特許 7292217 試料中のバベシア種の核酸の検出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-06-08

(45)【発行日】2023-06-16

(54)【発明の名称】試料中のバベシア種の核酸の検出

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20230609BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20230609BHJP

   C12Q 1/6893 20180101ALI20230609BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230609BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6893 Z

C12N15/09 Z ZNA

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2019567565

(86)(22)【出願日】2018-06-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-08-20

(86)【国際出願番号】 US2018036214

(87)【国際公開番号】W WO2018226798

(87)【国際公開日】2018-12-13

【審査請求日】2021-06-02

(31)【優先権主張番号】62/516,530

(32)【優先日】2017-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/520,793

(32)【優先日】2017-06-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500128402

【氏名又は名称】ジーイーエヌ－プローブ・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ヴァネッサ・ブレス

(72)【発明者】

【氏名】ディアナ・セルフ

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー・エム・リネン

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】特開２０００－１３５０８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／０６４８８７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１８３２８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０２１８６５７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０３１０３２８６（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００３／００９１５９８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／００１５３６０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１８１２９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許第０６１６５７２３（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中のバベシア種の核酸を特異的に検出する方法であって、
（１）試料を、バベシア種の標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、前記試料が、バベシア種の核酸を含む疑いがあり、前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
（ａ）第１の増幅オリゴマーであって、
（ｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列中に含まれ、かつ配列番号５６または５７を含み、あるいは、
（ｉｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含み、あるいは、
（ｉｉｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列中に含まれ、かつ配列番号１０１を含み、あるいは、
（ｉｖ）配列番号８を含むか、またはそれからなり、あるいは、
（ｖ）配列番号８３を含むか、またはそれからなる、
第１の標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の増幅オリゴマーと、
（ｂ）第２の増幅オリゴマーであって、
（ｉ）配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含むか、あるいは
（ｉｉ）配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５または配列番号５２を含み、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１を含み、あるいは、
（ｉｖ）配列番号８４を含むか、またはそれからなる、
長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドである第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマーと接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前記試料中に存在する任意のバベシア標的核酸が、増幅産物を産生するための鋳型として使用される、増幅反応を実施することと、
（３）前記増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより、前記試料中のバベシア種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む、方法。

【請求項2】

前記第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２および４および６および８からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、前記第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２および４および８からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる、ならびに／あるいは、
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、および８６からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる、ならびに／あるいは、
前記第２の増幅オリゴマー配列が、配列番号２１または配列番号２７または配列番号３４または配列番号８４または配列番号８６を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１および第２の標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、
（ａ）配列番号２もしくは６および配列番号１１、
（ｂ）配列番号４もしくは６および配列番号１３、
（ｃ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７、
（ｄ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９、
（ｅ）配列番号４および配列番号２０、
（ｆ）配列番号４もしくは６もしくは８および配列番号２１、
（ｇ）配列番号２もしくは４もしくは８および配列番号２７、
（ｈ）配列番号４および配列番号２８、
（ｉ）配列番号４および配列番号２９、
（ｊ）配列番号４および配列番号３１、
（ｋ）配列番号８および配列番号３２、
（ｌ）配列番号８および配列番号３３、
（ｍ）配列番号８および配列番号３４、
（ｎ）配列番号８および配列番号３５、
（ｏ）配列番号８および配列番号３６、
（ｐ）配列番号８および配列番号８４、
（ｑ）配列番号８および配列番号８６、
（ｒ）配列番号８３および配列番号３２、
（ｓ）配列番号８３および配列番号３３、
（ｔ）配列番号８３および配列番号３４、
（ｕ）配列番号８３および配列番号３５、
（ｖ）配列番号８３および配列番号３６、
（ｗ）配列番号８３および配列番号８４、または
（ｘ）配列番号８３および配列番号８６
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１および第２の標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、
（ａ）配列番号２および配列番号２７、
（ｂ）配列番号４および配列番号２１、
（ｃ）配列番号８および配列番号２１、
（ｄ）配列番号８および配列番号３４、
（ｅ）配列番号８および配列番号８４、
（ｆ）配列番号８および配列番号８６、
（ｇ）配列番号８３および配列番号３４、
（ｈ）配列番号８３および配列番号８４、または
（ｉ）配列番号８３および配列番号８６
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記検出工程（３）が、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記増幅産物の存在または非存在が決定される条件下で、前記増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成された検出プローブオリゴマーと接触させて、それにより、前記試料中のバベシア種の存在または非存在を示すことを含み、
前記検出プローブオリゴマーが、長さが１４～４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、配列番号５９の相補体、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、または配列番号６５、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、配列番号６５の相補体、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡを含むか、またはそれからなる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含む、あるいは、
前記検出プローブの標的ハイブリダイズ配列が、配列番号５９の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号４２、９２、９４、または９９の配列を含む、あるいは、
前記検出プローブの標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６５の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号５９、９４、または９９の配列を含む、あるいは、
前記検出プローブが、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９からなる群から選択される配列からなる、あるいは、
前記検出プローブオリゴマーが、長さが１６～２５個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６５、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするか、または配列番号６５の相補体、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、あるいは、
前記検出プローブオリゴマー配列が、配列番号５９、９４、または９９を含むか、またはそれからなるヌクレオチド配列をさらに含む、ならびに／あるいは、
前記検出プローブオリゴマーが、配列番号４２、９２、９４、または９９を含むか、またはそれからなるヌクレオチド配列をさらに含む、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

前記第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および前記検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、
（ａ）配列番号２および配列番号１１および配列番号３９または配列番号３７、
（ｂ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８または配列番号３９、
（ｃ）配列番号４および配列番号１３および配列番号３９または配列番号３７、
（ｄ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７および配列番号３９、
（ｅ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９および配列番号３９または配列番号３７、
（ｆ）配列番号４および配列番号２０および配列番号３９または配列番号３７、
（ｇ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７、
（ｈ）配列番号４および配列番号２７および配列番号３９または配列番号３８、
（ｉ）配列番号４および配列番号２８および配列番号３９、
（ｊ）配列番号４および配列番号２９および配列番号３９または配列番号３７、
（ｋ）配列番号４および配列番号３１および配列番号３９、
（ｌ）配列番号６および配列番号１１および配列番号３７、
（ｍ）配列番号６および配列番号１３および配列番号３７、
（ｎ）配列番号６および配列番号２１および配列番号３７、
（ｏ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７または配列番号４２、
（ｐ）配列番号８および配列番号２７および配列番号３９、
（ｑ）配列番号８および配列番号３２ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｒ）配列番号８および配列番号３３ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｓ）配列番号８および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｔ）配列番号８および配列番号３５ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｕ）配列番号８および配列番号３６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｖ）配列番号８および配列番号８４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｗ）配列番号８および配列番号８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｘ）配列番号８３および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７または配列番号４２、
（ｙ）配列番号８３および配列番号２７および配列番号３９、
（ｚ）配列番号８３および配列番号３２ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａａ）配列番号８３および配列番号３３ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｂ）配列番号８３および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｃ）配列番号８３および配列番号３５ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｄ）配列番号８３および配列番号３６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｅ）配列番号８３および配列番号８４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｆ）配列番号８３および配列番号８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、あるいは、
（ａｇ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４または８６、および配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および前記検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、
（ａ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８、
（ｂ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９、
（ｃ）配列番号８および配列番号２１ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｄ）配列番号８および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｅ）配列番号８および配列番号８４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｆ）配列番号８および配列番号８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｇ）配列番号８３および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｈ）配列番号８３および配列番号８４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｉ）配列番号８３および配列番号８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、あるいは、
（ｊ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４または８６、および配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

試料中のバベシア種の核酸を特異的に検出する方法であって、前記方法が、
（１）試料を、バベシア種の標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、前記試料が、バベシア種の核酸を含む疑いがあり、前記少なくとも２つの増幅オリゴマーが、
、
（ａ）第１の増幅オリゴマーであって、
（ｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列中に含まれ、かつ配列番号５６または５７を含み、
（ｉｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含み、
（ｉｉｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列中に含まれ、かつ配列番号１０１を含み、
（ｉｖ）配列番号８を含むか、またはそれからなる、あるいは、
（ｖ）配列番号８３を含むか、またはそれからなる、
第１の標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の増幅オリゴマーと、および、
（ｂ）第２の増幅オリゴマーであって、
（ｉ）配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含み、
（ｉｉ）配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５または配列番号６９を含み、
（ｉｉｉ）配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１を含み、あるいは
（ｉｖ）配列番号８４を含むか、またはそれからなる、
長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドである第２の標的ハイブリダイズ配列を含む、第２の増幅オリゴマーを含む、オリゴマーと接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、前記試料中に存在する任意のバベシア標的核酸が、増幅産物を産生するための鋳型として使用され、前記増幅産物が、１８０～２２０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含む、インビトロ増幅を実施することと、
（３）前記増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより、前記試料中のバベシア種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む、方法。

【請求項9】

前記第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２、および４、および６、および８からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、前記第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２、および４、および８からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる、ならびに／あるいは、
前記第２の増幅オリゴマーが、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、および８６からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる、ならびに／あるいは、
前記第２の増幅オリゴマー配列が、配列番号２１、または配列番号２７、または配列番号３４、または配列番号８４、または配列番号８６を含むか、またはそれからなる、ならびに／あるいは、
前記第１および第２の標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、
（ａ）配列番号２もしくは６および配列番号１１、
（ｂ）配列番号４もしくは６および配列番号１３、
（ｃ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７、
（ｄ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９、
（ｅ）配列番号４および配列番号２０、
（ｆ）配列番号４もしくは６もしくは８および配列番号２１、
（ｇ）配列番号２もしくは４もしくは８および配列番号２７、
（ｈ）配列番号４および配列番号２８、
（ｉ）配列番号４および配列番号２９、
（ｊ）配列番号４および配列番号３１、
（ｋ）配列番号８および配列番号３２、
（ｌ）配列番号８および配列番号３３、
（ｍ）配列番号８および配列番号３４、
（ｎ）配列番号８および配列番号３５、
（ｏ）配列番号８および配列番号３６、
（ｐ）配列番号８および配列番号８４、
（ｑ）配列番号８および配列番号８６、
（ｒ）配列番号８３および配列番号３４、
（ｓ）配列番号８３および配列番号８４、
（ｔ）配列番号８３および配列番号８６
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第１および第２の標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、
（ａ）配列番号２および配列番号２７、
（ｂ）配列番号４および配列番号２１、
（ｃ）配列番号８および配列番号２１、
（ｄ）配列番号８および配列番号３４、
（ｅ）配列番号８および配列番号８４、
（ｆ）配列番号８および配列番号８６、
（ｇ）配列番号８３および配列番号３４、
（ｈ）配列番号８３および配列番号８４、
（ｉ）配列番号８３および配列番号８６
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

前記検出工程（３）が、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記増幅産物の存在または非存在が決定される条件下で、前記増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成された検出プローブオリゴマーと接触させて、それにより、前記試料中のバベシア種の存在または非存在を示すことを含み、
前記検出プローブオリゴマーが、長さが１４～４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、配列番号５９の相補体、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、配列番号６５、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、配列番号６５の相補体、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡを含むか、またはそれからなる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含む、あるいは、
前記検出プローブの標的ハイブリダイズ配列が、配列番号５９の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号４２、９２、９４、または９９の配列を含む、あるいは、
前記検出プローブの標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６５の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号５９、６０、９４、または９９の配列を含む、あるいは、
前記検出プローブの標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、および９９からなる群から選択される配列からなる、あるいは、
前記検出プローブオリゴマーが、長さが１６～２５個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６５、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするか、または配列番号６５の相補体、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、あるいは、
前記検出プローブオリゴマー配列が、配列番号５９、６０、９４、または９９を含むヌクレオチド配列をさらに含む、
請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および前記検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、
（ａ）配列番号２および配列番号１１および配列番号３９または配列番号３７、
（ｂ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８または配列番号３９、
（ｃ）配列番号４および配列番号１３および配列番号３９または配列番号３７、
（ｄ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７および配列番号３９、
（ｅ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９および配列番号３９または配列番号３７、
（ｆ）配列番号４および配列番号２０および配列番号３９または配列番号３７、
（ｇ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７、
（ｈ）配列番号４および配列番号２７および配列番号３９または配列番号３８、
（ｉ）配列番号４および配列番号２８および配列番号３９、
（ｊ）配列番号４および配列番号２９および配列番号３９または配列番号３７、
（ｋ）配列番号４および配列番号３１および配列番号３９、
（ｌ）配列番号６および配列番号１１および配列番号３７、
（ｍ）配列番号６および配列番号１３および配列番号３７、
（ｎ）配列番号６および配列番号２１および配列番号３７、
（ｏ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７または配列番号４２、
（ｐ）配列番号８および配列番号２７および配列番号３９、
（ｑ）配列番号８および配列番号３２ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｒ）配列番号８および配列番号３３ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｓ）配列番号８および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｔ）配列番号８および配列番号３５ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｕ）配列番号８および配列番号３６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｖ）配列番号８および配列番号８４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｗ）配列番号８および配列番号８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｘ）配列番号８３および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７または配列番号４２、
（ｙ）配列番号８３および配列番号２７および配列番号３９、
（ｚ）配列番号８３および配列番号３２ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａａ）配列番号８３および配列番号３３ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｂ）配列番号８３および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｃ）配列番号８３および配列番号３５ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｄ）配列番号８３および配列番号３６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｅ）配列番号８３および配列番号８４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ａｆ）配列番号８３および配列番号８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、あるいは、
（ａｇ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４または８６、および配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、あるいは、
前記第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および前記検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、
（ａ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８、
（ｂ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９、
（ｃ）配列番号８および配列番号２１ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｄ）配列番号８および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｅ）配列番号８および配列番号８４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｆ）配列番号８および配列番号８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｇ）配列番号８３および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｈ）配列番号８３および配列番号８４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、
（ｉ）配列番号８３および配列番号８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、あるいは、
（ｊ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４または８６、および配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９
のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

試料中のバベシアの存在または非存在を決定するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせであって、前記オリゴマーの組み合わせが、バベシア標的核酸の標的領域を増幅するための第１および第２の増幅オリゴマーを含み、
（ａ）前記第１の増幅オリゴマーが、（ｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６または５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含み、あるいは（ｉｖ）配列番号８を含むかまたはそれからなり、あるいは（ｖ）配列番号８３を含むか、またはそれからなる、第１の標的ハイブリダイズ配列を含み、
（ｂ）前記第２の増幅オリゴマーが、
（ｉ）配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含むか、あるいは
（ｉｉ）配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５または配列番号５２を含み、
（ｉｉｉ）配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１を含み、あるいは
（ｉｖ）配列番号８４を含むか、またはそれからなる、長さが１５～３３個の連続したヌクレオチドである、第２の標的ハイブリダイズ配列を含む、組み合わせ。

【請求項14】

検出プローブオリゴマーであって、長さが１４～４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、配列番号５９の相補体、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、配列番号６５、そのＲＮＡもしくはＤＮＡ、配列番号６５の相補体、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡに含まれる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含み、あるいは、
前記検出プローブの標的ハイブリダイズ配列が、配列番号５９の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号４２、９２、９４、または９９の配列を含む、あるいは、
前記検出プローブの標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６５の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号５９、９４、または９９の配列を含む、あるいは、
前記検出プローブが、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９からなる群から選択される配列からなる、あるいは、
前記検出プローブオリゴマーが、長さが１６～２５個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６５、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするか、または配列番号６５の相補体、もしくは、そのＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、あるいは、
前記検出プローブオリゴマー配列が、配列番号５９、９４、または９９を含むか、またはそれからなるヌクレオチド配列をさらに含む、ならびに／あるいは、
前記検出プローブオリゴマーが、配列番号４２、９２、９４、または９９を含むか、またはそれからなるヌクレオチド配列をさらに含む、
検出プローブオリゴマー。

【請求項15】

試料からバベシア種の核酸を特異的に単離するための捕捉プローブオリゴマーであって、前記捕捉プローブオリゴマーが、固定プローブに結合する配列または部分に共有結合した標的ハイブリダイズ配列を含み、前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４４、７８、７９、８８、９０あるいはそのＲＮＡもしくはＤＮＡの配列に含まれる１５～３０個の連続したヌクレオチドである、捕捉プローブオリゴマー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月７日に出願された米国仮出願第６２／５１６，５３０号、および２０１７年６月１６日に出願された同第６２／５２０，７９３号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、利益を主張し、各仮出願の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

バベシア症は、バベシア属の寄生原虫の種による赤血球の感染によって引き起こされる。Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ種は、米国で報告されているほとんどのヒトのバベシア症の感染の原因となっている。感染は通常、ヒト個体では無症候性であるが、特に高齢者または免疫抑制された個体では、重度の病気または死亡につながる可能性がある。寄生虫は、風土病地域のシカへの曝露または輸血（輸血感染バベシア症（ＴＴＢ））によってヒトに伝染する。１９７９年以来、１００例を超える輸血感染バベシア症がＦＤＡに報告されている。米国の血液供給に対してほとんど取り組まれていない感染リスクとして報告されているにもかかわらず、献血された血液においてＢ．ｍｉｃｒｏｔｉをスクリーニングするためのライセンスを取得していない試験がいまだにある（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２０１６）８，３７５（２３）：（２２３６－２２４５）。ＴＴＢの脅威により、食品医薬品局（ＦＤＡ）および米国血液バンク協会（ＡＡＢＢ）は、バベシアへの献血のスクリーニングが血液の安全性のために緊急に必要であるという合意をもたらした。ＴＴＢを予防するために、血液ドナーのスクリーニングの開始は、高い優先順位を与えられるべきである（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１６）２３（６）：５７３－５８０）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】米国仮出願第６２／５１６，５３０号

【文献】米国仮出願第６２／５２０，７９３号

【非特許文献】

【0004】

【文献】Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．（２０１６）８，３７５（２３）：（２２３６－２２４５）

【文献】Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１６）２３（６）：５７３－５８０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、試料中のバベシア種を検出するための特異的かつ高感度なアッセイが必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

