子は、タングステン、金、白金からなるものなどが挙げられる。微粒子銃の特別の利点は、それが単子葉植物の再現性のある形質転換に有効な手段であることに加えて、プロトプラストの単離、またアグロバクテリウム感染の感受性のどちらも必要ではないことである。加速度によりトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞にＤＮＡを送達する方法の例示的な実施形態は、懸濁液の中で培養されたトウモロコシ細胞で覆われたフィルター表面上に、ＤＮＡで被覆された粒子をステンレススチールまたはＮｙｔｅｘスクリーンなどのスクリーンを通して加速するために使用できる、微粒子銃α粒子送達システムである。本発明での使用に適した粒子送達システムである、ヘリウム加速ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ銃は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手可能である。

【0162】

衝撃のために、懸濁液中の細胞は、フィルター上に濃縮することができる。衝撃される細胞を含むフィルターは、微粒子停止プレートの下の適切な距離に配置される。必要に応じて、一つ若しくはそれ以上のスクリーンが、また、銃と衝撃される細胞の間に配置される。

【0163】

あるいは、未熟胚または他の標的細胞は、固体のインキュベート培地に配置してもよい。衝撃される細胞は、微粒子停止プレートの下の適切な距離に配置される。必要に応じて、一つ若しくはそれ以上のスクリーンが、また、加速デバイスと衝撃される細胞の間に配置される。本明細書で設定される技術の使用を介して、一時的にマーカー遺伝子を発現する、１０００個以下若しくはそれ以上の形質転換巣の細胞を得ることができる。形質転換巣における、衝撃４８時間後に外来遺伝子産物のを発現する細胞数は、しばしば、１～１０個の範囲にあり、平均して、１～３個である。

【0164】

衝撃形質転換において、安定な形質転換体の最大数を得るために、衝撃の前の培養条件及び衝撃パラメータを最適化できる。衝撃のための物理的及び生物学的パラメータの両方が、この技術において重要である。物理的因子は、ＤＮＡ／微粒子沈殿を操作することを含むもの、または、マクロ、若しくは、ミクロ粒子のいずれかの飛行及び速度に影響を与えるものである。生物学的因子は、衝撃前、及び、衝撃直後の細胞の操作；衝撃に関連する外傷を軽減するための標的細胞の浸透圧調整；及び、また、線状化されたＤＮＡまたは完全なスーパーコイルプラスミドなどの形質転換ＤＮＡの状態を含む、全ての段階を包含する。衝撃前の操作は、未熟胚の形質転換の成功のために、特に重要であると考えられる。

【0165】

別の更なる実施形態において、プラスチドは、安定的に形質転換することができる。高等植物におけるプラスチド形質転換のために開示された方法は、選択マーカーを含むＤＮＡの粒子銃送達と、相同的組換えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化を含んでいる（ＵＳ５，４５１，５１３、ＵＳ５，５４５，８１８、ＵＳ５，８７７，４０２、ＵＳ５，９３２４７９、及び、ＷＯ９９／０５２６５）。

【0166】

従って、条件を十分に最適化するために、小規模研究において衝撃パラメーターの様々な態様を調整することが望ましいと想定される。特に、ギャップ距離、飛行距離、組織距離及びヘリウム圧などの物理的パラメータを調整することが望ましい。また、レシピエント細胞の生理的状態に影響を与える条件を改変することにより外傷の低減要因を最小化し、従って、形質転換及び組込み効率に影響を及ぼすことができる。例えば、レシピエント細胞の浸透圧状態、組織水和、及び継代培養段階または細胞周期は、最適な形質転換のために調整されうる。他の日常的な調整の実行は、本開示に照らして当業者に公知であろう。

【0167】

アグロバクテリウム媒介による形質移入は、植物細胞に遺伝子を導入するために広く適用できるシステムである。何故ならば、ＤＮＡを、全植物組織に導入することができるからであり、それゆえにプロトプラストから完全な植物を再生する必要性が回避される。植物細胞にＤＮＡを導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組み込みベクターの使用は、当技術分野で公知である（参照、例えば、ＵＳ５，１７７，０１０、ＵＳ５，１０４，３１０、ＵＳ５，００４，８６３、ＵＳ５，１５９，１３５）。さらに、Ｔ－ＤＮＡの組込みは、わずかな再構成しか生じない比較的正確な工程である。移入されるＤＮＡの領域は、境界配列により定義されており、介在するＤＮＡは、通常、植物ゲノムに挿入される。

【0168】

現代のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、アグロバクテリウムのみならず、大腸菌でも複製が可能であり、それにより記載されているような便利な操作を可能にする（Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ， Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ， ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．１７９－２０３（１９８５）。また、アグロバクテリウム媒介遺伝子移入のためのベクターにおける技術的進歩により、ベクター中の遺伝子及び制限部位の配置が改善されており、様々なポリペプチドをコードする遺伝子を発現できるベクターの構築が容易である。記載されたベクターは、挿入されたポリペプチドをコードする遺伝子を直接発現するためのプロモーターとポリアデニル化部位の近傍に、便利なマルチリンカー領域を有しており、本発明の目的に適している。また、武装した、及び、非武装のＴｉ遺伝子の両方を含むアグロバクテリウムが、形質転換のために使用することができる。アグロバクテリウム媒介の形質転換が有効であるこれらの植物品種においては、遺伝子導入が容易であり明確な性質であるため、それが選択すべき方法である。

【0169】

アグロバクテリウム形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、一般的には、１つの染色体上に単一の座位を含有する。そのようなトランスジェニック植物は、追加された遺伝子に対してヘミ接合であると言うことができる。より好ましくは、追加された構造遺伝子に対してホモ接合型であるトランスジェニック植物、即ち、２つの追加された遺伝子、染色体対の各染色体上の同一座位における１つの遺伝子を含有するトランスジェニック植物である。ホモ接合トランスジェニック植物は、単一の追加された遺伝子を含む独立した分離個体であるトランスジェニック植物を交配し（自家受粉）、生成した種子の一部を発芽させ、目的の遺伝子について得られた植物を分析することによって得ることができる。

【0170】

また、２つの異なるトランスジェニック植物が、独立して分離している２つの外因性遺伝子を含む子孫を作製するために交配できることを理解すべきである。適切な子孫の自殖により、両方の外因性遺伝子に対してホモ接合型である植物を作製することができる。親植物に対する戻し交配、及び、非トランスジェニック植物との異系交配が、また、栄養繁殖として意図される。異なる形質、及び、作物に一般的に使用される他の育種方法の説明は、Ｆｅｈｒ，Ｉｎ：Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｗｉｌｃｏｘ Ｊ． ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．（１９８７）に見出すことができる。

【0171】

植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、及び、これらの処理の組み合わせに基づいた方法を用いて達成することができる。異なる植物品種へのこれらのシステムの適用は、プロトプラストからその特定の植物株が再生する能力に依存する。プロトプラストから穀物植物を再生するための例示的方法が記載されている（Ｆｕｊｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｔｏｒｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ａｂｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。

【0172】

細胞形質転換の他の方法として、花粉への直接ＤＮＡ移入；植物の生殖器官へのＤＮＡの直接注入；または、乾燥胚を再水和させた後、未熟胚細胞へのＤＮＡの直接注入などによる、植物へのＤＮＡ導入などが使用することができるが、それに限定されるものではない。

【0173】

単一の植物プロトプラスト形質転換体から、または、様々な形質転換された外植片からの植物の再生、生育、及び、栽培は、当該分野で公知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．，（１９８８）。この再生及び生長工程は、一般的に、形質転換細胞を選択し、胚発生の通常の段階を経て、発根小植物体段階を通る、それらの個別の細胞を培養する複数の段階を含む。。トランスジェニック胚及び種子は、同様にして再生される。生成したトランスジェニック根付き新芽は、その後、土壌などの適切な植物生長培地に植えられる。

【0174】

外来性の外因遺伝子を含有する植物の発育または再生は、当技術分野で公知である。好ましくは、再生された植物は、ホモ接合トランスジェニック植物を提供するために自家受粉されたものである。さもなくば、再生された植物から得られた花粉を、農学的に重要な系統である種子から育つ植物に交配させる。逆に、これらの重要な系統である植物の花粉は、再生された植物を受粉するために使用される。所望の外因性核酸を含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者に公知の方法を用いて栽培される。

【0175】

主として、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用することにより、双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得るための方法は、綿（ＵＳ５，００４，８６３、ＵＳ５，１５９，１３５、ＵＳ５，５１８，９０８）、大豆（ＵＳ５，５６９，８３４、ＵＳ５，４１６，０１１）、アブラナ属（ＵＳ５，４６３，１７４）、落花生（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９６）、及びエンドウ（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ，１９９５）について公表されている。

【0176】

外因性核酸の導入により植物に遺伝的変異を導入するための、及び、プロトプラストまたは未成熟植物胚から植物を再生のための、オオムギなどの穀物植物を導入するための方法は、公知である。例えば、ＣＡ２，０９２，５８８、ＡＵ６１７８１／９４、ＡＵ６６７９３９、 ＵＳ６，１００，４４７、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１、ＵＳ５，５８９，６１７、ＵＳ６，５４１，２５７、及びＷＯ９９／１４３１４を参照する。好ましくは、トランスジェニックオオムギ植物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を媒介した形質転換手法により生成される。所望の核酸コンストラクトを保有するベクターは、組織培養植物または外植片の再生可能なオオムギ細胞、または、プロトプラストなどの適切な植物系に導入することができる。

【0177】

再生可能オオムギ細胞は、未熟胚の胚盤、成熟胚、これらから誘導されたカルス、または、分裂組織に由来するものが好ましい。

【0178】

トランスジェニック細胞及び植物における導入遺伝子の存在を確認するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の増幅、または、サザンブロット分析を、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。導入遺伝子の発現産物は、産物の性質に応じて、ウェスタンブロット及び酵素アッセイを含む多様な方法のいずれかで検出することができる。タンパク質の発現を定量し、異なる植物組織における複製を検出するための特に有用な方法の一つは、ＧＵＳなどのレポーター遺伝子を使用することである。トランスジェニック植物が得られたら、それらを所望の表現型を有する植物組織または部分を作製するために生長させることができる。植物組織または植物部分を収穫する、及び／または、種子を収集することができる。種子は、所望の特性を有する組織または部分を備え、さらに植物を生長させるための供給源として役立つ。

【0179】

変異植物の生成：
内因性ホルデイン遺伝子を変異させることにより、ホルデインレベルの低下したオオムギを生成するために使用することができる当該分野で公知の多くの技術が存在しており、ＴＩＬＬＩＮＧ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＳＰＲ）を含むが、それに限定されない。

【0180】

ＴＩＬＬＩＮＧ：
本発明の植物は、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）として知られている方法を用いて作製することができる。第一の段階において、種子（または花粉）を化学変異原で処理することにより新規の単一塩基対の変化などの突然変異が植物の集団に誘導され、その後、変異が安定的に継承される世代に植物を進める。ＤＮＡを抽出し、繰り返して長期間アクセスできる資源を創造するために、集団のすべてのメンバーから種子が貯蔵される。

【0181】

ＴＩＬＬＩＮＧアッセイのために、ＰＣＲプライマーは、特に、目的の単一の遺伝子標的を増幅するように設計されている。標的が遺伝子ファミリーのメンバー、または、倍数体ゲノムの一部である場合、特異性は特に重要である。次に、色素で標識化されたプライマーを、集めた複数の個体のＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅するために使用することができる。これらのＰＣＲ産物は、変性され、ミスマッチ塩基対の形成を可能にするために再アニーリングされる。ミスマッチ体、または、ヘテロ二本鎖は、天然に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）を表し（すなわち、集団からのいくつかの植物が、同じ多型を運ぶ可能性がある）、及び誘導されたＳＮＰ（すなわち、まれな個々の植物のみが、その突然変異を持つ可能性がある）の両方を表している。ヘテロ二本鎖を形成した後、ミスマッチのＤＮＡを認識して切断するＣｅｌ Ｉなどのエンドヌクレアーゼの使用は、ＴＩＬＬＩＮＧ集団内の新規ＳＮＰを発見するための鍵となる。

