特許 7291973 豚流行性下痢ウイルスワクチン組成物およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-08

(45)【発行日】2023-06-16

(54)【発明の名称】豚流行性下痢ウイルスワクチン組成物およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/215 20060101AFI20230609BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230609BHJP

   A23K 20/147 20160101ALI20230609BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230609BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20230609BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20230609BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20230609BHJP

   C07K 14/17 20060101ALI20230609BHJP

【ＦＩ】

A61K39/215

A61P31/14

A23K20/147

C12N15/63 Z

A01H5/00 A

C12P21/02 C

C12N15/50 ZNA

C07K14/17

【請求項の数】 13

(21)【出願番号】P 2021551520

(86)(22)【出願日】2020-04-13

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-04-20

(86)【国際出願番号】 KR2020004954

(87)【国際公開番号】W WO2020213898

(87)【国際公開日】2020-10-22

【審査請求日】2021-08-30

(31)【優先権主張番号】10-2019-0044008

(32)【優先日】2019-04-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】519142114

【氏名又は名称】バイオアプリケーションズ インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ウン－ジュ

(72)【発明者】

【氏名】イ、ヨン ジク

【審査官】川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】韓国公開特許第１０－２００７－００４５８１７（ＫＲ，Ａ）

【文献】韓国特許第１０－１５７０４５３（ＫＲ，Ｂ１）

【文献】国際公開第２０１８／１３５８６０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／２０８０９９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１８／１４０７６６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１７－５２４３３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Porcine epidemic diarrhea virus strain K13JA12-1 spike protein gene, compkete cds，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ539151.1

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる豚流行性下痢ウイルスタンパク質を有効成分として含む、豚流行性下痢ウイルスワクチン組成物。

【請求項2】

配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる豚流行性下痢ウイルスタンパク質を有効成分として含む、豚流行性下痢の予防または治療用飼料組成物。

【請求項3】

請求項１に記載のワクチン組成物をヒトを除いた動物に投与することによって、豚流行性下痢を予防または治療する方法。

【請求項4】

配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列を含む、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる豚流行性下痢ウイルスタンパク質発現用ベクター。

【請求項5】

前記ベクターは、図１に記載された構造を有することを特徴とする請求項４に記載のベクター。

【請求項6】

前記ベクターは、小胞体信号ペプチド、Ｆｃ断片およびＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）よりなる群から選ばれた１つ以上をコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項５に記載のベクター。

【請求項7】

前記小胞体信号ペプチドは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＳＥＫＤＥＬ、ＫＨＥＤＬ、ＫＥＥＬ、およびＳＥＨＥＤＬで表されるペプチド配列よりなる群から選ばれた１つであることを特徴とする請求項６に記載のベクター。

【請求項8】

請求項４～７のいずれか一項に記載のベクターで形質転換された、形質転換体。

【請求項9】

前記形質転換体は、植物であることを特徴とする請求項８に記載の形質転換体。

【請求項10】

（ａ）請求項８に記載の形質転換体を培養する段階と、
（ｂ）前記形質転換体または培養液から豚流行性下痢ウイルスタンパク質を分離および精製する段階と、を含む、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる豚流行性下痢ウイルスタンパク質の生産方法。

【請求項11】

前記段階（ｂ）の精製は、水溶性分画を使用して精製することを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質の生産方法。

【請求項12】

配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる豚流行性下痢ウイルスタンパク質を有効成分として含む組成物を用いることを含む、豚流行性下痢の予防または治療方法（ヒトを対象とするものを除く）。

【請求項13】

配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる豚流行性下痢ウイルスタンパク質の豚流行性下痢ワクチンまたは薬剤の製造のための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質を有効成分として含む豚流行性下痢ウイルスワクチン組成物などに関する。

【0002】

本出願は、２０１９年４月１６日に出願された韓国特許出願第１０－２０１９－００４４００８号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。

【背景技術】

【0003】

豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ，Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ）は、致命的であり、伝染性の高い豚の腸疾患であり、急性下痢／嘔吐および脱水を特徴とし、新生子豚で高い致死率を招く。前記疾患は、１９７１年に英国で最初報告され、ヨーロッパ全域に急速に広がっていき、１９８０年代にアジア大陸へ渡ってきたと推定される。１９７８年に初期にＣＶ７７７と命名されたコロナウイルス類似体をベルギーで原因病原体として同定したことがある。