一態様では、試料中のバベシア種の核酸を特異的に検出する方法が提供され、該方法は、（１）バベシア種の核酸を含む疑いがある試料を、バベシア種の標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、少なくとも２つの増幅オリゴマーが、（ａ）第１の増幅オリゴマーであって、（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列中に含まれ、かつ配列番号５６または５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列中に含まれる、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列中に含まれかつ配列番号１０１を含む、（ｉｖ）配列番号８を含むか、またはそれからなる、（ｖ）配列番号８３を含むか、またはそれからなる、第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、（ｂ）第２の増幅オリゴマーであって、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および（ｉ）配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含むか、あるいは（ｉｉ）配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５または配列番号５２を含み、（ｉｉｉ）配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１を含むか、あるいは（ｉｖ）配列番号８４を含むか、またはそれからなる、第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマーと接触させることと、（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、該試料中に存在するバベシア標的核酸が、増幅産物を産生するための鋳型として使用される、増幅反応を実施することと、（３）増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより、該試料中のバベシア種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む。

【0007】

適切には、第１の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２および４および６および８からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、第１の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２、および４、および８からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0008】

適切には、第２の増幅オリゴマーは、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、および８６からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0009】

適切には、第２の増幅オリゴマー配列は、配列番号２１または配列番号２７または配列番号３４または配列番号８４または配列番号８６を含むか、またはそれからなる。

【0010】

適切には、第１の増幅オリゴマーは、第１の標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。適切には、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列である。適切には、Ｔ７プロモーター配列は、配列番号５８を含むか、またはそれからなる。

【0011】

適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号１、および３、および５、および７、および８２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号１、および３、および７、および８２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0012】

適切には、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２もしくは６および配列番号１１、（ｂ）配列番号４もしくは６および配列番号１３、（ｃ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７、（ｄ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９、（ｅ）配列番号４および配列番号２０、（ｆ）配列番号４もしくは６もしくは８および配列番号２１、（ｇ）配列番号２もしくは４もしくは８および配列番号２７、（ｈ）配列番号４および配列番号２８、（ｉ）配列番号４および配列番号２９、（ｊ）配列番号４および配列番号３１、（ｋ）配列番号８および配列番号３２、（ｌ）配列番号８および配列番号３３、（ｍ）配列番号８および配列番号３４、（ｎ）配列番号８および配列番号３５、（ｏ）配列番号８および配列番号３６、（ｐ）配列番号８および配列番号８４、（ｑ）配列番号８および配列番号８６、（ｒ）配列番号８３および配列番号３４、（ｓ）配列番号８３および配列番号３５、（ｔ）配列番号８３および配列番号３６、（ｕ）配列番号８３および配列番号８４、（ｖ）配列番号８３および配列番号８６。

【0013】

適切には、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる：（ａ）配列番号２および配列番号２７、（ｂ）配列番号４および配列番号２１、（ｃ）配列番号８および配列番号２１、（ｄ）配列番号８および配列番号３４、（ｅ）配列番号８および配列番号８４、（ｆ）配列番号８および配列番号８６、（ｇ）配列番号８３および配列番号３４、（ｈ）配列番号８３および配列番号８４、（ｉ）配列番号８３および配列番号８６。

【0014】

適切には、この方法は、工程（１）の前に試料中の他の成分から標的核酸を精製することをさらに含む。

【0015】

適切には、精製工程は、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含み、標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号７８の配列に含まれる約１５～２１個の連続したヌクレオチドであるか、または（ｉｉ）配列番号７８の配列を含む約２１～３０個の連続したヌクレオチドであるか、または（ｉｉｉ）配列が配列番号４４である。適切には、捕捉プローブオリゴマー配列は、配列番号４３を含むか、またはそれからなる。

【0016】

適切には、検出工程（３）は、該インビトロ核酸増幅反応物を、増幅産物の存在または非存在が決定される条件下で、増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成された検出プローブオリゴマーと接触させて、それにより、該試料中のバベシア種の存在または非存在を示すことを含む。

【0017】

適切には、検出プローブオリゴマーは、長さが約１４～約４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、配列番号５９のＲＮＡ同等物、配列番号５９の相補体、配列番号５９の相補体のＲＮＡ同等物、または配列番号６５、配列番号６５のＤＮＡ同等物、配列番号６５の相補体、もしくは配列番号６５の相補体のＤＮＡ同等物を含むか、またはそれからなる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含む。

【0018】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６５の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号３７または配列番号４２の配列を含む。

【0019】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号４１の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号３８または配列番号３９の配列を含む。

【0020】

適切には、検出プローブは、配列番号３７、３８、３９、４１、４２、９１、９２、９４、または９９からなる群から選択される配列からなる。

【0021】

適切には、検出プローブは、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、および９９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。

【0022】

適切には、検出プローブオリゴマーは、ヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つに２’メトキシ修飾をさらに含む。

【0023】

適切には、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２および配列番号１１および配列番号３９または配列番号３７、（ｂ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８または配列番号３９、（ｃ）配列番号４および配列番号１３および配列番号３９または配列番号３７、（ｄ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７および配列番号３９、（ｅ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９および配列番号３９または配列番号３７、（ｆ）配列番号４および配列番号２０および配列番号３９または配列番号３７、（ｇ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７、（ｈ）配列番号４および配列番号２７および配列番号３９または配列番号３８、（ｉ）配列番号４および配列番号２８および配列番号３９、（ｊ）配列番号４および配列番号２９および配列番号３９または配列番号３７、（ｋ）配列番号４および配列番号３１および配列番号３９、（ｌ）配列番号６および配列番号１１および配列番号３７、（ｍ）配列番号６および配列番号１３および配列番号３７、（ｎ）配列番号６および配列番号２１および配列番号３７、（ｏ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７または配列番号４２、（ｐ）配列番号８および配列番号２７および配列番号３９、（ｑ）配列番号８および配列番号３２および配列番号３７または配列番号４２、（ｒ）配列番号８および配列番号３３および配列番号３７または配列番号４２、（ｓ）配列番号８および配列番号３４および配列番号３７または配列番号４２、（ｔ）配列番号８および配列番号３５および配列番号３７または配列番号４２、（ｕ）配列番号８および配列番号３６および配列番号３７または配列番号４２、（ｖ）配列番号８、および配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号９１、９２、または９３、（ｖ）配列番号８、および配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９、あるいは（ｘ）配列番号８３、および配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号９１、９２、または９３。

【0024】

適切には、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８、（ｂ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９、（ｃ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３７または配列番号３９、（ｄ）配列番号８および配列番号３４ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、（ｅ）配列番号８および配列番号３４、または８４または８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、（ｆ）配列番号８３および配列番号３４、８４、または８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、（ｇ）配列番号８および配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３、（ｈ）配列番号８３および配列番号３４、８４または８６ならびに配列番号３７、３８、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９、あるいは（ｉ）配列番号８３および配列番号３４、８４、または８６ならびに配列番号３７、４２、９１、９２、または９３。

【0025】

適切には、検出プローブは、標識を含む。適切には、標識は、化学発光標識または蛍光標識である。適切には、検出工程（３）は増幅工程（２）中に行う。適切には、検出プローブは蛍光標識および消光剤を含む。適切には、検出プローブは、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブからなる群から選択される。適切には、検出プローブは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む。適切には、検出プローブは、分子トーチまたは分子ビーコンである。

【0026】

適切には、工程（２）における増幅反応は、等温増幅反応である。好適には、増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である。適切には、増幅反応は、リアルタイム増幅反応である。

【0027】

適切には、試料は、臨床試料である。適切には、試料は、血液試料である。適切には、試料は、溶解血球試料である。適切には、溶解血球試料は、溶解赤血球試料である。

【0028】

適切には、増幅産物は、１８０～２２０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含む。

【0029】

さらなる態様では、試料中のバベシア種の核酸を特異的に検出する方法が記載され、該方法は、（１）バベシア種の核酸を含む疑いがある試料を、バベシア種の標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、該少なくとも２つの増幅オリゴマーのうちの２つが、（ａ）第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマーであって、第１の増幅オリゴマーが、（ｉ）長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号６６に含まれ、かつ配列番号５６または配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列中に含まれる、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列中に含まれかつ配列番号１０１を含む、（ｉｖ）配列番号８を含む／それからなる、（ｖ）配列番号８３を含むか、またはそれからなる、第１の標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマー、または（ｂ）第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマーであって、第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および（ｉ）配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含むか、あるいは（ｉｉ）配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５または配列番号６９を含み、あるいは（ｉｉｉ）配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１を含むか、あるいは（ｉｖ）配列番号８４を含むか、またはそれからなる、第２の標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマーからなる群から選択される、オリゴマーと接触させることと、（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、該試料中に存在するバベシア標的核酸が、増幅産物を産生するための鋳型として使用される、該増幅産物が、１８０～２２０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号６５またはその相補体を含む、増幅反応を実施することと、（３）増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより、該試料中のバベシア種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む。

【0030】

適切には、第１の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２、および４、および６、および８からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、第１の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２、および４、および８からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0031】

適切には、第２の増幅オリゴマーは、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、および８６からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0032】

適切には、第２の増幅オリゴマー配列は、配列番号２１または配列番号２７または配列番号３４または配列番号８４または配列番号８６を含むか、またはそれからなる。

【0033】

適切には、第１の増幅オリゴマーは、第１の標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。適切には、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列である。適切には、Ｔ７プロモーター配列は、配列番号５８を含むか、またはそれからなる。適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号１および３および５および７および８２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号１および３および７および８２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0034】

適切には、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２もしくは６および配列番号１１、（ｂ）配列番号４もしくは６および配列番号１３、（ｃ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７、（ｄ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９、（ｅ）配列番号４および配列番号２０、（ｆ）配列番号４もしくは６もしくは８および配列番号２１、（ｇ）配列番号２もしくは４もしくは８および配列番号２７、（ｈ）配列番号４および配列番号２８、（ｉ）配列番号４および配列番号２９、（ｊ）配列番号４および配列番号３１、（ｋ）配列番号８および配列番号３２、（ｌ）配列番号８および配列番号３３、（ｍ）配列番号８および配列番号３４、（ｎ）配列番号８および配列番号３５、（ｏ）配列番号８および配列番号３６、（ｐ）配列番号８および配列番号８４、（ｑ）配列番号８および配列番号８６、（ｒ）配列番号８３および配列番号３４、（ｓ）配列番号８３および配列番号８４、（ｔ）配列番号８３および配列番号８６。

【0035】

適切には、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる：（ａ）配列番号２および配列番号２７、（ｂ）配列番号４および配列番号２１、（ｃ）配列番号８および配列番号２１、（ｄ）配列番号８および配列番号３４、（ｅ）配列番号８および配列番号８４、（ｆ）配列番号８および配列番号８６、（ｇ）配列番号８３および配列番号３４、（ｈ）配列番号８３および配列番号８４、（ｉ）配列番号８３および配列番号８６。

【0036】

適切には、この方法は、工程（１）の前に試料中の他の成分から標的核酸を精製することをさらに含む。

【0037】

適切には、精製工程は、試料を、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーと接触させることを含み、標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号７８の配列に含まれる約１５～２１個の連続したヌクレオチドであるか、または（ｉｉ）配列番号７８の配列を含む約２１～約３０個の連続したヌクレオチドであるか、または（ｉｉｉ）配列が配列番号４４である。

【0038】

適切には、捕捉プローブオリゴマー配列は、配列番号４３を含むか、またはそれからなる。

【0039】

適切には、検出工程（３）は、該インビトロ核酸増幅反応物を、増幅産物の存在または非存在が決定される条件下で、増幅産物に特異的にハイブリダイズするように構成された検出プローブオリゴマーと接触させて、それにより、該試料中のバベシア種の存在または非存在を示すことを含む。

【0040】

適切には、検出プローブオリゴマーは、長さが約１４～約４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、配列番号５９のＲＮＡ同等物、配列番号５９の相補体、配列番号５９の相補体のＲＮＡ同等物、配列番号６５、配列番号６５のＤＮＡ同等物、配列番号６５の相補体、もしくは配列番号６５の相補体のＤＮＡ同等物を含むか、またはそれからなる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含む。

【0041】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号５９の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号４２、９２、９４または９９の配列を含む。

【0042】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号４１の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号３８または配列番号６０の配列を含む。

【0043】

適切には、検出プローブオリゴマーは、長さが１６～２５個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６５、もしくはそのＤＮＡ同等物に特異的にハイブリダイズするか、または配列番号６５の相補体、もしくはそのＤＮＡ同等物に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。

【0044】

適切には、検出プローブオリゴマー配列が、配列番号５９または配列番号６０を含むヌクレオチド配列をさらに含む。

【0045】

適切には、検出プローブオリゴマーは、配列番号３７、３８、３９、４２、または９９からなるヌクレオチド配列をさらに含む。

【0046】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、および９９からなる群から選択される配列からなる。

【0047】

適切には、検出プローブオリゴマーは、ヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つに２’メトキシ修飾をさらに含む。

【0048】

適切には、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２および配列番号１１および配列番号３９または配列番号３７、（ｂ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８または配列番号３９、（ｃ）配列番号４および配列番号１３および配列番号３９または配列番号３７、（ｄ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７および配列番号３９、（ｅ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９および配列番号３９または配列番号３７、（ｆ）配列番号４および配列番号２０および配列番号３９または配列番号３７、（ｇ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７、（ｈ）配列番号４および配列番号２７および配列番号３９または配列番号３８、（ｉ）配列番号４および配列番号２８および配列番号３９、（ｊ）配列番号４および配列番号２９および配列番号３９または配列番号３７、（ｋ）配列番号４および配列番号３１および配列番号３９、（ｌ）配列番号６および配列番号１１および配列番号３７、（ｍ）配列番号６および配列番号１３および配列番号３７、（ｎ）配列番号６および配列番号２１および配列番号３７、（ｏ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７または配列番号４２、（ｐ）配列番号８および配列番号２７および配列番号３９、（ｑ）配列番号８および配列番号３２および配列番号３７または配列番号４２、（ｒ）配列番号８および配列番号３３および配列番号３７または配列番号４２、（ｓ）配列番号８および配列番号３４および配列番号３７または配列番号４２、（ｔ）配列番号８および配列番号３５および配列番号３７または配列番号４２、（ｕ）配列番号８および配列番号３６および配列番号３７または配列番号４２、（ｖ）配列番号８、および配列番号８４ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｗ）配列番号８および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｘ）配列番号８３および配列番号３４、ならびに配列番号９１、９２および／または９３、（ｙ）配列番号８３および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２および／または９３、（ｚ）配列番号８３および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、あるいは（ａａ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９。

【0049】

適切には、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８、（ｂ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９、（ｃ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３７または配列番号３９、あるいは（ｄ）配列番号８および配列番号３４および配列番号３７または配列番号４２、（ｅ）配列番号８および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｆ）配列番号８、および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｇ）配列番号８３、および配列番号３４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｈ）配列番号８３、および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｉ）配列番号８３、および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、あるいは、（ｊ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９。

【0050】

適切には、検出プローブは、標識を含む。適切には、標識は、化学発光標識または蛍光標識である。適切には、検出工程（３）は増幅工程（２）中に行う。適切には、検出プローブは蛍光標識および消光剤を含む。適切には、検出プローブは、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブからなる群から選択される。適切には、検出プローブは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む。適切には、検出プローブは、分子トーチまたは分子ビーコンである。

【0051】

適切には、工程（２）における増幅反応は、等温増幅反応である。好適には、増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である。適切には、増幅反応は、リアルタイム増幅反応である。

【0052】

適切には、試料は、臨床試料である。適切には、試料は、血液試料である。適切には、試料は、溶解血球試料である。

【0053】

適切には、溶解血球試料は、溶解赤血球試料である。

【0054】

さらなる態様では、試料中のバベシアの存在または非存在を決定するための少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせが記載され、該オリゴマーの組み合わせが、バベシア標的核酸の標的領域を増幅するための第１および第２の増幅オリゴマーを含み、（ａ）第１の増幅オリゴマーが、（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６または５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含み、（ｉｖ）配列番号８を含むかまたはそれからなり、（ｖ）配列番号８３を含むか、またはそれからなる、第１の標的ハイブリダイズ配列を含み、（ｂ）第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および（ｉ）配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含むか、あるいは（ｉｉ）配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５または配列番号５２を含み、あるいは（ｉｉｉ）配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１を含み、あるいは（ｉｖ）配列番号８４を含むか、またはそれからなる、第２の標的ハイブリダイズ配列を含む。

【0055】

適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２および４および６および８および８３からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２および４および８および８３からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0056】

適切には、第２の増幅オリゴマーは、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、および８６からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0057】

適切には、第２の増幅オリゴマー配列は、配列番号２１または配列番号２７または配列番号３４または配列番号８４または配列番号８６を含むか、またはそれからなる。

【0058】

適切には、第１の増幅オリゴマーは、第１の標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。適切には、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列である。適切には、Ｔ７プロモーター配列は、配列番号５８を含むか、またはそれからなる。

【0059】

適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号１および３および５および７および８２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号１および３および７および８２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0060】

適切には、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２もしくは６および配列番号１１、（ｂ）配列番号４もしくは６および配列番号１３、（ｃ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７、（ｄ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９、（ｅ）配列番号４および配列番号２０、（ｆ）配列番号４もしくは６もしくは８および配列番号２１、（ｇ）配列番号２もしくは４もしくは８および配列番号２７、（ｈ）配列番号４および配列番号２８、（ｉ）配列番号４および配列番号２９、（ｊ）配列番号４および配列番号３１、（ｋ）配列番号８および配列番号３２、（ｌ）配列番号８および配列番号３３、（ｍ）配列番号８および配列番号３４、（ｎ）配列番号８および配列番号３５、（ｏ）配列番号８および配列番号３６、（ｐ）配列番号８および配列番号８４、（ｑ）配列番号８および配列番号８６、（ｒ）配列番号８３および配列番号３４、（ｓ）配列番号８３および配列番号８４、あるいは（ｔ）配列番号８３および配列番号８６。

【0061】

適切には、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる：（ａ）配列番号２および配列番号２７、（ｂ）配列番号４および配列番号２１、（ｃ）配列番号８および配列番号２１、（ｄ）配列番号８および配列番号３４、（ｅ）配列番号８および配列番号８４、（ｆ）配列番号８および配列番号８６、（ｇ）配列番号８３および配列番号３４、（ｈ）配列番号８３および配列番号８４、あるいは（ｉ）配列番号８３および配列番号８６。