【0182】

このアプローチを使用して、ゲノムの任意の遺伝子または特定領域での小さな挿入、または、欠失（１～３０ｂｐ）に加え、ゲノムの単一塩基変化を有する任意の個体を同定するために何千もの植物をスクリーニングすることができる。分析されたゲノム断片は、０．３～１．６ｋｂまでの任意のサイズの範囲とすることができる。
８倍のプールでは、アッセイ当たり１．４ｋｂの断片（ＳＮＰ検出がノイズにより問題となる末端を割り引く）が９６レーンで行われるが、この組み合わせは、ゲノムＤＮＡの百万塩基対を単一のアッセイでスクリーニングすることを可能にし、ＴＩＬＬＩＮＧを高スループット技術にしている。

【0183】

ＴＩＬＬＩＮＧは更に、Ｓｌａｄｅ、及び、Ｋｎａｕｆ （２００５）；並びに、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（２００４）に記載されている。

【0184】

変異の効率的な検出を可能にすることに加えて、高スループットＴＩＬＬＩＮＧ技術は、天然の多型を検出するのに理想的である。したがって既知の配列に未知の相同ＤＮＡでヘテロ二重鎖を形成することによる調査で、多型部位の数と位置を明らかにすることができる。少なくともいくつかの反復配列の繰り返し数を含む、ヌクレオチドの変化、及び、わずかな挿入及び欠失の両方を識別することができる。これは、Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇと呼ばれている（Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0185】

各ＳＮＰは、数ヌクレオチド内でのおおよその位置で記録される。このように、各々のハプロタイプは、その移動度に基づいてアーカイブすることができる。配列データは、ミスマッチ切断アッセイのために使用されるものと同じ増幅ＤＮＡの一定量を使用して、比較的小さな労力の追加で得ることができる。単一の反応のための左または右の配列決定プライマーは、多型に近接している部位で選択される。シーケンサーのソフトウェアは、マルチプルアライメントで塩基の変化を発見し、それぞれのケースでゲルバンドにより確認される。

【0186】

Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇは、完全なシークエンシングよりも安価に行うことができ、この方法は、現在、専らＳＮＰ検出で使用されている。突然変異誘発植物からのＤＮＡプールよりもむしろ、配置された生態型のＤＮＡを含むプレートの方がスクリーニングすることができる。ゲル上での検出は、ほぼ塩基対の分解能を有しており、またレーン全体のバックグラウンドが均一であるので、同じサイズであるバンドを一致させることができ、その結果、単一のステップでＳＮＰを検出し、遺伝子型を判定することができる。この方法において、ＳＮＰの最終的なシークエンシングは、簡単で、効率的であり、スクリーニングのために使用したものと同じＰＣＲ産物の一定量をＤＮＡ配列決定に供することができるという事実がそれを一層裏付けている。

【0187】

部位特異的ヌクレアーゼを使用したゲノム編集：
ゲノム編集は、配列特異的なＤＮＡ結合領域を非特異的ＤＮＡ切断モジュールに融合させて構成されている、設計されたヌクレアーゼを使用する。これらのキメラヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの二本鎖切断を誘発し、それを修復するために、細胞の内因性ＤＮＡの修復機構が刺激されることにより、、効率的かつ正確な遺伝子改変を可能にする。そのような機構には、例えば、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、及び、相同性配向型修復（ＨＤＲ）が含まれる。

【0188】

拡張された相同性アームを有するドナープラスミドの存在下では、ＨＤＲは、既存の遺伝子を修正するか、または代替するために、単一または複数の導入遺伝子を導くことができる。ドナープラスミドが存在しない場合、ＮＨＥＪ媒介修復は、遺伝子破壊の原因となる標的の小さな挿入または欠失変異をもたらす。

【0189】

本発明の方法において有用な設計されたヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮを）、及び、転写活性体様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。

【0190】

一般的にヌクレアーゼをコードした遺伝子は、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、または、生体外で転写したｍＲＮＡにより、細胞に送達される。蛍光代用レポーターベクターの使用は、また、ＺＦＮ－、及び、ＴＡＬＥＮを改変した細胞の濃縮を可能にする。ＺＦＮ遺伝子送達システムの代替として、細胞は、細胞膜を横断し、内因性遺伝子の破壊を誘導することができる精製されたＺＦＮタンパク質と接触させることができる。

【0191】

複雑なゲノムは、しばしば、意図されたＤＮＡ標的と同一または高度に相同的な配列の複数のコピーを含んでおり、潜在的なオフターゲット活性及び細胞毒性につながる。これに対処するために、構造（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｓｚｃｚｅｐｅｋ ｅｔ ａｌ．， ２００７）及び選択（Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１； Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に基づいたアプローチが、改善されたＺＦＮ及び最適化された切断特異性と低い毒性を有するＴＡＬＥＮのヘテロ二量体を生成するために使用することができる。

【0192】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＤＮＡ結合領域、及び、ＤＮＡ切断領域で構成されており、ここで、ＤＮＡ結合領域は、少なくとも１つのジンクフィンガーを含み、作動的にＤＮＡ切断領域に連結されている。ジンクフィンガーＤＮＡ結合領域は、タンパク質のＮ末端にあり、及び、ＤＮＡ切断領域は、該タンパク質のＣ末端に位置する。

【0193】

ＺＦＮは、少なくとも一つのジンクフィンガーを有する必要がある。好ましい実施形態において、ＺＦＮは、宿主細胞または生物における標的遺伝子組換えのために有用な十分な特異性を有するために、少なくとも３つのジンクフィンガーを有することが望まれる。一般的に、３つ若しくはそれ以上のジンクフィンガーを有するＺＦＮは、ジンクフィンガーが追加されるにつれ、際だって高い特異性を有するようになる。

【0194】

ジンクフィンガー領域は、任意のクラスまたはタイプのジンクフィンガーから誘導できる。特定の実施形態においては、ジンクフィンガー領域は、極めて一般的にみられるＣｉｓ_２Ｈｉｓ_２タイプのジンクフィンガーであり、例えば、転写因子であるＴＦＩＩＩＡまたはＳｐ１のジンクフィンガーにより構成される。好ましい実施形態において、ジンクフィンガー領域は、３つのＣｉｓ_２Ｈｉｓ_２タイプのジンクフィンガーを含む。ＤＮＡ認識、及び／または、ＺＦＮの結合特異性は、細胞のＤＮＡ中の任意の選択された部位で標的としている遺伝子の組換えを達成するために変更することができる。そのような改変は、公知の分子生物学、及び／または、化学合成技術を用いて達成することができる（例えば、Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００２を参照）。

【0195】

ＺＦＮのＤＮＡ切断領域は、あるクラスの非特異的ＤＮＡ切断領域、例えば、ＦｏｋＩなどのタイプＩＩ制限酵素のＤＮＡ切断領域に由来している（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。他の有用なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ，ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、及び、ＡｌｗＩを含めることができる。

【0196】

ＺＦＮの切断領域と認識領域の間のリンカーは、存在する場合、生成したリンカーが柔軟であるように選択されたアミノ酸残基の配列を含む。または、標的部位への最大の特異性のために、リンカーなしのコンストラクトも作られる。リンカーなしのコンストラクトは、強い結合指向性を示し、その後認識部位から６ｂｐ離れた間で切断される。しかし、０～１８アミノ酸長のリンカー長を有するＺＦＮ介在の切断では、５～３５ｂｐ離れた認識部位の間で起こる。リンカー長が与えられているために、結合及び二量体化の両方と一致した認識部位間の距離は制限されているだろう（Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００１）。好ましい実施形態において、切断及び認識の領域間にリンカーは存在せず、標的座位が６つのヌクレオチドのスペーサーにより区切られた互いに逆方向の２つの９塩基の認識部位を含む。

【0197】

本発明の好適な実施形態により、遺伝子組換えまたは変異を標的にするために、２つの９ｂｐのジンクフィンガーＤＮＡ認識配列は、宿主ＤＮＡで特定されていなければならない。これらの認識部位は、約６ｂｐのＤＮＡで互いに逆方向に区切られる。ＺＦＮは、その後、標的である座位で特異的にＤＮＡに結合するジンクフィンガーの組み合わせを設計及び作成し、そして、その後、ＤＮＡ切断領域へジンクフィンガーを連結することによって形成される。

【0198】

ＺＦＮの活性は、ヌクレアーゼ発現レベルを増加させるための一時的な低温の培養条件の使用（Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、及び、ＤＮＡの末端プロセシング酵素による部位特異的ヌクレアーゼの共送達（Ｃｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）により改善することができる。ＺＦＮ媒介ゲノム編集の特異性は、誤りやすいＮＨＥ－Ｊ修復経路を活性化することなくＨＤＲを刺激するジンクフィンガーニッカーゼ（ＺＦＮｉｃｋａｓｅｓ）を使用することにより改善することができる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２； Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

【0199】

転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合領域及びエンドヌクレアーゼ領域を含む。

【0200】

ＴＡＬエフェクターは、病原体により注入される植物病原細菌のタンパク質であり、植物細胞内でそれらが核に移動し、特定の植物遺伝子を活性化する転写因子として機能する。ＴＡＬエフェクターのアミノ酸一次配列は、それが結合するヌクレオチド配列を反映している。従って、標的部位は、ＴＡＬエフェクターにより予測することができ、そしてＴＡＬエフェクターは、特定のヌクレオチド配列へ結合するように設計及び形成することができる。

【0201】

ＴＡＬエフェクターをコードする核酸配列は、ヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの一部をコードする配列、一般的に、ＦｏｋＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼからの非特異的切断領域（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）と融合される。他の有用な酵素として、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ及びＡｌｗＩを含めることができる。いくつかのエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）は、二量体としてのみ機能するという事実は、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を強化するために利用できる。例えば、いくつかの場合において、それぞれのＦｏｋＩモノマーを、異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合することができ、２つの認識部位が近接している場合にのみ、不活性であるモノマーが集まり、機能性酵素が作製される。ヌクレアーゼの活性化にＤＮＡの結合が必要であることにより、高度に部位特異的な制限酵素を作製することができる。

【0202】

配列特異的ＴＡＬＥＮは、細胞内に存在する予め選択された標的ヌクレオチド配列内の特定の配列を認識することができる。従って、いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列をヌクレアーゼ認識部位について走査することができ、特定のヌクレアーゼが標的配列に基づいて選択される。他の例では、ＴＡＬＥＮは、特定の細胞配列を標的とするように設計することができる。

【0203】

プログラム化可能な、ＲＮＡ－誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集：
上記のサイト固有のヌクレアーゼとは異なり、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＡＳシステムは、対象となる遺伝子変異を誘導するためのＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの代替手段を提供する。細菌では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ誘導型のＤＮＡ切断を通じて、外来性ＤＮＡの侵入に対して獲得免疫を提供する。

【0204】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲのＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及び、侵入外来ＤＮＡを配列特異的にサイレンシングするためのトランス活性化型キメラＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依存している。３つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムが存在しており、そのうちのＩＩ型システムでＣａｓ９は、ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡの標的認識時に、ＤＮＡを切断するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する。切断のための相補的ＤＮＡ部位に、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを導くために、ＣＲＩＳＰＲのＲＮＡ塩基は、ｔｒａｃｒＲＮＡと対になり、複合ＲＮＡ構造を形成する。

【0205】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＡＳのエンドヌクレアーゼ、及び、必要なｃｒＲＮＡ構成成分を発現するプラスミドの共送達により、植物細胞に移植することができる。Ｃａｓのエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ修復機構上に追加の制御を提供するために、ニッカーゼに転換できる（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0206】

ＣＲＩＳＰＲ座位は、別個のクラスの散在する反復配列（Ｓｈｏｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ）であり、最初に大腸菌で認識された（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｎａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。同様の散在したＳＳＲは、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）、Ａｎａｂａｅｎａ（アナベナ）、及び、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）で同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

【0207】

ＣＲＩＳＰＲ座位は、短い規則的な間隔の反復（Ｓｈｏｒｔ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｓｐａｃｅｄ Ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＲＳＲ）と呼ばれている反復構造により、他のＳＳＲとは異なっている（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２；Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。反復は、常に一定長を有するユニークな介在配列により規則正しく間隔を置いて配置されているクラスターの中にある短いエレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。反復配列は品種の間で高度に保存されているものの、散在反復の数とスペーサー領域の配列は、品種により異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。

【0208】

ＣＲＩＳＰＲ座位の共通の構造的特徴は、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２００２）が、（ｉ）複数の短い直接反復が存在しており、これは、所定の座位内で、全く同じ配列であるか、又は非常に小さい配列変化を示す；（ｉｉ）同様のサイズの反復の間に、非反復的なスペーサ配列が存在している；（ｉｉｉ）複数のＣＲＩＳＰＲ座位を保有するほとんどの種において、数百塩基対の共通のリーダー配列が存在している；（ｉｖ）座位内に長いオープンリーディングフレームは存在しない；及び、（ｖ）１つ若しくはそれ以上のｃａｓ遺伝子が存在している；であると記載している。