【0004】

このようなＰＥＤを予防するために、より安全でかつ経済的であり、病気が発生した時、より迅速に対応できる戦略として、サブユニットワクチン（Ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）開発の必要性が台頭している。サブユニットワクチンは、病原性微生物を構成している抗原性が知られた構造または非構造タンパク質を組み換え微生物で（大腸菌または他の発現システム）大量生産してワクチンの抗原タンパク質として使用することをいう。

【0005】

韓国内では、一般的に弱毒化ＰＥＤ生ワクチンを使用しているが、このようなワクチンの最も大きな問題点は、弱毒化したとしても、ウイルスが生きているので、毒性が回復しすることで病原性を帯びることになるので、安全性に問題が発生することがある。また、ワクチンを開発するに際して、弱毒化する段階で動物細胞で１００回継代培養をするのに比較的長い時間が必要とされるので、変異速度が速いウイルスに対する迅速な対応が難しく、動物細胞培養を利用するので、ワクチンの開発費用も、比較的高いほうである。

【0006】

なお、このような病気を予防するためのワクチンは、タンパク質のフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）、糖化過程（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）等の問題によってバクテリアを利用せず、主に動物細胞を用いて生産されている。しかしながら、動物細胞を用いたワクチン生産方法は、大量生産のための設備拡充に大きな費用が必要とされるので、製造が容易でなく、ワクチンの価格が高価な場合が大部分である。また、動物細胞を用いて製造された不活性ウイルスワクチンは、保存が容易でないだけでなく、動物に感染可能なウイルスに汚染される可能性が高いという短所を有している。しかしながら、植物の場合には、動物細胞とは異なって、動物に感染可能なウイルスに汚染される可能性が非常に低く、耕作面積のみが確保されると、いつでも大量生産が可能なだけでなく、植物体を通じて長期保管が可能なので、安定して低コストのワクチンの生産が可能であることが期待される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、前述のような従来技術上の問題点を解決するためになされたもので、植物体を用いて効率的な生産が可能なだけでなく、高い免疫原性およびウイルス中和能を示す組み換え豚流行性下痢ウイルスタンパク質、これを含むワクチン組成物、前記タンパク質の製造方法などを提供することをその目的とする。

【0008】

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が明確に理解できる。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む豚流行性下痢ウイルスタンパク質を有効成分として含む豚流行性下痢ウイルスワクチン組成物を提供する。前記豚流行性下痢ウイルスタンパク質は、配列番号５で表されるアミノ酸配列の機能性同等物も、本発明の権利範囲に含まれ、前記機能的同等物とは、アミノ酸の付加、置換、または欠失の結果、前記アミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは、７０％以上、より好ましくは、８０％以上、最も好ましくは、９０％以上の配列相同性を有するものであり、前記配列番号５で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を示すポリペプチドを意味し、植物体を用いて安定して生産され得る豚流行性下痢ウイルスタンパク質のアミノ酸配列であれば、これらに制限されない。

【0010】

また、本発明は、前記豚流行性下痢ウイルスタンパク質を有効成分として含む豚流行性下痢の予防または治療用飼料組成物を提供する。

【0011】

また、本発明は、前記豚流行性下痢ウイルスタンパク質を個体に投与することによって豚流行性下痢を予防または治療する方法を提供する。

【0012】

また、本発明は、前記豚流行性下痢ウイルスタンパク質の豚流行性下痢の予防または治療用途を提供する。

【0013】

また、本発明は、前記豚流行性下痢ウイルスタンパク質の豚流行性下痢ワクチンまたは薬剤の製造のための用途を提供する。

【0014】

また、本発明は、配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む豚流行性下痢ウイルスタンパク質発現用ベクターを提供する。前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列である。

【0015】

本発明の一具体例において、前記ベクターは、プロモーター遺伝子および配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの順序で作動可能に順次に連結され得る。

【0016】

本発明の他の具体例において、前記ベクターは、図１に記載された構造 を有するものでありうるが、これに制限されるものではない。

【0017】

本発明のさらに他の具体例において、前記ベクターは、小胞体信号ペプチド、Ｆｃ断片およびＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）よりなる群から選ばれた１つ以上をコードする遺伝子をさらに含むものでありうるが、これらに制限されるものではない。

【0018】

本発明のさらに他の具体例において、前記小胞体信号ペプチドは、ＫＤＥＬ、ＨＤＥＬ、ＳＥＫＤＥＬ、ＫＨＥＤＬ、ＫＥＥＬ、およびＳＥＨＥＤＬで表されるペプチド配列よりなる群から選ばれた１つでありうるが、これらに制限されるものではない。