【0062】

適切には、組み合わせは、少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーをさらに含む。

【0063】

少なくとも１つの捕捉プローブオリゴマーが、固定化プローブに結合する配列または部分に共有結合した標的ハイブリダイズ配列を含み、該標的ハイブリダイズ配列が、（ｉ）配列番号７８の配列に含まれる約１５～約２１個の連続したヌクレオチドであるか、または（ｉｉ）配列番号７８の配列を含む約２１～３０個の連続したヌクレオチドであるか、または（ｉｉｉ）配列が配列番号４４からなる。

【0064】

適切には、捕捉プローブオリゴマー配列は、配列番号４３を含むか、またはそれからなる。

【0065】

適切には、組み合わせは、検出プローブオリゴマーをさらに含む。

【0066】

適切には、検出プローブオリゴマーは、長さが約１４～約４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、配列番号５９のＲＮＡ同等物、配列番号５９の相補体、配列番号５９の相補体のＲＮＡ同等物、配列番号６５、配列番号６５のＤＮＡ同等物、配列番号６５の相補体、もしくは配列番号６５の相補体のＤＮＡ同等物に含まれる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含む。

【0067】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号５９の配列を含み、かつ少なくとも配列番号４２、９２、９４または９９の配列を含む。

【0068】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６０の配列を含み、かつ少なくとも配列番号３８または配列番号３９の配列を含む。

【0069】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９からなる群から選択される配列からなる。

【0070】

適切には、検出プローブオリゴマーは、長さが１６～２５個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６５、もしくはそのＤＮＡ同等物に特異的にハイブリダイズするか、または配列番号６５の相補体、もしくはそのＤＮＡ同等物に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。

【0071】

適切には、検出プローブオリゴマー配列が、配列番号５９または配列番号６０を含むヌクレオチド配列をさらに含む。

【0072】

好適には、検出プローブオリゴマーは、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９からなるヌクレオチド配列をさらに含む。

【0073】

適切には、検出プローブオリゴマーは、ヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つに２’メトキシ修飾をさらに含む。

【0074】

適切には、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２および配列番号１１および配列番号３９または配列番号３７、（ｂ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８または配列番号３９、（ｃ）配列番号４および配列番号１３および配列番号３９または配列番号３７、（ｄ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７および配列番号３９、（ｅ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９および配列番号３９または配列番号３７、（ｆ）配列番号４および配列番号２０および配列番号３９または配列番号３７、（ｇ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７、（ｈ）配列番号４および配列番号２７および配列番号３９または配列番号３８、（ｉ）配列番号４および配列番号２８および配列番号３９、（ｊ）配列番号４および配列番号２９および配列番号３９または配列番号３７、（ｋ）配列番号４および配列番号３１および配列番号３９、（ｌ）配列番号６および配列番号１１および配列番号３７、（ｍ）配列番号６および配列番号１３および配列番号３７、（ｎ）配列番号６および配列番号２１および配列番号３７、（ｏ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７または配列番号４２、（ｐ）配列番号８および配列番号２７および配列番号３９、（ｑ）配列番号８および配列番号３２および配列番号３７または配列番号４２、（ｒ）配列番号８および配列番号３３および配列番号３７または配列番号４２、（ｓ）配列番号８および配列番号３４および配列番号３７または配列番号４２、（ｔ）配列番号８および配列番号３５および配列番号３７または配列番号４２、（ｕ）配列番号８および配列番号３６および配列番号３７または配列番号４２、（ｖ）配列番号８、および配列番号８４ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｗ）配列番号８および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｘ）配列番号８３および配列番号３４、ならびに配列番号９１、９２および／または９３、（ｙ）配列番号８３および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２および／または９３、（ｚ）配列番号８３および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、あるいは（ａａ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９。

【0075】

適切には、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８、（ｂ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９、（ｃ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３７または配列番号３９、（ｄ）配列番号８および配列番号３４および配列番号３７または配列番号４２、（ｅ）配列番号８および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｆ）配列番号８、および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｇ）配列番号８３、および配列番号３４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｈ）配列番号８３、および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｉ）配列番号８３、および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、あるいは、（ｊ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９。

【0076】

適切には、検出プローブは、標識を含む。適切には、標識は、化学発光標識または蛍光標識である。適切には、検出プローブは蛍光標識および消光剤を含む。適切には、検出プローブは、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブからなる群から選択される。適切には、検出プローブは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む。適切には、検出プローブは、分子トーチまたは分子ビーコンである。

【0077】

さらなる態様では、長さが約１４～約４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、配列番号５９のＲＮＡ同等物、配列番号５９の相補体、配列番号５９の相補体のＲＮＡ同等物、配列番号６５、配列番号６５のＲＮＡ同等物、配列番号６５の相補体、もしくは配列番号６５の相補体のＲＮＡ同等物に含まれる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含む、検出プローブオリゴマーが記載される。

【0078】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号５９の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号４２、９２、９４または９９の配列を含む。

【0079】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６５の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号５９または配列番号９４の配列を含む。

【0080】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、および９９からなる群から選択される配列からなる。

【0081】

適切には、検出プローブオリゴマーは、ヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つに２’メトキシ修飾をさらに含む。

【0082】

適切には、検出プローブは、標識を含む。適切には、標識は、化学発光標識または蛍光標識である。適切には、検出プローブは蛍光標識および消光剤を含む。適切には、検出プローブは、分子トーチ、分子ビーコン、およびＴａｑＭａｎ検出プローブからなる群から選択される。

【0083】

適切には、検出プローブは、非標的ハイブリダイズ配列をさらに含む。

【0084】

適切には、検出プローブは、分子トーチまたは分子ビーコンである。

【0085】

さらなる態様では、試料からバベシア種の核酸を特異的に単離するための捕捉プローブオリゴマーが記載され、該捕捉プローブオリゴマーは、固定プローブに結合する配列または部分に共有結合した標的ハイブリダイズ配列を含み、該標的ハイブリダイズ配列は、配列番号７８の配列に含まれる約１５～約３０個の連続したヌクレオチドである。

【0086】

適切には、捕捉プローブオリゴマー配列は、配列番号４３を含むか、またはそれからなる。

【0087】

さらなる態様では、請求項７８～１０７のいずれか一項に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含むキットが記載される。

【0088】

さらなる態様では、請求項７８～１０７のいずれか一項に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせを含む反応混合物が記載される。

【0089】

さらなる態様では、試料中のバベシア種の核酸を特異的に増幅するための、請求項７８～１０７のいずれか一項に記載の少なくとも２つのオリゴマーの組み合わせの使用が記載される。

【0090】

さらなる態様では、試料中のバベシア種の核酸を特異的に検出するための、請求項１０８～１２１のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマーの使用が記載される。

【0091】

さらなる態様では、試料中のバベシア種の核酸を特異的に捕捉するための、請求項１１２または１２３に記載の捕捉プローブオリゴマーの使用が記載される。

【0092】

適切には、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｕｎｃａｎｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｖｅｎａｔｏｒｕｍが検出される。

【0093】

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。

【0094】

「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。

【0095】

「試料」には、バベシア核酸またはバベシア核酸の断片などのバベシア核酸またはその成分を含む可能性があるか、または含むことが疑われる任意の標本が含まれる。試料は、単離された試料であってもよい。試料としては、バベシア寄生虫またはその成分（例えば、それに由来する標的核酸）を含み得る、生きたまたは死んだヒトに由来する任意の組織または材料を含む「生物学的試料」が含まれ、例えば、血液、末梢血、および赤血球が挙げられる。バベシア寄生虫またはその成分（例えば、それに由来する標的核酸）を含む可能性のある他の試料型の使用－血漿、血清、リンパ節、胃腸組織、糞便、尿、精液または他の体液もしくは材料など－も企図される。生物学的試料は、組織または細胞構造を物理的または機械的に破壊するように処理されてもよく、したがって、標準的な方法を使用して分析用の生物学的試料を調製するために使用される酵素、緩衝液、塩、洗剤などをさらに含み得る溶液中に細胞内成分を放出する。また、試料は、試料を濾過デバイスの上もしくは中に通すことから、または遠心分離後に、または媒体、マトリクス、もしくは支持体への付着によって得られるものなどの処理済み試料を含み得る。

【0096】

「核酸」とは、窒素ヘテロ環塩基または塩基類似体を有する２つ以上の共有結合したヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物であって、ヌクレオシドは、ホスホジエステル結合または他の結合によって互いに結合して、ポリヌクレオチドを形成する。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはキメラＤＮＡ－ＲＮＡポリマーもしくはオリゴヌクレオチド、およびそれらの類似体を含む。核酸「骨格」は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ中、ＷＯ９５／３２３０５を参照されたい）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボースもしくはデオキシリボースのいずれか、または既知の置換、例えば、２’メトキシ置換および２’ハライド置換（例えば２’－Ｆ）を有する同様の化合物であり得る。窒素塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えば、イノシン、５－メチルイソシトシン、イソグアニン；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００７）４３：６１７－２４）であってもよく、これは、プリンまたはピリミジン塩基の誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－またはアザ－プリン、デアザ－またはアザ－ピリミジン、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２、６、および／または８位に改変または置き換え置換基を有するプリン塩基、例えば、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、０６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、および０４－アルキル－ピリミジン、ならびにピラゾロ－化合物、例えば、非置換または３－置換ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号、同第６，９４９，３６７号、およびＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）を含む。核酸は、骨格が１つ以上の残基に対して窒素塩基を含まない「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、ＲＮＡおよびＤＮＡに見られるような従来の糖、塩基、および結合のみを含んでもよく、または従来の成分および置換（例えば、２’メトキシ骨格によって結合される従来の塩基、もしくは従来の塩基および１つ以上の塩基類似体の混合物を含む核酸）を含んでもよい。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含んでもよく、１つ以上のヌクレオチドモノマーは、糖立体配座を模倣するＲＮＡにロックされた二環式フラノース単位を有し、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、または二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中の相補的配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００４）４３：１３２３３－４１）。核酸は、核酸の機能または挙動を変化させるための修飾塩基、例えばさらなるヌクレオチドが核酸に付加されるのを阻止するための３’－末端ジデオキシヌクレオチドの付加を含み得る。インビトロで核酸を作製するための合成方法は、当該技術分野において周知であるが、核酸は、日常的な技術を使用して天然源から精製されてもよい。

【0097】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸鎖を意味する。本出願全体を通して、核酸は、５’末端から３’末端に指定される。標準的な核酸、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的には、「５’から３’に」、すなわち、成長している核酸の３’末端へのヌクレオチド付加によって合成される。

【0098】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭素糖、および窒素塩基からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５炭素糖は、２’－デオキシリボースである。この用語はまた、リボースの２’位にあるメトキシ基（２’－０－Ｍｅ）などのこのようなサブユニットの類似体も含む。

【0099】

本明細書で使用される場合、「核酸ベースの検出アッセイ」は、標的核酸内の標的配列の検出のためのアッセイであり、標的配列に特異的にハイブリダイズするもう１つのオリゴヌクレオチドを利用する。

【0100】

ある特定の実施形態では、核酸ベースの検出アッセイは、「増幅ベースのアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するための１つ以上の工程を利用するアッセイである。検出アッセイで使用するための様々な増幅方法が当技術分野において既知であり、そのうちのいくつかを本明細書でさらに要約する。明確にするために、増幅ベースのアッセイは、例えば、非増幅ベースのアッセイ方法（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイまたは切断ベースのアッセイ）で使用される工程など、標的配列を増幅しない１つ以上の工程を含んでもよい。

【0101】

他の実施形態では、核酸ベースの検出アッセイは、「非増幅ベースのアッセイ」、すなわち、核酸標的配列を増幅するためのいずれの工程にも依存しないアッセイである。明確にするために、対応する下流の増幅オリゴマーの非存在下でのプライマーの伸長反応を含む核酸ベースの検出アッセイ（例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を産生する逆転写酵素によるプライマーの伸長、続いて、ＲＮＡ標的に相補的な一本鎖ｃＤＮＡが得られるが、ｃＤＮＡのコピーは生成されないＲＮＡのＲＮａｓｅ消化）は、非増幅ベースのアッセイであると理解されている。

【0102】

例示的な非増幅ベースのアッセイは、「切断ベースのアッセイ」であり、これは、標的核酸への重複オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションによって形成される直鎖二重鎖切断構造の、フラップエンドヌクレアーゼによる特異的切断に依存するアッセイである。これらのアッセイでは、非標的ハイブリダイズフラップ領域を含むプローブオリゴヌクレオチドは、フラップエンドヌクレアーゼによって重複依存的様式で切断され、その後検出される切断産物を放出する。切断ベースのアッセイの原理は当該技術分野で周知であり、例示的なアッセイは、例えばＮａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１７：２９２－２９６，Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．（１９９９）４：１３５－１４４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００６）４４：３４４３－３４４７、および米国特許第５，８４６，７１７号、同第６，７０６，４７１号、ならびに同第５，６１４，４０２号に記載されている。切断ベースのアッセイとしては、例えば、市販のＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられる。

【0103】

本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、検出される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、本明細書に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、標的配列以外の他の配列を含んでもよい。

【0104】

「単離された」とは、標的核酸を含む試料がその自然環境から採取されることを意味するが、この用語は精製のいかなる程度も意味するものではない。

【0105】

本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、検出されるべき標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」には、検出プロセス（例えば、ＴＭＡもしくはＰＣＲなどの増幅ベースの検出アッセイ、または、例えば、切断ベースのアッセイなどの非増幅ベースの検出アッセイ）中にオリゴヌクレオチド（例えば、プローブオリゴヌクレオチド、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合する複合体配列が含まれる。標的核酸がもともと一本鎖である場合、「標的配列」という用語はまた、標的核酸中に存在する「標的配列」に相補的な配列を指す。標的核酸がもともと二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（－）鎖の両方を指す。標的配列を選択する際、当業者は、無関係なまたは密接に関連する標的核酸を区別するために「特有な」配列が選択されるべきであることを理解するであろう。

【0106】

「標的ハイブリダイズ配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されたオリゴマー部分を指すために本明細書において使用される。好ましくは、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成されている。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成された標的配列の部分に１００％相補的であってもよいが、必ずしもそうではない。標的ハイブリダイズ配列はまた、標的配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたヌクレオチド残基を含んでもよい。標的配列に対する標的ハイブリダイズ配列の１００％未満の相補性は、例えば、バベシアの様々な株にハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの場合のように、標的核酸が種内の複数の株である場合に生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するよう標的ハイブリダイズ配列を構成するための他の理由が存在することが理解される。

【0107】

バベシア種の核酸の領域に関して本明細書で使用される「配列を標的にする」という用語は、オリゴヌクレオチドが本明細書に記載の検出を可能にする様式で標的配列にハイブリダイズするプロセスを指す。一実施形態では、本オリゴヌクレオチドは、標的化バベシア種の核酸配列と相補的であり、ミスマッチを含まない。別の実施形態では、本オリゴヌクレオチドは、相補的であるが、標的化バベシア種の核酸配列と１、２、３、４、または５つのミスマッチを含む。好ましくは、標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、標的配列に相補的な少なくとも１０個～最大５０個ものヌクレオチドを含む。少なくとも１０個および最大５０個は包括的範囲であるため、１０、５０、およびそれらの間の各整数が含まれることが理解される。好ましくは、オリゴマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズする。

【0108】

「～するように構成される」という用語は、参照されるオリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を示す。例えば、標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照された配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する。

【0109】

本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズするように構成された」という用語は、オリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域が、参照されたバベシア種の標的領域の配列を標的にし得るポリヌクレオチド配列を有するように設計されることを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、その配列のみを標的とすることに限定されず、むしろ組成物として、キット内で、またはバベシア種標的核酸を標的化するための方法において有用である。本オリゴヌクレオチドは、試料からのバベシア種の検出のためのアッセイの構成要素として機能するように設計されており、したがって試験試料中に通常見られる他の核酸の存在下でバベシア種を標的化するように設計されている。「特異的にハイブリダイズする」とは、当該技術分野において理解されるように、非標的核酸へのある程度の小さいレベルのハイブリダイゼーションが起こり得るため、排他的にハイブリダイズすることを意味しない。むしろ、「特異的にハイブリダイズする」とは、試料中の標的核酸の正確な検出が決定され得るように、オリゴヌクレオチドが標的を主にハイブリダイズするようにアッセイにおいて機能するように構成されていることを意味する。「～するように構成される」という用語は、オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を示す。

【0110】

バベシア種の標的化核酸に関して本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、１つの連続した核酸を指す。

【0111】

本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、核酸の一部分を指し、前述の一部分は、全核酸よりも小さい。例えば、参照される核酸がオリゴヌクレオチドプロモータープライマーである場合、「領域」という用語は、全オリゴヌクレオチドのより小さいプロモーター部分を指すために使用され得る。別の非限定的な例として、参照される核酸がアンプリコンである場合、領域という用語は、プローブの標的ハイブリダイズ配列によるハイブリダイゼーションのために同定されたより小さいヌクレオチド配列を指すために使用され得る。

【0112】

互換性のある「オリゴマー」、「オリゴ」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般に１，０００ヌクレオチド未満のヌクレオチド（ｎｔ）残基を有する核酸を指し、約５ｎｔの残基の下限および約５００～９００ｎｔの残基の上限を有する範囲内のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２～１５ｎｔの下限および約５０～６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲内にあり、他の実施形態は、約１５～２０ｎｔの下限および約２２～１００ｎｔの上限を有するサイズ範囲内にある。オリゴヌクレオチドは、自然発生源から精製されてもよく、または様々な周知の酵素的または化学的方法のいずれかを使用して合成されてもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対するいかなる特定の機能も示さず、むしろ、本明細書に記載される全てのそのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、相補鎖に特異的であり、相補鎖にハイブリダイズすることができ、核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、プライマーとして機能することができ、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含み、転写（例えば、Ｔ７プライマー）を可能にする場合、プライマーとして機能し、プロモーターを提供することができ、標的核酸またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることが可能であり、検出可能部分（例えば、アクリジニウム－エステル化合物）をさらに提供する場合、標的核酸を検出するように機能することができる。