【0209】

ＣＲＩＳＰＲは、一般的には、１１ｂｐまでの内側と末端の逆反復を含む２４～４０ｂｐの短い部分的な回文構造を持つ配列である。単離されたエレメントが検出されているものの、それらは、一般的に、介在する２０～５８ｂｐの固有の配列で区切られた、繰り返し単位のクラスター（ゲノム当たり、約２０個以上）の中に配置されている。ＣＲＩＳＰＲは、一般的に均一であり、指定されたゲノム内でそれらのほとんどは同一である。しかし、例えば、古細菌のように、不均一性の例も存在する（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
本明細書で使用する場合、用語「ｃａｓ遺伝子」は、一般的に、ＣＲＩＳＰＲ座位の近傍に連結しているか、付随しているか、近接しているか、または、隣接している１つ若しくはそれ以上のｃａｓ遺伝子を指す。ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的なレビューは、Ｈａｆｔらに提示されている（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．２００５）。所定のＣＲＩＳＰＲ座位におけるｃａｓ遺伝子の数は、種の間で変化し得る。

【実施例】

【0210】

【実施例1】

【0211】

原料及び方法：
植物原料：
オオムギ系統の品種Ｓｌｏｏｐ（野生型）は、オーストラリアの冬穀物コレクション（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｗｉｎｔｅｒ Ｃｅｒｅａｌｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｔａｍｗｏｒｔｈ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。Ｒｉｓ_φ５６（Ｂ－ホルデインを発現しない）、及び、Ｒｉｓ_φ１５０８（Ｃ－ホルデインを発現せず、Ｄ－及びＢ－ホルデインは低発現）（Ｄｏｌｌ，１９７３；Ｄｏｌｌ，１９８３）は、北欧の遺伝資源バンクから入手した（Ａｌｎａｒｐ，Ｓｗｅｄｅｎ）。Ｒｉｓ_φ１５０８は、エチレンイミン誘導された突然変異体であり、染色体５Ｈ上のｌｙｓ３ａ遺伝子に変異を保有し、Ｃ－ホルデインの蓄積が少ない。これらの各系統は、一般に入手可能である。植物は、日中２５℃、及び、夜間２０℃の温室条件下で生長させ、収穫した種子は、汚染物を除去するために検査した。麦芽化と醸造の実験のために、品種Ｓｌｏｏｐ、Ｒｉｓ_φ５６及びＲｉｓ_φ１５０８の植物は、ＣＳＩＲＯ Ｇｉｎｎｉｎｄｅｒｒａ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｃａｎｂｅｒｒａの圃場で、並べて生長させ、そして各々１０ｋｇの穀粒が収穫された。穀粒を麦芽化し、標準的な技術を用いて２０Ｌバッチのビールを醸造した。

【0212】

粉からのプロラミン抽出：
プロラミン（アルコール可溶性タンパク質）を抽出するために、穀粒は、標準的な技術を用いて、全粒粉に粉砕した。水洗した全粒粉（１０グラム）中のプロラミンは、５５％（ｖ／ｖ）の２－プロパノール（ＨＰＬＣグレード）に溶解させ、２％（ｗ／ｖ）のジチオストレイトール（ＤＴＴ）で６５℃、４５分間インキュベートし、２容積の２－プロパノールで、一晩－２０℃で沈殿させた。沈殿したプロラミンは、８Ｍの尿素、１％ＤＴＴ、２５ｍＭのトリエタノールアミン塩酸塩（ｐＨ６）に溶解させ、４ｍＬで、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ＲＰＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｓｙｄｎｅｙ， ＮＳＷ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）により精製し、１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に３０ｍＬのアセトニトリルを３～６０％（ｖ／ｖ）に直線勾配させて（流速２ｍＬ／分）溶出した。

【0213】

フィルターを用いたサンプルの調製（ＦＡＳＰ）方法：
ホルデイン抽出物（５０μＬ）を、ＰＡＬＬ Ｎａｎｏｓｅｐ １０ ＭＷＣＯフィルターに移した。２００μＬの８Ｍの尿素（Ｓｉｇｍａ社製）／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ塩酸塩水溶液ｐＨ８．５（ＵＡ）を加え、混合物を１４，０００ｒｐｍ、約２０℃で１５分間遠心分離した。チューブを透過した画分は廃棄した。２００μＬのＵＡを、更にフィルターユニットに添加し、１４，０００ｒｐｍで、１５分間再遠心分離した。１００μＬのＩＡＡ溶液（０．０５Ｍのヨードアセトアミド／ＵＡ）を添加し、サンプルを、２０℃に設定したサーモミキサーで、６００ｒｐｍ、１分間混合し、次いで２０分間、混合することなくインキュベートした。１００μＬのＵＡをフィルターユニットに添加し、１５分間、１４，０００×ｇで、遠心分離した。この手順を２回繰り返した。１００μＬの０．０５ＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３（重炭酸アンモニウム、ＡＢＣ）水溶液をフィルターユニットに添加し、１０分間、１４０００×ｇで遠心分離した。この手順を２回繰り返した。１５μＬのトリプシン保存液（１．５μｇ／μＬ、Ｓｉｇｍａ社製）と共に４０μＬのＡＢＣを添加し、各サンプルをサーモミキサーで、１分間、６００ｒｐｍで混合した。フィルターユニットは、酵素分解のため、４～１８時間、３７℃の湿潤チャンバー中でインキュベートした。フィルターユニットは、新しい回収チューブに移し、１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。４０μＬのＡＢＣを添加し、フィルターユニットは、１０分間、１４，０００ｒｐｍで再度遠心分離した。この手法を１回繰り返した。透過画分に、１５μＬの５％ギ酸を添加し、凍結乾燥した。抽出し、乾燥したペプチドは、ＭＲＭによる分析のために、３０μＬの０．５％ギ酸に再懸濁した。

【0214】

麦芽汁及びビールの調製：
オオムギは、数個の８００ｇの缶中で、Ｊｏｅ Ｗｈｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｍａｌｔｉｎｇシステムを用いて麦芽させた。浸漬方式は、１７℃で８時間浸漬、９時間静止、５時間浸漬（Ｓｌｏｏｐ）；１７℃で８時間浸漬、１０時間静止、５時間浸漬（Ｒｉｓ_φ５６）；及び、１７℃で７時間浸漬、８時間静止、３時間浸漬（Ｒｉｓ_φ１５０８）を含む。発芽は、Ｓｌｏｏｐは１６℃、２つのホルデイン欠失変異体は１５℃で、９４時間かけて発生させた。窯の設定は、５０～８０℃で、２１時間以上であった。窯で焙燥した麦芽を、Ｃｏｌｇｒａｖｅら（２０１２）に記載されている通りマッシングした。示されているアミラーゼの静止時間の後、マッシュを沸騰させ、麦芽汁を製造するために１時間煮沸した。沸騰中には、沸騰した麦芽汁は、２１～２２ＩＢＵを達成するために、Ｔｅｔｔｎａｎｇホップで苦味を付けた。麦芽汁を２０℃で一晩冷却し、その後、Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ ＵＳ－０５イーストを用い、１８～２０℃で発酵させ、約２週間後に完了させた。濾過していないビールは、樽に詰め、瓶詰めの前に炭酸を付与した。

【0215】

ビールの分析：
６０種の市販ビールの選択が、Ｃｏｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）の別表１に示す通り得られた。それぞれの２つの異なる瓶から３連のサンプル（１ｍＬ）を採取し、減圧下でＣＯ_２を除去するために脱気した。脱気したビールを一定量（１００μＬ）採取し、２０μＬの５０ｍＭのＤＴＴを添加し、６０°Ｃで、３０分間、Ｎ_２気流下で還元した。これらの溶液に、２０μＬの１００ｍＭヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を添加し、サンプルを室温で１５分間インキュベートした。各々の溶液に、５μＬの１ｍｇ／ｍＬトリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）または、キモトリプシン（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、サンプルを一晩、３７℃でインキュベートした。分解したペプチド溶液を、１０μＬの５％ギ酸を添加することにより酸性化し、１０ｋＤａのＭＷフィルター（Ｐａｌｌ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に通した。濾液を凍結乾燥し、１％ギ酸中で再構成し、分析まで４℃で保存した。

【0216】

未分解麦芽汁及びビール：
野生型（Ｓｌｏｏｐ）由来のオオムギ及びホルデイン欠失変異体の麦芽汁及びビール（０．１ｍＬ）は、３０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離することにより、１０ｋＤａの分子量を除くフィルター（Ｐａｕｌ）に通し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに適したペプチド画分を生成した。ペプチド画分（１０μＬ）を、ＱＳｔａｒ Ｅｌｉｔｅ質量分析計で分析した。

【0217】

Ｑ－ＴＯＦ ＭＳ：
サンプルは、５μｍの粒子サイズを有するＶｙｄａｃ ＭＳ Ｃ１８３００Åのカラム（１５０ｍ×０．３ｍｍ）（Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ， Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＵＳＡ）を使用して、３μＬ／分の流速で２０分間かけて、溶媒Ｂを２～４２％に直線勾配させて、ＳｈｉｍａｄｚｕナノＨＰＬＣシステム（島津製作所製、Ｒｙｄａｌｍｅｒｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のクロマトグラフィーで分離した。移動相は、溶媒Ａ（０．１％ギ酸）、及び、溶媒Ｂ（０．１％ギ酸／９０％アセトニトリル／１０％水）より構成されている。ＱＳｔａｒ ＥＬｉｔｅＱｑＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）は、ナノエレクトロスプレーイオン源を備えた標準的なＭＳ／ＭＳデータ取得モードで使用した。分析したＭＳスペクトルは、最も強い親イオンを元に（ＭＳ／ＭＳに対して、１０カウント／秒の閾値、２＋～５＋の荷電状態、及び、ｍ／ｚ＝１００～１６００質量範囲）、３つのＭＳ／ＭＳ測定の後、メーカーの「スマート出口」を用いて、１秒間（ｍ／ｚ＝４００～１８００）収集した。以前に標的とした親イオンは、３０秒間の反復ＭＳ／ＭＳの収集（１００ｍＤＡの質量許容範囲）から除外した。

【0218】

線形イオントラップ（三段四重極）ＭＳ：
還元及びアルキル化したトリプシンペプチドは、陽イオンモードで操作するＴｕｒｂｏＶイオン源を装備した、アプライドバイオシステム４０００ ＱＴＲＡＰ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で分析した。サンプルは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（２．１ｍｍ×１０ｃｍ）製カラムで、４００μＬ／分の流速、１５分間で５～４５％のアセトニトリル（ＡＣＮ）を直線勾配させることによりＳｈｉｍａｄｚｕ ＮｅｘｅｒａＵＨＰＬＣ（島津製作所製）のクロマトグラフィーを用いて分離した。ＨＰＬＣからの溶出液は直接質量分析計に流れる。データを取得し、Ａｎａｌｙｓｔ １．５ソフトウエア（登録商標）を用いて処理した。Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ （ＩＤＡ）分析には、サーベイスキャンが質量範囲３５０～１５００で、タンデム型マススペクトルの収集を目的とした、強化されたＭＳ（ＥＭＳ）スキャン（ＥＭＳ）を用いた。定義した閾値（１００，０００カウント）を超える２つのトップイオンが選択され、そして、初めに、質量範囲１２５～１６００の強化されたプロダクトスキャン（ＥＰＩ）を入手する前に、強化された分割（ＥＲ）スキャンにかけた。

【0219】

マススペクトルの分析及びデータベースの探索：
Ｐａｒａｇｏｎ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを備えたＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（登録商標）４．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、タンパク質の同定のために使用した。タンデム型質量分析データは、Ｕｎｉｐｒｏｔ（２０１１／０５版）、及び、ＮＣＢＩ（２０１１／０５版）データベースのインシリコでのＴｒｉｔｉｃｅａｅ連のタンパク質のトリプシン、または、キモトリプシン分解に対して検索した。すべての検索パラメータは、分解酵素としてトリプシンまたはキモトリプシンのいずれかで、システインアルキル化で修飾されたヨードアセトアミドとして定義した。修飾は、このソフトウェアパッケージに付属している「ジェネリック精製」及び「生物学的」修飾セットに設定されており、１２６の可能性のある改変、例えば、アセチル化、メチル化、及び、ホスホリル化から成る。ジェネリック精製の修飾セットには、例えば、酸化、脱水、脱アミドなど、サンプル処理の結果として発生し得る５１の改変が含まれる。１つ切断し損なわれたペプチドを分析に含めた。