【0019】

本発明のさらに他の具体例において、前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストン プロモーター、Ｃｌｐプロモーターなどであるが、これらに制限されない。

【0020】

本発明のさらに他の具体例において、前記組み換え発現ベクターは、ＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチド、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードする遺伝子、豚の免疫グロブリンＦｃ断片をコードする遺伝子などをさらに含むことができる。

【0021】

また、本発明は、前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。

【0022】

本発明の一具体例において、前記形質転換体は、好ましくは、大腸菌、バシラス、サルモネラ、酵母などのような微生物、昆虫細胞、ヒトを含む動物細胞、マウス、ラット、犬、猿、豚、馬、牛などのような動物、アグロバクテリウムツメファシエンス、植物などであり得、より好ましくは、稲、小麦、麦、とうもろこし、豆、ジャガイモ、小豆、エンバク、およびモロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、ハクサイ、ダイコン、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ、およびニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、木花、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、およびアブラナを含む特用作物類；およびリンゴの木、梨の木、ナツメの木、桃、ブドウ、ミカン、柿、スモモ、アンズ、およびバナナを含む果樹類；およびバラ、カーネーション、菊、ユリ、およびチューリップを含む草花類などでありうるが、本発明のベクターで形質転換され得る生命体であれば、これらに制限されない。

【0023】

また、本発明は、（ａ）前記形質転換体を培養する段階と、（ｂ）前記形質転換体または培養液から豚流行性下痢ウイルスタンパク質を分離および精製する段階と、を含む豚流行性下痢ウイルスタンパク質の生産方法を提供する。前記形質転換体は、好ましくは、細胞自体、植物体、または細胞を含む培養物であり得、前記培養液は、好ましくは、細胞を培養した後、細胞を除去した培養液でありうるが、本発明の組み換え抗原を含んでいると、これに制限されない。

【0024】

本発明の一具体例において、前記段階（ｂ）の精製は、水溶性分画を使用して精製するものでありうるが、これに制限されるものではない。

【発明の効果】

【0025】

本発明の組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質は、植物体でも効果的に発現するだけでなく、高い水溶解性を有していて、分離および精製が容易であり、また、体内で抗原として作用して高い免疫原性およびウイルス中和能を示すので、多様な分野において幅広く使用可能なものと期待される。また、体内で顕著な免疫原性およびウイルス中和能を示すので、新規の豚流行性下痢ワクチン組成物として使用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明の一実施例による植物体において豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質（ＰＥＤＶ－Ｓ１）の発現のための遺伝子の配列を示す図である。

【図2】本発明の一実施例による植物体において豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質の発現をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。

【図3】本発明の一実施例による豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質の分離精製結果を示す図である。

【図4】本発明の一実施例による組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質抗原を２回投与し、免疫原性を確認した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本発明では、配列番号１で表される豚流行性下痢ウイルスタンパク質遺伝子を用いると、植物体でも高い免疫原性を有する豚流行性下痢ウイルスタンパク質を効率的に生産および分離が可能であることを確認した。したがって、本発明の豚流行性下痢ウイルスタンパク質は、安定的かつ効率的な大量生産が可能なので、低コストであり、安定した豚流行性下痢ワクチンを提供できることが期待される。

【0028】

本明細書において、「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、体内で免疫反応を起こすすべての物質を総称し、好ましくは、ウイルス、化合物質、細菌、花粉、癌細胞、エビなどまたはこれらの一部のペプチドまたはタンパク質や、体内で免疫反応を起こすことができる物質であれば、これらに制限されない。

【0029】

本明細書において、「豚流行性下痢（ＰＥＤ，ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ）ウイルス」は、コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）に属し、一本鎖ＲＮＡをゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）として有し、長さは約２８Ｋｂであり、３個の主な構成タンパク質であるｓｐｉｋｅタンパク質、膜タンパク質または外皮タンパク質、そしてヌクレオカプシドタンパク質を暗号化している。本発明において用語、「スパイク（Ｓｐｉｋｅ）タンパク質」は、ＰＥＤウイルスの主な構成タンパク質であり、目標細胞を認識し、ウイルスと細胞膜（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を融合させる生物学的に重要な機能を有している。スパイク（Ｓｐｉｋｅ）タンパク質の一部の遺伝子を弱毒化抗原決定基（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）として用いることができ、成熟過程でスパイクタンパク質は、受容体結合サブユニットＳ１と膜結合サブユニットＳ２に切断されることがある。特にＳタンパク質のＳ１ドメインは、細胞受容体に特異的な結合を媒介する受容体結合ドメイン（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ：ＲＢＤ）を含んでいる。