【0113】

本明細書で使用される場合、特定の参照核酸配列に「実質的に対応する」オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが参照核酸配列と十分に類似し、これにより、オリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズするという点で、参照核酸配列と同様のハイブリダイゼーション特性を有することを意味する。当業者は、「実質的に対応するオリゴヌクレオチド」が参照配列とは異なり得、それでもなお同じ標的核酸配列にハイブリダイズし得ることを理解するであろう。また、第２の核酸に対応する第１の核酸は、文脈上他の明確な指示がない限り、そのＲＮＡおよびＤＮＡを含み、かつその相補物を含むことが理解される。核酸からのこの変形形態は、配列内の同一の塩基の百分率またはプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基の百分率で記述され得る。したがって、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、塩基同一性または相補性のこれらの百分率が１００％～約８０％である場合、参照核酸配列に「実質的に対応する」。好ましい実施形態では、この百分率は、１００％～約８５％である。より好ましい実施形態では、この百分率は１００％～約９０％であり、他の好ましい実施形態では、この百分率は、１００％～約９５％である。同様に、核酸または増幅された核酸の領域は、参照核酸配列に対応するものとして本明細書でみなされる。当業者は、許容できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こすことなく、特異的標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、様々な百分率の相補性で必要とされ得るハイブリダイゼーション条件への様々な修正を理解するであろう。

【0114】

「増幅オリゴマー」は、少なくともその３’末端が標的核酸に相補的であり、標的核酸またはその補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴマーである。増幅オリゴマーの例は、標的核酸にハイブリダイズし、増幅プロセスにおいてポリメラーゼによって伸長される３’ＯＨ末端を含む「プライマー」である。増幅オリゴマーの別の例は、ポリメラーゼによって伸長されない（例えば、それが３’ブロック化末端を有するため）が、増幅に関与するかまたは増幅を促進するオリゴマーである。例えば、増幅オリゴヌクレオチド－本明細書に記載の第１の増幅オリゴマーなど－の５’領域は、標的核酸に対して非相補的であるプロモーター配列を含んでもよい（これは「プロモータープライマー」または「プロモータープロバイダー」と称され得る）。当業者は、プライマーとして機能する増幅オリゴマーが５’プロモーター配列を含むように修飾され得、したがってプロモータープライマーとして機能することを理解するであろう。３’ブロック化末端を組み込むことは、今や標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始するのに役立つ上流プロモーター配列を提供することが可能であるが、オリゴ伸長のためのプライマーを提供しないプロモータープライマーをさらに修飾する。そのような修飾オリゴは、本明細書において「プロモータープロバイダー」オリゴマーと称される。増幅オリゴヌクレオチドのサイズ範囲は、約１０～約７０ｎｔの長さであり（プロモーター配列またはポリＡテールを含まない）、標的核酸配列（またはその相補鎖）の領域に相補的である少なくとも約１０個の連続した塩基、さらには少なくとも１２個の連続した塩基を含むものを含む。連続した塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または完全に相補的である。増幅オリゴマーは、修飾されたヌクレオチドもしくは類似体、または増幅反応に関与するが、標的核酸もしくは鋳型配列に相補的でも含まれてもいない、さらなるヌクレオチドを任意に含んでもよい。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さの範囲に言及する場合、その範囲が全ての整数を含む（例えば、１９～２５個の連続したヌクレオチド長には、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５が含まれる）ことが理解される。

【0115】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、核酸に結合し、特異的部位でＲＮＡの転写を開始するシグナルとして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（「転写酵素」）によって認識される特異的核酸配列である。

【0116】

本明細書で使用される場合、「プロモータープロバイダー」または「プロバイダー」は、第１および第２の領域を含み、その３’末端からのＤＮＡ合成の開始を防止するように修飾されているオリゴヌクレオチドを指す。プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドの「第１の領域」は、ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする塩基配列を含み、このハイブリダイズする配列は、プロモーター領域の３’に位置するが、必ずしも隣接しない。プロモーターオリゴヌクレオチドのハイブリダイズ部分は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であり、最大５０ヌクレオチド以上の長さまで伸長してもよい。「第２の領域」は、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む。プロモーターオリゴヌクレオチドは、それがＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素によって伸長され得ないように操作され、上記のようにその３’末端にブロッキング部分を含むことが好ましい。本明細書で言及されるように、「Ｔ７プロバイダー」は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるオリゴヌクレオチド配列を提供するブロック化プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドである。

【0117】

「増幅」とは、標的核酸配列、またはその補体、またはそのフラグメントの複数のコピーを得るための任意の既知の手順を指す。複数のコピーは、アンプリコンまたは増幅産物と称され得る。既知の増幅方法としては、熱循環増幅法および等温増幅法の両方が挙げられる。いくつかの実施形態には、等温増幅法が好ましい。レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅が、核酸増幅法の非限定的な例である。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼ（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）などのレプリカーゼを使用する。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー対、および熱サイクリングを使用して、ｄｓＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成するか、またはｃＤＮＡから合成する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）。ＬＣＲ増幅は、４つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する（例えば、米国特許第５，４２７，９３０号および米国特許第５，５１６，６６３号）。ＳＤＡは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマー、および標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れるエンドヌクレアーゼを使用し、それにより、一連のプライマー伸長および鎖置換ス工程で増幅が起こる（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号、米国特許第５，５４７，８６１号、および米国特許第５，６４８，２１１号）。好ましい実施形態は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）またはＮＡＳＢＡなどのＲＮＡ標的核酸の増幅に適した増幅方法を使用するが、当業者には、本明細書に開示されるオリゴマーが、他の増幅方法においてプライマーとして容易に使用され得ることが明らかであろう。

【0118】

「転写関連増幅」はまた、本明細書では「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）と称され、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅を指す。これらの方法は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター配列を含む鋳型相補オリゴヌクレオチドを用い、任意に１つ以上の他のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。ＴＭＡ法は、本明細書に記載されるＨＳＶ標的配列を増幅および検出するために使用される増幅方法の実施形態である。転写関連増幅の変形形態は、以前に詳細に開示されているように（例えば、米国特許第４，８６８，１０５号、同第５，１２４，２４６号、同第５，１３０，２３８号、同第５，４３７，９９０号、同第５，５５４，５１６号、および同第７，３７４，８８５、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１３０２号、同第ＷＯ８８／１０３１５号、および同第ＷＯ９５／０３４３０号）、当該技術分野において周知である。当業者は、開示された組成物が、ポリメラーゼによるオリゴマー配列の伸長に基づく増幅方法で使用され得ることを理解するであろう。

【0119】

本明細書で使用される場合、「リアルタイムＴＭＡ」という用語は、リアルタイム検出手段によって監視される標的核酸の単一プライマー転写媒介増幅（「ＴＭＡ」）を指す。

【0120】

「増幅産物」と互換的に使用される「アンプリコン」という用語は、標的配列内に含まれる配列に相補的または相同である、増幅手順の間に産生される核酸分子を指す。これらの用語は、一本鎖増幅産物、二本鎖増幅産物、または二本鎖増幅産物の鎖のうちの一方を指すために使用され得る。

【0121】

「検出プローブ」、「検出オリゴヌクレオチド」、および「検出プローブオリゴマー」は、標的配列または増幅された核酸の検出を可能にするために、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸中または増幅された核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを指すために互換的に使用される。検出は、直接的（例えば、その標的配列に直接ハイブリダイズされたプローブ）または間接的（例えば、中間分子構造を介してその標的に結合されたプローブ）のいずれかであってもよい。プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの組み合わせであってもよく、かつ標識されていても、または標識されていなくてもよい。プローブの「標的配列」は、一般に、標準的な塩基対合によってプローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、より大きい核酸配列内のより小さい核酸配列を指す。プローブは、標的特異的配列、およびプローブの三次元立体配座に寄与する他の配列を含み得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６／００６８４１７号）。好ましい実施形態では、検出プローブは、より高い信号の取得につながり得る２’メトキシ骨格を含む。

【0122】

「ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ」という用語は、通常５’塩基に蛍光色素、通常３’塩基に非蛍光消光色素（消光剤）を含む検出オリゴヌクレオチドを指す。照射されると、励起された蛍光色素は、蛍光ではなく近くの消光色素分子にエネルギーを移動し、非蛍光基質をもたらす。。増幅中、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが切断されて蛍光団が消光剤から分離され、増幅の指標として蛍光団から非消光シグナルが放出される。

【0123】

本明細書で使用される場合、「標識」は、検出される、または検出可能なシグナルをもたらすプローブに直接的または間接的に結合された部分または化合物を指す。直接的標識化は、共有結合または非共有相互作用、例えば、水素結合、疎水性およびイオン性相互作用、またはキレートもしくは配位錯体の形成を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通して起こり得る。間接的標識化は、直接的または間接的のいずれかで標識され、かつ検出可能なシグナルを増幅し得る架橋部分または「リンカー」、例えば、結合対メンバー、抗体または追加のオリゴマーを使用して行うことができる。標識としては、放射性核種、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン）、酵素もしくは酵素基質、反応基、または発色団（例えば、検出可能な色を付与する色素、粒子、もしくはビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、または化学発光標識）、またはフルオロフォアが挙げられる。標識は、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブとは異なる検出可能な変化、例えば、不安定性または特異的な分解特性を示す均質アッセイにおいて検出可能であり得る。「均質な検出可能な標識」は、未結合形態の標識または標識プローブから結合したものを物理的に除去することなく検出され得る（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。標識としては、化学発光化合物、例えば、標準的アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）および誘導体を含むＡＥ化合物が挙げられる（例えば、米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）。合成および標識を核酸に結合する方法ならびに標識を検出する方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ １０；米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号）。２つ以上の標識および２つ以上の種類の標識が特定のプローブ上に存在してもよく、または検出は、検出可能なシグナルを産生する化合物によって各プローブが標識されるプローブの混合物を使用してもよい（例えば、米国第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号）。

【0124】

本明細書で使用される場合、構造は、結合領域（例えば、「標的結合ドメイン」）によって接続され、かつ所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の異なる領域（「標的閉鎖ドメイン」）を含むように設計されている「分子トーチ」と称される。標的閉鎖ドメインを含むヌクレオチド配列の全部または一部は、標的結合ドメインとして機能する場合もある。したがって、標的閉鎖配列には、標的結合配列、非標的結合配列、およびこれらの組み合わせが含まれ得る。

【0125】

「捕捉プローブ」、「捕捉オリゴヌクレオチド」、「標的捕捉オリゴヌクレオチド」、および「捕捉プローブオリゴマー」は、標準的な塩基対合によって標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、固定化プローブ上の結合パートナーに結合して、標的核酸を支持体に捕捉する核酸オリゴマーを指すために本明細書で互換的に使用される。捕捉オリゴマーの一例には、標的ハイブリダイズ配列および固定化プローブ結合領域という２つの結合領域を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。この例の変形形態として、２つの領域は、１つ以上のリンカーによって互いに結合した２つの異なるオリゴマー上に存在してもよい。捕捉オリゴマーの別の実施形態の標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸に非特異的に結合し、それを支持体上の固定化プローブに結合するためのランダムもしくは非ランダムのポリＧＵ、ポリＧＴ、またはポリＵ配列を含む配列である（例えば、ＷＯ２００８／０１６９８８を参照されたい）。固定化プローブ結合領域は、テールと呼ばれる核酸配列であり得る。テールは、支持体粒子または支持体マトリクスに取り付けられた相補的固定化配列に結合する、約１０～４０個のヌクレオチド（例えば、Ａｉｏ～Ａ４０）または約１４～３３個のｎｔ（例えば、Ｔ３Ａ１４～Ｔ３Ａ３０）の実質的にホモポリマーのテールを含む。このため、好ましい核酸テールの非限定的な例には、いくつかの実施形態では、Ｔ０－４Ａ１０４０配列が含まれ得る。捕捉オリゴマーの別の例は、２つの領域、標的ハイブリダイズ配列、および核酸配列ではない結合対メンバーを含む。

【0126】

本明細書で使用される場合、「固定化オリゴヌクレオチド」、「固定化プローブ」、または「固定化核酸」とは、捕捉オリゴマーを支持体に直接または間接的に結合する核酸結合パートナーを指す。支持体に結合した固定化プローブは、試料中の未結合材料からの捕捉プローブ結合標的の分離を容易にする。固定化プローブの一実施形態は、試料中の未結合材料からの結合標的配列の分離を容易にする、支持体に結合したオリゴマーである。支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン、ポリプロピレン、金属、または他の組成物で作られてもよく、その一実施形態が磁気誘引性粒子である、既知の材料、例えば、マトリクスおよび溶液中で遊離している粒子を含み得る。支持体は、固定化プローブが直接的に（共有結合、キレート化、もしくはイオン相互作用を介して）、または間接的に（１つ以上のリンカーを介して）結合している単分散磁性球体（例えば、均一サイズ＋５％）であってもよく、プローブと支持体との間の連結または相互作用は、ハイブリダイゼーション条件下で安定である。

【発明を実施するための形態】

【0127】

本開示は、一般に、試料－例えば、血液試料中の寄生原虫バベシア種の存在または非存在を決定するための方法および組成物に関する。適切には、本明細書に記載の方法および組成物は、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｕｎｃａｎｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｖｅｎａｔｏｒｕｍの存在を検出することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、被験者のバベシア症を診断するための方法および組成物を提供する。他の、相互に排他的な実施形態では、本開示は、試料中のバベシア種の検出のための方法を提供し、本方法は、バベシア種からの標的核酸の増幅ベースの検出を行うことを含む。本開示は、試料中のバベシア種－Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｕｎｃａｎｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｖｅｎａｔｏｒｕｍを含む－検出するためのオリゴマーの組み合わせを含む組成物（反応混合物を含む）およびキットをさらに提供する。オリゴマーの組み合わせは、一般に、試料中のバベシア種－Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｕｎｃａｎｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｖｅｎａｔｏｒｕｍを含む－を検出するための少なくとも２つの増幅オリゴマーを含み、バベシア種－Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｄｕｎｃａｎｉおよび／またはＢａｂｅｓｉａ ｖｅｎａｔｏｒｕｍを含む－の増幅ベースの検出を実施するための、本明細書に記載の１つ以上の追加のオリゴマー、例えば、捕獲プローブおよび／または検出プローブなどをさらに含んでもよい。

【0128】

バベシア種症を診断するための方法は、一般に、被験者からの試料中のバベシア種の存在または非存在を検出することを含む。試料は、バベシア種に感染しているか、または含んでいる疑いがあり得る。被験者は、バベシア種に感染しているか、またバベシア症を患っている疑いがあり得る。特に、バベシア種の核酸の試料における特異的検出のためのアッセイが実施される。検出アッセイの結果に基づいて、バベシア種に陽性または陰性の状態が割り当てられる。被験者におけるバベシア症の存在または非存在は、バベシア種の状態に基づいて決定することができる。

【0129】

バベシア種の核酸は、任意の適切な方法を使用して検出することができるが、これらの寄生原虫は、核酸ベースの検出アッセイを使用して検出されることが好ましい。核酸ベースの検出アッセイは、一般に、試料中に存在する疑いがある他の核酸との最小限の交差反応性を有する、バベシア種の標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを利用する。したがって、バベシア種の核酸ベースの検出のためのオリゴヌクレオチドは、例えば、熱帯熱マラリア原虫を含む他の核酸に対する最小限の交差反応性を有するであろう。

【0130】

本開示による核酸ベースの検出アッセイからの陽性シグナルは、試料中のＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂａｂｅｓｉａ ｄｕｎｃａｎｉ、および／またはＢａｂｅｓｉａ ｖｅｎａｔｏｒｕｍのうちの１つ以上の存在を示している。

【0131】

核酸ベースの検出アッセイ－増幅ベースのアッセイなど－の使用を含む方法のいくつかの実施形態では、バベシア種を検出するために使用される。このような方法は、一般に、インビトロでの核酸増幅反応を利用して標的核酸内の標的配列を増幅することと、例えば、増幅産物を、試料中の標的の存在を示すシグナルを提供する核酸検出プローブと特異的にハイブリダイズすることによって、増幅産物を検出することと、を含む。増幅工程は、標的核酸が試料中に存在する場合、試料を標的核酸中の標的配列に特異的な２つ以上の増幅オリゴマーと接触させて増幅産物を産生することを含む。増幅は、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼを使用して、鋳型鎖を使用して、増幅オリゴマー（プライマー）から配列を伸長することによって、標的配列またはその相補体の追加のコピーを合成する。増幅産物を検出するための一実施形態は、増幅産物を、選択された増幅オリゴマーによって増幅された配列、例えば、選択された増幅オリゴマーの対が隣接する標的配列に含まれる配列に特異的な少なくとも１つのプローブと接触させることを含むハイブリダイズステップを使用する。好適な増幅方法としては、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。このような増幅方法は、当該技術分野において周知であり（例えば、定義セクションの増幅方法の説明を参照されたい）、本発明の方法に従って容易に使用される。

【0132】

例えば、ＴＭＡ増幅を使用するいくつかの増幅方法は、以下のステップを含む。簡潔に述べると、増幅される配列を含む標的核酸は、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。当業者は、二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の従来の融解が、一本鎖標的核酸を提供するために使用され得ることを理解するであろう。プロモータープライマーは、その標的配列で標的核酸へ特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖を鋳型として用いてプロモータープライマーの３’末端を伸長して、標的配列鎖のｃＤＮＡコピーを作り出し、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を結果的に生じる。ＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を消化し、第２のプライマーは、プロモータープライマー末端から下流のｃＤＮＡ鎖上に位置するその標的配列に特異的に結合する。ＲＴは、第１のｃＤＮＡ鋳型を使用して、第２のプライマーの３’末端を伸長することによって、新たなＤＮＡ鎖を合成して、機能的プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡを作り出す。次いで、プロモーター配列に特異的なＲＮＡポリメラーゼが、転写を開始して、反応中の最初の標的鎖の約１００～１０００個の増幅コピー（「アンプリコン」）であるＲＮＡ転写物を産生する。第２のプライマーがアンプリコンの各々の中のその標的配列に特異的に結合するときに、増幅は継続し、ＲＴがアンプリコンＲＮＡ鋳型からＤＮＡコピーを作り出して、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を産生する。反応混合物中のＲＮａｓｅは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖からアンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーは、新たに合成されたＤＮＡ中のその相補的配列に特異的に結合する。ＲＴは、プロモータープライマーの３’末端を伸長して、ＲＮＡポリメラーゼが結合して標的鎖に相補的である追加のアンプリコンを転写する機能的プロモーターを含むｄｓＤＮＡを作り出す。より多くのアンプリコンコピーを作製する自己触媒サイクルは、反応中に繰り返され、試料中に存在する標的核酸の約１０億倍の増幅を結果的に生じる。増幅産物は、増幅中にリアルタイムで、または増幅産物に含まれる標的配列に特異的に結合するプローブを使用することによって、増幅反応の終わりに検出され得る。結合したプローブから生じるシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。