【0220】

特注の穀物データベースの構築及び応用：
少数の特注の穀物種子貯蔵タンパク質のデータベースは、ＮＣＢＩ、ＴＩＧＲ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｉｃｅｓ、または、ＴＩＧＲ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓが所有するＴｒｉｔｉｃｕｍ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ａｖｅｎａ、Ｓｅｃａｌｅ、及び、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ連におけるヌクレオチド登録から報告されたすべてのタンパク質配列を含めることにより構築されている。上記の種のヌクレオチド配列は、６つのフレームで翻訳され、最長のオープンリーディングフレームのみを維持するためにトリミングされた。得られたタンパク質配列のセットは、非重複化した。 最初から最後まで１００％合致する配列のみが、すべての多様性を保持するために、一緒に潰された。最後に、これらのファイルは、グルテン、グリアジン、グルテニン、ホルデイン、アベニン、または、セカリンの言葉を含むエントリのみを保持するために選別した。タンデム型の質量分析データは、カスタム穀物データベースに対して検索した。

【0221】

タンパク質の配列及び原型ペプチドの同定：
既知の全てのホルデインタンパク質はＵｎｉｐｒｏｔデータベースで、そして予測されるホルデインタンパク質はＴＩＧＲデータベースで揃えた。それぞれのファミリー（Ｂ、Ｃ、Ｄまたはγ）内の共通ペプチドを、ファミリーの代表として選定した。ＭＲＭ遷移は、各ペプチドに対して決定され、そこでは前駆体イオン（Ｑ１）のｍ／ｚは各ペプチドのサイズ及び予想される電荷に基づいており、そしてフラグメントイオン（Ｑ３）のｍ／ｚは、既知のフラグメント化パターン、及び／または、キャラクタリゼーションのワークフローで収集されたデータを用いて予測される。最大６までの遷移が予備的な分析に使用され、そのＭＲＭ遷移は細分化され、上位２つのＭＲＭ遷移が最終的な方法で使用するためにペプチド毎に選択される。ここで、最も強いＭＲＭ遷移を定量用に使用し、第二の最も強い遷移を確認用に使用した。

【0222】

ＭＲＭ質量分析：
ＭＲＭ実験は、ホルデイン由来のトリプシンペプチドの定量化のために使用した。ＩＤＡ及びＭＲＭ双方によるＭＳ／ＭＳ実験ののために、スキャン速度を１０００Ｄａ／ｓに設定し、そして、ペプチドは、前駆体イオンのサイズ及び電荷に依存して回転する衝突エネルギーを用いて、衝突セルにおいて窒素ガスでフラグメント化した。ホルデインペプチドの定量化は、各ＭＲＭ遷移と１秒のサイクル時間に対して、１２０秒の検出窓を使用してスケジュール化したＭＲＭスキャン実験を使用して実施した。最初の四重極は、分析物、いわゆる前駆体イオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を選択するために使用した。前駆体イオンは、その後、衝突セル（第２四重極）に移送された。衝突誘起解離（ＣＩＤ）は、第３の四重極に移送されたフラグメントイオンの生成をもたらすことになる。質量選択の第２段階は、具体的には、既知のフラグメントイオンのｍ／ｚ値を標的とする。２つの質量選択の段階はＱ１及びＱ３として知られ、選択が生じる四重極を指す。従って、Ｑ１からＱ３への遷移は、ＭＲＭ遷移として知られ、選択した分析物に対して高度に特異的かつ択的である。

【0223】

ホルデインの相対定量化：
各ホルデインの相対定量化は、各ペプチドについて最も強いＭＲＭ遷移のピーク面積を積分することにより行った。平均ピーク面積は、ボトルＡ及びＢ（生物学的に複製を表す）から、２回の繰り返し測定（異なる日に）の平均をとることによって決定した。結果は、すべてのグルテン含有ビールのホルデイン平均含量に対する各ホルデインタンパク質の百分率として提示される。

【実施例2】

【0224】

オオムギ粉におけるホルデインの特性評価：
アルコール溶液に可溶化することにより、オオムギ粉（野生型品種Ｓｌｏｏｐ）から抽出されたホルデインは、実施例１に記載の通り、ＦＰＬＣで精製された。精製されたホルデイン画分は、還元され、アルキル化され、トリプシンまたはキモトリプシン分解に供された。酵素分解後、１０ｋＤａ未満の画分は、精製されたプロラミン画分に存在するホルデインを同定するためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析され、この粉から醸造されたビール中に存在すると予想される全ホルデインタンパク質が得られた。１％の偽発見率（ＦＤＲ）を使用して、全部で１４４のタンパク質がトリプシン分解後に同定され、全部で５５のタンパク質がキモトリプシン分解後に同定された。

【0225】

表１に、トリプシン分解後に粉から検出されたホルデインタンパク質の生成物を記載した。検出された最も豊富なタンパク質の中には、以前に報告されたＢ３－ホルデイン（アクセッション番号：Ｐ０６４７１、Ｋｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、γ－３－ホルデイン（Ｐ８０１９８、Ｆａｓｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）及び予測されたγ－１－ホルデイン（Ｐ１７９９０、Ｃａｍｅｒｏｎ－Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８）があった。同様に、Ｄ－ホルデイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ８４ＬＥ９、Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，２００３）が、豊富に検出された。２つのγ－ホルデイン及び１つのＢ１－ホルデインを含む、少ない量の他のタンパク質が検出され、それはＮＣＢＩまたはＵｎｉｐｒｏｔデータベースのいずれにも存在しなかった（表１）。これらのタンパク質は、ＮＣＢＩ、ＴＩＧＲ Ｇｅｎｅ Ｉｎｄｉｃｅｓ、またはＴＩＧＲ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓに登録されているヌクレオチドから翻訳された穀物タンパク質からなる特注のデータベースを検索することにより同定された。予測されたγ－グリアジン及びグルテニン（コムギから）、及び、アベニン様タンパク質－Ａ（コムギ及びヤギムギから）に合致するいくつかのペプチドが検出された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより単離された１６～１７ｋＤａのタンパク質バンドのトリプシン分解から生じる１５個のアミノ酸ペプチド（ＱＱＣＣＱＰＬＡＱＩＳＥＱＡＲ；配列番号：５）の検出に基づき、アベニン様Ａタンパク質はビール中に存在することが報告された（Ｐｉｃａｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。そのペプチド配列は、同一の予測タンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｆ２ＥＧＤ５）に合致する、さらなる１３個のアミノ酸（ａａ）のペプチドに加えて、ＢＬＡＳＴｐ検索で決定される通り、オオムギからの単一タンパク質中の配列と合致した。Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ（ヤギムギ）から、アベニン様タンパク質Ａ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ２Ａ７８２）に合致する、１１個のａａ（ＭＶＬＱＴＬＰＳＭＣＲ；配列番号：６）のペプチドもまた、検出された。翻訳されたＥＳＴデータベース（ＴＩＧＲ）のその後の検索で、オオムギタンパク質が１１個のａａペプチドと証明されることを明らかにした。予測したアベニン様タンパク質Ａ及びγ－ホルデインタンパク質の間の相同性に基づいて、これらをその後の分析に含めた。

【0226】

単一のペプチドの同定により、ホルデイン画分内にＣ－ホルデインの存在が示唆されたが、既知のＣ－ホルデインタンパク質の配列アラインメントから、これらのグルタミンリッチタンパク質内にトリプシン切断部位が存在しないことが明らかとなった。結果として、ホルデイン画分のキモトリプシン分解により最大８０％の配列カバー率を伴うＣ－ホルデインが同定され（表２）、この種類のホルデインを特徴付ける代替分解戦略の必要性を強調している。

【0227】

【表1】

【0228】

【表2】

【実施例3】

【0229】

麦芽汁及びビール中のホルデインの特性評価：
麦芽汁、醸造中のマッシング工程から抽出された液体及びビールの分析が、続いて実施され、類似した一連のプロラミンが同定された（表３）。合計２７タンパク質が麦芽汁中で同定され、そして、７９タンパク質は、ビール中で同定され、最も量の多いタンパク質である、非特異的な脂質輸送タンパク質１（ＬＴＰ１）及びα－アミラーゼトリプシン阻害剤（ＣＭｄ、ＣＭｂ、ＣＭａ）を有していた。麦芽汁中で同定されたグルテンタンパク質は、以前にホルデインが豊富な画分で観察されたアベニン様Ａタンパク質（１８ペプチド）、γ－ホルデイン－３（１０ペプチド）、及び、Ｄ－ホルデイン（４ペプチド）を含む。５０％超のペプチドは、トリプシン作用が半分（Ｌｙｓ／Ａｒｇ以外の部位の一端で切断される）であるが、タンパク質の著しい分解が醸造工程の間に生じたことを示しているのは興味深い。ＥＳＴデータベース検索から同定されたアベニン様タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＢＥ１９５３３７）は、タンパク質同定の信頼性を上昇させる、＞６０％の配列カバー率（１２ペプチド）で検出された。

【0230】

Ｃ－ホルデインタンパク質はビールの中に目立って存在しないが、これがトリプシンの切断部位の数が少ないことによる偽陽性ではないということを確かめるために、キモトリプシン分解を行い、ビール中にＣ－ホルデインが存在しないことを確認した（表３）。Ｃ－ホルデインの不在は、おそらく、水に不溶性であることに関連していた。Ｃ－ホルデインは、ＰＱＱＰＦＰＱＱ（配列番号：７）のコンセンサス配列を有する複数のオクタペプチドの繰り返し単位から構成され、それらは高度に不溶性であった。Ｃ－ホルデイン分解生成物の多くは、麦芽汁で同定されるが、ビール製造につながる醸造及び濾過工程には存在しなかった。

【0231】

ペプチドのフラグメントを特徴付けるために、麦芽汁及びビールは１０ｋＤａの分子量を除くフィルターに通過させ、酵素分解なしで分析した。１Ｄ－ＰＡＧＥ分析は、濾過工程がビールからタンパク質を除去するのに効率的であることを明らかにした。ＭＳ分析は、いくつかの短縮型または分解したホルデイン生成物の存在を明らかにした。表４は、同定されたペプチドのフラグメントを示す。ホルデインペプチドに加えて、セルピン－Ｚ４、非特異的脂質輸送タンパク質１、α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、ホロインドール（Ｈｏｒｄｏｉｎｄｏｌｅｓ）（Ｂ１、Ｂ２）及びＧＡＰＤＨを含む、オオムギタンパク質由来のペプチドは、麦芽汁及びビールで同定された（Ｃｏｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２の、表４及び補足の表２に記載される）。興味深いのは、麦芽汁では多数のＣ－ホルデインが観察され、ビールではＣ－ホルデインペプチドが微量のみ検出されたことである。

【0232】

酵素分解していないビールの特性評価により、そのままのホルデインに加えて、部分的に分解されたホルデイン断片が多数存在し、これらもセリアック病の毒性に寄与し得ると明確に証明される。これらのペプチド断片の多くは、セリアック病患者において免疫応答を誘発し得るＧｌｎ及びＰｒｏの配列を含んでいた。検出された潜在的に免疫原性のペプチドの例には、ＦＶＱＰＱ［ＱＱＰＦＰ］ＬＱＰＨＱＰ（アベニン様Ａ；ＧｅｎＢａｎｋ：ＴＡ３１０８６、配列番号：８）；ＹＰＥＱＰ［ＱＱＰＦＰ］ＷＱＱＰＴ（γ－１－ホルデイン；Ｐ１７９９０、配列番号：９）；ＬＥＲＰ［ＱＱＬＦＰ］ＱＷＱＰＬＰＱＱＰＰ（γ－３－ホルデイン；Ｐ８０１９８、配列番号：１０）；及びＬＩＩＰＱＱＰ［ＱＱＰＦＰ］ＬＱＰＨＱＰ（Ｃ－ホルデイン；Ｐ１７９９１、配列番号：１１）があり、ここで［ ］で括られた配列は、以前に報告された免疫原性ペプチドと高度な相同性を有する（Ｔｙｅ－Ｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋａｈｌｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0233】