【0030】

本明細書において、「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」とは、生体に免疫反応を起こす抗原を含有する生物学的な製剤であり、感染症の予防のためにヒトや動物に注射したり経口投与することによって、生体に免疫を生じさせる免疫原をいう。前記動物は、ヒトまたは非ヒト動物であり、前記非ヒト動物は、豚、牛、馬、犬、ヤギ、羊などを称すが、これらに制限されない。

【0031】

本明細書において、「発現用ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、ベクター内に挿入された異種の核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現できるベクターを称するものであり、好ましくは、豚のＦｃ断片が融合した目的抗原（本発明では、豚流行性下痢ウイルスタンパク質）を発現できるように製造されたベクターを意味する。前記「ベクター」は、試験管内、生体外または生体内で宿主細胞へ塩基の導入および／または転移のための任意の媒介物をいい、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であり得、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節により複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスなど）をいう。本発明の組み換え発現ベクターは、好ましくは、ＲＮＡ重合酵素が結合する転写開始因子であるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列と転写および翻訳の終結を調節する配列、ターミネーターなどを含むことができ、より好ましくは、タンパク質の合成量を増加させるためのＭ１７の５’ＵＴＲ部位遺伝子、目的タンパク質を小胞体に移動させるためのＢｉＰ遺伝子、目的タンパク質の発現量および溶解性を増加させるＦｃ断片、タンパク質が小胞体内で安定的に維持され得るようにタンパク質の分解を最小化するための小胞体信号ペプチド（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、小胞体標的化配列と同じ意味）遺伝子、クローニングサイト（ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）等をさらに含むことができ、より好ましくは、組み換えタンパク質を容易に分離するためのタグ用遺伝子、形質転換体を選別するための抗生剤耐性遺伝子などの選別用マーカー遺伝子などをさらに含むことができる。

【0032】

本発明の「豚流行性下痢ウイルスタンパク質」は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列で表される。本発明の一実施例によれば、本発明の豚流行性下痢ウイルスタンパク質は、高い溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を有しているので、分離精製が容易であり、組み換えタンパク質の凝集が抑制されて、組み換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持するのに効果的である。

【0033】

また、本発明のタンパク質は、配列番号１で表される遺伝子塩基配列で暗号化されるものでありうる。また、前記遺伝子変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号１の塩基配列と７０％以上、より好ましくは、８０％以上、最も好ましくは、９０％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含む。

【0034】

前記「ＢｉＰ遺伝子」は、発現した組み換えタンパク質を小胞体に移動させるために使用されたＢｉＰ配列のうち一部であり、好ましくは、配列番号２の塩基配列を含む遺伝子であり、最も好ましくは、配列番号２で表される遺伝子であるが、配列番号２の塩基配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわちギャップ）を含むことができる。前記「ＢＩＰ遺伝子」は、発現組み換えタンパク質を小胞体に移動させるために使用されるものであり、発現するとき、配列の一部が切られて、一部のアミノ酸のみが残ることもできる。

【0035】

前記「小胞体信号ペプチド」（ＥＲ信号配列）は、細胞質細網上の信号認識粒子によりタンパク質が認識されることを許容して、タンパク質がＥＲ内腔内に転位されるようにするアミノ酸配列を意味する。本発明において前記小胞体信号ペプチドは、当業者に知られた植物小胞体信号ペプチドであれば、その種類およびアミノ酸配列が制限されず、例えばＵＳ２０１３０２９５０６５、ＷＯ２００９１５８７１６等の文献を参考にすることができる。本発明において前記「小胞体信号ペプチド」は、好ましくは、ＫＤＥＬ（配列番号６）、ＨＤＥＬ（配列番号７）、ＳＥＫＤＥＬ（配列番号８）、ＫＨＥＤＬ（配列番号９）、ＫＥＥＬ（配列番号１０）、ＳＥＨＥＤＬ（配列番号１１）よりなる群から選ばれたいずれか１つのポリペプチドであり得、最も好ましくは、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、配列番号７）で表示されるポリペプチドであり得、配列番号４で暗号化されるものであり得る。また、本発明の小胞体信号ペプチドは、配列番号４の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号４の塩基配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわちギャップ）を含むことができる。前記小胞体信号ペプチドの結合位置は、植物細胞内で発現または合成を目的とするタンパク質のＣ末端に追加（または連結）されることを特徴とする。