【0133】

いくつかの実施形態では、方法は、「逆方向」ＴＭＡ反応を利用する。そのような変形形態において、開始または「順方向」増幅オリゴマーは、標的領域の３’末端の付近で標的核酸にハイブリダイズするプライミングオリゴヌクレオチドである。逆転写酵素（ＲＴ）は、鋳型として標的核酸を使用してプライマーの３’末端を伸長することによって、ｃＤＮＡ鎖を合成する。第２のまたは「逆」増幅オリゴマーは、合成されたｃＤＮＡ鎖内に含まれる標的配列にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を有するプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーである。第２の増幅オリゴマーがプロモータープライマーである場合、ＲＴは、鋳型としてｃＤＮＡ鎖を使用してプロモータープライマーの３’末端を伸長して、標的配列鎖の第２のｃＤＮＡコピーを作り出し、それにより機能的プロモーター配列を含むｄｓＤＮＡを作り出す。次いで、増幅は、ＲＮＡポリメラーゼを利用したプロモーター配列からの転写の開始に関する上記のように本質的に継続する。あるいは、第２の増幅オリゴマーがプロモータープロバイダーである場合、標的領域の５’末端の付近にある標的配列にハイブリダイズする終結オリゴヌクレオチドは、典型的には、終結オリゴヌクレオチドの３’末端でプライミングオリゴマーの伸長を終結するように利用され、それにより、プライミングオリゴマーからの伸長によって合成した初期ｃＤＮＡ鎖について画定された３’末端を提供する。次いで、プロモータープロバイダーの標的ハイブリダイズ配列は、初期ｃＤＮＡ鎖の定義された３’末端にハイブリダイズし、ｃＤＮＡ鎖の３’末端は伸長されて、プロモータープロバイダーのプロモーター配列に相補的な配列を付加し、二本鎖プロモーター配列の形成を結果的に生じる。次いで、初期ｃＤＮＡ鎖は鋳型として使用されて、二本鎖プロモーターを認識し、それから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを使用して、プロモーター部分を含まない初期ｃＤＮＡ鎖に相補的な複数のＲＮＡ転写物を転写する。次いで、これらのＲＮＡ転写物の各々は、第１のプライミング増幅オリゴマーからのさらなる増幅のための鋳型として機能するために利用可能である。

【0134】

一態様では、少なくとも２つの増幅オリゴマーの使用を含む、試料中のバベシア種を特異的に検出するための方法が提供され、この増幅オリゴマーは、（ａ）（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６または５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含み、（ｉｖ）配列番号８を含むかまたはそれからなり、（ｖ）配列番号８３を含むか、またはそれからなる、第１の標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の増幅オリゴマーと、（ｂ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および（ｉ）配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含むか、あるいは（ｉｉ）配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５または配列番号５２を含み、あるいは（ｉｉｉ）配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１を含み、あるいは（ｉｖ）配列番号８４を含むか、またはそれからなる、第２の標的ハイブリダイズ配列を含む、第２の増幅オリゴマーと、を含む。したがって、増幅ベースの検出アッセイを含むある特定の実施形態では、少なくとも２つの増幅オリゴマーの組み合わせがバベシア種の核酸の検出に利用される。

【0135】

適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２および４および６および８および８３からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、より適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号２および４および８および８３からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0136】

この組み合わせの第１の増幅オリゴマーは、第１の標的ハイブリダイズ配列の５’に位置するプロモーター配列をさらに含むプロモータープライマーまたはプロモータープロバイダーであり得る。適切には、プロモーター配列は、配列番号５８を任意に含むか、またはそれからなるＴ７プロモーター配列である。この実施形態によれば、第１の増幅オリゴマーは、配列番号１および３および５および７および８２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなり、適切には、第１の増幅オリゴマーは、配列番号１および３および７および８２からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。

【0137】

適切には、第２の増幅オリゴマーは、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、および８６からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。より適切には、第２の増幅オリゴマー配列は、配列番号２１または配列番号２７または配列番号３４または配列番号８４または配列番号８６を含むか、またはそれからなる。

【0138】

一実施形態では、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる：（ａ）配列番号２もしくは６および配列番号１１、（ｂ）配列番号４もしくは６および配列番号１３、（ｃ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７、（ｄ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９、（ｅ）配列番号４および配列番号２０、（ｆ）配列番号４もしくは６もしくは８および配列番号２１、（ｇ）配列番号２もしくは４もしくは８および配列番号２７、（ｈ）配列番号４および配列番号２８、（ｉ）配列番号４および配列番号２９、（ｊ）配列番号４および配列番号３１、（ｋ）配列番号８および配列番号３２、（ｌ）配列番号８および配列番号３３、（ｍ）配列番号８および配列番号３４、（ｎ）配列番号８および配列番号３５、（ｏ）配列番号８および配列番号３６、（ｐ）配列番号８および配列番号８４、（ｑ）配列番号８および配列番号８６、（ｒ）配列番号８３および配列番号３４、（ｓ）配列番号８３および配列番号８４、あるいは（ｔ）配列番号８３および配列番号８６。

【0139】

別の実施形態では、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる：（ａ）配列番号２および配列番号２７、（ｂ）配列番号４および配列番号２１、（ｃ）配列番号８および配列番号２１、（ｄ）配列番号８および配列番号３４、（ｅ）配列番号８および配列番号８４、（ｆ）配列番号８および配列番号８６、（ｇ）配列番号８３および配列番号３４、（ｈ）配列番号８３および配列番号８４、あるいは（ｉ）配列番号８３および配列番号８６。

【0140】

組み合わせが１つ以上の検出プローブをさらに含む実施形態では、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列を含んでもよいか、またはそれらからなってもよい：（ａ）配列番号２および配列番号１１および配列番号３９または配列番号３７、（ｂ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８または配列番号３９、（ｃ）配列番号４および配列番号１３および配列番号３９または配列番号３７、（ｄ）配列番号４および配列番号１６または配列番号１７および配列番号３９、（ｅ）配列番号４および配列番号１８または配列番号１９および配列番号３９または配列番号３７、（ｆ）配列番号４および配列番号２０および配列番号３９または配列番号３７、（ｇ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７、（ｈ）配列番号４および配列番号２７および配列番号３９または配列番号３８、（ｉ）配列番号４および配列番号２８および配列番号３９、（ｊ）配列番号４および配列番号２９および配列番号３９または配列番号３７、（ｋ）配列番号４および配列番号３１および配列番号３９、（ｌ）配列番号６および配列番号１１および配列番号３７、（ｍ）配列番号６および配列番号１３および配列番号３７、（ｎ）配列番号６および配列番号２１および配列番号３７、（ｏ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３９または配列番号３７または配列番号４２、（ｐ）配列番号８および配列番号２７および配列番号３９、（ｑ）配列番号８および配列番号３２および配列番号３７または配列番号４２、（ｒ）配列番号８および配列番号３３および配列番号３７または配列番号４２、（ｓ）配列番号８および配列番号３４および配列番号３７または配列番号４２、（ｔ）配列番号８および配列番号３５および配列番号３７または配列番号４２、（ｕ）配列番号８および配列番号３６および配列番号３７または配列番号４２、（ｖ）配列番号８、および配列番号８４ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｗ）配列番号８および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｘ）配列番号８３および配列番号３４、ならびに配列番号９１、９２および／または９３、（ｙ）配列番号８３および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２および／または９３、（ｚ）配列番号８３および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、あるいは（ａａ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９。

【0141】

組み合わせが１つ以上の検出プローブオリゴマーをさらに含む他の実施形態では、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマーの標的ハイブリダイズ配列は、それぞれ以下のヌクレオチド配列含んでもよいか、またはそれらからなってもよい：（ａ）配列番号２および配列番号２７および配列番号３８、（ｂ）配列番号４および配列番号２１および配列番号３９、（ｃ）配列番号８および配列番号２１および配列番号３７または配列番号３９、（ｄ）配列番号８および配列番号３４および配列番号３７または配列番号４２、（ｅ）配列番号８および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｆ）配列番号８、および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｇ）配列番号８３、および配列番号３４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｈ）配列番号８３、および配列番号８４、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、（ｉ）配列番号８３、および配列番号８６、ならびに配列番号９１、９２、および／または９３、あるいは、（ｊ）配列番号８または８３、配列番号３４、８４、または８６、ならびに配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８または９９。

【0142】

理解されるように、本開示は、第１および第２の増幅オリゴマーの様々な組み合わせの使用を企図し、様々な組み合わせは、（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５３を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５４を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号８５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６７に含まれ、かつ配列番号５２を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４７を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４８を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４９を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号５０を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；および（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５６を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号８４を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとを含む。

【0143】

第１および第２の増幅オリゴマーのさらなる組み合わせには、（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５３を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５４を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号８５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６７に含まれ、かつ配列番号５２を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４７を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４８を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４９を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号５０を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとを含み；および（ｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６６の配列に含まれ、かつ配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号８４を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとを含む。

【0144】

第１および第２の増幅オリゴマーのさらなる組み合わせには、配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５３を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５４を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６８に含まれ、かつ配列番号８５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号６７に含まれ、かつ配列番号５２を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４７を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４８を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４９を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号５０を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および配列番号７０に含まれ、かつ配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマー；および配列番号８または８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号８４を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーを含む。

【0145】

本開示はまた、第１および第２の増幅オリゴマーの他の組み合わせの使用も企図し、この組み合わせは、第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２０を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３２を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３４を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３５を含むか、またはそれからなる；および第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３６を含むか、またはそれからなる、増幅オリゴマーを含む。

【0146】

本開示はまた、第１および第２の増幅オリゴマーの他の組み合わせの使用も企図し、この組み合わせは、以下を含む増幅オリゴマーを含む：第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２０を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３２を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３４を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３５を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３６を含むか、またはそれからなる。

【0147】

本開示はまた、第１および第２の増幅オリゴマーの他の組み合わせの使用も企図し、この組み合わせは、第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２０を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３２を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３４を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３５を含むか、またはそれからなる；および第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３６を含むか、またはそれからなる、増幅オリゴマーを含む。

【0148】

本開示はまた、第１および第２の増幅オリゴマーの他の組み合わせの使用も企図し、この組み合わせは、第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２０を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３２を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３４を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３５を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３６を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８４を含むか、またはそれからなる；および第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８６を含むか、またはそれからなる、増幅オリゴマーを含む。

【0149】

本開示はまた、第１および第２の増幅オリゴマーの他の組み合わせの使用も企図し、この組み合わせは、第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２０を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２７を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２８を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２９を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３１を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３２を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３３を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３４を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３５を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３６を含むか、またはそれからなる；第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８４を含むか、またはそれからなる；および第１の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８３を含むか、またはそれからなり、かつ第２の標的ハイブリダイズ配列が、配列番号８６を含むか、またはそれからなる、増幅オリゴマーを含む。

【0150】

本開示はまた、第１および第２の標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ、下記のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる、第１および第２の増幅オリゴマーの他の組み合わせの使用も企図する：配列番号２および配列番号１１；配列番号６および配列番号１１；配列番号４および配列番号１３；配列番号６および配列番号１３；配列番号４および配列番号１６；配列番号４および配列番号１７；配列番号４および配列番号１８；配列番号４および配列番号１９；配列番号４および配列番号２０；配列番号４および配列番号２１；配列番号６および配列番号２１；配列番号８および配列番号２１；配列番号２および配列番号２７；配列番号４および配列番号２７；配列番号８および配列番号２７；配列番号４および配列番号２８；配列番号４および配列番号２９；配列番号４および配列番号３１；配列番号８および配列番号３２；配列番号８および配列番号３３；配列番号８および配列番号３４；配列番号８および配列番号８４；配列番号８および配列番号８６；配列番号８および配列番号３５；配列番号８および配列番号３６；配列番号８３および配列番号３２；配列番号８３および配列番号３３；配列番号８３および配列番号３４；配列番号８３および配列番号８４；配列番号８３および配列番号８６；配列番号８３および配列番号３５；または配列番号８３および配列番号３６。

【0151】

本開示はまた、第１および第２の増幅オリゴマー標的ハイブリダイズ配列および検出プローブオリゴマー標的ハイブリダイズ配列が、それぞれ下記のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる、第１の増幅オリゴマー、第２の増幅オリゴマー、および検出プローブオリゴマーの組み合わせの使用も企図する：配列番号２および配列番号１１および配列番号３９；配列番号２および配列番号１１および配列番号３７；配列番号２および配列番号２７および配列番号３８；配列番号２および配列番号２７および配列番号３９；配列番号４および配列番号１３および配列番号３９；配列番号４および配列番号１３および配列番号３７；配列番号４および配列番号１６および配列番号３９；配列番号４および配列番号１７および配列番号３９；配列番号４および配列番号１８および配列番号３９；配列番号４および配列番号１９および配列番号３９；配列番号４および配列番号１８および配列番号３７；配列番号４および配列番号１９および配列番号３７；配列番号４および配列番号２０および配列番号３９；配列番号４および配列番号２０および配列番号３７；配列番号４および配列番号２１および配列番号３９；配列番号４および配列番号２１および配列番号３７；配列番号４および配列番号２７および配列番号３９；配列番号４および配列番号２７および配列番号３８；配列番号４および配列番号２８および配列番号３９；配列番号４および配列番号２９および配列番号３９；配列番号４および配列番号２９および配列番号３７；配列番号４および配列番号３１および配列番号３９；配列番号６および配列番号１１および配列番号３７；配列番号６および配列番号１３および配列番号３７；配列番号６および配列番号２１および配列番号３７；配列番号８および配列番号２１および配列番号３９；配列番号８および配列番号２１および配列番号３７；配列番号８および配列番号２１および配列番号４２；配列番号８および配列番号２７および配列番号３９；配列番号８および配列番号３２および配列番号３７；配列番号８および配列番号３２および配列番号４２；配列番号８および配列番号３３および配列番号３７；配列番号８および配列番号３３および配列番号４２；配列番号８および配列番号３４および配列番号３７；配列番号８および配列番号３４および配列番号４２；配列番号８および配列番号３５および配列番号３７；配列番号８および配列番号３５および配列番号４２；配列番号８および配列番号３６および配列番号３７；または配列番号８および配列番号３６および配列番号４２；配列番号８、および配列番号８４、および配列番号９１、９２ならびに／または９３；配列番号８、および配列番号８６、および配列番号９１、９２ならびに／または９３；配列番号８３、および配列番号３４、および配列番号９１、９２ならびに／または９３；配列番号８３、および配列番号８４、および配列番号９１、９２ならびに／または９３；配列番号８３、および配列番号８６、および配列番号９１、９２ならびに／または９３；または配列番号８もしくは８３、配列番号３４、８４もしくは８６，および配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８もしくは９９。

【0152】

さらなる態様では、試料中のバベシア種の核酸を特異的に検出する方法が記載され、該方法は、（１）バベシア種の核酸を含む疑いがある試料を、バベシア種の標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つのオリゴマーと接触させることであって、該少なくとも２つの増幅オリゴマーのうちの２つが、（ａ）第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマーであって、第１の増幅オリゴマーが、（ｉ）長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号６６に含まれ、かつ配列番号５６または配列番号５７を含むか、あるいは（ｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９６の配列中に含まれる、かつ配列番号１０１を含むか、あるいは（ｉｉｉ）長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号９７の配列中に含まれかつ配列番号１０１を含む、（ｉｖ）配列番号８または８３を含む／それからなる、第１の標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマー、または（ｂ）第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマーであって、第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、および（ｉ）配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含むか、あるいは（ｉｉ）配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５または配列番号６９を含み、あるいは（ｉｉｉ）配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１を含むか、あるいは（ｉｖ）配列番号８４を含むか、またはそれからなる、第２の標的ハイブリダイズ配列を含む、第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマーからなる群から選択される、オリゴマーと接触させることと、（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、該試料中に存在するバベシア標的核酸が、増幅産物を産生するための鋳型として使用される、該増幅産物が、１８０～２２０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号６５またはその相補体を含む、増幅反応を実施することと、（３）増幅産物の存在または非存在を検出し、それにより、該試料中のバベシア種標的核酸の存在または非存在を示すことと、を含む。

【0153】

増幅産物が１８０～２２０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含む実施形態では、増幅産物が１８０～２１０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含むことも企図される。増幅産物は、１８０～２００個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含むことも企図される。増幅産物は、１８０～１９０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含むことも企図される。増幅産物は、１９０～２２０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含むことも企図される。増幅産物は、２００～２２０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含むことも企図される。増幅産物は、２１０～２２０個の連続したヌクレオチドの長さを有し、配列番号６５またはその相補体を含むことも企図される。

【0154】

したがって、第１および第２の増幅オリゴマーのさらなる組み合わせには、第１の増幅オリゴマーが、長さが１５～３３個の連続する核酸塩基であり、配列番号６６に含まれ、かつ配列番号５６を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含むか、または長さが１５～３３個の連続する核酸塩基であり、配列番号６６に含まれ、かつ配列番号５７を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含むか、または長さが１５～３３個の連続する核酸塩基であり、配列番号９６に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含むか、または長さが１５～３３個の連続する核酸塩基であり、配列番号９７に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含むか、または配列番号８を含むか、またはそれからなるものも含む。

【0155】

したがって、第１および第２の増幅オリゴマーのさらなる組み合わせには、第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２を含むか、または配列番号５３を含むか、または配列番号５４を含むか、または配列番号５５を含むか、または配列番号８５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含むものも含む。

【0156】

したがって、第１および第２の増幅オリゴマーのさらなる組み合わせには、第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５を含むか、または配列番号６９を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含むものも含む。

【0157】

したがって、第１および第２の増幅オリゴマーのさらなる組み合わせには、第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６を含むか、または配列番号４７を含むか、または配列番号４８を含むか、または配列番号４９を含むか、または配列番号５０を含むか、または配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含むものも含む。

【0158】

したがって、第１および第２の増幅オリゴマーのさらなる組み合わせには、第２の増幅オリゴマーが、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、かつ配列番号８４を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含むものも含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、特定の第１および第２の増幅オリゴマーの組み合わせが好ましい。