【表3】

【0234】

【表4-1】

【表4-2】

【実施例4】

【0235】

ＭＲＭ質量分析によるビール中のホルデインの相対定量：
実施例２の精製されたホルデイン及び実施例３のビールのプロテオミクス特性評価により、オオムギ中に存在する主要なホルデインタンパク質の解明が可能となった。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）がペプチド及びタンパク質の定量に有用なツールであることを確認した。この方法では、タンパク質をトリプシン分解後、タンパク質分解断片をＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分離し、ＭＲＭ質量分析により分析した。最初の四重極（Ｑ１）は、第一のペプチドのｍ／ｚ値（前駆体の質量）を選択し、衝突セル（Ｑ２）に、このイオンを移行させた。衝突誘起解離は、タンパク質分解断片のアノ酸配列に関連するフラグメントイオン系列の生成をもたらした。特徴的なフラグメントイオンを第３の四重極（Ｑ３）で選択し、目的のペプチドを定量可能な検出器に送った。一般的に、タンパク質当たり少なくとも２つのペプチドで、ペプチド当たり３つのＭＲＭ遷移が用いられた。

【0236】

それぞれのタンパク質ファミリーからの単一のアイソフォームが、選択育種系のオオムギから醸造されたビールのグルテン含有量をモニターするために選択された（下記参照）。複数のトリプシンペプチド（＞２のペプチド／タンパク質）を、定量的アッセイの開発のために選択した。これらのペプチドが過去の定性実験で検出された場合、そのペプチドのｍ／ｚ、及び、フラグメントイオン情報を、使用するＭＲＭ遷移を決定するために使用した。最初に同定されなかった多くのペプチドは、最低でもタンパク質当たり２つのペプチドが用いられるようにＭＲＭアッセイに含めた。これらの例では、保持時間が分からず、最初の通過実験でＭＲＭ遷移をスケジュール化できなかった。ペプチドの保持時間を決定した後の実験では、スケジュール化されたＭＲＭ遷移を使用した。

【0237】

単一の優良なオーストラリア麦芽用オオムギ（「Ｓｌｏｏｐ」）に由来するビールは全てのホルデインタンパク質を含んでいるため、ＭＲＭ法の開発と改良に使用した。一方で、オオムギの変異種（Ｒｉｓ_φ５６及びＲｉｓ_φ１５０８）は、Ｂ及びＣ－ホルデイン含量が低い、または欠失していることが予想された。野生型及び２つのホルデイン変異体のオオムギ粒（Ｒｉｓ_φ５６及びＲｉｓ_φ１５０８）のサンプルから醸造されたビールをＭＲＭアッセイにより分析したとき、８つの選択されたペプチド（ペプチド当たり３つのＭＲＭ遷移）が、野生型のオオムギビールに対してすべて明確に観察された。Ｒｉｓ_φ５６ビールは、Ｄ－ホルデインペプチドの量で、約３倍の低下を示したが、Ｂ－ホルデインペプチドは、明確に存在しなかった。Ｒｉｓ_φ１５０８ビールでは、測定された各ペプチド量がさらに減少していたが、微量のアベニン様Ａタンパク質が観察された。

【0238】

分析方法の再現性は、単一品種のオオムギビール（「Ｓｌｏｏｐ」）を調べることにより評価した。第一に、ビールは、複数の凍結融解サイクル（１、１０、２０、または、５０サイクルのいずれか）にかけたが、５０サイクル後でも各々のモニターされたＭＲＭ遷移のピーク面積で、有意な変化（変動係数、ＣＶ：＜１５％）は観察されなかった。第二に、分解効率は、＜１５％のＣＶをもたらす、６回の繰り返し分解産物により検討した。分析の再現性は、＜１５％のＣＶで各分解物を４回繰り返し分析することにより評価した。最後に、二つの異なるボトル間でのホルデイン含量の変動を評価し、＜１０％であることが判明した。

【0239】

市販ビールの分析：
ビール中のホルデインを定量するＭＲＭ法の更なる検証は、低グルテン及びグルテンフリーと表示されたビールを含む６０種の市販ビールから、選択したグルテン含有量を分析することにより提供される。別々のボトルからの２連のサンプルを還元、アルキル化及び分解（実施例１）処理し、ＭＲＭ質量分析により分析した。図２は、Ｓｌｏｏｐに対する市販ビール中のアベニン様Ａタンパク質（Ａ）、Ｂ－ホルデイン（Ｂ、Ｃ）、Ｄ－ホルデイン（Ｄ）及び、γ－ホルデイン（Ｅ）の相対量を示す。非グルテンフリービールの平均値と比較して、市販ビールは、種類（所属するホルデインファミリー）、及び、量（任意の所定のホルデインタンパク質の平均値の参照値は、１～３８０％）で変化することが観察された。８つのビール（番号：１７、４７、４９、５０、５１、５２、５８及び６０）は、ソルガム麦芽、テフ、コメ、キビまたはトウモロコシから醸造されたので、グルテンフリーと表示された。これらの穀物は、オオムギ及びコムギに存在するグルテンタンパク質を欠失している。ＭＲＭアッセイにより、８つのビールが標的となるホルデインタンパク質及びホルデイン関連のタンパク質（アベニン様Ａ）を欠失していることを確認した。ビール１７及び５０～５２は、ソルガムベースであり、ビール４７は、何からつくられたかを特定しなかった。ビール４９は、キビベースであり、ビール５８はソルガム麦芽、テフ、及びコメから醸造され、ビール６０は、非穀物由来のビールであった。低グルテン（＜１０ｐｐｍ）に分類されている２つのビール（５７及び５９）での試験において、相対的なホルデイン含有量は、試験したビールの範囲にわたって平均的なホルデイン含有量と変わらなかった。ビール５７は、低アベニン様Ａタンパク質レベル（参照平均値：～５０％）を示したが、意外にも、Ｂ１－ホルデイン（参照平均値：＞３００％）、Ｄ－ホルデイン（～１０５％）及びγ３－ホルデイン（～６２％）由来のペプチドで有意なレベルを示した。ビール５９は、低レベルで、有意なレベルのＢ１－ホルデイン、Ｄ－ホルデイン、及び、γ－ホルデイン（それぞれ、５５％、４２％及び９２％）、及び、グルテン含有ビールで観察されたものと同等レベルのアベニン様Ａタンパク質を示した。

【0240】

結論：
オオムギから作られたビールは、醸造工程において、使用される穀粒に由来するグルテンを含有していた。ビール中のグルテンのレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して測定できるが、しかし、現在のＥＬＩＳＡ技術を用いたホルデインの正確な測定には、関連する多くの制限がある。上記の実施例において、質量分析アッセイは、精製されたホルデイン調製物、麦芽汁及びビール中のすべてのホルデインを特徴付けるため、及び最も豊富なホルデインタンパク質の相対定量を行うために開発された。質量分析法を用いたアッセイは、粒紛、麦芽汁及びビールにおけるホルデイン（グルテン）を測定するのに堅牢かつ高感度であり、麦芽に容易に適用することができる。

【実施例5】

【0241】

オオムギのＨｏｒ３遺伝子におけるヌル変異の同定：
１０５ｋＤａのオオムギＤ－ホルデインのポリペプチドは、染色体１Ｈの長腕上のＨｏｒ３遺伝子によりコードされる（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８と命名されたオオムギの野生種は、Ｄ－ホルデインを蓄積しないことが認識されており（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、公的に入手可能な遺伝資源コレクションである、ジョンイネスセンター公開コレクション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）から入手した（アクセッション Ｎｏ． ３７７１）。この品種は、穀物の商業製造には全く不向きなオオムギの野生種であった。

【0242】

Ｅｔｈｉａ Ｒ１１８の穀粒は、温室で播種した。結果として得られた植物は、２系統と６系統の表現型として、並びに、黒、着色種子及び緑色種子用に分離して観察した。緑色の種子を製造する二条性の系統が選択され、品種Ｓｌｏｏｐと交配した。Ｄ－ホルデインの製造に陰性であったＦ２半種子が選択された。この系統の植物は、野生型Ｓｌｏｏｐに戻し交配し、そして、Ｄ－ホルデインに対してヌルであるＦ２植物が再度選択された。この植物は、Ｓｌｏｏｐに戻し交配され、後代植物は、Ｄ－ホルデイン産生が陰性であり、スループゲノムの約８７．５％の遺伝的背景を有するＢＣ_２系統を作成するために、再び、戻し交配された。

【0243】

Ｄ－ホルデインをコードする遺伝子は、Ｓｌｏｏｐ ＢＣ_２、Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８由来のＤ－ホルデイン陰性植物、及びその野生型であるＳｌｏｏｐのそれぞれから単離したゲノムＤＮＡから増幅した。これは、標準的な条件を用いたＰＣＲによるものであり、そして一連の３つのオーバーラップしたフラグメントを生成した。増幅に使用されたプライマー対は：
フラグメント１：
５′Ｄｈｏｒ１：ＧＡＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＣ（配列番号：６０）及び
３′Ｄｈｏｒ３：ＡＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴＴＡＣＣＧＣ（配列番号：６１）
フラグメント２：
５′Ｄｈｏｒ１ｂ：ＧＡＧＡＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＴＣＣＡＣＣ （配列番号：６２）；及び
３′Ｄｈｏｒ１：ＣＴＴＧＴＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡ（配列番号：６３）；
フラグメント３：
５′Ｄｈｏｒ２：ＧＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＣＴＡＣＣＣＡＡＧＴＡＴＧ（配列番号：６４）；及び
３′Ｄｈｏｒ２：ＧＣＴＧＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＧ（配列番号：６５）；
である。

【0244】

増幅産物を精製し、それぞれの塩基配列を決定した。アセンブルしたＳｌｏｏｐからの配列は、２８３８ｂｐ長であり（配列番号：７２）であり、Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８由来の配列は、２７２４ｂｐ長（配列番号：７３）であった。両タンパク質の予測ＡＴＧ翻訳開始コドンは、それぞれの配列の位置３９８～４００にあった。Ｓｌｏｏｐでは、終止コドンは、７４７アミノ酸残基のタンパク質をコードする、ヌクレオチド位置２６４１～２６４３にあった。Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８からの配列の分析では、Ｓｌｏｏｐと比較した場合、Ｈｏｒ３遺伝子の位置８４８（開始コドンに対して位置４５０）でＣからＧへの変化があり、インフレームにＴＡＧ終止コドンが導入されることによりタンパク質中の位置１５０（図３）においてポリペプチドの短縮化がもたらされることが明らかにされた。このＤ－ホルデインポリペプチドの短縮化は、セリアック病患者の免疫原性であることが示されているエピトープを含むプロリン及びグルタミンリッチな領域よりも前の部分で起こっていた。

【0245】

このヌクレオチド置換により、栽培品種Ｓｌｏｏｐの野生型のヌクレオチド配列中に存在するＫｐｎＩ部位がなくなるため、共優性ＣＡＰＳマーカーの開発が可能である。この目的のために、２７２ｂｐのＤＮＡ断片をプライマ：５′－Ｄｈｏｒ－マーカー（ＧＧＣＡＡＴＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣ、配列番号：６６）、及び、３′－Ｄｈｏｒ－マーカー（ＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＣ、配列番号；６７）（図４）のプライマー対を用いて増幅した。増幅産物を、その後、制限酵素ＫｐｎＩとともにインキュベートし、アガロースゲル上で電気泳動した。野生型のオオムギＳｌｏｏｐからの断片は、ＫｐｎＩにより切断されて１６４ｂｐ及び１０８ｂｐの２つの断片を生成した。これとは対照的に、Ｄ－ヌルＥｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８からの２７２ｂｐの断片は、分解されなかった。従って、この方法により、Ｄ－ホルデインをコードする遺伝子の野生型とヌル変異型アリルを明確に判別することが可能であった。

【実施例6】

【0246】

オオムギのＨｏｒ２座位での欠失変異のための分子マーカーの同定：
オオムギ染色体１Ｈの短腕上にあるＨｏｒ２座位は、約３６～４５ｋＤａの大きさの範囲において、それぞれ、Ｂ－ホルデインをコードする、約２０～３０の遺伝子ファミリーを含んでいる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｒｉｓ_φ ５６は、γ線誘発によりすべて、または、ほぼ全てのＢ－ホルデイン遺伝子を含む約８６ｋｂの領域を欠失した突然変異体である（Ｋｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）。この変異は、Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）が、以前に説明した通り、全ホルデインの発現レベルが大幅に低下したＨｏｒ２－ｌｙｓ３ａ二重突然変異を作製するために使用される。