【0036】

前記「Ｆｃ断片（Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、免疫グロブリンがパパイン（ｐａｐａｉｎ）により消化されたとき、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；Ｈ ｃｈａｉｎ）部分のみがＳ－Ｓ結合で連結され、抗原結合部位を有しない部分をＦｃ断片といい、本発明のＦｃ断片は、好ましくは、豚のＦｃ断片であり、より好ましくは、配列番号３で表される豚のＦｃ断片であるが、目的タンパク質と融合したとき、目的タンパク質の発現量および溶解性を増加させるＦｃ断片であれば、これに制限されない。また、本発明のＦｃ断片は、配列番号３の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号３の塩基配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわちギャップ）を含むことができる。

【0037】

前記「クローニングサイト」とは、ベクター内で各遺伝子を連結／区分することを目的で挿入されたものを総称し、好ましくは、配列番号１２内で「ｇｇａｔｃｃｔｇ」、「ｃｃｃｃｇｇｇｃａ」で表される部分、配列番号１３の８番目～１０番目に位置する「ＲＩＬ、Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ」、７２７番目～７２９番目に位置する「ＰＲＡ、Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ」で表される部分でありうるが、これらに限定されない。

【0038】

本発明において前記ウイルスタンパク質は、好ましくはＦｃ断片と融合（ｆｕｓｉｏｎ）した形態で提供され得る。前記用語「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」は、化学的または遺伝的融合を全部含む意味であり、本発明では、好ましくは遺伝的融合を称する。前記「遺伝的融合」とは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の遺伝的発現を通じて形成された線形（ｌｉｎｅａｒ）の共有結合からなる連結（ｌｉｎｋ）を意味する。

【0039】

前記タグ用遺伝子は、一例としてＡｖｉタグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＩｇＧ－Ｆｃタグ、ＣＴＢタグ、Ｓｏｆｔａｇ １タグ、Ｓｏｆｔａｇ ３タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグなどが含まれ得、前記ＩｇＧ－Ｆｃタグは、ヒト、マウス、ウサギまたは豚に由来したものでありうる。

【0040】

前記選別用マーカー遺伝子には、一例としてグリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）またはホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子、ａａｄＡ遺伝子などが含まれ得、前記プロモーターには、一例としてｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーターなどが含まれ得、前記ターミネーターは、一例としてノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、稲アミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネーター、パセオリンターミネーター、アグロバクテリウムツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネーター、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーターなどであるが、前記例は、例示に過ぎず、これらに制限されない。

【0041】

本明細書において、前記「ベクター」は、図１に開示された構造 を有することができるが、これに制限されるものではない。

【0042】

本明細書において、前記「ベクター」は、好ましくは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む遺伝子であり、最も好ましくは、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるが、配列番号１３の配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

【0043】

また、前記アミノ酸配列は、配列番号１２で表される遺伝子配列で暗号化されるものでありうるが、これに制限されるものではない。具体的に、前記遺伝子は、配列番号１２の塩基配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。

【0044】

本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、注入されたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入して製造された生命体であり、好ましくは、本発明の組み換え発現ベクターにより形質転換された生命体であり、前記生命体は、微生物、真核細胞、昆虫、動物、植物など生命がある生物であれば、制限がなく、好ましくは、大腸菌、サルモネラ、バシラス、酵母、動物細胞、マウス、ラット、犬、猿、豚、馬、牛、アクロバクテリウムツメファシエンス、植物などであるか、これらに制限されない。

【0045】

本明細書において、「植物」は、タンパク質を大量生産できる植物であれば、制限なく使用できるが、より具体的には、タバコ、シロイヌナズナ、とうもろこし、稲、大豆、カノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、モロコシ、小麦、木花、ピーナッツ、トマト、ジャガイモ、レタスおよび唐辛子よりなる群から選ばれるものであり得、好ましくは、タバコでありうる。本発明においてのタバコは、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｅｎｕｓ）植物であり、タンパク質を過発現できるものであれば、特にその種類が制限されず、形質転換方法とタンパク質大量生産の目的に合うように適切な品種を選択して本発明を実施することができる。例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｌ．やＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．ｘａｎｔｈｉなどの品種を用いることができる。

【0046】

前記形質転換体は、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、超音波処理法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎ ｇｌｙｃｏｌ）媒介形質転換方法などの方法で製造できるが、本発明のベクターを注入できる方法であれば制限がない。