【0160】

１つの好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号６６に含まれ、かつ配列番号５６または配列番号５７を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号６７に含まれ、かつ配列番号４５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号１に記載の配列を含むか、またはそれからなるか、または配列番号２に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号２７に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３８に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0161】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号６６に含まれ、かつ配列番号５６を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４９または配列番号５０、または配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号３に記載の配列を含むか、またはそれからなるか、または配列番号４に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号２１に記載標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0162】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号９６に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７もしくは８２に記載の配列を含むか、またはそれからなるか、または配列番号８もしくは８３に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、または８６に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0163】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号９６に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４９または配列番号５０、または配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７もしくは８２に記載の配列を含むか、またはそれからなるか、または配列番号８もしくは８３に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、または８６に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0164】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号９６に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号８４を含むか、またはそれからなる第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７もしくは８２に記載の配列を含むか、またはそれからなるか、または配列番号８もしくは８３に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、または８６に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0165】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号９７に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号６８に含まれ、かつ配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号８５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７もしくは８２に記載の配列を含むか、またはそれからなるか、または配列番号８もしくは８３に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、または８６に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0166】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号９７に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４９または配列番号５０、または配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７もしくは８２に記載の配列を含むか、またはそれからなるか、または配列番号８もしくは８３に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、または８６に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0167】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号９７に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、配列番号８４を含むか、またはそれからなる第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７もしくは８２に記載の配列を含むか、またはそれからなるか、または配列番号８もしくは８３に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号１３、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、８４、または８６に記載の標的ハイブリダイズ配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0168】

別の好ましい組み合わせは、標的ハイブリダイズ配列が配列番号８または配列番号８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４９または配列番号５０、または配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７または配列番号８または配列番号８２または配列番号８３に記載の配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号２１に記載の配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0169】

別の好ましい組み合わせは、標的ハイブリダイズ配列が配列番号８または配列番号８３を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号７０に含まれ、かつ配列番号４６または配列番号４７または配列番号４８または配列番号４９または配列番号５０または配列番号５１を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７または配列番号８または配列番号８２または配列番号８３に記載の配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号３４または配列番号８４または配列番号８６に記載の配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0170】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号９６に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６８に含まれ、かつ配列番号８５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７または配列番号８または配列番号８２または配列番号８３に記載の配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号３４または配列番号８４または配列番号８６に記載の配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0171】

別の好ましい組み合わせは、長さが１５～３３個の連続した核酸塩基であり、配列番号９７に含まれ、かつ配列番号１０１を含む第１の標的ハイブリダイズ配列を含む第１の増幅オリゴマーと、長さが約１５～約３３個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６８に含まれ、かつ配列番号８５を含む第２の標的ハイブリダイズ配列を含む第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。より好ましい組み合わせは、配列番号７または配列番号８または配列番号８２または配列番号８３に記載の配列を含むか、またはそれからなる第１の増幅オリゴマーと、配列番号３４または配列番号８４または配列番号８６に記載の配列を含むか、またはそれからなる第２の増幅オリゴマーとの組み合わせである。この実施形態によれば、第１および第２の増幅オリゴマーのこれらの組み合わせは、検出プローブ、適切には、その標的ハイブリダイズ配列が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９に記載の配列を含むか、またはそれからなる検出プローブと組み合わせて使用することができる。

【0172】

増幅産物の検出は、増幅された標的配列に特異的に関連するシグナルを検出するための様々な方法によって達成され得る。核酸は、検出可能な電気的変化などの物理的変化をもたらす表面と会合されてもよい。増幅された核酸は、それらをマトリクスの中または上で濃縮し、核酸またはそれらと関連する色素（例えば、臭化エチジウムまたはサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出するか、または溶液相中の核酸と関連する色素の増加を検出することによって検出され得る。他の検出方法は、増幅産物中の配列に特異的にハイブリダイズし、プローブ：産物複合体の存在を検出するように構成された核酸検出プローブを使用してもよく、または増幅産物と関連する検出可能なシグナルを増幅させ得るプローブの複合体を使用することによる（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号、および同第５，８４９，４８１号）。増幅産物と特異的に会合する直接的または間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。

【0173】

相補的な増幅配列にハイブリダイズする検出プローブ（標識されている）は、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴマー、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドの組み合わせを含むオリゴマー、または修飾された骨格で合成されたオリゴマー、例えば、１つ以上の２’－メトキシ置換リボヌクレオチドを含むオリゴマーであってもよい。増幅配列の検出に使用されるプローブは、非標識で間接的に（例えば、プローブ上の部分への別の結合パートナーの結合によって）検出されてもよく、または様々な検出可能な標識で標識されてもよい。転写媒介増幅（ＴＭＡ）を使用したある特定の実施形態など、ＢＶを診断するための方法のいくつかの実施形態では、検出プローブは、線状化学発光標識プローブ、より好ましくは、線状アクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブである。検出ステップはまた、例えば、その核酸塩基配列の全部または一部分など、増幅配列に関する追加の情報を提供し得る。検出は、増幅反応が完了した後に実施され得るか、または標的領域を例えばリアルタイムで増幅させることと同時に実施され得る。一実施形態では、検出工程は、混合物から非ハイブリダイズプローブを除去することなく、ハイブリダイズされたプローブの検出などの均質な検出を可能にする（例えば、米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号を参照されたい）。

【0174】

増幅ステップの終わり近くまたは終わりに増幅産物を検出する実施形態では、増幅産物へのプローブのハイブリダイゼーションを示すシグナルを提供するために、線状検出プローブを使用してもよい。そのような検出の一例は、標的核酸にハイブリダイズする発光標識されたプローブを使用する。次いで、発光標識は、非ハイブリダイズプローブから加水分解される。検出は、照度計を使用した化学発光によって実施される。（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ ８９／００２４７６号を参照されたい）。リアルタイム検出を使用する他の実施形態では、検出プローブは、例えば、プローブが増幅産物に結合するときに検出されるレポーター部分で標識される分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブなどのヘアピンプローブであってもよい。そのようなプローブは、標的ハイブリダイズ配列および非標的ハイブリダイズ配列を含み得る。そのようなプローブの様々な形態が以前に記載されている（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６／００６８４１７Ａ１号および同第２００６／０１９４２４０Ａ１号を参照されたい）。

【0175】

バベシア種を標的とする増幅ベースの検出アッセイを含むある特定の実施形態では、この方法は、バベシア種の増幅産物に特異的にハイブリダイズする１つ以上の検出プローブを利用する。特定の変形形態では、バベシア種に特異的な検出プローブオリゴマーは、長さが約１４～約４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、配列番号５９のＲＮＡ同等物、配列番号５９の相補体、配列番号５９の相補体のＲＮＡ同等物、配列番号６５、配列番号６５のＤＮＡ同等物、配列番号６５の相補体、もしくは配列番号６５の相補体のＤＮＡ同等物に含まれる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含む。

【0176】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号５９の配列を含み、かつ少なくとも配列番号３７、４２、または９９の配列を含む。

【0177】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６５の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号５９、９４または９９の配列を含む。

【0178】

適切には、検出プローブオリゴマーは、長さが１６～２５個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６５、もしくはそのＤＮＡ同等物に特異的にハイブリダイズするか、または配列番号６５の相補体、もしくはそのＤＮＡ同等物に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。

【0179】

適切には、検出プローブオリゴマー配列は、配列番号５９、９４、または９９を含むか、またはそれからなるヌクレオチド配列をさらに含む。

【0180】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９からなる群から選択される配列からなる。

【0181】

適切には、検出プローブオリゴマーは、ヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つに２’メトキシ修飾をさらに含む。

【0182】

核酸塩基検出アッセイの使用を含む方法のいくつかの実施形態では、バベシア種を検出するために非増幅ベースのアッセイが使用される。いくつかのこのような実施形態では、非増幅ベースのアッセイは、特定の検出プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを含むハイブリダイゼーションアッセイである。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実施する方法は、当技術分野において十分に開発されてきた。ハイブリダイゼーションアッセイの手順および条件は、用途に応じて異なり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００２）、およびＢｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）を参照するものを含む、既知の一般的結合方法に従って選択される。一般的に、プローブと試料とは、特定の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合され、その後、プローブのそれぞれの標的への特定のハイブリダイゼーションが検出される。核酸ハイブリダイゼーションは、様々なアッセイ形式に適応可能である。適切な形式の１つは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応可能なサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチ型アッセイの主要な構成要素は、非標識でＤＮＡ配列の一部に相補的な固定化核酸プローブに吸着または共有結合した固体支持体である。標的核酸は固定化プローブにハイブリダイズし、第２の標識検出プローブ（固定化された非標識核酸プローブがハイブリダイズする同じＤＮＡ鎖の第２のおよび異なる領域に相補的である）が、［標的核酸］：［固定化プローブ］二本鎖にハイブリダイズして、標的アクサンを検出する。別の例示的な形式は、シグナルトランスデューサとして適切な電極表面に固定化された非標識検出プローブにハイブリダイズした標的核酸の電気化学的検出を利用する。例えば、Ｄｒｕｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１１９２，２００３；Ｇｏｏｄｉｎｇ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １４：１１４９，２００２；Ｗａｎｇ，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４６９：６３，２００２；Ｃａｇｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｓ ９：３１２２，２００９；Ｋａｔｚ ａｎｄ Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １５：９１３，２００３；Ｄａｎｉｅｌｓ ａｎｄ Ｐｏｕｒｍａｎｄ，Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ １９：１２３９，２００７を参照されたい。

【0183】

ハイブリダイゼーションアッセイを含むある特定の実施形態では、検出プローブはバベシア種の検出に利用される。このような実施形態では、バベシア種を検出するためのプローブオリゴマーは、長さが約１４～約４０個のヌクレオチドであり、配列番号５９、配列番号５９のＲＮＡ同等物、配列番号５９の相補体、配列番号５９の相補体のＲＮＡ同等物、配列番号６５、配列番号６５のＤＮＡ同等物、配列番号６５の相補体、もしくは配列番号６５の相補体のＤＮＡ同等物に含まれる標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成される標的ハイブリダイズ配列を含む。

【0184】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号５９の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号４２、９２、９４または９９の配列を含む。

【0185】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号５９の配列を含み、かつ少なくとも配列番号３７、４２、または９９の配列を含む。

【0186】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６５の配列に含まれ、かつ少なくとも配列番号５９、９４または９９の配列を含む。

【0187】

適切には、検出プローブオリゴマーは、長さが１６～２５個の連続したヌクレオチドであり、配列番号６５、もしくはそのＤＮＡ同等物に特異的にハイブリダイズするか、または配列番号６５の相補体、もしくはそのＤＮＡ同等物に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。

【0188】

適切には、検出プローブオリゴマー配列は、配列番号５９、９４、または９９を含むヌクレオチド配列をさらに含む。

【0189】

適切には、検出プローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、５９、６０、９１、９２、９３、９４、９８、または９９からなる群から選択される配列からなる。

【0190】

適切には、検出プローブオリゴマーは、ヌクレオチド配列のヌクレオチド残基メンバーのうちの少なくとも１つに２’メトキシ修飾をさらに含む。

【0191】

いくつかの実施形態では、バベシア種の検出のための非増殖ベースのアッセイは、非標的ハイブリダイズフラップ領域を含むプローブオリゴヌクレオチドが、フラップエンドヌクレアーゼによって重複依存的様式で切断され、その後検出される切断産物を放出する切断ベースのアッセイである。例示的な切断ベースのアッセイ試薬は、例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２９２－２９６，１９９９），Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４：１３５－１４４，１９９９）、およびＡｌｌａｗｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３４４３－３４４７，２００６）の記載されている。

【0192】

フラップエンドヌクレアーゼ反応の適切な条件は既知であるか、または当技術分野において既知の方法を使用して容易に決定することができる（例えば、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１３８－７２１３９４，１９９９を参照されたい）。この方法で使用できる例示的なフラップエンドヌクレアーゼには、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、哺乳動物ＦＥＮ－１、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＦＥＮ－１、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＦＥＮ－１、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｉｉｒｉｏｓｕｓ ＦＥＮ－１、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＦＥＮ－１、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＦＥＮ－１、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＴＨ１、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＡＤ２７、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ｒａｄ２、バクテリオファージＴ５ ５’－３’エキソヌクレアーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ ＦＥＮ－１、ヒトエンドヌクレアーゼ１、子ウシ胸腺５’－３’エキソヌクレアーゼ、真正細菌、真核生物、および古細菌におけるそれらの同族体、例えば構造特異的酵素のクラスＩＩファミリーのメンバー、ならびにその酵素的に活性な変異体または改変体を含めるものが挙げられる。フラップエンドヌクレアーゼの説明は、例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：７７８－７８３，１９９３；Ｅｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６７３－６７６，２００１；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ．Ｓｃｉ．２３：１７１－１７３，１９９８；Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１３８７－２１３９４，１９９９；Ｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２４６９３－２４７００，２０００；Ａｌｌａｗｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２８：５３７－５５４，２００３；Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２３４８７－２３４９６，２００３；およびＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４５０－４５６，２００４で見出すことができる。

【0193】

ある特定の変形形態では、切断ベースのアッセイは、バベシア種のＲＮＡ標的核酸を検出し、切断ベースのアッセイは、切断可能なフラップエンドヌクレアーゼおよびＲＮＡ：ＤＮＡ線状二本鎖構造を利用する。いくつかの代替実施形態では、切断ベースのアッセイは、バベシア種のＤＮＡ標的核酸を検出し、切断ベースのアッセイは、切断可能なフラップエンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ：ＤＮＡ線状二本鎖構造を利用する。ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖を切断することができる例示的なフラップエンドヌクレアーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属のポリメラーゼ欠損５’ヌクレアーゼ、ならびに例えばＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＢＮ（ＴａｑポリメラーゼのＢｓｔＸ－Ｎｏｔｌ欠失、米国特許第５，６１４，４０２号を参照）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＩＩ（完全長Ｔａｑポリメラーゼの「ＡＧ」変異体、米国特許第５，６１４，４０２号を参照）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＶＩＩ（完全長Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼの合成欠損突然変異）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＩＸ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ欠損変異体）、およびＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）ＸＩＩ（ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの断片から構築されたポリメラーゼ欠損キメラポリメラーゼ）などの特定のＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）酵素（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられる。ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を切断できる例示的なフラップエンドヌクレアーゼとしては、上記のフラップエンドヌクレアーゼ、ならびにＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）２．０（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＦＥＮ－１）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）２．１ （Ｃ末端に６つのヒスチジンを含むＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＦＥＮ－１）、ＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）３．０（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ ＦＥＮ－１）、およびＣＬＥＡＶＡＳＥ（登録商標）３．１（Ｃ末端に６つのヒスチジンを含むＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ ＦＥＮ－１）が挙げられる。

【0194】

いくつかの実施形態では、切断ベースのアッセイは、バベシア種のＲＮＡ標的核酸を検出し、このアッセイは、ＲＮＡ標的領域のＤＮＡ相補体を合成するための工程を含み、このｃＤＮＡ鎖は、次に重複する第１および第２のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、フラップエンドヌクレアーゼによる切断のための線状二本鎖切断構造を形成する。ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を使用して、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成するための反応条件は、当該技術分野において周知である。

【0195】

核酸ベースの検出アッセイを利用するある特定の実施形態では、この方法は、試料中の他の成分からバベシア種標的核酸を精製することをさらに含む。そのような精製は、試料中に含まれる生物を他の試料成分から分離および／または濃縮する方法を含み得る。特定の実施形態では、標的核酸を精製することは、標的核酸を捕捉して、標的核酸を他の試料成分から特異的または非特異的に分離することを含む。非特異的標的捕捉法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的沈殿、他の試料成分を除去するために洗浄される支持体への核酸の付着、またはバベシア種の核酸および他の試料成分を含む混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を伴ってもよい。

【0196】

いくつかの実施形態では、バベシア種の標的核酸は、この標的核酸を捕捉プローブオリゴマーにハイブリダイズさせることにより、他の試料成分から分離される。捕獲プローブオリゴマーは、標的核酸に特異的または非特異的にハイブリダイズして、他の試料成分から分離された［標的核酸］：［捕獲プローブ］複合体を形成するように構成された標的ハイブリダイズ配列を含む。標的核酸の非特異的捕捉に適した標的ハイブリダイズ配列を含む捕捉プローブは、例えば、ＷＯ２００８／０１６９８８に記載されている。バベシア種標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列（複数可）を含むいくつかの特定の変形形態では、バベシア特異的捕捉プローブは、（ｉ）配列番号７８の配列に含まれる約１５～約２１個の連続したヌクレオチドであるか、または（ｉｉ）配列番号７８の配列を含む約２１～３０個の連続したヌクレオチドであるか、または（ｉｉｉ）この配列が配列番号４４からなる、標的ハイブリダイズ配列を含む。好ましい変形形態では、捕捉プローブは、［標的核酸］：［捕捉プローブ］複合体を固定化プローブに結合させて、［標的核酸］：［捕捉プローブ］：［固定化プローブ］複合体を形成し、これが、試料から分離され、任意に洗浄されて非標的試料成分を除去する（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号、同第６，２８０，９５２号、および同第６，５３４，２７３号を参照されたい）。このような変形形態では、捕捉プローブオリゴマーは、捕捉プローブをその結合した標的配列と共に、固体支持体に結合した固定化プローブに結合させ、それにより、ハイブリダイズされた標的核酸が他の試料成分から分離されることを可能にする部分をさらに含む。

【0197】

より具体的な実施形態では、捕捉プローブオリゴマーは、米国特許第６，１１０，６７８号で以前に記載されているように、標的核酸に相補的ではないが、固定化プローブ上の外列に特異的にハイブリダイズし、それにより、標的核酸が他の試料成分から分離されることを可能にするテール部分（例えば、３’テール）を含む。任意の配列は、一般に、約５～５０ｎｔの長さであるテール領域で使用されてもよく、好ましい実施形態は、固体支持体、例えば、マトリクスまたは粒子に結合した相補的な固定化配列（例えば、ポリ－Ｔ）に結合する、約１０～４０ｎｔ（例えば、Ａ１０～Ａ４０）、より好ましくは約１４～３３ｎｔ（例えば、Ａ１４～Ａ３０またはＴ３Ａ１４～Ｔ３Ａ３０）の実質的にホモポリマーのテールを含む。バベシア種標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された標的ハイブリダイズ配列を含むいくつかのこのような実施形態では、バベシア特異的捕捉プローブは、配列番号４３のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。