【0247】

野生型Ｈｏｒ２座位を検出し、そしてＨｏｒ２欠失座位とそれを区別するために、分子マーカーを設計し、標準的なＰＣＲ条件を使用して次のように試験した。８００ｂｐのＢ１－ホルデインＰＣＲバンドがない場合、Ｈｏｒ２座の欠如（欠損）している、即ち、Ｈｏｒ２の変異アリルを持っていることを意味している。この増幅に使用されるプライマー対は；
３′－Ｂ１Ｈｏｒ：ＴＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧ（配列番号：６８）；
５′－Ｂ１Ｈｏｒ：ＣＡＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＣＴＣ（配列番号：６９）；
であった。

【0248】

各ＤＮＡサンプルについて、４５０ｂｐの特徴的なＰＣＲバンドを生成するコントロールＰＣＲ反応を、プライマー対：
５′－γ－Ｈｏｒ３：ＣＧＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＡＴＴＡＣＴＣＣＡＧ（配列番号：７０）；
３’－γ－３：全長：ＡＧＴＡＡＣＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＴＣＧ（配列番号：７１）；
を使用して実施したところ、γ－ホルデイン座位の存在が示され、サンプルＤＮＡの品質はＨｏｒ２反応用として十分であることが確認された。

【実施例7】

【0249】

三重ヌルオオムギ変異体の生成：
ＷＯ２００９／０２１２８５で、Ｇ１^＊として識別されるＨｏｒ２－ｌｙｓ３ａ二重変異体オオムギ系統のＦ５植物は、Ｆ６子孫を生成するために、温室内で生育させた。Ｆ６植物は、その後、Ｆ７子孫を生成するために、圃場で生育させた。Ｈｏｒ２－ｌｙｓ３ａ変異体をＨｏｒ３ヌル変異体と組み合わせるために、Ｆ７世代の植物は、Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８（実施例５）に由来するＤ－ホルデイン陰性のＢＣ_２植物と交配し（実施例５）、そのＦ１子孫は、Ｆ２種子を製造するために自家受粉した。Ｆ２種子を半分に切断し、胚芽のある半分を発芽させ、そして、その苗を、、実施例５及び６の通り、Ｂ－及びＤ－ホルデインのスクリーニングのためと、γ－ホルデインのためのＰＣＲを行った。胚乳を含むそれぞれの種子の残り半分は、８Ｍの尿素及び１％のＤＴＴを含む溶液中で粉砕し、そして、抽出タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した。約５０ｋＤａの特徴的なタンパク質バンドが存在しないことは、Ｃ－ｈｏｒタンパク質が存在しないことを示している。Ｔ１、Ｔ２及びＴ３と命名された３つのホルデインの三重ヌルは、約３００のＦ２種子から同定された。メンデル遺伝学による、３つの劣性変異の組み合わせによる、各々のホモ接合型の予想頻度は１／６４であり、Ｈｏｒ２（Ｂ－ホルデイン）、及び、Ｈｏｒ３（Ｄ－ホルデイン）の座位は、容易に組み換えが起こるように、染色体１Ｈ上で十分に分離されていることが推定された。

【0250】

Ｔ１、Ｔ２及びＴ３と命名された３つの変異体（Ｈｏｒ２－ｌｙｓ３ａ－Ｈｏｒ２）のそれぞれについて、ホモ接合型の３つの植物を維持し、単粒系統法で３世代まで繁殖させ、各世代で最も重い１２の種を選択した。これらの系統からのＦ３種子の平均重量は、Ｔ１：３８．２ｍｇ；Ｔ２：３７．０ｍｇ；Ｔ３：３９ｍｇであった。系統当たりの種子収量（２０穂当たりの種子グラム）、及び、植物の高さを測定した。穂先に穀粒が十分に満ちていない植物は廃棄した。Ｔ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５の２つのＦ４系統が選択され、これらを更に、圃場で試用した。この内、Ｔ２－４－８が、わずかに良好な穀物収量を有したことからこれを選択し、オオムギＵＬＧ３．０と命名した。

【0251】

穀粒サイズ及び形状及び穀粒の収量指標に関連する、オオムギ粒用の重要な表現型は、２．８、２．５、２．２及び２．０ｍｍの網目サイズ、特に、２．８ｍｍのふるいを通過しない粒子の割合である。小さい穀粒は、野生型オオムギと比べて加工及び麦芽化においてあまり効率的ではない。この表現型は、「２．８ｍｍのスクリーニング」と呼ばれ、特定のふるいを通過しない穀粒の割合として示される。Ｓｌｏｏｐなどの野生型品種の場合、２．８ｍｍスクリーニングのパラメータは、一般的に、９５～９８％である。Ｈｏｒ２－ｌｙｓ３ａなどのホルデイン欠失系統の場合、二重変異体（ＵＬＧ２．０）の２．８ｍｍスクリーニングのパラメータは、概して約５３％であった。時には、生長条件、例えば、干ばつに依存して、それは１０％未満であり、粒子の大部分は、２．５ｍｍのふるいを通過することができた。ＵＬＧ３．０については、２．８ｍｍのスクリーニングパラメータは、約５４％であった。圃場で生長した穀粒の平均重量（ｍｇ）は、Ｓｌｏｏｐ：５３．６±０．９；ＵＬＧ２．０：３３．５±０．４；ＵＬＧ３．０：３９．１±０．３であった。従って、ＵＬＧ３．０は、ＵＬＧ２．０が野生型Ｓｌｏｏｐ（１００％）に対して５０％の収量であったのに比べ、６９％の穀粒収量をもたらした。従って、ＵＬＧ３．０は、ＵＬＧ２．０系統に比べて、穀粒収量が大幅に向上した。しかし、２．８ｍｍのスクリーニングパラメータは、オオムギＵＬＧ３．０においても問題が残ったままであった。

【実施例8】

【0252】

収量の増加を伴う更なる三重のヌルオオムギ変異体の生成：
ＵＬＧ３．０オオムギ系統は、ＵＬＧ２．０と比較して、収量が増加しているものの、より一層増加することが望まれた。したがって、ＵＬＧ３．０の植物を、野生型のＳｌｏｏｐ品種、Ｂａｕｄｉｎ及びＹａｇａｎ、並びに、各々の親の生殖質を５０％含むことが同定されたホルデイン三重ヌル系統の植物と交配した。これらのホルデイン三重ヌル系統は相互交配させ、また、野生型の品種Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ及びＣｏｍｍａｎｄｅｒと交配させた。全ての３つのヌル変異を含む子孫は、Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ及びＣｏｍｍａｎｄｅｒ、並びに、単粒系統法により作製された複数のホモ接合系統の植物と２回、戻し交配した。作製された多くの系統の内、生じた１つの系統を選択し、オオムギＵＬＧ３．１と命名した。

【0253】

Ｓｌｏｏｐ、Ｙａｇａｎ、及び、Ｂａｕｄｉｎ種の植物との相互交配から、各々の三重ヌル変異を含む植物の始まりとなる３つの親品種の遺伝的背景を組み合わせるために、第二ラウンドの相互交配を実施した。相互交配したＦ１植物から得られる全ての子孫が、３つの変異の全てを含むことが予想された。列当たり約１０００個のＦ２種子を、圃場列に播種した。相対的に丈の短いＦ２植物を選択し、そして、大きな穀粒を持ち、十分に満たされた穂先を有するＦ３種を作成した。初期及び後期成熟植物の両方を選択した。圃場で発育したそれ以降の世代において、更に、相対的に高い穀物アミラーゼ、相対的に高い収穫指数及び穂先長、最適な高さ（半矮性）、倒伏の欠如、及びうどんこ病に対する耐性を示した系統が選択された。１５００ファミリーから、最良であった約２０を選択した。最良２０系統におけるデータは表５に提示した。個々の種子重量（穀粒重量）はＵＬＧ３．０の４１．８ｍｇ／種を超えて改善されており、そのうち最大のものはＰ１２０７２－２の系統で観察された４８．４ｍｇ／種であった。この種子サイズの改良は、収穫指数の増加に伴うものであり、種形成効率の測定では４０％を超えており、最大のものは系統Ｐ１２１２４－１の４６．５％であった。最も重要なことは、２．８ｍｍスクリーニングにおける割合が、ＵＬＧ３．０が５３．５％であったのに対して８０％を超えており、系統Ｐ１２１４０－１においては９７．３％に改良していた。

【0254】

Ｈｏｒ２－ｌｙｓ３ａ－Ｈｏｒ３の３つのヌルアリルについてホモ接合型である植物を作成するために、一つの選択された系統が単粒系統法により固定され、ＵＬＧ３．２と命名された。ＵＬＧ３．２の２．８ｍｍスクリーニングパラメータは、圃場で生育させた幾つかの繰り返し試験において、８０～９３％の範囲であり、Ｓｌｏｏｐに対して約９７％；Ｈｉｎｄｍａｒｓｈに対して８５％；Ｏｘｆｏｒｄ野生種に対して９６％；及びＭａｒａｔｉｍｅに対して９８％であった。

【0255】

種の平均重量及び肉厚は、ＵＬＧ２．０：３３．４ｍｇ、２．４ｍｍ；ＵＬＧ３．０：４１．８ｍｇ、２．５ｍｍ；ＵＬＧ３．２：４７．２ｍｇ、２．８ｍｍであった。

【0256】

【表5】

【実施例9】

【0257】

三重ヌルオオムギ変異体におけるホルデインの測定：
多重反応モニタリングによる質量分析（ＭＲＭ ＭＳ）法を用いたによるＵＬＧ３．０粉のホルデイン含量の定量：
ホルデイン含有量を正確に測定するために、ＭＲＭ ＭＳアッセイを以下の通りに使用した。穀粒または半粒は、全粒粉のように、全穀粉と同じ組成を有する粒粉を製造するために粉砕した。２０ｍｇの粉サンプルからのプロラミンポリペプチドは、５５％（ｖ／ｖ）のイソプロパノール及び２％（ｗ／ｖ）のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する溶液２００μＬを用いて抽出した。５ｍｇの粒粉に相当する一定量の抽出物は、１０ｋＤａのＭＷを除外するフィルターユニットを用いて、３回遠心分離することにより、８Ｍ尿素／０．１Ｍのトリス塩酸塩（ｐＨ８．５）に緩衝液に置換した。ポリペプチド中のシステインは、室温で１時間、５０ｍＭのヨードアセトアミド１００μＬを加えて、インキュベートすることによりアルキル化した。緩衝液は、１００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ８．５）で置換し、ポリペプチドは、１０μＬ（２０μｇ）のトリプシンで１８時間、３７℃で分解した。ペプチドは１０ｋＤａのフィルターを通して濾過することにより回収し、乾燥し、３０μＬの１％（ｖ／ｖ）ギ酸で再構成した。ペプチドは、０．４ｍｌ／分の流速で１０分かけて溶媒Ｂを５％から４０％へ勾配させながら、Ｐｈｅｎｏｍｅｍｅｎｅｘカラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ、１．７μｍ、Ｃ１８、１００×２．１ｍｍ）を装着した島津Ｎｅｘｅｒａ ＨＰＬＣの液体クロマトグラフィーにより分離した。溶媒Ａは、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸水溶液であり、溶媒Ｂは、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む９０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルであった。ＨＰＬＣ溶出液は質量分析計に直接送り、ＭＲＭ分析はホルデイン由来のトリプシンペプチドを標的とする４０００ＱＴＲＡＰ質量分析計で実施した。データは、Ａｎａｌｙｓｔ ｖ１．５のソフトウェア及びＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ ｖ２．０．２ソフトウェアを使い、ピーク面積積分値を用いて解析した。

【0258】

図５は、選択されたＢ－ホルデイン、Ｃ－ホルデイン、Ｄ－ホルデイン、γ－３－ホルデイン（Ｇ３）、及び、γ－１－ホルデイン（Ｇ１）で得られたデータを示す。図５は、対照群のオオムギ（野生型、品種Ｓｌｏｏｐ）、ホルデイン単一ヌル系統のＲｉｓ_φ５６、Ｒｉｓ_φ１５０８、及び、Ｅｔｈｉｏｐｉａ Ｒ１１８由来のＤ－ヌル系統、ホルデイン二重ヌル系統ＵＬＧ２．０、及び、三重ヌル系統Ｔ２－４－８、及び、Ｔ２－６－Ａ５（全系統）からの半穀粒の４回繰り返し測定で、Ｓｌｏｏｐ（１００％）に対して補正した各ＭＲＭ遷移のピーク面積の平均値を示す。１つの、各ホルデインファミリーを代表する基本型ペプチドが選択され、即ち、Ｂ－ホルデインに対してはＴＬＰＴＭＣＳＶＮＶＰＬＹＲ（配列番号：４８）；Ｄ－ホルデインに対してはＤＶＳＰＥＣＲＰＶＡＬＳＱＶＶＲ（配列番号：４９）；Ｃ－ホルデインに対してはＬＰＱＫＰＦＰＶＱＱＰＦ（配列番号：５０）；Ｇ３－ホルデインに対してはＱＱＣＣＱＱＬＡＮＩＮＥＱＳＲ（配列番号：５０）；及び、Ｇ１－ホルデインに対してはＣＴＡＩＤＳＩＶＨＡＩＦＭＱＱＧＲ（配列番号：５１）であった。これらのペプチドは、野生型のオオムギで頻繁に、そして比較的大量に発現することに基づき選択された。