【0047】

本明細書において、「溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」とは、目的タンパク質またはペプチドが人体に投与するに適した溶媒に溶解できる程度を意味する。具体的には、特定の温度で与えられた溶媒に対して溶質が飽和した程度を示すものでありうる。溶解性は、溶質の飽和濃度を決定することによって測定することができ、例えば溶媒に溶質を過量で添加し、これを撹拌し、濾過した後、濃度をＵＶ分光器またはＨＰＬＣなどを使用して測定することができるが、これに制限されるものではなく、高い溶解性は、組み換えタンパク質の分離精製に有利であり、組み換えタンパク質の凝集が抑制されて、組み換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持する長所を有する。

【0048】

本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明による組み換え豚流行性下痢ウイルスタンパク質の投与によって豚流行性下痢を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。

【0049】

本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明によるタンパク質の投与によって豚流行性下痢の症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味する。

【0050】

本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本発明の組み換え豚流行性下痢ウイルスタンパク質が投与され得る対象をいい、その対象には制限がない。

【0051】

本発明の「ワクチン組成物」は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記レシチン類似乳化剤に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用できる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを使用でき、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、色々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性製剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤が含まれる。非水溶性製剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。

【0052】

また、本明細書において、「免疫抗原補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、一般的に抗原に対する体液および／または細胞免疫反応を増加させる任意の物質を称する。これより、本発明のワクチン用組成物は、「免疫抗原補強剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）」をさらに含むことができる。前記免疫抗原補強剤としては、例えば、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ，ＩＦＡ）、ミョウバン、オイル、Ｌｉｐｉｄ Ａ、モノホスホリルリピドＡ、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ－Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｒｉｎ）等の細菌製剤、ＣｐＧ－ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなどの核酸、ツベルクリンなどの細菌成分製剤、キーホールリンペットヘモシアニンや酵母マンナンなどの天然高分子物質、ムラミルトリペプチドまたはムラミルジペプチドまたはそれらの誘導体、ミョウバン（ａｌｕｍ）、非イオン性ブロックコポリマー、インターロイキン２（ＩＬ－２）や顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ，ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）等のサイトカインなどが挙げられ、これらの１種または２種以上を組み合わせて使用でき、本発明の一実施例では、ＩＭＳ１３１３オイルアジュバントを使用した。

【0053】

本発明のワクチン組成物または薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用できる。

【0054】

本発明によるワクチン組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。本願に使用された用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明のワクチン組成物は、また、直腸投与のための坐剤の形態で投与され得る。

【0055】

本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物の投与量は、個体の年齢、体重、性別、身体状態などを考慮して選択される。特別な副作用なく個体に免疫保護反応を誘導するのに必要な量は、免疫原として使用された組み換えタンパク質および賦形剤の任意存在によって多様になり得る。一般的に、それぞれの用量は、本発明の組み換えタンパク質の滅菌溶液ｍｌ当たり０．１～１０００μｇのタンパク質、好ましくは、０．１～１００μｇを含有する。ワクチン組成物の場合には、必要に応じて初期用量に引き続いて任意に繰り返された抗原刺激を行うことができる。

【0056】

本明細書において、「飼料組成物」は、本発明の組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質を含む飼料であり、前記飼料としては、豚肉、牛肉、鶏肉などの副産物をはじめとして、とうもろこし、米、一般わら、野草、牧草、エンシレージ、乾草、山野草などがあるが、これらに制限されるものではなく、家畜の飼育に使用される飼料であれば制限がない。このような飼料に本発明の組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質を添加して配合する方法としては、機械的混合、吸着、吸蔵などの方法があるが、これらに制限されるものではない。

【0057】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。

【実施例】

【0058】

実施例１：組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質（ＰＥＤＶ－Ｓ１）植物発現ベクターの製造
図１のように植物体で豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質を発現させることができるように、組換え植物発現ベクターを製作した。より詳しくは、豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質に関する遺伝子情報を確保し、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）での発現に最適化した配列で遺伝子（配列番号１）を合成した。ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）、豚の免疫グロブリンＦｃ断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｐＦｃ）のｐＦｃ２をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）を順に連結して、豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質植物発現ベクターを製作した。