【0198】

標的捕捉は、典型的には、ハイブリダイズ条件下で、通常、［テール配列］：［固定化プローブ配列］二本鎖のＴｍよりも高い温度で、標的配列にハイブリダイズする１つ以上の捕捉プローブオリゴマーを含む液相混合物中で行う。捕捉プローブテールを含む実施形態では、捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズし、次いで、固体支持体上の複合体全体が他の試料成分から分離されるように、ハイブリダイゼーション条件を調節することによって、［標的核酸］：［捕捉プローブ］複合体が捕捉される。結合した［固定化プローブ］：［捕捉プローブ］：［標的核酸］を有する支持体は、１回以上洗浄されて、他の試料成分をさらに除去してもよい。好ましい実施形態は、常磁性ビーズなどの粒子状固体支持体を使用し、これにより、結合した［標的核酸］：［捕捉プローブ］：［固定化プローブ］複合体を有する粒子は、洗浄溶液中に懸濁し、洗浄溶液から、好ましくは磁気引力を使用することによって回収され得る。増幅ベースの検出アッセイの使用を含む方法の実施形態では、取り扱い工程の数を制限するために、支持体上の複合体中の標的核酸を増幅オリゴマーと単に混合して、増幅工程を進めることによって、標的核酸が増幅されてもよい。

【0199】

バベシア種の検出が被験者のバベシア症を示す、バベシア症の診断方法のいくつかの実施形態では、この方法は、被験者のバベシア症を治療することをさらに含む。バベシア症の治療計画は一般に当技術分野において知られており、例えば、抗寄生虫薬の投与または補助療法としての赤血球交換輸血が含まれる。ある特定の変形形態では、被験者は以前にバベシア症と診断されていない。他の実施形態では、被験者は以前にバベシア症と診断されており、本開示の診断方法が実施される時点でバベシア症の治療を受けている。このような変形形態は、被験者のバベシア症の治療を監視するのに特に有用である。例えば、方法が被験者にバベシア症がまだ存在することを示している場合、被験者は治療を継続することができる。いくつかの実施形態では、同じ治療計画（すなわち、被験者が本診断方法の実施時に受けている同じ治療）が被験者に再度施される。あるいは、治療を受けている被験者におけるバベシア症の継続的な存在は、進行中の治療の変更が必要であり、異なる治療計画（例えば、異なる薬物療法、または増加した用量および／または薬物の頻度）が被験者に施される。

【0200】

本開示によれば、バベシア種の存在または非存在を検出することは、別個に（例えば、別個の反応容器内で）実行されても、または多重反応システムとして別のアッセイと一緒に実行されてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法（例えば、バベシア症を診断する方法）は多重反応を利用し、ここでは、反応混合物が複数（例えば、少なくとも２、３、４つ、またはそれ以上）の異なる標的配列を並行してアッセイするための試薬を含む。これらの場合、反応混合物は、検出アッセイを実行するための複数の異なる標的特異的オリゴヌクレオチドを含んでもよい。例えば、増幅ベースの検出アッセイを利用する方法では、多重反応は、増幅オリゴマーの複数のセット（例えば、複数のペア）を含む場合がある（例えば、ＰＣＲプライマーの複数のペアまたはＴＭＡ増幅オリゴマーの複数のペア（例えば、ＴＭＡ、プロモータープライマーと非プロモータープライマーとの複数のペア、またはプロモータープロバイダーと非プロモータープライマーとの複数のペア）。切断ベースの検出アッセイを利用する他の実施形態では、多重反応は、異なるフラップを有する複数のプローブオリゴヌクレオチド、複数の異なる重複プローブオリゴヌクレオチド、および異なるフラップを、一旦それらが切断されると検出するための複数の異なるＦＲＥＴカセットを含み得る。

【0201】

本明細書に記載のオリゴマーの組み合わせは、オリゴマーを含む反応混合物またはキットの形態であってもよい。反応混合物またはキットは、例えば、捕捉プローブ核酸または捕捉プローブ核酸のアレイなどの多くの任意の成分をさらに含んでもよい。増幅反応混合物に関して、反応混合物は、典型的には、例えば、緩衝液、塩溶液、適切な三リン酸ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）、ならびに／または酵素（例えば、逆転写酵素および／もしくはＲＮＡポリメラーゼ）などのインビトロ増幅を実施するのに適した他の試薬を含み、典型的には、バベシア種標的核酸が存在しても、ｍたは存在しなくてもよい試験試料成分を含むであろう。バベシア種の増幅のためのオリゴマー組み合わせを含むキットはまた、例えば、緩衝液、塩溶液、適切な三リン酸ヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）、ならびに／または酵素（例えば、逆転写酵素および／もしくはＲＮＡポリメラーゼ）などのインビトロ増幅を実施するのに適した他の試薬を含んでもよい。検出プローブと共に共通の標的核酸を標的とする増幅オリゴマーの組み合わせを含むオリゴマーの組み合わせ（例えば、反応混合物またはキット）の場合、増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって連結されている（すなわち、この組み合わせは、増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう）。

【0202】

バベシア核酸の検出のための組成物、方法、反応混合物、システム、キットなどは、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。

【実施例】

【0203】

「試料輸送溶液」とは、一般に、試料を保存するために配合された溶液を指し、場合によっては、試料中の１つ以上の細胞型を少なくとも部分的に溶解するように配合されている。１つの例示的な試料輸送溶液は、ｐＨ６．７で、１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、および１１０ｍＭのラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）を含む溶液を指す。別の例示的な試料輸送溶液は、ｐＨ７．５で、１００ｍＭのＴＲＩＳ、３０ｍＭの塩化マグネシウム、および６％（ｖ／ｖ）のＬＬＳの水溶液を含む。別の例示的な試料輸送溶液は、ｐＨ７．４で、１４ｍＭの重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭの塩化マグネシウム、５％（ｖ／ｖ）のＬＬＳ、および０．１ｍＭのＥＤＴＡの水溶液を含む。試料輸送溶液の他の配合物も同様に機能し得る。

【0204】

「標的捕捉試薬」とは、一般に、溶液からの核酸の捕捉を容易にする多くの成分を含む溶液を指す。１つの例示的な標的捕捉試薬は、ｐＨ６．４で、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３１０ｍＭの水酸化リチウム、１．８８Ｍの塩化リチウム、１００ｍＭのＥＤＴＡ、およびｄＴ_１４オリゴマーがそれに共有結合した２５０μｇ／ｍｌの磁性粒子（１ミクロンのＳＥＲＡ－ＭＡＧ（商標）ＭＧ－ＣＭ粒子、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。別の例示的な標的捕捉試薬は、７９０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４５３ｍＭの水酸化リチウム、１０％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、２３０ｍＭのコハク酸、０．０３％（ｗ／ｖ）のＦｏａｍ Ｂａｎ ＭＳ－５７５、およびｄＴ_１４オリゴマーが共有結合した０．０１２５％（ｗ／ｖ）の磁性粒子（１ミクロンのＳＥＲＡ－ＭＡＧ（商標）ＭＧ－ＣＭ粒子、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。標的捕捉試薬の他の配合物も同様に機能し得る。

【0205】

「洗浄溶液」とは、一般に、ｐＨ７．５で１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、６．５ｍＭの水酸化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン、および０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウムを含む溶液を指す。

【0206】

「プローブ試薬」とは、一般に、１つ以上の標識検出プローブを含む溶液を指す。１つの例示的なプローブ試薬は、ｐＨ４．７で、約７５～約１００ｍＭのコハク酸リチウム、２％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、１５ｍＭのメルカプトエタンスルホネート、１．２Ｍの塩化リチウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ、および３％（ｖ／ｖ）のエタノールで構成された溶液である。別の例示的なプローブ試薬は、ｐＨ４．１～４．３で、約７５～約１００ｍＭのコハク酸リチウム、３．５％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、７５ｍＭの水酸化リチウム、１５ｍＭのアルドリチオール－２、１．０Ｍの塩化リチウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、および３．０％（ｖ／ｖ）のエタノールで構成された溶液である。他の配合物も同様に働くことができる。

【0207】

「増幅試薬」は、一般に、増幅反応を促進するための反応成分の濃縮混合物を指す。増幅試薬は、例えば増幅の種類（ＰＣＲ、ＴＭＡなど）、標的核酸（ＧＣ含有量）などの要因に応じて、様々な濃度の多数の異なる試薬を含むであろう。１つの例示的な増幅試薬は、ｐＨ７．５～７．６で、４７．６ｍＭのＮａ－ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭのＮ－アセチル－Ｌ－システイン、２．５％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ－１００、５４．８ｍＭのＫＣｌ、２３ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＮａＯＨ、０．３５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、７．０６ｍＭのｒＡＴＰ、１．３５ｍＭのｒＣＴＰ、１．３５ｍＭのＵＴＰ、８．８５ｍＭのｒＧＴＰ、０．２６ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、２．９％のトレハロース、０．２２５％のエタノール、０．０７５％のメチルパラベン、０．０１５％のプロピルパラベン、および０．００２％のフェノールレッドを含む。別の例示的な増幅試薬は、ｐＨ８．２５～８．４５で、１９．１ｍＭのＴｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ、７．５ｍＭのＴｒｉｚｍａ塩酸塩、２３．３ｍＭのＫＣｌ、２１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、６．５ｍＭのｒＡＴＰ、４．０ｍＭのｒＣＴＰ、４．０ｍＭのＵＴＰ、６．５ｍＭのｒＧＴＰ、３．３３％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．０５ｍＭの酢酸亜鉛、６ｐｐｍのＰｒｏ Ｃｌｉｎ ３００防腐剤を含む。増幅試薬の他の配合物も同様に機能し得る。プライマーが増幅試薬に添加され得るか、または増幅試薬とは別の増幅反応に添加され得る。増幅試薬中の酵素は、単位が以下のように機能的に定義される、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）およびバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのうちの１つ以上を含むことができる。１ＵのＭＭＬＶ－ＲＴが鋳型として２００～４００マイクロモルのオリゴｄＴ－プライムポリ（Ａ）を使用して、３７℃において１０分で１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを組み込み、１ＵのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７プロモーターを含むＤＮＡ鋳型を使用して、３７℃において１時間で１ｎｍｏｌのＡＴＰをＲＮＡに組み込む。

【0208】

「ハイブリダイゼーション試薬」とは、一般に、ｐＨ４～５で、７５～１００ｍＭのコハク酸、２％～３．５％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、７５～１００ｍＭの水酸化リチウム、１４～１６ｍＭのアルドリチオール－２、１．０～１．２Ｍの塩化リチウム、２０～１０００ｍＭのＥＤＴＡ、および２．０～４．０％（ｖ／ｖ）エタノールのおよその範囲の濃度を有する試薬をから構成される溶液を指す。ハイブリダイゼーション試薬用の他の配合物も同様に機能し得る。

【0209】

「選択試薬」は、一般に、ｐＨ８．５で６００ｍＭのホウ酸、１８２．５ｍＭの水酸化ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００）を含む溶液を指す。

【0210】

「検出試薬」は、一般に、１ｍＭの硝酸および３２ｍＭの過酸化水素を含む溶液を指す「検出試薬Ｉ」、ならびに一般に、１．５Ｍの水酸化ナトリウムの溶液を指す「検出試薬ＩＩ」を含む。

【0211】

実施例１：初期オリゴスクリーニング
目的：
バベシアの種（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉおよびＢ．ｖｅｎａｔｏｒｕｍを含む）を増幅し、かつ特異的に検出する能力を有するプライマー－プローブ組み合わせを特定するために、転写媒介増幅（ＴＭＡ）およびハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）のための手動Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ｅＳＡＳ）を使用して、非Ｔ７およびＴ７プライマーならびにプローブをスクリーニングした。このアッセイは、これらのバベシア種を区別しない。反応性の結果は、試料がバベシアに陽性であることを示している。

【0212】

材料および方法
Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ（配列番号６１）、Ｂａｂｅｓｉａ ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ（配列番号６２）、およびＢａｂｅｓｉａ ｄｕｎｃａｎｉ（配列番号６３）に対してインビトロ転写物（ＩＶＴ）を使用した手動ＰｒｏｃｌｅｉｘシステムでＴＭＡを使用して、初期プライマースクリーニングを実施した。この試験の反応は、増幅工程で開始した。アッセイラックは１０列の１０チューブユニット（ＴＴＵ）からなっていた。７５マイクロリットルの増幅試薬および表１～３からの１つのＴ７プロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドならびに表１～３からの１つの非Ｔ７プライマーオリゴヌクレオチドのそれぞれ１０ピコモルを、増幅オリゴマーの各組み合わせが、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴ（配列番号６４）を１反応あたり１０，０００コピーで、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ、およびＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴを反応あたり１５コピーのそれぞれの２つのレプリケートで試験されるように、ラック上の適切なチューブに添加した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、バベシアとマラリア原虫間の保存された領域のために、交差反応性検体として最初のスクリーニングに含まれていた。増幅および検出システムがバベシアに特異的であることを判断する必要がある。反応ごとの標的コピーを達成するために、緩衝液で希釈した１ｅ６ｃ／ｍＬのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴの１０μＬを適切なチューブにスパイクし、緩衝液で希釈した１．５００ｃ／ｍＬのバベシア種ＩＶＴの１０μＬを適切なチューブにスパイクした。プライマーの様々な組み合わせを試験した。このセットアップでは、ラックごとに１０種のプライマーの組み合わせを可能にする。プライマーの組み合わせおよびＩＶＴをスパイクしたら、２００μＬのオイルを各チューブに添加し、次いでラックをシーリングカードで覆い、最低２０秒間ボルテックスした。

【0213】

次いで、ラックを６０±１℃の水浴で１０±１分間インキュベートした後、４１．５±１℃の水浴で９～２０分間インキュベートした。ラックを水浴に入れたまま、シーリングカードを取り外し、市販のＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素試薬（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）２５μＬを各反応チューブに添加し、その後、シーリングカードで再び覆った。ラックを静かに振とうして混合し、シーリングカードで再び覆い、４１．５±１℃の水浴でさらに６０±５分間インキュベートした。

【0214】

インキュベーションが完了したら、ラックをハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）領域に移し、そこでシーリングカードを取り外した。１つのアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブ（表１～３）からなる１００μＬのプローブ試薬を、ハイブリダイゼーション試薬への反応ごとに合計５ｅ６相対光単位（ＲＬＵ）の所望の濃度で添加した。次いで、プローブ試薬を適切な反応チューブに添加した。チューブをシーリングカードで覆い、ラックを最低２０秒間ボルテックスし、その後ラックを６１±２℃水浴で１５±１分間インキュベートした。

【0215】

ラックを水浴から取り出し、シーリングカードを取り外し、市販のＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ選択試薬（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）２５０μＬを各チューブに添加した。チューブをシーリングカードで覆い、最低２０秒間ボルテックスし、その後６１±２℃水浴に戻し、１０±１分間インキュベートした。インキュベーション後、ラックを２３±４℃の水浴で最低１０分間冷却した。

【0216】

検出のために、ＴＴＵをラックから取り外して、市販のＰｒｏｃｌｅｉｘ Ａｕｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ １および２試薬（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を使用したその後の消光のために自動リーダー機器に充填し、結果を相対光単位（ＲＬＵ）でのシグナル分析用にエクスポートした。

【0217】

グループ１ａおよびグループ１ｂ（表１）でスクリーニングされたプライマーは、両方の検出プローブ配列番号３７および３９を使用して、配列番号１２～１６、１８および１９～２１のそれぞれと対になった配列番号３および配列番号５のプロモータープロバイダーオリゴマーのそれぞれであった。各ラックは、システム配列番号１、１１、および３７を対照として使用した。

【0218】

【表1】

【0219】

グループ２（表２）でスクリーニングされたプライマーは、配列番号３９の検出プローブを使用して配列番号２２～３１、７５および７６のプライマーのそれぞれと対になった配列番号３プロモータープロバイダーであった。各ラックは、システム配列番号３、配列番号２１、および配列番号３９を対照として使用した。

【0220】

【表2】

【0221】

グループ３（表３）でスクリーニングされたプライマーは、配列番号２１、２７および２９のプライマーと配列番号３８、４０および４１の検出プローブとのそれぞれと対になった配列番号１のプロモータープロバイダー；配列番号２１、２７および２９のプライマーと配列番号３８および４０の検出プローブとのそれぞれと対になった配列番号３のプロモータープロバイダー；ならびに配列番号２１のプライマー１と配列番号３９の検出プローブと対になった配列番号３、７、および９のプロモータープロバイダーのそれぞれであった。

【0222】

【表3】

【0223】

結果：
スクリーニングからの理想的な候補は、全ての複製物に対して１，０００，０００ＲＬＵまたはそれ以上で一貫して検体シグナルを有するバベシア種ＩＶＴ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよびＢ．ｄｕｎｃａｎｉ）に対して反応性があり、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＩＶＴおよび１０，０００ＲＬＵ未満の検体シグナルを有する検体を含む陰性試料に対して陰性であると予想された。バベシアでは１，０００，０００ＲＬＵ近くの、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよび陰性試料では３０，０００ＲＬＵ未満を有する一部の候補も考慮された。

【0224】

グループ１ａでスクリーニングされたプライマーおよび検出プローブでは、全てのプライマー－プローブの組み合わせが一貫して全ての種を増幅および検出したわけではなく、一部の組み合わせは陰性試験体（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよび陰性試料）に対して高い検体シグナルをもたらした。このグループの検体ＲＬＵの結果を表４に列挙している。このグループの好ましい候補は、配列番号１３、２０または２１のプライマーと対となり、かつ配列番号３７の検出プローブを使用した配列番号３のプロモータープロバイダー、および配列番号２１プライマーと配列番号３９の検出プローブと対になった配列番号３のプロモータープロバイダーであった。

【0225】

【表4】

【0226】

グループ１ｂでスクリーニングされたプライマーおよび検出プローブでは、全てのプライマー－プローブの組み合わせが一貫して全ての種を増幅および検出したわけではなく、一部の組み合わせは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに対して高い検体シグナルをもたらした。このグループの検体ＲＬＵの結果を表５に列挙している。このグループでの好ましい候補は、配列番号１１または１３のプライマーと対となり、かつ配列番号３７の検出プローブを使用した配列番号５のプロモータープロバイダーであった。