【0259】

系統Ｔ２－４－８、及び、第二の三重ヌル系統Ｔ２－６－Ａ５からの三重ヌルのＵＬＧ３．０穀粒は、検出可能なレベルのＢ－、Ｃ－、Ｄ－、または、最も驚くべきことに、γ－１－ホルデインを保持していないことが分かった。即ち、野生型と比べて観測されたのは１％未満であった。同様に、γ－２－ホルデインは、ＵＬＧ３．０穀粒で検出されなかった。ＳｌｏｏｐにおけるＧ３－ホルデインと比較して、約２０％のレベルで存在する、比較的低レベルのγ－３－ホルデイン（全系統）があった。γ－３－ホルデインは、微量なホルデインであり；Ｓｌｏｏｐのγ－３－ホルデイン含量は、全ホルデイン含量の１％よりはるかに少ない。単一ヌルの穀粒及び二重ヌルの穀粒は、特定のホルデインを蓄積しなかった。例えば、Ｒｉｓ_φ５６及びＵＬＧ２．０は、Ｂ－ホルデインを予想通り蓄積しなかった。Ｒｉｓ_φ１５０８及びＵＬＧ２．０は、Ｃ－ホルデインを予想通り蓄積しなかった。Ｄ－ヌル穀粒は、野生型レベルのＢ－及びＣ－ホルデインを示したが、Ｄ－ホルデインは蓄積しなかった。

【0260】

いくつかの異なるペプチド配列、特に、Ｂ－ホルデイン変異体においては、終止コドンの位置より十分Ｃ末端方向にあるため、野生型のＤ－ホルデインタンパク質にのみ存在するＤ－ホルデインペプチド：ＡＱＱＬＡＡＱＬＰＡＭＣＲ（配列番号：８５）に対して分析を繰り返したとき、類似した結果が得られた（図６）。アベニン様Ａタンパク質も、また、粒粉には存在しなかった。

【0261】

ホルデイン三重ヌルであるＴ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５から得られた穀粒は、検出可能なレベルのＢ－、Ｃ－、Ｄ－ホルデイン、そして選択したγ－１（Ｐ１７９９０）、及び、γ－２ホルデインを含んでいないことは明確であった。γ－１、及び、γ－２ホルデインで見られた結果は、それに対応する遺伝子を完全にサイレンシングさせる変異のいずれも三重ヌル変異体の系統に含まれていることが知られていなかったため、発明者にとって最も意外なものであった。

【0262】

ＭＲＭにより決定されるＵＬＧ３．０穀粒の低いホルデイン含量を、二次元ゲル電気泳動法により以下の通り確認した。ホルデインヌル系統Ｔ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５、並びに、対照群のオオムギ品種Ｒｉｓ_φ５６のそれぞれに由来する粉抽出物からの５０μｇのアルコール可溶性タンパク質の各々は、１μｇの指標となるポリペプチド標準品のＢＳＡ、大豆トリプシン阻害剤及びウマミオグロビンが添加されているが、Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）に基づき、０．００６％（ｗ／ｖ）のコロイダルクーマシー（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）Ｇ２５０で染色し、標準的な２０、３０、４０、５０、６０、８０ｋＤａのタンパク質と比較した（Ｍ；Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。スポットは、２Ｄゲルから切り出し、対照群のＲｉｓ_φ５６に由来する以下のタンパク質が、トリプシンペプチドの質量分析により同定された：Ｃ－ホルデイン、γ－２－ホルデイン（γ２）、γ－３－ホルデイン（γ３）、及びγ－１－ホルデイン（γ１）であった。ＵＬＧ３．０穀粒からゲル中のγ－１－、γ－２、及び、γ－３のホルデインのスポットの予測位置は、Ｒｉｓ_φ５６ゲルと比較して同定された。γ－３－ホルデインのみがＵＬＧ３．０の粒粉で観察されたが、他の３つのポリペプチドは、検出されなかった。各々のスポットのγ－３－ホルデイン濃度は、以下の３つの方法で測定され：１）５０μｇのタンパク質からのすべてのスポット容積の割合として、ＵＬＧ３．０のγ３の含量平均は、１３．５±１．６ｐｐｍであった；２）１μｇのＢＳＡのスポット強度に対するＵＬＧ３．０の平均γ３含量は、１０．９±１．３ｐｐｍであった；３）１μｇのＢＳＡのスポット容積（強度×面積）に対して、ＵＬＧ３．０の平均γ３含量は、３．４±０．４１ｐｐｍであった。

【0263】

ＭＲＭにより定量されるＵＬＧ３．０穀粒の低ホルデイン含量は、更に、以下の通り、ＥＬＩＳＡ法により確認した。２０ｍｇの全粒粉サンプルまたは穀粒の胚乳の半分が粉砕され、そして、振動ミル（Ｒｅｔｓｃｈ Ｇｍｂｈ，Ｒｈｅｉｎｉｓｃｈｅ）を用いて、９６ウエルで、３０回／秒で、３×３０秒、振とうすることにより、０．５ｍｇのＭｉｌｌｉＱ水で３回洗浄し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した。粒粉中のプロラミンは、対照群の系統Ｓｌｏｏｐ、Ｒｉｓ_φ５６、Ｒｉｓ_φ１５０８に対して、及び、ＵＬＧ２．０、ホルデイン三重ヌル系統Ｔ１、Ｔ２、及びＴ３、並びに、Ｔ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５に由来する単粒系統法の子孫に対して、０．５ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール／１％（ｗ／ｖ）ＤＴＴより成るアルコール溶液に抽出された。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）に記載の通りに測定し、４０ｎｇ（三重ヌルの穀粒に対して１９００ｎｇ）のアルコール可溶性タンパク質を、初期抽出物から残留する任意のＤＴＴを消失するために加えられた、一定で過剰の０．２ｍＭのＨ_２Ｏ_２を有するＥＬＩＳＡシステム希釈液を含む溶液で希釈した。希釈されたタンパク質溶液は、製造業者の指示書に基づき、ＥＬＩＳＡプレートウエル（ＥＬＩＳＡＳｙｓｔｅｍｓ社、Ｗｉｎｄｓｏｒ、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、 ＡＵＳＴＲＡＬＩＡ）に加え、洗浄し、３７℃で１５分間発色させた。対照群の抽出物中のホルデイン量は、Ｓｌｏｏｐの標準に対して、０～５０ｎｇの全ホルデインと測定された。三重ヌルのホルデイン含量は、ＵＬＧ２．０の標準に対して０～５ｎｇの全ホルデインと測定された。Ｓｌｏｏｐ及びＵＬＧ２．０のホルデインは、Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１０）に記載の通りに調製した。

【0264】

ＥＬＩＳＡ法による二重ヌル粒粉の全ホルデイン含量は、野生型品種Ｓｌｏｏｐに対して２．９％である一方で、２つの選択されたホルデイン三重ヌル系統のＴ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５の残留ホルデイン含量は、３．９及び１．５μｇ／ｇ（百万分の１、ｐｐｍ：表６）であり、両者は、グルテンフリー食品中のグルテン濃度が２０ｐｐｍであるＦＳＡＮＺ規制レベルより非常に低く、野生種Ｓｌｏｏｐ穀粒中のレベルより１５，０００倍低かった。

【0265】

多重反応モニタリングによる質量分析（ＭＲＭ ＭＳ）でのＵＬＧ３．０ビールのホルデイン含量の定量：
オオムギのＵＬＧ３．０の穀粒から醸造されたビールのホルデイン含量を、若干の変更を加えた実施例３及び４に記載の通りの方法を用いてＭＲＭ ＭＳにより測定し、特定のペプチド配列を検出した。データは、図７に示した。アッセイでは、アベニン様Ａタンパク質、Ｂ１－、及び、Ｂ３－ホルデイン、Ｄ－ホルデインの欠失、及び、γ－１－ホルデイン、及び、γ－３－ホルデインの低下を示し、質量分析における背景ノイズより高く検出されなかった（図７）。アッセイは、また、Ｃ－ホルデインが存在しないことを示した。

【0266】

【表6】

【0267】

ＭＲＭ ＭＳによるＵＬＧ３．１及びＵＬＧ３．２粒粉のホルデイン含量の測定：
ＵＬＧ３．１系統、及び、ＵＬＧ３用の１０候補系統の穀粒から粉砕された粒粉のホルデイン含量は、ＵＬＧ３．０穀粒で記載された通り、ＭＲＭ ＭＳにより定量した。半穀粒は、粒粉へ粉砕され、２０ｍｇの粒粉（ｎ＝４回繰り返し測定）からプロラミンタンパク質が抽出され、アルキル化され、トリプシン分解され、上記の通り、ＭＲＭ ＭＳにより分析した。ＵＬＧ３、１、及び、０４３－２～１４８－２と命名された二重の親系統の相互交配から作製された系統について、各々の半穀粒から得られた各々のペプチドの平均ピーク面積（３つのＭＲＭ遷移の合計）を示すデータを図８にプロットした。これらは、対照群のオオムギ（野生タイプの品種：Ｓｌｏｏｐ、Ｂａｕｄｉｎ、Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ、及び、Ｈｉｎｄｍａｒｓｈ）、及び、三重ヌル系統Ｔ２－４－８と比較しながらプロットした。表示されたピークエリアは各々のホルデインファミリーを代表する、選択された基本型のペプチドについてであり、そのＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号、及び以下のアミノ酸配列は以下の通りである：
Ａ－Ｆ２ＥＧＤ５＿ＱＱＣＣＱＰＬＡＱＩＳＥＱＡＲ（配列番号：５２；Ｆ２ＥＧＤ５から；アベニン様Ａタンパク質の中心）；
Ｂ１－Ｑ４００２０＿ＶＦＬＱＱＱＣＳＰＶＲ（配列番号：５３；Ｂ１－ホルデインのＮ末端に近接する）；
Ｂ３－Ｑ４Ｇ３Ｓ１＿ＶＦＬＱＱＱＣＳＰＶＰＭＰＱＲ（配列番号：５４）；
Ｃ－Ｑ４００５５＿ＱＬＮＰＳＨＱＥＬＱＳＰＱＱＰＦＬＫ（配列番号：５５；Ｃ－ホルデインのＮ末端に近接する）；
Ｄ－Ｑ８４ＬＥ９＿ＥＬＱＥＳＳＬＥＡＣＲ（配列番号：５６；Ｑ８４ＬＥ９から；Ｙ１５０での終止コドンの前）；
Ｇ１－Ｐ１７９９０＿ＡＰＦＶＧＶＶＴＧＶＧＧＱ（配列番号：５７；Ｐ１７９９０から；Ｃ－末端ペプチド）；及び
Ｇ３－Ｐ８０１９８＿ＱＱＣＣＱＱＬＡＮＩＮＥＱＳＲ（配列番号：５８； Ｐ８０１９８から；γ３－ホルデインの中心）；
のピーク面積を示した。

【0268】

図８に示した二つの親の相互交配穀におけるＤ－ホルデインのレベルは、ＵＬＧ２．０、並びに、ホルデイン三重ヌル系統であるＴ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５からの穀粒のそれと類似しており、ほとんどゼロであった。Ｄ－ホルデインがＴ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５系統からの穀粒で検出されないことは、２Ｄ－ＰＡＧＥによる観察で確認された。二つの親の相互交配穀粒におけるγ－１－ホルデインレベルも、また、ＵＬＧ２．０、並びに、ホルデイン三重ヌル系統であるＴ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５のそれと類似していた。幾つかのＵＬＧ３．２系統で、ペプチド：ＡＰＦＶＧＶＶＴＧＶＧＧＱ（配列番号：５９）のレベルはほとんどゼロであった。γ－１－ホルデインは、Ｔ２－４－８、及び、Ｔ２－６－Ａ５系統では２Ｄ－ＰＡＧＥにより検出されなかった。二つの親の相互交配穀粒におけるγ－３－ホルデインのレベルも、ＵＬＧ２．０、及び、非常に低いレベルである系統１２４．１（ＵＬＧ３．２）を除いたホルデイン三重ヌル系統のそれと類似していた。γ－３－ホルデインもまた、Ｔ２－４－８及びＴ２－６－Ａ５系統では２Ｄ－ＰＡＧＥにより低下したレベルで検出された。