【0059】

実施例２：組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質の発現確認
２．１．植物発現ベクター一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
前記の実施例１で準備した植物発現ベクターをアグロバクテリア菌株ＬＢＡ４４０４に電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリアを５ｍｌのＹＥＰ（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｅｐｔｏｎｅ）液体培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間振とう培養した後、１次培養液１ｍｌを５０ｍｌの新しいＹＥＰ培地に接種して２８℃の条件で６時間振とう培養した。このように培養されたアグロバクテリアは、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃５分）して収集した後、インフィルトレーション（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）バッファー（１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、２００μＭのアセトシリンゴン）に６００ｎｍの波長でＯ．Ｄ．１．０の濃度でさらに懸濁させた。アグロバクテリア懸濁液は、注射針を除去した注射器を用いてニコチアナ・ベンサミアナ葉の裏面に注入する方法でアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。

【0060】

２．２．植物体で組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質の発現確認
前記の実施例２．１で準備した植物葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている水溶性分画（Ｓ）にあるタンパク質とペレット（ｐｅｌｌｅｔ；Ｐ）分画にあるタンパク質をウェスタンブロットで確認した。より詳しくは、各分画３０μＬをＳＤＳ試料バッファーと混合した後に加熱した。そして、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに電気泳動してサイズ別にタンパク質を分離し、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後に、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を用いてブロッキング段階を経た後に、ｐＦｃ２を認識するａｎｔｉ－ｐｉｇ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙを結合させ、ＥＣＬ溶液を製造社で提供する方法によって処理して、組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質の発現を確認した。その結果は図２に示した。

【0061】

図２に示されたように、発現した組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質の大部分が水溶性分画に存在することを確認した。

【0062】

前記結果を通じて、本発明の組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質発現用ベクターは、植物体で組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質を効果的に発現させることができ、前記ベクターを用いて製造された組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質は、高い溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を有しているので、分離精製が容易であり、組み換えタンパク質の凝集が抑制されて、組み換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持するのに効果的であることを確認することができた。

【0063】

実施例３：組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質の分離精製
前記の実施例２．１で準備したニコチアナ・ベンサミアナ４０ｇにタンパク質抽出溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１Ｘタンパク質加水分解酵素阻害剤（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ））２００ｍＬを添加し、ブレンダで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離してタンパク質抽出液を回収した。発現した組み換え豚流行性下痢ウイルスタンパク質の分離精製のために、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅレジンが充填されたカラムで親和クロマトグラフィーを実施した。カラムにレジンを５ｍＬ充填した後、洗浄溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）５０ｍＬで平衡化させた。回収したタンパク質抽出液をカラムに適用した後、洗浄溶液１００ｍＬを流してレジンを洗浄し、溶出溶液（０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ ３．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で組み換えタンパク質を溶出し、中和溶液（１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０））を添加してタンパク質溶出液を中和させた。組み換えタンパク質が含まれた溶出溶液は、３０ｋＤの大きさのフィルターを使用して生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に交換および濃縮を実施して、分離精製された組み換え豚流行性下痢ウイルスタンパク質を獲得した。分離精製されたタンパク質は、タンパク質電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）後、クマシー染色法（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じて確認した（図３）。

【0064】

図３に示されたように、約１２０Ｋｄの大きさを有する組み換えタンパク質が精製されたことを確認した。

【0065】

本発明の組み換えタンパク質は、従来のタンパク質との大きな差異なしに良好に精製された。このような結果は、タンパク質を植物で発現させる場合、糖構造が変異されて生産効率が低下する問題点が発見されていないことを確認したのであり、本発明によるタンパク質が植物で良好に生産されることを確認した結果である。

【0066】

実施例４：植物発現豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質の免疫原性の確認
組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質抗原が生体内で抗体を誘導して免疫原性を有するかを確認するために、各グループ当たり５匹ずつの６週齢の雌ギニアピッグを用いて実験を進めた。より詳しくは、陰性対照群は、生理食塩水を投与し、陽性対照群は、市販の豚流行性下痢ワクチン（中央ワクチン）を投与し、実験群は、組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質を１回当たり１５０μｇずつ３週間隔で２回皮下で投与した。抗原の投与時には、同量のＩＭＳ１３１３ ａｄｊｕｖａｎｔ（ＳＥＰＰＩＣ）を混ぜて注射した。血液は、抗原の投与前と２次投与後２週目後に頚静脈または心臓から採取後、血清を分離して、－２０℃に冷凍保管した。各血清で豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質に対する特異抗体の生成は、Ｈｉｓ ｔａｇが融合したＰＥＤＶ－Ｓ１組み換えタンパク質がコートされたエライザ（ＥＬＩＳＡ）プレートを用いて確認し、その結果は、図４に示した。