【0227】

【表5】

【0228】

グループ２でスクリーニングされたプライマーおよび検出プローブでは、全てのプライマー－プローブの組み合わせが一貫して全ての種を増幅および検出したわけではなく、一部の組み合わせは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍに対して高い検体シグナルをもたらした。このグループの検体ＲＬＵの結果を表６に列挙している。このグループでの好ましい候補は、配列番号２７、配列番号２８または愛列番号２９のプライマーと配列番号３９の検出プローブとに対になった配列番号３のプロモータープロバイダーであった。

【0229】

【表6】

【0230】

グループ３でスクリーニングされたプライマーおよび検出プローブについての検体ＲＬＵの結果を表７に列挙する。配列番号４０および配列番号４１の検出プローブと対になったプライマーは、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、陰性試料およびバベシア陽性試料に対して高検体シグナルをもたらし、プローブの不良な設計を示している。したがって、配列番号４０および配列番号４１は、追加の例には含まれなかった。配列番号３のプロモータープロバイダーと検出プローブ配列番号３８との組み合わせ（この例で使用したプライマーに関係なく）は、陰性試料で高い検体シグナルをもたらし、プライマープローブの相互作用の可能性が高いため、これらのオリゴマーは追加の例には含まれなかった。追加の検出プローブと共に使用することが考えられる候補は、配列番号２７または２９と配列番号３８の検出プローブと対になった配列番号１のプロモータープロバイダーであった。このグループでスクリーニングされた新しいＴ７プロモータープロバイダーについては、配列番号２１のプライマーと配列番号３９の検出プローブとに対になった配列番号３および７が考慮された。配列番号９のプロモータープロバイダー、配列番号２１のプライマーおよび配列番号３９の検出プローブは、バベシア標的の増幅および検出を示さなかった。

【0231】

【表7】

【0232】

結論：
この初期スクリーニングの結果は、全てのプライマーおよびプローブが全てのバベシア種を確実に増幅および検出するわけではないことを実証した。一部の候補はバベシアに特異的ではなく、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのいくらかの増幅を示したが、他の候補は偽陽性、偽陰性および／またはプライマー－プローブ相互作用を示した。増幅および検出システムの初期スクリーニングにより、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよびＢ．ｄｕｎｃａｎｉの高感度かつ特異的な検出を示すいくつかの候補が特定された。これらの候補は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍと交差反応せず、システムの特異性をさらに実証している。この例からの高感度かつ特異的な組み合わせは、さらなる感度および特異性の評価のために考慮された。

【0233】

実施例２：バベシアアッセイのための二次オリゴスクリーニング
目的：
手動Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ｅＳＡＳ）を使用したバベシアアッセイについて実施例１で特定された候補の増幅組み合わせを、完全自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍでスクリーニングし、バベシア種のインビトロ転写物（ＩＶＴ）を使用して、特異性および感度の観点から最適な候補を決定した。
材料および方法

【0234】

候補増幅システムを、自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）で試験した。試験された増幅および検出オリゴマーの組み合わせを表８に列挙している。各オリゴの配列を表９に列挙している。合計８種の条件をスクリーニングした。スクリーニングされた候補を、陰性パネルの４５複製物およびＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよびＢ．ｄｕｎｃａｎｉについての３０ｃ／ｍｌで希釈したバベシアインビトロ転写物（ＩＶＴ）（それぞれ配列番号６１、６２、および６３）の６複製物に対して試験した。５００ｃ／ｍＬのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉのＩＶＴパネルを含むアッセイキャリブレーターが、分析用の検体のカットオフを決定するために含まれた。アッセイソフトウェアは、検体カットオフを使用して、試料が反応性か、または非反応性かを判定する。カットオフ比が１を超えるシグナルを有する試料は反応性とみなされ、一方１未満のものは非反応性とみなされる。使用したアッセイ試薬は、次のものが含んだ：反応あたり５ピコモルの濃度で添加された単一の標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）で構成される標的捕捉試薬（ＴＣＲ）、１反応あたり１０ピコモルの濃度でそれぞれ添加された１つのＴ７プロモータープロバイダーと１つの非Ｔ７プライマーとを含む増幅試薬、溶液に対する反応ごとに５ｅ６相対光単位（ＲＬＵ）の合計濃度で添加された１つのアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブからなるプローブ試薬、酵素試薬、および選択試薬。

【0235】

実施例１で特定された候補システムをフォローアップするために、第２ラウンドのオリゴスクリーニングを実施した。このグループで試験された条件を、表１０に列挙している。各オリゴの配列を表１１に列挙している。合計６種の追加条件をスクリーニングした。スクリーニングされる条件を、陰性試料の８複製物およびＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよびＢ．ｄｕｎｃａｎｉのそれぞれについての１００、３０、および１０ｃ／ｍｌで希釈したバベシアインビトロ転写物（ＩＶＴ）の７複製物に対して試験した。１ｅ６ｃ／ｍＬでのＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＩＶＴの８複製物からなる交差反応性パネルもまた、システムがマラリア原虫の存在下でバベシアに特異的であるかどうかを決定するために試験した。アッセイキャリブレーターは、５００ｃ／ｍＬでのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴパネルから構成された。

【0236】

【表8】

【0237】

【表9】

【0238】

【表10】

【0239】

【表11】

【0240】

結果：
１００，０００ＲＬＵの検体シグナルカットオフを使用して、表１２の条件１～８についてスクリーニングした試験体の反応性を決定した。このカットオフを上回る試料は、反応性とみなされた。条件１および４は、それぞれ２２％および１３％の陰性試験体の偽陽性率をもたらし、プローブとのプライマー相互作用を示している。条件７では、１００％の反応性で、３０ｃ／ｍＬにおけるＢ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓおよびＢ．ｄｕｎｃａｎｉ ＩＶＴを検出できなかった。配列番号１のプロモータープロバイダーを使用したこの例で見られた偽陽性の割合が高いため、代替候補での追加のスクリーニングが実施した。

【0241】

【表12-1】

【0242】

【表12-2】

【0243】

前のラウンドのスクリーニングでは、いくつかの候補者がバベシア種ＩＶＴに対して良好な感度および特異性を示した。条件６は、良好な感度および特異性を有しており、試験されたバベシアＩＶＴ試験体に対して強い検体シグナルを有し、陰性試験体に対して低い検体シグナルを有した。これらのオリゴマーの組み合わせの性能を決定するために、多数の非Ｔ７プライマーと対になった配列番号７のプロモータープロバイダーを使用して、Ｐａｎｔｈｅｒシステムで追加のスクリーニングを実施した。条件１２は、このラウンドでスクリーニングされた条件の中で最高の性能を有した。条件１２は、全てのバベシア種のＩＶＴで試験された全てのレベルで反応性パーセントに関して最高の性能を示し、全てのレベルで最も強いＲＬＵシグナルを示した。条件１２はまた、陰性試験体に対して最低の検体シグナルを有していた。

【0244】

【表13-1】

【0245】

【表13-2】

【0246】

【表13-3】

【0247】

結論：
手動ｅＳＡＳシステムで特定されたいくつかの候補システムは、完全自動化されたＰａｎｔｈｅｒシステムでの二次スクリーニング中にバベシアアッセイバベシア種ＩＶＴに対して良好な特異性および感度をもたらした。他の組み合わせは、不良な感度（条件７）または特異性（条件１および４）を示し、追加のスクリーニングには進まなかった。Ｐａｎｔｈｅｒシステムでの第２ラウンドのスクリーニングは、試験された他の条件よりも優れたバベシア種ＩＶＴの低希釈度において感度が高く、バベシアアッセイの特異性が高い新しいシステム（条件１２）を特定した。

【0248】

実施例３：臨床試料のスクリーニング
目的：
手動Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｅｍｉ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ｅＳＡＳ）でのバベシアアッセイについて以前に特定された候補の増幅組み合わせを、完全自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍでスクリーニングし、バベシア種の臨床試料を使用して、特異性および感度の観点から最適な候補を決定した。この実施例でスクリーニングされたプライマーは、実施例２と同じである。この実験は、最高の性能の候補を決定するための追加の試験として機能した。

【0249】

材料および方法
候補増幅システムを、自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで試験した。試験された組み合わせを、表１４に列挙している。各オリゴの配列を表１５に列挙している。合計８種の条件をスクリーニングした。スクリーニングされる条件は、溶解された陰性全血および希釈されたバベシア感染臨床試料のそれぞれの９複製物で試験した。バベシア臨床試料は、ＰＣＲ陽性バベシア感染ヒト赤血球（ＲＢＣ）試料からなていた。試料は、ｍＬあたりの推定寄生虫値を受容した。ｍＬあたりの推定寄生虫値に基づいて、臨床試料を通常の陰性ヒト全血で希釈して、ｍＬあたり推定３０、１０、および３個の寄生虫にした。希釈したバベシア感染全血を、溶解溶液のＡｐｔｉｍａ尿輸送培地（市販）中で１：６の比率で溶解するか、０．８ｍＬの全血４．８ｍＬの溶解溶液のＡｐｔｉｍａ尿輸送培地中で溶解した。陰性パネルを、同じ手順に従って溶解した。使用したアッセイ試薬は、次のものが含んだ：反応あたり５ピコモルの濃度で添加された単一の標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）で構成される標的捕捉試薬（ＴＣＲ）、１反応あたり１０ピコモルの濃度でそれぞれ添加された１つのＴ７プロモータープロバイダーと１つの非Ｔ７プライマーとを含む増幅試薬、溶液に対する反応ごとに５ｅ６相対光単位（ＲＬＵ）の合計濃度で添加された１つのアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブからなるプローブ試薬、酵素試薬、および選択試薬。

【0250】

このグループで試験された条件を、表１６に列挙している。各オリゴの配列を、表１７に列挙している。合計６種の追加条件をスクリーニングした。条件を、バベシア陰性全血試料および希釈されたバベシア感染全血臨床試料のそれぞれの５複製物で試験した。陰性および陽性の試料を試験する前に、検量線を使用して、バベシア感染臨床試料の寄生虫濃度を推定した。検量線は、既知の標準（定量化されたバベシア陽性全血試験体）の連続希釈液からの溶解物を使用して作成された。臨床試料と既知の標準の段階希釈液を、リアルタイムアッセイを使用して試験した。既知の標準の各希釈液からのＴｔｉｍｅを寄生虫／ｍＬに対してプロットし、等式を作成した。次に、この等式を使用して、同じアッセイを使用して臨床試料を実行したときにＴｔｉｍｅを寄生虫／ｍＬに変換した。臨床試料を、その後、正常な陰性ヒト全血で、１ｍＬあたり推定３０および１０個の寄生虫に希釈した。希釈した臨床試料を、全血１ｍＬと溶解バッファー３ｍＬの比率で溶解した。５００ｃ／ｍＬでのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ ＩＶＴパネルを構成するアッセイキャリブレーターも使用した。上記の実施例で説明したスクリーニングと同様に、単一のＴＣＯを反応あたり５ピコモルでＴＣＲに添加し、１つのＴ７プロモータープロバイダーと１つの非Ｔ７プライマーとを各反応あたり１０ピコモルで増幅試薬に添加した。このラウンドのスクリーニングにおけるプローブ試薬は、反応あたり２．５ｅ６ ＲＬＵの配列番号３７の検出プローブオリゴマーおよび反応あたり５ｅ６ ＲＬＵの配列番号４２の検出プローブオリゴマーから構成されていた。

【0251】

【表14】

【0252】

【表15】

【0253】

【表16】

【0254】

【表17】

【0255】

結果：
１００，０００ＲＬＵの検体シグナルカットオフを使用して、表１８の条件１～８についてスクリーニングした試験体の反応性を決定した。このカットオフを上回る試料は、反応性とみなされた。条件１および４は、溶解した陰性全血試験体でそれぞれ１１％および３３％の割合で偽陽性をもたらした。条件２、５および８は、１ｍＬあたり１０および３個の寄生虫で溶解したバベシア感染臨床試料で１００％未満のバベシアを検出した。配列番号１のプロモータープロバイダーを用いた偽陽性率が高く、性能の低い候補が多数あるため、追加のスクリーニングを行って代替候補を特定した。

【0256】

【表18-1】

【0257】

【表18-2】

【0258】

前のラウンドのスクリーニングでは、ほんの少しの候補が溶解したバベシア感染臨床試料に対して良好な感度および特異性を示した。条件６は、１００％の反応性でｍＬあたり３個の寄生虫まで溶解した臨床試料を検出する良好な特異性および感度を有しており、試験された陽性試験体の強い検体信号と陰性試験体の低い検体信号を伴った。多数の追加の非Ｔ７プライマーと対になった配列番号７プロモータープロバイダーを使用して、追加のスクリーニングをＰａｎｔｈｅｒシステムで実施した。このラウンドのスクリーニングの条件を、臨床試料の溶解希釈液を使用して再度試験した。条件１１以外の全ての条件で、１００％の反応性で３０および１０ｐ／ｍＬの溶解物を検出した。陰性試験体で偽陽性をもたらした条件はなかった。

【0259】

【表19】

【0260】

結論：
実施例２のバベシア種ＩＶＴによる二次スクリーニングおよびこの実施例における臨床試料によるスクリーニングの結果を考慮すると、条件３および６が、特異性および感度の観点で最良の候補であった。条件１２は、条件９～１４でスクリーニングされた条件の中で最高の性能を有した。条件１２は、試験された全てのレベルでの反応性パーセント、およびＰａｎｔｈｅｒシステムでのバベシア種ＩＶＴおよび溶解された臨床試料希釈液で試験された全てのレベルで一貫したＲＬＵシグナルに関して最高の性能を有した。さらに、条件１２は、陰性試験体に対する最も低い検体シグナルを有した。

【0261】

上記から、特定の実施形態が例示のために本明細書に記載されているが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく様々な変更が行われ得ることを理解されたい。したがって、本発明は明示的な開示によって限定されない。本明細書で引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、あらゆる目的で参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0262】

実施例４：バベシアＩＶＴおよびバベシア陽性全血試料スクリーニング
目的：
Ｐｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで候補増幅システムをスクリーニングし、ＩＶＴおよび人為的なバベシア臨床試料を使用して、特異性および感度の観点からオリゴ候補を決定しました。

【0263】

材料および方法
候補増幅システムを、自動化されたＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｐａｎｔｈｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで試験した。試験した組み合わせを、表２０に列挙している。各オリゴの配列を、表２１に列挙している。合計８種の条件をスクリーニングした。３０ｃ／ｍＬまたは１０ｃ／ｍＬのいずれかで、緩衝液中で希釈されたＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ、およびＢ．ｖｅｎａｔｏｒｕｍのインビトロ転写物（配列番号６１、６２、６３、および１００）からなるパネルメンバーの１６このレプリケートを使用して、条件をスクリーニングした。条件はまた、考案された臨床試料のそれぞれの１２複製物に対してスクリーニングした。考案された臨床試料は、バベシア陰性のヒト全血とＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ感染ハムスター全血（アメリカ赤十字社（ＡＲＣ）から取得）との混合物を含んだ。要するに、所定の寄生虫血症値を有するＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ感染ハムスター血液を、バベシア陰性ヒト全血で希釈して、推定４個の寄生虫／ｍＬ（ｐ／ｍＬ）の感染血液混合物を得た。次に、感染した血液混合物を１対３の比率で溶解した（ここでは、ｐＨ７．５で、１００ｍＭのＴＲＩＳ、３０ｍＭの塩化マグネシウム、および６％（ｖ／ｖ）のＬＬＳの水溶液２．７ｍＬに０．９ｍＬの全血を使用する）。溶解された感染血液混合物は、本明細書ではハムスター血液溶解物と称される。いくつかの試験条件では、ハムスター血液溶解物を、陰性溶解物で、０．０１寄生虫／ｍＬに相当するレベルに希釈した。同じ手順に従って、陰性溶解物を調製した。アッセイ陽性キャリブレーターは５００ｃ／ｍＬでのＢ．ｍｉｃｒｏｔｉのインビトロ転写物ＩＶＴ）（配列番号６１）パネルからなっていた。陰性キャリブレーターと陰性緩衝液試験体は、緩衝液のみを含んだ。使用したアッセイ試薬は、次のものが含んだ：反応あたりおよそ５ピコモルの濃度で添加された単一の標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）で構成される標的捕捉試薬（ＴＣＲ）、 各反応あたりおよそ５ピコモルの濃度で添加されたＴ７およびＮＴ７プライマーから構成される増幅試薬、反応ごとにおよそ１ｅ６相対光単位（ＲＬＵ）の合計濃度で添加されたアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識プローブからなるプローブ試薬。市販のＰｒｏｃｌｅｉｘ Ｕｌｔｒｉｏ Ｐｌｕｓ酵素および選択試薬を使用した。

【0264】

【表20】

【0265】

【表21】

【0266】

結果：
検体シグナルカットオフを、陰性および陽性のキャリブレーションおよびＰａｎｔｈｅｒソフトウェアを使用して計算した。１．０以上のカットオフ比に対するシグナルをもたらす試験結果は、反応性とみなされた。試験された全ての条件は、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ、およびＢ．ｖｅｎａｔｏｒｕｍ、ならびにハムスター血液溶解物パネルメンバーをある程度検出した（表２２）。１６複製物のうち１５が検出された条件５を除き、全ての条件が、３０ｃ／ｍＬレベルで１００％の反応性で全ての種を検出した。条件１～５については、１２複製物のうち８が検出された条件２を除いて、４ｐ／ｍＬの全てのハムスター血液溶解物パネルは、１００％の反応性であった。０．０１ｐ／ｍＬでハムスター血液溶解物を試験した条件６～８については、結果は、１４／１６、１５／１６、および１４／１６が陽性であることを示している。因正反応における偽陽性はなかった。

【0267】

【表22-1】

【0268】

【表22-2】

【0269】

【表22-3】

【0270】

【表22-4】

【0271】

結論：
本明細書で試験されたオリゴの組み合わせは、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ、およびＢ．ｖｅｎｔｏｒｕｍを含むバベシア種の特異的かつ高感度な捕捉、増幅、検出を例示し、全血中のＢａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ寄生虫の検出を実証した。

【0272】

【表23-1】

【表23-2】

【表23-3】

【表23-4】

【表23-5】

【表23-6】

【表23-7】

【表23-8】

【表23-9】

【表23-10】

【表23-11】

【表23-12】

【表23-13】

【表23-14】

【表23-15】

【表23-16】

【表23-17】

【表23-18】

【表23-19】

【配列表】

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