【0269】

興味深いことに、たとえＨｏｒ３変異体（Ｄ－ホルデイン）が存在していなくても、ＵＬＧ２．０においてＨｏｒ２及びｌｙｓ３ａ変異の相乗効果による、Ｄ－ホルデイン含量の低下が見られた。同様に、３つの変異（Ｈｏｒ２－ｌｙｓ３ａ－Ｈｏｒ３）すべての存在により、上記のペプチドで言及されたような、相乗効果によるγ－１－、及び、γ－２－ホルデインの蓄積の低下がみられた。

【実施例10】

【0270】

殻無し三重ヌルオオムギ変異体の生成：
ＵＬＧ３．０、ＵＬＧ３．１及びＵＬＧ３．２の選択で用いたオオムギの穀粒は、全て殻付きであり、それは麦芽汁の濾過（麦芽汁濾過）の最終段階の間、濾過床を形成する使用済み殻として醸造業に有益である。しかし、オオオムギ粒の殻は、多量の小さなシリカスパイクを有するため、ヒトが消費する前に殻を精白により除去する必要がある。別のアプローチは、遺伝的手段により殻のない穀粒を生成することである。したがって、ＵＬＧ３．０の植物を、Ｂａｒｌｅｙｍａｘ ＩＩ（ＷＯ２０１１／０１１８３３）と命名された殻無しオオムギ品種と交配し、ＳＳＩＩａ遺伝子が野生型である、殻無しの、ホルデインＢ、Ｃ、Ｄ－三重ヌル変異体（Ｈｏｒ２－ｌｙｓ３ａ－Ｈｏｒ３）植物を選択した。

【0271】

幾つかのＦ６殻無しホルデイン三重ヌルの選択物（例えば、Ａ７＿１）は、３回の単粒系統法を行った後では、粒粉中に含まれる全ホルデインは０．１ｐｐｍ未満であった。

【実施例11】

【0272】

オオムギの突然変異誘発：
オオムギで選択された遺伝子の突然変異体を単離するために、Ｃａｌｄｗｅｌｌ（２００４）により記載されたように、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）変異誘発を実施した。ＵＬＧ３．０の約４５，０００（１．５ｋｇ）穀粒を、下記の通り、変異誘発をさせた。穀粒は、通気しながら、室温で４時間、蒸留水２．５リットルで吸収させた。吸収期間中、水は１時間毎に交換した。種子はその後、２．５Ｌの新たに調製した３０ｍＭＥＭＳを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）の中で、通気しながら室温で１６時間インキュベートした。その後、室温で１０分間、１００ｍＭのチオ硫酸ナトリウム２．５Ｌで種子を洗浄した。チオ硫酸塩での洗浄を繰り返した後、穀粒を通気しながら、室温で３０分間、２×２Ｌの蒸留水で完全に洗浄した。種子は、翌日の圃場での植え付けの前に、空気流の元で吸収性ろ紙上で一晩、空気乾燥した。Ｍ２種子の大部分を収穫して集め、変異体を分析した。この処置後の突然変異の頻度は、１０００種子当たり、目的の遺伝子における変異体は約１個であった。γ－３ホルデイン特異的モノクローナル抗体を使用して、半穀粒上のドットブロットにより種子のγ－３－ホルデインの発現喪失をスクリーニングすることにより、シグナルを示さない４０粒子が、数万のＭ２穀粒から同定された。これらの穀粒でγ－３ホルデインが欠失していることは、モノクロナール抗体を用いたウエスタンブロットにより、及び、特定のペプチド（配列番号：５８）についての質量分析により確認した。これらの穀粒におけるγ－３－ホルデインの欠失が確認された。各々の陰性であった穀粒からの胚を含む半穀粒は、発芽を可能にする培地上に植え付けた。半粒のほとんどの胚が発芽しなかったが、いくつかは発芽した。

【実施例12】

【0273】

低ホルデインのオオムギからのビールの製造：
醸造試験は、標準的な方法によりＵＬＧ２．０穀粒から生成された麦芽を用いて実施し、対照群の野生型のオオムギ品種Ｇａｉｒｄｎｅｒと比較した。Ｇａｉｒｄｎｅｒは、オーストラリアの穀物製造地域全体で広く栽培されている半矮性の二条性のオオムギで、中期から後期に成熟させる高収率の品種である。それは、有利な条件下で良好な粒子サイズを生成し、適度な抽出レベル、発酵及び糖化力を生成し、その結果、「標準的な」業界での醸造評価試験における対照群としての使用に最適であることを表す。ＵＬＧ２．０から生成した麦芽は、Ｇａｉｒｄｎｅｒ麦芽（５．０％）と比較して、５．７％の若干高い水分量を有していたが、外観はＧａｉｒｄｎｅｒ麦芽と著しく異なり、穀粒は、へこみ、しわが寄っていた。ＵＬＧ２．０麦芽の糖化力（ＤＰ）は、Ｇａｉｒｄｎｅｒの２９９ＷＫのＤＰよりもはるかに低い５４ＷＫであった。麦芽オオムギは、一般に、少なくとも２５０ＷＫのＤＰを有する。しかし、ＵＬＧ２．０の麦芽は、２０分のマッシング時間の後、デンプンは陰性であり、そして、１．７°プラトーのＬＧ結果を達成した。

【0274】

麦芽は、２つのロールミルを２回通過させることで粉砕し、穀粒の満足的な粗砕を達成した。麦芽は、その粒子形態に基づき、６つのローラーミルでより複雑に粉砕するのが最適であった。また、マッシュフィルタと連動したハンマーミルは、麦芽汁分離のための濾過桶よりも使用できる。粉砕された製品は、余分な散布液を添加して、６５℃の初期温度で２０分間、その後７４℃で５分間、標準的な方法により磨り潰した。全体的に、ＵＬＧ２．０の麦芽のしなびた形態は、通常の麦芽と比較して、満足に粉砕し、磨り潰すことが困難になる。磨り潰し製品は、その後、濾過し、そこで、再び、ＵＬＧ２．０のしなびたモルホロジーが、困難を引き起こした。濾過床は、停止するのに必要な排水、及び、再度集めた濾過床をチャネル化するには離れていた。潜在的な抽出物のかなりの量は、目標が１４°プラトーを達成したとき、１０．９６°及び、１１．１２°のプラトーのすべてで、ケトル値を達成し、非効率的な粉砕に起因して、濾過処理中に失われた。ｐＨ、ＥＢＣ色、及び、β－グルカンのレベルは、許容できるものであった。粉砕の欠乏は、また、濾材として機能するのに殻床の効率的な形成がなかったことを意味し、より低い予想抽出物に貢献した。麦芽汁の透明性は、３０Ｌの流失で、許容可能まで改良したが、流出による透明性は、床形成が乏しいことに起因して、最初は非常に曇っていた。

【0275】

生成した麦芽汁は、１２０時間、１８．５℃で、酵母株サッカロミセスウバルムＡ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｕｖａｒｕｍ Ａ）で発酵させた。発酵プロファイルは正常であったが、ジアセチルの有意なレベルは、発酵重力が終わりに達した後、延長されたジアセチル残存相が与えられた後でさえも残存するが、発酵の開始時に、延長された誘導期には存在しなかった。ビールが、酵母を、再吸収し、及び、ジアセチルを代謝することを可能にするために、０℃にビールを冷却する前に、より高い発酵温度で放置されるところで、ジアセチル残渣があった。一般的に、発酵の終了時の２４時間は、酵母の時間がこの製品を破壊することを可能にするために必要とされる。これは、両方のＵＬＧ２．０の試作ビールでは発生しなかった。異性化ホップ抽出物は、３０ｍｇ／Ｌで添加し、リカーは、シリカヒドロゲルを添加して澄明にした。完成した明るいビールは、対照群の醸造より物理的安定性が低かった。初期の冷却したヘイズは、高いと考えられ、強制した冷却ヘイズは、通常の仕様外であった。しかし、冷却ヘイズは、微粒子を形成しなかった。

【0276】

完成したビールは、訓練された醸造パネリストによる官能分析を行ったところ、粉砕及び濾過工程での困難性にも関わらず、麦芽の醸造パフォーマンスに関連する事項に与えられた結果は、驚くほど良好であった。ＤＭＳ（硫化ジメチル）が、優勢な味であったが、しかし、これは不快と見なされていなかった。ＤＭＳの存在は、しばしば、オーストラリアのビール風味の障害と考えられているが、一般的に、ヨーロッパに、特に、ドイツビールによく受け入れらている。醸造に関するコメントは、ＵＬＧ２．０ビールが対照群のビールにあまりにも似ていないことであり、そして、それらはビールとしてまずまずなレべルであり、ドイツビールを連想させるものであった。明白な「粗くて」または「穀物」タイプの風味、及び、「グルテンフリー」として販売されている市販のビールの代表であり得るＵＬＧ２．０ビールにザラザラ感なく、渋味もなかった。全体的な風味プロファイルは、許容され、合理的であった。

【0277】

ビールは、ＵＬＧ２．０と同様の方法によりＵＬＧ３．０のオオムギ粒から作られ、ＵＬＧ３．２のオオムギ粒からも作られた。主として、製粒工程は、粒の皴が少なくなったことに起因して改善されたので、ＵＬＧ３．０粒の麦芽製造は、ＵＬＧ３．０粒に比べて改善された。ＵＬＧ３．０から作られたビールは、許容可能かつ合理的な味の良好な品質であった。ＵＬＧ３．２からの穀物の改良された粒子形態（サイズ及び形状）により、醸造工程の粉砕及び濾過が容易となり、１ｐｐｍ未満の全ホルデインを有するビールが提供された。

【実施例13】

【0278】

ＵＬＧオオムギを使用した食品の製造：
２つの小スケール（１０グラム）のパンを、ＵＬＧ３．０及びＵＬＧ３．２オオムギ系統を用いて焼き上げた。小スケールのパンは、テストを目的として焼き上げたが、この方法は商業的な量へ容易にスケールアップすることができる。１つのパンは、上述したように粉砕し、粉成分として１００％のＵＬＧオオムギ粉で作られたが、一方、第二のパンは、粉の成分としてコメ粉などの粉３０％と市販の非グルテン粉７０％のブレンドで作られた。粉（１３．０２ｇ）及び他の成分は、３５ｇのミキソグラフの中で、生地形成時間が最大になるまで混合した。それぞれの場合に、粉１３．０２ｇを基準にして使用しれたレシピは、粉：１００％、塩：２％、乾燥酵母：１．５％、植物油：２％及び発酵強化剤：１．５％である。水の添加量は、ミクロＺアーム吸水値に基づいており、全ての配合のために調整されている。成形、発酵は、４０℃、８５％の室内湿度で、二段階発酵工程で行われる。焼成は、１９０℃で１４分間、ＲＯＴＥＬのオーブン中で行われた。

【0279】

パンは、２０ｐｐｍ未満のグルテン含有量を含み、ＣＤを患う対象者によるヒトの消費に適している。

【0280】

広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施例に示すように、多数の変形、及び／または、改変が本発明に対して実施されてもよいことは、当業者により理解されるであろう。従って、本発明の実施形態は、あらゆる点に関して、例示として考慮され、かつ、限定するものではないことを考慮されるべきである。

【0281】

本出願は、２０１３年６月１３日に出願されたＡＵ２０１３９０２１４０、及び、２０１３年７月１１日に出願されたＡＵ２０１３９０２５６５に優先権を主張し、両方の内容は、参照することにより、本明細書に導入したものとする。

【0282】

本明細書で議論された、及び／または、参照された全ての刊行物は、その全体を本明細書に組み込まれている。

【0283】

本明細書に含まれている文書、行動、物質、装置、物品などの任意の議論は、本発明のための文脈を提供する目的のためだけである。これらの事項のいずれかまたは全ては、従来技術の基礎の一部を形成するとして、または、本発明に関連する分野における共通で一般的な知識は、本出願の各請求項の優先日前に存在していたことを承認されるものと解釈すべきではない。

【0284】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【配列表】

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