【0067】

図４に示されたように、抗原非投与群の血清では、組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質に対する反応性が全く観察されなかったが、市販のワクチンまたは組み換え抗原タンパク質を２回投与した群の血清では、豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質に対して反応性を示すことを確認し、市販のワクチン投与群に比べて組み換え抗原タンパク質を投与した群が相対的にさらに高い特異抗体生成率を示すことを確認した。

【0068】

実施例５：血中の中和抗体価の確認
前記の実施例４で準備した血清で組み換え抗原タンパク質の投与で形成された血中抗体が豚流行性下痢ウイルス中和能を有するかを確認した。より詳しくは、中和抗体の試験には、ＰＥＤＶ ＱＩＡＰ１４０１ ｓｔｒａｉｎウイルスとＶｅｒｏ ｃｅｌｌを感染宿主として使用した。採血された血液の血清を分離して５７℃で３０分間不活性化した後、１０ｕｇ／ｍｌのｔｒｙｐｓｉｎが含有されたＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ Ｅａｇｌｅ）培地で２倍希釈した。各希釈血清に３１６ ＴＣＩＤ_５０／０．１ｍｌのＰＥＤＶウイルスを同量混合して、３７℃で９０分間中和させた。培養が終わる直前に、９６ウェルプレートにモノレイヤ状態で準備したＶｅｒｏ ｃｅｌｌをＰＢＳで３回洗浄後、血清－ウイルス混合液１００μｌを添加後、３７℃で２時間培養した。培養が終わった後、２μｇ／ｍｌのトリプシンが添加された培地を１００μｌ添加後、３７℃で細胞変性効果（ＣＰＥ）が現れるまで３日～５日間培養した。中和抗体の力価は、ＣＰＥが現れる直前にウェルの血清希釈倍数を顕微鏡下で観察して測定した（表１）。

【0069】

その結果、組み換えＰＥＤＶ－Ｓ１抗原タンパク質による中和抗体価が、平均１６．０（Ｌｏｇ２）、市販ワクチンによる中和抗体価が、７．２（Ｌｏｇ２）であって、組み換えＰＥＤＶ－Ｓ１抗原タンパク質による中和抗体価の形成がさらに高いことが分かった。

【0070】

【表1】

【0071】

前記結果を通じて、本発明の組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質は、植物体でも効果的に発現するだけでなく、高い水溶解性を有していて、分離および精製が容易であり、また、体内で抗原として作用して高い免疫原性およびウイルス中和能を示すので、新規の豚流行性下痢のワクチン組成物として使用可能であることを確認することができた。

【0072】

以下、本発明の薬学的組成物および飼料組成物の製剤例を説明するが、これは、本発明を限定しようとするものでなく、単に具体的に説明しようとするものである。

【0073】

製剤例１．薬学的組成物の製造
１．１．散剤の製造

【0074】

【表2】

【0075】

前記の成分を混合し、気密袋に充填して、散剤を製造する。

【0076】

１．２．錠剤の製造

【0077】

【表3】

【0078】

前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して、錠剤を製造する。

【0079】

１．３．カプセル剤の製造

【0080】

【表4】

【0081】

通常のカプセル剤の製造方法によって前記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填して、カプセル剤を製造する。

【0082】

１．４．注射剤の製造

【0083】

【表5】

【0084】

通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当たり（２ｍｌ）前記の成分含量で製造する。

【0085】

１．５．液剤の製造

【0086】

【表6】

【0087】

通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適正量加えた後、前記の成分を混合した後、精製水を加えて全体を１００ｍＬに調節した後、茶色瓶に充填して滅菌させて、液剤を製造する。

【0088】

製剤例２．飼料組成物の製造

【0089】

【表7】

【0090】

通常の飼料の製造方法によって前記成分を混合して、飼料を製造する。

【0091】

上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。

【産業上の利用可能性】

【0092】

本発明の組み換え豚流行性下痢ウイルスＳ１タンパク質は、植物体でも効果的に発現するだけでなく、高い水溶解性を有していて、分離および精製が容易であり、また、体内で抗原として作用して高い免疫原性およびウイルス中和能を示すので、多様な分野において幅広く使用可能なもものと期待される。また、体内で顕著な免疫原性およびウイルス中和能を示すので、新規の豚流行性下痢ワクチン組成物として使用可能なものと期待されるところ、産業上の利用可能性がある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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